KR20210013074A - 맛 및 향미-변형 단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 기준 단백질로부터 하나 이상의 아미노산 대체를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변형된 단백질 및 식품 산업에서 이의 용도에 관한 것이며, 변형된 단백질은 기준 단백질과 비교하여 적어도 하나의 개선된 식품-관련 특성을 가진다.
Description
본 발명은 맛 및 향미 단백질에 관한 것이다.
감미료 시장은 인공 감미료 및 천연 공급원, 예를 들어 스테비아(stevia) 및 나한과(monk-fruit) 추출물에서 유래된 감미료를 포함하여 기타 감미료로 이루어진 시장 점유율의 10% 미만과 함께, 설탕 및 고과당 시럽이 지배적이다.
GB2123672는 임의로 식품 산 또는 증량제(bulking agent)와 함께, 다양한 음료, 구강 세정제 또는 제약 기제에 포함된, 타우마틴(Thaumatin) 및 모넬린 (Monellin)과 같은 감미 단백질(sweet proteins) 및 약산성 다당류 검을 기재한다.
WO8402450은 검 기제, 감미료 및 향료를 포함하는 츄잉 검 조성물의 표면에 대한 타우마틴 또는 모넬린의 적용을 기재한다.
Leone, S. 등, Zhao 등, Zheng W. 등, 및 Pica A., 등은 MNEI의 돌연변이체를 기재한다.
Masuda, T. 등은 매우 달콤한(hypersweet) 타우마틴 유도체를 기재한다.
단백질 설계를 위한 계산 도구는 [Samish I., S., et al (2011) and (2017)]에 기재된 개선된 구체적인 특징을 가진 단백질을 설계하는 신뢰할 수 있는 대안적인 방법으로 나타났다.
현재 개시된 주제에 대한 배경으로 관련된 것으로 간주되는 참고문헌은 하기에 열거되었다.
Leone, S. et al. Sweeter and stronger: enhancing sweetness and stability of the single chain monellin MNEI through molecular design. Sci. Rep. 6, 34045; doi: 10.1038/srep34045 (2016)
Masuda, T. et al. A Hypersweet Protein: Removal of The Specific Negative Charge at Asp21 Enhances Thaumatin Sweetness. Sci. Rep. 6, 20255; doi: 10.1038/srep20255 (2016)
Samish I.,S, MacDermaid CM.,S, Perez-Aguilar JMP., Saven JG.PI, (2011). Theoretical and Computational Protein Design. Annu Rev Phys Chem 62:129-149
Samish I., (Editor), Computational Protein Design (2017), Methods in Molecular Biology, Springer Protocols, Humana Press.
Zhao, Meng & Xu, Xiangqun & Liu, Bo. (2018). Structure basis of the improved sweetness and thermostability of a unique double-sites single-chain sweet-tasting protein monellin (MNEI) mutant. Biochimie. 154;
Zheng W., et al. (2018) Expression, purification and characterization of a novel double-sites mutant of the single-chain sweet-tasting protein monellin (MNEI) with both improved sweetness and stability. Protein Expr Purif., 143:52-56.
Pica A., et al (2018) pH driven fibrillar aggregation of the super-sweet protein Y65R-MNEI: A step-by-step structural analysis. Biochim Biophys Acta Gen Subj., 1862:808-815.
일 측면에 따르면, 본 발명은 기준 단백질(reference protein)로부터 하나 이상의 아미노산 대체를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변형된 단백질을 제공하며, 여기서 변형된 단백질은 기준 단백질과 비교하여 적어도 하나의 개선된 식품-관련 특성을 가진다. 일 실시예에 따르면, 변형된 단백질은 기준 단백질로부터 적어도 2개의 아미노산 대체를 포함한다.
일 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호: 5의 잔기 E2, E23 및 Y65에서 적어도 3개의 아미노산 치환을 포함하는, 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 변형된 단백질을 제공하며, 여기서 변형된 단백질은 서열번호: 5와 비교하여 적어도 하나의 개선된 식품-관련 특성을 가진다.
일 측면에 따르면, 본 발명은 기준 단백질로부터 하나 이상의 아미노산 대체를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변형된 단백질을 포함하는 식품을 제공하며, 여기서 변형된 단백질은 기준 단백질과 비교하여 적어도 하나의 개선된 식품-관련 특성을 가진다. 일 실시예에 따르면, 변형된 단백질은 기준 단백질로부터 적어도 2개의 아미노산 대체를 포함한다.
일 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호: 5의 잔기 E2, E23 및 Y65에서 적어도 3개의 아미노산 치환을 포함하는, 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 변형된 단백질을 포함하는 식품을 제공하며, 여기서 변형된 단백질은 서열번호: 5와 비교하여 적어도 하나의 개선된 식품-관련 특성을 가진다.
인공 저칼로리 감미료는 시장에서 구할 수 있으며, 일부는 부작용이 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 사카린은 칼로리 또는 탄수화물 없이 음식 및 음료를 달게하는데 널리 사용되었으며, 방광암 발병과 관련이 있다. 따라서, 한편으로는 최적의 관능 프로파일(sensory profile)을 제공하고 다른 한편으로는 식품 및 음료에 사용하기에 적합할 현재 이용가능한 인공 저칼로리 감미료의 잠재적인 대체물이 필요하다.
본 발명은 신규한 감미 단백질 및 신규 맛 변형 단백질에 관한 것이며, 최적화 방법, 예를 들어 계산 방법에 기초하여 알려진 감미료에 비해 개선된 특성을 나타내는 신규한 단백질을 생성한다.
놀랍게도, 본 발명자들은 알려진 단백질 (본 명세서에서 "기준 단백질"로 표시됨)의 아미노산 서열에 다양한 특이적 치환을 도입하면 기준 단백질과 비교하여 적어도 하나의 개선된 특성을 갖는 신규한 단백질이 생성된다는 것을 발견하였다. 신규한 단백질의 적어도 하나의 개선된 특성은 식음료 적용에서 변형된 단백질의 적합성 및 활용에 있어 매우 중요할 수 있음을 시사하였다.
구체적으로, 하기 실시예에 나타난 바와 같이, 신규한 단백질 (본 명세서에서 "변형된 단백질" 또는 "설계자 단백질(designer protein)"로 표시됨)은 기준 단백질과 비교하여 개선된 관능 프로파일 및/또는 열 안정성을 나타내었다. 본 명세서에 기재된 관능 프로파일은 맛 프로파일 (예를 들어, 감미 효능, 뒷맛 및 여운 (lingering))과 관련된다.
따라서, 가장 광범위한 측면에서, 본 발명은 기준 단백질의 아미노산 서열에 적어도 하나의 아미노산 대체 (치환)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변형된 단백질에 관한 것이며, 여기서 변형된 단백질은 기준 단백질과 비교하여 적어도 하나의 개선된 식품-관련 특성을 가진다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 적어도 2개의 아미노산 대체 (치환), 때로는 기준 단백질의 아미노산 서열에서 3개의 아미노산 대체 (치환)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
적어도 하나의 개선된 식품-관련 특성은 향미, 질감, 맛, 감미 역치, 감미 수준, 감미 프로파일, 관능 프로파일, 감미 동역학, 안정성 (구조적 및 기능적), 내열성, 식품 매트릭스에 대한 적합성, 유통기한(shelf-life), 다른 향미의 차폐 및/또는 증강, 이미(off-taste), 맛 개시(taste onset), 여운 맛(lingering taste), 맛의 부드러움(roundness of taste) 또는 설탕-유사 맛과 같은 식음료 적용에서 변형된 단백질의 적합성을 가능하게 하는 특성을 포함한다.
일 실시예에서, 적어도 하나의 식품-관련 특성은 관능-영향 특성(sensory-affecting property)이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "관능-영향 특성"은, 예를 들어 미각(sense of taste)에 의해 결정되는 관능 인상(sensory impression)의 변화를 나타낸다. 관능-영향 특성은 예를 들어 감미 효능 (설탕-유사 향미), 감미 동역학 (개시 시간, 여운 시간, 맛 지속시간(taste duration)), 이미의 부족, 및 다른 맛인 이미 (예를 들어, 금속 맛)의 차폐 또는 증강과 같은 감미 프로파일을 포함한다. 예를 들어, 개선된 특성은 감미 증가, 감소된 개시 시간 또는 감소된 여운 맛과 관련이 있다.
적어도 하나의 특성이 관능-영향 특성인 일 실시예에 따르면, 변형된 단백질은 설탕 대체물로 간주될 수 있다. 일 실시예에서, 적어도 하나의 식품-관련 특성은 감미 효능, 감소된 개시 시간 또는 감소된 여운 맛 중 적어도 하나이다.
일 실시예에서, 적어도 하나의 식품-관련 특성은 안정성이다. 일 실시예에서, 안정성은 열 안정성, 더 긴 유통기한, 낮은 pH에 대한 안정성, 염 농도 안정성, 이온 강도 안정성, 또는 지방-함유 또는 단백질-함유 매트릭스에서의 안정성 중 적어도 하나이다. 일 실시예에서, 적어도 하나의 식품-관련 특성은 열 안정성이다.
일 실시예에서, 적어도 하나의 식품-관련 특성은 증가된 유통기한 안정성이다. 예를 들어, 변형된 단백질은 적어도 1주, 2주, 1개월, 및 심지어 1년 동안 안정적일 수 있다.
상술한 바와 같이, 변형된 단백질은 적어도 하나의 추가 식품 성분과 조합하여 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 적어도 하나의 식품-관련 특성은 변형된 단백질과 적어도 하나의 식품 성분 간의 상승 효과를 나타낼 수 있다. 식품 성분의 비-제한적인 예는 인공 또는 천연 향료, 식품 첨가제, 식용 색소, 방부제 또는 추가 설탕 첨가제를 포함한다. 식품 성분은 차폐 맛 효과 또는 증강 맛 효과를 가질 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 기준 단백질은 맛 변형 단백질 및/또는 맛 증강제 단백질 및/또는 맛 단백질, 특히 감미 단백질이다. 맛 변형 단백질은 비-감미 물질, 예를 들어 물 및 신맛 물질의 달콤한 맛을 이끌어낸다. 본 명세서에서 사용되는 맛있는(tasty) 단백질은 맛 수용체에 결합하여 미각을 유발하는 것으로 알려져 있다. 본 명세서에서 사용되는 감미 단백질은 감미 수용체에 결합하여 달콤함을 유발하는 것으로 알려져 있다. 감미 수용체의 비-제한적인 예는 맛 수용체 유형 1 구성원 1 (TAS1R1, 인간 유전자의 Uniprot ID: TS1R1_HUMAN), 맛 수용체 유형 1 구성원 2 (TAS1R2, T1R2, TR2, UniProt - Q8TE23), 맛 수용체 유형 1 구성원 3 (TAS1R3, T1R3, UniProt - Q7RTX0)을 포함한다.
기준 단백질은 길이가 다를 수 있다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 적어도 45 아미노산, 적어도 80 아미노산, 적어도 100 아미노산, 적어도 258 아미노산을 포함한다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 45 아미노산, 50 아미노산, 54 아미노산, 97 아미노산, 100 아미노산, 158 아미노산, 220 아미노산, 235 아미노산, 258 아미노산의 길이를 가진다.
일 실시예에서, 기준 단백질 자연적으로-발생하는 단백질이다. 일부 다른 실시예에서, 기준 단백질은 열대 식물과 같은 식물에서 발견된다. 식물의 비-제한적인 예는 카파리스 마사이카이(capparis masaika), 오우블리(oubli), 세렌디피티 베리(serendipity berry), 카템페(katemfe), 기적 과일 베리(miracle fruit berry), 또는 렘바(lemba) 중 적어도 하나를 포함한다.
일 실시예에서, 기준 감미 단백질은 타우마틴, 모넬린, 미라쿨린 (Miraculin), 커쿨린(Curculin), 브라제인(Brazzein) 및 마빈린(Mabinlin)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시예에서, 기준 감미 단백질은 타우마틴이다.
일 실시예에서, 기준 감미 단백질은 모넬린이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 타우마틴-1 (GenBank Entry No. P02883; 서열번호: 1)이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 타우마틴-2 (GenBank Entry No. P02884; 서열번호: 2)이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 사슬 A (GenBank Entry No. P02881; 서열번: 3) 및 사슬 B (GenBank Entry No. P02882; 서열번: 4)로 제조된 모넬린이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 미라쿨린 (GenBank Entry No. P13087; 서열번호: 6)이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 커쿨린-1 GenBank Entry No. P19667; 서열번호: 7) 또는 커쿨린-2 (GenBank Entry No. Q6F495; 서열번호: 8)이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 브라제인 (디펜신(Defensin)-유사 단백질로도 알려짐) (GenBank Entry No. P56552; 서열번호: 9)이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 마빈린 I/감미 단백질 마빈린-1 (GenBank Entry No. P80351; 서열번호: 10), 마빈린 II (감미 단백질 마빈린-2로도 알려짐) (GenBank Entry No. P30233; 서열번호: 11), 마빈린 III (감미 단백질 마빈린-3으로도 알려짐) (GenBank Entry No. P80352; 서열번호: 12), 마빈린 IV (감미 단백질 마빈린-4로도 알려짐) (GenBank Entry No. P80353; 서열번호: 13) 또는 마빈린-1 사슬 A (GenBank Entry No. B9SA35; 서열번호: 14)이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 자연에서 발견되지 않는 서열이므로, 인공 단백질, 또는 합성 단백질 또는 조작된 단백질이라고 한다. 합성 단백질은 자연적으로 발생하는 단백질의 아미노산 서열의 전체 또는 일부 (단백질의 폴리펩티드 사슬의 전부 또는 일부) 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 단백질은 야생형 단백질의 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬이 다른 아미노산에 의해 공유 결합되도록, 자연적으로 발생하는 단백질에 상응하는 단일 폴리펩티드 사슬을 생성하는 자연적으로 발생하는 단백질의 결합 변형을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 MNEI로 알려진 변형된 모넬린 단백질이다.
일 실시예에서, 기준 단백질 단일 사슬 모넬린 (MNEI) 단백질 (서열번호: 5)이다.
신규한 변형된 단백질은 다양한 방법으로 설계될 수 있다.
일 실시예에서, 단백질의 설계는 계산 도구를 이용하거나 또는 전문적인 단백질 설계 및 구조 생물학 방법, 예를 들어, 하기에 추가로 기재되는 바와 같이 부위-지정 돌연변이 생성(site-directed mutagenesis), 단백질 공학 또는 지정 진화 (directed evolution)에 의해 수행된다. 본 발명자들은 기준 향미 단백질의 서열 자료, 기준 향미 단백질의 구조적 자료 및/또는 기준 향미 단백질의 진화적 자료 및 서열 및/또는 구조적 특징에서 기준 향미 단백질과 국소적(local) 또는 전체적 (global) 유사성을 갖는 기타 단백질에 기초한 계산 방법론을 개발하였다. 본 명세서에서 개발되고 적용되는 계산 방법의 능력은, 본 발명자들이 에너지적으로 유리하고 따라서 개선된 열안정성, 할로안정성, pH-안정성, 유통기한, 접힘 및 용해도 특징을 가질 것으로 예측되는 특정 아미노산 치환을 갖는 단백질을 설계할 수 있게 하였다. 구체적으로, 계산적 단백질 설계(Computational Protein Design, CPD)는 기준 단백질 구조 및/또는 반드시 수용체에 대한 기능적 결합 부위가 아닌 서열 내의 특정 부위에 초점을 맞추기 위해 적용되었다. 또한, CPD의 사용으로 본 발명자들은 필요한 개선된 특징에 맞는 미리정의된 아미노산 세트로 치환을 제한할 수 있었다. 미리정의된 아미노산 세트는 입력 자료, 즉 CPD를 받는 단백질의 영역, 및 출력 자료, 즉 결과로 생성된 변형된 단백질에 존재할 수 있는 아미노산의 위치 및 유형에 모두 있다.
예를 들어, CPD를 사용하면 "비-이상적인" 아미노산 (예를 들어, 소수성 코어 내의 친수성 아미노산 또는 외부 표면 영역의 소수성 아미노산)을 "이상적인" 아미노산 (예를 들어, 외부 표면 영역의 친수성 아미노산 및 소수성 코어 내의 소수성 아미노산)으로 대체할 수 있다.
이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 외부 표면 영역의 소수성 아미노산을 외부 표면 영역의 친수성 아미노산으로 대체하는 것이 구강에 대한 비-특이적 결합을 감소시키고 맛 느낌(taste feeling) 후의 여운을 감소시킬 것이라고 제안하였다.
본 명세서에서 개발된 방법론은 "안정화 치환", 예를 들어 단백질 구조의 전체 에너지를 감소시키는 아미노산 치환을 검색하는 것을 포함한다. 전체 에너지는 당해 기술분야에 알려진 알고리즘을 적용하여 계산될 수 있다. 이러한 알고리즘의 비-제한적인 예는 Rosetta, OSPREY (M. Hallen, J. Martin, et al., Journal of Computational Chemistry 2018; 39(30): 2494-2507) 또는 EnCoM (Frappier V, Chartier M, Najmanovich RJ. Nucleic Acids Res. 2015;43(W1):W395-400)를 포함한다. 이러한 CPD 방법은 진화적 서열 및 구조적 일치(structural consensus), 일반 및 고온 분자 역학 (MD), 상관 돌연변이 분석 (correlated mutational analysis, CMA), 육안 검사, 및 공동(cavities), 소수성 패치, 만족스럽지 않은 수소 결합 등의 분석과 같은 다수의 직교 방법(orthogonal methods)에 의해 초점 및 필터링을 거친다.
아미노산 치환은 하기의 고려사항을 기반으로 한다: (a) 표면 정전기 전위 및 표면 상의 소수성 패치(의 결여), (b) 특정 범위로 단백질의 등전점 (pI)의 유지, (c) 단백질-내 공동 분석, (d) 고온 역학에서 상관 돌연변이 분석, 정상 모드 분석 및 평균 제곱근 변동(root mean square fluctuations, RMSF)을 포함하는 동적 안정성, (e) 치환 에너지학의 엔트로피 및/또는 엔탈피 성분, (f) 특정 치환의 시각화, (g) 선별된 다중 서열 정렬 (multiple sequence alignment, MSA)의 진화적 보존 분석에 의해 반영된 바와 같이, 관련 단백질 계열에서 허용되는 아미노산 유형, (h) 낮은-의사-에너지(low-pseudo-energy) CPD 계산에 반영된 치환의 빈도.
계산 방법론은 하기의 단계 중 하나 이상을 포함한다:
(1) 다중 서열 정렬 (MSA).
이 단계에서, 표적 기준 단백질과 유사한 서열 및/또는 단백질은 공용 데이터베이스에서 검색된다. 이 검색을 기반으로, 다중 서열 정렬 (MSA)을 구성하고, 보존율(conservation rate)을 계산한다. 이를 바탕으로, 수행할 CPD 수준에 대한 결정을 내린다. 비-보존적 위치에서, 모든 아미노산 (시스테인이 있는 또는 없는)은 CPD 동안 허용되는 반면, 더 보존적 위치의 경우 CPD는 발견된 것과 유사한 특성 (예를 들어, 전하, 크기 등)을 가진 잔기로 제한된다. 이 단계는 물리적 지식 및 보존 자료를 기반으로 각 치환된 위치에서 치환을 제한하는 것을 포함한다.
(2) 단백질 기능 분석.
이 단계에서, 선행 지식(prior knowledge)을 이용하여 (활성, 구조, 결합 등에 대한) 알려진 영향이 있는 치환 데이터베이스를 구성한다. 안정성 및/또는 기능을 방해하는 선행 지식을 기반으로 알려진 치환 및 인접 위치 (예를 들어, 이러한 위치로부터 0.5-1 nm의 거리)는 CPD 동안 제한되며 치환되지 않는다.
(3) CPD.
이 단계는 ROSETTA, OSPREY, SCWRL 등과 같은 지정된 소프트웨어에 의해 수행된다. 결정론적 CPD를 수행하기 전, 기준 단백질 3D 구조/모델은 에너지를 최소화한다. 각 기준 단백질에 대해, 여러 모델이 고려된다.
(4) 선택
가장 낮은 에너지를 갖는 단백질 모델을 모은다. 이러한 모델에서 MSA를 계산하고 보존 서열을 결정한다. 생화학적 및 생물물리학적 사전-지식(pre-knowledge)을 기반으로, 치환의 하위집합(subsets)을 선택한다. 이러한 하위집합은 높은 빈도로 CPD 동안 나타나는 하나 이상의 위치에서 대체를 나타낸다. 그 다음, 각 하위집합은 최소화된 단백질과 에너지의 3D 구조에서 모델링된다. 그 다음, 추가 계산 및 실험 검증을 위해 가장 낮은 에너지 하위집합을 선택한다.
CPD에서 사용된 고려사항 중 하나는 수용체 결합 부위 및 결합 영역과 이의 근접성에서 아미노산을 치환할지 여부의 결정이다. 맛 수용체에 대한 결합에서 중요한 단백질의 아미노산 잔기를 결정하는 것은 일반적으로 다양한 아미노산의 단일점 치환에 의해 수행될 수 있다. 실시예에서 상세히 설명된 바와 같이, 본 발명자들은 맛 수용체에서 추정 결합 부위의 특징화를 위해 계산적 분석을 사용하였다. 본 발명자들은 기준 단백질 및 변형된 단백질에 결합하는 맛 수용체에서 몇 가지 신규한 결합 부위를 확인하였다.
변형된 단백질은 기준 단백질 (아미노산 서열)을 기반으로 하므로, 변형된 단백질과 관련하여 본 명세서에 기재된 임의의 특징/특성/특징화가 기준 해당 단백질과 관련하여 제공된다는 점에 유의해야 한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 변형된 단백질은 기준 단백질 (기준 아미노산 서열)에 비해 적어도 하나, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 18의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 단백질 (기준 아미노산 서열)에 비해 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 18의 아미노산 치환을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 단백질 (기준 아미노산 서열)에 비해 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 18의 아미노산 치환을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 단백질 (기준 아미노산 서열)에 비해 1 내지 20의 아미노산 치환, 때로는 2 내지 10의 아미노산 치환, 때로는 3 내지 10의 아미노산 치환, 때로는 3 내지 6의 아미노산 치환을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13 및 서열번호: 14로 이루어진 군으로부터 선택된, 기준 단백질 (기준 아미노산 서열)에 비해 적어도 하나, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 18의 아미노산 치환을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 기준 단백질에 비해 적어도 하나, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 18의 아미노산 치환을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 기준 단백질에 비해 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 18의 아미노산 치환을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 서열번호: 1로 표시되는 기준 단백질에 비해 적어도 하나, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 18의 아미노산 치환을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 서열번호: 1로 표시되는 기준 단백질에 비해 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 18의 아미노산 치환을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 단백질의 아미노산 서열과 40% 내지 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 아미노산 서열과 90% 내지 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 아미노산 서열과 60% 내지 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 아미노산 서열과 70% 내지 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13 및 서열번호: 14로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13 및 서열번호: 14로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 60% 내지 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13 및 서열번호: 14로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 90% 내지 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열과 90% 내지 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열과 80% 내지 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
2 이상의 아미노산 서열 사이의 % 동일성은 최대 대응을 위해 비교 및 정렬될 때 2 이상의 서열에 대해 결정된다. 본 발명의 문맥에서, % 동일성을 갖는 본 명세서에 기재된 서열 (아미노산)은 동일성이 계산되는 기준 서열과 동일한 기능/활성을 갖는 것으로 간주된다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 단백질의 아미노산 서열과 40% 내지 99% 유사한 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 아미노산 서열과 90% 내지 99% 유사한 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 아미노산 서열과 60% 내지 99% 유사한 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 아미노산 서열과 70% 내지 90% 유사한 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13 및 서열번호: 14로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13 및 서열번호: 14로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 60% 내지 99% 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13 및 서열번호: 14로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 90% 내지 99% 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열과 90% 내지 99% 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열과 80% 내지 99% 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 서열 유사성 또는 서열 상동성은 유사한 물리화학적 특성으로 보존된 아미노산, 예를 들어, 류신 및 이소류신의 양 (%)을 나타낸다.
서열 동일성을 결정함에 있어서, 갭은 계수되지 않고 서열 동일성은 둘 중 더 짧은 서열에 상대적이다. 이와 관련하여, 기준 단백질 (아미노산 서열)의 길이는 변형된 단백질 (아미노산 서열)과 동일하거나 또는 변형된 단백질 (아미노산 서열)과 상이할 수 있음에 유의해야 한다.
용어 "아미노산 서열" 및/또는 "폴리펩티드 사슬"은 아미노산 서열 또는 폴리펩티드 사슬을 갖는 단백질을 기재하는데 사용된다. 따라서, 용어 "기준 단백질"은 용어 "기준 아미노산 서열"과 동등하고, 용어 "변형된 단백질"은 용어 "변형된 아미노산 서열"과 동등하다. 용어 "아미노산 서열" 및/또는 "폴리펩티드 사슬"은 3D 구조를 갖는 서열 및 3D 구조가 없는 서열을 포함한다는 점에 유의해야 한다.
계산적 최적화 과정의 일부로서, 변형된 단백질은 에너지적 고려사항, 즉 낮은 에너지를 갖는 서열을 기반으로, 계산적-, 생물정보학적- 또는 구조-생물학 분석에 따라 아미노산 서열의 대량 생산 집단으로부터 선택될 수 있다.
에너지적 계산은 전체 아미노산 서열에 적용되거나 또는 대안적으로 전체 아미노산 내의 상이한 영역 또는 선택된 아미노산으로 제한될 수 있다. 후자 (상이한 영역 또는 선택된 아미노산)에서, 정보를 통합하여 전체 단백질에 대한 측정값을 얻을 수 있다.
아미노산 서열 (예를 들어, 변형된 단백질) 각각의 계산은 물리-기반 및 통계-기반 전위를 결합하여, 예를 들어 로제타 에너지 단위 (Rosetta Energy Unit, REU)를 이용하여 수행될 수 있다. 로제타 에너지 단위 (REU)는 단백질 구조의 계산적 모델링 및 분석을 위한 알고리즘 패키지인 로제타 소프트웨어의 알고리즘이다. 로제타 소프트웨어는 새로운 단백질 설계, 효소 설계, 리간드 도킹, 및 생물학적 거대분자 및 거대분자 복합체의 구조 예측을 포함하여, 계산적 생물학에서 주목할만한 과학적 발전을 가능하게 한다. 로제타 에너지 함수는 실제 물리적 에너지 단위와 일치하지 않는 물리적 및 통계적 기반 전위의 조합이다. 로제타 에너지는 임의의 규모이며 때로는 ("로제타 에너지 단위"의 경우) REU라고 한다.
일 실시예에서, REU는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 전체 단백질 서열에 대해 계산될 수 있다. 일부 다른 실시예에서, REU는 전체 단백질 서열의 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 적어도 하나의 영역에 대해 계산될 수 있다. 일부 다른 실시예에서, REU는 전체 단백질 서열에서 적어도 하나의 아미노산 치환에 대해 계산될 수 있다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 REU에 제공된 -190보다 낮은 에너지를 가진다. 일 실시예에서, 변형된 단백질은 REU에 제공된 약 -190의 에너지를 가진다. 일 실시예에서, 변형된 단백질은 REU에 제공된 약 -195의 에너지를 가진다. 일 실시예에서, 변형된 단백질은 REU에 제공된 -195보다 낮은 에너지를 가진다. 일 실시예에서, 변형된 단백질은 REU에 제공된 -196보다 낮은 에너지를 가진다. 일 실시예에서, 변형된 단백질은 REU에 제공된 -197보다 낮은 에너지를 가진다. 일 실시예에서, 변형된 단백질은 REU에 제공된 -198보다 낮은 에너지를 가진다. 일 실시예에서, 변형된 단백질은 REU에 제공된 약 -198의 에너지를 가진다. 일 실시예에서, 변형된 단백질은 REU에 제공된 -198.4보다 낮은 에너지를 가진다. 일 실시예에서, 변형된 단백질은 REU에 제공된 -200보다 낮은 에너지를 가진다. 일 실시예에서, 변형된 단백질은 REU에 제공된 -206.4보다 낮은 에너지를 가진다. 일 실시예에서, 변형된 단백질은 REU에 제공된 -210보다 낮은 에너지를 가진다. 일 실시예에서, 변형된 단백질은 REU에 제공된 -214.6보다 낮은 에너지를 가진다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 REU에 제공된 -270.11보다 낮은 에너지를 가진다. 일 실시예에서, 변형된 단백질은 REU에 제공된 -300보다 낮은 에너지를 가진다. 일 실시예에서, 변형된 단백질은 REU에 제공된 -350보다 낮은 에너지를 가진다. 일 실시예에서, 변형된 단백질은 REU에 제공된 -400보다 낮은 에너지를 가진다. 일 실시예에서, 변형된 단백질은 REU에 제공된 -410보다 낮은 에너지를 가진다. 일 실시예에서, 변형된 단백질은 REU에 제공된 -418보다 낮은 에너지를 가진다. 일 실시예에서, 변형된 단백질은 REU에 제공된 -420보다 낮은 에너지를 가진다. 일 실시예에서, 변형된 단백질은 REU에 제공된 -430보다 낮은 에너지를 가진다. 일 실시예에서, 변형된 단백질은 REU에 제공된 -433보다 낮은 에너지를 가진다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 REU에 제공된 -190 내지 REU에 제공된 약 -214.6의 에너지를 가진다. 일부 다른 실시예에서, 변형된 단백질은 REU에 제공된 -195 내지 REU에 제공된 약 -214.6의 에너지를 가진다. 일부 다른 실시예에서, 변형된 단백질은 REU에 제공된 -197 내지 REU에 제공된 약 -214.6의 에너지를 가진다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 변형된 단백질은 단백질의 다양한 영역에서 아미노산 치환의 결과일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "단백질의 영역"은 단백질 서열 (아미노산 서열) 또는 단백질 구조의 일부인 아미노산 서열 또는 구조적 모티프를 나타낸다. 단백질 영역의 비-제한적인 예는 단백질 표면, 단백질 코어, 단백질 루프 영역, 2차 구조 캡핑 영역, 이황화 영역, 결합-부위 영역, 링커 영역, 소수성-패치 영역, 또는 단백질 소수성 영역을 포함한다.
기준 단백질의 아미노산 치환은 특정 단백질 영역 또는 서열에 제한되지 않는다. 아미노산 치환을 포함할 수 있는 기준 단백질의 영역은 기준 단백질 표면, 기준 단백질 소수성 코어, 또는 루프 영역, 2차 구조의 가장자리 (2차 구조 캡핑 영역으로도 표시됨), 이황화 영역, 결합-부위 영역, 링커 영역, 소수성-패치 영역이라고 하는 기준 단백질 영역을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 기준 단백질 구조 및/또는 서열 내의 제한된 영역 내에서 치환될 수 있다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 표면 영역에서 치환될 수 있다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 코어 영역에서 치환될 수 있다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 이황화 결합으로 치환될 수 있다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 루프 영역에서 치환될 수 있다. 일 실시예에서, 2 이상의 아미노산 대체는 기준 단백질의 표면에 위치한다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 수용체에 대한 기준 단백질의 예측되거나 또는 알려진 결합 부위에 인접한 영역에 없는 한정된 영역으로 치환될 수 있다. 이 문맥에서 '인접'은 결합 계면에서 4-7Å를 의미할 수 있다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 기준 단백질 구조 및/또는 서열 내의 상이한 영역에서 치환될 수 있다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 적어도 표면 영역, 코어 영역, 이황화 결합 영역 또는 루프 영역 및 이들의 임의의 조합에서 치환될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 단백질 표면 영역은 용매에 대한 부분적 또는 전체적인 접근이 가능한 영역이다 (SASA-용매 접근가능한 표면적). 본 명세서에서 사용된 단백질 코어 영역은 50% 미만의 아미노산 상대 SASA (용매 접근가능한 표면적) 또는 내부 코어의 경우 20% 미만으로 용매에 접근할 수 없는 영역이다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 아미노산 서열 표면 영역에 비해 표면 영역에서 10% 내지 99%, 때로는 20% 내지 99%, 때로는 30% 내지 99%, 때로는 40% 내지 99%, 때로는 50% 내지 90%, 때로는 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 아미노산 서열 표면 영역에 비해 표면 영역에서 10% 내지 99%, 때로는 20% 내지 99%, 때로는 30% 내지 99%, 때로는 40% 내지 99%, 때로는 50% 내지 90%, 때로는 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%의 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 아미노산 서열 소수성 코어 (소수성-패치) 영역에 비해 소수성 코어 (소수성-패치) 영역에서 10% 내지 99%, 때로는 20% 내지 99%, 때로는 30% 내지 99%, 때로는 40% 내지 99%, 때로는 50% 내지 90%, 때로는 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 아미노산 서열 소수성 코어 (소수성-패치) 영역에 비해 소수성 코어 (소수성-패치) 영역에서 10% 내지 99%, 때로는 20% 내지 99%, 때로는 30% 내지 99%, 때로는 40% 내지 99%, 때로는 50% 내지 90%, 때로는 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%의 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 아미노산 서열 표면 영역에 비해 표면 영역에서 셋 (3) 내지 사십 (40)의 아미노산 치환, 4 내지 30의 아미노산 치환, 5 내지 30의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 아미노산 서열 표면 영역에 비해 표면 영역에서 적어도 하나 (1), 둘 (2), 셋 (3), 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 18, 적어도 20, 적어도 25 또는 30의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 아미노산 서열 코어 영역에 비해 코어 영역에서 20%, 30%, 50%, 80%, 90%, 95%, 98% 동일성인 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 아미노산 서열 코어 영역에 비해 코어 영역에서 20%, 30%, 50%, 80%, 90%, 95%, 98% 유사성인 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 아미노산 서열 코어 영역에 비해 코어 영역에서 1 내지 5의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 아미노산 서열의 수용체에 결합하는 영역에 비해 수용체 (수용체 결합 부위)에 결합하는 영역에서 90%, 95%, 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 아미노산 서열의 수용체 결합 부위에 비해 수용체 결합 부위에서 90%, 95%, 99% 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 기준 단백질의 수용체 결합 부위는 변형된 단백질에서 치환되지 않는다.
일 실시예에서, 이황화 결합 중 적어도 하나가 제거되고 그 주변의 영역이 제거된 각각의 이황화 결합 주변에 8 내지 20의 치환으로 재설계된다.
아미노산은 일반적으로 알려진 세 글자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명법 위원회에 의해 권장되는 한 글자 기호로 본 명세서에서 언급될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 아미노산 치환 (대체)은 하나의 아미노산에서 다른 아미노산으로의 변화를 나타낸다. 이것은 일반적으로 기준 대신 다른 아미노산을 코딩하도록 코돈 서열을 변경하는 비유사(nonsynonymous) 미스센스 돌연변이에 의해 야기된 DNA 서열의 점 돌연변이 때문이다. 아미노산 대체는 단백질의 기능 또는 구조에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 일반적으로 대체된 아미노산이 얼마나 유사한지 또는 다른지, 및 서열 또는 구조에서 이들의 위치에 따라 달라진다. 예를 들어, 아미노산 치환은 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 벌키성(bulkiness) (또는 유연성), 베타-분지, 방향성, 특정 결합 상호작용을 부여하는 능력 (수소 결합, 염 다리, 극성 및 비-극성 상호작용), pK, 당 결합 능력 및 다른 번역-후 변형 및/또는 관련된 잔기의 양친매성 특성의 유사성을 기반으로 할 수 있다.
일 실시예에서, 아미노산 치환은 보존적 대체일 수 있다. 이러한 대체는 유사한 특성을 나타내는 다른 아미노산으로의 아미노산의 변화를 포함한다. 보존적 아미노산 대체 (보존적 아미노산 "치환" 또는 보존적 아미노산 돌연변이로도 표시됨)는 제공된 아미노산을 유사한 생화학적, 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 변경하는 단백질의 아미노산 대체이다.
예를 들어, 아미노산은 이들의 구조 및 이들의 측쇄 (R 기)의 일반적인 화학적 특성을 기준으로 6 가지 주요 종류로 분류될 수 있다.
지방족: 이소류신 (I), 류신 (L), 글리신 (G), 알라닌 (A), 발린 (V);
히드록실 또는 황/셀레늄-함유: 세린 (S), 시스테인 (C), 트레오닌 (T), 메티오닌 (M);
고리형: 프롤린 (P)
방향족: 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W)
염기성: 히스티딘 (H), 리신 (K), 아르기닌 (R)
산성 및 이의 아미드: 아스파르테이트 (D), 글루타메이트 (E), 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q).
또한, 각각의 하기의 군은 서로에 대해 보존적 치환인 다른 예시적인 아미노산을 함유한다:
1) 매우 작은: 알라닌 (A), 글리신 (G);
2) 음전하: 아스파르트산 (D), 글루타민산 (E);
3) 극성 (아미드화 카복실 측쇄): 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q);
4) 양전하: 아르기닌 (R), 리신 (K);
6) 방향족: 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W), 및 때로는 히스티딘 (H);
7) 작은 극성: 세린 (S), 트레오닌 (T);
8) 황-함유: 시스테인 (C), 메티오닌 (M);
9) 작은: 알라닌 (A), 글리신 (G), 세린 (S);
10) 베타-분지: 발린 (V), 이소류신 (I) 및 때로는 트레오닌 (T);
11) 극성: 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q), 세린 (S), 트레오닌 (T).
그럼에도 불구하고, 아미노산 특성의 다른 측면을 각각 강조하는 수많은 아미노산 인덱스를 생성하는 수많은 아미노산의 클러스터링이 있다. - 예를 들어, aa 인덱스 데이터베이스 https://www.genome.jp/aaindex/에서 수백 개의 이러한 인덱스 참조. 결과적으로, 보존적 대체 중 일부는 실제로 식음료 산업에서 산업적 사용에 대한 단백질의 적합성에 중요한 다른 특징, 예를 들어 혀 또는 기타 관능 프로파일 측면에 대한 비-특이적 결합을 나타낼 수 있다.
또한, 추가 보존 분석은 하기를 기반으로 한다:
- 비극성 "소수성" 아미노산은 발린 (V), 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 페닐알라닌 (F), 트립토판 (W), 시스테인 (C), 알라닌 (A), 티로신 (Y), 히스티딘 (H), 트레오닌 (T), 세린 (S), 프롤린 (P), 글리신 (G), 아르기닌 (R) 및 리신 (K)으로 이루어진 군으로부터 선택된다;
- "극성" 아미노산은 아르기닌 (R), 리신 (K), 아스파르트산 (D), 글루타민산 (E), 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q)으로 이루어진 군으로부터 선택된다;
- "양전하" 아미노산은 아르기닌 (R), 리신 (K) 및 히스티딘 (H)으로 이루어진 군으로부터 선택되며;
- "산성" 아미노산은 아스파르트산 (D), 아스파라긴 (N), 글루타민산 (E) 및 글루타민 (Q)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시예에서, 대체는 라디칼 대체이다. 라디칼 대체 (치환)는 아미노산의 다른 특성을 가진 다른 아미노산으로의 교환이다.
기준 단백질 및 변형된 단백질 사이의 서열 유사성 및/또는 서열 동일성의 정도는 일반적으로 변형된 단백질의 특성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 다수의 치환은 결합 동역학, 접힘 동역학, 용해도, 열안정성, 할로안정성, pH 안정성, 유통기한, 비-수성 입자에 대한 결합 (예를 들어, 식품 매트릭스의 단백질 또는 지방 또는 구강 내 소수성 영역), 3D 구조 및 이의 활성 및 관련 특성에 영향을 미칠 수 있다. 본 명세서에서 개발되고 적용된 계산 방법은 개선된 변형된 단백질을 야기할 치환을 위한 추정 아미노산 잔기에 대한 철저한 이해를 제공한다.
일 측면에 따르면, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다. 하기 실시예 1에 나타난 바와 같이, CPD 분석은 치환에 중요한 것으로 제안된 여러 아미노산 치환을 나타내었다.
따라서, 일 측면에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 아미노산을 포함하는, 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 변형된 단백질에 관한 것이며, 여기서 변형된 단백질은 서열번호: 5와 비교하여 적어도 하나의 개선된 식품-관련 특성을 가진다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이고, 치환될 아미노산은 E2이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이고, 치환될 아미노산은 I8이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이고, 치환될 아미노산은 F11이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이고, 치환될 아미노산은 N14이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이고, 치환될 아미노산은 G16이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이고, 치환될 아미노산은 K17이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이고, 치환될 아미노산은 F18이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이고, 치환될 아미노산은 V20이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이고, 치환될 아미노산은 D21이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이고, 치환될 아미노산은 E23이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이고, 치환될 아미노산은 Q28이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이고, 치환될 아미노산은 R31이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이고, 치환될 아미노산은 T33이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이고, 치환될 아미노산은 N35이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이고, 치환될 아미노산은 C41이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이고, 치환될 아미노산은 L62이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이고, 치환될 아미노산은 V64이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이고, 치환될 아미노산은 Y65이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이고, 치환될 아미노산은 S67이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이고, 치환될 아미노산은 A73이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이고, 치환될 아미노산은 R84이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이고, 치환될 아미노산은 F89이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이고, 치환될 아미노산은 하기의 아미노산 E2, I8, F11, N14, G16, K17, F18, V20, D21, E23, Q28, R31, T33, N35, C41, L62, V64, S67, A73, R84 또는 F89 중 적어도 하나이다.
일 실시예에서, 적어도 하나의 아미노산 치환은 보존적 치환이다. 일 실시예에서, 적어도 하나의 아미노산 치환은 라디칼 치환이다. 일 실시예에서, 2 이상의 아미노산이 치환된다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 극성 비하전(uncharged) 아미노산으로의 E2의 적어도 하나의 치환을 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 적어도 하나의 치환 E2S, E3T, E2N 또는 E2Q를 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 극성 비하전 아미노산 또는 소수성 아미노산으로의 I8의 적어도 하나의 치환을 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 적어도 하나의 치환 I8T 또는 I8V를 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 하전(charged) 아미노산으로의 F11의 적어도 하나의 치환을 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 적어도 하나의 치환 F11D 또는 F11E를 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 하전 아미노산으로의 N14의 적어도 하나의 치환을 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 적어도 하나의 치환 N14K 또는 N14E를 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 소수성 아미노산으로의 G16의 적어도 하나의 치환을 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 적어도 하나의 치환 G16A를 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 하전 아미노산으로의 K17의 적어도 하나의 치환을 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 적어도 하나의 치환 K17E 또는 K17R을 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 하전 아미노산 또는 소수성 아미노산으로의 F18의 적어도 하나의 치환을 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 적어도 하나의 치환 F18D를 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 소수성 아미노산으로의 V20의 적어도 하나의 치환을 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 적어도 하나의 치환 V20A를 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 하전 아미노산으로의 D21의 적어도 하나의 치환을 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 적어도 하나의 치환 D21K, D21R 또는 D21E를 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 극성 비하전 아미노산 또는 소수성 아미노산으로의 E23의 적어도 하나의 치환을 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 적어도 하나의 치환 E23T 또는 E23A를 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 하전 아미노산으로의 Q28의 적어도 하나의 치환을 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 적어도 하나의 치환 Q28K를 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 소수성 아미노산으로의 R31의 적어도 하나의 치환을 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 적어도 하나의 치환 R31V를 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 소수성 아미노산으로의 T33의 적어도 하나의 치환을 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 적어도 하나의 치환 T33V를 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 소수성 아미노산으로의 N35의 적어도 하나의 치환을 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 적어도 하나의 치환 N35V를 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 하전 아미노산 또는 극성 비하전 아미노산으로의 C41의 적어도 하나의 치환을 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 적어도 하나의 치환 C41R 또는 C41S를 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 하전 아미노산 또는 극성 비하전 아미노산으로의 L62의 적어도 하나의 치환을 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 적어도 하나의 치환 L62I를 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 하전 아미노산 또는 극성 비하전 아미노산으로의 V64 L62의 적어도 하나의 치환을 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 적어도 하나의 치환 V64F를 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 Y65의 적어도 하나의 치환을 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 극성 비하전 아미노산으로의 S67의 적어도 하나의 치환을 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 적어도 하나의 치환 S67N을 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 소수성 아미노산으로의 A73의 적어도 하나의 치환을 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 적어도 하나의 치환 A73G를 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 소수성 아미노산으로의 R84의 적어도 하나의 치환을 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 적어도 하나의 치환 R84L을 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 극성 비하전 아미노산으로의 F89의 적어도 하나의 치환을 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다. 일 실시예에서, 기준 단백질은 적어도 하나의 치환 F89S를 포함하는 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 MNEI이고, 치환될 아미노산은 하기의 아미노산 E2, I8, F11, N14, G16, K17, F18, V20, D21, E23, Q28, R31, T33, N35, C41, L62, V64, S67, A73, R84 또는 F89 중 적어도 하나이다.
MNEI의 아미노산 치환은 여러 돌연변이를 포함하여 이전에 보고되었다. 예를 들어, Zheng 등은 개선된 감미 및 안정성을 갖는 신규한 이중 돌연변이체 MNEI-기반 단백질을 보고하였다. 구체적으로, Zheng 등은 MNEI에서 단일 치환 E2N이 3배 개선된 감미 및 약간 감소된 안정성을 야기함을 입증하였다. Zheng 등은 E2N 치환 이외에, 추가 치환인 E23A 또는 Y65R을 도입하는 것 (예를 들어, E2N/E23A, E2N/Y65R)이 감미에 영향을 미치지 않았음을 추가로 나타내었다.
상기 기재된 바와 같이, 아미노산 E23은 CPD 분석 동안 단백질 안정성에 중요한 것으로 확인되었다. 따라서, 상대적으로 매립된 MNEI의 위치 23 (E23)에 있는 하전 글루타메이트는 소수성 아미노산으로 대체되었다.
아래의 예에서도 본 명세서에 나타난 바와 같이, 위치 E2, E23 및 Y65에서의 아미노산에서 3개의 치환을 포함하는 변형된 단백질은 놀랍게도 6 내지 7배 개선된 감미 및 다른 성분 (스테비아와 같은 다른 감미료 포함)과의 상승작용 및 관능 프로파일과 같은 잠재적으로 다른 개선된 특성을 야기하였다. 이론에 얽매이지 않고, 삼중 치환이 변형된 단백질의 감미에 상승 효과를 야기하는 것으로 제안되었다. 또한 하기에 나타난 바와 같이, 위치 E2, E23 및 Y65에서의 아미노산에서 3개의 치환을 포함하는 변형된 단백질은 MNEI와 동일한 범위의 REU를 가지며, 이는 REU가 치환이 안정성을 방해하지 않음을 나타낸다는 것을 시사한다.
따라서, 일 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호: 5의 잔기 E2, E23 및 Y65에서 적어도 3개의 아미노산 치환을 포함하는, 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 변형된 단백질에 관한 것이며, 여기서 변형된 단백질은 서열번호: 5와 비교하여 적어도 하나의 개선된 식품-관련 특성을 가진다.
이러한 실시예에 따르면, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 MNEI이고 설계 단백질은 서열번호: 5의 아미노산 E2, E23 및 Y65에서 적어도 3개의 치환을 포함한다는 것을 이해해야 한다.
아미노산 E2, E23 및 Y65 각각은 임의의 아미노산으로 치환될 수 있다. 일 실시예에서, 아미노산 (잔기) E2에서의 아미노산 치환은 E2R, E2H, E2K, E2D, E2S, E2T, E2N, E2Q, E2C, E2G, E2P, E2A, E2V, E2I, E2L, E2M, E2F, E2Y, E2W 중 어느 하나일 수 있다. 일 실시예에서, 아미노산 (잔기) E23에서의 아미노산 치환은 E23R, E23H, E23K, E23D, E23S, E23T, E23N, E23Q, E23C, E23G, E23P, E23A, E23V, E23I, E23L, E23M, E23F, E23Y, E23W 중 어느 하나일 수 있다. 일 실시예에서, 아미노산 (잔기) Y65에서의 아미노산 치환은 Y65R, Y65H, Y65K, Y65D, Y65E, Y65S, Y65T, Y65N, Y65Q, Y65C, Y65G, Y65P, Y65A, Y65V, Y65I, Y65L, Y65M, Y65F 및 Y65W 중 어느 하나일 수 있다.
일 실시예에서, MNEI인 기준 단백질에서 적어도 3개의 아미노산 치환 중 적어도 하나, 적어도 둘 또는 적어도 셋은 보존적 치환이다.
일 실시예에서, 치환될 적어도 3개의 아미노산 중 적어도 하나는 아미노산 E2이고, 하전 잔기, 임의로 음전하 아미노산으로 치환된다. 일 실시예에서, 치환될 적어도 3개의 아미노산 중 적어도 하나는 아미노산 E2이고, 산성 잔기로 치환된다. 일 실시예에서, 치환될 적어도 3개의 아미노산 중 적어도 하나는 아미노산 E2이고, 극성 잔기로 치환된다. 일 실시예에서, 치환될 적어도 3개의 아미노산 중 적어도 하나는 E2N, E2D, E2Q, E2R 또는 E2K이다. 일 실시예에서, 치환될 적어도 3개의 아미노산 중 적어도 하나는 E2N, E2D 또는 E2Q이다. 일 실시예에서, 치환될 적어도 3개의 아미노산 중 적어도 하나는 E2N이다.
일 실시예에서, 치환될 적어도 3개의 아미노산 중 적어도 하나는 아미노산 E23이고, 하전 잔기, 임의로 음전하 아미노산으로 치환된다. 일 실시예에서, 치환될 적어도 3개의 아미노산 중 적어도 하나는 아미노산 E23이고, 산성 잔기로 치환된다. 일 실시예에서, 치환될 적어도 3개의 아미노산 중 적어도 하나는 아미노산 E23이고, 극성 잔기로 치환된다. 일 실시예에서, 치환될 적어도 3개의 아미노산 중 적어도 하나는 E23N, E23D, E23Q, E23R 또는 E23K이다. 일 실시예에서, 치환될 적어도 3개의 아미노산 중 적어도 하나는 E23N, E23D 또는 E23Q이다.
일 실시예에서, 치환될 적어도 3개의 아미노산 중 적어도 하나는 아미노산 Y65이고, 방향족 잔기로 치환된다. 일 실시예에서, 치환될 적어도 3개의 아미노산 중 적어도 하나는 아미노산 Y65이고, 비극성 소수성 잔기로 치환된다. 일 실시예에서, 치환될 적어도 3개의 아미노산 중 적어도 하나는 Y65F, Y65W, Y65H, Y65V, Y65I, Y65L, Y65M, Y65C, Y65A, Y65T, Y65S, Y65P, Y65G, Y65K 및 Y65R이다. 일 실시예에서, 치환될 적어도 3개의 아미노산 중 적어도 하나는 Y65K 및 Y65R이다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 MNEI이고, 치환될 적어도 3개의 아미노산 중 적어도 하나는 E2N, E2D, E2Q, E2R, E2K, E23N, E23D, E23Q, E23R, E23K, Y65F, Y65W, Y65H, Y65V, Y65I, Y65L, Y65M, Y65C, Y65A, Y65T, Y65S, Y65P, Y65G, Y65K 및 Y65R로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 MNEI이고, 적어도 3개의 치환은 E2N, E23V, E23A, Y65K, 및 Y65R로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 MNEI이고, 적어도 3개의 치환은 E2N, E23V 및 Y65K로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 MNEI이고, 적어도 3개의 치환은 E2N, E23A 및 Y65R로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 하기의 아미노산 서열을 가진다:
GNWEIIDIGPFTQNLGKFAVDEVNKIGQYGRLTFNKVIRPCMKKTIYENEGFREIKGYEYQLYVKASDKLFRADISEDYKTRGRKLLRFNGPVPPP (서열번호: 16). 서열번호: 16은 본 명세서에서 DM08로 표시된다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 하기의 아미노산 서열을 가진다:
GNWEIIDIGPFTQNLGKFAVDEANKIGQYGRLTFNKVIRPCMKKTIYENEGFREIKGYEYQLYVRASDKLFRADISEDYKTRGRKLLRFNGPVPPP (서열번호: 17). 서열번호: 17은 본 명세서에서 DM09로 표시된다.
일 측면에 따르면, 기준 단백질은 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열을 가진다. 하기 실시예 2에 나타난 바와 같이, CPD 분석은 치환에 중요한 것으로 제안된 여러 아미노산 치환을 나타내었다.
따라서, 일 측면에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 아미노산을 포함하는, 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 변형된 단백질에 관한 것이며, 여기서 변형된 단백질은 서열번호: 1과 비교하여 적어도 하나의 개선된 식품-관련 특성을 가진다.
일 실시예에서, 기준 단백질은 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지며, 치환될 아미노산은 하기의 아미노산 A1, T2, F3, E4, V, R8, S10, Q30, N32, S33, E35, S36, W37, T38, I39, N40, A52, A88, N93, I100, N104, M112, N113, F114, S115, T117, T118, R119, V124, R125, A127, A128, D129, V131, G132, Q133, A136, K137, K139, A140, G142, A148, F152, T154, Y157, G165, P166, E168, Y169, R171, L176, D179, V191, S196, S197, N198, R200, T202, T206 또는 A207 중 적어도 하나이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 변형된 단백질은 개선된 식품-관련 특성을 가진다. 변형된 단백질의 감미 효능 (설탕-유사 향미), 이미의 부족, 감소된 개시 시간 및 감소된 여운 맛과 같은 단백질의 감미 프로파일은 당해 기술분야에 알려진 임의의 알려진 맛 시험에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 수크로오스 또는 다른 감미료의 감미에 대한 비교는 맛 패널에 의해 이루어질 수 있으며, 감미 효능은 하기 실시예에 상세히 설명된 바와 같이 등급이 매겨질 수 있다.
비교는 예를 들어 달콤함을 유발하는데 필요한 최소 농도 또는 감미 프로파일, 감미 개시 시간, 여운 맛, 식감(mouthfeel), 뒷맛(aftertaste), 이미, 및 원치 않는 맛의 차폐와 같은 특성 포함하여 감미 프로파일의 평가를 결정함으로써 알려진 감미료, 예를 들어, 수크로오스와 비교하여 변형된 단백질의 역치를 결정할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 감미-영향 특성은 약 0.28mg/L 이상의 감미 역치, 약 1 내지 20 초, 때로는 2 내지 18 초, 때로는 2-4 초의 감미 지속시간 중 적어도 하나에 의해 결정된 달콤함을 포함한다.
기준 단백질과 유사한 변형된 단백질은 감미 수용체에 결합한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 중량 기준으로 설탕보다 300-16,000 높은 감미 역치를 인지하였다.
관능 프로파일은 일반적으로 시간에 따른 맛 강도를 나타내는 가우스 (gaussian)인 맛 동역학, 즉 개시 지속시간 (맛을 느낄 때까지의 시간), 맛 지속시간 및 여운 맛의 시간 (가우스의 꼬리에 해당)을 포함한다. 추가 특징은 이미 (예를 들어, 다른 수용체와의 결합으로 인한), 맛의 부드러움, 금속 및 기타 측면-맛 (side-tastes), 다른 성분과의 상승작용 (예를 들어, 다른 향미 또는 이들의 원치 않는 맛, 예를 들어 스테비아의 차폐 및 증강) 등을 포함한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 단백질과 동일하거나 또는 개선된 하기 중 적어도 하나를 특징으로 한다: (1) 구조적 열 안정성 (2) 기능적 열 안정성, (3) pH 안정성 (4) 물 또는 부분적으로 수성 환경(aqueous milieu) (예를 들어, 지방 함유 식품)에서의 용해도 또는 (5) 유통기한 안정성.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 단백질과 동일하거나 또는 개선된 구조적 열 안정성을 가진다.
본 명세서에서 사용된 용어 "구조적 열 안정성" 또는 "열 안정성"은 기준 단백질의 온도보다 높은 온도에서 3D 구조를 유지하는 변형된 단백질의 능력을 나타낸다. 단백질의 3D 구조적 안정성은 원형 이색성 (Circular Dichroism, CD)과 같은 당해 기술분야에 알려진 임의의 방법, 또는 시차 주사 형광측정법 (Differential Scanning Fluorimetry, DSF) 또는 시차 주사 열량측정법 (Differential Scanning Calorimetry, DSC)과 같은 열 이동 분석에 의해 측정될 수 있다. 단백질의 3D 구조는 단백질의 기능에 영향을 미칠 수 있다. 특히, 식음료 제품에 필요한 유통기한 및 열 안정성은 구조적 열 안정성과 관련이 있을 수 있으며 다양한 측정가능 항목으로 이루어진다, 예를 들어 저온 살균은 상이한 프로토콜에 의해 적용될 수 있으며 매우 짧은 시간 동안 단백질 구조를 유지하는 내열성과 관련이 있다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 단백질과 동일하거나 또는 더 높은 기능적 열 안정성을 가진다. 본 명세서에서 사용된 용어 "기능적 열 안정성"은 기준 단백질과 비교하여 고온에 노출된 후 기능을 유지하는 변형된 단백질의 능력을 나타낸다.
일 실시예에서, 본 명세서에서 변형된 단백질은 제한될 수 있는 시간 동안 고온에 노출된 후 또는 고온에서 감미 효과를 유지할 수 있다. 다시 말해서, 제품을 실온보다 높은 온도, 때로는 최대 50℃, 때로는 최대 100℃, 또는 심지어 최대 150℃까지 노출한 후 감미- 또는 관능- 프로파일에 감지된 변화가 없다. 단백질 기능, 예를 들어 가장 달콤한(sweetest)은 감각 시험(sensational test)으로 측정될 수 있다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 단백질과 동일하거나 또는 더 높은 pH 안정성을 가진다. pH 안정성은 제품을 3 내지 8의 임의의 pH, 때로는, 4 내지 8의 pH에서 노출시킨 후, 기준 단백질에 비해 더 넓은 pH 범위에서 변형된 단백질의 안정성을 나타낸다. (즉, 변형된 단백질은 3D 구조 및/또는 기능을 유지함). 예를 들어, 감미 단백질 중 일부는 안정하지 않고 즉시 또는 음료의 일반 유통기한보다 짧은 시간 후에 기능을 잃는 경우, 콜라와 같은 소다는 2.3-2.5의 pH를 가진다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 단백질에 비해 더 높은 용해도를 가진다. 용해도는 지방 함유 식품과 같은 수성, 부분 수성 또는 비-수성 환경에 있을 수 있다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 단백질에 비해 개선된 유통기한을 가진다. 개선된 유통기한은 제품을 최대 150℃의 임의의 온도, 때로는, 4℃ 내지 150℃의 임의의 온도, 또는 100℃에 노출한 후. 조성물을 포함하는 제품의 감미 (기능) 또는 물리적 열화 (예를 들어, 색상 변화, 상 분리 등)에 감지된 변화가 없음을 나타낸다.
일부 다른 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 단백질과 동일하거나 또는 개선된 하기 중 적어도 하나를 특징으로 한다: (1) 접힘 동역학, (2) 단백질의 번역-후 변형 (예를 들어, 글리코실화) 패턴이 기준 단백질에 비해 상이하다, (3) 이황화 결합의 수가 기준 단백질에 비해 낮다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 기준 단백질과 동일하거나 또는 더 높은 접힘 동역학을 가진다. 즉, 비접힌 또는 부분적으로-접힌 구조에서 단백질 접힘 속도가 더 빠르다 (예를 들어, 분자 역학 또는 in vitro 또는 in vivo 실험 방법에 의해 in silico에서 평가됨). 대안적으로, 더 빠른 접힘 동역학도 예를 들어, 변성제 적정(denaturant titrations) (예를 들어, 염화 구아니디늄 및/또는 고-농도 우레아) 또는 기타 방법에 의해 변성 실험에서 더 느린 비접힘 동역학을 나타낸다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 평가된 숙주 유기체에서 기준 단백질과 동일하거나 또는 더 높은 발현 수율을 특징으로 한다.
일 실시예에서, 변형된 단백질은 7.8 내지 8.4의 PI 값을 가진다.
달콤한 맛 및 잠재적으로 다른 맛 효과 (원치 않는 맛의 차폐, 덜한 뒷맛, 덜한 여운 맛, 덜한 이미, 덜한 여운 맛 개시, 감칠맛(umami taste))를 특징으로 하는 본 명세서에 기재된 변형된 단백질은, 경구 전달용 제품의 제조에서 감미료로 사용될 수 있다.
변형된 단백질은 향미 변형제 또는 향미 증강제로 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 단백질은 경구 제품으로 사용하기 위한 것이다. 일 실시예에서, 제품은 식품, 식품 보충 제품 또는 약제이다. 제품의 제조를 위해, 본 명세서에 기재된 단백질은 임의의 식품 등급 첨가제와 조합될 수 있다. 식품은 미세 분말, 동결건조물, 과립, 정제 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 고체 건조 형태로 제공되고 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 조성물은 액체 형태, 예를 들어, 물 (수용액)에서 용질로 제공된다.
단백질을 포함하는 제품은 다양한 적용이 가능하다. 이것은 식음료 산업 (청량 음료, 즉석 음료, 시럽, 기능성 음료, 스포츠 음료 등), 낙농 산업, 즉 낙농 제품, 요구르트 및 푸딩, 제약 산업, 자연 요법 산업(naturopathic industry), 기능 식품 산업(nutraceutical industry) 및 기타 건강관리 제품 (예를 들어, 치약, 구강 세정제); 사탕 및 껌 산업, 또는 부형제 또는 첨가제로 향미 변형 조성물의 사용을 필요로 하는 임의의 기타 적용에서 감미료, 향료, 증강제 또는 차폐제로의 활용을 포함하나, 이에 한정되지 않는다 (이하 각각은 본 발명의 별도 실시예를 구성함).
제품은 추가 식품 성분을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 식품 성분은 감미료, 예를 들어 스테비아이다. 하기 실시예에 나타난 바와 같이, 본 명세서에 기재된 변형된 단백질 및 스테비아의 조합은 상승 효과를 생성하였다. 따라서, 일 실시예에서, 제품은 서열번호: 16 또는 서열번호: 17로 표시되는 적어도 하나의 변형된 단백질 및 스테비아를 포함한다.
본 발명에 따른 변형된 단백질은 당해 기술분야에 알려진 임의의 방법으로 제조될 수 있으며, 예를 들어 단백질은 재조합 DNA 기술에 의해 또는 발효기를 통해 미생물에서 또는 식물 또는 식물 캘러스(plant callus) 또는 기타 생물반응기에서 단백질 생성에 의해 합성적으로 제조될 수 있다는 점에 유의해야 한다. 일 실시예에서, 변형된 단백질은 박테리아, 예를 들어 E. Coli에서 제조될 수 있다. 일부 다른 실시예에서, 변형된 단백질은 효모, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 제조될 수 있다. 일 실시예에서, 선택된 아미노산 서열의 DNA 서열은 RNA 및 DNA 수준에서 최적화된다. RNA 수준에서는 RNA 2차 구조의 최소화를 포함하여 리보솜으로의 빠른 삽입을 보장한다. DNA 수준에서는 숙주 유기체에 대한 코돈 최적화 (RNA 수준 최적화 고려)를 포함한다. 코돈-사용 최적화는 발현된 각 아미노산에 대해 숙주 유기체에서 가장 풍부한 tRNA를 사용하기 위한 선호도를 제공한다.
상기와 관련하여, 제공된 경우, 예를 들어 10%, 50%, 120%, 500% 등과 같은 백분율 값은, 각각 "배 변화(fold change)" 값, 즉, 0.1, 0.5, 1.2, 5 등과 상호교환할 수 있음을 이해해야 한다.
본 명세서에서 사용된 모든 과학 기술 용어는 달리 명시되지 않는 한 당해 기술분야에서 일반적으로 사용되는 의미를 가진다. 본 명세서에 제공된 정의는 본 명세서에서 자주 사용되는 특정 용어에 대한 이해를 돕기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것을 의미하지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "약"은 ± 10%를 나타낸다. 용어 "포함하다 (comprises)", "포함하는(comprising)", "포함하다(includes)", "포함하는 (including)", "갖는(having)" 및 이들의 접합체는 "포함하나 이에 한정되지 않는"을 의미한다. 용어 "본질적으로 이루어지는"은 조성물, 방법 또는 구조가 추가 성분, 단계 및/또는 부분을 포함할 수 있으나, 추가 성분, 단계 및/또는 부분이 청구된 조성물, 방법 또는 구조의 기본적 및 신규한 특성을 실질적으로 변경하지 않는 경우만을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "약"은 최대 1%, 더 구체적으로 5%, 더 구체적으로 10%, 더 구체적으로 15%, 어떤 경우에는 나타낸 값보다 최대 20% 더 높거나 또는 더 낮은 편차가 있을 수 있는 값을 나타내고, 편차 범위는 정수 값을 포함하고, 적용가능한 경우, 비-정수 값도 연속 범위를 구성한다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 내용이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다.
본 명세서에 개시된 주제를 더 잘 이해하고 이것이 실제로 수행될 수 있는 방법을 예시하기 위하여, 실시예는 이제 첨부된 도면을 참조하여 비-제한적인 예로서만 기재될 것이다:
도 1은 MNEI 및 MNEI-기반 변형된 단백질의 감미 평균 점수를 나타내는 히스토그램이다.
도 2는 MNEI 및 MNEI-기반 변형된 단백질의 감미 평균 점수를 나타내는 히스토그램이다.
도 3은 피치아(pichia) 균주에서 발현 실험의 아크릴아미드 겔이다.
도 4a 내지 4c는 TAS1R2 및 TAS1R3에 도킹하는(docking) 타우마틴 수용체의 3개의 결합 부위의 표시(representations)이다.
도 1은 MNEI 및 MNEI-기반 변형된 단백질의 감미 평균 점수를 나타내는 히스토그램이다.
도 2는 MNEI 및 MNEI-기반 변형된 단백질의 감미 평균 점수를 나타내는 히스토그램이다.
도 3은 피치아(pichia) 균주에서 발현 실험의 아크릴아미드 겔이다.
도 4a 내지 4c는 TAS1R2 및 TAS1R3에 도킹하는(docking) 타우마틴 수용체의 3개의 결합 부위의 표시(representations)이다.
비-제한적인 실시예
실시예 1 - MNEI 기반 단백질의 설계 및 특징화
실시예 1A:
MNEI 기반 단백질의 설계
MNEI-기반 단백질의 설계는 하기와 같이 수행되었다: 단일-사슬 모넬린인 MNEI는 ~11kD의 분자량 및 ~8.7의 pI를 갖는, 96개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드이다. MNEI는 서열번호: 5로 표시된다.
계산 방법
상기 기재된 바와 같이, 계산 및 인간-전문가 분석은 계산적으로 또는 전문가에 의해 또는 실험적으로 또는 이들 방법의 조합에 의해 더 분석될 수 있는 감소 된 서열 공간을 제공한다. 이러한 분석은 개별 아미노산, 아미노산 클러스터 또는 기타 조합에 적용될 수 있다.
CPD 과정 동안, 수용체에 대한 결합 부위의 일부가 되는 경향이 적은 특정 영역, 예를 들어 나선형 주변 및 단백질의 코어를 형성하는 베타-시트의 비-노출면에서 아미노산 대체가 허용되었다. ROSETTA 실행은 160K 모델에서 결과를 얻었다. 모든 모델의 에너지가 그려졌을 때, 결과 그래프는 로짓 함수(logit function)의 형태를 가진다. 로짓 함수 (로그-확률(log-odds)이라고도 알려짐)는 확률의 로그 p/(1-p) (여기서, p는 확률(probability)임)이다. 이것은 S자형(sigmoidal) "로지스틱 (logistic)" 함수의 역이다.
추가 분석을 위해, 5K 최저 모델을 선택하였다. REU의 함수로 (MNEI와 비교 하여) 대체 횟수를 플로팅하면 가우스 분포가 제공되어, 모집단이 정상이며 추가 분석에 유효함을 나타낸다.
표 1은 모든 기준 단백질 서열에 걸쳐있는 특정 잔기에서 수행된 CPD가 MNEI의 모든 2차 구조 요소에 걸쳐있는 알파-나선형, 베타-시트 및 루프의 대체를 제안하였음을 나타낸다.
중요하게도, 사소하지 않은(non-trivial) 대체가 확인되었다. 예를 들어, V64F의 대체는 베타-시트에 큰 비-베타-시트 아미노산을 도입하였다. 베타-시트 영역에서 대부분의 대체는 이의 3차 구조를 보호하기 위하여 베타-시트 아미노산으로 대체된다.
표 1에서, 또한 대부분의 매립 위치에 대해 CPD 제안은 Leu, Ala 또는 Val과 같은 소수성 잔기로의 대체에 대한 것임을 알 수 있다. 이러한 대체는 단백질의 코어를 안정화시켜 안정성 및 유통기한을 촉진할 수 있다. 그럼에도 불구하고, CPD는 대체가 극성 또는 하전 잔기 (예를 들어, N14K)인 경우가 거의 없다. 이러한 대체는 MNEI의 코어를 안정화시킬 것 같지 않다. 주의깊게 살펴보면, 이러한 놀라운 대체는 다른 잔기 또는 물 분자와 수소 결합을 형성할 가능성이 있는 것 같다.
표면이 완전히- 또는 부분적으로-노출된 위치는 대부분 물과 상호작용하고 MNEI를 안정화할 수 있는 극성 또는 하전 잔기로 대체된다. 그러나, CPD가 소수성 잔기, 예를 들어 R84L로의 대체를 제안하는 예상치 못한 경우가 있다. 이러한 경우는 예상치 못한 독특한 것이며, MNEI의 3D 구조의 검사로 설명되지 않을 것 같다.
| MNEI의 아미노산 유형 및 위치 | MNEI의 아미노산 영역 | 아미노산의 2차 구조 영역 | CPD 높은-선호도 제안된 치환 |
| I8 | 노출됨 | 루프 | T/I/V |
| F11 | 노출됨 | 나선형 | F/D/E |
| N14 | 대부분 매립됨 | 나선형 | K/E |
| G16 | 매립됨 | 나선형 | G/A |
| K17 | 노출됨 | 나선형 | K/E/R |
| F18 | 부분적으로 노출됨 | 나선형 | F/D |
| V20 | 대부분 매립됨 | 나선형 | V/A |
| D21 | 노출됨 | 나선형 | K/R/E |
| E23 | 대부분 매립됨 | 나선형 | T/A |
| Q28 | 노출됨 | 루프 | K |
| R31 | 노출됨 | 루프 | V |
| T33 | 매립됨 | 루프 | V |
| N35 | 노출됨 | 베타 | V |
| C41 | 대부분 매립됨 | 루프 | R/S |
| L62 | 매립됨 | 베타 | I/L |
| V64 | 매립됨 | 베타 | F |
| S67 | 부분적으로 노출됨 | 루프 | N |
| A73 | 매립됨 | 베타 | G/A |
| R84 | 노출됨 | 베타 | L |
| F89 | 대부분 매립됨 | 베타 | S/F |
또한, CPD 과정 동안, 단백질의 분석 후 특정 아미노산을 선택하였고, 아미노산 E23은 안정성을 위한 중요한 잔기로 확인되었다. 이 아미노산 단독 또는 조합의 기여는 CPD에 의해 시험되었다. 표 2는 이러한 분석의 REU 값을 나타낸다.
| 아미노산 치환 | REU |
| E2H | -197.945 |
| E2M | -198.603 |
| E2N | -201.348 |
| E2Q | -201.655 |
| E2N/E23A | -198.488 |
| E23A | -199.430 |
| E23Q | -198.000 |
| E23T | -197.985 |
| E23V | -198.724 |
| E23S | -197.037 |
표 3은 상기에 상세히 설명된 대로 설계된 변형된 MNEI 기반 단백질 (설계자 단백질)의 서열을 나타낸다.
| 서열번호: | 서열 |
| 서열번호: 15(DM03) | GNWEIIDTGPFTQKLGKFAVDEANKIGKYGTLTFTKVIRPTMKKTIYENEGFREIKGYEYQLYVKANDKLFRADISEDYKTRGLKLLRFNGPVPPP |
| 서열번호: 16(DM08) | GNWEIIDIGPFTQNLGKFAVDEVNKIGQYGRLTFNKVIRPCMKKTIYENEGFREIKGYEYQLYVKASDKLFRADISEDYKTRGRKLLRFNGPVPPP |
| 서열번호: 17(DM09) | GNWEIIDIGPFTQNLGKFAVDEANKIGQYGRLTFNKVIRPCMKKTIYENEGFREIKGYEYQLYVRASDKLFRADISEDYKTRGRKLLRFNGPVPPP |
| 서열번호: 18(DM010) | GEWEIIDIGPFTQNLGKFAVDEENKIGKYGTLTFTKVIRPCMKKTIYENEGFREIKGYEYQLYVYANDKLFRADISEDYKTRGRKLLRFNGPVPPP |
| 서열번호: 19(DM11) | GEWEIIDTGPFTQKLGKFAVDEENKIGQYGRLTFNKVIRPTMKKTIYENEGFREIKGYEYQLYVYASDKLFRADISEDYKTRGLKLLRFNGPVPPP |
| 서열번호: 20(DM12) | GEWEIIDTGPFTQNLGKFAVDEENKIGQYGRLTFNKVIRPTMKKTIYENEGFREIKGYEYQLYVYASDKLFRADISEDYKTRGLKLLRFNGPVPPP |
단백질을 1L 고밀도 발효에서 발현시키고, 이온 교환 크로마토그래피에 이어 크기 배제 크로마토그래피에 의해 >90% 수준으로 정제하였다.
표 4는 신규한 설계자 단백질의 구조적 특징화를 나타낸다.
실시예 1B: 청량 음료 모델 용액에서 설계자 MNEI 기반 단백질에 대한 달콤한 맛 역치의 관능 평가(Sensory evaluation)
이 연구의 목적은 신규한 MNEI-기반 단백질 및 MNEI의 달콤한 맛 역치를 평가하고 신규한 단백질 DM08 및 DM10의 맛 역치를 추정하는 것이었다.
방법:
수크로오스에 대한 본 명세서에 기재된 MNEI-기반 단백질의 감미 효능은 일반적으로 1:700 내지 1:16,000의 범위이다. 따라서, 비교를 위해, MNEI-기반 단백질 및 MNEI (기준 단백질) 용액을 처음에 1:1000으로 희석하였고, 필요에 따라 추가로 희석하였다. 일반적으로, 청량 음료에서 대부분의 사람들에게 설탕의 감미 역치는 0.32% - 1.0%이다. 이에 따라 MNEI-기반 단백질 및 MNEI (기준 단백질) 농도의 계산을 수행하였다.
이 연구에서 사용된 용액은 표 5에 상세히 설명되어 있다. 용액은 하기와 같이 제조되었다: 각 용액에 대해, 표 5에 표시된 양의 감미료 (수크로오스/ MNEI/설계자 (변형된) 단백질; 상세한 내용은 표 1 참조)를 첨가하고, 용액을 (1% 설탕 당량 감미료를 얻기 위해) 물로 100g으로 완성하였다. 20ml의 각 용액을 시음 컵 (tasting cup)에 붓고, 각 시료를 표 5에 따라 맹검(blind testing) 용으로 표시하였다.
| 달콤한 맛 분자 | 추정 농도 |
단백질 순도
[%] |
100ml 1:1,000 1% 감미 강도 (수크로오스에 비해)에 대해 추가할 양 | 시료 세부사항 & 희석 인자 |
| 수크로오스 - 기준 시료 일반 설탕 |
NA | NA | 1gr | A: 물 A1: 1:200 (0.5%) A2: 1:100 (1.0%) |
| MNEI | 7.5 mg/ml | >90% | B1: 1:1,000 | |
| DM08 | 2.1 mg/ml | >90% | 4.76 ml | C1: 1:1,000 |
| DM10 | 3.2 mg/ml | >90% | 3.13 ml | D1: 1:1,000 |
시험 과정:
제조된 용액 중 각각에 대한 감미 역치를 평가하기 위해, 이중-맹검 맛 분석을 수행하였다. 시험된 시료는 MNEI, 2개의 MNEI 설계자 단백질 (DM08 및 DM10), 수크로오스 및 광천수(mineral water)를 포함하였다. 맛 분석 직전에 단백질의 저장 용액을 광천수 (pH 6.9)로 희석하여 일련의 농도를 준비하였다 (표 6). 30-50세의 5명의 건강한 평가자(assessors) (2명의 남성 및 3명의 여성)가 이 세션에 참여하였으며, 이들 중 3명은 훈련된 감식가(taster)였다.
설탕 용액과 비교하여, 20 ml의 시료를 무작위로 시험하였다. 각 분석 전에, 평가자는 입안을 물로 헹구고 잔류 맛이 남아 있지 않을 때까지 중성-맛 크래커를 먹도록 요청받았다. 시험 용액을 적어도 10초 동안 입안에 두었다. 그 다음, 평가자는 0-10 사이의 반응에 따라 시료의 등급을 매겼다; 0 - 달콤한 인식이 없음, 10 - 매우 달콤함.
감미 검출 역치는 감식가가 시료를 달콤한 것으로 인정한 최저 농도로 정의되었다. 감미 효능은 수크로오스와 관련하여 보고된다.
결과 및 논의
대부분의 참가자들은 0.5% 수크로오스 용액이 0.63 ± 0.6의 평균 점수로 달콤하다고 인정하였다. 1% 수크로오스 용액의 평균 점수는 1.25 ± 0.9 이었으며, 이는 선형 용량 반응(linear dose response)을 나타낸다 (자료는 표시되지 않음).
유사한 패턴이 MNEI에 대해 관찰되었다: 각각 1:4,000, 1:2,000 및 1:1,000의 희석 인자에 대해 0.68 ± 0.2, 0.98 ± 0.4 및 2.2 ± 1.0. 이러한 결과는 MNEI 감미 역치가 1 0Bx 인식을 모의실험하는(simulating) 약 2,000의 감미 효능으로, 1:2,000에 가깝다는 것을 나타내었다.
MNEI 설계자 단백질 DM08과 관련하여, 선형 용량 반응 곡선도 약 1:12,000의 감미 역치, 1 0Bx 인식을 모의실험하는 약 10,000의 감미 효능으로, 1:12,000 - 1:1,000의 희석 범위를 나타내었다.
MNEI 설계자 단백질 DM10도 1:1,000에 가까운 감미 역치 및 1 0Bx 인식을 모의실험하는 약 1,000의 감미 효능으로 선형 곡선을 제시하였다.
도 1은 상기 기재된 용액의 감미 평균 점수의 요약을 나타낸다.
실시예 1C: 용액 내 MNEI에 대한 달콤한 맛 역치의 관능 평가
이 연구의 목적은 감미 MNEI-기반 설계자 단백질 특성을 특징화하고, 달콤한 것으로 검출되거나 또는 인정될 수 있는 달콤한 맛의 최저 농도로 정의된 달콤한 맛 역치를 평가하는 것이었다. 이 연구에서, 새로운 설계자 MNEI-기반 단백질 DM09, DM11 및 DM12의 맛 역치를 시험하였다.
방법:
상기에 언급한 바와 같이, 설탕에 비해 감미 단백질의 감미 효능은 식품 조성에 따라 다르며 일반적으로 1:700 내지 1:3,000의 범위이다. 결과적으로, 감미 단백질 용액을 처음에 1:1000으로 희석하였고, 필요에 따라 추가로 희석하였다.
청량 음료에서 대부분의 사람들에게 설탕의 감미 역치는 0.32% - 1.0%이다. 이에 따라 MNEI 및 MNEI-기반 단백질 농도의 계산을 수행하였다.
이 연구에서 사용된 용액은 표 4에 상세히 설명되어 있다. 용액은 하기와 같이 제조되었다: 각 용액에 대해, 표 6에 표시된 양의 감미료 (수크로오스/ MNEI / 설계자 (변형된) 단백질; 상세한 내용은 표 1 참조)를 첨가하고, 용액을 (1% 설탕 당량 감미료를 얻기 위해) 물로 100g으로 완성하였다. 20ml의 각 용액을 시음 컵에 붓고, 각 시료를 표 6에 따라 맹검용으로 표시하였다.
| 달콤한 맛 분자 | 추정 농도 |
단백질 순도
[%] |
100ml 1:1,000 1% 감미 강도 (수크로오스에 비해)에 대해 추가할 양 | 시료 세부사항 & 희석 인자 |
| 수크로오스 - 기준 시료 일반 설탕 |
NA | NA | 1gr | D: 물 D1: 1:200 (0.5%) D2: 1:100 (1.0%) |
| MNEI 이전 로트 기준 | 5.2 mg/ml | >90% | 1mg=214ul | A: 1:500 A1: 1:1,000 A2: 1:2,000 |
| DM09 | 2.97 mg/ml | >90% | 1mg=374ul | E3: 1:4,000 E4: 1:8,000 E5: 1:16,000 |
| DM11 | 2.76 mg/ml | >90% | 1mg=403ul | C: 1:500 C1: 1:1,000 C2: 1:2,000 |
| DM12 | 2.97 mg/ml | >90% | 1mg=214ul | B: 1:500 B1: 1:1,000 B2: 1:2,000 |
시험 과정:
제조된 용액 중 각각에 대한 감미 역치를 평가하기 위해, 이중-맹검 맛 분석을 수행하였다. 시험된 시료는 MNEI, 2개의 MNEI 설계자 단백질 (DM09, DM11 및 DM12), 수크로오스 및 광천수를 포함하였다. 맛 분석 직전에 단백질의 저장 용액을 광천수 (pH 6.9)로 희석하여 일련의 농도를 준비하였다 (표 6). 30-75세의 6명의 건강한 평가자 (5명의 남성 및 1명의 여성)가 이 세션에 참여하였으며, 이들 중 절반은 훈련된 감식가였다.
설탕 용액과 비교하여, 20 ml의 시료를 무작위로 시험하였다. 각 분석 전에, 평가자는 입안을 물로 헹구고 잔류 맛이 남아 있지 않을 때까지 중성-맛 크래커를 먹도록 요청받았다. 시험 용액을 적어도 10초 동안 입안에 두었다. 그 다음, 평가자는 0-10 사이의 반응에 따라 시료의 등급을 매겼다; 0 - 달콤한 인식이 없음, 10 - 매우 달콤함.
감미 검출 역치는 감식가가 시료를 달콤한 것으로 인정한 최저 농도로 정의되었다. 감미 효능은 수크로오스와 관련하여 보고된다.
결과 및 논의
물 감미 (대조군)는 0.5 ± 0.8의 평균값으로 감지되었다. 0이 아닌 값(non-zero value)은 이전 시료의 여운 효과 때문일 수 있다. 모든 참가자들은 0.5% 수크로오스 용액이 1.9 ± 0.9의 평균 점수로 달콤하다고 인정하였다. 1% 수크로오스 용액의 평균 점수는 3.8 ± 1.9 이었으며, 이는 선형 용량 반응을 나타낸다 (도 1).
유사한 패턴이 MNEI에 대해 관찰되었다: 각각 1:2,000, 1:1,000 및 1:500의 희석 인자에 대해 1.0 ± 0.7, 2.5 ± 1.4 및 4.7 ± 3.2. 이러한 결과는 MNEI 감미 역치가 1 0Bx 설탕 용액과 호환되는 약 1,000의 감미 효능으로, 1:1,000 내지 1:2,000임을 나타낸다.
모넬린 설계자 단백질 DM11과 관련하여, 시료 점수 (각각 1:500, 1:1,000 및 1:2,000의 희석 인자에 대해 0.0 ± 0.0, 0.3 ± 0.8 및 0.4 ± 0.9)에 나타난 바와 같이, 감미 효능이 500 미만인 것으로 보인다. 모넬린 설계자 단백질 DM12는 뚜렷한 용량 반응없이 모든 희석 인자에 대해 유사한 값 1.0을 나타내었다.
모넬린 설계자 단백질 DM09는 1 0Bx 설탕 용액을 모의실험하는 16,000 내지 8,000의 감미 효능으로 약 1:16,000의 감미 역치를 나타내는, 선형 용량 반응 곡선을 나타내었다.
결과는 도 2에 나타내었다.
실시예 1D: MNEI 및 MNEI 설계자 단백질의 감미 효능
상기 최적화를 기반으로 하여, DM08 및 DM09의 감미 효능, 뒷맛 및 여운 효과를 표 7에 나타난 바와 같이 MNEI 및 추가 감미료와 비교하여 시험하였다. 시험 방법은 설탕 용액과 비교하여 6명의 훈련된 참가자에서 각 단백질에 대한 맹검을 포함하였다.
알 수 있는 바와 같이, MNEI에 비해 MNEI 설계자 단백질에 대한 더 높은 감미 효능. MNEI 및 MNEI 변형된 단백질의 감미 역치는 시험된 실험에서 DM08이 설탕보다 10,000 중량이 더 크고 DM09가 설탕보다 15,000 더 크다는 점에 유의해야 한다. DM08에 대한 8 0BX 인식에서 감미 효능은 설탕보다 3,500 더 크고 DM09의 감미 효능은 설탕보다 4,000 더 크다는 것을 나타내는, 비-선형 용량 반응을 나타내었다.
또한, 상승 효과는 설탕 용액과 비교하여 6명의 참가자에서 다양한 조합의 맹검으로 시험되었다 (표 8).
| 물질 | 늦은 개시 | 여운 | 추가 뒷맛 & 주석 |
| 스테비아 REB A: DM08 (1:1) |
스테비아 또는 DM08만 포함된 시료에 비해 감소된 지연된 개시 (표 7) | 달콤한 여운 | 약간 감초* 뒷맛 기준보다 높은 감미 강도 |
| 스테비아 REB A: DM09 (1:1) | 스테비아 또는 DM09만 포함된 시료에 비해 감소된 지연된 개시 (표 7) | 달콤한 여운 | 약간 시큼한 & 감초 뒷맛* 기준보다 높은 감미 강도 |
| 스테비아 REB A: DM08 (0.1:1) | 스테비아 또는 DM08만 포함된 시료에 비해 감소된 지연된 개시 (표 7) | 달콤한 여운 | 약간 감초* 뒷맛 기준보다 높은 감미 강도 |
| 스테비아 REB A: DM09 (0.1:1) | 스테비아 또는 DM09만 포함된 시료에 비해 감소된 지연된 개시 (표 7) | 달콤한 여운 | 약간 시큼한 & 감초* 뒷맛 기준보다 높은 감미 강도 |
* 감초 유형 향미의 감각
1.0:1.0 - 0.1:1.0 범위 내의 스테비아/MNEI 비에 대해 MNEI 설계자 단백질 (DM08 / DM09 및 스테비아 (REB A)) 간의 상승 효과가 입증되었다: 따라서,
- 스테비아 + MNEI 설계자 단백질 DM08 및 DM09의 감미 효능은 첨가제 값보다 높았다.
- MNEI 설계자 단백질과 스테비아의 조합은 지연된 개시 및 전반적인 여운 및 기타 뒷맛을 감소시켰다.
추가 조합은 6명의 참가자에서 설탕 용액에 대한 다양한 조합의 맹검 비교로 시험되었다.
| 물질 | 늦은 개시 | 여운 | 뒷맛 |
| 수크로오스 - 기준 시료 | No | No | No |
| 스테비아 REB A (3.0 0BX 설탕 첨가) |
감소된 늦은 개시 | 감소된 달콤한 여운 | |
| DM08(3.0 0BX 설탕 첨가) | 감소된 늦은 개시 | 감소된 달콤한 여운 | |
| DM09(3.0 0BX 설탕 첨가) | 감소된 늦은 개시 | 감소된 달콤한 여운 | |
| 스테비아 REB A: DM08 (1:1) (3.0 0BX 설탕 첨가) |
거의 설탕 같음 (Almost like sugar) |
여운이 거의 없음 (Almost no lingering) |
설탕보다 부드러움 (Rounder than sugar) |
| 스테비아 REB A: DM09 (1:1) (3.0 0BX 설탕 첨가) |
늦은 개시가 거의 없음 (Almost no late onset) |
감소된 달콤한 여운 | |
| 스테비아 REB A: DM08 (0.1:1) (3.0 0BX 설탕 첨가) |
거의 설탕 같음 | 여운이 거의 없음 | 설탕보다 부드러움 |
| 스테비아 REB A: DM09 (0.1:1) (3.0 0BX 설탕 첨가) |
늦은 개시가 거의 없음 | 감소된 달콤한 여운 |
모든 시험된 시료는 감소된 늦은 개시 및 감소된 여운 및 기타 뒷맛과 함께, 설탕 (3 0Bx)의 존재 하에 더 좋은 맛 성능을 나타내었다.
스테비아/DM08 (E & G)의 혼합물은 설탕과 같은 맛 프로파일로 강조되었다.
나타난 바와 같이, 모든 시험된 변형된 단백질은 동일하거나 또는 개선된 감미 및 DM12에 의해 MNEI, DM09와 유사한 수준으로 적어도 동일하거나 또는 개선된 용융 온도로 설명된 밝혀진 달콤한 맛을 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 2 -
타우마틴 기반 단백질의 설계
실시예 2A:
타우마틴 기반 단백질의 설계
타우마틴-기반 단백질의 설계는 기준 단백질로서 서열번호: 1을 기반으로 수행되었다.
계산 방법
CPD 과정 동안, 허용된 유일한 대체는 나선형 주변 및 단백질의 코어를 형성하는 베타-시트의 비-노출면에서의 대체이다. ROSETTA 실행은 71K 이상의 모델에서 결과를 얻었다. 모든 모델의 에너지가 그려졌을 때, 결과 그래프는 로짓 함수의 형태를 가진다. 로짓 함수 (로그-확률(log-odd)이라고도 알려짐)는 확률의 로그 p/(1-p) (여기서, p는 확률(probability)임)이다. 이것은 S자형 "로지스틱" 함수의 역이다.
추가 분석을 위해, 5K 최저 모델을 선택하였다. REU의 함수로 대체 횟수를 플로팅하면 가우스 분포가 제공되어, 모집단이 정상이며 추가 분석에 유효함을 나타낸다. CPD의 결과는 다음에서 알 수 있다. 오류!(Error!) 기준 출처를 찾을 수 없음.
| 위치 | 서열번호:1의 잔기 | 노출됨/매립됨 | 나선형/베타/루프 | 제안된 치환 |
| 1 | A | 노출됨 | 베타 | S |
| 2 | T | 매립됨 | 베타 | V/I |
| 3 | F | 노출됨 | 베타 | W/F |
| 4 | E | 노출됨 | 베타 | V/E |
| 6 | V | 부분적으로 노출됨 | 베타 | V/Y/I |
| 8 | R | 노출됨 | 루프 | N/M |
| 10 | S | 노출됨 | 루프 | P |
| 30 | Q | 노출됨 | 베타 | Q/E |
| 32 | N | 노출됨 | 루프 | P |
| 33 | S | 노출됨 | 루프 | P |
| 35 | E | 노출됨 | 베타 | A |
| 36 | S | 노출됨 | 베타 | V/T |
| 37 | W | 대부분 매립됨 | 베타 | W |
| 38 | T | 노출됨 | 베타 | V/P |
| 39 | I | 매립됨 | 베타 | A/I |
| 40 | N | 노출됨 | 베타 | V/Y |
| 52 | A | 매립됨 | 베타 | G |
| 88 | A | 매립됨 | 베타 | A/V |
| 93 | N | 부분적으로 노출됨 | 베타 | N/M |
| 100 | I | 매립됨 | 베타 | I/V |
| 104 | N | 매립됨 | 루프 | L/N |
| 112 | M | 매립됨 | 베타 | A/M/V |
| 113 | N | 부분적으로 노출됨 | 베타 | K/E |
| 114 | F | 매립됨 | 베타 | V/C |
| 115 | S | 노출됨 | 베타 | R/E |
| 117 | T | 노출됨 | 루프 | L/A/F/K |
| 118 | T | 노출됨 | 루프 | T/D |
| 119 | R | 노출됨 | 루프 | T |
| 124 | V | 매립됨 | 베타 | A/S |
| 125 | R | 노출됨 | 베타 | E |
| 127 | A | 노출됨 | 루프 | S/D |
| 128 | A | 노출됨 | 루프 | S |
| 129 | D | 노출됨 | 루프 | P |
| 131 | V | 노출됨 | 나선형 | E |
| 132 | G | 노출됨 | 나선형 | K/D |
| 133 | Q | 노출됨 | 나선형 | Q/N |
| 136 | A | 노출됨 | 나선형 | P |
| 137 | K | 노출됨 | 나선형 | D/S |
| 139 | K | 노출됨 | 루프 | R |
| 140 | A | 노출됨 | 루프 | H |
| 142 | G | 노출됨 | 루프 | G/E |
| 148 | A | 매립됨 | 나선형 | P |
| 152 | F | 노출됨 | 나선형 | Y/F |
| 154 | T | 노출됨 | 루프 | Q |
| 157 | Y | 노출됨 | 나선형 | Y/H |
| 165 | G | 노출됨 | 루프 | G/T |
| 166 | P | 부분적으로 노출됨 | 루프 | P/A |
| 168 | E | 노출됨 | 나선형 | E/D/P |
| 169 | Y | 부분적으로 노출됨 | 나선형 | A |
| 171 | R | 노출됨 | 나선형 | K |
| 172 | F | 부분적으로 노출됨 | 나선형 | Y/F |
| 175 | R | 노출됨 | 나선형 | K/L |
| 176 | L | 노출됨 | 나선형 | L/N |
| 179 | D | 노출됨 | 루프 | E |
| 191 | V | 부분적으로 노출됨 | 베타 | V/Q/W |
| 196 | S | 노출됨 | 루프 | G |
| 197 | S | 노출됨 | 루프 | A |
| 198 | N | 노출됨 | 루프 | R/H/N |
| 200 | R | 노출됨 | 베타 | E/R |
| 202 | T | 부분적으로 노출됨 | 베타 | I/V |
| 206 | T | 노출됨 | 루프 | N/R |
| 207 | A | 노출됨 | 루프 | T/I |
실시예 2B: 피치아 파스토리스 (현재 코마가탤라 파피(Komagataella phaffi)라고 함)에서 타우마틴 변형된 단백질의 발현
2개의 상이한 유도 시스템, 즉 메탄올 유도 및 글루코오스 유도 발현을 이용하여, 효모 P.파소리스 (P.pasoris)로부터의 발현 및 분비에 대해 6개의 타우마틴 변이체를 시험하였다. 서열 및 발현 시스템은 하기 표 12에 나타내었다.
| 서열번호: | 하기와 같이 표시됨 | 하기에 의해 유도 |
| 21 | TM1 | 메탄올 |
| 23 | TM2 | 메탄올 |
| 25 | TM3 | 메탄올 |
| 27 | TM4 | 글루코오스 |
| 29 | TM5 | 글루코오스 |
| 31 | TM6 | 글루코오스 |
제오신 (500-1000 ㎍/ml)에 의한 전기천공(electroporation) 및 선택 후 X33 또는 LP1 피치아 균주에서 발현을 시험하였다. 결과의 예는 도 3에서 볼 수 있으며, 아크릴아미드 겔로 분리된 배양 조건 배지를 제시한다. 선택된 콜로니의 조건 배지는 아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리되고 은 염색으로 검출되었다. 코스마틴(Cosmatin) (레인 2-7)은 22kDal의 정확한 분자량 (화살표)에서 검출된다. 분비는 아밀라제 (T8-1) 또는 알파 교배 인자(mating factor) (2) 신호 서열에 의해 유도된다. 레인 1- 동일한 조건 하에서 타우마틴 발현, 타우마틴 "프리(pre)" 신호 서열 (MAATTCFFFLFPFLLLLTLSRA)에 의해 분비.
실험은 X-33, GS115 및 LP1을 포함한 3개의 상이한 숙주 유기체 균주로 수행되었다. 발현 시스템은 메탄올 유도 (프로모터 AOX1 사용, 균주 X33, GS115 및 LP1에서 시험됨) 및 글루코오스 유도 (프로모터 G1-3 사용, 균주 LP1 및 GS115에서 시험된) 둘 다 포함하였다.
상이한 신호 펩티드를 스크리닝하였다. AOX1의 경우, 이들은 아밀라제, 알파K(alphaK), 알파T(alphaT), 글루코아밀(Glucoamyl), 이눌리나제(inulinase), 인버타제(invertase), 킬러프로(killerpro), 리소자임, 알부민 및 프리-타우마틴(pre-thamatin)을 포함한다. G1-3의 경우, 이들은 프리-타우마틴, LSP1, LSP2 및 알파M (alphaM)을 포함한다.
타우마틴의 경우, CPD 소프트웨어로 받은 가장 낮은 의사-에너지(pseudo-energy) 점수는 54개의 치환을 포함하였다. 그러나, 수많은 직교 방법에 의한 교차-검증 후, 실험실에서 발현된 일부 변형된 단백질은 3개 및 22개의 치환을 포함하였다. 직교 방법은 컴퓨터-유래 모델 및 단백질의 진화 계열 내에서 서열- 및 구조적 보존, 소수성 패치, 공동, 동적 고온 및 저온의 역학 분석 (예를 들어, 분자 역학에 의해 평가됨), 시각화, 알려진 돌연변이와 일치 등, ~72,000개의 모델 및 의사-에너지 (점수 함수) 분포를 포함한다. 각 모델은 상이한 서열이며, 모든 의사-에너지는 입력 (야생형) 단백질보다 낮다. 5,000개의 가장 낮은 의사-에너지 모델에 초점을 맞춘다: 의사-에너지 대 치환 횟수 (직교 방법에 의한 점수 및 검증 전 컴퓨터 출력).
실시예 3: 수용체 결합 부위의 특징화
적어도 하기의 아미노산을 포함하는 수용체 결합 부위의 특징화, 여기서 A는 TAS1R2 (인간)에 해당하고 B는 TAS1R3 (인간)에 해당하며, 여기서 번호매기기 (numbering)는 해당 서열의 해당 잔기 (아미노산)에 해당한다:
| 아미노산 | 아단위(subunit) |
| 203 | A |
| 212 | A |
| 220 | B |
| 204 | A |
| 483 | A |
| 226 | A |
| 233 | A |
| 207 | B |
| 236 | B |
| 258 | A |
| 249 | A |
| 233 | B |
| 496 | B |
| 262 | B |
| 256 | A |
| 240 | B |
| 224 | B |
| 191 | B |
| 317 | A |
| 239 | A |
| 318 | A |
| 230 | A |
| 261 | B |
| 234 | B |
| 225 | A |
| 231 | B |
| 265 | A |
| 315 | A |
| 205 | A |
| 484 | A |
| 254 | A |
| 228 | B |
| 221 | A |
| 205 | B |
| 231 | A |
| 265 | B |
| 237 | A |
| 217 | A |
| 208 | B |
| 294 | A |
| 268 | A |
| 290 | A |
| 266 | A |
| 228 | A |
| 267 | B |
| 475 | A |
| 292 | A |
| 232 | B |
| 314 | A |
| 479 | A |
| 255 | A |
| 202 | A |
| 229 | A |
| 257 | A |
또한, 적어도 하기의 아미노산을 포함하는 수용체 결합 부위, 여기서 A는 TAS1R2 (인간)에 해당하고 B는 TAS1R3 (인간)에 해당하며, 여기서 번호매기기는 해당 서열의 해당 잔기 (아미노산)에 해당한다 (표 14).
| 아미노산 | 아단위 |
| 77 | B |
| 249 | B |
| 314 | B |
| 127 | A |
| 467 | B |
| 48 | B |
| 382 | B |
| 290 | B |
| 437 | A |
| 380 | B |
| 369 | B |
| 122 | B |
| 343 | B |
| 63 | B |
| 132 | A |
| 61 | B |
| 348 | B |
| 65 | B |
| 307 | B |
| 350 | B |
| 117 | A |
| 425 | A |
| 330 | B |
| 254 | B |
| 386 | B |
| 56 | B |
| 357 | B |
| 308 | B |
| 174 | A |
| 363 | B |
| 413 | A |
| 401 | A |
| 435 | A |
| 346 | B |
| 385 | B |
| 349 | B |
| 47 | B |
| 124 | A |
| 364 | B |
| 67 | B |
| 355 | B |
| 342 | B |
| 414 | A |
| 375 | B |
| 311 | B |
| 339 | B |
| 404 | A |
| 354 | B |
| 125 | A |
| 59 | B |
| 358 | B |
| 289 | B |
| 362 | B |
| 440 | A |
| 366 | B |
| 129 | A |
| 465 | B |
| 426 | A |
| 123 | B |
| 428 | A |
| 371 | B |
| 252 | B |
| 372 | B |
| 360 | B |
| 54 | B |
| 317 | B |
| 130 | A |
| 341 | B |
| 464 | B |
| 32 | B |
| 345 | B |
| 53 | B |
| 291 | B |
| 253 | B |
| 379 | B |
| 313 | B |
| 359 | B |
| 463 | B |
| 356 | B |
| 412 | A |
적어도 하기의 아미노산을 포함하는 수용체 결합 부위, 여기서 A는 TAS1R2 (인간)에 해당하고 B는 TAS1R3 (인간)에 해당하며, 여기서 번호매기기는 해당 서열의 해당 잔기 (아미노산)에 해당한다 (표 15).
| 아미노산 | 아단위 |
| 77 | B |
| 120 | B |
| 128 | B |
| 380 | B |
| 135 | B |
| 369 | B |
| 122 | B |
| 343 | B |
| 348 | B |
| 350 | B |
| 417 | B |
| 333 | B |
| 34 | B |
| 357 | B |
| 336 | B |
| 363 | B |
| 411 | B |
| 346 | B |
| 349 | B |
| 124 | A |
| 87 | B |
| 364 | B |
| 94 | B |
| 355 | B |
| 342 | B |
| 409 | B |
| 339 | B |
| 354 | B |
| 125 | A |
| 358 | B |
| 362 | B |
| 366 | B |
| 123 | B |
| 420 | B |
| 85 | B |
| 88 | B |
| 412 | B |
| 332 | B |
| 133 | B |
| 360 | B |
| 341 | B |
| 413 | B |
| 121 | B |
| 32 | B |
| 345 | B |
| 379 | B |
| 92 | B |
| 359 | B |
| 418 | B |
| 356 | B |
도 4a 내지 4c는 제안된 결합 부위의 표시를 나타낸다. 수용체에 도킹하는 타우마틴의 모의실험 후, 수용체에서 3개의 높은-확률 결합 부위가 확인되었다. 모의실험 동안, 수많은 도킹 예측 실험을 수행하고 저-에너지 결과를 클러스터링한다. 도 4a 내지 4c는 3개의 부위 및 이들 부위에 클러스터링한 타우마틴을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING
<110> Amai Proteins Ltd.
<120> TASTE AND FLAVOR-MODIFIER PROTEINS
<130> 2647289
<150> US 62/667,532
<151> 2018-05-06
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 207
<212> PRT
<213> Thaumatococcus daniellii
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Thaumatin I GenBank Entry No. P02883
<400> 1
Ala Thr Phe Glu Ile Val Asn Arg Cys Ser Tyr Thr Val Trp Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ser Lys Gly Asp Ala Ala Leu Asp Ala Gly Gly Arg Gln Leu Asn
20 25 30
Ser Gly Glu Ser Trp Thr Ile Asn Val Glu Pro Gly Thr Asn Gly Gly
35 40 45
Lys Ile Trp Ala Arg Thr Asp Cys Tyr Phe Asp Asp Ser Gly Ser Gly
50 55 60
Ile Cys Lys Thr Gly Asp Cys Gly Gly Leu Leu Arg Cys Lys Arg Phe
65 70 75 80
Gly Arg Pro Pro Thr Thr Leu Ala Glu Phe Ser Leu Asn Gln Tyr Gly
85 90 95
Lys Asp Tyr Ile Asp Ile Ser Asn Ile Lys Gly Phe Asn Val Pro Met
100 105 110
Asn Phe Ser Pro Thr Thr Arg Gly Cys Arg Gly Val Arg Cys Ala Ala
115 120 125
Asp Ile Val Gly Gln Cys Pro Ala Lys Leu Lys Ala Pro Gly Gly Gly
130 135 140
Cys Asn Asp Ala Cys Thr Val Phe Gln Thr Ser Glu Tyr Cys Cys Thr
145 150 155 160
Thr Gly Lys Cys Gly Pro Thr Glu Tyr Ser Arg Phe Phe Lys Arg Leu
165 170 175
Cys Pro Asp Ala Phe Ser Tyr Val Leu Asp Lys Pro Thr Thr Val Thr
180 185 190
Cys Pro Gly Ser Ser Asn Tyr Arg Val Thr Phe Cys Pro Thr Ala
195 200 205
<210> 2
<211> 234
<212> PRT
<213> Thaumatococcus daniellii
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Thaumatin-2 GenBank Entry No. P02884
<400> 2
Met Ala Ala Thr Thr Cys Phe Phe Phe Leu Phe Pro Phe Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Thr Leu Ser Arg Ala Ala Thr Phe Glu Ile Val Asn Arg Cys Ser
20 25 30
Tyr Thr Val Trp Ala Ala Ala Ser Lys Gly Asp Ala Ala Leu Asp Ala
35 40 45
Gly Gly Arg Gln Leu Asn Ser Gly Glu Ser Trp Thr Asn Val Glu Pro
50 55 60
Gly Thr Lys Gly Gly Lys Ile Trp Ala Arg Thr Asp Cys Tyr Phe Asp
65 70 75 80
Asp Ser Gly Arg Gly Ile Cys Arg Thr Gly Asp Cys Gly Gly Leu Leu
85 90 95
Gln Cys Lys Arg Phe Gly Arg Pro Pro Thr Thr Leu Ala Glu Phe Ser
100 105 110
Leu Asn Gln Tyr Gly Lys Asp Tyr Ile Asp Ile Ser Asn Ile Lys Gly
115 120 125
Phe Asn Val Pro Met Asp Phe Ser Pro Thr Thr Arg Gly Cys Arg Gly
130 135 140
Val Arg Cys Ala Ala Asp Ile Val Gly Gln Cys Pro Ala Lys Leu Lys
145 150 155 160
Ala Pro Gly Gly Gly Cys Asn Asp Ala Cys Thr Val Phe Gln Thr Ser
165 170 175
Glu Tyr Cys Cys Thr Thr Gly Lys Cys Gly Pro Thr Glu Tyr Ser Arg
180 185 190
Phe Phe Lys Arg Leu Cys Pro Asp Ala Phe Ser Tyr Val Leu Asp Lys
195 200 205
Pro Thr Thr Val Thr Cys Pro Gly Ser Ser Asn Tyr Arg Val Thr Phe
210 215 220
Cys Pro Thr Ala Leu Glu Leu Glu Asp Glu
225 230
<210> 3
<211> 45
<212> PRT
<213> Dioscoreophyllum cumminsii
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Monellin chain A GenBank Entry No. P02881
<400> 3
Phe Arg Glu Ile Lys Gly Tyr Glu Tyr Gln Leu Tyr Val Tyr Ala Ser
1 5 10 15
Asp Lys Leu Phe Arg Ala Asp Ile Ser Glu Asp Tyr Lys Thr Arg Gly
20 25 30
Arg Lys Leu Leu Arg Phe Asn Gly Pro Val Pro Pro Pro
35 40 45
<210> 4
<211> 50
<212> PRT
<213> Dioscoreophyllum cumminsii
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Monellin chain B GenBank Entry No. P02882
<400> 4
Gly Glu Trp Glu Ile Ile Asp Ile Gly Pro Phe Thr Gln Asn Leu Gly
1 5 10 15
Lys Phe Ala Val Asp Glu Glu Asn Lys Ile Gly Gln Tyr Gly Arg Leu
20 25 30
Thr Phe Asn Lys Val Ile Arg Pro Cys Met Lys Lys Thr Ile Tyr Glu
35 40 45
Glu Asn
50
<210> 5
<211> 96
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Monelin MNEI
<400> 5
Gly Glu Trp Glu Ile Ile Asp Ile Gly Pro Phe Thr Gln Asn Leu Gly
1 5 10 15
Lys Phe Ala Val Asp Glu Glu Asn Lys Ile Gly Gln Tyr Gly Arg Leu
20 25 30
Thr Phe Asn Lys Val Ile Arg Pro Cys Met Lys Lys Thr Ile Tyr Glu
35 40 45
Asn Glu Gly Phe Arg Glu Ile Lys Gly Tyr Glu Tyr Gln Leu Tyr Val
50 55 60
Tyr Ala Ser Asp Lys Leu Phe Arg Ala Asp Ile Ser Glu Asp Tyr Lys
65 70 75 80
Thr Arg Gly Arg Lys Leu Leu Arg Phe Asn Gly Pro Val Pro Pro Pro
85 90 95
<210> 6
<211> 220
<212> PRT
<213> Synsepalum dulcificum
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Miraculin GenBank Entry No. P13087
<400> 6
Met Lys Glu Leu Thr Met Leu Ser Leu Ser Phe Phe Phe Val Ser Ala
1 5 10 15
Leu Leu Ala Ala Ala Ala Asn Pro Leu Leu Ser Ala Ala Asp Ser Ala
20 25 30
Pro Asn Pro Val Leu Asp Ile Asp Gly Glu Lys Leu Arg Thr Gly Thr
35 40 45
Asn Tyr Tyr Ile Val Pro Val Leu Arg Asp His Gly Gly Gly Leu Thr
50 55 60
Val Ser Ala Thr Thr Pro Asn Gly Thr Phe Val Cys Pro Pro Arg Val
65 70 75 80
Val Gln Thr Arg Lys Glu Val Asp His Asp Arg Pro Leu Ala Phe Phe
85 90 95
Pro Glu Asn Pro Lys Glu Asp Val Val Arg Val Ser Thr Asp Leu Asn
100 105 110
Ile Asn Phe Ser Ala Phe Met Pro Cys Arg Trp Thr Ser Ser Thr Val
115 120 125
Trp Arg Leu Asp Lys Tyr Asp Glu Ser Thr Gly Gln Tyr Phe Val Thr
130 135 140
Ile Gly Gly Val Lys Gly Asn Pro Gly Pro Glu Thr Ile Ser Ser Trp
145 150 155 160
Phe Lys Ile Glu Glu Phe Cys Gly Ser Gly Phe Tyr Lys Leu Val Phe
165 170 175
Cys Pro Thr Val Cys Gly Ser Cys Lys Val Lys Cys Gly Asp Val Gly
180 185 190
Ile Tyr Ile Asp Gln Lys Gly Arg Arg Arg Leu Ala Leu Ser Asp Lys
195 200 205
Pro Phe Ala Phe Glu Phe Asn Lys Thr Val Tyr Phe
210 215 220
<210> 7
<211> 158
<212> PRT
<213> Molineria latifolia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Curculin-1 GenBank Entry No. P19667
<400> 7
Met Ala Ala Lys Phe Leu Leu Thr Ile Leu Val Thr Phe Ala Ala Val
1 5 10 15
Ala Ser Leu Gly Met Ala Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly Gln Thr Leu
20 25 30
His Ala Asp His Ser Leu Gln Ala Gly Ala Tyr Thr Leu Thr Ile Gln
35 40 45
Asn Lys Cys Asn Leu Val Lys Tyr Gln Asn Gly Arg Gln Ile Trp Ala
50 55 60
Ser Asn Thr Asp Arg Arg Gly Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Ser
65 70 75 80
Asp Gly Asn Leu Val Ile Tyr Asp His Asn Asn Asn Asp Val Trp Gly
85 90 95
Ser Ala Cys Trp Gly Asp Asn Gly Lys Tyr Ala Leu Val Leu Gln Lys
100 105 110
Asp Gly Arg Phe Val Ile Tyr Gly Pro Val Leu Trp Ser Leu Gly Pro
115 120 125
Asn Gly Cys Arg Arg Val Asn Gly Gly Ile Thr Val Ala Lys Asp Ser
130 135 140
Thr Glu Pro Gln His Glu Asp Ile Lys Met Val Ile Asn Asn
145 150 155
<210> 8
<211> 158
<212> PRT
<213> Molineria latifolia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Curculin-2 GenBank Entry No. Q6F495
<400> 8
Met Ala Ala Lys Phe Leu Leu Thr Ile Leu Val Thr Phe Ala Ala Val
1 5 10 15
Ala Ser Leu Gly Met Ala Asp Ser Val Leu Leu Ser Gly Gln Thr Leu
20 25 30
Tyr Ala Gly His Ser Leu Thr Ser Gly Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Gln
35 40 45
Asn Asn Cys Asn Leu Val Lys Tyr Gln His Gly Arg Gln Ile Trp Ala
50 55 60
Ser Asp Thr Asp Gly Gln Gly Ser Gln Cys Arg Leu Thr Leu Arg Ser
65 70 75 80
Asp Gly Asn Leu Ile Ile Tyr Asp Asp Asn Asn Met Val Val Trp Gly
85 90 95
Ser Asp Cys Trp Gly Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Leu Val Leu Gln Gln
100 105 110
Asp Gly Leu Phe Val Ile Tyr Gly Pro Val Leu Trp Pro Leu Gly Leu
115 120 125
Asn Gly Cys Arg Ser Leu Asn Gly Glu Ile Thr Val Ala Lys Asp Ser
130 135 140
Thr Glu Pro Gln His Glu Asp Ile Lys Met Val Ile Asn Asn
145 150 155
<210> 9
<211> 54
<212> PRT
<213> Pentadiplandra brazzeana
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Brazzein or Defensin-like protein GenBank Entry No. P56552
<400> 9
Gln Asp Lys Cys Lys Lys Val Tyr Glu Asn Tyr Pro Val Ser Lys Cys
1 5 10 15
Gln Leu Ala Asn Gln Cys Asn Tyr Asp Cys Lys Leu Asp Lys His Ala
20 25 30
Arg Ser Gly Glu Cys Phe Tyr Asp Glu Lys Arg Asn Leu Gln Cys Ile
35 40 45
Cys Asp Tyr Cys Glu Tyr
50
<210> 10
<211> 104
<212> PRT
<213> Capparis masaikai
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Sweet protein mabinlin-1 GenBank Entry No. P80351
<400> 10
Glu Pro Leu Cys Arg Arg Gln Phe Gln Gln His Gln His Leu Arg Ala
1 5 10 15
Cys Gln Arg Tyr Ile Arg Arg Arg Ala Gln Arg Gly Gly Leu Val Asp
20 25 30
Glu Gln Arg Gly Pro Ala Leu Arg Leu Cys Cys Asn Gln Leu Arg Gln
35 40 45
Val Asn Lys Pro Cys Val Cys Pro Val Leu Arg Gln Ala Ala His Gln
50 55 60
Gln Leu Tyr Gln Gly Gln Ile Glu Gly Pro Arg Gln Val Arg Gln Leu
65 70 75 80
Phe Arg Ala Ala Arg Asn Leu Pro Asn Ile Cys Lys Ile Pro Ala Val
85 90 95
Gly Arg Cys Gln Phe Thr Arg Trp
100
<210> 11
<211> 155
<212> PRT
<213> Capparis masaikai
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Sweet protein mabinlin-2 GenBank Entry No. P30233
<400> 11
Met Ala Lys Leu Ile Phe Leu Phe Ala Thr Leu Ala Leu Phe Val Leu
1 5 10 15
Leu Ala Asn Ala Ser Ile Gln Thr Thr Val Ile Glu Val Asp Glu Glu
20 25 30
Glu Asp Asn Gln Leu Trp Arg Cys Gln Arg Gln Phe Leu Gln His Gln
35 40 45
Arg Leu Arg Ala Cys Gln Arg Phe Ile His Arg Arg Ala Gln Phe Gly
50 55 60
Gly Gln Pro Asp Glu Leu Glu Asp Glu Val Glu Asp Asp Asn Asp Asp
65 70 75 80
Glu Asn Gln Pro Arg Arg Pro Ala Leu Arg Gln Cys Cys Asn Gln Leu
85 90 95
Arg Gln Val Asp Arg Pro Cys Val Cys Pro Val Leu Arg Gln Ala Ala
100 105 110
Gln Gln Val Leu Gln Arg Gln Ile Ile Gln Gly Pro Gln Gln Leu Arg
115 120 125
Arg Leu Phe Asp Ala Ala Arg Asn Leu Pro Asn Ile Cys Asn Ile Pro
130 135 140
Asn Ile Gly Ala Cys Pro Phe Arg Ala Trp Pro
145 150 155
<210> 12
<211> 104
<212> PRT
<213> Capparis masaikai
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Sweet protein mabinlin-3 GenBank Entry No. P80352
<400> 12
Glu Pro Leu Cys Arg Arg Gln Phe Gln Gln His Gln His Leu Arg Ala
1 5 10 15
Cys Gln Arg Tyr Leu Arg Arg Arg Ala Gln Arg Gly Gly Leu Ala Asp
20 25 30
Glu Gln Arg Gly Pro Ala Leu Arg Leu Cys Cys Asn Gln Leu Arg Gln
35 40 45
Val Asn Lys Pro Cys Val Cys Pro Val Leu Arg Gln Ala Ala His Gln
50 55 60
Gln Leu Tyr Gln Gly Gln Ile Glu Gly Pro Arg Gln Val Arg Arg Leu
65 70 75 80
Phe Arg Ala Ala Arg Asn Leu Pro Asn Ile Cys Lys Ile Pro Ala Val
85 90 95
Gly Arg Cys Gln Phe Thr Arg Trp
100
<210> 13
<211> 100
<212> PRT
<213> Capparis masaikai
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Sweet protein mabinlin-4 GenBank Entry No. P80353
<400> 13
Glu Pro Leu Cys Arg Arg Gln Phe Gln Gln His Gln His Leu Arg Ala
1 5 10 15
Cys Gln Arg Tyr Leu Arg Arg Arg Ala Gln Arg Gly Glu Gln Arg Gly
20 25 30
Pro Ala Leu Arg Leu Cys Cys Asn Gln Leu Arg Gln Val Asn Lys Pro
35 40 45
Cys Val Cys Pro Val Leu Arg Gln Ala Ala His Gln Gln Leu Tyr Gln
50 55 60
Gly Gln Ile Glu Gly Pro Arg Gln Val Arg Arg Leu Phe Arg Ala Ala
65 70 75 80
Arg Asn Leu Pro Asn Ile Cys Lys Ile Pro Ala Val Gly Arg Cys Gln
85 90 95
Phe Thr Arg Trp
100
<210> 14
<211> 258
<212> PRT
<213> Ricinus communis
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Sweet protein mabinlin-1 chain A GenBank Entry No. B9SA35
<400> 14
Met Ala Lys Leu Ile Pro Thr Ile Ala Leu Val Ser Val Leu Leu Phe
1 5 10 15
Ile Ile Ala Asn Ala Ser Phe Ala Tyr Arg Thr Thr Ile Thr Thr Ile
20 25 30
Glu Ile Asp Glu Ser Lys Gly Glu Arg Glu Gly Ser Ser Ser Gln Gln
35 40 45
Cys Arg Gln Glu Val Gln Arg Lys Asp Leu Ser Ser Cys Glu Arg Tyr
50 55 60
Leu Arg Gln Ser Ser Ser Arg Arg Ser Pro Gly Glu Glu Val Leu Arg
65 70 75 80
Met Pro Gly Asp Glu Asn Gln Gln Gln Glu Ser Gln Gln Leu Gln Gln
85 90 95
Cys Cys Asn Gln Val Lys Gln Val Arg Asp Glu Cys Gln Cys Glu Ala
100 105 110
Ile Lys Tyr Ile Ala Glu Asp Gln Ile Gln Gln Gly Gln Leu His Gly
115 120 125
Glu Glu Ser Glu Arg Val Ala Gln Arg Ala Gly Glu Ile Val Ser Ser
130 135 140
Cys Gly Val Arg Cys Met Arg Gln Thr Arg Thr Asn Pro Ser Gln Gln
145 150 155 160
Gly Cys Arg Gly Gln Ile Gln Glu Gln Gln Asn Leu Arg Gln Cys Gln
165 170 175
Glu Tyr Ile Lys Gln Gln Val Ser Gly Gln Gly Pro Arg Arg Ser Asp
180 185 190
Asn Gln Glu Arg Ser Leu Arg Gly Cys Cys Asp His Leu Lys Gln Met
195 200 205
Gln Ser Gln Cys Arg Cys Glu Gly Leu Arg Gln Ala Ile Glu Gln Gln
210 215 220
Gln Ser Gln Gly Gln Leu Gln Gly Gln Asp Val Phe Glu Ala Phe Arg
225 230 235 240
Thr Ala Ala Asn Leu Pro Ser Met Cys Gly Val Ser Pro Thr Glu Cys
245 250 255
Arg Phe
<210> 15
<211> 96
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DM3
<400> 15
Gly Asn Trp Glu Ile Ile Asp Thr Gly Pro Phe Thr Gln Lys Leu Gly
1 5 10 15
Lys Phe Ala Val Asp Glu Ala Asn Lys Ile Gly Lys Tyr Gly Thr Leu
20 25 30
Thr Phe Thr Lys Val Ile Arg Pro Thr Met Lys Lys Thr Ile Tyr Glu
35 40 45
Asn Glu Gly Phe Arg Glu Ile Lys Gly Tyr Glu Tyr Gln Leu Tyr Val
50 55 60
Lys Ala Asn Asp Lys Leu Phe Arg Ala Asp Ile Ser Glu Asp Tyr Lys
65 70 75 80
Thr Arg Gly Leu Lys Leu Leu Arg Phe Asn Gly Pro Val Pro Pro Pro
85 90 95
<210> 16
<211> 96
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DM8
<400> 16
Gly Asn Trp Glu Ile Ile Asp Ile Gly Pro Phe Thr Gln Asn Leu Gly
1 5 10 15
Lys Phe Ala Val Asp Glu Val Asn Lys Ile Gly Gln Tyr Gly Arg Leu
20 25 30
Thr Phe Asn Lys Val Ile Arg Pro Cys Met Lys Lys Thr Ile Tyr Glu
35 40 45
Asn Glu Gly Phe Arg Glu Ile Lys Gly Tyr Glu Tyr Gln Leu Tyr Val
50 55 60
Lys Ala Ser Asp Lys Leu Phe Arg Ala Asp Ile Ser Glu Asp Tyr Lys
65 70 75 80
Thr Arg Gly Arg Lys Leu Leu Arg Phe Asn Gly Pro Val Pro Pro Pro
85 90 95
<210> 17
<211> 96
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DM9
<400> 17
Gly Asn Trp Glu Ile Ile Asp Ile Gly Pro Phe Thr Gln Asn Leu Gly
1 5 10 15
Lys Phe Ala Val Asp Glu Ala Asn Lys Ile Gly Gln Tyr Gly Arg Leu
20 25 30
Thr Phe Asn Lys Val Ile Arg Pro Cys Met Lys Lys Thr Ile Tyr Glu
35 40 45
Asn Glu Gly Phe Arg Glu Ile Lys Gly Tyr Glu Tyr Gln Leu Tyr Val
50 55 60
Arg Ala Ser Asp Lys Leu Phe Arg Ala Asp Ile Ser Glu Asp Tyr Lys
65 70 75 80
Thr Arg Gly Arg Lys Leu Leu Arg Phe Asn Gly Pro Val Pro Pro Pro
85 90 95
<210> 18
<211> 96
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DM10
<400> 18
Gly Glu Trp Glu Ile Ile Asp Ile Gly Pro Phe Thr Gln Asn Leu Gly
1 5 10 15
Lys Phe Ala Val Asp Glu Glu Asn Lys Ile Gly Lys Tyr Gly Thr Leu
20 25 30
Thr Phe Thr Lys Val Ile Arg Pro Cys Met Lys Lys Thr Ile Tyr Glu
35 40 45
Asn Glu Gly Phe Arg Glu Ile Lys Gly Tyr Glu Tyr Gln Leu Tyr Val
50 55 60
Tyr Ala Asn Asp Lys Leu Phe Arg Ala Asp Ile Ser Glu Asp Tyr Lys
65 70 75 80
Thr Arg Gly Arg Lys Leu Leu Arg Phe Asn Gly Pro Val Pro Pro Pro
85 90 95
<210> 19
<211> 96
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DM11
<400> 19
Gly Glu Trp Glu Ile Ile Asp Thr Gly Pro Phe Thr Gln Lys Leu Gly
1 5 10 15
Lys Phe Ala Val Asp Glu Glu Asn Lys Ile Gly Gln Tyr Gly Arg Leu
20 25 30
Thr Phe Asn Lys Val Ile Arg Pro Thr Met Lys Lys Thr Ile Tyr Glu
35 40 45
Asn Glu Gly Phe Arg Glu Ile Lys Gly Tyr Glu Tyr Gln Leu Tyr Val
50 55 60
Tyr Ala Ser Asp Lys Leu Phe Arg Ala Asp Ile Ser Glu Asp Tyr Lys
65 70 75 80
Thr Arg Gly Leu Lys Leu Leu Arg Phe Asn Gly Pro Val Pro Pro Pro
85 90 95
<210> 20
<211> 96
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DM12
<400> 20
Gly Glu Trp Glu Ile Ile Asp Thr Gly Pro Phe Thr Gln Asn Leu Gly
1 5 10 15
Lys Phe Ala Val Asp Glu Glu Asn Lys Ile Gly Gln Tyr Gly Arg Leu
20 25 30
Thr Phe Asn Lys Val Ile Arg Pro Thr Met Lys Lys Thr Ile Tyr Glu
35 40 45
Asn Glu Gly Phe Arg Glu Ile Lys Gly Tyr Glu Tyr Gln Leu Tyr Val
50 55 60
Tyr Ala Ser Asp Lys Leu Phe Arg Ala Asp Ile Ser Glu Asp Tyr Lys
65 70 75 80
Thr Arg Gly Leu Lys Leu Leu Arg Phe Asn Gly Pro Val Pro Pro Pro
85 90 95
<210> 21
<211> 207
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TM1
<400> 21
Ala Thr Phe Asp Ile Arg Asn Asn Cys Pro Tyr Thr Val Trp Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ser Lys Gly Asp Ala Ala Leu Asp Ala Gly Gly Arg Arg Leu Asp
20 25 30
Arg Gly Gln Ser Trp Thr Ile Asn Val Glu Pro Gly Thr Asn Gly Gly
35 40 45
Lys Ile Trp Ala Arg Thr Asn Cys Tyr Phe Asp Asp Ser Gly Ser Gly
50 55 60
Ile Cys Lys Thr Gly Asp Cys Gly Gly Leu Leu Arg Cys Lys Arg Phe
65 70 75 80
Gly Arg Pro Pro Thr Thr Leu Ala Glu Phe Ser Leu Asn Gln Tyr Gly
85 90 95
Lys Asp Tyr Phe Asp Ile Ser Leu Ile Lys Gly Phe Asn Val Pro Met
100 105 110
Glu Phe Ser Pro Thr Ser Arg Gly Cys Arg Gly Ile Arg Cys Thr Ala
115 120 125
Asp Ile Asn Gly Gln Cys Pro Asn Glu Leu Arg Ala Pro Gly Gly Gly
130 135 140
Cys Asn Asp Ala Cys Thr Val Phe Gln Thr Ser Glu Tyr Cys Cys Thr
145 150 155 160
Thr Gly Lys Cys Gly Pro Thr Glu Tyr Ser Arg Phe Phe Lys Asp Arg
165 170 175
Cys Pro Asp Ala Phe Ser Tyr Val Leu Asp Asp Pro Thr Thr Val Thr
180 185 190
Cys Pro Gly Ser Ser Asn Tyr Arg Val Thr Phe Cys Pro Thr Ala
195 200 205
<210> 22
<211> 627
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TD1
<400> 22
gcaacctttg atatcagaaa taactgtccc tacacagtat gggctgctgc atctaaaggt 60
gatgctgcac ttgacgccgg tggcagacgt ctagatcgtg gacagtcctg gaccatcaat 120
gttgagcctg gtacaaatgg tggaaagatt tgggctagga ctaattgcta ctttgatgac 180
tctggatccg gtatatgtaa gactggtgac tgtggcggat tgttgagatg taagagattc 240
ggtaggcccc caactacact ggctgaattc tcgttgaatc aatatggtaa agattacttt 300
gacattagtc tgattaaggg attcaacgtt cctatggaat tctccccaac ctcacgtggg 360
tgcagaggaa tcagatgtac ggctgacatc aacggtcaat gtccgaatga attgcgagcc 420
cctggtggtg gatgtaacga tgcatgcaca gtgttccaaa cttctgagta ttgttgtact 480
actggtaagt gcggaccaac tgagtactcc agatttttca aagatcgttg tccagatgca 540
ttcagctatg tgttagacga cccaactaca gttacgtgcc caggttcaag caattacaga 600
gtcaccttct gtcctacagc ttaatag 627
<210> 23
<211> 207
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TM2
<400> 23
Ala Thr Phe Asp Ile Arg Asn Asn Cys Pro Tyr Thr Val Trp Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ser Lys Gly Asp Ala Ala Leu Asp Ala Gly Gly Arg Arg Leu Asp
20 25 30
Arg Gly Gln Ser Trp Thr Ile Asn Val Glu Pro Gly Thr Asn Gly Gly
35 40 45
Lys Ile Trp Ala Arg Thr Asn Cys Tyr Phe Asp Asp Ser Gly Ser Gly
50 55 60
Ile Cys Lys Thr Gly Asp Cys Gly Gly Leu Leu Arg Cys Lys Arg Phe
65 70 75 80
Gly Arg Pro Pro Thr Thr Leu Ala Glu Phe Ser Leu Asn Gln Tyr Gly
85 90 95
Lys Asp Tyr Ile Asp Ile Ser Asn Ile Lys Gly Phe Asn Val Pro Met
100 105 110
Glu Phe Ser Pro Thr Ser Arg Gly Cys Arg Gly Val Arg Cys Thr Ala
115 120 125
Asp Ile Asn Gly Gln Cys Pro Asn Glu Leu Arg Ala Pro Gly Gly Gly
130 135 140
Cys Asn Asp Ala Cys Thr Val Phe Gln Thr Ser Glu Tyr Cys Cys Thr
145 150 155 160
Thr Gly Lys Cys Gly Pro Thr Glu Tyr Ser Arg Phe Phe Lys Asp Arg
165 170 175
Cys Pro Asp Ala Phe Ser Tyr Val Leu Asp Asp Pro Thr Thr Val Thr
180 185 190
Cys Pro Gly Ser Ser Asn Tyr Arg Val Thr Phe Cys Pro Thr Ala
195 200 205
<210> 24
<211> 627
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TD2
<400> 24
gcaacctttg atatcagaaa taactgtccc tacacagtat gggctgctgc atctaaaggt 60
gatgctgcac ttgacgccgg tggcagacgt ctagatcgtg gacagtcctg gaccatcaat 120
gttgagcctg gtacaaatgg tggaaagatt tgggctagga ctaattgcta ctttgatgac 180
tctggatccg gtatatgtaa gactggtgac tgtggcggat tgttgagatg taagagattc 240
ggtaggcccc caactacact ggctgaattc tcgttgaatc aatatggtaa agattacatc 300
gacattagta acattaaggg attcaacgtt cctatggaat tctccccaac ctcacgtggg 360
tgcagaggag tcagatgtac ggctgacatc aacggtcaat gtccgaatga attgcgagcc 420
cctggtggtg gatgtaacga tgcatgcaca gtgttccaaa cttctgagta ttgttgtact 480
actggtaagt gcggaccaac tgagtactcc agatttttca aagatcgttg tccagatgca 540
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gtcaccttct gtcctacagc ttaatag 627
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<223> TM3
<400> 25
Ala Thr Phe Glu Ile Val Asn Arg Cys Ser Tyr Thr Val Trp Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ser Lys Gly Asp Ala Ala Leu Asp Ala Gly Gly Arg Gln Leu Asn
20 25 30
Ser Gly Glu Ser Trp Thr Ile Asn Val Glu Pro Gly Thr Asn Gly Gly
35 40 45
Lys Ile Trp Ala Arg Thr Asp Cys Tyr Phe Asp Asp Ser Gly Ser Gly
50 55 60
Ile Cys Lys Thr Gly Asp Cys Gly Gly Leu Leu Arg Cys Lys Arg Phe
65 70 75 80
Gly Arg Pro Pro Thr Thr Leu Ala Glu Phe Ser Leu Asn Gln Tyr Gly
85 90 95
Lys Asp Tyr Phe Asp Ile Ser Leu Ile Lys Gly Phe Asn Val Pro Met
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Cys Asn Asp Ala Cys Thr Val Phe Gln Thr Ser Glu Tyr Cys Cys Thr
145 150 155 160
Thr Gly Lys Cys Gly Pro Thr Glu Tyr Ser Arg Phe Phe Lys Arg Leu
165 170 175
Cys Pro Asp Ala Phe Ser Tyr Val Leu Asp Lys Pro Thr Thr Val Thr
180 185 190
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gatgcagctc tagatgccgg tggcagacaa cttaatagcg gtgagtcctg gacaatcaat 120
gttgagcccg gaactaacgg tggaaaaatc tgggctagga ctgactgtta ctttgacgac 180
tctggttccg gaatctgcaa aacgggtgat tgtggtggac tgttacgttg taaaagattc 240
ggtaggccac caactacctt ggcagaattt tccctgaatc agtacggtaa agattatttc 300
gatatttcgt tgattaaggg tttcaatgtg cctatgaact tttctcctac taccagaggt 360
tgcagaggaa tcagatgtgc tgctgatatt gtgggacaat gtccggcaaa gttgaaagct 420
cctggtggcg ggtgtaacga cgcttgcaca gtctttcaaa caagcgagta ctgttgtaca 480
actggtaagt gcggtccaac agaatatagt cgtttcttta agagactttg tcctgacgca 540
ttctcttatg tattggacaa accaactaca gttacgtgcc caggatcatc aaactacaga 600
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Pro Gly Glu Ser Trp Thr Ile Asn Val Glu Pro Gly Thr Asn Gly Gly
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Lys Asp Tyr Ile Asp Ile Ser Leu Ile Lys Gly Phe Asn Val Pro Ile
100 105 110
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115 120 125
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gttgaaccgg gaacaaatgg tggtaaaatc tgggccagaa cagactgtta tttcgatgat 180
tctggatccg gtatttgtaa gactggtgac tgtggtggat tgctgaggtg taaaagattt 240
ggtcgtcctc caactacgtt agcagagttt tcattgaatc aatacggtaa agactacatt 300
gatatttcat tgataaaggg atttaacgtc cctatcgaag tacagccaac tacgacaggt 360
tgcagaggag ttagatgttc cagcccaatc cagactcaat gtccagcaaa gcttagacat 420
cccggtggtg ggtgtaatga cccatgcact gtgtaccaaa catctgagta ctgttgtacc 480
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Claims (34)
- 기준 단백질(reference protein)로부터 하나 이상의 아미노산 대체를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변형된 단백질로서,
변형된 단백질은 기준 단백질과 비교하여 적어도 하나의 개선된 식품-관련 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 변형된 단백질. - 제 1항에 있어서, 기준 단백질로부터 적어도 2개의 아미노산 대체를 포함하는, 변형된 단백질.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 적어도 2개의 아미노산 대체는 기준 단백질의 표면 또는 기준 단백질의 코어에 위치하는 것을 특징으로 하는, 변형된 단백질.
- 기준 단백질과 40% 내지 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변형된 단백질로서,
변형된 단백질은 기준 단백질과 비교하여 적어도 하나의 개선된 식품-관련 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 변형된 단백질. - 제 4항에 있어서, 기준 단백질과 90% 내지 99% 동일성을 갖는, 변형된 단백질.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 로제타 에너지 단위 (Rosetta Energy Unit, REU)에 제공된 -190보다 낮은 에너지를 갖는, 변형된 단백질.
- 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 식품-관련 특성은 감미 효능, 감미 동역학, 차폐 효과, 맛 증강 및 이미(off-taste) 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는, 변형된 단백질.
- 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 기준 단백질과 비교하여 적어도 1.5배 증가된 감미 역치 효능을 갖는, 변형된 단백질.
- 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 기준 단백질과 비교하여 적어도 6배 증가된 감미 역치 효능을 갖는, 변형된 단백질.
- 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 기준 단백질과 비교하여 하기 중 적어도 하나를 특징으로 하는, 변형된 단백질: (1) 증가된 열 안정성 (2) 증가된 pH 안정성, (3) 증가된 용해도, 및 (4) 증가된 유통기한 안정성.
- 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 기준 단백질과 비교하여 증가된 열 안정성을 특징으로 하는, 변형된 단백질.
- 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 기준 단백질은 모넬린, MNEI, 타우마틴, 미라쿨린(Miraculin), 커쿨린(Curculin), 브라제인(Brazzein) 및 마빈린 (Mabinlin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 변형된 단백질.
- 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 기준 단백질은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13 및 서열번호: 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 변형된 단백질.
- 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 기준 단백질은 서열번호: 5로 표시되는 단백질인 것을 특징으로 하는, 변형된 단백질.
- 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 5의 잔기 E2, E23 및 Y65에서 적어도 3개의 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 변형된 단백질.
- 제 15항에 있어서, 적어도 3개의 아미노산 치환 중 적어도 하나는 E2N, E2D, E2Q, E2R, E2K, E23N, E23D, E23Q, E23R, E23K, Y65F, Y65W, Y65H, Y65V, Y65I, Y65L, Y65M, Y65C, Y65A, Y65T, Y65S, Y65P, Y65G, Y65K 및 Y65R로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 변형된 단백질.
- 제 15항에 있어서, 적어도 3개의 아미노산 치환 중 적어도 하나는 E2N, E23V, E23A, Y65K, 및 Y65R로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 변형된 단백질.
- 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 16 및 서열번호: 17로 표시되는 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, 변형된 단백질.
- 서열번호: 5의 잔기 E2, E23 및 Y65에서 적어도 3개의 아미노산 치환을 포함하는, 서열번호: 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 변형된 단백질.
- 제 19항에 있어서, REU에 제공된 -190 내지 REU에 제공된 -204.6의 에너지를 갖는, 변형된 단백질.
- 제 19항 또는 제 20항에 있어서, 적어도 하나의 식품-관련 특성은 감미 효능, 감미 동역학, 차폐 효과, 증강 맛 또는 이미 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는, 변형된 단백질.
- 제 19항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 기준 단백질과 비교하여 적어도 2배 증가된 감미 역치 효능을 갖는, 변형된 단백질.
- 제 19항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 기준 단백질과 비교하여 증가된 열 안정성을 특징으로 하는, 변형된 단백질.
- 제 19항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 3개의 아미노산 치환 중 적어도 하나는 E2N, E2D, E2Q, E2R, E2K, E23N, E23D, E23Q, E23R, E23K, Y65F, Y65W, Y65H, Y65V, Y65I, Y65L, Y65M, Y65C, Y65A, Y65T, Y65S, Y65P, Y65G, Y65K 및 Y65R로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 변형된 단백질.
- 제 24항에 있어서, 적어도 3개의 아미노산 치환 중 적어도 하나는 E2N, E23V, E23A, Y65K, 및 Y65R로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 변형된 단백질.
- 제 19항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 16 및 서열번호: 17로 표시되는 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, 변형된 단백질.
- 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 경구 전달용 제품의 제조에 사용하기 위한, 변형된 단백질.
- 제 27항에 있어서, 제품은 식품, 식품 보충 제품 또는 약제인 것을 특징으로 하는, 변형된 단백질.
- 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 향미 변형제 또는 향미 증강제로 사용하기 위한, 변형된 단백질.
- 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 감미료로 사용하기 위한, 변형된 단백질.
- 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 따른 변형된 단백질을 포함하는, 식품.
- 제 31항에 있어서, 적어도 하나의 식품 성분을 포함하는, 식품.
- 제 32항에 있어서, 식품 성분은 인공 향료, 식품 첨가제, 식용 색소, 방부제 또는 설탕 첨가제 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는, 식품.
- 제 32항에 있어서, 식품 성분은 스테비아인 것을 특징으로 하는, 식품.
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