KR20200144562A - 난치성 소아 고형 종양에 대한 할로겐화-크산텐의 시험관 내 및 이종이식 항-종양 - Google Patents
난치성 소아 고형 종양에 대한 할로겐화-크산텐의 시험관 내 및 이종이식 항-종양 Download PDFInfo
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Abstract
관리 종양의 종양 세포 제거를 유도하는 양의 할로겐화 크산텐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 바람직하게는 로즈 벵갈 이나트륨을 병소 내로 투여하는 것을 포함하는 포유동물 대상의 소아 암성 고형 종양의 치료 방법을 개시한다. 다른 고려된 방법은 관리 종양의 종양 세포의 제거를 유도하는 양의 할로겐화 크산텐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 바람직하게는 로즈 벵갈 이나트륨을 병소 내로 투여하는 단계 및 상기 할로겐화 크산텐과 함께 상승적 세포독성을 제공하는 종양-억제 유효량의 전신성 항암 약물을 전신적으로 투여하는 단계를 포함한다. 상기 두 투여는 동시에, 또는 하나가 다른 하나의 이전에 발생할 수 있다.
Description
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2018년 5월 16일에 출원된 출원번호 제62/672,373호로부터 우선권을 주장하며, 그 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
소아에서 발생하는 암의 유형은 흔히 성인에서 발생하는 유형과는 다르다. 소아암은 보통 생애의 매우 이른 시기에, 때로는 출생 전에 일어나는 세포 DNA 변화로 발생한다. 따라서 암을 유발하는 유전적 돌연변이는 자궁 내 태아 발달 시기에 일어날 수 있다. 성인의 많은 암과 달리, 소아암은 생활방식이나 환경적 위험 요소와 밀접하게 연관되지 않는다.
또한, 소아는 암의 치료 기간 중, 치료 완료 후, 및 암의 생존자로서 독특한 문제에 직면한다. 예를 들어, 소아는 더 강한 치료를 받을 수 있지만, 암과 이의 치료는 성인의 신체에 비해 소아의 성장기 신체에 다른 영향을 미칠 수 있다. 소아는 성인의 증상을 조절하는데 사용되는 약물에 다르게 반응할 수 있다.
청소년 및 젊은 성인들은 흔히 더 어린 소아 또는 더 나이 많은 성인과는 다른 유형의 암을 진단받는다. 특정 암 유형의 발생률은 청소년 및 젊은 성인 연령 연속체 전역에 걸쳐 다양하다. 일부 증거에 따르면 급성 림프구성 백혈병을 앓는 청소년 및 젊은 성인은 성인 치료 요법을 받는 경우 보다 소아 치료 요법을 받는 경우 더 좋은 결과를 얻을 수 있다.
일반적으로, 유잉육종, 신경모세포종, 골육종 및 횡문근육종과 같은 재발성 또는 전이성 고형 종양을 앓는 소아는 전체 생존율이 30% 미만으로 낮다[1]. 소아 고형 종양 중에서, 신경모세포종은 소아에서 가장 일반적으로 발생하는 두개 외 암이고 1 내지 4세 소아에서 사망의 주요 원인이다[2].
신경모세포종은 교감신경조직에서 기원하고 매우 많은 다른 종류들로 이루어지며 복잡한 질환이다[3]. 최근 신경모세포종 치료의 개선으로 비-고위험 질환에 대한 5년 생존률이 90% 이상으로 증가하였다[4]. 하지만, 신경모세포종을 앓는 환자의 40% 이상이 고-위험으로 간주되며 집중 치료 요법에도 불구하고, 5년 생존율은 50% 미만이다[2, 4]. 또한, 재발성 신경모세포종의 예후는 5년 생존율이 10% 미만으로 암울하다[4].
재발성 또는 전이성 고형 종양, 특히 고-위험 및 재발성 신경모세포종을 앓는 소아 환자의 낮은 생존율을 감안할 때, 이들 악성 종양에 대한 새로운 요법적 접근이 시급히 필요하다.
성인 암성 종양에 대한 유용한 항암제군의 하나가 할로겐화 크산텐(할로겐화 크산텐) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다. 미국특허 제6,331,286호, 제7,390,668호 및 제7,648,695호 참조. 이들 할로겐화 크산텐 중에서, 로즈 벵갈 이나트륨(Rose Bengal disodium; 4,5,6,7-테트라클로로-2',4',5',7'-테트라아이오도플루오레세인 이나트륨; 4,5,6,7-tetrachloro-2',4',5',7'-tetraiodofluorescein disodium; RB)이 특히 효과적이고 쉽게 이용할 수 있는 것으로 나타났다. 성인 종양과 소아 종양의 습성이 매우 다른 경우가 많기 때문에, RB 및 이와 유사한 할로겐화 크산텐이 소아 암성 종양에서도 유사하게 효과적일지는 알려져 있지 않다.
PV-10은 0.9% 염수 중 10%의 RB 멸균 용액으로, 임상적으로는 유아의 간 기능을 측정할 때 사용한다[5]. 이전 연구에서 이 PV-10은 리소솜에 축적되고[6] 다양한 성인 암에서 세포 사멸을 유도하는 것으로 나타났다[7-11].
난치의 전이성 흑색종을 앓는 환자에 대한 임상 2상에서, PV-10의 병소 내(intralesional; IL) 주사가 51%의 전체 반응율로 종양 퇴행을 유도하였다[12]. 또한 PV-10은 인트랜짓(in-transit) 또는 전이성 흑색종을 앓는 환자에 대한 임상 2상에서 방사선요법과의 조합에 따라 86.6%의 전체 반응률로 효능이 입증되었다[13]. 직접 암세포 사멸을 유도하는 것에 더해, PV-10은 또한 마우스 연구[7, 8, 14] 및 임상[10, 12, 14, 15, 16] 모두에서 종양-특이적 면역 반응을 유도하는 것으로 나타났다.
포유동물 대상에서 소아암성 고형 종양을 치료하는 방법이 본 발명에서 고려된다. 관리 종양의 종양 세포 제거를 유도하는 양의 할로겐화 크산텐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 병소 내로 투여하는 것이 하나의 방법으로 고려된다. 두 번째 방법은 관리 종양의 종양 세포 제거를 유도하는 양의 할로겐화 크산텐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 병소 내로 투여하는 단계를 포함한다. 할로겐화 크산텐과 함께 상승적 세포독성을 제공하는 종양-억제 유효량의 전신성 항암 약물(medication) 또한 포유동물 대상에 전신적으로 투여된다.
상기 두 약물은 동시에 투여되거나, 하나가 다른 약물보다 약 1 내지 약 4주 전에 투여될 수 있다. 전신 투여의 약 1 내지 약 4주 전에 병소 내 투여를 수행하는 것이 바람직하다.
본 명세서의 일부를 형성하는 도면에서
도 1A 내지 1E를 포함하는 도 1은 PV-10이 소아 고형 종양 세포주에서 세포 생존력을 감소시키는 것을 나타낸다. 서로 다른 소아 고형 종양 세포주(유잉육종, 신경모세포종, 골육종 및 횡문근육종), 정상 섬유아세포주 및 1차 골수 시료에 PV-10을 농도별(3.125 내지 400μM)로 96시간 동안 처리하였다. 세포 생존력은 alamar blue® 분석으로 측정하였다. 세포 생존력%는 PBS(매체 대조군)의 해당 처리로 표준화하였다. 세포 생존력의 평균%는 3회의 개별 실험으로부터 계산하였고 평균의 표준오차를 나타내었다.
도 2A 및 2B를 포함하는 도 2는 PV-10이 신경모세포종 세포주에 세포독성을 나타낸다는 것을 보여주는 현미경사진이다. 도 2(A)에서, 신경모세포종 세포주 SK-N-AS, SK-N-BE(2) 및 IMR5, 그리고 가깝게 연관된 신경상피종 세포주 SK-N-MC를 PBS(매체 대조군), 50μM 또는 100μM PV-10으로 96시간 동안 처리하고 위상차 광학 현미경으로 관찰하였다. 실험은 3회 수행하였고 이미지로 나타내었다. 스케일바는 100㎛이다. 도 2(B)에서, 신경모세포종 세포주 SK-N-AS, SK-N-BE(2) 및 IMR5, 신경상피종 세포주 SK-N-MC를 PBS(매체 대조군) 또는 100μM PV-10으로 처리하고 시간-경과 비디오 현미경으로 관찰하였다. 48시간 동안 매 30분마다 이미지를 얻었다. 세포수를 세고 0시의 세포수로 표준화하였다. 실험 당 처리 당 적어도 350개의 세포를 계수하였다. 3회의 개별 실험으로부터 계산된 세포수의 평균% 및 평균의 표준오차를 나타내었다.
도 3은 PV-10이 암성 세포에서 리소솜을 파괴하는 것을 나타낸다. 신경모세포종 세포주 SK-N-AS, SK-N-BE(2) 및 IMR5를 PBS(매체 대조군) 또는 100μM PV-10으로 16시간 처리하였다. 산성 세포소기관에 모여 형광을 발하는 핵산 염색 Hoechst 33342 및 LysoTracker®Green DND-26으로 살아있는 세포를 염색하고, 형광 현미경으로 관찰하였다. 스케일바는 20㎛이다. 표현된 데이터는 3회의 개별 실험을 대표한다.
도 4A 및 도 4B를 포함하는 도 4는 PV-10이 세포 주기 G1 단계 세포의 %를 증가시키고 세포자멸사에 의한 세포 사멸을 유도한다는 것을 보여준다. 도 4A에서, 신경모세포종 세포주 SK-N-AS 및 IMR5를 PBS(매체 대조군), 50μM 또는 100μM PV-10으로 16 또는 24시간 동안 처리하고, DAPI로 염색하고 세포 주기 단계를 검출하기 위해 유세포분석으로 분석하였다. 3회의 개별 실험으로부터 G1, S 또는 G2/M 단계의 세포 평균%를 계산하고 평균의 표준오차를 나타내었다. 도 4B에서, 신경모세포종 세포주 SK-N-AS, SK-N-BE(2) 및 IMR5, 그리고 신경상피종 세포주 SK-N-MC를 PBS(매체 대조군), 75μM 또는 100μM PV-10으로 24시간 동안 처리하였다. 총 세포 파쇄물을 준비하고 전체 및 절단된 폴리-ADP 리보스 중합효소(poly-ADP ribose polymerase: PARP), 카스파제(카스파제) 3, 카스파제 7 및 카스파제 9의 수준을 검출하기 위해 웨스턴블롯으로 분석하였다. 엑틴(actin)을 로딩 대조군으로 사용하였다. 분자 질량을 킬로달톤(kDa)으로 나타내었다. 표현된 데이터는 2회의 개별 실험을 대표한다.
도 5는 PV-10 처리가 서로 다른 항암제 처리와 시너지 효과가 있음을 나타낸다. 신경모세포종 세포주 SK-N-AS, SK-N-BE(2) 및 IMR5, 신경상피종 세포주 SK-N-MC 및 정상 섬유아세포주 BJ를 0.1μM의 7종의 서로 다른 항암제 단독으로 또는 50μM PV-10과의 조합으로 처리하였다. 세포를 96시간 동안 처리하고 alamar blue®로 세포 생존력을 측정하였다. 세포 생존력%는 PBS(매체 대조군) 처리로 표준화하였다. 2회의 개별 실험으로부터 계산된 세포 생존력 평균% 및 이 평균의 표준오차를 나타내었다.
도 6A 및 도 6B를 포함하는 도 6은 PV-10 처리가 방사선조사 효과를 강화한다는 것을 보여준다. 신경모세포종 세포주 SK-N-AS(도 6A) 및 IMR5(도 6B)를 PBS(매체 대조군) 또는 50μM PV-10으로 4시간 동안 전처리하였다. 이후 세포를 0.5, 1 또는 2㏉로 방사선조사하고 추가 92시간 동안 배양하였다. 세포 생존력은 alamar blue®로 측정하였다. 3회의 개별 실험으로부터 계산된 세포 생존력 평균% 및 평균의 표준오차를 나타내었다. 별표는 유의적인 차이가 있음(대응 스튜던트 T-검정(paired student's t-test), p < 0.05)을 나타낸다.
도 7A 내지 7F를 포함하는 도 7은 PV-10 처리가 생체 내에서 종양 퇴행을 유도한다는 것을 나타낸다. CB17 SCID 마우스(군당 n=4) 오른쪽 옆구리에 IMR5-mCherryFluc 또는 SK-N-AS-mCherryFluc 세포를 피하 주사하였다. 종양 크기가 적어도 5 x 5 m가 되었을 때, 종양에 50㎕ PBS(매체 대조군), 25㎕ PV-10 또는 50㎕ PV-10을 주사하였다. 도 7A에서, 버니어 캘리퍼(버니어 캘리퍼)를 사용하여 IMR5-mCherryFluc 종양 성장을 측정하였다. 화살표는 처리일(6일째)을 나타낸다. 평균 종양 크기 및 평균의 표준오차를 나타내었다. 별표는 유의적인 차이가 있음(비대응 스튜던트 T-검정(unpaired student's t-test), p < 0.05)을 나타낸다. 도 7B에서, D-루시페린(D-luciferin)을 복강 내 주사한 후 Xenogen IVIS®200 시스템으로 생물발광 신호를 검출하여 IMR5-mCherryFluc 종양 성장을 측정하였다. 평균 종양 크기 및 평균의 표준오차를 나타내었다. 도 7C는 IMR5-mCherryFluc 종양을 갖는 마우스에 대한 생존 곡선을 보여준다. 별표는 유의적인 차이가 있음(로그-순위(맨텔-콕스) 검정(Log-rank (Mantel-Cox) test), p < 0.05)을 나타낸다. 도 7D에서, SK-N-AS-mCherryFluc 종양 성장을 버니어 캘리퍼를 사용하여 시간에 걸쳐 일 단위로 측정하였다. 화살표는 처리일(14일째)을 나타낸다. 평균 종양 크기 및 평균의 표준오차를 나타내었다. 도 7E에서, D-루시페린(D-luciferin)을 복강 내 주사한 후 Xenogen IVIS®200 시스템으로 생물발광 신호를 검출하여 처리 후 0, 12 및 15일에 SK-N-AS-mCherryFluc 종양 성장을 측정하였다. 평균 종양 크기 및 평균의 표준오차를 나타내었다. 도 7F는 SK-N-AS-mCherryFluc 종양을 갖는 마우스의 생존 곡선을 보여준다.
도 8은 도 7에 나타낸 각 실험군의 마우스 사진을 보여주는 것으로, 여기서 생물발광 이미지는 6, 12 및 17일 후 각 실험군(PBS 대조군, PV-10 25㎕ 및 PV-10 50㎕ 투여)의 활성화 옆구리 종양을 나타낸다.
도 1A 내지 1E를 포함하는 도 1은 PV-10이 소아 고형 종양 세포주에서 세포 생존력을 감소시키는 것을 나타낸다. 서로 다른 소아 고형 종양 세포주(유잉육종, 신경모세포종, 골육종 및 횡문근육종), 정상 섬유아세포주 및 1차 골수 시료에 PV-10을 농도별(3.125 내지 400μM)로 96시간 동안 처리하였다. 세포 생존력은 alamar blue® 분석으로 측정하였다. 세포 생존력%는 PBS(매체 대조군)의 해당 처리로 표준화하였다. 세포 생존력의 평균%는 3회의 개별 실험으로부터 계산하였고 평균의 표준오차를 나타내었다.
도 2A 및 2B를 포함하는 도 2는 PV-10이 신경모세포종 세포주에 세포독성을 나타낸다는 것을 보여주는 현미경사진이다. 도 2(A)에서, 신경모세포종 세포주 SK-N-AS, SK-N-BE(2) 및 IMR5, 그리고 가깝게 연관된 신경상피종 세포주 SK-N-MC를 PBS(매체 대조군), 50μM 또는 100μM PV-10으로 96시간 동안 처리하고 위상차 광학 현미경으로 관찰하였다. 실험은 3회 수행하였고 이미지로 나타내었다. 스케일바는 100㎛이다. 도 2(B)에서, 신경모세포종 세포주 SK-N-AS, SK-N-BE(2) 및 IMR5, 신경상피종 세포주 SK-N-MC를 PBS(매체 대조군) 또는 100μM PV-10으로 처리하고 시간-경과 비디오 현미경으로 관찰하였다. 48시간 동안 매 30분마다 이미지를 얻었다. 세포수를 세고 0시의 세포수로 표준화하였다. 실험 당 처리 당 적어도 350개의 세포를 계수하였다. 3회의 개별 실험으로부터 계산된 세포수의 평균% 및 평균의 표준오차를 나타내었다.
도 3은 PV-10이 암성 세포에서 리소솜을 파괴하는 것을 나타낸다. 신경모세포종 세포주 SK-N-AS, SK-N-BE(2) 및 IMR5를 PBS(매체 대조군) 또는 100μM PV-10으로 16시간 처리하였다. 산성 세포소기관에 모여 형광을 발하는 핵산 염색 Hoechst 33342 및 LysoTracker®Green DND-26으로 살아있는 세포를 염색하고, 형광 현미경으로 관찰하였다. 스케일바는 20㎛이다. 표현된 데이터는 3회의 개별 실험을 대표한다.
도 4A 및 도 4B를 포함하는 도 4는 PV-10이 세포 주기 G1 단계 세포의 %를 증가시키고 세포자멸사에 의한 세포 사멸을 유도한다는 것을 보여준다. 도 4A에서, 신경모세포종 세포주 SK-N-AS 및 IMR5를 PBS(매체 대조군), 50μM 또는 100μM PV-10으로 16 또는 24시간 동안 처리하고, DAPI로 염색하고 세포 주기 단계를 검출하기 위해 유세포분석으로 분석하였다. 3회의 개별 실험으로부터 G1, S 또는 G2/M 단계의 세포 평균%를 계산하고 평균의 표준오차를 나타내었다. 도 4B에서, 신경모세포종 세포주 SK-N-AS, SK-N-BE(2) 및 IMR5, 그리고 신경상피종 세포주 SK-N-MC를 PBS(매체 대조군), 75μM 또는 100μM PV-10으로 24시간 동안 처리하였다. 총 세포 파쇄물을 준비하고 전체 및 절단된 폴리-ADP 리보스 중합효소(poly-ADP ribose polymerase: PARP), 카스파제(카스파제) 3, 카스파제 7 및 카스파제 9의 수준을 검출하기 위해 웨스턴블롯으로 분석하였다. 엑틴(actin)을 로딩 대조군으로 사용하였다. 분자 질량을 킬로달톤(kDa)으로 나타내었다. 표현된 데이터는 2회의 개별 실험을 대표한다.
도 5는 PV-10 처리가 서로 다른 항암제 처리와 시너지 효과가 있음을 나타낸다. 신경모세포종 세포주 SK-N-AS, SK-N-BE(2) 및 IMR5, 신경상피종 세포주 SK-N-MC 및 정상 섬유아세포주 BJ를 0.1μM의 7종의 서로 다른 항암제 단독으로 또는 50μM PV-10과의 조합으로 처리하였다. 세포를 96시간 동안 처리하고 alamar blue®로 세포 생존력을 측정하였다. 세포 생존력%는 PBS(매체 대조군) 처리로 표준화하였다. 2회의 개별 실험으로부터 계산된 세포 생존력 평균% 및 이 평균의 표준오차를 나타내었다.
도 6A 및 도 6B를 포함하는 도 6은 PV-10 처리가 방사선조사 효과를 강화한다는 것을 보여준다. 신경모세포종 세포주 SK-N-AS(도 6A) 및 IMR5(도 6B)를 PBS(매체 대조군) 또는 50μM PV-10으로 4시간 동안 전처리하였다. 이후 세포를 0.5, 1 또는 2㏉로 방사선조사하고 추가 92시간 동안 배양하였다. 세포 생존력은 alamar blue®로 측정하였다. 3회의 개별 실험으로부터 계산된 세포 생존력 평균% 및 평균의 표준오차를 나타내었다. 별표는 유의적인 차이가 있음(대응 스튜던트 T-검정(paired student's t-test), p < 0.05)을 나타낸다.
도 7A 내지 7F를 포함하는 도 7은 PV-10 처리가 생체 내에서 종양 퇴행을 유도한다는 것을 나타낸다. CB17 SCID 마우스(군당 n=4) 오른쪽 옆구리에 IMR5-mCherryFluc 또는 SK-N-AS-mCherryFluc 세포를 피하 주사하였다. 종양 크기가 적어도 5 x 5 m가 되었을 때, 종양에 50㎕ PBS(매체 대조군), 25㎕ PV-10 또는 50㎕ PV-10을 주사하였다. 도 7A에서, 버니어 캘리퍼(버니어 캘리퍼)를 사용하여 IMR5-mCherryFluc 종양 성장을 측정하였다. 화살표는 처리일(6일째)을 나타낸다. 평균 종양 크기 및 평균의 표준오차를 나타내었다. 별표는 유의적인 차이가 있음(비대응 스튜던트 T-검정(unpaired student's t-test), p < 0.05)을 나타낸다. 도 7B에서, D-루시페린(D-luciferin)을 복강 내 주사한 후 Xenogen IVIS®200 시스템으로 생물발광 신호를 검출하여 IMR5-mCherryFluc 종양 성장을 측정하였다. 평균 종양 크기 및 평균의 표준오차를 나타내었다. 도 7C는 IMR5-mCherryFluc 종양을 갖는 마우스에 대한 생존 곡선을 보여준다. 별표는 유의적인 차이가 있음(로그-순위(맨텔-콕스) 검정(Log-rank (Mantel-Cox) test), p < 0.05)을 나타낸다. 도 7D에서, SK-N-AS-mCherryFluc 종양 성장을 버니어 캘리퍼를 사용하여 시간에 걸쳐 일 단위로 측정하였다. 화살표는 처리일(14일째)을 나타낸다. 평균 종양 크기 및 평균의 표준오차를 나타내었다. 도 7E에서, D-루시페린(D-luciferin)을 복강 내 주사한 후 Xenogen IVIS®200 시스템으로 생물발광 신호를 검출하여 처리 후 0, 12 및 15일에 SK-N-AS-mCherryFluc 종양 성장을 측정하였다. 평균 종양 크기 및 평균의 표준오차를 나타내었다. 도 7F는 SK-N-AS-mCherryFluc 종양을 갖는 마우스의 생존 곡선을 보여준다.
도 8은 도 7에 나타낸 각 실험군의 마우스 사진을 보여주는 것으로, 여기서 생물발광 이미지는 6, 12 및 17일 후 각 실험군(PBS 대조군, PV-10 25㎕ 및 PV-10 50㎕ 투여)의 활성화 옆구리 종양을 나타낸다.
종양-억제 유효량의 로즈 벵갈(RB, 4,5,6,7-테트라클로로-2',4',5',7'-테트라아이오도플루오레세인 이나트륨)과 같은 할로겐화 크산텐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 약학적 조성물로 종양 내로(병소 내로) 소아 고형 종양을 치료하는 방법이 본 발명에서 고려된다. 로즈 벵갈-함유 조성물은 단독 치료제로 유용할 수 있지만, 일부 바람직한 실시형태에서, 바람직하게는 소분자(비-단백질성, 약 1000그램/몰 미만) 또는 단백질성 분자(항체 또는 효소와 같은), 이온화 방사선 요법 또는 소위 체크포인트 억제 항체 요법이 될 수 있는 전신성 항암 약물(medication)과 같은 다른 항-종양 양식과 결합한다. 본 명세서에 나타난 바와 같이, 이들 조합 중 몇몇은 소아 종양에 대한 상승적 독성을 나타냈다.
할로겐화 크산텐
고려된 할로겐화 크산텐, 특히 바람직하게는 로즈 벵갈(4,5,6,7-테트라클로로-2',4',5',7'-테트라아이오도플루오레세인), 또는 에리트로신(erythrosin) B, 플록신(phloxine) B, 4,5,6,7-테트라브로모-2',4',5',7'-테트라아이오도플루오레세인(4,5,6,7-tetrabromo-2',4',5',7'-tetra-iodofluorescein), 2',4,5,6,7-펜타클로로-4',5',7'-트라이아이오도플루오레세인(2',4,5,6,7-pentachloro-4',5',7'-tri-iodofluorescein), 4,4',5,6,7-펜타클로로-2',5',7'-트라이아이오도플루오레세인(4,4',5,6,7-pentachloro-2',5',7'-tri-iodofluorescein), 2',4,5,6,7,7'-헥사클로로-4',5'-다이아이오도플루오레세인(2',4,5,6,7,7'-hexachloro-4',5'-di-iodofluorescein), 4,4',5,5',6,7-헥사클로로-2',7'-다이아이오도플루오레세인(4,4',5,5',6,7-hexachloro-2',7'-di-iodofluorescein), 2',4,5,5',6,7-헥사클로로-4',7'-다이아이오도플루오레세인(2',4,5,5',6,7-hexachloro-4',7'-di-iodofluorescein), 4,5,6,7-테트라클로로-2',4',5'-트라이아이오도플루오레세인(4,5,6,7-tetrachloro-2',4',5'-tri-iodofluorescein), 4,5,6,7-테트라클로로-2',4',7'-트라이아이오도플루오레세인(4,5,6,7-tetrachloro-2',4',7'-tri-iodofluorescein), 4,5,6,7-테트라브로모-2',4',5'-트라이아이오도플루오레세인(4,5,6,7-tetrabromo-2',4',5'-tri-iodofluorescein) 및 4,5,6,7-테트라브로모-2',4',7'-트라이아이오도플루오레세인(4,5,6,7-tetrabromo-2',4',7'-tri-iodofluorescein)을 포함하는 다른 할로겐화 크산텐은 적절한 약학적 조성물에 용해되거나 분산된 상태로 존재한다.
바람직한 형태인 로즈 벵갈 이나트륨은 다음의 구조식을 갖는다:
고려된 조성물에 대한 이러한 바람직한 실시형태의 특정 세부사항은 미국특허 제5,998,597호, 제6,331,286호, 제6,493,570호 및 제8,974,363호에 설명되어 있으며, 이들의 개시내용은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
고려된 조성물의 할로겐화 크산텐 성분의 전달은 조성물이 생리학적 pH(즉, 약 pH 7)에 가까운 pH 값을 가질 때, 특히 pH 값이 약 4를 초과하여, 할로겐화 크산텐이 조성물에서 이염의 형태로 존재하는 것이 보장될 때 가장 유리하다. 그러므로, 바람직한 실시형태에서, 조성물의 pH 값은 약 4 내지 약 10이며, 보다 바람직하게는 약 5 내지 약 9이고, 가장 바람직하게는 약 pH 6 내지 약 pH 8이다.
할로겐화 크산텐 성분을 조직으로 구획화하기 위한 선호도를 최대화하기 위해 친수성 매체가 약제에 바람직하다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 매체는 이러한 구획화에 간섭할 수 있는 비-친수성 성분을 최소한으로 함유한다.
따라서, 바람직한 조성물의 제형은, 친수성, 바람직하게는 물-함유, 매체에 할로겐화 크산텐, 특히 바람직하게는 로즈 벵갈(4,5,6,7-테트라클로로-2',4',5',7'-테트라아이오도플루오레세인), 또는 에리트로신 B, 플록신 B, 4,5,6,7-테트라브로모-2',4',5',7'-테트라-아이오도플루오레세인, 2',4,5,6,7-펜타클로로-4',5',7'-트라이-아이오도플루오레세인, 4,4',5,6,7-펜타클로로-2',5',7'-트라이-아이오도플루오레세인, 2',4,5,6,7,7'-헥사클로로-4',5'-다이-아이오도플루오레세인, 4,4',5,5',6,7-헥사클로로-2',7'-다이-아이오도플루오레세인, 2',4,5,5',6,7-헥사클로로-4',7'-다이-아이오도플루오레세인, 4,5,6,7-테트라클로로-2',4',5'-트라이-아이오도플루오레세인, 4,5,6,7-테트라클로로-2',4',7'-트라이-아이오도플루오레세인, 4,5,6,7-테트라브로모-2',4',5'-트라이-아이오도플루오레세인 및 4,5,6,7-테트라브로모-2',4',7'-트라이-아이오도플루오레세인을 포함하는 다른 할로겐화 크산텐을 적절한 약학적 조성물에 함유한다.
바람직한 형태인 로즈 벵갈 이나트륨은 다음의 구조식을 갖는다:
약학적 조성물에 대한 이러한 바람직한 실시형태의 특정 세부사항은 미국특허 제5,998,597호, 제6,331,286호, 제6,493,570호 및 제8,974,363호에 설명되어 있으며, 이들의 개시내용은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
고려된 할로겐화 크산텐-함유 조성물은 전형적으로 수성 매체 내 약 0.1% (w/v) 내지 약 20% (w/v)의 농도로 할로겐화 크산텐을 함유한다. 할로겐화 크산텐-함유 약학적 조성물은 바람직하게는 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 양이온 및 염화물, 인산염 및 질산염으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 음이온을 포함하는 수용성 전해질을 포함하며, 여기서 전해질은 약 0.1% (w/v) 및 약 2% (w/v) 사이의 농도이다.
제3의 성분은 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘의 염화물, 인산염 및 질산염으로부터 선택된 수용성 전해질이며, 여기서 전해질은 약 0.1 내지 약 2중량%의 농도, 또는 대안적으로는 약 100 mOsm/kg 초과 내지 약 600 mOsm/kg 까지의 삼투압농도를 제공하기에 충분한 수준으로 존재한다. 보다 바람직하게는, 약제 조성물의 삼투압농도는 250 mOsm/kg 초과이고, 가장 바람직하게는 약 300 내지 500 mOsm/kg이다. 전해질은 바람직하게는 염화나트륨이다. 전해질은 바람직하게는 약 0.5 내지 약 1.5%의 농도, 보다 바람직하게는 약 0.8 내지 약 1.2%의 농도, 가장 바람직하게는 약 0.9%의 농도로 생리식염수 내에 존재한다.
조성물의 수성 매체는 바람직하게는 주사에 사용하기 위한 기준을 충족하는 물 단독이다. 매체 부피의 약 20%까지는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 2-부탄올, 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 1,2-부탄디올, 2,3-부탄디올, 에리스리톨, 트레이톨, 트라이메틸올프로판, 솔비톨 등과 같은 하나 이상의 C1 내지 C6 1가- 또는 다가알코올일 수 있다. 보다 바람직하게는, 알코올은 고려된 조성물에 매체 부피 기준으로 약 10% 미만, 보다 바람직하게는 부피 기준으로 약 5% 미만으로 존재한다.
대안적으로 보면, 본 발명은 아래 화학식 1의 화합물로, 여기서 R1은 독립적으로 F, Cl, Br, I, H 또는 C1-C4 알킬; R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로 Cl, H 또는 I로 R2, R3, R4, R5로부터 선택된 적어도 하나의 치환기가 I이고 적어도 하나가 Cl 또는 H; R6은 독립적으로 H 또는 C1-C4 알킬; R11은 H 또는 C1-C4 알킬; R12는 H 또는 C1-C7 알킬;인 화합물 및 이의 모든 (a) 호변이성(tautomeric) 형태; (b) 회전장애 이성질체(atropisomer), (c) 화학식 2(아래)와 같은 폐쇄 락톤 형태, (d) 화학식 2의 락톤 형태의 거울상 이성질체(enantiomer) 및 (e) 약학적으로 허용가능한 염을 사용한다.
용어 "생리학적으로 허용되는 염", "약학적으로 허용가능한 염" 및 이의 다양한 문법적 형태는 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘, 마그네슘, 바륨, 암모늄 및 프로타민 아연 염을 포함하는 약학 산업에서 일반적으로 사용되는 알칼리 금속, 알칼리 토금속 및 암모늄 염과 같은 임의의 비-독성 양이온을 의미하며, 이 분야에 알려진 방법으로 제조할 수 있다. 고려된 양이온은 수용성 크산텐 염을 제공한다. 바람직하게는, 이 염은 단일염기 또는 이염기 염 형태의 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 암모늄이다. 약학적 화합물과 함께 생리학적으로 허용가능한 염을 형성하는 일반적으로 사용되는 생리학적으로(또는 약학적으로) 허용가능한 산 및 염기 리스트에 대해 문헌 [Berge, J. Pharm. Sci. 1977 68(1):1-19]을 참조할 수 있다.
할로겐화 크산텐 약학적 조성물의 pH 값은 당업자에게 알려진 임의의 적합한 수단으로 조절 또는 조정할 수 있다. 조성물은 완충하거나 산 또는 염기 등을 첨가하여 pH 값을 조정할 수 있다. 할로겐화 크산텐 또는 이의 생리학적으로 허용가능한 염은 할로겐화 크산텐 농도 및/또는 전해질 농도에 의존하는 약산이므로, 조성물의 pH 값은 완충제 및/또는 pH 값-조절제의 사용을 필요로 하지 않을 수 있다. 특히 바람직하게는 일단 투여되면 생물학적 환경에 적합하도록 조성물에 완충제가 없는 것이다.
또한, 많은 방부제가 약학적 조성물 또는 이의 제형에 유해하게 간섭하거나, 또는 할로겐화 크산텐 조성물 활성 성분과 복합체화 또는 상호작용하거나 이 활성 성분의 전달을 방해할 수 있어, 약학적 조성물은 어떠한 방부제도 포함하지 않는 것이 바람직하다. 방부제를 사용한다면, 이미드우레아(imidurea)가 약학적 조성물 내에서 또는 투여 시 할로겐화 크산텐과 상호작용하지 않으므로 바람직하다.
고려된 치료 방법은 이를 필요로하는 포유동물에 사용된다. 치료받는 포유동물은 인간과 같은 영장류, 침팬지 또는 고릴라와 같은 유인원, 필리핀 원숭이 또는 마카크와 같은 원숭이, 랫드, 마우스 또는 토끼와 같은 실험동물, 개, 고양이, 말과 같은 반려동물 또는 암소, 수소, 양, 어린양, 돼지, 염소, 라마와 같은 식용동물 등일 수 있다.
각 고려된 조성물은 전형적으로 치료되는 고형 암성 종양이 원하는 정도로 감소할 때까지, 예를 들어 검출될 수 없을 때까지, 이를 필요로 하는 포유동물에 생체 내로 반복적으로 투여된다. 따라서, 필요로하는 포유동물에 대한 투여는 치료하는 의사의 지시에 따라 하루, 매일, 매주, 매달 또는 수개월 내지 수년에 걸쳐 여러 번 발생할 수 있다.
고려된 할로겐화 크산텐 화합물은 종양에 직접적으로 주사되었을 때 전형적으로 암세포의 리소솜에 흡수 및 축적되고 세포자멸사 또는 다른 메커니즘을 통해 세포 사멸을 유도한다. 암세포 사멸을 유발하면, 세포는 분해되거나 제거된다. 이때 발생하는 세포 단편은 특히 세포 단편 상에 표시된 항원으로 포유동물의 면역 체계를 자극하여 종양 내(병소 내) 주사 부위로부터 멀리 떨어진 종양을 인식하고 죽이도록 하는 것으로 생각된다.
앞서 언급한 바와 같이, 할로겐화 크산텐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 바람직한 고려된 조성물은 PV-10™을 가리키며, 이 PV-10™는 0.9% 염수에 로즈 벵갈(RB, 4,5,6,7-테트라클로로-2',4',5',7'-테트라아이오도플루오레세인 이나트륨)이 10%로 포함된 멸균 용액이다.
할로겐화 크산텐과 조합으로 사용될 때 상승적 세포독성을 제공하는 종양-억제 유효량의 전신성 항암 약물은 필요로하는 포유동물 대상에 투여되며 일반적인 액체, 젤, 고체 또는 다른 형식을 사용하여 제형화될 수 있다. 그러므로, 전신성 항암 약물은 예시적으로 타블렛 또는 액체 조성물로 경구적으로, i.v., i.m., s.c., 복강 내 주사로, 이온화 방사선에 의해, 또는 대상에 유효량의 항암 약물을 제공하는 임의의 다른 형태로 투여될 수 있다.
전신성 항암 약물
소분자(비-단백질성, 약 1000그램/몰 미만) 또는 보다 큰 단백질성 분자인 전신성 항암 약물은 치료를 위해 대상 포유동물에 투여되고 이로 인해 약물은 할로겐화 크산텐의 병소 내 투여로 발생하는 국소적 투여와 달리 대상의 신체 전체에 걸쳐 퍼진다. 예시적인 소분자 항암 약물은 본 명세서에 사용된 독소루비신(doxorubicin), 에토포시드(etoposide), 빈크리스틴(vincristine), 시스플라틴(cisplatin), 이리노테칸(irinotecan) 및 시타라빈(cytarabine)을 포함하며, 예시적인 단백질성 분자는 아스파라기나제(asparaginase)이다. 이들 약물 중, 독소루비신, 에토포시드 및 빈크리스틴은 PV-10의 치사량보다 낮은 투여량의 치료와 함께 상승적인 것으로 나타났으므로, 바람직하다.
소분자 전신성 항암 약물의 유용한 유효 투여량은 FDA-, 국내- 또는 국제 기관-승인 약물의 라벨링 정보에 명시된 용량이다. 일반적으로, 단일요법 투여량 일정은 초기-단계 임상시험에서 최대 내성 투여량(MTD)을 결정하여 설정된다. MTD(또는 그에 가까운 변형)는 유효성 평가 및 안전성에 대한 보다 상세한 평가를 위해 후기-단계 임상시험에서 발표된다. 주로 이 MTD는 임상시험 완료 시 확립된 요법적 투여량이 된다. 하지만, 소분자 전신성 항암 약물을 PV-10과 함께 사용하는 것을 고려하기 때문에, MTD는 사용될 최대 투여량이며, 이 양은 일반적인 절차에 따라 하향조정된다.
국소적 PV-10 요법과 본 발명에서 조합될 수 있는 다수의 전신성 항암 약물에 대한 예시적인 투여 일정을 아래 표 A에 제공한다. 아래에 나열된 약물 중 몇몇은 위에서 정의된 "소분자"이며, 다른 것들은 항체와 같은 큰 단백질성 분자이다. 그렇더라도 이들 모두 전신적으로 투여된다.
아래에 기재된 단백질성 항암 약물은 일반적으로 TNF 패밀리 및 인터루킨 패밀리와 같은 케모카인으로 야기되는 염증성 반응을 억제한다.
[표 A]
추가적이거나 상승적인 효과 때문에, 본 발명의 조합 요법 및 치료 방법은 아래 기술된 바와 같은 국소 요법과 함께 사용될 때, 표 A에 기재된 것과 같은 전신성 물질에 대한 일반적인 투여 일정의 수준 또는 이하의 수준에서 전신성 물질의 사용을 허가한다. 하지만, 표 A에 제공되는 투여 일정은 그 투여량이 주어진 환자를 돌보는 의사가 적절하다고 판단한 줄어든 양으로 적정될 수 있는 치료를 시작하기 위해 유용한 가이드를 제공한다.
이온화 방사선 치료
본 명세서에 개시된 결과는 PV-10과 이온화 방사선의 조합 치료 또한 전체적으로 치료의 세포독성을 높인다는 것을 보여준다. 여기서 시험관 내 연구를 위해, 먼저 신경모세포종 세포를 치사량 아래의 PV-10과 4시간 동안 접촉시키고 이온화 방사선을 0.5, 1 또는 2 Gray의 투여량으로 조사하였다.
이러한 치료 요법은 예시적인 것이며 이러한 치료 조합 개념이 입증되었음을 이해해야 한다. 당업자는 이러한 효과 및 이에 따른 치료 규모를 활용할 수 있다.
체크포인트 항체 억제제
추가 조합 치료 요법은 PV-10 및 특별한 전신성 항암 약물로 볼 수 있는 체크포인트 항체 억제제의 투여를 이용한다. 유용한 체크포인트 항체 억제제는 인간화 단일클론 항체로 이의 투여는 면역 체계가 암세포를 이물질로 인식하고 신체에서 이들 암세포를 제거하는 것을 도울 수 있다.
일부 체크포인트 억제제 항체는 T 세포의 표면 상 PD-1(세포 예정사 단백질 1; programmed cell death protein 1) 수용체 또는 이 수용체의 리간드 PD-L1을 표적으로 한다. 이러한 단일클론의 예시는 PD-1을 억제하는 펨브로리주맙(pembrolizumab) 및 니볼루맙(nivolumab)이다. PD-L1을 표적으로 하는 항체는 아테졸리주맙(atezolizumab), 아벨루맙(avelumab) 및 더발루맙(durvalumab)이다. 다른 군의 체크포인트 억제제 단일클론 항체에는 면역 체계를 하향조절하는 단백질 수용체인 CTLA-4를 표적화하는 이필리무맙(ipilimumab) 및 트레멜리무맙(tremelimumab)이 포함된다.
이들 항암 약물은 일반적으로 전신적으로도 사용된다. 이들 약물의 포장 라벨에 표시된 MTD는 이전에 언급된 바와 같이 시험 중 일반적으로 하향 적정되는 시작 투여량이 될 수 있다.
투여량
PV-10 동반 전신성 약물은 수용 대상이 필요로 하거나 견딜 수 있는 만큼 자주 투여될 수 있다. 소분자는 전형적으로 생체 내 반감기가 비교적 짧거나 몇분 내지 며칠이다. 반면에, 체크포인트 억제제 항체는 주로 1 내지 3주의 생체 내 반감기를 갖는다.
로즈 벵갈의 생체 내 생물학적 수명은 랫드에서 몇분인 것으로 이해된다. 하지만, 병소 내 PV-10 투여가 T 세포 면역 상승을 유도하는 것으로 알려져 있기 때문에, PV-10의 투여 효과는 기억 T 세포에 의해 수개월 또는 그 이상 지속될 수 있다.
조성물 반응물의 다양한 반감기의 영향으로, 먼저 PV-10으로 치료하고 이후 하나 이상의 조합 약물로 치료하는 것이 바람직하다. 조합 약물은 바람직하게는 유도된 면역 활성화가 적어도 시작될 수 있도록 PV-10 투여 후 약 1 내지 약 4주에 투여한다.
전신성 항암 약물 사전처리도 유용할 수 있다. 여기서 전신성 항암 물질은 면역 반응을 개시할 수 있고 이후 PV-10 처리로 면역 반응이 강화될 수 있다. 여기서, 또한 처음 두 처리 사이의 시간이 약 1 내지 약 4주인 것이 바람직하다.
두 약물은 또한 거의 같은 시간에, 동시에, 서로 약 1주 내에 동시에 투여할 수 있다.
결과
PV-10은 소아 고형 종양 세포주의 성장을 억제한다
소아 고형 종양에서 PV-10의 효과를 결정하기 위해 유잉육종, 신경모세포종, 골육종, 횡문근육종 및 정상 섬유아세포주 및 정상 1차 골수 시료를 서로 다른 농도의 PV-10(3.125 내지 400μM)으로 96시간 동안 처리하고 alamar blue®을 사용하여 세포 생존력을 측정하였다(도 1A 내지 도 1E). PV-10은 실험한 모든 세포주에서 농도-의존적으로 세포 생존력을 감소시켰다. 실험한 모든 고형 종양 세포주에 대한 IC50 값을 계산하였다. 아래 표 1은 96시간의 PV-10 처리 후 소아 고형 종양 세포주에 대한 값을 보여준다. 보다시피, 그 값은 45 내지 108μM의 범위이며, 평균은 70μM이다.
| 세포주 | 세포 유형 | PV-10 IC50 μM |
| SK-PN-DW | 유잉육종 | 80 |
| SK-ES | 유잉육종 | 45 |
| SK-N-AS | 신경모세포종 | 85 |
| LAN1 | 신경모세포종 | 80 |
| SK-N-BE(2) | 신경모세포종 | 73 |
| IMR5 | 신경모세포종 | 73 |
| SHEP | 신경모세포종 | 73 |
| SK-N-SH | 신경모세포종 | 65 |
| SK-N-MC | 신경상피종 | 45 |
| 143B | 골육종 | 108 |
| HOS | 골육종 | 75 |
| RD | 횡문근육종 | 56 |
| RH30 | 횡문근육종 | 51 |
이와 대조적으로, 정상 섬유아세포주 및 1차 골수 시료에 대한 IC50 값은 73 내지 143μM의 범위, 평균 104μM로 더 높았다(표 2). 표 2는 96시간의 PV-10 처리 후 정상 섬유아세포주 및 1차 골수 시료에 대한 절반 최대 억제 농도(IC50) 값을 제공한다.
| 세포주 | 세포 유형 | PV-10 IC50 (μM) |
| BJ | 정상 섬유아세포(포피) | 143 |
| 1차 골수 | 정상 1차 섬유아세포 | 136 |
| WI38 | 정상 섬유아세포(폐) | 93 |
| WI38 hTERT | 정상 섬유아세포(폐) hTERT 형질전환 | 75 |
| BJ hTERT | 정상 섬유아세포(포피) hTERT 형질전환 | 73 |
PV-10은 신경모세포종 세포주에 대해 세포독성을 나타낸다
PV-10이 소아 고형 종양 세포주에 대해 세포독성을 나타낸다는 것을 확인하고, 신경모세포종에 관심을 가지게 되었는데, 이는 신경모세포종이 소아에서 가장 일반적인 두개외 암이기 때문이다. PV-10이 신경모세포종 세포주에 대해 세포독성을 나타내는지 또는 세포증식억제성을 나타내는지를 조사하였다. 실험을 위해 4종의 서로 다른 세포주, 즉 서로 다른 돌연변이를 가지며 IC50 값을 기초로 PV-10에 서로 다른 민감도를 갖는 3종의 신경모세포종 세포주[SK-N-AS, SK-N-BE(2) 및 IMR5], 및 IC50 값을 기초로 PV-10에 매우 민감한 1종의 신경상피종 세포주(SK-N-MC)를 선택하였다.
세포를 PBS(매체 대조군), 50μM 또는 100μM PV-10으로 96시간 동안 처리하고 위상차 광학 현미경으로 관찰하였다(도 2A). PBS로 처리한 세포는 밀집하여 성장하였다. 50μM PV-10으로 처리한 세포는 밀집하여 성장하지 않았지만 죽은 세포는 거의 발견되지 않았다.
이와 대조적으로, 100μM PV-10으로 처리한 플레이트에는 붙은 채로 남아있는 세포가 거의 없었고, 이는 100μM PV-10이 모든 세포주에 대해 세포독성을 나타내었다는 것을 의미한다. 하지만, SK-N-AS 세포가 처리에 대해 가장 잘 저항하고 SK-N-MC가 처리에 대해 가장 민감한 것과 같이 세포주마다 PV-10에 대해 서로 다른 민감도를 갖는 것으로 나타났다.
신경모세포종 세포주들은 PV-10에 대해 서로 다른 민감도를 나타낸다
시간-경과 비디오 현미경을 사용하여 100μM PV-10으로 12, 24, 36 및 48시간 처리한 후 플레이트에 부착된 세포의 비율을 정량함으로써 PV-10에 대한 4종 세포주(SK-N-AS, SK-N-BE(2), IMR5 및 SK-N-MC)의 서로 다른 민감도를 조사하였다. 처리 후 부착된 세포수를 0시간의 세포수에 대해 표준화하였다(도 2B).
SK-N-AS 세포는 12시간에 세포의 89%, 48시간에 세포의 41%가 부착되어 처리에 대해 가장 잘 저항하였다. SK-N-MC 세포는 12시간에 세포의 3.5%가 부착되었고, 48시간에는 부착된 세포가 0%로 처리에 대해 가장 민감했다. IMR5 세포는 SK-N-BE(2) 세포(각각 부착된 세포의 54 및 14%)와 비교하여 12 및 24시간(각각 세포의 16%, 7%가 부착)에는 처리에 대해 더 민감하였지만, 36시간에는 두 세포주의 부착된 세포 비율이 유사하였다(SK-N-BE(2)는 3%, IMR5 세포는 2%).
이 데이터는 처리 후 초기에 SK-N-MC 세포가 처리에 대해 가장 민감하고, IMR5이 SK-N-BE(2) 세포 보다 처리에 대해 더 민감하고, SK-N-AS 세포가 처리에 대해 가장 잘 저항한다는 것을 보여준다.
PV-10 처리는 리소솜을 붕괴시킨다
이전에, PV-10이 리소솜의 온전성 손실을 유도하는 것으로 나타났다[6]. 따라서 SK-N-AS, SK-N-BE(2) 및 IMR5 세포를 PBS(매체 대조군) 또는 100μM PV-10으로 16시간 동안 처리하였다. 산성 세포소기관에 모여 형광을 발하는 핵산 염색 Hoechst 33342 및 LysoTracker®Green DND-26으로 살아있는 세포를 염색하고, 형광 현미경으로 관찰하였다(도 3).
PBS-처리한 세포 및 SK-N-AS PV-10-처리 세포에서, 리소솜이 특정 초점으로 가시화되었다. 하지만, PV-10 처리한 SK-N-BE(2) 및 IMR5 세포에서는, 이들 초점이 더이상 보이지 않았다.
PV-10 처리는 세포 주기의 G1 단계 IMR5 세포 비율을 증가시킨다
추가로 PV-10의 표적 조절을 결정하기 위해 유세포분석으로 세포 주기 상 PV-10의 효과를 분석하였다(도 4A). 가장 잘 저항하는 신경모세포종 세포주(SK-N-AS) 및 가장 민감한 신경모세포종 세포주(IMR5)를 PBS(매체 대조군), 50μM 또는 100μM PV-10으로 16 또는 24시간 동안 처리하였다.
PV-10은 SK-N-AS 세포의 세포 주기에 대한 효과가 없었다. 반면, 100μM PV-10은 G1 단계의 IMR5 세포 비율을 증가시켰다. 100μM PV-10 처리 16시간 후에, G1 단계의 IMR5 세포의 비율이 PBS 처리 세포에 비해 28% 증가하였다. 유사하게, 100μM PV-10 처리 24시간 후에, G1 단계의 세포 비율이 비-처리 세포에 비해 30% 증가하였다.
PV-10 처리는 세포자멸사를 유도한다
PV-10 처리 세포가 세포자멸사를 겪는지를 조사하기 위해 웨스턴블롯 분석을 실시하였다. SK-N-AS, SK-N-BE(2), IMR5 및 SK-N-MC 세포를 PBS(매체 대조군), 75μM 또는 100μM PV-10으로 24시간 동안 처리하였다. 전체 및 절단된 폴리-ADP 리보스(PARP), 전체 및 절단된 카스파제 3, 전체 및 절단된 카스파제 7 및 엑틴(로딩 대조군)의 수준을 검출하기 위해 총 세포 추출물을 웨스턴블롯으로 분석하였다(도 4B).
PV-10 처리는 PARP의 농도-의존적 절단을 나타냈다. SK-N-MC 세포(PV-10에 대해 가장 민감한 세포주)에서 총 단백질 및 총 PARP 수준이 낮은 것과 같이 100μM PV-10 처리는 모든 세포주에서 PARP 절단을 유도하였다. 75μM PV-10으로 처리한 SK-N-AS 및 SK-N-BE(2) 세포는 100μM PV-10 처리 세포보다 PARP 절단이 덜한 것으로 나타난 반면, IMR5 세포는 75μM 및 100μM PV-10으로 처리한 경우의 PARP 절단 수준이 유사했다. 100μM로 처리한 세포에 비해 75μM PV-10으로 처리한 SK-N-MC 세포에서 더 많은 총 PARP가 존재하였다.
카스파제 3, 7 및 9의 활성화는 PV-10 농도 및 세포주에 의존적이었다. 잘린 카스파제 3는 100μM PV-10를 처리한 IMR5 세포 내에 존재하였다. 총 카스파제 7의 수준은 SK-N-BE(2) 세포에서 더 낮았다.
IMR5 및 SK-N-MC 세포를 75 및 100μM PV-10로 처리하였고 잘린 카스파제 7이 100μM PV-10로 처리한 SK-N-AS 및 SK-N-BE(2) 세포 및 75 및 100μM PV-10로 처리한 IMR5 세포에서 검출되었다. 총 카스파제 9의 수준은 75 및 100μM PV-10로 처리한 SK-N-BE(2) 세포에서 더 낮았고 잘린 카스파제 9은 75 및 100μM PV-10로 처리한 IMR5 세포에서 검출되었다. 이들 데이터는 PV-10이 세포자멸사에 의해 세포 사멸을 유도한다는 것을 나타낸다.
PV-10은 다른 항암제와 시너지 효과가 있다
일반적으로 사용되는 소분자 전신성 항암 약물을 PV-10과 조합하여 세포독성을 높일 수 있는지를 확인하기 위해, 신경모세포종 세포주 SK-N-AS, SK-N-BE(2) 및 IMR5, 신경상피종 세포주 SK-N-MC 및 정상 섬유아세포주 BJ를 다른 작용기작을 갖는 7가지의 기존 화학요법제의 패널에 대해 먼저 스크리닝하였다(도 5). 모든 제제를 0.1μM로, 단독 및 세포독성 농도보다 낮은 농도인 50μM의 PV-10와 조합으로 스크리닝하였다. alamar blue® 분석을 사용하여 96시간 처리 후 세포 생존력을 결정하였다.
이들 결과를 기초로, 조합하였을 때 가장 큰 세포독성 증가를 나타내고 BJ 세포 상에서 적은 효과를 갖는 제제를 조합 지수(CI) 및 시너지를 결정하기 위한 다음 연구를 위해 선택하였다[18]. SK-N-AS, SK-N-BE(2), IMR5 및 SK-N-MC 세포에서 CI 연구를 위해 평가한 제제는 독소루비신, 에토포시드 및 빈크리스틴이었다.
아래 표 3은 독소루비신, 에토포시드 또는 빈크리스틴을 단독으로 또는 50μM PV-10과의 조합으로 96시간 동안 처리한 신경모세포종 세포주(SK-N-AS, SK-N-BE(2) 및 IMR5) 및 신경상피종 세포주 SK-N-MC에 대한 조합 지수를 제공한다.
| 세포주 | 독소루비신 | 에토포시드 | 빈크리스틴 |
| SK-N-AS | 0.77 | 0.17 | 0.35 |
| SK-N-BE(2) | 0.72 | 0.66 | 0.1 |
| IMR5 | 0.38 | 0.65 | 0.2 |
| SK-N-MC | 0.42 | 0.58 | 0.43 |
모든 제제는 각각 분석된 세포주에서 50μM PV-10과의 시너지 효과를 나타내었다. 보는 바와 같이, CI 값은 독소루비신에 대해 0.42 내지 0.77, 에토포시드에 대해 0.17 내지 0.66, 빈크리스틴에 대해 0.1 내지 0.43의 범위였다.
PV-10은 신경모세포종 세포주에서 방사선 감수성을 유도한다
일반적으로 사용되는 화학요법에 더해, PV-10이 SK-N-AS(도 6A) 및 IMR5(도 6B) 세포에서 이온화 방사선(IR) 치료 효과를 높이는지를 조사하였다. 세포를 PBS(매체 대조군) 또는 50μM PV-10으로 4시간 동안 전처리하고 0.5, 1 또는 2 그레이(㏉)로 방사능 처리하였다. 치료 시작 96시간 후 alamar blue®로 세포 생존력을 측정하였다.
50μM PV-10 전처리는 SK-N-AS 및 IMR5 세포 모두에서 IR의 효과를 높였다. SK-N-AS 세포의 경우, 세포를 0.5㏉, 1㏉ 또는 2㏉로 방사선 처리하기 4시간 전에 PV-10으로 전처리하였을 때 세포 생존력이 각각 54.8%, 58.7% 및 60% 감소하였다. IMR5 세포의 경우, 세포를 0.5㏉, 1㏉ 또는 2㏉로 방사선 처리하기 4시간 전에 PV-10으로 전처리하였을 때 세포 생존력이 각각 24%, 21% 및 13% 감소하였다.
PV-10은 생체 내에서 종양 퇴행을 유도한다
PV-10이 생체 내에서도 활성적인지를 확인하기 위해, CB17 SCID 마우스의 피하 SK-N-AS 및 IMR 종양에 대한 PV-10 피하 종양 내 주사의 효과를 특성화하였다. 종양을 25 또는 50㎕ PV-10[8]으로 1회 주사하고 매일 모니터링하였다.
IMR5 종양은 PV-10 처리에 매우 민감하였다(도 7A 및 도 7B). 대조군 종양의 경우, 처리 6일 후 25.6㎟에서 처리 23일 후 172.9㎟로 종양 크기가 증가하였다. 이에 비해, 25㎕ PV-10으로 처리한 종양은 26.6㎟에서 41.2㎟로 증가하였고 50㎕ PV-10으로 처리한 종양은 27.9㎟에서 47.3㎟로 증가하였다. 또한, D-루시페린을 복강 내 주사한 다음 종양으로부터 방출되는 생물발광 신호를 측정하는 Xenogen IVIS®200 시스템을 사용하여 종양 성장을 정량하였다.
종양 크기는 25 및 50㎕ PV-10 처리 후 감소하였으며 처리 17일 후에도 낮게 유지되었다. PV-10 처리는 또한 투여량 의존적으로 생존율을 증가시켰다(도 7C).
대조군 처리한 마우스는 평균 25.5일의 생존을 나타낸 반면, 25㎕ PV-10으로 처리한 마우스는 평균 41.5일 생존하였고 50㎕ PV-10으로 처리한 마우스는 평균 76일 생존하였다. 추가적으로, 50㎕ PV-10으로 처리한 마우스 중 2마리는 완전한 종양 퇴행을 겪었고 처리 후 120일 동안 종양이 없는 채로 유지되었다.
SK-N-AS 종양 또한 PV-10 처리에 반응하였다(도 7D 및 도 7E). 대조군 종양의 경우, 종양 크기가 처리 6일 후 28.9㎟에서 처리 18일 후 179.3㎟로 증가하였다. 이에 비해, 25㎕ PV-10으로 처리한 종양은 25.3㎟에서 92.1㎟로 증가하였고 50㎕ PV-10으로 처리한 종양은 29.3㎟에서 57.5㎟로 증가하였다. Xenogen IVIS®200 시스템을 사용하여 측정하였을 때 종양 크기가 25 및 50㎕ PV-10으로 처리한 후 감소하였고 처리 15일 후 대조군 처리한 종양에 비해 낮게 유지되었다.
PV-10 처리는 생존율도 증가시켰다(도 7F). 대조군 처리한 마우스는 평균 29일의 생존을 나타낸 반면, 25㎕ PV-10으로 처리한 마우스는 평균 37일 생존하였고 50㎕ PV-10으로 처리한 마우스는 평균 36일 생존하였다. 추가적으로, 50㎕ PV-10으로 처리한 마우스 1마리는 완전한 종양 퇴행을 겪었고 처리 후 80일 동안 종양이 없는 채로 유지되었다.
논의
소아 고형 종양을 앓는 소아의 전체 생존율은 혈액 악성종양을 앓는 소아에 비해 낮다[1]. 재발성 또는 전이성 유잉육종, 신경모세포종, 골육종 및 횡문근육종을 앓는 소아의 경우, 전체 생존율은 30% 미만이다[1].
이들 암 중에서, 신경모세포종이 가장 일반적이고 1 내지 4세 소아의 주요 사망 원인이다[2]. 소아 고형 종양을 앓는 환자의 생존율이 낮고, 고위험 및 재발 환자에 제공되는 집중적인 치료 요법과 연관된 이환율을 감안하면, 새로운 요법적 접근법의 개발과 이러한 암을 앓는 환자에 대한 초기 단계 임상 시험이 시급히 필요하다.
PV-10은 0.9% 염수 중 10%의 로즈 벵갈륨(RB, 4,5,6,7-테트라클로로-2',4',5',7'-테트라아이오도플루오레세인 이나트륨) 멸균 용액으로, 다양한 성인 암에서 세포 사멸을 유도하지만, 소아 암에 사용하기 위해서는 시험되지 않았다[7-11]. PV-10이 다른 성인 암에서 세포 사멸을 유도하고 몇몇 임상 시험에서 평가되었기 때문에[10, 12, 14, 15, 16], 다른 소아 고형 종양 세포주(유잉육종, 신경모세포종, 골육종 및 횡문근육종)에서 PV-10의 효과를 조사하였다.
PV-10은 소아 고형 종양 세포주에서 세포 생존력을 농도-의존적으로 감소시켰다. 기대했던 것처럼, 정상 섬유아세포주 및 1차 골수 시료는 PV-10에 덜 민감하였다. 이들 데이터는 이전에 공개된 성인 암에서의 데이터와 유사하며[7, 9, 11] PV-10이 여러 소아 고형 종양에 대한 효과적인 치료제가 될 수 있음을 나타낸다.
PV-10의 표적 조절을 특징짓기 위해, 소아에서 발견되는 가장 일반적인 두개 외 고형 악성종양인 신경모세포종 및 이와 밀접하게 관련된 신경상피종에 연구를 집중하였다. 위상차 현미경을 통해, PV-10이 신경모세포종에 세포독성적이며 IC50 값과도 일치함을 발견하였고, PV-10 처리에 대해 SK-N-AS 세포가 가장 저항하고 SK-N-MC가 가장 민감한 것으로 확인되었다. 이러한 발견은 처리에 대해 SK-N-AS 세포가 가장 저항하고 SK-N-MC이 가장 민감한 것으로 나타난 시간-경과 비디오 현미경으로 확증되었다.
추가적으로, 비록 36시간에 두 유형의 세포가 거의 남아있지 않았지만, 12 및 24시간에서 IMR5 세포가 SK-N-BE(2) 세포보다 처리에 대해 더 민감함을 발견하였다. 초기에 100μM PV-10에 대한 민감도가 다름에도 불구하고, 이 농도는 96시간에 여전히 대부분의 SK-N-AS 세포에 대해 세포독성적이었고 용량을 200μM로 높이면 SK-N-AS 세포 사멸이 더욱 증가하였다. 비록 일부 하위-유형에 대해 용량을 더 높이는 것이 필요할 수 있지만, 이들 데이터는 PV-10이 모든 신경모세포종에 대해 효과적인 치료제가 될 수 있음을 제안한다.
PV-10에 대한 다른 민감도는 세포주의 다른 유전적 배경뿐만 아니라 세포주가 단리된 종양의 다른 이력(다른 환자 치료 및 1차와 재발)에 따른 것일 수 있다. 신경모세포종은 유전적으로 서로 다른 질환이므로 이를 반영하기 위해 다른 세포주를 선택하였다.
신경모세포종에서 가장 일반적인 종양형성 원인은 환자의 약 25%에서 나타나는 MYCN 증폭, 환자의 약 10 내지 15%에서 나타나는 역형성 림프종 인산화효소(anaplastic lymphoma kinase: ALK) 돌연변이 및 증폭 및 재발 시 획득되는 TP53의 돌연변이이다[2]. COSMIC(Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) 세포주 프로젝트를 사용하여[20], SK-N-AS 세포가 NRAS 및 FLT3에 돌연변이를 갖고; SK-N-BE(2) 클론이 TP53의 동형접합 돌연변이로 ALK, AKT 및 MYCN을 과발현하고; IMR5 세포가 mTOR의 동형접합 돌연변이로 AKT 및 MYCN의 과발현을 나타내고; SK-N-MC 클론이 MYCN의 과발현 및 TP53의 동형접합 돌연변이를 나타낸다는 것을 확인하였다. 추가적으로, SK-N-AS, SK-N-BE(2) 및 SK-N-MC 세포주는 모두 다른 치료 이력을 갖는 전이성 종양으로부터 유래한 반면, IMR5 세포주는 1차 종양으로부터 유래하였다.
이전에 PV-10이 리소솜을 붕괴시켜 세포 사멸을 유도하는 것으로 나타났다[6]. 암세포는 변경된 물질 대사를 가지며 영양분의 재순환 및 빠른 성장 및 분열 산물(응집된 단백질 및 손상된 세포소기관과 같은)의 제거를 위해 리소솜에 의존할 수 있기 때문에 리소솜의 붕괴는 특히 암세포의 생존에 영향을 미친다[21]. 더욱이, 리소솜의 붕괴는 괴사(necrosis) 또는 세포자멸사를 유도할 수 있는 카텝신(cathepsin) 단백질분해효소를 방출한다[21].
신경모세포종의 리소솜 상에서 PV-10의 효과를 조사하기 위해, 산성 세포소기관에 모여 형광을 내는 LysoTracker®Green DND-26로 염색한 세포를 관찰하였다. 이전 결과와 유사하게, PBS-처리한 세포에서는 리소솜이 명확한 점으로 나타났지만, PV-10으로 처리한 SK-N-BE(2) 및 IMR5 세포에서는 나타나지 않았다. 흥미롭게도, 더 저항성인 SK-N-AS 세포에서는 처리 후에도 리소솜이 붕괴되지 않았고 명확한 점으로 나타났다.
100μM PV-10 처리는 IMR5에서 G1-단계 세포 주기 억류를 유도하였고(SK-N-AS에서는 그렇지 않았음), 용량- 및 세포주-의존적으로 세포자멸사를 유도하였다. 성인 암에서 PV-10가 세포자멸사 또는 괴사에 의해 세포 사멸을 유도하는 것은 이전에 확인되었다[7, 9, 11, 14]. 세포가 괴사에 의해 죽는 것으로 나타난 연구에서, PV-10는 세포 사멸 전에 G2/M 세포 주기 억류를 유도하였는데[7], 이는 PV-10가 다른 암의 세포주에서 다른 작용기작을 가질 수 있다는 것을 제안한다.
성인 종양에 대한 임상 시험 및 전-임상 연구에서 PV-10 단일 처리의 효능이 증명되었지만, 고-위험 신경모세포종 환자는 재발 후 여러 화학요법 및 방사선 치료를 받는다[2]. 이에 따라 PV-10을 일반적으로 사용되는 화학요법제와 함께 조합 치료 요법에 사용하는 것에 대한 가능성을 조사하였다.
처음 스크리닝 후, PV-10의 세포독성보다 낮은 용량(50μM)이 모든 세포주 연구에서 독소루비신, 에토포시드 및 빈크리스틴과 시너지 효과가 있음을 발견하였다. 추가적으로, 방사선 조사 전 PV-10 전-처리가 SK-N-AS 및 IMR5 세포 모두에 대한 방사선 치료의 효능을 개선하였다. 이들 데이터는 흑색종 환차를 PV-10으로 전-처리한 후 방사선 치료하여 세포독성의 큰 증가없이 종양 퇴행을 유도한 이전 2상 임상 시험에서의 데이터와 일치한다[13]. 이들 데이터는 재발 신경모세포종을 앓는 고-위험 환자를 위해 PV-10을 일반적으로 사용되는 다른 치료제와 함께 효과적으로 조합할 수 있다는 것을 의미한다.
PV-10이 시험관 내에서 소아 고형 종양 세포주에 대해 세포독성적이라는 것을 확인한 후, 피하 신경모세포종 이종이식 마우스를 사용하여 생체 내 PV-10의 활성을 시험하였다. 약학적 관련 용량[12, 13, 16]의 PV-10이 종양 퇴행을 유도하고 용량- 및 종양-의존적으로 생존을 증가시키는 것을 발견하였다. 25 및 50㎕ PV-10의 병소 내 주사는 초기 종양 퇴행을 유도하였고, 50㎕ PV-10은 SK-N-AS 또는 IMR5 종양을 갖는 마우스의 전체 생존을 증가시켰다. 이들 데이터는 PV-10의 종양 내 주사가 피하 동계 결장 종양[7], 동계 피하 유방 종양 및 흑색종[14, 8]의 퇴행을 유도한 동물 모델을 사용한 이전 연구에서와 유사하다.
요약하면, 본 연구는 소아 고형 종양(유잉육종, 신경모세포종, 골육종 및 횡문근육종)의 성공적인 치료에서 PV-10의 효능에 대한 전임상적 개념-증명 데이터를 제공한다. 신경모세포종을 중심으로, PV-10이 리소솜을 붕괴시켜 세포를 세포 주기의 G1-단계에 억류시키고 세포자멸사를 유도한다는 것을 발견하였다. 일반적으로 사용되는 여러 치료제가 PV-10과 시너지 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 더욱이, 신경모세포종 이종이식 마우스 연구를 통해 생체 내 PV-10 치료 효능이 확인되었다.
대표적인 세포주 및 면역약화 마우스의 생체 내에서 수행된 연구 결과들은 직접적 세포독성 가능성뿐만 아니라 이 약제가 암세포에서 표적 조절 효과를 유도할 수 있는 메커니즘에 대한 증거를 제공한다. 치료 시너지를 생성하기 위해 조합할 수 있는 물질 또한 확인되어, 초기 단계 임상 시험의 제형화에 대한 프레임워크를 제공한다. 이는 앞서 설명한 예상되는 면역 자극 효과에 더해, PV-10 근간 요법을 면역 체크포인트 억제제와 같은 물질과 함께 조합하여 재발 또는 난치성 소아 고형 종양을 앓는 환자에서 물질의 활성을 더 높일 수 있는 가능한 접근방식에 대한 뒷받침을 제공한다.
재료 및 방법
세포주 및 조직 배양
세포주(SK-N-AS, SK-N-BE(2), IMR5, LAN1, SK-N-MC, SK-N-SH, SHEP, BJ, BJ hTERT, WI38, WI38 hTERT, Hs68 hTERT, RD, RH30, 143B, HOS, SK-ES 및 SK-PN-DW)는 5% (v/v) 열 불활성화 우태아혈청(FBS)(Gibco), 100 유닛/㎖ 페니실린 및 100 유닛/㎖ 스트렙토마이신(Gibco)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(Gibco, 캐나다 온타리오주 소재)에서 배양하였다. 세포 배양은 5% C02로 가습 인큐베이터에서 37℃로 유지하였다. 1차 골수 시료는 지역 연구 윤리 위원회(local Research Ethics Board: RBD)의 승인 및 서면 동의 후에 얻었다(Ethics ID #17184). 림프구는 이전 문헌에 설명된 바와 같이 골수 시료로부터 Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare Life Sciences, 캐나다 온타리오주 소재)를 사용하여 밀도 구배 원심분리로 단리하였다[17].
재료 및 시약
PV-10(0.9% 염수 중 로즈 벵갈 이나트륨 10% 용액)은 Provectus Biopharmaceuticals Inc.(미국 테네시주 녹스빌 소재)에서 제공받아 상온에서 암조건으로 보관하였다. 독소루비신, 에토포시드, 빈크리스틴, 시스플라틴, 페그아스파라기나제(pegasparaginase), 이리노테칸 및 시타라빈은 Alberta Children's Hospital Pharmacy(캐나다 앨버타주 캘거리 소재)에서 얻어 상온에서 암조건으로 보관하였다. 후속 연구를 위해, 약물은 DMEM + 보충제에 적절한 농도로 희석하였다.
세포독성 분석
세포를 100㎕ DMEM이 담긴 96-웰 플레이트(Greiner Bio-One, 미국 노스캐롤라이나주 소재)에 웰당 5×l03으로 접종하고 24시간 동안 배양하였다. PV-10 단독 또는 인산 완충 식염수(PBS; 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HP04, 1.8mM KH2P04, pH 7.25)(매체 대조군)를 DMEM에 희석하고 100㎕를 각 웰에 첨가하였다. 모든 처리는 3.125 내지 400mM의 최종 농도 범위로 3반복으로 실행하였다.
플레이트를 96시간 동안 배양하였다. 웰을 PBS로 2회 세척하고, 200㎕의 신선한 DMEM을 각 웰에 첨가하고 제조업체의 지침에 따라 alamar blue®(Invitrogen, 캐나다 온타리오주 소재) 세포독성분석법을 사용하여 세포 생존력을 평가하였다. 절반 최고 억제 농도(IC50)는 CompuSyn 소프트웨어(ComboSyn Inc.)를 사용하여 결정하였다.
광현미경법
세포를 6-웰 플레이트(Corning Inc., 미국 뉴욕주 소재)에 웰당 2×l05으로 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS(매체 대조군) 또는 PV-10으로 처리하고 96시간 동안 배양하였다. 위상차 이미지는 Zeiss Axiovert 200M 현미경 상에서 Zeiss AxioVision Se64 소프트웨어를 사용하여 Zeiss AxioCam MRm Rev.3 FireWire 카메라로 얻었다. 이미지는 Adobe Photoshop(Adobe Creative Cloud 2017)을 사용하여 처리하였다.
시간-경과 비디오 현미경법
세포를 96-웰 플레이트(Greiner Bio-One)에 웰당 5×l03으로 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS(매체 대조군) 또는 PV-10으로 처리하였다. 37℃, 5% C02 가습 인큐베이터에 위치한 IncuCyte®Zoom 현미경 및 IncuCyte®Zoom 소프트웨어(Essen BioScience, 미국 미시간주 소재)를 사용하여 48시간 동안 30분마다 웰당 3개의 이미지를 얻었다. 각 웰의 세포수는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 계수하고 0시의 세포수로 표준화하였다. 실험 당 처리 당 350개 이상의 세포를 계수하였다.
리소솜 검출 및 형광현미경법
비처리 세포의 경우 2×l05/웰로 6-웰 플레이트(Corning) 내, 그리고 처리 세포의 경우 6×l05/웰로 6-웰 플레이트(Corning) 내 멸균 커버슬립에 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS(매체 대조군) 또는 PV-10으로 16시간 동안 처리하였다. 웰을 PBS로 2회 세척하고 2.5 ㎍/㎖ Hoechst 33342 염색제(Invitrogen) 함유 2㎖의 DMEM을 각 웰에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 10분 동안 배양하고 Lysotracker®Green DND-26(Invitrogen)을 최종 농도 500 nM로 배지에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 15분 동안 배양하고, 이미징 시 커버슬립을 유리 슬라이드에 장착하고 Zeiss Axiovert 200M 현미경 상에서 Zeiss AxioVision Se64 소프트웨어를 사용하여 Zeiss AxioCam MRm Rev.3 FireWire 카메라로 이미지를 얻었다. 이미지는 Adobe Photoshop(Adobe Creative Cloud 2018)을 사용하여 처리하였다.
유세포분석
세포 주기 변화를 분석하기 위해, 세포를 100 mm 접시(Corning)에 접종하여, 처리 후 최소 2×l06 세포를 수집할 수 있었다. 세포를 24시간 동안 배양하고, PBS(매체 대조군) 또는 PV-10으로 처리하고, 16 또는 24시간 동안 배양하였다. 트립신 처리로 세포를 수집하고, PBS로 세척하고, 40㎛ 나일론 세포 스트레이너(Falcon, Corning, 미국 뉴욕주 소재)로 여과하고, 트라이판 블루 염색법과 혈구계산기를 사용하여 계수하고, 0.9%(w/v) 멸균 NaCl에 재현탁하고, 차가운 90%(v/v) 에탄올에서 고정하였다. 시료는 상온에서 30분 동안 항온처리한 후 -20℃에서 보관하였다.
분석을 위해, 시료를 1400 rpm으로 4℃에서 5분 동안 원심분리하고 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 300㎕ 표지 완충액(0.1% Triton X-100 PBS 중 10 ㎍/㎖ DAPI(Sigma, 캐나다 온타리오주 소재), 200 ㎍/㎖ RNase A(Sigma))에서 37℃로 20분 동안 항온처리하였다. 시료를 Diva 6.1.3 소프트웨어(BD Bioscience)를 사용하여 BD Bioscience LSR II 세포측정기에 적용하였다. 결과는 ModFitLT™3.3 소프트웨어(Verity Software House)를 사용하여 분석하였다.
세포 추출물 준비
세포를 100㎜ 접시(Corning)에 1×106으로 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS(매체 대조군) 또는 PV-10으로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 세포 배양물에서 배지를 수집하고, 세포를 PBS로 세척하고 트립신 처리 후 수집하였다. 세포를 차가운 PBS로 세척하고 1200 rpm으로 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 상등액을 제거하고, 펠렛을 1%(v/v) 포스파타제 억제제(Sigma) 및 1%(v/v) 단백질분해효소 억제제(Sigma)가 첨가된 방사선 면역-침전 분석(RIPA) 완충액(50mM Tris-HCl(pH 8), 150mM NaCl, 1%(v/v) NP-40, 0.5%(w/v) 데옥시콜산 나트륨, 0.1%(w/v) SDS(sodium dodecyl sulfate))에 재현탁하였다. 시료를 1.5㎖ 튜브로 옮기고, 얼음에서 10분 동안 항온처리하고 12,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 전체 세포 용해물로 상등액을 수집하고 즉시 사용하거나 -20℃에 보관하였다.
웨스턴 블롯
이전 문헌에 설명된 바와 같이 웨스턴 블롯을 수행하였다[17]. 간략하게, 단백질을 Trans-Blot®Turbo™ 전이 시스템(BioRad, 캐나다 퀘벡주 소재)을 사용하여 나이트로셀룰로스 막으로 옮기고, Ponceau S 염색제(5%(v/v) 아세트산 중 0.1%(w/v))를 사용하여 전이를 확인하고 막을 Tris-완충 염수 중 5% 탈지유에서 0.1%(v/v) Tween®-20(TBS-T; 50mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 0.1%(v/v) Tween®-20)으로 상온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 막을 TBS-T 중 5%(w/v) 탈지유에 희석한 다음의 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새(약 18시간) 항온처리하였다: 항-PARP(1:3000, Cell Signaling, 9542S), 항-카스파제 3(1:500, Cell Signaling, 9662S), 항-카스파제 7(1:1000, Cell signaling, 9492S), 항-카스파제 9(1:1000, Cell Signaling, 9502S) 및 항-β-엑틴(1:5000, Cell Signaling, 8457L). 막을 TBS-T로 3회 세척하고, 항-토끼 2차 항체(1:3000, Cell signaling, 7074S)와 함께 항온처리하고, TBS-T로 3회 세척하고, Western Lightning Plus-ECL 시약(Perkin-Elmer, 미국 매사추세츠주 소재)과 함께 2분 동안 항온처리하고 ChemiDoc MP 이미징 시스템(BioRad) 상에서 화학발광 설정을 사용하여 전개하였다.
조합 스크리닝
세포독성 분석에서 설명한 바와 같이 세포를 배양하였다. 시험 약물(독소루비신, 에토포시드, 빈크리스틴, 시스플라틴, 페그아스파라기나제, 이리노테칸 및 시타라빈)을 PBS(매체 대조군) 또는 PV10(50μM 최종) 함유 배지에 0.1μM의 최종 농도로 준비하였다. 처리물을 3반복으로 세포에 첨가하였다. 플레이트를 배양하고, 세척하고 세포독성 분석에서 설명한 바와 같이 alamar blue®로 세포 생존력을 분석하였다.
조합 연구
세포독성 분석에서와 같이 세포를 배양하였다. 3종의 시험 약물(독소루비신, 에토포시드, 빈크리스틴)의 연속 희석을 PBS(매체 대조군) 또는 PV10(50μM 최종) 함유 DMEM에 준비하고 3반복으로 세포에 첨가하였다. 플레이트를 배양하고, 세척하고 세포독성 분석에서 설명한 바와 같이 alamar blue®로 세포 생존력을 분석하였다. 50μM PV-10과의 조합에서 시험 약물의 IC50에 대한 조합 지수(CI)는 CompuSyn 소프트웨어(ComboSyn Inc.)를 사용하여 계산하였다. CI 값은 다음 기준에 따라 점수를 매겼다: CI<1은 시너지 활성을 나타냄, CI=1은 부가적 활성을 나타냄, CI>1은 시너지 활성을 나타냄[18].
방사선 민감도 분석
세포를 60 mm 접시(Corning)에 5×l04으로 접종하고 24시간 동안 배양하고 PBS(매체 대조군) 또는 50μM PV-10으로 처리하고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 세포를 Gammacell®1000 Elite(MDS Nordion, 캐나다 온타리오주 소재)를 사용하여 0.5, 1 또는 2 Gray(Gy)로 방사선 처리하고 92시간 동안 배양하였다. 처리는 3반복으로 실시하였다. 접시를 PBS로 2회 세척하고 세포독성 분석에서 설명한 바와 같이 alamar blue®로 세포 생존력을 분석하였다.
생체 내 이종이식 모델
모든 동물 절차는 캐나다 동물 관리 위원회의 지침 및 실험동물의 관리 및 사용에 관한 NIH 지침에 따라 수행하였다. 모든 프로토콜은 캘거리대학의 동물 관리 위원회의 검토 및 승인을 받았다(프로토콜 승인 번호: AC16-0243).
IMR5-mCherryFluc 및 SK-N-AS-mCherryFluc 세포를 동물 연구에 사용하였다. 이들 세포주는 쥣과 줄기 세포 바이러스(mscv)의 내부 U3 영역, 강화된 반딧불 루시퍼라제(effLuc), 뇌심근염바이러스(encephalomyocarditis virus; emcv)의 내부 리보솜 결합 부위(IRES) 요소 및 mCherry를 암호화하는 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터 상에서 반딧불 루시퍼라제(luciferase) 및 mCherry를 안정적으로 강하게 발현한다.
2.5×l06 세포(SK-N-ASmCherryFluc 또는 IMR5mCherryFluc)를 0.1 ㎖ Matrigel®Matrix(Fischer Scientific, 캐나다 온타리오주 소재)에 현탁하여 6 내지 8주령 암컷 CB17 SCID 마우스(Charles River Laboratories, 캐나다 퀘벡주 소재)의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다(0일). 종양 주사 7일 후, 적어도 5 x 5 mm의 검출가능한 종양 성장을 갖는 동물을 무작위로 처리군으로 분류했다. 이전에 확립된 프로토콜[8]에 따라, 종양 내(병소 내) 주사로 이 군을 50㎕ PBS(매체 대조군), 50㎕ PV-10 또는 25㎕ PV-10로 처리하였다. 동물들을 매일 모니터링하고 버니어 캘리퍼로 종양 면적을 확인하였다. 종양이 15×15㎜의 정의된 종말점에 도달할 때, 마우스를 안락사시켰다. 종양이 없는 채로 남아있는 동물은 처리 후 120일 동안 유지시켰다.
종양 성장은 Xenogen IVIS®200 시스템(Xenogen Corporation, 미국 캘리포니아주 소재)을 사용해서도 모니터링하였다. D-루시페린(Gold Biotechnology, 미국 미주리주 소재)의 복강 내 주사 후, 종양에서 방출되는 생물발광 신호를 기록하기 위해 이미지화하였다. 데이터는 확립된 방법[19]에 따라, 관심 영역의 총 광자 플럭스 방출(photons/s)을 결정하여 분석하였다.
인용문헌
Claims (14)
- 포유동물 대상체에서의 소아암성 고형 종양 치료 방법으로서,
종양 세포의 제거를 유도하는 양의 할로겐화 크산텐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 병소 내로 투여하는 것을 포함하는, 소아암성 고형 종양의 치료 방법. - 제1항에 있어서, 상기 할로겐화 크산텐 분자는 로즈 벵갈 이나트륨인, 소아암성 고형 종양의 치료 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인, 소아암성 고형 종양의 치료 방법.
- 포유동물 대상체에서의 소아암성 고형 종양의 치료 방법으로서,
(1) 종양 세포의 제거를 유도하는 양의 할로겐화 크산텐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 병소 내로 투여하는 단계 및 (2) 상기 할로겐화 크산텐과 함께 상승적 세포독성을 제공하는 종양-억제 유효량의 전신성 항암 약물을 투여하는 단계를 포함하는, 소아암성 고형 종양의 치료 방법. - 제4항에 있어서, 상기 전신성 항암 약물은 소분자, 단백질성 분자, 이온화 방사선 요법 및 체크포인트 억제제 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 소아암성 고형 종양의 치료 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 소분자 항암 약물은 세포 유사분열을 억제하는, 소아암성 고형 종양의 치료 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 단백질성 항암 약물은 염증성 케모카인 활성을 억제하는, 소아암성 고형 종양의 치료 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 체크포인트 억제제 항체는 PD-1 수용체, PD-L1 리간드 또는 CTLA-4 수용체를 억제하는, 소아암성 고형 종양의 치료 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 전신성 항암 약물은 이온화 방사선에 의해 제공되는, 소아암성 고형 종양의 치료 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 할로겐화 크산텐 분자는 로즈 벵갈 이나트륨인, 소아암성 고형 종양의 치료 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 할로겐화 크산텐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 병소 내 투여는 상기 전신성 항암 약물의 투여 전에 이루어지는, 소아암성 고형 종양의 치료 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 할로겐화 크산텐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 병소 내 투여는 상기 전신성 항암 약물의 투여 후에 이루어지는, 소아암성 고형 종양의 치료 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 할로겐화 크산텐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 병소 내 투여는 상기 전신성 항암 약물의 투여와 동시에 이루어지는, 소아암성 고형 종양의 치료 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인, 소아암성 고형 종양의 치료 방법.
Applications Claiming Priority (3)
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Publications (1)
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