CN112996502B - 卤代呫吨针对难治性小儿实体瘤的体外和异种移植抗肿瘤活性 - Google Patents

卤代呫吨针对难治性小儿实体瘤的体外和异种移植抗肿瘤活性 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种在哺乳动物受试者中治疗小儿癌性实体瘤的方法，该方法包括病灶内施用一定量的引起所施用肿瘤的肿瘤细胞消融的卤代呫吨或其药学上可接受的盐，优选玫瑰红二钠。另一种涉及的方法包括以下步骤：病灶内施用一定量的引起所施用肿瘤的肿瘤细胞消融的卤代呫吨或其药学上可接受的盐，优选玫瑰红二钠，和全身性施用肿瘤抑制有效量的全身性抗癌药物，其与卤代呫吨一起提供协同细胞毒性。两种施用可以同时进行，或可以先后进行。

Description

卤代呫吨针对难治性小儿实体瘤的体外和异种移植抗肿瘤 活性
描述
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年5月16日提交的系列号为62/672,373的申请的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
背景技术
在儿童中发展的癌症类型通常不同于在成人中发展的癌症类型。儿童时期的癌症通常是在生命的很早期、有时甚至在出生之前发生的细胞中的DNA改变的结果。因此，在子宫中胎儿发育过程中会出现引发癌症发展的遗传突变。与成人中的许多癌症不同，儿童时期的癌症与生活方式或环境风险因素没有强烈的关系。
另外，在癌症治疗期间、完成治疗后以及作为癌症幸存者，儿童会面临独特的问题。例如，与成人身体相比，儿童可能接受更强烈的治疗，而他们的癌症及其治疗可能对儿童的成长中的身体产生不同的影响。儿童对用于控制成人中的症状的药物的反应可能不同。
青少年通常被诊断出患有与年龄较小的儿童或年龄较大的成人不同类型的癌症。特定癌症类型的发生率在青少年的连续年龄段中差异很大。一些证据表明，如果用小儿治疗方案治疗患有急性淋巴细胞白血病的青少年，比如果接受成人治疗方案可能具有更好的结果。
目前，患有复发性或转移性实体瘤(例如尤因肉瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤和横纹肌肉瘤)的儿童具有低于30％的低总生存率[1]。在小儿实体瘤中，神经母细胞瘤是儿童中最常见的颅外癌症，并且是1-4岁儿童的主要死亡原因[2]。
神经母细胞瘤起源于交感神经组织，并且是非常异源且复杂的疾病[3]。神经母细胞瘤治疗的最新改善已将非高风险疾病的5年生存率提高到超过90％[4]。然而，超过40％的神经母细胞瘤患者被认为是高风险患者，并且尽管采取了强化治疗方案，但这些患者的5年生存率仍低于50％[2、4]。此外，复发性神经母细胞瘤的预后令人沮丧，其5年生存率不到10％[4]。
鉴于患有复发性或转移性实体瘤的小儿患者(特别是患有高风险和复发性神经母细胞瘤的那些小儿患者)的存活率较差，迫切需要愿意治疗这些恶性肿瘤的新颖的治疗方法。
用于成人癌性肿瘤的一组有用的抗癌剂是卤代呫吨或其药学上可接受的盐。参见美国专利号6,331,286、7,390,668和7,648,695。已经发现，在这些卤代呫吨中，玫瑰红二钠(4,5,6,7-四氯-2’,4’,5’,7’-四碘荧光素二钠；RB)特别有效且易于使用。由于成人肿瘤的行为常常与小儿肿瘤非常不同，因此尚不清楚RB和类似的卤代呫吨在用于对抗小儿癌性肿瘤时是否会同样有效。
PV-10是(RB)溶于0.9％盐水的10％无菌溶液，其已在临床上用于测量婴儿的肝功能[5]。先前的研究表明，PV-10在溶酶体中积累[6]，并在一系列成人癌症中诱导细胞死亡[7-11]。
在针对患有难治性转移性黑色素瘤的患者的II期临床试验中，PV-10的病灶内(IL)注射诱导肿瘤消退，其中总反应率为51％[12]。在患有转运或转移性黑色素瘤的患者的II期临床试验中，PV-10还与放射疗法组合地显示疗效，其中总反应率为86.6％[13]。除了直接诱导癌细胞死亡外，PV-10还在小鼠研究[7、8、14]和临床试验[10、12、14、15、16]中均已显示出诱导肿瘤特异性免疫反应。
发明概述
本发明涉及一种在哺乳动物受试者中治疗小儿癌性实体瘤的方法。一种方法涉及病灶内施用一定量的引起所施用肿瘤的肿瘤细胞消融的卤代呫吨或其药学上可接受的盐。第二种方法包括以下步骤：病灶内施用一定量的引起所施用肿瘤的肿瘤细胞消融的卤代呫吨或其药学上可接受的盐。还向哺乳动物受试者全身性施用肿瘤抑制有效量的全身性抗癌药物，其与卤代呫吨一起提供协同细胞毒性。
两种药物可以同时施用，或者其中一种可以先于另一种约1至约4周施用。优选在全身性施用之前约1至约4周进行病灶内施用。
附图的简要说明
在附图(其形成本公开内容的一部分)中：
图1(包括图1A-1E)示出了PV-10降低小儿实体瘤细胞系中的细胞存活率。用递增浓度(3.125-400μM)的PV-10处理不同的小儿实体瘤细胞系(尤因肉瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤和横纹肌肉瘤)、正常成纤维细胞系和原代骨髓样品96小时。通过alamar 测定测量细胞存活率。将细胞存活百分比针对使用PBS(媒介物对照)的相应处理进行标准化。从三个分开的研究中计算出细胞存活率的平均百分比，并显示了平均值的标准误差。
图2(包括图2A和2B)是显微照片，显示PV-10对神经母细胞瘤细胞系具有细胞毒性。在图2(A)中，神经母细胞瘤细胞系SK-N-AS、SK-N-BE(2)和IMR5以及密切相关的神经上皮瘤细胞系SK-N-MC用PBS(媒介物对照)、50μM PV-10或100μM PV-10处理96小时，并通过相差光学显微镜观察。研究进行了3次，并显示了代表性图像。比例尺等于100μm。在图2(B)中，用PBS(媒介物对照)或100μM PV-10处理神经母细胞瘤细胞系SK-N-AS、SK-N-BE(2)和IMR5以及神经上皮瘤细胞系SK-N-MC并通过延时视频显微镜观察。每30分钟捕获一次图像，持续48小时。计数细胞数，并针对0小时的细胞数进行标准化。每个研究的每次处理计数至少350个细胞。显示了从三个分开的研究计算得出的细胞数平均百分比和平均值的标准误差。
图3示出了PV-10破坏癌细胞中的溶酶体。将神经母细胞瘤细胞系SK-N-AS、SK-N-BE(2)和IMR5用PBS(媒介物对照)或100μM PV-10处理16小时。活细胞用核酸染料Hoechst33342和Green DND-26(其在酸性细胞器中富集并发出荧光)染色，并通过荧光显微镜观察。比例尺等于20μm。所提供的数据代表了三个分开的研究。
图4(包括图4A和4B)显示PV-10增加细胞周期G1期中的细胞百分比，并通过凋亡诱导细胞死亡。在图4A中，用PBS(媒介物对照)、50μM或100μM PV-10处理神经母细胞瘤细胞系SK-N-AS和IMR5 16或24小时，用DAPI染色并通过流式细胞术分析以检测细胞周期阶段。通过三个分开的研究计算了细胞周期的G1、S或G2/M期中细胞的平均百分比，并显示了平均值的标准误差。在图4B中，用PBS(媒介物对照)、75μM或100μM PV-10处理神经母细胞瘤细胞系SK-N-AS、SK-N-BE(2)和IMR5以及神经上皮瘤细胞系SK-N-MC 24小时。制备总细胞裂解物并通过蛋白质印迹分析以检测总的和切割的聚ADP核糖聚合酶(PARP)、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶7和胱天蛋白酶9的水平。肌动蛋白用作上样对照。分子量以千道尔顿(kDa)表示。所呈现的数据代表两个独立的研究。
图5示出了PV-10处理与不同抗癌剂的处理协同作用。神经母细胞瘤细胞系SK-N-AS、SK-N-BE(2)和IMR5、神经上皮瘤细胞系SK-N-MC和正常成纤维细胞系BJ用单独的或与50μM PV-10组合的0.1μM的七种不同抗癌剂处理。处理细胞96小时，并通过alamar测量细胞存活率。将细胞存活百分比标准化至使用PBS(媒介物对照)的处理。显示了通过两个独立的研究计算得出的细胞存活率的平均百分比，以及平均值的标准误差。
图6(包括图6A和6B)显示PV-10处理增强辐照的作用。将神经母细胞瘤细胞系SK-N-AS(图6A)和IMR5(图6B)用PBS(媒介物对照)或50μM PV-10预处理4小时。然后用0.5、1或2Gy辐照细胞，并再培养92小时。细胞存活率通过alamar测量。显示了从三个分开的研究计算得出的细胞存活率的平均百分比以及平均值的标准误差。星号显示显著差异，配对学生t检验，p<0.05。
图7(包括图7A-7F)示出了PV-10治疗在体内诱导肿瘤消退。将CB17 SCID小鼠(每组n＝4)用IMR5-mCherryFluc或SK-N-AS-mCherryFluc细胞在右侧腹进行皮下注射。当肿瘤大小为至少5×5mm时，向肿瘤注射50μl PBS(媒介物对照)、25μl PV-10或50μl PV-10。在图7A中，使用游标卡尺测量IMR5-mCherryFluc肿瘤生长。箭头指示治疗日期(第6天)。显示了平均肿瘤大小和平均标准误差。星号显示显著差异，未配对学生t检验，p<0.05。在图7B中，使用Xenogen200系统以在用D-荧光素腹膜内注射后检测生物发光信号来测量IMR5-mCherryFluc肿瘤生长。显示了平均肿瘤大小和平均标准误差。图7C显示了具有IMR5-mCherryFluc肿瘤的小鼠的存活曲线。星号显示显著差异，对数秩(Mantel-Cox)检验，p<0.05。在图7D中，使用游标卡尺在数天内随时间测量SK-N-AS-mCherryFluc肿瘤生长。箭头指示治疗日期(第14天)。显示了平均肿瘤大小和平均标准误差。在图7E中，使用Xenogen200系统以在用D-荧光素腹膜内注射后检测生物发光信号来测量在第0、12和15天的SK-N-AS-mCherryFluc肿瘤生长。显示了平均肿瘤大小和平均标准误差。图7F显示了具有SK-N-AS-mCherryFluc肿瘤的小鼠的存活曲线。
图8显示了图7所描述的每个实验组中的一组小鼠照片，其中生物发光图像描绘了每个实验组(PBS对照、PV-10 25μL和PV-10 50μL剂量)中在第6天、第12天和第17天之后的活动性侧腹肿瘤。
优选实施方案的详细描述
本发明涉及一种在肿瘤中(病灶内)使用药物组合物治疗小儿实体瘤的方法，该药物组合物包含肿瘤抑制有效量的卤代呫吨或其药学上可接受的盐，例如玫瑰红(RB，4,5,6,7-四氯-2’,4’,5’,7’-四碘荧光素二钠)。可以使用含玫瑰红的组合物作为唯一的治疗剂，但在某些优选的实施方案中，RB优选与另一种抗肿瘤疗法结合，该另一种抗肿瘤疗法例如可以是小分子(非蛋白质的，小于约1000克/摩尔)或蛋白质分子例如抗体或酶、电离辐射疗法或所谓的检查点抑制抗体疗法。如本文所示，这些组合中的几种已经表现出对小儿肿瘤的协同毒性。
卤代呫吨
将涉及的卤代呫吨(例如特别优选的玫瑰红(4,5,6,7-四氯-2’,4',5',7'-四碘荧光素)，或另一种卤代呫吨，包括赤藓红B、荧光桃红B、4,5,6,7-四溴-2’,4',5',7'-四碘荧光素、2’,4,5,6,7五氯-4',5',7'-三碘荧光素、4,4’,5,6,7-五氯-2',5',7'-三碘荧光素、2’,4,5,6,7,7’-六氯-4’,5’-二碘荧光素、4,4’,5,5’,6,7-六氯-2’,7’-二碘荧光素、2’,4,5,5’,6,7-六氯-4’,7’-二碘荧光素、4,5,6,7-四氯-2’,4’,5’-三碘荧光素、4,5,6,7-四氯-2’,4’,7’-三碘荧光素、4,5,6,7-四溴-2’,4’,5’-三碘荧光素和4,5,6,7-四溴-2’,4’,7’-三碘荧光素)溶解或分散在合适的药物组合物中。
优选的形式玫瑰红二钠具有以下结构式：
对于涉及的组合物，该优选实施方案的某些细节描述于美国专利号5,998,597、6,331,286、6,493,570和号8,974,363中，这些专利的公开内容通过引用整体并入本文。
当组合物的pH值接近生理pH(即，约pH 7)时、并且特别是当pH值大于约4时，涉及的组合物的卤代呫吨组分的递送是最有利的，从而确保卤代呫吨在组合物中保持二元形式。因此，在一个优选的实施方案中，组合物的pH值为约4至约10，更优选为约5至约9，最优选为约pH 6至约pH 8。
对于药物，亲水性媒介物是优选的，以最大化优先将卤代呫吨组分分配在组织中。因此，在优选的实施方案中，媒介物包含最少的可能干扰这种分配的非亲水性组分。
因此，该组合物的优选制剂在适当的药物组合物中在亲水性优选含水的媒介物中包含卤代呫吨，例如特别优选的玫瑰红(4,5,6,7-四氯-2’,4',5',7'-四碘荧光素)，或另一种卤代呫吨，包括赤藓红B、荧光桃红B、4,5,6,7-四溴-2’,4',5',7'-四碘荧光素、2’,4,5,6,7五氯-4',5',7'-三碘荧光素、4,4’,5,6,7-五氯-2',5',7'-三碘荧光素、2’,4,5,6,7,7’-六氯-4’,5’-二碘荧光素、4,4’,5,5’,6,7-六氯-2’,7’-二碘荧光素、2’,4,5,5’,6,7-六氯-4’,7’-二碘荧光素、4,5,6,7-四氯-2’,4’,5’-三碘荧光素、4,5,6,7-四氯-2’,4’,7’-三碘荧光素、4,5,6,7-四溴-2’,4’,5’-三碘荧光素和4,5,6,7-四溴-2’,4’,7’-三碘荧光素。
优选的形式玫瑰红二钠具有下式：
对于该药物组合物，该优选实施方案的某些细节描述于美国专利号5,998,597、6,331,286、6,493,570和号8,974,363中，这些专利的公开内容通过引用整体并入本文。
涉及的含卤代呫吨的组合物通常在水性介质中以约0.1％(w/v)至约20％(w/v)的浓度包含卤代呫吨。含卤代呫吨的药物组合物优选包含水溶性电解质，该水溶性电解质包括选自钠、钾、钙和镁的至少一种阳离子和选自氯化物、磷酸根和硝酸根的至少一种阴离子，其中电解质的浓度为约0.1％(w/v)至约2％(w/v)。
第三种成分是选自钠、钾、钙和镁的氯化物、磷酸盐和硝酸盐的水溶性电解质，其中该电解质以约0.1至约2重量％的浓度存在，或者可替代地以足以提供大于约100mOsm/kg到高至600mOsm/kg的重量克分子渗透压浓度的水平存在。更优选地，药物组合物的重量克分子渗透压浓度大于250mOsm/kg，最优选地为大约300-500mOsm/kg。电解质优选是氯化钠。电解质优选以约0.5至约1.5％的浓度存在，甚至更优选以约0.8至约1.2％的浓度存在，最优选以如在盐水中存在的约0.9％的浓度存在。
组合物的水性介质优选仅是满足注射用标准的水。多至约20体积百分比的媒介物可以是一种或多种C1-C6一元或多元醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、仲丁醇、甘油、乙二醇、丙二醇、1,2-丁二醇、2,3-丁二醇、赤藓糖醇、苏糖醇、三羟甲基丙烷、山梨糖醇等。更优选地，醇在涉及的组合物中的存在量小于媒介物的约10体积百分比，更优选小于约5体积百分比。
另一方面，本发明利用下面的式1的化合物，其中R1独立地为F、Cl、Br、I、H或C1-C4烷基；R2、R3、R4和R5独立地为Cl、H或I，其中选自R2、R3、R4、R5的至少一个取代基为I，并且至少一个为Cl或H；和R6独立地为H或C1-C4烷基；R11是H或C1-C4烷基；R12为H或C1-C7酰基；以及所有(a)互变异构形式；(b)阻旋异构体，(c)如式2(如下)所示的封闭内酯形式，(d)式2所示的内酯形式的对映体，以及(e)其药学上可接受的盐。
各种语法形式的术语“生理上可接受的盐”或“药学上可接受的盐”是指制药工业中常用的任何无毒阳离子，例如碱金属、碱土金属和铵盐，包括钠、钾、锂、钙、镁、钡、铵和鱼精蛋白锌盐，其可以通过本领域已知的方法制备。涉及的阳离子提供水溶性呫吨盐。优选地，盐是一价或二价盐形式的钠、钾、钙和铵。对于与药物化合物形成生理上可接受的盐的常用生理上(或药学上)可接受的酸和碱的列表，读者可参考Berge,J.Pharm.Sci.1977 68(1):1-19。
卤代呫吨药物组合物的pH值可以通过本领域技术人员已知的任何合适的手段来调节或调整。可以通过添加酸或碱等来缓冲组合物或调节pH值。由于卤代呫吨或其生理上可接受的盐是弱酸，取决于卤代呫吨浓度和/或电解质浓度，组合物的pH值可能不需要使用缓冲剂和/或pH值调节剂。但是，特别优选的是，该组合物不含缓冲剂，使得其能够在施用时适应生物环境。
还优选地，药物组合物不包含任何防腐剂，许多防腐剂会有害地干扰药物组合物或其制剂，或者可能与卤代呫吨组合物活性成分复合或以其他方式相互作用或干扰其递送。就使用防腐剂的程度而言，咪脲是优选的防腐剂，因为它在药物组合物中或在施用时均不与卤代呫吨相互作用。
涉及的治疗方法用于需要其的哺乳动物。经治疗的哺乳动物可以是灵长类动物，例如人、猿类(例如黑猩猩或大猩猩)、猴子(例如食蟹猴或猕猴)、实验动物(例如大鼠、小鼠或兔子)、伴侣动物(例如狗、猫、马)或食用动物，例如牛或阉牛、绵羊、羔羊、猪、山羊、美洲驼等。
通常将每种涉及的组合物在体内向需要其的哺乳动物重复施用，直到治疗的实体癌性肿瘤减小至所需程度，例如无法检测到。因此，根据治疗医师的指示，可以在一天内、每天、每周、每月、或在数月至数年的时间内在需要的哺乳动物中多次施用。
当直接注射到肿瘤中时涉及的卤代吨化合物通常会被癌细胞的溶酶体吸收并累积，并通过凋亡或其他机制诱导细胞死亡。在引起癌细胞死亡的过程中，细胞分解或消融。据信，细胞碎片的消融特异性针对消融的细胞碎片上显示的抗原刺激哺乳动物的免疫系统，使得远离肿瘤内(病灶内)注射部位的肿瘤被识别并被杀死。
如先前也已经指出的，卤代呫吨或其药学上可接受的盐的优选涉及的组合物称为PV-10TM。PV-10TM是玫瑰红(RB，4,5,6,7-四氯-2’,4’,5’,7’-四碘荧光素二钠)溶于0.9％盐水的无菌10％溶液。
将当与卤代呫吨酮组合使用时提供协同细胞毒性的肿瘤抑制有效量的全身性抗癌药物施用于有需要的哺乳动物受试者，并且可以使用常规的液体、凝胶、固体或其他形式配制。因此，应当理解，全身性抗癌药物可以举例说明地通过片剂或液体组合物口服施用，通过i.v.、i.m.、s.c.、腹膜内注射施用，通过电离辐射施用或以向受试者提供有效量的抗癌药物的任何其他形式施用。
全身性抗癌药物
将作为小分子(非蛋白质的，小于约1000克/摩尔)或较大的蛋白质分子的全身性抗癌药物施用于要治疗的哺乳动物受试者，使得与在使用卤代呫吨的病灶内施用时发生的局部施用相比，该药物扩散到整个受试者体内。示例性小分子抗癌药物包括在本文使用的阿霉素、依托泊苷、长春新碱、顺铂、伊立替康和阿糖胞苷，而示例性蛋白质分子是天冬酰胺酶。在这些药物中，阿霉素、依托泊苷和长春新碱似乎与亚致死剂量PV-10的治疗协同作用，从而是优选的。
小分子全身性抗癌药物的有用的有效剂量是FDA、国家或国际机构批准的药物的标签信息中列出的剂量。通常，通过确定早期临床试验中的最大耐受剂量(MTD)来设置单药治疗剂量方案。然后将MTD(或其近似的变异值)发布到后期临床试验中，以用于评估效力和更详细的安全性评估。这些MTD常常在完成临床测试后成为确立的治疗剂量。但是，由于考虑将小分子全身性抗癌药物与PV-10一起使用，因此MTD是将要使用的最大量，并且该量应按照常规程序向下滴定。
下表A中提供了可在本发明中与局部PV-10疗法组合的多种全身性抗癌药物的示例性给药方案。注意，下面列出的药物中的几种是如上定义的“小分子”，而其他的是大的蛋白质分子，例如抗体。尽管如此，还是将它们进行了全身施用。
下文提到的蛋白质抗癌药物通常抑制由趋化因子例如TNF家族和白介素家族引起的炎症反应。
表A示例性全身免疫调节或靶向抗癌药
由于累加或协同作用，本发明的组合疗法和治疗方法通常允许在以局部疗法使用(例如下文所述)时以等于或低于全身药剂的典型剂量方案(例如在表A中描述的那些)的水平使用全身药剂。但是，表A中提供的给药方案为从可以被滴定至如护理给定患者的医师所认为合适的减少的量的剂量开始治疗提供了有用的指导。
电离辐射治疗
本文报道的结果显示，PV-10与电离辐射的组合治疗还整体上增强了治疗的细胞毒性。对于此处的体外研究，首先将神经母细胞瘤细胞与亚致死剂量的PV-10接触4小时，然后用0.5、1或2Gray剂量的电离辐射进行辐照。
应当理解，该治疗方案是举例说明性的，并且已经证明了这种治疗组合的概念。普通技术人员能够利用这些作用并相应地按比例扩展治疗。
检查点抗体抑制剂
进一步的组合治疗方案利用PV-10和检查点抗体抑制剂(可以将其视为特殊的全身性抗癌药物)的施用。有用的检查点抗体抑制剂是人源化单克隆抗体，其施用允许免疫系统将癌细胞识别为外来物，并有助于从体内清除那些癌细胞。
一些检查点抑制剂抗体靶向T细胞表面的PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)受体或该受体的配体PD-L1。这些单克隆抗体的例子是抑制PD-1的派姆单抗和纳武单抗。靶向PD-L1的两种抗体是阿特珠单抗、avelumab和度伐单抗。另一组检查点抑制剂单克隆抗体包括靶向CTLA-4(一种下调免疫系统的蛋白受体)的伊匹单抗、替西木单抗。
这些抗癌药物通常也可以全身使用。如前所述，在这些药物的包装标签中所述的MTD可以再次成为通常在试验过程中向下滴定的起始剂量。
给药(Dosing)
PV-10伴随全身性药物可以根据受体受试者的需要或耐受程度多次施用。小分子药物通常具有相对较短或数分钟至数天的体内半衰期。另一方面，检查点抑制剂抗体的体内半衰期通常为一到三周。
玫瑰红的体内生物寿命据了解在大鼠中为数分钟。但是，由于已知病灶内的PV-10施用诱导T细胞免疫增强，因此通过记忆T细胞，PV-10的施用的作用可以持续数月或更长时间。
由于组合的试剂的多样半衰期，优选首先用PV-10然后用一种或多种组合药物治疗。组合药物优选在PV-10施用后约1至约4周施用，使得诱导的免疫激活至少可以开始。
用全身性抗癌药物进行预处理也可能有用。在此，全身性抗癌药能够启动免疫反应，其随后通过PV-10治疗得到增强。在此，还优选前两次治疗之间的时间为约1至约4周。
两种药物也可以在大约同一时间同时施用，这可以同时在彼此大约一周内进行。
结果
PV-10抑制实体瘤细胞系的生长
用不同浓度的PV-10(3.125-400μM)处理尤因肉瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤和正常成纤维细胞细胞系以及正常原代骨髓样品96小时，并使用alamar 测量细胞存活率(图1A-1E)以确定PV-10对小儿实体瘤的作用。PV-10在所有测试的细胞系中均以浓度依赖性的方式降低了细胞存活率。计算所有检查的实体瘤细胞系的IC50值。下表1显示了治疗后96小时经PV-10处理的小儿实体瘤细胞系的值。如所见的，该值的范围为45-108μM，平均值为70μM。
表1
细胞系 细胞类型 PV-10IC50μM
SK-PN-DW 尤因肉瘤 80
SK-ES 尤因肉瘤 45
SK-N-AS 神经母细胞瘤 85
LAN1 神经母细胞瘤 80
SK-N-BE(2) 神经母细胞瘤 73
IMR5 神经母细胞瘤 73
SHEP 神经母细胞瘤 73
SK-N-SH 神经母细胞瘤 65
SK-N-MC 神经上皮瘤 45
143B 骨肉瘤 108
HOS 骨肉瘤 75
RD 横纹肌肉瘤 56
RH30 横纹肌肉瘤 51
相比之下，正常成纤维细胞系和原代骨髓样品的IC50值较高，范围为73-143μM，平均值为104μM(表2)，如下所示。表2提供了治疗后96小时经PV 10处理的正常成纤维细胞系和原代骨髓样品的半最大抑制浓度(IC50)值。
表2
细胞系 细胞类型 PV-10IC50(μM)
BJ 正常成纤维细胞(包皮) 143
原代骨髓 正常原代成纤维细胞 136
WI38 正常成纤维细胞(肺) 93
WI38hTERT hTERT转化的正常成纤维细胞(肺) 75
BJ hTERT hTERT转化的正常成纤维细胞(包皮) 73
PV-10对神经母细胞瘤细胞系具有细胞毒性
在已鉴定PV-10对小儿实体瘤细胞系具有细胞毒性后，神经母细胞瘤就成为研究重点，因为它是儿童中最常见的颅外癌症。研究了PV-10对神经母细胞瘤细胞系是否具有细胞毒性或细胞抑制作用。选择了四种不同的细胞系进行研究，其中是具有不同突变和基于IC50值对PV-10具有不同敏感性的三种神经母细胞瘤细胞系[SK-N-AS、SK-N-BE(2)和IMR5]和基于其IC50值对PV-10非常敏感的神经上皮瘤细胞系(SK-N-MC)。
将细胞用PBS(媒介物对照)、50μM或100μM PV-10处理96小时，并通过相差光学显微镜观察(图2A)。用PBS处理的细胞生长至汇合。用50μM PV-10处理的细胞未生长至融合，但几乎观察不到死细胞。
相比之下，在用100μM PV-10处理后，几乎没有细胞附着在板上，这表明100μM PV-10对所有细胞系均具有细胞毒性。但是，不同的细胞系似乎对PV-10具有不同的敏感性，其中SK-N-AS细胞对处理的抵抗力最高，而SK-N-MC细胞对处理的敏感性最高。
神经母细胞瘤细胞系显示对PV-10的不同敏感性
使用延时视频显微镜定量在用100μM PV-10处理12、24、36和48小时后附着在板上的细胞百分比来研究四种细胞系(SK-N-AS、SK-N-BE(2)、IMR5和SK-N-MC)对PV-10的不同敏感性。将在处理后附着的细胞数标准化至在零小时处的细胞数(图2B)。
SK-N-AS细胞对处理的抵抗力最高，在12小时时89％和在48小时时41％的细胞附着。SK-N-MC细胞对处理最敏感，在12小时时3.5％和在48小时时0％的细胞附着。与SK-N-BE(2)细胞(分别附着54％和14％的细胞)相比，IMR5细胞在12和24小时(分别附着16和7％的细胞)对处理更敏感，但是在36小时对于两种细胞系附着相似百分比的细胞(3％的SK-N-BE(2)和2％的IMR5细胞)。
这些数据表明，在处理后的早期，SK-N-MC细胞对处理最敏感，与SK-N-BE(2)细胞相比IMR5对处理更敏感，并且SK-N-AS细胞对处理的抵抗力最高。
使用PV-10的处理破坏溶酶体
以前，PV-10已被证明诱导溶酶体完整性的丧失[6]。因此，将SK-N-AS、SK-N-BE(2)和IMR5细胞用PBS(媒介物对照)或100μM PV-10处理16小时。用核酸染料Hoechst 33342和在酸性细胞器中富集并发荧光的Green DND-26染色活细胞，并通过荧光显微镜观察细胞(图3)。
在PBS处理的细胞和SK-N-AS PV-10处理的细胞中，溶酶体可见为特定焦点。但是，在PV-10处理的SK-N-BE(2)和IMR5细胞中，这些焦点不再可见。
PV-10处理增加细胞周期的G1期中IMR5细胞的百分比
通过流式细胞术分析了PV-10对细胞周期的影响(图4A)，以进一步确定PV-10的靶标调节。用PBS(媒介物对照)、50或100μM PV-10处理最抗具抗性(SK-N-AS)和最敏感(IMR5)的神经母细胞瘤细胞系16或24小时。
PV-10对SK-N-AS细胞的细胞周期没有影响。相比之下，100μM PV-10增加了G1期中IMR5细胞的百分比。在16小时时，与用PBS处理的细胞相比，用100μM PV-10处理后G1期中IMR5细胞的百分比增加了28％。类似地，在24小时时，与未处理的细胞相比，用100μM PV-10处理后G1期中的细胞增加了30％。
使用PV-10的处理诱导凋亡
然后进行蛋白质印迹分析以研究PV-10处理的细胞是否正在发生凋亡。将SK-N-AS、SK-N-BE(2)、IMR5和SK-N-MC细胞用PBS(媒介物对照)、75或100μM PV-10处理24小时。通过蛋白质印迹分析总细胞提取物，以检测总的和切割的聚ADP核糖(PARP)、总的和切割的胱天蛋白酶3、总的和切割的胱天蛋白酶7以及肌动蛋白(上样对照)的水平(图4B)。
PV-10处理显示PARP的浓度依赖性裂解。用100μM PV-10处理诱导所有细胞系中的PARP裂解，其中在SK-N-MC细胞(对PV-10最敏感的细胞系)中总蛋白和总PARP水平较低。用75μM PV-10处理的SK-N-AS和SK-N-BE(2)细胞显示比用100μM PV-10处理的细胞更少的PARP裂解，而IMR5细胞在用75μM和100μM PV-10处理时具有相似的PARP裂解水平。与用100μM处理的细胞相比，用75μM PV-10处理的SK-N-MC细胞中存在更多的总PARP。
胱天蛋白酶3、7和9的激活取决于PV-10浓度和细胞系。裂解的胱天蛋白酶3存在于用100μM PV-10处理的IMR5细胞中。SK-N-BE(2)细胞中的总胱天蛋白酶7的水平较低。
将IMR5和SK-N-MC细胞用75和100μM PV-10处理，并在100μM PV-10处理的SK-N-AS和SK-N-BE(2)细胞和75和100μM PV-10处理的IMR5细胞中检测到裂解的胱天蛋白酶7。在75和100μM PV-10处理的SK-N-BE(2)细胞中，总胱天蛋白酶9的水平较低，并且在75和100μMPV-10处理的IMR5细胞中检测到裂解的胱天蛋白酶9。这些数据表明PV-10通过凋亡诱导细胞死亡。
PV-10与不同抗癌剂协同作用
为了确定哪些常用的小分子全身性抗癌药物可以与PV-10组合以增强细胞毒性，首先针对一组具有不同作用机制的七种常规化疗剂筛选神经母细胞瘤细胞系SK-N-AS、SK-N-BE(2)和IMR5、神经上皮瘤细胞系SK-N-MC和正常成纤维细胞系BJ(图5)。所有试剂以0.1μM的浓度单独地或与50μM PV-10的亚细胞毒性浓度组合地筛选。在处理后96小时，使用alamar测定确定细胞存活率。
基于这些结果，选择了在组合时表现出最大的细胞毒性增加，并且对BJ细胞影响较小的药物用于进一步研究以确定组合指数(CI)和协同作用[18]。在SK-N-AS、SK-N-BE(2)、IMR5和SK-N-MC细胞中针对CI研究评估的药物是阿霉素、依托泊苷和长春新碱。
下表3提供了单独地或与50μM PV-10组合地用阿霉素、依托泊苷或长春新碱处理96小时的神经母细胞瘤细胞系(SK-N-AS，SK-N-BE(2)和IMR5)和神经上皮瘤细胞系SK-N-MC的组合指数。
表3
细胞系 阿霉素 依托泊苷 长春新碱
SK-N-AS 0.77 0.17 0.35
SK-N-BE(2) 0.72 0.66 0.1
IMR5 0.38 0.65 0.2
SK-N-MC 0.42 0.58 0.43
在每种测定的细胞系中，所有试剂均显示出与50μM PV-10的协同作用。可以看出，阿霉素的CI值范围为0.42-0.77，依托泊苷的CI值范围为0.17-0.66，长春新碱的CI值范围为0.1-0.43。
PV-10在神经母细胞瘤细胞系中诱导辐射敏感性
除了常用的化学疗法外，还研究了PV-10是否增强SK-N-AS(图6A)和IMR5(图6B)细胞中电离辐射(IR)的治疗效果。将细胞用PBS(媒介物对照)或50μM PV-10预处理4小时，然后用0.5、1或2Gray(Gy)辐照。初始处理后96小时通过alamar 测量细胞存活率。
用50μM PV-10进行预处理增强SK-N-AS和IMR5细胞中IR的作用。对于SK-N-AS细胞，在用0.5Gy、1Gy或2Gy辐照之前将细胞用PV-10预处理4小时时，细胞存活率分别下降54.8％、58.7％和60％。对于IMR5细胞，当用0.5Gy、1Gy或2Gy辐照之前将细胞用PV-10预处理4小时时，细胞存活率分别降低24％、21％和13％。
PV-10在体内诱导肿瘤消退
为了确定PV-10是否在体内也具有活性，我们表征了PV-10瘤内注射对CB17 SCID小鼠中的皮下SK-N-AS和IMR肿瘤的作用。肿瘤用25或50μl PV-10注射一次[8]并每天进行监测。
IMR5肿瘤对PV-10治疗非常敏感(图7A和7B)。对于对照肿瘤，肿瘤大小从治疗后六天的25.6mm2增加到治疗后23天的172.9mm2。相比之下，用25μl PV-10治疗的肿瘤从26.6mm2增加到41.2mm2，而用50μl PV-10治疗的肿瘤从27.9mm2增加到47.3mm2。还在腹膜内注射D-荧光素后使用Xenogen 200系统对肿瘤的生长进行了定量，该系统测量从肿瘤发出的生物发光信号。
用25和50μl PV-10治疗后肿瘤大小减小，并且在治疗后17天保持低水平。PV-10的治疗还以剂量依赖的方式提高了生存率(图7C)。
对照治疗的小鼠的中位生存期为25.5天，而25μl PV-10治疗的小鼠的中位生存期为41.5天，和50μl PV-10治疗的小鼠的中位生存期为76天。另外，用50μl PV-10治疗的小鼠中的两只经历了完全的肿瘤消退并且在治疗后120天保持无肿瘤。
SK-N-AS肿瘤对PV-10的治疗也有反应(图7D和7E)。对于对照肿瘤，肿瘤大小从治疗后六天的28.9mm2增加到治疗后18天的179.3mm2。相比之下，用25μl PV-10治疗的肿瘤从25.3mm2增加到92.1mm2，和用50μl PV-10治疗的肿瘤从29.3mm2增加到57.5mm2。当使用Xenogen200系统进行测量时，在用25和50μl PV-10治疗后，肿瘤大小减小，并且在治疗后15天仍小于对照治疗的肿瘤。
PV-10的治疗还可以提高生存率(图7F)。对照治疗的小鼠的中位生存期为29天，而25μl PV-10治疗的小鼠的中位生存期为37天，和50μl PV-10治疗的小鼠的中位生存期为36天。另外，用50μl PV-10治疗的小鼠中的一只经历了完全的肿瘤消退并且在治疗后80天保持无肿瘤。
讨论
患有小儿实体瘤的儿童的总生存率低于患有血液系统恶性肿瘤的儿童[1]。对于患有复发性或转移性尤因肉瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤和横纹肌肉瘤的儿童，总生存率低于30％[1]。
在这些癌症中，神经母细胞瘤是最常见的，并且是1-4岁儿童的主要死亡原因[2]。鉴于小儿实体瘤患者的低生存率，以及与对高风险和复发患者施用强化治疗方案相关的发病率，迫切需要为患有这些癌症的患者开发新的治疗方法和早期临床试验。
PV-10是玫瑰红(RB，4,5,6,7-四氯-2’,4’,5’,7’-四碘荧光素二钠)溶于0.9％盐水的无菌10％溶液，其诱导一系列成人癌症中的细胞死亡，但以前尚未针对小儿癌症的使用进行检查[7-11]。由于PV-10在不同的成人癌症中诱导细胞死亡，并且已经在数项临床试验中进行了评估[10、12、14、15、16]，因此研究了PV-10对不同的小儿实体瘤细胞系(尤因肉瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤和横纹肌肉瘤)的作用。
PV-10以浓度依赖的方式降低了小儿实体瘤细胞系中的细胞存活率。如预期的，正常的成纤维细胞细胞系和原代骨髓样品对PV-10不太敏感。这些数据类似于先前发表的有关成人癌症的数据[7、9、11]，并且表明PV-10可能是多种小儿实体瘤的有效治疗方法。
为了表征PV-10的靶调节作用，这些研究集中于神经母细胞瘤(儿童中最常见的颅外实体恶性肿瘤)和密切相关的神经上皮瘤。通过相差显微镜观察，发现PV-10对神经母细胞瘤细胞具有细胞毒性，并且与IC50值一致，SK-N-AS细胞被鉴定为对PV-10治疗最有抵抗力，SK-N-MC对PV-10治疗最敏感。延时视频显微镜证实了这些发现，再次表明SK-N-AS细胞对治疗最有抵抗力，而SK-N-MC对治疗最敏感。
此外，发现在12和24小时，IMR5细胞比SK-N-BE(2)细胞对治疗更敏感，尽管到36小时，两种类型的细胞都剩下很少。尽管早期对100μM PV-10的敏感性有所不同，但该浓度在96小时时仍对大多数SK-N-AS细胞具有细胞毒性，并且将剂量增加至200μM进一步增加了SK-N-AS细胞死亡。这些数据表明，PV-10可能是所有神经母细胞瘤的有效治疗方法，尽管对于某些亚型可能需要更高的剂量。
对PV-10的不同敏感性可能是由于细胞系的不同遗传背景以及肿瘤的不同病史(不同的患者治疗以及原发性相对复发性)所致。神经母细胞瘤是一种遗传异质性疾病，并选择了不同的细胞系以反映该异质性。
神经母细胞瘤中最常见的致癌驱动因素是在约25％的患者中见到的MYCN扩增、在约10-15％的患者中见到的间变性淋巴瘤激酶(ALK)突变和扩增以及在复发时获得的TP53突变[2]。使用癌症体细胞突变目录(COSMIC)细胞系计划[20]，确定了：SK-N-AS细胞在NRAS和FLT3中具有突变；SK-N-BE(2)的克隆具有过表达的ALK、AKT和MYCN以及TP53的纯合突变；IMR5细胞表现出AKT和MYCN的过度表达以及mTOR纯合突变；和SK-N-MC的克隆表现出MYCN的过表达和TP53的杂合突变。此外，SK-N-AS、SK-N-BE(2)和SK-N-MC细胞系均来源于具有不同治疗史的转移性肿瘤，而IMR5细胞系来源于原发性肿瘤。
先前已显示PV-10通过破坏溶酶体而起作用，从而导致细胞死亡[6]。溶酶体的破坏特别地影响癌细胞的存活，因为癌细胞具有改变的代谢，并可能依赖溶酶体来回收营养物质并去除快速生长和分裂的产物，例如聚集的蛋白质和受损的细胞器[21]。此外，溶酶体的破坏释放组织蛋白酶，其可导致坏死或凋亡的诱导[21]。
为了研究PV-10对神经母细胞瘤中溶酶体的作用，观察到了用Green DND-26(其在酸性细胞器中富集并发荧光)染色的细胞。与以前的结果相似，发现溶酶体在PBS处理的细胞中表现为明显的焦点，但溶酶体在用PV-10处理的SK-N-BE(2)和IMR5细胞中不存在。有趣的是，在抵抗性更高的SK-N-AS细胞中，溶酶体没有被破坏，并且甚至在治疗后仍表现为明显的焦点。
用100μM PV-10处理在IMR5而非SK-N-AS中诱导G1期细胞周期停滞，并以剂量和细胞系依赖性方式诱导凋亡。以前已经显示，在成人癌症中，PV-10通过凋亡或坏死诱导细胞死亡[7、9、11、14]。在其中发现细胞通过坏死死亡的研究中，PV-10诱导了在细胞死亡之前的G2/M细胞周期停滞[7]，这表明PV-10在来自不同癌症的细胞系中可能具有不同的作用机制。
尽管使用单一药剂的PV-10的治疗已在成人肿瘤的临床试验和临床前研究中证明了疗效，但高风险神经母细胞瘤患者在复发后用多种化学疗法和辐照进行治疗[2]。因此，研究了PV-10在与常用的化学治疗剂的组合治疗方案中的潜在用途。
初步筛选后，发现在所有研究的细胞系中，亚细胞毒性剂量的PV-10(50μM)与阿霉素、依托泊苷和长春新碱协同作用。此外，对于SK-N-AS和IMR5细胞，在辐照前用PV-10进行预治疗改善放射治疗的功效。这些数据与先前的数据(其中在一项II期临床试验中，使用PV-10预治疗黑色素瘤患者，然后进行放射治疗，诱导肿瘤消退而没有大幅增加细胞毒性[13])一致。这些结果表明，PV-10可以有效地与不同的常用治疗组合使用，以使患有复发性神经母细胞瘤的高风险患者受益。
在已鉴定PV-10在体外对小儿实体瘤细胞系具有细胞毒性后，在小鼠中使用皮下神经母细胞瘤异种移植物检查了PV-10的体内活性。发现PV-10的药理学相关剂量[12、13、16]以剂量和肿瘤依赖性方式诱导肿瘤消退和增加存活率。腹腔内注射25和50μl PV-10诱导早期肿瘤消退，其中50μl PV-10增加患有SK-N-AS或IMR5肿瘤的小鼠的总生存率。这些数据与以前使用动物模型进行的研究相似，其中PV-10的瘤内注射引起皮下同基因结肠肿瘤[7]、同基因皮下乳腺肿瘤和黑色素瘤[14、8]的退化。
总而言之，本研究提供了有关PV-10在成功治疗小儿实体瘤(尤因肉瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤和横纹肌肉瘤)中的功效的临床前概念验证数据。通过关注神经母细胞瘤，发现PV-10通过破坏溶酶体、将细胞滞留在细胞周期的G1期并诱导凋亡而发挥作用。已经鉴定出与PV-10显示协同活性的几种常用的治疗方法。此外，使用神经母细胞瘤异种移植小鼠研究已经证实了PV-10治疗的体内功效。
在代表性细胞系和体内免疫功能低下的小鼠中进行的发现为直接的细胞毒性潜力以及该药剂可诱导癌细胞中的靶标调节作用的机制提供了证据。还鉴定了可以组合产生治疗协同作用的药剂，从而为制定早期临床试验提供了框架。这是附加于先前描述的预期的免疫刺激作用的，为潜在的方法提供了支持，在该方法中，PV-10主治方案可以与药剂诸如免疫检查点抑制剂组合使用以进一步增强其在患有复发性或难治性小儿实体瘤的患者中的活性。
材料和方法
细胞系和组织培养
细胞系(SK-N-AS、SK-N-BE(2)、IMR5、LAN1、SK-N-MC、SK-N-SH、SHEP、BJ、BJ hTERT、WI38、WI38 hTERT、Hs68hTERT、RD、RH30、143B、HOS、SK-ES和SK-PN-DW)在补充了5％(v/v)热灭活的胎牛血清(FBS)(Gibco)、100单位/ml青霉素和100单位/ml链霉素(Gibco)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(Gibco，ON，Canada)中培养。将细胞培养物在37℃保持在5％CO2的潮湿培养箱中。经当地研究伦理委员会(REB)批准并获得知情同意书(EthicsID#17184)后，获得了原代骨髓样品。如前所述[17]，使用Ficoll-Paque Plus(GEHealthcare Life Sciences,ON,Canada)通过密度梯度离心从骨髓样品中分离出淋巴细胞。
材料和试剂
由Provectus Biopharmaceuticals Inc.(Knoxville,TN,USA)提供PV-10(玫瑰红二钠溶于0.9％盐水的10％溶液)，并在室温下避光保存。阿霉素、依托泊苷、长春新碱、顺铂、pegasparaginase、伊立替康和阿糖胞苷的原液获自Alberta Children’s HospitalPharmacy(Calgary,AB,Canada)，并在室温下避光保存。为了进行后续研究，将药物在添加补充剂的DMEM中稀释至合适的浓度。
细胞毒性测定
将细胞以每孔5×103的密度接种到96孔板(Greiner Bio-One，NC，USA)中的100μlDMEM中，并培养24小时。在DMEM中稀释单独的PV-10或磷酸盐缓冲盐水(PBS；137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4,pH 7.25)(媒介物对照)，并向每个孔中添加100μl处理液。所有处理均以3.125至400μM的最终浓度重复进行三次。
将板子培养96小时。将孔用PBS洗涤两次，向每个孔中加入200μl新鲜DMEM，并按照制造商的说明使用alamar(Invitrogen,ON,Canada)对细胞存活率进行评估。使用CompuSyn软件(ComboSyn Inc.)确定半最大抑制浓度(IC50)。
光学显微镜检查
将细胞以每孔2×105的密度接种在6孔板(Corning Inc.，NY，USA)中，并培养24小时。用PBS(媒介物对照)或PV-10处理细胞，并培养96小时。使用Zeiss AxioVision Se64软件在带有Zeiss AxioCam MRm Rev.3FireWire相机的Zeiss Axiovert 200M显微镜上捕获相衬图像。使用Adobe Photoshop(Adobe Creative Cloud2017)处理图像。
延时视频显微镜检查
将细胞以每孔5×103的密度接种在96孔板(Greiner Bio-One)中，并培养24小时。用PBS(媒介物对照)或PV-10处理细胞。使用位于37℃的5％CO2的潮湿培养箱中的Zoom显微镜和/>Zoom软件(Essen BioScience，MI，USA)，每30分钟每孔捕获三幅图像，持续48小时。使用ImageJ软件对每个孔中的细胞数进行计数，并标准化至在零小时处的细胞数。每个实验每次处理计数至少350个细胞。
溶酶体检测和荧光显微镜检查
对于未处理的细胞，将细胞以2×105/孔接种到6孔板(Corning)中的无菌盖玻片上，对于处理的细胞，以6×105/孔接种到6孔板(Corning)中的无菌盖玻片上，并培养24小时。用PBS(媒介物对照)或PV-10处理细胞16小时。用PBS洗涤孔两次，并向每个孔中加入含有2.5μg/ml Hoechst 33342染色剂(Invitrogen)的2ml DMEM。将细胞在37℃下孵育10分钟，然后将Green DND-26(Invitrogen)以500nM的终浓度添加到培养基中。将细胞在37℃下孵育15分钟，在成像时将盖玻片固定在载玻片上，并使用ZeissAxioVision Se64软件在带有Zeiss AxioCam MRm Rev.3FireWire相机的Zeiss Axiovert200M显微镜上捕获图像。使用Adobe Photoshop(Adobe Creative Cloud 2018)处理图像。
流式细胞术
为了分析细胞周期变化，将细胞接种在100毫米培养皿(Corning)中，以便在处理后可以至少收集2×106个细胞。将细胞培养24小时，用PBS(媒介物对照)或PV-10处理，并培养16或24小时。通过胰蛋白酶消化收集细胞，用PBS洗涤，通过40μm尼龙细胞滤网(Falcon，Corning，NY，USA)过滤，使用血细胞计数器通过台盼蓝染色计数，重悬于0.9％(w/v)无菌NaCl中并固定在冰冷的90％(v/v)乙醇中。样品在室温下孵育30分钟，然后在-20℃下保存。
为了进行分析，将样品在4℃下以1400rpm离心5分钟，然后用冰冷的PBS洗涤两次。然后将细胞在300μl标记缓冲液(在PBS中的0.1％Triton X-100中10μg/ml DAPI(Sigma，ON，Canada)、200μg/ml RNase A(Sigma))中于37℃孵育20分钟。使用Diva 6.1.3软件(BDBioscience)在BD Bioscience LSR II细胞计数器上运行样品。使用ModFitLTTM3.3软件(Verity Software House)分析结果。
细胞提取物的制备
将细胞以1×106接种在100毫米培养皿(Corning)中，并培养24小时。然后将细胞用PBS(媒介物对照)或PV-10处理，并培养24小时。从细胞培养物中收集培养基，并用PBS洗涤细胞并在胰蛋白酶消化后收集细胞。在冰冷的PBS中洗涤细胞，并在4℃以1200rpm离心5分钟。除去上清液，并将沉淀重悬于补充有1％(v/v)磷酸酶抑制剂(Sigma)和1％(v/v)蛋白酶抑制剂(Sigma)的放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 8)，150mM NaCl，1％(v/v)NP-40、0.5％(w/v)脱氧胆酸钠，0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS))中。将样品转移至1.5ml试管，在冰上孵育10分钟，涡旋并以12,000rpm离心10分钟。收集上清液作为全细胞裂解物，并立即使用或保存在-20℃。
蛋白质印迹
如先前所述进行蛋白质印迹[17]。简而言之，使用TurboTM转移系统(BioRad，QC，Canada)将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，使用Ponceau S染色剂(5％(v/v)乙酸中的0.1％(w/v))确认转移，并在具有0.1％(v/v)/>-20的Tris缓冲盐水(TBS-T；50mM Tris-HCl,pH 7.5,150mM NaCl,0.1％(v/v)/>-20)中的5％脱脂奶中在室温下封闭膜两个小时。然后将膜与在TBS-T中的5％(w/v)脱脂奶中稀释的以下一抗在4℃下孵育过夜(约18小时)：抗PARP(1:3000，Cell Signaling，9542S)，抗胱天蛋白酶3(1:500，CellSignaling，9662S)，抗胱天蛋白酶7(1:1000，Cell Signaling，9492S)，抗胱天蛋白酶9(1:1000，Cell Signaling，9502S)和抗β-肌动蛋白(1:5000，Cell Signaling，8457L)。将膜用TBS-T洗涤3次，与抗兔二抗(1:3000，Cell Signaling，7074S)孵育，用TBS-T洗涤3次，与Western Lightning Plus-ECL试剂(Perkin-Elmer，MA，USA)孵育两分钟，然后使用化学发光设置在ChemiDoc MP成像系统(BioRad)上进行显影。
组合筛选
如对于细胞毒性测定所述培养细胞。在含有PBS(媒介物对照)或PV10(最终50μM)的培养基中以0.1μM的终浓度制备测试药物(阿霉素、依托泊苷、长春新碱、顺铂、pegasparaginase、伊立替康、阿糖胞苷)。将处理一式三份加入细胞中。如对于细胞毒性测定所述，将板子进行培养、洗涤并通过alamar分析细胞存活率。
组合研究
如对于细胞毒性试验所述培养细胞。在含有PBS(媒介物对照)或PV10(最终50μM)的DMEM中制备三种测试药物(阿霉素、依托泊苷、长春新碱)的稀释系列物，并一式三份加入细胞中。如对于细胞毒性测定所述，将板子进行培养、洗涤并通过alamar分析细胞存活率。使用CompuSyn软件(ComboSyn Inc.)计算与50μM PV-10组合的测试药物的IC50的组合指数(CI)。根据以下标准对CI值进行评分：CI<1指示协同活性，CI＝1指示累加活性，和CI>1指示协同活性[18]。
放射敏感性测定
将细胞以5×104接种在60毫米培养皿(Corning)中，孵育24小时，然后用PBS(媒介物对照)或50μM PV-10处理，并在37℃孵育4小时。使用1000Elite(MDSNordion，ON，Canada)用0.5、1或2Gray(Gy)辐照细胞，并培养92小时。处理一式三份进行。将培养皿用PBS洗涤两次，并如对于细胞毒性测定所述的通过alamar/>分析细胞存活率。
体内异种移植模型
所有动物程序均按照加拿大动物保护委员会和美国国家卫生研究院关于实验动物的护理和使用的指南进行。卡尔加里大学动物护理委员会审查并批准了所有方案(方案批准号：AC16-0243)。
IMR5-mCherryFluc和SK-N-AS-mCherryFluc细胞用于动物研究。这些细胞系稳定表达在自灭活的慢病毒载体上的增强的萤火虫萤光素酶和mCherry，该载体编码来自鼠干细胞病毒(mscv)的内部U3区、增强的萤火虫萤光素酶(effLuc)、来自脑心肌炎病毒(emcv)的内部核糖体进入位点(IRES)元件和mCherry。
将六到八周龄的CB17 SCID雌性小鼠(Charles River Laboratories，QC，Canada)在右侧腹皮下注射悬浮在0.1mlMatrix(Fischer Scientific,ON,Canada)中的2.5×106个细胞(SK-N-ASmCherryFluc或IMR5mCherryFluc)(第零天)。肿瘤注射后7天，将具有至少5×5mm的可检测的肿瘤生长的动物随机分到治疗组中。根据先前建立的方案[8]，通过肿瘤内(病灶内)注射用50μl PBS(媒介物对照)、50μl PV-10或25μl PV-10治疗各组。每天监测动物，并用游标卡尺测定肿瘤面积。当肿瘤达到15×15mm的定义的终点时，对小鼠实施安乐死。将保持无肿瘤的动物在治疗后饲养120天。
还使用Xenogen200系统(Xenogen Corporation，CA，USA)监测肿瘤生长。在腹膜内注射D-荧光素(Gold Biotechnology,MO,USA)后，对小鼠进行成像以记录从肿瘤发出的生物发光信号。根据已建立的方法[19]，通过确定感兴趣区域中的总光子通量发射(光子/秒)来分析数据。
引用文献
1.Chen X,Pappo A,Dyer MA.Pediatric solid tumor genomics anddevelopmental pliancy.Oncogene.2015；34:5207.doi:10.1038/onc.2014.474.
2.Moreno L,Caron H,Geoerger B,Eggert A,Schleiermacher G,Brock P etal.Accelerating drug development for neuroblastoma-New Drug DevelopmentStrategy:an Innovative Therapies for Children with Cancer,European Networkfor Cancer Research in Children and Adolescents and International Society ofPaediatric Oncology Europe Neuroblastoma project.Expert opinion on drugdiscovery.2017；12(8):801-11.doi:10.1080/17460441.2017.1340269.
3.Cheung N-KV,Dyer MA.Neuroblastoma:Developmental Biology,CancerGenomics,and Immunotherapy.Nature reviews Cancer.2013；13(6):397-411.doi:10.1038/nrc3526.
4.Park JR,Bagatell R,London WB,Maris JM,Cohn SL,Mattay KK etal.Children's Oncology Group's 2013blueprint for research:neuroblastoma.Pediatric blood&cancer.2013；60(6):985-93.doi:10.1002/pbc.24433.
5.Yvart J,Moati F,Alvarez F.Odievre M.Degrez A.131I Rose Bengal:ItsUse in the Evaluation of Infantile Jaundice.European Journal of NuclearMedicine.1981；6:355-359.
6.Wachter,E.,Dees,C.,Harkins,J.,Fisher,W.,Scott,T.2002.Functionalimaging of photosensitizers using multiphoton microscopy.Proceedings of SPIE,Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences II,Periasamy,A.and So,P.T.C.(eds),Bellingham,Washington:4620:143–147.
7.Qin J,Kunda N,Qiao G,Calata JF,Pardiwala K,Prabhakar BS et al.Coloncancer cell treatment with Rose Bengal generates a protective immune responsevia immunogenic cell death.Cell Death&Amp；Disease.2017；8:e2584.doi:10.1038/cddis.2016.473
8.Toomey P,Kodumudi K,Weber A,Kuhn L,Moore E,Sarnaik AA etal.Intralesional Injection of Rose Bengal Induces a Systemic Tumor-SpecificImmune Response in Murine Models of Melanoma and Breast Cancer.PLoS ONE.2013；8(7):e68561.doi:10.1371/journal.pone.0068561.
9.Koevary SB.Selective toxicity of Rose Bengal to ovarian cancercells in vitro.International journal of physiology,pathophysiology andpharmacology.2012；4(2):99-107.
10.Thompson JF,Hersey P,Wachter E.Chemoablation of metastaticmelanoma using intralesional Rose Bengal.Melanoma research.2008；18(6):405-11.doi:10.1097/CMR.0b013e32831328c7.
11.Zamani Taghizadeh Rabe S,Mousavi SH,Tabasi N,Rastin M,ZamaniTaghizadeh Rabe S,Siadat Z et al.Rose Bengal suppresses gastric cancer cellproliferation via apoptosis and inhibits nitric oxide formation inmacrophages.Journal of immunotoxicology.2014；11(4):367-75.doi:10.3109/1547691x.2013.853715.
12.Thompson JF,Agarwala SS,Smithers BM,Ross MI,Scoggins CR,CoventryBJ et al.Phase 2 Study of Intralesional PV-10 in Refractory MetastaticMelanoma.Annals of surgical oncology.2015；22(7):2135-42.doi:10.1245/s10434-014-4169-5.
13.Foote M,Read T,Thomas J,Wagels M,Burmeister B,Smithers BM.Resultsof a phase II,open-label,non-comparative study of intralesional PV-10followed by radiotherapy for the treatment of in-transit or metastaticmelanoma.Journal of surgical oncology.2017；115(7):891-7.doi:10.1002/jso.24580.
14.Liu H,Innamarato PP,Kodumudi K,Weber A,Nemoto S,Robinson JL etal.Intralesional Rose Bengal in melanoma elicits tumor immunity viaactivation of dendritic cells by the release of high mobility group box1.Oncotarget.2016；7(25):37893-905.doi:10.18632/oncotarget.9247.
15.Lippey J,Bousounis R,Behrenbruch C,McKay B,Spillane J,Henderson MAet al.Intralesional PV-10 for in-transit melanoma-A single-centerexperience.Journal of surgical oncology.2016；114(3):380-4.doi:10.1002/jso.24311.
16.Ross MI.Intralesional therapy with PV-10(Rose Bengal)for in-transit melanoma.Journal of surgical oncology.2014；109(4):314-9.doi:10.1002/jso.23554.
17.Jayanthan A,Ruan Y,Truong TH,Narendran A.Aurora kinases asdruggable targets in pediatric leukemia:heterogeneity in target modulationactivities and cytotoxicity by diverse novel therapeutic agents.PLoSOne.2014；9(7):e102741.doi:10.1371/journal.pone.0102741.
18.Chou T-C.Drug Combination Studies and Their Synergy QuantificationUsing the Chou-Talalay Method.Cancer Research.2010；70(2):440.
19.Lun X,Ruan Y,Jayanthan A,Liu DJ,Singh A,Trippett T et al.Double-deleted vaccinia virus in virotherapy for refractory and metastatic pediatricsolid tumors.Molecular oncology.2013；7(5):944-54.doi:10.1016/j.molonc.2013.05.004.
20.Catalogue of Somatic Mutations in Cancer(COSMIC).https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic.Accessed 30.10.17.
21.Fennelly C,Amaravadi RK.Lysosomal Biology in Cancer.Methods inmolecular biology(Clifton,NJ).2017；1594:293-308.doi:10.1007/978-1-4939-6934-0_19.

Claims (12)

1.玫瑰红或其药学上可接受的盐在制备用于在哺乳动物受试者中治疗选自尤因肉瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、神经上皮瘤和横纹肌肉瘤中的一种或多种的小儿癌性实体瘤的药物中的用途，其中所述治疗包括病灶内施用一定量的引起肿瘤细胞消融的所述玫瑰红或其药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述玫瑰红的药学上可接受的盐是玫瑰红二钠。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述哺乳动物是人。
4.玫瑰红或其药学上可接受的盐和全身性抗癌药物在制备用于在哺乳动物受试者中治疗选自神经母细胞瘤和神经上皮瘤中的一种或多种的小儿癌性实体瘤的药物中的用途，
其中所述治疗包括：
(1)病灶内施用一定量的引起肿瘤细胞消融的玫瑰红或其药学上可接受的盐，和
(2)施用肿瘤抑制有效量的全身性抗癌药物，其与所述玫瑰红或其药学上可接受的盐一起提供协同细胞毒性，所述全身性抗癌药物选自阿霉素、依托泊苷和长春新碱中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述玫瑰红的药学上可接受的盐是玫瑰红二钠。
6.根据权利要求4所述的用途，其中所述玫瑰红或其药学上可接受的盐的所述病灶内施用在所述全身性抗癌药物的施用之前进行。
7.根据权利要求4所述的用途，其中所述玫瑰红或其药学上可接受的盐的所述病灶内施用在所述全身性抗癌药物的施用之后进行。
8.根据权利要求4所述的用途，其中所述玫瑰红或其药学上可接受的盐的所述病灶内施用与所述全身性抗癌药物的施用同时进行。
9.根据权利要求4所述的用途，其中所述哺乳动物是人。
10.玫瑰红或其药学上可接受的盐在制备用于在哺乳动物受试者中诱导小儿癌性实体瘤神经母细胞瘤的辐射敏感性的辐照之前的预处理剂中的用途，所述预处理和辐照包括：
(1)病灶内施用一定量的引起肿瘤细胞消融的玫瑰红或其药学上可接受的盐，和
(2)施用肿瘤抑制有效量的电离辐射。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述玫瑰红的药学上可接受的盐是玫瑰红二钠。
12.根据权利要求10所述的用途，其中所述哺乳动物是人。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115916343A (zh) * 2020-03-26 2023-04-04 普罗维克图斯药品技术公司 卤代呫吨在肿瘤学和病毒学中的新用途
US11938182B2 (en) 2020-03-26 2024-03-26 Provectus Pharmatech, Inc. Halogenated xanthenes as vaccine adjuvants
AU2021440597A1 (en) * 2021-04-16 2022-11-10 Provectus Pharmatech, Inc. Composition and method for oral treatment of leukemia

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103476943A (zh) * 2011-03-10 2013-12-25 普罗维克图斯药品公司 用于增强治疗癌症的局部和全身性免疫调节疗法的组合
WO2017009843A2 (en) * 2015-07-16 2017-01-19 Biokine Therapeutics Ltd. Compositions, articles of manufacture and methods for treating cancer

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5829448A (en) 1996-10-30 1998-11-03 Photogen, Inc. Method for improved selectivity in photo-activation of molecular agents
US6493570B1 (en) 1998-11-02 2002-12-10 Photogen, Inc. Method for improved imaging and photodynamic therapy
US7390668B2 (en) 1996-10-30 2008-06-24 Provectus Pharmatech, Inc. Intracorporeal medicaments for photodynamic treatment of disease
US6331286B1 (en) 1998-12-21 2001-12-18 Photogen, Inc. Methods for high energy phototherapeutics
US8974363B2 (en) 1997-12-11 2015-03-10 Provectus Pharmatech, Inc. Topical medicaments and methods for photodynamic treatment of disease
US7648695B2 (en) 1998-08-06 2010-01-19 Provectus Pharmatech, Inc. Medicaments for chemotherapeutic treatment of disease
EP3322441A4 (en) 2015-07-16 2018-12-19 Bharat Biotech International Limited Vaccine compositions
US10130658B2 (en) 2015-12-18 2018-11-20 Provectus Pharmatech, Inc. Method of ex vivo enhancement of immune cell activity for cancer immunotherapy with a small molecule ablative compound

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103476943A (zh) * 2011-03-10 2013-12-25 普罗维克图斯药品公司 用于增强治疗癌症的局部和全身性免疫调节疗法的组合
WO2017009843A2 (en) * 2015-07-16 2017-01-19 Biokine Therapeutics Ltd. Compositions, articles of manufacture and methods for treating cancer

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张文丽等. 《医学病理技术与诊断基础 上》.2016,145-146,150. *
李勤等.神经母细胞瘤的治疗进展.《重庆医学》.2007,第36卷(第15期),1483-1485,1488. *

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