ES2964399T3 - Actividad antitumoral in vitro y xenoinjerto de un xanteno halogenado contra tumores sólidos pediátricos refractarios - Google Patents

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Abstract

Se divulga un método para tratar un tumor sólido canceroso pediátrico en un sujeto mamífero que comprende administrar intralesionalmente una cantidad de xanteno halogenado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, preferiblemente rosa de Bengala disódica, que provoca la ablación de las células tumorales del tumor administrado. Otro método contemplado comprende las etapas de administrar intralesionalmente una cantidad de un xanteno halogenado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, preferiblemente rosa de Bengala disódica, que provoca la ablación de las células tumorales del tumor administrado y administrar sistémicamente una cantidad eficaz inhibidora de tumores de un antisistémico. -medicamento contra el cáncer que proporciona citotoxicidad sinérgica con el xanteno halogenado. Las dos administraciones pueden ocurrir simultáneamente o una antes que la otra. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Actividad antitumoralin vitroy xenoinjerto de un xanteno halogenado contra tumores sólidos pediátricos refractarios
Referencia cruzada con solicitud relacionada
Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud N° de serie 62/672,373 que fue presentada el 16 de mayo de 2018.
La presente invención se refiere a un xanteno halogenado, que es la Rosa de Bengala o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, opcionalmente en combinación con un medicamento sistémico contra el cáncer, para uso en el tratamiento de un tumor sólido canceroso pediátrico en un sujeto mamífero, como se define en las reivindicaciones.
Técnica antecedente
Los tipos de cáncer que se desarrollan en los niños a menudo son diferentes de los tipos que se desarrollan en los adultos. Los cánceres infantiles son a menudo el resultado de cambios en el ADN de las células que tienen lugar muy temprano en la vida, a veces incluso antes del nacimiento. Por lo tanto, las mutaciones genéticas que inician el desarrollo del cáncer pueden surgir durante el desarrollo de un feto en el útero. A diferencia de muchos cánceres en adultos, los cánceres infantiles no están fuertemente relacionados con el estilo de vida o los factores de riesgo ambientales.
Además, los niños enfrentan problemas únicos durante su tratamiento para el cáncer, después de completar el tratamiento y como sobrevivientes de cáncer. Por ejemplo, los niños pueden recibir tratamientos más intensos, mientras que su cáncer y sus tratamientos pueden tener diferentes efectos en el cuerpo en crecimiento de un niño en comparación con el cuerpo de un adulto. Los niños pueden responder de manera diferente a los medicamentos utilizados para controlar los síntomas en los adultos.
A los adolescentes y adultos jóvenes a menudo se les diagnostican diferentes tipos de cáncer, ya sea en niños más pequeños o en adultos mayores. La incidencia de tipos específicos de cáncer varía ampliamente a lo largo del proceso de edad de los adolescentes y los adultos jóvenes. Cierta evidencia indica que los adolescentes y adultos jóvenes con leucemia linfoblástica aguda pueden tener mejores desenlaces si se tratan con regímenes de tratamiento pediátricos que si reciben regímenes de tratamiento para adultos.
En la actualidad, los niños con tumores sólidos recidivantes o metastásicos, tales como el sarcoma de Ewing, el neuroblastoma, el osteosarcoma y el rabdomiosarcoma, tienen una tasa de supervivencia general baja de menos del 30 % [1]. De los tumores sólidos pediátricos, el neuroblastoma es el cáncer extracraneal más común en niños y una de las principales causas de muerte en niños de 1-4 años [2].
El neuroblastoma se origina en el tejido nervioso simpático y es una enfermedad muy heterogénea y compleja [3]. Las mejoras recientes en el tratamiento del neuroblastoma han aumentado las tasas de supervivencia a 5 años para la enfermedad que no es de alto riesgo a más del 90% [4]. Sin embargo, más del 40 % de los pacientes que presentan neuroblastoma se consideran de alto riesgo y, a pesar de los regímenes de tratamiento intensivo, las tasas de supervivencia a 5 años para estos pacientes son inferiores al 50 % [2, 4]. Además, el pronóstico del neuroblastoma recidivante es sombrío, con una tasa de supervivencia a 5 años inferior al 10% [4].
Dadas las bajas tasas de supervivencia de los pacientes pediátricos con tumores sólidos recidivantes o metastásicos, en particular aquellos con neuroblastoma de riesgo alto y recidivante, se necesitan con urgencia novedosos enfoques terapéuticos para el tratamiento de estas neoplasias malignas.
Un grupo de agentes contra el cáncers útiles para los tumores cancerosos en adultos son los xantenos halogenados, o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Véanse las patentes U.S. N° 6,331,286, No. 7,390,668, y No. 7,648,695. De esos xantenos halogenados, se ha encontrado que la Rosa de Bengala disódica, (4, 5, 6, 7-tetracloro-2', 4', 5', 7' - tetrayodofluoresceína disódica; RB) es particularmente eficaz y fácil de utilizar. Debido al comportamiento a menudo muy diferente de los tumores adultos respecto de los tumores pediátricos, no se sabe si el RB y los xantenos halogenados similares serían igualmente eficaces cuando se usan contra los tumores cancerosos pediátricos.
PV-10 es una solución estéril al 10% de (RB), en solución salina al 0.9%, que se ha utilizado clínicamente para medir la función hepática en lactantes [5]. Estudios previos han demostrado que el PV-10 se acumula en los lisosomas [6] e induce la muerte celular en una variedad de cánceres adultos [7-11].
En un ensayo clínico de fase II para pacientes con melanoma metastásico refractario, la inyección intralesional (IL) de PV-10 indujo una regresión tumoral con una tasa de respuesta general de 51 % [12]. PV-10 también demostró eficacia en combinación con radioterapia en un ensayo clínico de fase II para pacientes con melanoma en tránsito o metastásico, con una tasa de respuesta global del 86.6% [13]. Además de inducir la muerte directa de las células cancerosas, también se ha demostrado que PV-10 induce una respuesta inmunitaria específica del tumor tanto en estudios con ratones [7, 8, 14] como en ensayos clínicos [10, 12, 14, 15, 16].
El comunicado de prensa https://www.provectusbio.com/news/press-releases/provectus-pr-20180425-1/ divulga que los datos preclínicos de la investigación en curso sobre el cáncer pediátrico sobre PV-10 se presentarán en una presentación de póster en la Reunión Anual de la American Society of Clinical Oncology (American Society of Clinical Oncology) del 1 al 5 de junio de 2018. De Kraker et al., informa "131I-Rose Bengal Therapy in Hepatoblastoma Patients" (Eur. J. Cancer, 27(5), 1991,613-615).
Breve resumen de la invención
Las referencias a métodos de tratamiento en esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.
La presente invención contempla un método para tratar un tumor sólido canceroso pediátrico en un sujeto mamífero. El método deacuerdo con la invención contempla la administración intralesional de una cantidad de xanteno halogenado que es la Rosa de Bengala o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que provoca la ablación de las células tumorales del tumor administrado. Un segundo método comprende las etapas de administración intralesional de una cantidad de dicho xanteno halogenado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que provoque la ablación de las células tumorales del tumor administrado. También se administra sistémicamente al sujeto mamífero una cantidad efectiva inhibidora del tumor de un medicamento sistémico contra el cáncer que proporciona citotoxicidad sinérgica con el xanteno halogenado.
Los dos medicamentos pueden administrarse simultáneamente, o uno puede administrarse antes que el otro entre aproximadamente una a aproximadamente cuatro semanas. Es preferible realizar la administración intralesional antes de la administración sistémica entre aproximadamente una a aproximadamente cuatro semanas.
Breve descripción de los dibujos
En los dibujos que forman parte de esta divulgación
La Fig. 1, incluidas las Figs. 1A-1E, ilustran que PV-10 disminuye la viabilidad celular en líneas celulares de tumores sólidos pediátricos. Diferentes líneas celulares de tumores sólidos pediátricos (sarcoma de Ewing, neuroblastoma, osteosarcoma y rabdomiosarcoma), líneas celulares de fibroblastos normales y una muestra primaria de médula ósea se trataron con concentraciones crecientes (3.125-400<j>M) de PV-10 durante 96 horas. La viabilidad celular se midió mediante el ensayo de blue® de alamar. El porcentaje de viabilidad celular se normalizó al tratamiento correspondiente con PBS (control de vehículos). Los porcentajes medios de viabilidad celular se calcularon a partir de tres estudios separados y se muestran los errores estándar de las medias.
La Fig. 2, incluidas las Figs. 2A y 2B, son fotomicrografías que muestran que PV-10 es citotóxico para las líneas celulares de neuroblastoma. En la Fig. 2 (A), las líneas celulares de neuroblastoma SK-N-AS, SK-N-BE(2) e IMR5, y la línea celular de neuroepitelioma estrechamente relacionada SK-N-MC se trataron con PBS (control de vehículo), 50 j M o 100 j M PV-10 durante 96 horas y se observaron mediante microscopía óptica de contraste de fase. Los estudios se realizaron tres veces y se muestran imágenes representativas. La barra de escala es igual a 100 jm . En la Fig. 2 (B), las líneas celulares de neuroblastoma SK-N-AS, SK-N-BE(2) e IMR5, y la línea celular de neuroepitelioma SK-N-MC se trataron con PBS (control de vehículo) o PV-10 de 100<j>M y se observaron mediante microscopía de vídeo de lapso de tiempo. Las imágenes se capturaron cada 30 minutos durante 48 horas. El número de células se contó y se normalizó al número de células a las 0 horas. Se contaron al menos 350 células por tratamiento por estudio. Se muestran los porcentajes medios de números de células calculados a partir de tres estudios separados y los errores estándar de las medias.
La Fig. 3 ilustra que PV-10 altera los lisosomas en las células cancerosas. Las líneas celulares de neuroblastoma SK-N-AS, SK-N-BE(2) e IMR5 se trataron con PBS (control de vehículo) o 100<j>M PV-10 durante 16 horas. Las células vivas se tiñeron con tinción de ácido nucleico Hoechst 33342 y LysoTracker® Green DND-26, que se concentra y emite fluorescencia en orgánulos ácidos, y se observaron mediante microscopía de fluorescencia. La barra de escala es igual a 20 jm . Los datos presentados son representativos de tres estudios separados.
La Fig. 4, incluyendo las Figs. 4A y 4B, muestran que PV-10 aumenta el porcentaje de células en la fase G1 del ciclo celular e induce la muerte celular por apoptosis. En la Fig. 4A, las líneas celulares de neuroblastoma SK-N-AS e IMR5 se trataron con PBS (control de vehículo), 50 j M o 100 j M PV-10 durante 16 o 24 horas, se tiñeron con DAPI y se analizaron mediante citometría de flujo para detectar la fase del ciclo celular. Los porcentajes medios de células en las fases G1, S o G2/M del ciclo celular se calcularon a partir de tres estudios separados y se muestran los errores estándar de las medias. En la Fig. 4B, las líneas celulares de neuroblastoma SK-N-AS, SK-N-BE(2) e IMR5, y la línea celular de neuroepitelioma SK-N-MC se trataron con PBS (control de vehículo), 75 j M o 100 j M PV-10 durante 24 horas. Los lisados celulares totales se prepararon y analizaron mediante transferencia Western para detectar niveles de poli-ADP ribosa polimerasa (PARP) total y escindida, caspasa 3, caspasa 7 y caspasa 9. La actina se utilizó como control de carga. Las masas moleculares se indican en kilodaltons (kDa). Los datos presentados son representativos de dos estudios separados.
La Fig. 5 ilustra que el tratamiento con PV-10 es sinérgico con diferentes tratamientos con agentes contra el cáncers. Las líneas celulares de neuroblastoma SK-N-AS, SK-N-BE(2) e IMR5, la línea celular de neuroepitelioma SK-N-MC y la línea celular de fibroblastos normales BJ se trataron con 0.1 pM de siete agentes contra el cáncers diferentes, ya sea solos o en combinación con 50 pM PV-10. Las células se trataron durante 96 horas y la viabilidad celular se midió con blue® de alamar. El porcentaje de viabilidad celular se normalizó al tratamiento con PBS (control de vehículos). Se muestran los porcentajes medios de viabilidad celular calculados a partir de dos estudios separados y los errores estándar de las medias.
La Fig. 6, incluidas las Figs. 6A y 6B, muestran que el tratamiento con PV-10 mejora el efecto de la irradiación. Las líneas celulares de neuroblastoma SK-N-AS (Fig. 6A) e IMR5 (Fig. 6B) se trataron previamente con PBS (control de vehículos) o 50 pM PV-10 durante 4 horas. A continuación, las células se irradiaron con 0.5, 1 o 2 Gy y se cultivaron durante 92 horas más. La viabilidad celular se midió con blue® de alamar. Se muestran los porcentajes medios de viabilidad celular calculados a partir de tres estudios separados y los errores estándar de las medias. Los asteriscos muestran diferencias significativas, prueba t de Student pareada, p < 0.05.
La Fig. 7, incluyendo las Figs. 7A-7F, ilustran que el tratamiento con PV-10 induce la regresión tumoralin vivo. Losratones CB17 SCID (n = 4 por grupo) fueron inyectados por vía subcutánea en el flanco derecho con células IMR5-mCherryFluc o SK-N-AS-mCherryFluc. Cuando el tamaño del tumor era de al menos 5 * 5 mm, los tumores se inyectaron con 50 pl de PBS (control de vehículo), 25 pl de PV-10 o 50 pl de PV-10. En la figura 7A, se midió el crecimiento tumoral de IMR5-mCherryFluc utilizando un calibrador Vernier. La flecha indica el día del tratamiento (día 6). Se muestra el tamaño medio del tumor y el error estándar de la media. Los asteriscos muestran diferencias significativas, prueba t de Student no pareada, p < 0.05. En la figura 7B, se midió el crecimiento tumoral de IMR5-mCherryFluc utilizando el sistema Xenogen IVIS® 200 para detectar la señal bioluminiscente después de la inyección intraperitoneal con D-luciferina. Se muestra el tamaño medio del tumor y el error estándar de la media. La figura 7C muestra una curva de supervivencia para ratones con tumores IMR5-mCherryFluc. Los asteriscos muestran diferencias significativas, prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox), p < 0.05. En la Fig. 7D, se midió el crecimiento tumoral de sk-n-as-mCherryFluc a lo largo del tiempo en días utilizando un calibrador Vernier. La flecha indica el día del tratamiento (día 14). Se muestra el tamaño medio del tumor y el error estándar de la media. En la Fig. 7E, se midió el crecimiento tumoral de SK-N-AS-mCherryFluc a cero, 12 y 15 días después del tratamiento utilizando el sistema Xenogen IVIS® 200 para detectar la señal bioluminiscente después de la inyección intraperitoneal con D-luciferina. Se muestra el tamaño medio del tumor y el error estándar de la media. La figura 7F muestra una curva de supervivencia para ratones con tumores SK-N-AS-mCherryFluc.
La Fig. 8 muestra un grupo de fotografías de ratón en cada grupo experimental descrito en la Fig. 7 donde la imagen bioluminiscente representa tumores de flanco activos en cada uno de los grupos experimentales (PBS Control, PV-10 25 pL y PV-1050 pE dosis) después del día 6, el día 12 y el día 17.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
La presente invención contempla un método de tratamiento de un tumor sólido pediátrico con una composición farmacéutica que contiene una cantidad efectiva inhibidora del tumor de un xanteno halogenado o sal farmacéuticamente aceptable del mismo que es Rosa de Bengala (RB, 4,5,6,7-tetracloro-2',4',5',7'-tetrayodofluoresceína disódica) en el tumor (intralesionalmente). La composición que contiene Rosa de Bengala se puede utilizar como único agente de tratamiento, pero en algunas realizaciones preferidas, RB se combina preferiblemente con otra modalidad antitumoral que es un medicamento sistémico contra el cáncer seleccionado a partir de una molécula pequeña (no proteica, menos de aproximadamente 1000 gramos/mol) o una molécula proteica tal como un anticuerpo o una enzima, radioterapia ionizante o la llamada terapia de anticuerpos de inhibición de puntos de control, tal como se define en las reivindicaciones. Como se muestra en este documento, varias de estas combinaciones han exhibido efectos tóxicos sinérgicos para los tumores pediátricos.
Xanteno halogenado
Un xanteno halogenado contemplado tal como el de la Rosa de Bengala (4,5,6,7-tetracloro-2',4',5',7'-tetrayodofluoresceína) que es de acuerdo con la invención, u otro xanteno halogenado, incluyendo la eritrosina B, la floxina B, 4,5,6,7-tetrabromo-2',4',5',7'-tetrayodofluoresceína, 2',4,5,6,7-pentacloro-4',5',7'-triyodofluoresceína, 4,4',5,6,7-pentacloro-2',5',7'-triyodofluoresceína, 2',4,5,6,7,7'-hexacloro-4',5'-diyodofluoresceína, 4,4',5,5',6,7-hexacloro-2',7'-diyodofluoresceína, 2',4,5,5',6,7-hexacloro-4',7'-diyodofluoresceína, 4,5,6,7-tetracloro-2',4',5'-triyodofluoresceína, 4,5,6,7-tetracloro-2',4',7'-triyodofluoresceína, 4,5,6,7-tetrabromo-2',4',5'-triyodofluoresceína, y 4,5,6,7-tetrabromo-2',4',7'-triyodofluoresceína (que no forman parte de la invención reivindicada) están presentes disueltas o dispersas en una composición farmacéutica apropiada.
Una forma preferida de acuerdo con la invención, la Rosa de Bengala disódica, tiene la siguiente fórmula estructural:
Ciertos detalles de esta realización preferida para una composición contemplada se describen en las patentes U.S. No. 5,998,597, No. 6,331,286, No. 6,493,570, y No. 8,974, 363.
El suministro del componente de xanteno halogenado de una composición contemplada es más favorable cuando la composición tiene un valor de pH cercano al pH fisiológico (es decir, aproximadamente pH 7), y especialmente cuando el valor de pH es mayor que aproximadamente 4, asegurando así que un xanteno halogenado permanezca en forma dibásica en la composición. Por lo tanto, en una realización preferida, el valor de pH de la composición es de aproximadamente 4 a aproximadamente 10, y más preferiblemente de 5 a aproximadamente 9, y más preferiblemente de pH 6 a aproximadamente pH 8.
Se prefiere un vehículo hidrofílico para el medicamento para maximizar la preferencia por la partición del componente halogenado de xanteno en el tejido. En consecuencia, en una realización preferida, el vehículo contiene un mínimo de componentes no hidrofílicos que podrían interferir con dicha partición.
En consecuencia, una formulación preferida de la composición contiene, en un vehículo hidrofílico, preferiblemente que contiene agua, un xanteno halogenado tal como el de la Rosa de Bengala (4,5,6,7-tetracloro-2',4',5',7'-tetrayodofluoresceína) que es de acuerdo con la invención, u otro xanteno halogenado, incluyendo la eritrosina B, la floxina B, 4,5,6,7-tetrabromo-2',4',5',7'-tetrayodofluoresceína, 2',4,5,6,7-pentacloro-4',5',7'-triyodofluoresceína, 4,4',5,6,7-pentacloro-2',5',7'-triyodofluoresceína, 2',4,5,6,7,7'-hexacloro-4',5'-diyodofluoresceína, 4,4',5,5',6,7-hexacloro-2',7'-diyodofluoresceína, 2',4,5,5',6,7 -hexacloro-4',7'-diyodofluoresceína, 4,5,6,7-tetracloro-2',4',5'-triyodofluoresceína, 4,5,6,7-tetracloro-2',4',7'-triyodofluoresceína, 4,5,6,7-tetrabromo-2',4',5'-triyodofluoresceína, y 4,5,6,7-tetrabromo-2',4',7'-triyodofluoresceína (que no forman parte de la invención reivindicada) en una composición farmacéutica apropiada.
Una forma preferida de acuerdo con la invención, la Rosa de Bengala disódica, tiene la siguiente fórmula:
Ciertos detalles de esta realización preferida para la composición farmacéutica se describen en las patentes U.S. No.
5,998,597, No. 6,331,286, No. 6,493,570, y No. 8,974, 363.
Una composición contemplada que contiene xanteno halogenado típicamente contiene el xanteno halogenado a una concentración de aproximadamente 0.1% (p/v) a aproximadamente 20% (p/v) en un medio acuoso. La composición farmacéutica que contiene xanteno halogenado incluye preferentemente un electrolito soluble en agua que comprende al menos un catión seleccionado del grupo que consiste en sodio, potasio, calcio y magnesio y al menos un anión seleccionado del grupo que consiste en cloruro, fosfato y nitrato, en el que el electrolito se encuentra en una concentración de entre aproximadamente el 0.1% (p/v) y aproximadamente el 2% (p/v).
Un tercer ingrediente es un electrolito soluble en agua seleccionado de cloruros de sodio, potasio, calcio y magnesio, fosfatos y nitratos, en el que el electrolito está presente en una concentración de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 2% en peso, o alternativamente a un nivel suficiente para proporcionar una osmolalidad de más de aproximadamente 100 mOsm/kg hasta aproximadamente 600 mOsm/kg. Preferiblemente, la osmolalidad de la composición del medicamento es superior a 250 mOsm/kg, y preferiblemente aproximadamente 300-500 mOsm/kg. El electrolito es preferiblemente cloruro de sodio. El electrolito está presente preferiblemente en una concentración de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 1.5%, y aún más preferiblemente a una concentración de aproximadamente 0.8 a aproximadamente 1.2%, y más preferiblemente a una concentración de aproximadamente 0.9% como está presente en la solución salina fisiológica.
El medio acuoso de la composición es preferiblemente solo agua que cumpla con los criterios para uso en inyección. Hasta aproximadamente el 20 por ciento en volumen del vehículo puede haber uno o más alcoholes monohídricos o polihídricos Ci-C6 tal como metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, sec-butanol, glicerol, etilenglicol, propilenglicol, 1,2-butanodiol, 2,3-butanodiol, eritritol, treitol, trimetilolpropano, sorbitol y similares. Más preferiblemente, un alcohol está presente en una composición contemplada a menos del 10 por ciento en volumen del vehículo, y más preferiblemente en menos del 5 por ciento en volumen.
Visto alternativamente, la presente divulgación utiliza un compuesto de la Fórmula 1, a continuación, en el que R1 es independientemente de alquilo F, Cl, Br, I, H o C1-C4 alkyl; R2, R3, R4, y R5 son independientemente Cl, H o I con al menos un sustituyente seleccionado de R2, R3, R4, R5 siendo I y al menos uno es Cl o H; y R6 es independientemente H o alquilo C1-C4; R11 es H o alquilo C1-C4; R12 es H o acilo C1-C7; y todas las formas tautoméricas; b) los atropisómeros, c) las formas cerradas de lactona representadas en la Fórmula 2 (a continuación), d) los enantiómeros de las formas de lactona representados en la Fórmula 2, y e) sus sales farmacéuticamente aceptables. Sólo la Rosa de Bengala o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma forma parte de la invención reivindicada.
El término "sal fisiológicamente aceptable" "sal farmacéuticamente aceptable" en sus diversas formas gramaticales se refiere a cualquier catión no tóxico tal como un metal alcalino, un metal alcalinotérreo y una sal de amonio comúnmente utilizados en la industria farmacéutica, incluidas las sales de sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, bario, amonio y protamina zinc, que pueden prepararse mediante métodos conocidos en la técnica. Un catión contemplado proporciona una sal de xanteno soluble en agua. Preferiblemente, las sales son sodio, potasio, calcio y amonio en forma de sal mono o dibásica. Se dirige al lector a Berge, J. Pharm. Sci. 197768(1):1-19 para obtener listas de ácidos y bases fisiológicamente (o farmacéuticamente) aceptables de uso común que forman sales fisiológicamente aceptables con compuestos farmacéuticos.
El valor de pH de la composición farmacéutica de xanteno halogenado puede ser regulado o ajustado por cualquier medio adecuado conocido por los expertos en la técnica. La composición se puede tamponar o ajustar el valor del pH mediante la adición de ácido o base o similares. Dado que los xantenos halogenados, o sus sales fisiológicamente aceptables, son ácidos débiles, dependiendo de la concentración de xanteno halogenado y/o de la concentración de electrolitos, el valor de pH de la composición puede no requerir el uso de un agente tampón y/o modificador del valor del pH. Sin embargo, es especialmente preferible que la composición esté libre de tampones, lo que permite que se ajuste al entorno biológico una vez administrada.
También es preferible que la composición farmacéutica no incluya conservantes, muchos de los cuales pueden interferir perjudicialmente con la composición farmacéutica o la formulación de la misma, o pueden hacer complejos o interactuar de otro modo con el componente activo de la composición de xanteno halogenado o interferir con ella. En la medida en que se utiliza un conservante, la imidurea es un conservante preferido, ya que no interactúa con los xantenos halogenados, ni en la composición farmacéutica ni en el momento de la administración.
Un método de tratamiento contemplado se utiliza en un mamífero que lo necesita. Un mamífero tratado puede ser un primate tal como un humano, un simio tal como un chimpancé o un gorila, un mono tal como un mono cynomolgus o un macaco, un animal de laboratorio tal como una rata, un ratón o un conejo, un animal de compañía tal como un perro, un gato, un caballo o un animal de consumo tal como una vaca o un buey, ovejas, corderos, cerdos, cabras, llamas o similares.
Cada composición contemplada se administra típicamente repetidamentein vivo a un mamíferoque la necesita hasta que el tumor canceroso sólido tratado disminuye en la medida deseada, de modo que no se puede detectar. Por lo tanto, la administración a un mamífero necesitado puede ocurrir una pluralidad de veces dentro de un día, diariamente, semanalmente, mensualmente o durante un período de varios meses a varios años, según lo indique el médico tratante.
Un compuesto de xanteno halogenado contemplado, cuando se inyecta directamente en un tumor, suele ser absorbido por los lisosomas de las células cancerosas y se acumula en ellos, e induce la muerte celular por apoptosis u otro mecanismo. Al causar la muerte de las células cancerosas, las células se desintegran o se ablacionan. Se cree que la ablación de fragmentos celulares estimula específicamente el sistema inmunológico del mamífero a los antígenos que se muestran en los fragmentos celulares ablacionados, de modo que los tumores distantes del sitio de la inyección intratumoral (intralesional) se reconocen y también mueren.
Como también se ha señalado anteriormente, una composición contemplada preferida de un xanteno halogenado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se denomina PV-10™. PV-10™ es una solución estéril al 10% de Rosa de Bengala (RB, 4,5,6,7-tetracloro-2',4',5',7'-tetrayodofluoresceína disódica) en solución salina al 0.9%.
Se administra al sujeto mamífero que lo necesita una cantidad eficaz inhibidora de tumores de un medicamento sistémico contra el cáncer que proporciona citotoxicidad sinérgica cuando se usa en combinación con el xanteno halogenado y se puede formular utilizando líquidos, geles, sólidos u otros formatos habituales. Por lo tanto, debe entenderse que un medicamento sistémico contra el cáncer puede administrarse por vía oral ilustrativamente como por composición en tabletas o líquidos, por inyección i.v., i.m., s.c., intraperitoneal, a través de radiación ionizante, o por cualquier otra forma que proporcione una cantidad efectiva del medicamento contra el cáncer al sujeto.
Medicación sistémica contra el cáncer
El medicamento sistémico contra el cáncer que es una molécula pequeña (no proteica, menos de aproximadamente 1000 gramos/mol) o una molécula proteica más grande, se administra al mamífero sujeto que va a ser tratado de tal manera que el medicamento se propaga por todo el cuerpo del sujeto en comparación con la administración localizada que ocurre con una administración intralesional de xanteno halogenado. De acuerdo con la invención, los medicamentos contra el cáncers de molécula pequeña incluyen doxorrubicina, etopósido, vincristina, cisplatino, irinotecán y citarabina que se utilizaron aquí, mientras que una molécula proteica ejemplar es la asparaginasa. De esos medicamentos, la doxorrubicina, el etopósido y la vincristina parecieron tener sinergia con el tratamiento con una dosis subletal de PV-10, y se prefieren.
Una dosificación eficaz útil de un medicamento sistémico contra el cáncer de molécula pequeña es la dosis establecida en la información de la etiqueta de un medicamento aprobado por la FDA, una agencia nacional o internacional. Por lo general, los esquemas de dosis de monoterapia se establecen mediante la determinación de la dosis máxima tolerada (MTD) en los ensayos clínicos en etapa inicial. A continuación, la MTD (o una variación cercana de la misma) se promulga a ensayos clínicos en etapas posteriores para evaluar la eficacia y una evaluación más detallada de la seguridad. Con frecuencia, estAs MTD se convierten en la dosis terapéutica establecida una vez finalizadas las pruebas clínicas. Sin embargo, debido a que el medicamento contra el cáncer sistémico de molécula pequeña se contempla para uso con PV-10, una MTD es la cantidad máxima que se utilizaría, y esa cantidad debe ajustarse a la baja siguiendo los procedimientos habituales.
En la Tabla A, a continuación, se proporcionan programaciones de dosificación ejemplares para una serie de medicamentos sistémicos contra el cáncer que pueden combinarse en la presente invención con terapia localizada con PV-10. Cabe señalar que varios de los medicamentos que se enumeran a continuación son "moléculas pequeñas" como se definieron anteriormente, mientras que otros son moléculas grandes y proteicas, tales como los anticuerpos. No obstante, se administran de forma sistémica.
Los medicamentos proteicos contra el cáncer que se indican a continuación inhiben típicamente una respuesta inflamatoria causada por quimioquinas tales como la familia del TNF y la familia de las interleucinas.
Tabla A
(continuación)
Debido a los efectos aditivos o sinérgicos, las terapias combinadas y el método de tratamiento de la presente invención generalmente permiten el uso del agente sistémico a un nivel igual o inferior a la programación de dosis típica para el agente sistémico, tal como los descritos en la Tabla A, cuando se usa con una terapia tópica local, tal como la que se describe a continuación. Sin embargo, las programaciones de dosificación proporcionados en la Tabla A proporcionan una guía útil para comenzar el tratamiento a partir de la cual las dosificaciones se pueden ajustar a cantidades disminuidas según lo considere apropiado el médico que atiende a un paciente determinado.
Tratamiento con radiaciones ionizantes
Los resultados reportados en este documento muestran que la combinación del tratamiento de PV-10 con radiación ionizante también mejoró la citotoxicidad del tratamiento en su conjunto. Para los estudiosin vitroen el presente documento, las células de neuroblastoma se pusieron en contacto primero con una dosis subletal de PV-10 durante un período de tiempo de cuatro horas y luego se irradiaron con dosis de 0.5, 1 o 2 Gray de radiación ionizante. Debe entenderse que este régimen de tratamiento fue ilustrativo y ha demostrado el concepto de esta combinación de tratamientos. Los trabajadores ordinarios pueden utilizar estos efectos y escalar el tratamiento en consecuencia. Inhibidores de anticuerpos de punto de control
Un régimen de tratamiento combinado adicional utiliza la administración de PV-10 y un inhibidor de anticuerpos de punto de control, que se puede considerar como un medicamento sistémico especial contra el cáncer. Un inhibidor útil de anticuerpos de punto de control es un anticuerpo monoclonal humanizado cuya administración permite que el sistema inmunitario reconozca las células cancerosas como extrañas y ayude a eliminar esas células cancerosas del cuerpo.
Algunos anticuerpos inhibidores de puntos de control se dirigen al receptor PD-1 (proteína de muerte celular programada 1) en la superficie de las células T o al ligando de ese receptor PD-L1. Ejemplos de estos monoclonales son el pembrolizumab y el nivolumab que inhiben PD-1. Dos anticuerpos que se dirigen a PD-L1 son atezolizumab, avelumab y durvalumab. Otro grupo de anticuerpos monoclonales inhibidores de puntos de control incluye ipilimumab tremelimumab que se dirige a CTLA-4, un receptor de proteína que subregula el sistema inmunitario.
Estos medicamentos contra el cáncer también se usan por lo general de forma sistémica. La MTD, tal como se describe en las etiquetas de los empaques de estos medicamentos, puede ser una dosificación inicial que típicamente se ajusta hacia abajo durante los ensayos, como se ha comentado anteriormente.
Dosificación
Un medicamento sistémico complementario PV-10 puede administrarse con la frecuencia que sea necesaria o tolerada por el sujeto receptor. Los medicamentos de moléculas pequeñas tíoicamente tienen vidas mediasin vivorelativamente cortas o de minutos a días. Por otro lado, los anticuerpos inhibidores de puntos de control suelen tener vidas mediasin vivode una a tres semanas.
Se entiende que la vida biológicain vivo de laRosa de Bengala es de unos pocos minutos en la rata. Sin embargo, debido a que se sabe que la administración intralesional de PV-10 induce una mejora inmunitaria de las células T, el efecto de una administración de PV-10 puede durar meses o más, a través de las células T de memoria.
Como consecuencia de las diversas vidas medias de los reactivos de composición, se prefiere tratar primero con PV-10 y luego con uno o más medicamentos combinados. El medicamento combinado se administra preferiblemente aproximadamente de 1 a aproximadamente 4 semanas después de la administración del PV-10 para que la activación inmune inducida pueda al menos comenzar.
El tratamiento previo con un medicamento sistémico contra el cáncer también puede ser útil. En este caso, el agente contra el cáncer sistémico puede iniciar la respuesta inmunitaria que se ve reforzada por el tratamiento posterior con PV-10. En este caso, también es preferible que el tiempo entre los dos primeros tratamientos sea de aproximadamente 1 a 4 semanas.
Los dos medicamentos también se pueden administrar aproximadamente al mismo tiempo, al mismo tiempo, de manera concurrente, lo que puede ocurrir simultáneamente con una semana de diferencia.
Resultados
PV-10 inhibe el crecimiento de líneas celulares tumorales sólidas pediátricas
El sarcoma de Ewing, el neuroblastoma, el osteosarcoma, el rabdomiosarcoma y las líneas celulares normales de fibroblastos y una muestra de médula ósea primaria normal se trataron con diferentes concentraciones de PV-10 (3.125-400 |<j>M) durante 96 horas y se midió la viabilidad celular con blue® de alamar (Figs. 1A-1E) para determinar los efectos de PV-10 en los tumores sólidos pediátricos. PV-10 disminuyó la viabilidad celular de una manera dependiente de la concentración en todas las líneas celulares probadas. Se calcularon los valores de IC<50>para todas las líneas celulares tumorales sólidas examinadas. En la Tabla 1 se muestran los valores de las líneas celulares tumorales sólidas pediátricas tratadas con PV-10 96 horas después del tratamiento. Como se observa, los valores oscilaron entre 45-108<j>M, con una media de 70<j>M.
Tabla 1
(continuación)
Por el contrario, los valores de IC<50>para las líneas celulares de fibroblastos normales y las muestras primarias de médula ósea fueron más altos y oscilaron de 73-143 j M, con una media de 104 j M (Tabla 2), a continuación. La Tabla 2 proporciona la mitad de los valores de concentración inhibitoria máxima (IC<50>) para líneas celulares de fibroblastos normales tratadas con PV-10 y una muestra primaria de médula ósea 96 horas después del tratamiento.
Tabla 2
PV-10 es citotóxico para las líneas celulares de neuroblastoma
Una vez identificado que PV-10 es citotóxico para las líneas celulares tumorales sólidas pediátricas, se centró en el neuroblastoma porque es el cáncer extracraneal más común en niños. Se investigó si PV-10 era citotóxico o citostático para las líneas celulares de neuroblastoma. Se eligieron cuatro líneas celulares diferentes para el estudio, tres líneas celulares de neuroblastoma [SK-N-AS, SK-N-BE(2) e IMR5] que tienen diferentes mutaciones y diferentes sensibilidades a PV-10 según los valores de IC<50>, y una línea celular de neuroepitelioma (SK-N-MC) que fue muy sensible a PV-10 según su valor de IC<50>.
Las células se trataron con PBS (control de vehículos), 50 j M o 100 j M PV-10 durante 96 horas y se observaron mediante microscopía óptica de contraste de fase (Fig. 2A). Las células tratadas con PBS crecieron hasta la confluencia. Las células tratadas con 50<j>M de PV-10 no crecieron hasta la confluencia, pero se observaron pocas células muertas.
Por el contrario, pocas células permanecieron adheridas a la placa después del tratamiento con 100 pM PV-10, lo que indica que 100 pM PV-10 fueron citotóxicas para todas las líneas celulares. Sin embargo, las diferentes líneas celulares parecían tener diferentes sensibilidades a PV-10, siendo las células SK-N-AS las más resistentes al tratamiento y las SK-N-MC las más sensibles al tratamiento.
Las líneas celulares de neuroblastoma muestran diferentes sensibilidades a PV-10
Las diferentes sensibilidades de las cuatro líneas celulares (SK-N-AS, SK-N-BE(2), IMR5 y SK-N-MC) a PV-10 se investigaron utilizando microscopía de vídeo de lapso de tiempo para cuantificar el porcentaje de células adheridas a la placa después de 12, 24, 36 y 48 horas de tratamiento con 100 pM PV-10. El número de células adheridas después del tratamiento se normalizó al número de células a las cero horas (Fig. 2B).
Las células SK-N-AS fueron más resistentes al tratamiento, a las 12 horas el 89 % y a las 48 horas el 41 % de las células estaban adheridas. Las células SK-N-MC fueron las más sensibles al tratamiento, a las 12 horas el 3.5% y a las 48 horas el 0% de las células estaban adheridas. Las células IMR5 fueron más sensibles al tratamiento a las 12 y 24 horas (16 y 7% de las células adheridas respectivamente) en comparación con las células SK-N-BE(2) (54 y 14% de las células adheridas respectivamente), pero a las 36 horas se ahirió un porcentaje similar de células para ambas líneas celulares (3% de las células SK-N-BE(2) y 2% de las células IMR5).
Estos datos mostraron que en los primeros momentos posteriores al tratamiento, las células SK-N-MC eran más sensibles al tratamiento, las IMR5 eran más sensibles al tratamiento que las células SK-N-BE(2) y que las células SK-N-AS eran más resistentes al tratamiento.
El tratamiento con PV-10 altera los lisosomas
Anteriormente, se había demostrado que PV-10 inducía la pérdida de la integridad de los lisosomas. Por lo tanto, las células SK-N-AS, SK-N-BE(2) e IMR5 se trataron con PBS (control de vehículos) o 100 pM PV-10 durante 16 horas. Las células vivas se tiñeron con la tinción de ácido nucleico Hoechst 33342 y LysoTracker® Green DND-26 que se concentra y emite fluorescencia en orgánulos ácidos, y las células se observaron mediante microscopía de fluorescencia (Fig. 3).
En las células tratadas con PBS y en las células tratadas con SK-N-AS PV-10, los lisosomas eran visibles como focos específicos. Sin embargo, en las células SK-N-BE(2) e IMR5 tratadas con PV-10, esos focos ya no eran visibles.
El tratamiento con PV-10 aumenta el porcentaje de células IMR5 en la fase G1 del ciclo celular
Se analizó el efecto de PV-10 sobre el ciclo celular mediante citometría de flujo (Fig. 4A) para determinar adicionalmente la modulación diana de PV-10. Las líneas celulares de neuroblastoma más resistentes (SK-N-AS) y más sensibles (IMR5) se trataron con PBS (control de vehículo), 50 o 100 pM PV-10 durante 16 o 24 horas.
PV-10 no tuvo ningún efecto sobre el ciclo celular de las células SK-N-AS. Por el contrario, 100 pM PV-10 aumentaron el porcentaje de células IMR5 en la fase G1. A las 16 horas, el porcentaje de células IMR5 en la fase G1 después del tratamiento con 100 pM de PV-10 aumentó en un 28% en comparación con las células tratadas con PBS. Del mismo modo, a las 24 horas, hubo un aumento del 30% en las células en la fase G1 después del tratamiento con 100 pM PV-10, en comparación con las células no tratadas.
El tratamiento con PV-10 induce la apoptosis
A continuación, se realizó un análisis de transferencia Western para investigar si las células tratadas con PV-10 estaban sufriendo apoptosis. Las células SK-N-AS, SK-N-BE(2), IMR5 y SK-N-MC se trataron con PBS (control de vehículos), 75 o 100 pM PV-10 durante 24 horas. Los extractos de células totales se analizaron mediante transferencia Western para detectar niveles de poli-ADP ribosa total y escindida (PARP), caspasa 3 total y escindida, caspasa 7 total y escindida y actina (control de carga) (Fig. 4B).
El tratamiento con PV-10 mostró una escisión de PARP dependiente de la concentración. El tratamiento con 100 pM de PV-10 indujo la escisión de PARP en todas las líneas celulares, con niveles más bajos de proteína total y PARP total en células SK-N-MC (la línea celular más sensible a PV-10). Las células SK-N-AS y SK-N-BE(2) tratadas con 75 pM PV-10 mostraron menos escisión de PARP que las células tratadas con 100 pM PV-10, mientras que las células IMR5 tuvieron niveles similares de escisión de PARP cuando se trataron con 75 y 100 pM PV-10. En las células SK-N-MC tratadas con 75 pM de PV-10 se observó una mayor presencia de PARP total en comparación con las células tratadas con 100 pM.
La activación de las caspasas 3, 7 y 9 dependió de la concentración de PV-10 y de la línea celular. La caspasa 3 escindida estaba presente en las células IMR5 tratadas con 100 pM PV-10. Los niveles de caspasa 7 total fueron menores en las células SK-N-BE(2).
Las células IMR5 y SK-N-MC se trataron con PV-10 de 75 y 100 pM y se detectó caspasa 7 escindida en células SK-N-AS y SK-N-BE(2) tratadas con 100 pM de PV-10 y en células |Mr 5 tratadas con PV-10 de 75 y 100 pM. Los niveles de caspasa 9 total fueron más bajos en las células SK-N-BE(2) tratadas con PV-10 de 75 y 100 pM y se detectó caspasa 9 escindida en las células IMR5 tratadas con PV-10 de 75 y 100 pM. Estos datos indicaron que PV-10 estaba induciendo la muerte celular por apoptosis.
PV-10 es sinérgico con diferentes agentes contra el cáncers
Para determinar qué medicamentos sistémicos contra el cáncer de molécula pequeña de uso común podrían combinarse con PV-10 para mejorar la citotoxicidad, las líneas celulares de neuroblastoma SK-N-AS, SK-N-BE(2) e IMR5, la línea celular de neuroepitelioma SK-N-MC y la línea celular de fibroblastos normales BJ se examinaron primero con un panel de siete agentes quimioterapéuticos convencionales, con diferentes mecanismos de acción (Fig. 5). Todos los fármacos se examinaron a 0.1 pM, solos y en combinación con una concentración subcitotóxica de 50 pM PV-10. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de blue® de alamar, 96 horas después del tratamiento.
Sobre la base de estos resultados, se seleccionaron los agentes que mostraron el mayor aumento en la citotoxicidad cuando se combinaron, y que tuvieron un efecto menor en las células BJ, para estudios adicionales a fin de determinar los índices de combinación (CI) y la sinergia [18]. Los agentes evaluados para los estudios de CI en células SK-N-AS, SK-N-BE(2), IMR5 y SK-N-M<c>fueron doxorrubicina, etopósido y vincristina.
En la Tabla 3, a continuación, se proporcionan índices combinados para las líneas celulares de neuroblastoma (SK-N-AS, SK-N-BE(2) e IMR5) y la línea celular de neuroepitelioma SK-N-MC tratadas con doxorrubicina, etopósido o vincristina, ya sea sola o en combinación con 50 pM PV-10 durante 96 horas.
Tabla 3
Todos los agentes demostraron sinergia con 50 pM PV-10 en cada una de las líneas celulares analizadas. Como se observa, los valores de CI oscilaron entre 0.42-0.77 para la doxorrubicina, 0.17-0.66 para el etopósido y 0.1-0.43 para la vincristina.
PV-10 induce radiosensibilidad en líneas celulares de neuroblastoma
Además de las quimioterapias de uso común, se investigó si la PV-10 mejoró el efecto del tratamiento con radiación ionizante (IR) en células SK-N-AS (Figura 6A) e IMR5 (Fig. 6B). Las células se pretrataron durante 4 horas con PBS (control de vehículos) o 50 pM PV-10 y luego se irradiaron con 0.5, 1 o 2 Gray (Gy). La viabilidad celular se midió con blue® de alamar 96 horas después del tratamiento inicial.
El pretratamiento con PV-10 de 50 pM mejoró el efecto de la IR tanto en las células SK-N-AS como en IMR5. En el caso de las células SK-N-AS, la viabilidad celular disminuyó en un 54.8%, 58.7% y 60% cuando las células se trataron previamente con PV-10 durante 4 horas antes de la irradiación con 0.5 Gy, 1 Gy o 2 Gy, respectivamente. En el caso de las células IMR5, la viabilidad celular disminuyó en un 24%, 21% y 13% cuando las células se pretrataron con PV-10 durante 4 horas antes de la irradiación con 0.5 Gy, 1 Gy o 2 Gy, respectivamente.
PV-10 induce la regresión tumoralin vivo
Para determinar si PV-10 también es activoin vivo,caracterizamos el efecto de la inyección intratumoral de PV-10 en tumores subcutáneos SK-N-AS e IMR en ratones CB17 SCID. Los tumores se inyectaron una vez con 25 o 50 pl de PV-10 [8] y se monitorizaron diariamente.
Los tumores IMR5 fueron muy sensibles al tratamiento con PV-10 (Fig. 7A y 7B). Para los tumores de control, el tamaño del tumor aumentó de 25.6 mm2 seis días después del tratamiento a 172.9 mm223 días después del tratamiento. En comparación, los tumores tratados con 25 pl de PV-10 aumentaron de 26.6 mm2 a 41.2 mm2 y los tumores tratados con 50 pl de PV-10 aumentaron de 27.9 mm2 a 47.3 mm2. El crecimiento tumoral también se cuantificó utilizando un sistema Xenogen IVIS® 200 que midió la señal bioluminiscente emitida por los tumores, después de la inyección intraperitoneal de D-Luciferina.
El tamaño del tumor disminuyó después del tratamiento con 25 y 50 |jl de PV-10 y permaneció bajo 17 días después del tratamiento. El tratamiento con PV-10 también aumentó la supervivencia, de forma dependiente de la dosis (Fig. 7C).
Los ratones tratados con control tuvieron una mediana de supervivencia de 25.5 días, mientras que los ratones tratados con 25 j l de PV-10 sobrevivieron una mediana de 41.5 días y los ratones tratados con 50 j l de PV-10 sobrevivieron una mediana de 76 días. Además, dos de los ratones tratados con 50 j l de PV-10 se sometieron a una regresión tumoral completa y permanecieron libres de tumor durante 120 días después del tratamiento.
Los tumores SK-N-AS también respondieron al tratamiento con PV-10 (Fig. 7D y 7E). Para los tumores de control, el tamaño del tumor aumentó de 28.9 mm<2>seis días después del tratamiento a 179.3 mm<2>18 días después del tratamiento. En comparación, los tumores tratados con 25 j l de PV-10 aumentaron de 25.3 mm<2>a 92.1 mm<2>y los tumores tratados con 50 j l de PV-10 aumentaron de 29.3 mm<2>a 57.5 mm<2>. Cuando se midió con el sistema Xenogen IVIS® 200, el tamaño del tumor disminuyó después del tratamiento con 25 y 50 j l PV-10 y se mantuvo por debajo de los tumores tratados con control 15 días después del tratamiento.
El tratamiento con PV-10 también aumentó la supervivencia (Fig. 7F). Los ratones tratados con control tuvieron una mediana de supervivencia de 29 días, mientras que los ratones tratados con 25 j l de PV-10 sobrevivieron una mediana de 37 días y los ratones tratados con 50 j l de PV-10 sobrevivieron una mediana de 36 días. Además, un ratón tratado con 50 j l PV-10 se sometió a una regresión tumoral completa y permaneció libre de tumor durante 80 días después del tratamiento.
Discusión
La tasa de supervivencia general de los niños con tumores sólidos pediátricos es más baja que la de los niños con neoplasias malignas hematológicas [1]. Para los niños con sarcoma de Ewing en recaída o metastásico, neuroblastoma, osteosarcoma y rabdomiosarcoma, la tasa de supervivencia global es inferior al 30% [1].
De estos cánceres, el neuroblastoma es el más común y es una de las principales causas de muerte en niños de 1 a 4 años de edad. Dadas las bajas tasas de supervivencia de los pacientes con tumores sólidos pediátricos y las morbilidades relacionadas con los regímenes de tratamiento intensivo administrados a los pacientes de alto riesgo y en recaída, existe una necesidad urgente de desarrollar novedosos enfoques terapéuticos y ensayos clínicos en fase temprana para pacientes con estos cánceres.
PV-10 es una solución estéril al 10% de Rosa de Bengala (RB, 4,5,6,7-tetracloro-2',4',5',7'-tetrayodofluoresceína disódica) en solución salina al 0.9%, que induce la muerte celular en una variedad de cánceres en adultos, pero no se ha examinado previamente para uso en cánceres pediátricos [7-11]. Dado que el PV-10 induce la muerte celular en diferentes cánceres del adulto y se ha evaluado en varios ensayos clínicos [10, 12, 14, 15, 16], se investigaron los efectos del PV-10 en diferentes líneas celulares tumorales sólidas pediátricas (sarcoma de Ewing, neuroblastoma, osteosarcoma y rabdomiosarcoma).
PV-10 disminuyó la viabilidad celular en líneas celulares tumorales sólidas pediátricas de una manera dependiente de la concentración. Como era de esperar, las líneas celulares de fibroblastos normales y una muestra primaria de médula ósea fueron menos sensibles a PV-10. Estos datos son similares a los datos publicados anteriormente sobre cánceres en adultos [7, 9, 11] e indican que el PV-10 podría ser un tratamiento eficaz para múltiples tumores sólidos pediátricos.
Para caracterizar la modulación diana de PV-10, estos estudios se centraron en el neuroblastoma, la más común de las neoplasias malignas sólidas extracraneales que se encuentran en niños, y el neuroepitelioma estrechamente relacionado. Mediante microscopía de contraste de fase, se encontró que PV-10 era citotóxico para las células de neuroblastoma y, de acuerdo con los valores de IC<50>, las células SK-N-AS se identificaron como las más resistentes y las SK-N-MC más sensibles al tratamiento con PV-10. Estos hallazgos se verificaron mediante microscopía de vídeo de lapso de tiempo que mostró nuevamente que las células SK-N-AS eran más resistentes al tratamiento y las SK-N-MC eran más sensibles.
Además, se encontró que las células IMR5 eran más sensibles al tratamiento que las células SK-N-BE(2) a las 12 y 24 horas, aunque a las 36 horas quedaban pocas células de ambos tipos. A pesar de las diferencias en la sensibilidad a 100 jM de PV-10 en los primeros momentos, esta concentración seguía siendo citotóxica para la mayoría de las células SK-N-AS a las 96 horas y el aumento de la dosis a 200 jM aumentó aún más la muerte celular SK-N-AS. Estos datos sugieren que PV-10 podría ser un tratamiento eficaz para todos los neuroblastomas, aunque es posible que las dosis deban ser más altas para algunos subtipos.
Es probable que las diferentes sensibilidades a PV-10 se deban a los diferentes antecedentes genéticos de las líneas celulares, así como a las diferentes historias de los tumores (diferentes tratamientos de pacientes y primarios frente a recidivantes) de los que se aislaron las líneas celulares. El neuroblastoma es una enfermedad genéticamente heterogénea y las diferentes líneas celulares se eligieron para reflejar esa heterogeneidad.
Los impulsores oncogénicos más comunes en el neuroblastoma son la amplificación de MYCN que se observa en aproximadamente 25 % de los pacientes, la mutación y amplificación de la quinasa del linfoma anaplásico (ALK) que se observa en aproximadamente 10-15%de los pacientes y las mutaciones en TP53 adquiridas en el momento de la recaída [2]. Utilizando el Proyecto de Líneas Celulares del Catálogo de Mutaciones Somáticas en el Cáncer (COSMIC) [20], se determinó que: las células SK-N-AS tenían mutaciones en NRAS y FLT3; un clon de SK-N-BE(2) tenía sobreexpresadas ALK, AKT y MYCN junto con una mutación homocigota de TP53; Las células IMR5 exhibieron sobreexpresión de AKT y MYCN con una mutación homocigota de mTOR; y un clon de SK-N-MC exhiobiado sobre la expresión de MYCN y una mutación heterocigota de TP53. Además, las líneas celulares SK-N-AS, SK-N-BE(2) y SK-N-MC se derivaron de tumores metastásicos con diferentes historias de tratamiento, mientras que la línea celular IMR5 se derivó de un tumor primario.
Se ha demostrado previamente que PV-10 actúa interrumpiendo los lisosomas, lo que conduce a la muerte celular [6]. La alteración de los lisosomas afecta específicamente a la supervivencia de las células cancerosas porque las células cancerosas tienen un metabolismo alterado y y pueden depender de los lisosomas para el reciclaje de nutrientes y la eliminación de los productos del rápido crecimiento y división, tales como las proteínas agregadas y los orgánulos dañados [21]. Además, la disrupción de los lisosomas libera catepsinas proteasas que pueden conducir a la inducción de necrosis o apoptosis [21].
Para investigar el efecto de PV-10 en los lisosomas en el neuroblastoma, se observaron células teñidas con LysoTracker® Green DND-26, que se concentra y emite fluorescencia en orgánulos ácidos. De manera similar a los resultados anteriores, se encontró que los lisosomas aparecen como focos distintos en las células tratadas con PBS, pero estaban ausentes en las células SK-N-BE(2) e IMR5 tratadas con PV-10. Curiosamente, en las células SK-N-AS más resistentes, los lisosomas no se interrumpieron y aparecieron como focos distintos incluso después del tratamiento.
El tratamiento con 100 pM de PV-10 indujo la detención del ciclo celular de la fase G1 en las células IMR5, pero no en las células SK-N-AS, e indujo la apoptosis de una manera dependiente de la dosis y de la línea celular. Se ha demostrado previamente que en los cánceres adultos, PV-10 induce la muerte celular por apoptosis o necrosis [7, 9, 11, 14]. En el estudio en el que se encontró que las células morían por necrosis, PV-10 indujo una detención del ciclo celular G2/M antes de la muerte celular [7], lo que sugiere que PV-10 puede tener diferentes mecanismos de acción en líneas celulares de diferentes tipos de cáncer.
Aunque el tratamiento con PV-10 en monoterapia ha demostrado eficacia en ensayos clínicos y estudios preclínicos con tumores adultos, los pacientes con neuroblastoma de riesgo alto se tratan con múltiples quimioterapias y radiación después de la recaída [2]. Por lo tanto, se investigó el uso potencial de PV-10 en regímenes de tratamiento combinados con agentes quimioterapéuticos de uso común.
Después de los cribados iniciales, se encontró que una dosis subcitotóxica de PV-10 (50 pM) era sinérgica con doxorrubicina, etopósido y vincristina en todas las líneas celulares estudiadas. Además, el pretratamiento con PV-10 antes de la irradiación mejoró la eficacia del tratamiento con radiación para las células SK-N-AS e IMR5. Estos datos son consistentes con datos previos donde, en un ensayo clínico de fase II, el pretratamiento de pacientes con melanoma con PV-10 seguido de radioterapia, indujo una regresión tumoral sin un gran aumento de la citotoxicidad [13]. Estos resultados indican que PV-10 puede combinarse eficazmente con diferentes tratamientos de uso común, para beneficiar a los pacientes de alto riesgo con neuroblastoma recidivante.
Una vez identificado que PV-10 era citotóxico para líneas celulares tumorales sólidas pediátricasin vitro,se examinó la actividad de PV-10in vivomediante xenoinjertos de neuroblastoma subcutáneo en ratones. Se encontró que las dosis farmacológicamente relevantes [12, 13, 16] de PV-10 indujeron la regresión tumoral y aumentaron la supervivencia de una manera dependiente de la dosis y del tumor. La inyección intralesional de 25 y 50 pl de PV-10 indujo una regresión tumoral temprana, con 50 pl de PV-10 aumentando la supervivencia general en ratones con tumores SK-N-AS o IMR5. Estos datos son similares a los de estudios previos con modelos animales, donde la inyección intratumoral de PV-10 indujo la regresión de tumores de colon singénicos subcutáneos [7], tumores de mama subcutáneos singénicos y melanoma [14, 8].
En resumen, los estudios en curso proporcionan datos preclínicos de prueba de concepto sobre la eficacia de PV-10 en el tratamiento exitoso de tumores sólidos pediátricos (sarcoma de Ewing, neuroblastoma, osteosarcoma y rabdomiosarcoma). Al centrarse en el neuroblastoma, se encuentra que PV-10 actúa interrumpiendo los lisosomas, deteniendo las células en la fase G1 del ciclo celular e induciendo la apoptosis. Se han identificado varios tratamientos de uso común con los que PV-10 muestra actividad sinérgica. Además, la eficacia de los tratamientos con PV-10in vivose ha validado mediante estudios en ratones con xenoinjertos de neuroblastoma.
Los hallazgos llevados a cabo en líneas celulares representativas y en ratones inmunocomprometidosin vivoproporcionan evidencia del potencial citotóxico directo, así como de los mecanismos por los cuales este agente puede inducir efectos moduladores de diana en las células cancerosas. También se han identificado agentes que pueden combinarse para generar sinergias terapéuticas, proporcionando el mar
fase temprana. Esto se suma al efecto inmunoestimulante esperado descrito anteriormente, lo que respalda un posible enfoque en el que se puede combinar un régimen de columna vertebral de PV-10 con agentes como los inhibidores de puntos de control inmunitario para mejorar adicionalmente su actividad en pacientes con tumores sólidos pediátricos en recaída o refractarios.
Materiales y métodos
Líneas celulares y cultivo de tejidos
Las líneas celulares (SK-N-AS, SK-N-BE(2), IMR5, LAN1, SK-N-MC, SK-N-SH, SHEP, BJ, BJ hTERT, WI38, WI38 hTERT, Hs68 hTERT, RD, RH30, 143B, HOS, SK-ES y SK-PN-DW) se cultivaron en el Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) (Gibco, ON, Canadá) suplementado con suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor al 5% (v/v) (Gibco), 100 unidades/ml de penicilina y 100 unidades/ml de estreptomicina (Gibco). Los cultivos celulares se mantuvieron a 37°C en una incubadora humidificada con 5% de CO<2>. La muestra primaria de médula ósea se obtuvo después de la aprobación de la Junta de Ética en Investigación (REB) local y del consentimiento informado por escrito (ID de ética #17184). Los linfocitos se aislaron de la muestra de médula ósea mediante centrifugación en gradiente de densidad utilizando Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare Life Sciences, ON, Canadá), como se describió anteriormente [17].
Materiales y reactivos
PV-10 (solución al 10% de rosa de bengala disódica en solución salina al 0.9%) fue suministrada por Provectus Biopharmaceuticals Inc. (Knoxville, TN, EE.UU.) y almacenada en la oscuridad a temperatura ambiente. Las soluciones madre de doxorrubicina, etopósido, vincristina, cisplatino, pegasparaginasa, irinotecán y citarabina se obtuvieron de la farmacia del Hospital Infantil de Alberta (Calgary, AB, Canadá) y se almacenaron a temperatura ambiente en la oscuridad. Para estudios posteriores, los fármacos se diluyeron en DMEM más suplementos a las concentraciones adecuadas.
Ensayos de citotoxicidad
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Greiner Bio-One, NC, EE.UU.) a 5*10<3>por pocillo en 100 pl de DMEM y se cultivaron durante 24 horas. PV-10 solo o solución salina tamponada con fosfato (PBS; NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na<2>HPO<4>10 mM, KH<2>PO<4>1.8 mM, pH 7.25) (control del vehículo) se diluyó en DMEM y se añadió un tratamiento de 100 pl a cada pocillo. Todos los tratamientos se realizaron por triplicado a concentraciones finales que oscilaron entre 3.125 y 400 pM.
Las placas se cultivaron durante 96 horas. Los pocillos se lavaron dos veces con PBS, se añadieron 200 pl de DMEM fresco a cada pocillo y se evaluó la viabilidad celular mediante el ensayo de citotoxicidad blue® de alamar (Invitrogen, ON, Canadá) según las instrucciones del fabricante. La mitad de las concentraciones inhibitorias máximas (IC<50>) se determinaron utilizando el software CompuSyn (ComboSyn Inc.).
Microscopía óptica
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos (Corning Inc., NY, EE.UU.) a 2*10<5>por pocillo y se cultivaron durante 24 horas. Las células se trataron con PBS (control de vehículos) o PV-10 y se cultivaron durante 96 horas. Las imágenes de contraste de fase se capturaron con un microscopio Zeiss Axiovert 200M con una cámara Zeiss AxioCam MRm Rev.3 FireWire utilizando el software Zeiss AxioVision Se64. Las imágenes se procesaron con Adobe Photoshop (Adobe Creative Cloud 2017).
Microscopía de vídeo en lapso de tiempo
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Greiner Bio-One) a 5*10<3>por pocillo y se cultivaron durante 24 horas. Las células fueron tratadas con PBS (control de vehículos) o PV-10. Se capturaron tres imágenes por pocillo cada 30 minutos durante 48 horas utilizando un microscopio IncuCyte® Zoom y el software IncuCyte® Zoom (Essen BioScience, MI, EE. UU.) ubicados en una incubadora humidificada con 5% de CO<2>a 37 °C. El número de células en cada pocillo se contó utilizando el software Imaged y se normalizó al número de células a las cero horas. Se contaron al menos 350 células por tratamiento y por experimento.
Detección de lisosoma y microscopía de fluorescencia
Las células se sembraron en cubreobjetos estériles en placas de 6 pocillos (Corning) a 2*10<5>/poc¡No para las células no tratadas y 6x10<5>/pocillo para las células tratadas en placas de 6 pocillos (Corning) y se cultivaron durante 24 horas. Las células se trataron con PBS (control de vehículos) o PV-10 durante 16 horas. Los pocillos se lavaron dos veces con PBS y se añadieron 2 ml de DMEM que contenía 2.5 ug/ml de tinción Hoechst 33342 (Invitrogen) a cada pocillo. Las células se incubaron a 37 °C durante diez minutos y luego se agregó Lysotracker® Green DND-26 (Invitrogen) al medio a una concentración final de 500 nM. Las células se incubaron a 37 °C durante 15 minutos, los cubreobjetos se montaron en portaobjetos de vidrio en el momento de la obtención de imágenes y las imágenes se capturaron en un microscopio Zeiss Axiovert 200M con una cámara Zeiss AxioCam MRm Rev.3 FireWire utilizando el software Zeiss AxioVision Se64. Las imágenes se procesaron con Adobe Photoshop (Adobe Creative Cloud 2018).
Citometría de flujo
Para analizar las alteraciones del ciclo celular, las células se sembraron en placas de 100 mm (Corning), de modo que se pudiera recolectar un mínimo de 2*10<6>células después del tratamiento. Las células se cultivaron durante 24 horas, se trataron con PBS (control de vehículos) o PV-10 y se cultivaron durante 16 o 24 horas. Las células se recolectaron por tripsinización, se lavaron con PBS, se filtraron a través de un filtro de células de nailon de 40 |jm (Falcon, Corning, NY, EE. UU.), se contaron mediante tinción con azul de tripano con un hemocitómetro, se resuspendieron en NaCl estéril al 0.9% (p/v) y se fijaron en etanol helado al 90% (v/v). Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se almacenaron a -20 °C.
Para el análisis, las muestras se centrifugaron a 1400 rpm durante cinco minutos a 4 °C y se lavaron dos veces con PBS helado. A continuación, las células se incubaron a 37 °C durante 20 minutos en tampón de marcado de 300 jl: 10 jg/m l DAPI (Sigma, ON, Canadá), 200 ug/ml de RNasa A (Sigma) en Triton X-100 al 0.1% en PBS. Las muestras se analizaron en un citómetro BD Bioscience LSR II utilizando el software Diva 6.1.3 (BD Bioscience). Los resultados se analizaron con el software ModFitLT™ 3.3 (Verity Software House).
Preparación de extractos celulares
Las células se sembraron a 1*10<®>en placas de 100 mm (Corning) y se cultivaron durante 24 horas. A continuación, las células se trataron con PBS (control de vehículos) o PV-10 y se cultivaron durante 24 horas. El medio se recolectó de cultivos celulares, las células se lavaron con PBS y se recolectaron después de la tripsinización. Las células se lavaron en PBS helado y se centrifugaron a 1200 rpm a 4 °C durante cinco minutos. Se retiró el sobrenadante y el gránulo se resuspendió en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) (50 mM de Tris-HCl (pH 8), 150 mM de NaCl, 1% (v/v) de NP-40, 0.5% (p/v) de desoxicolato de sodio, 0.1% (p/v) de dodecil sulfato de sodio (SDS)) suplementado con un inhibidor de la fosfatasa al 1% (v/v) (Sigma) y un inhibidor de la proteasa al 1% (v/v) (Sigma). Las muestras se transfirieron a tubos de 1.5 ml, se incubaron en hielo durante diez minutos, se sometieron a vórtex y se centrifugaron a 12,000 rpm durante diez minutos. Los sobrenadantes se recolectaron como lisados de células enteras y se usaron inmediatamente o se almacenaron a -20 °C.
Transferencia Western
La transferencia Western se llevó a cabo como se describió anteriormente [17]. En resumen, las proteínas se transfirieron a la membrana de nitrocelulosa utilizando un sistema de transferencia turbo Trans-Blot® (BioRad, QC, Canadá), la transferencia se confirmó mediante tinción Ponceau S (0.1% (p/v) en ácido acético al 5% (v/v)) y las membranas se bloquearon en leche desnatada al 5% en solución salina tamponada con Tween-20® al 0.1% (v/v) (TBS-T; 50 mM de Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM de NaCl,™ 0.1% (v/v) Tween-20®) a temperatura ambiente durante dos horas. A continuación, las membranas se incubaron durante la noche (aproximadamente 18 horas) a 4 °C con los siguientes anticuerpos primarios diluidos en leche descremada al 5% (p/v) en TBS-T: Anti-PARP (1:3000, Cell Signaling, 9542S), anti-caspasa 3 (1:500, Cell Signaling, 9662S), anti-caspasa 7 (1:1000, Cell signaling, 9492S), anticaspasa 9 (1:1000, Cell Signaling, 9502S) y anti-p-actina (1:5000, Cell Signaling, 8457L). Las membranas se lavaron tres veces con TBS-T, se incubaron con un anticuerpo secundario anti-conejo (1:3000, Cell signaling, 7074S), se lavaron tres veces con TBS-T, se incubaron con el reactivo Western Lightning Plus-ECL (Perkin-Elmer, MA, EE. UU.) durante dos minutos y se desarrollaron utilizando la configuración de quimioluminiscencia en un sistema de imágenes ChemiDoc MP (BioRad).
Cribados combinados
Las células se cultivaron como se describe para ensayos de citotoxicidad. Los fármacos de prueba (doxorrubicina, etopósido, vincristina, cisplatino, pegasparaginasa, irinotecán, citarabina) se prepararon a una concentración final de 0.1 jM en medios que contenían PBS (control del vehículo) o PV10 (50 jM final). Los tratamientos se añadieron a las células por triplicado. Las placas se cultivaron, lavaron y analizaron la viabilidad celular mediante blue® de alamar, como se describe para los ensayos de citotoxicidad.
Estudios de combinación
Las células se cultivaron como se describe para ensayos de citotoxicidad. Se preparó una serie de dilución de tres fármacos de prueba (doxorrubicina, etopósido, vincristina) en DMEM que contenía PBS (control de vehículos) o PV10 (50 jM final) y se añadió a las células por triplicado. Las placas se cultivaron, lavaron y analizaron la viabilidad celular mediante blue® de alamar, como se describe para los ensayos de citotoxicidad. Los índices de combinación (CI) para IC<50>del fármaco de prueba en combinación con 50 jM PV-10 se calcularon utilizando el software CompuSyn (ComboSyn Inc.). Los valores de CI se puntuaron de acuerdo con los siguientes criterios: CI<1 indicó actividad sinérgica, CI=1 indicó actividad aditiva y CI >1 indicó actividad sinérgica [18].
Ensayos de radiosensibilidad
Las células se sembraron a 5*10<4>en placas de 60 mm (Corning) y se incubaron durante 24 horas y se trataron con PBS (control de vehículos) o 50 jM PV-10 y se incubaron a 37 °C durante cuatro horas. Las células se irradiaron con 0.5, 1 o 2 Gray (Gy) utilizando un Gammacell® 1000 Elite (MDS Nordion, ON, Canadá) y se cultivaron durante 92 horas. Los tratamientos se realizaron por triplicado. Las placas se lavaron dos veces con PBS y la viabilidad celular se analizó con blue® de alamar, como se describe para los ensayos de citotoxicidad.
Modelos de xenoinjertoin vivo
Todoslos procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense sobre el Cuidado de los Animales y las directrices de los NIH sobre el cuidado y uso de animales de laboratorio. Todos los protocolos fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Calgary (número de aprobación del protocolo: AC16-0243).
En los estudios con animales se utilizaron células IMR5-mCherryFluc y SK-N-AS-mCherryFluc. Estas líneas celulares expresaron de manera estable luciferasa de luciferasa de luciérnaga mejorada y mCherry en un vector lentiviral autoinactivador que codifica la región interna U3 del virus de células madre murinas (mscv), luciferasa de luciérnaga mejorada (effLuc), el elemento del sitio de entrada ribosómico interno (IRES) del virus de la encefalomiocarditis (emcv) y mCherry.
Ratones hembra CB17 SCID de seis a ocho semanas de edad (Charles River Laboratories, QC, Canadá) fueron inyectados subcutáneamente en el flanco derecho con 2.5*10® células (SK-N-ASmCherryFluc o IMR5mCherryFluc) suspendidas en 0.1 ml de matriz Matrigel® (Fischer Scientific, ON, Canadá) (Día cero). Siete días después de la inyección tumoral, los animales con crecimiento tumoral detectable de al menos 5 * 5 mm se asignaron al azar a grupos de tratamiento. Los grupos fueron tratados con 50 pl de PBS (control de vehículos), 50 pl de PV-10 o 25 pl de PV-10 mediante inyección intratumoral (intralesional), de acuerdo con un protocolo previamente establecido [8]. Los animales fueron monitorizados diariamente y las áreas tumorales fueron determinadas con un calibrador Vernier. Cuando los tumores alcanzaron el punto final definido de 15 x 15 mm, los ratones fueron sacrificados. Los animales que permanecieron libres de tumores se mantuvieron durante 120 días después del tratamiento.
El crecimiento tumoral también se monitorizó mediante el sistema Xenogen IVIS® 200 (Xenogen Corporation, CA, EE. UU.). Se tomaron imágenes de ratones para documentar la señal bioluminiscente emitida por los tumores, después de la inyección intraperitoneal de D-Luciferina (Gold Biotechnology, MO, EE. UU.). Los datos se analizaron mediante la determinación de la emisión total de flujo de fotones (fotones/s) en la región de interés, según los métodos establecidos [19].
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13. Foote M, Read T, Thomas J, Wagels M, Burmeister B, Smithers BM. Results of a phase II, open-label, noncomparative study of intralesional PV-10 followed by radiotherapy for the treatment of in-transit or metastatic melanoma. Journal of surgical oncology. 2017;115(7):891-7. doi:10.1002/jso.24580.
14. Liu H, Innamarato PP, Kodumudi K, Weber A, Nemoto S, Robinson JL et al. Intralesional Rose Bengal in melanoma elicits tumor immunity via activation of dendritic cells by the release of high mobility group box 1. Oncotarget.
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15. Lippey J, Bousounis R, Behrenbruch C, McKay B, Spillane J, Henderson MA et al. Intralesional PV-10 for in-transit melanoma-A single-center experience. Journal of surgical oncology. 2016;114(3):380-4. doi:10.1002/jso.24311. 16. Ross MI. Intralesional therapy with PV-10 (Rose Bengal) for in-transit melanoma. Journal of surgical oncology.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un medicamento para uso en el tratamiento de un tumor sólido canceroso pediátrico en un sujeto de mamíferos, en el que el medicamento es un xanteno halogenado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y en el que el uso consiste en provocar la ablación de las células tumorales mediante la administración intralesional del xanteno halogenado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que el xanteno halogenado o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo es la Rosa de Bengala o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
2. El medicamento para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el xanteno halogenado o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo es Rosa de Bengala disódica.
3. El medicamento para uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el tumor sólido canceroso pediátrico es sarcoma de Ewing, neuroblastoma, neuroepitelioma, osteosarcoma o rabdomiosarcoma.
4. El medicamento para uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el uso comprende la administración de un medicamento sistémico contra el cáncer que es la terapia por radiación ionizante.
5. El medicamento para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el uso comprende la administración de un medicamento sistémico contra el cáncer que es una molécula proteica, en el que la molécula proteica es un anticuerpo o una enzima, opcionalmente asparaginasa.
6. El medicamento para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el uso comprende la administración de un medicamento sistémico contra el cáncer que es un anticuerpo inhibidor de puntos de control, opcionalmente en el que el anticuerpo inhibidor de puntos de control inhibe el receptor PD-1, el ligando PD-L1 o el receptor CTLA-4.
7. El medicamento para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el uso comprende la administración de un medicamento sistémico contra el cáncer que es un medicamento contra el cáncer de molécula pequeña, en el que el medicamento contra el cáncer de molécula pequeña se selecciona de doxorrubicina, etopósido, vincristina, cisplatino, irinotecán y citarabina.
8. El medicamento para uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho medicamento contra el cáncer de molécula pequeña es doxorrubicina, etopósido o vincristina.
9. Un xanteno halogenado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un medicamento sistémico contra el cáncer para uso en el tratamiento de un tumor sólido canceroso pediátrico en un sujeto mamífero, en el que el uso comprende (1) provocar la ablación de las células tumorales mediante la administración intralesional del xanteno halogenado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (2) administrar una cantidad efectiva inhibidora del tumor del medicamento sistémico contra el cáncer, en el que el xanteno halogenado o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo es la Rosa de Bengala o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y en el que el medicamento sistémico contra el cáncer se selecciona de doxorrubicina, etopósido y vincristina.
10. Un medicamento sistémico contra el cáncer para uso en el tratamiento de un tumor sólido canceroso pediátrico en un sujeto mamífero, en el que el uso comprende (1) provocar la ablación de las células tumorales mediante la administración intralesional de un xanteno halogenado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (2) administrar una cantidad efectiva inhibidora del tumor del medicamento sistémico contra el cáncer, en el que el xanteno halogenado o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo es Rosa de Bengala o un sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y en la que dicho medicamento sistémico contra el cáncer es doxorrubicina, etopósido o vincristina.
11. El xanteno halogenado o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo y el medicamento sistémico contra el cáncer, o el medicamento sistémico contra el cáncer, para uso de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en el que dicho xanteno halogenado o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo es Rosa de Bengala disódica.
12. El xanteno halogenado o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo y el medicamento sistémico contra el cáncer, o el medicamento sistémico contra el cáncer, para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el tumor sólido canceroso pediátrico es sarcoma de Ewing, neuroblastoma, neuroepitelioma, osteosarcoma o rabdomiosarcoma.
13. El medicamento, el xanteno halogenado o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo y el medicamento sistémico contra el cáncer, o el medicamento sistémico contra el cáncer, para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 12, en el que dicha administración intralesional del xanteno halogenado o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo debe ocurrir: (a) antes de la administración de dicho medicamento sistémico contra el cáncer, o (b) después de la administración de dicho medicamento sistémico contra el cáncer.
14. El medicamento, el xanteno halogenado o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo y el medicamento sistémico contra el cáncer, o el medicamento sistémico contra el cáncer, para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 12, en el que dicha administración intralesional de un xanteno halogenado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo debe ocurrir simultáneamente con la administración de dicho medicamento sistémico contra el cáncer.
15. El medicamento, el xanteno halogenado o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo y el medicamento sistémico contra el cáncer, o el medicamento sistémico contra el cáncer, para uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que dicho mamífero es un humano.
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