JP2021526549A

JP2021526549A - 難治性小児固形腫瘍に対するハロゲン化キサンテンのインビトロ（ｉｎｖｉｔｏｒｏ）および異種移植片での抗腫瘍活性

Info

Publication number: JP2021526549A
Application number: JP2021514306A
Authority: JP
Inventors: シンガージェイミー; エー．ワクターエリック; スイフトルーシー; ヂアンチュンフェン; トリペットタニャ; ナレンドランアル
Original assignee: プロヴェクタスファーマテック，インク．; ザガバナーオブザユニバーシティオブカルガリー
Priority date: 2018-05-16
Filing date: 2019-05-15
Publication date: 2021-10-07
Anticipated expiration: 2039-05-15
Also published as: WO2019222361A1; ES2964399T3; CA3100358A1; US20190350893A1; US11058664B2; EP3773548A1; KR20200144562A; CN112996502A; MX2020011836A; AU2019268353A1; US11974980B2; EP3773548B1; CN112996502B; US20210308091A1; JP7116252B2; AU2019268353B2; EP3773548A4; WO2019222361A9; AU2019268353A2

Abstract

投与された腫瘍の腫瘍細胞のアブレーションを誘発する量のハロゲン化キサンテンまたはその薬学的に許容される塩、好ましくはローズベンガル二ナトリウム、を病巣内に投与することを含む、哺乳動物対象の小児がん性固形腫瘍を治療する方法を開示する。別の企図される方法は、投与された腫瘍の腫瘍細胞のアブレーションを誘発する量のハロゲン化キサンテンまたはその薬学的に許容される塩、好ましくはローズベンガル二ナトリウム、を病巣内に投与するステップと、当該ハロゲン化キサンテンと相乗的な細胞毒性を提供する、腫瘍抑制に有効な量の全身性抗がん剤を全身投与するステップとを含む。２つの投与は、同時に行うことも、一方を他方の前に行うことも可能である。【選択図】図１

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１８年５月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／６７２，３７３号に基づく優先権を主張し、当該米国仮特許出願の開示内容を援用するものである。

小児に発生するがんの種類は、成人に発生するがんの種類とは異なることが多い。小児がんは、多くの場合、生涯のうちの非常に早い時期に、時には出生よりも前に生じる細胞のＤＮＡ変化が原因となる。したがって、がんの発生を引き起こす遺伝子変異は、子宮内での胎児の発育中に生じる可能性がある。成人の多くのがんとは異なり、小児がんは生活習慣や環境的なリスク要因とは強く関連していない。

さらに、小児は、がんの治療中、治療完了後、そしてがんの生存者として、特有の問題に直面する。たとえば、小児はより集中的な治療を受ける可能性があるが、がんとその治療は、成長途中の小児の体に対して成人の体とは異なる影響を与える可能性がある。小児は、成人の症状を抑制するために使用される薬に対して、成人とは異なる反応を示す可能性がある。

思春期の若者および若年成人は、その下の年代の子供またはその上の年代の成人のいずれかとは異なる種類のがんと診断されることが多い。特定の種類のがんの発生率は、思春期および若年成人世代の中で大きく異なる。いくつかのエビデンスは、急性リンパ芽球性白血病の思春期および若年成人は、成人の治療レジメンを受ける場合よりも小児の治療レジメンで治療される場合の方が良い結果をもたらす可能性があることを示唆している。

現在、ユーイング肉腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、および横紋筋肉腫などの再発または転移性固形腫瘍の小児の全生存率は、３０％未満と低い［非特許文献１］。小児固形腫瘍のうち、神経芽細胞腫は小児で最も一般的な頭蓋外がんであり、１歳〜４歳の小児の主要な死因である［非特許文献２］。

神経芽細胞腫は、交感神経組織に由来する非常に不均一で複雑な疾患である［非特許文献３］。神経芽細胞腫の治療における最近の改善により、非高リスク疾患の５年生存率は９０％超まで増加している［非特許文献４］。しかし、神経芽細胞腫を呈する患者の４０％超が高リスクと見なされており、集中的な治療レジメンにもかかわらず、これらの患者の５年生存率は５０％未満である［非特許文献２、４］。さらに、再発性神経芽細胞腫の予後は不良であり、５年生存率は１０％未満である［非特許文献４］。

特に高リスク神経芽細胞腫および再発性神経芽細胞腫の小児患者などの、再発または転移性固形腫瘍の小児患者の生存率が低いことを考慮すると、これらの悪性腫瘍を治療するための新しい治療アプローチが緊急に必要とされている。

成人のがん性腫瘍に有用な抗がん剤グループの１つは、ハロゲン化キサンテン、またはその薬学的に許容される塩である。特許文献１、２、および３を参照されたい。これらのハロゲン化キサンテンのうち、ローズベンガル二ナトリウム（４，５，６，７−テトラクロロ−２’，４’，５’，７’−テトラヨードフルオレセイン二ナトリウム；ＲＢ）は特に効果的で容易に利用できることがわかっている。成人の腫瘍の動態と小児の腫瘍の動態とは大きく異なる場合が多いため、ＲＢおよび類似のハロゲン化キサンテンを小児のがん性腫瘍に対して使用した場合に同様に有効であるかどうかは不明である。

ＰＶ−１０は、０．９％生理食塩水中の（ＲＢ）の１０％無菌溶液であり、乳幼児の肝機能を測定するために臨床的に使用されている［非特許文献５］。これまでの研究では、ＰＶ−１０がリソソームに蓄積し［非特許文献６］、様々な成人がんで細胞死を誘導することが示されている［非特許文献７〜１１］。

難治性転移性黒色腫患者を対象とした第ＩＩ相臨床試験では、ＰＶ−１０の病巣内（ＩＬ）注射により腫瘍の退縮が誘導され、全奏効率は５１％であった［非特許文献１２］。ＰＶ−１０は、in-transit黒色腫または転移性黒色腫の患者を対象とした第ＩＩ相臨床試験において、放射線療法との併用でも有効性を実証し、全奏効率は８６．６％であった［非特許文献１３］。ＰＶ−１０は、直接的ながん細胞死を誘導することに加え、マウス研究［非特許文献７、８、１４］と臨床試験［非特許文献１０、１２、１４、１５、１６］との両方において、腫瘍特異的免疫反応を誘導することも示されている。

米国特許第６３３１２８６号米国特許第７３９０６６８号米国特許第７６４８６９５号米国特許第５９９８５９７号米国特許第６４９３５７０号米国特許第８９７４３６３号

Chen X, Pappo A, Dyer MA. Pediatric solid tumor genomics and developmental pliancy. Oncogene. 2015;34:5207. doi: 10.1038/onc.2014.474. Moreno L, Caron H, Geoerger B, Eggert A, Schleiermacher G, Brock P et al. Accelerating drug development for neuroblastoma - New Drug Development Strategy: an Innovative Therapies for Children with Cancer, European Network for Cancer Research in Children and Adolescents and International Society of Paediatric Oncology Europe Neuroblastoma project. Expert opinion on drug discovery. 2017;12(8):801-11. doi: 10.1080/17460441.2017.1340269. Cheung N-KV, Dyer MA. Neuroblastoma: Developmental Biology, Cancer Genomics, and Immunotherapy. Nature reviews Cancer. 2013;13(6):397-411. doi: 10.1038/nrc3526. Park JR, Bagatell R, London WB, Maris JM, Cohn SL, Mattay KK et al. Children's Oncology Group's 2013 blueprint for research: neuroblastoma. Pediatric blood ＆ cancer. 2013;60(6):985-93. doi: 10.1002/pbc.24433. Yvart J, Moati F, Alvarez F. Odievre M. Degrez A. 131 I Rose Bengal: Its Use in the Evaluation of Infantile Jaundice. European Journal of Nuclear Medicine. 1981; 6:355-359. Wachter, E., Dees, C., Harkins, J., Fisher, W., Scott, T. 2002. Functional imaging of photosensitizers using multiphoton microscopy. Proceedings of SPIE, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences II, Periasamy, A. and So, P.T.C. (eds), Bellingham, Washington: 4620: 143-147. Qin J, Kunda N, Qiao G, Calata JF, Pardiwala K, Prabhakar BS et al. Colon cancer cell treatment with Rose Bengal generates a protective immune response via immunogenic cell death. Cell Death &Amp; Disease. 2017;8:e2584. doi: 10.1038/cddis.2016.473 Toomey P, Kodumudi K, Weber A, Kuhn L, Moore E, Sarnaik AA et al. Intralesional Injection of Rose Bengal Induces a Systemic Tumor-Specific Immune Response in Murine Models of Melanoma and Breast Cancer. PLoS ONE. 2013;8(7):e68561. doi: 10.1371/journal.pone.0068561. Koevary SB. Selective toxicity of Rose Bengal to ovarian cancer cells in vitro. International journal of physiology, pathophysiology and pharmacology. 2012;4(2):99-107. Thompson JF, Hersey P, Wachter E. Chemoablation of metastatic melanoma using intralesional Rose Bengal. Melanoma research. 2008;18(6):405-11. doi: 10.1097/CMR.0b013e32831328c7. Zamani Taghizadeh Rabe S, Mousavi SH, Tabasi N, Rastin M, Zamani Taghizadeh Rabe S, Siadat Z et al. Rose Bengal suppresses gastric cancer cell proliferation via apoptosis and inhibits nitric oxide formation in macrophages. Journal of immunotoxicology. 2014;11(4):367-75. doi: 10.3109/1547691x.2013.853715. Thompson JF, Agarwala SS, Smithers BM, Ross MI, Scoggins CR, Coventry BJ et al. Phase 2 Study of Intralesional PV-10 in Refractory Metastatic Melanoma. Annals of surgical oncology. 2015;22(7):2135-42. doi: 10.1245/s10434-014-4169-5. Foote M, Read T, Thomas J, Wagels M, Burmeister B, Smithers BM. Results of a phase II, open-label, non-comparative study of intralesional PV-10 followed by radiotherapy for the treatment of in-transit or metastatic melanoma. Journal of surgical oncology. 2017;115(7):891-7. doi:10.1002/jso.24580. Liu H, Innamarato PP, Kodumudi K, Weber A, Nemoto S, Robinson JL et al. Intralesional Rose Bengal in melanoma elicits tumor immunity via activation of dendritic cells by the release of high mobility group box 1. Oncotarget. 2016;7(25):37893-905. doi: 10.18632/oncotarget.9247. Lippey J, Bousounis R, Behrenbruch C, McKay B, Spillane J, Henderson MA et al. Intralesional PV-10 for in-transit melanoma-A single-center experience. Journal of surgical oncology. 2016;114(3):380-4. doi: 10.1002/jso.24311. Ross MI. Intralesional therapy with PV-10 (Rose Bengal) for in-transit melanoma. Journal of surgical oncology. 2014;109(4):314-9. doi: 10.1002/jso.23554. Jayanthan A, Ruan Y, Truong TH, Narendran A. Aurora kinases as druggable targets in pediatric leukemia: heterogeneity in target modulation activities and cytotoxicity by diverse novel therapeutic agents. PLoS One. 2014;9(7):e102741. doi: 10.1371/journal.pone.0102741. Chou T-C. Drug Combination Studies and Their Synergy Quantification Using the Chou-Talalay Method. Cancer Research. 2010;70(2):440. Lun X, Ruan Y, Jayanthan A, Liu DJ, Singh A, Trippett T et al. Double-deleted vaccinia virus in virotherapy for refractory and metastatic pediatric solid tumors. Molecular oncology. 2013;7(5):944-54. doi: 10.1016/j.molonc.2013.05.004. Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC). https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic. 検索日：２０１７年１０月３０日 Fennelly C, Amaravadi RK. Lysosomal Biology in Cancer. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). 2017;1594:293-308. doi: 10.1007/978-1-4939-6934-0_19.

本発明は、哺乳動物対象の小児がん性固形腫瘍を治療する方法を企図する。１つの方法は、投与された腫瘍の腫瘍細胞のアブレーションを誘発する量のハロゲン化キサンテンまたはその薬学的に許容される塩を病巣内に投与することを企図する。２つ目の方法は、投与された腫瘍の腫瘍細胞のアブレーションを誘発する量のハロゲン化キサンテンまたはその薬学的に許容される塩を病巣内に投与するステップを含む。ハロゲン化キサンテンと相乗的な細胞毒性を提供する、腫瘍抑制に有効な量の全身性抗がん剤もまた、哺乳動物対象に対して全身投与する。

２つの薬剤は同時に投与することが可能であり、または、一方の薬剤を他方の薬剤の投与の約１週間から約４週間前に投与することが可能である。全身投与の約１週間から約４週間前に病巣内投与を行うことが好ましい。

本開示の一部を構成する図面は、下記の通りである。

図１Ａ〜１Ｅは、ＰＶ−１０が小児固形腫瘍細胞株の細胞生存率を低下させることを示している。様々な小児固形腫瘍細胞株（ユーイング肉腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、および横紋筋肉腫）、正常線維芽細胞株、および初代骨髄サンプルを、ＰＶ−１０の濃度を上げながら（３．１２５〜４００μＭ）９６時間処理した。細胞生存率はalamarBlue（登録商標）アッセイによって測定した。細胞生存率の百分率は、ＰＢＳ（コントロール）による対応する処理に対して正規化された。細胞生存率の平均割合は、３つの別々の研究から計算され、平均の標準誤差が示されている。ＰＶ−１０が神経芽細胞腫細胞株に対して細胞毒性であることを示す顕微鏡写真である。神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、およびＩＭＲ５、ならびに密接に関連する神経上皮腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣを、ＰＢＳ（コントロール）、５０μＭのＰＶ−１０、または１００μＭのＰＶ−１０のいずれかで９６時間処理し、位相差光学顕微鏡解析により観察した。研究は３回行われ、代表的な画像が示されている。スケールバーは１００μｍに相当する。ＰＶ−１０が神経芽細胞腫細胞株に対して細胞毒性であることを示す図である。神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、およびＩＭＲ５、ならびに神経上皮腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣを、ＰＢＳ（コントロール）または１００μＭのＰＶ−１０のいずれかで処理し、経時的顕微鏡動画解析により観察した。３０分ごとに４８時間撮像を行った。細胞数を計測し、０時間での細胞数に対して正規化した。各研究の各処理ごとに、少なくとも３５０個の細胞を計測した。３つの別々の研究から計算された細胞数の平均割合と平均の標準誤差とが示されている。ＰＶ−１０によってがん細胞のリソソームが破壊されることを示す図である。神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、およびＩＭＲ５を、ＰＢＳ（コントロール）または１００μＭのＰＶ−１０のいずれかで１６時間処理した。酸性の細胞小器官に濃縮されて蛍光を発する核酸染色剤であるHoechst 33342およびLysoTracker（登録商標）Green DND-26で生細胞を染色し、蛍光顕微鏡解析により観察した。スケールバーは２０μｍに相当する。提示されたデータは、３つの別々の研究の代表である。ＰＶ−１０が細胞周期のＧ１期にある細胞の割合を増加させることを示す図である。神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＡＳおよびＩＭＲ５を、ＰＢＳ（コントロール）、５０μＭのＰＶ−１０、または１００μＭのＰＶ−１０のいずれかで１６時間または２４時間処理し、細胞周期段階を検出するために、ＤＡＰＩで染色してフローサイトメトリで分析した。細胞周期のＧ１期、Ｓ期、またはＧ２／Ｍ期のいずれかにある細胞の平均割合は、３つの別々の研究から計算され、平均の標準誤差が示されている。ＰＶ−１０がアポトーシスによる細胞死を誘導することを示す図である。神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、およびＩＭＲ５、ならびに神経上皮腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣを、ＰＢＳ（コントロール）、７５μＭのＰＶ−１０、または１００μＭのＰＶ−１０のいずれかで２４時間処理した。全細胞溶解液を調製し、ウエスタンブロットにより分析して、総および切断ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）、カスパーゼ３、カスパーゼ７、およびカスパーゼ９のレベルを検出した。アクチンをローディングコントロールとして使用した。分子量はキロダルトン（ｋＤａ）で示される。提示されたデータは、２つの別々の研究の代表である。ＰＶ−１０処理が様々な抗がん剤治療と相乗的であることを示す図である。神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、およびＩＭＲ５、神経上皮腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ならびに正常線維芽細胞株ＢＪを、０．１μＭの７種類の各抗がん剤単独で、または５０μＭのＰＶ−１０との併用で処理した。細胞を９６時間処理し、細胞生存率をalamarBlue（登録商標）で測定した。細胞生存率の百分率は、ＰＢＳ（コントロール）での処理に対して正規化された。２つの別々の研究から計算された細胞生存率の平均割合と平均の標準誤差とが示されている。ＰＶ−１０処理が様々な抗がん剤治療と相乗的であることを示す図である。神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、およびＩＭＲ５、神経上皮腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ならびに正常線維芽細胞株ＢＪを、０．１μＭの７種類の各抗がん剤単独で、または５０μＭのＰＶ−１０との併用で処理した。細胞を９６時間処理し、細胞生存率をalamarBlue（登録商標）で測定した。細胞生存率の百分率は、ＰＢＳ（コントロール）での処理に対して正規化された。２つの別々の研究から計算された細胞生存率の平均割合と平均の標準誤差とが示されている。ＰＶ−１０処理が様々な抗がん剤治療と相乗的であることを示す図である。神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、およびＩＭＲ５、神経上皮腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ならびに正常線維芽細胞株ＢＪを、０．１μＭの７種類の各抗がん剤単独で、または５０μＭのＰＶ−１０との併用で処理した。細胞を９６時間処理し、細胞生存率をalamarBlue（登録商標）で測定した。細胞生存率の百分率は、ＰＢＳ（コントロール）での処理に対して正規化された。２つの別々の研究から計算された細胞生存率の平均割合と平均の標準誤差とが示されている。ＰＶ−１０処理が様々な抗がん剤治療と相乗的であることを示す図である。神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、およびＩＭＲ５、神経上皮腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ならびに正常線維芽細胞株ＢＪを、０．１μＭの７種類の各抗がん剤単独で、または５０μＭのＰＶ−１０との併用で処理した。細胞を９６時間処理し、細胞生存率をalamarBlue（登録商標）で測定した。細胞生存率の百分率は、ＰＢＳ（コントロール）での処理に対して正規化された。２つの別々の研究から計算された細胞生存率の平均割合と平均の標準誤差とが示されている。ＰＶ−１０処理が様々な抗がん剤治療と相乗的であることを示す図である。神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、およびＩＭＲ５、神経上皮腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ならびに正常線維芽細胞株ＢＪを、０．１μＭの７種類の各抗がん剤単独で、または５０μＭのＰＶ−１０との併用で処理した。細胞を９６時間処理し、細胞生存率をalamarBlue（登録商標）で測定した。細胞生存率の百分率は、ＰＢＳ（コントロール）での処理に対して正規化された。２つの別々の研究から計算された細胞生存率の平均割合と平均の標準誤差とが示されている。ＰＶ−１０処理が放射線照射の効果を増強することを示す図である。神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＡＳを、ＰＢＳ（コントロール）または５０μＭのＰＶ−１０のいずれかで４時間前処理した。次に、０．５Ｇｙ、１Ｇｙ、または２Ｇｙのいずれかの放射線を細胞に照射し、さらに９２時間細胞を培養した。細胞生存率をalamarBlue（登録商標）で測定した。３つの別々の研究から計算された細胞生存率の平均割合と平均の標準誤差とが示されている。アスタリスクは、スチューデントの対応のあるｔ検定による、ｐ＜０．０５水準での有意差を示す。ＰＶ−１０処理が放射線照射の効果を増強することを示す図である。神経芽細胞腫細胞株ＩＭＲ５を、ＰＢＳ（コントロール）または５０μＭのＰＶ−１０のいずれかで４時間前処理した。次に、０．５Ｇｙ、１Ｇｙ、または２Ｇｙのいずれかの放射線を細胞に照射し、さらに９２時間細胞を培養した。細胞生存率をalamarBlue（登録商標）で測定した。３つの別々の研究から計算された細胞生存率の平均割合と平均の標準誤差とが示されている。アスタリスクは、スチューデントの対応のあるｔ検定による、ｐ＜０．０５水準での有意差を示す。図７Ａ〜７Ｆは、ＰＶ−１０処理がインビボ（in vivo）で腫瘍退縮を誘導することを示す図である。ＣＢ１７ＳＣＩＤマウス（グループあたりｎ＝４）の右脇腹に、ＩＭＲ５−ｍＣｈｅｒｒｙＦｌｕｃ細胞またはＳＫ−Ｎ−ＡＳ−ｍＣｈｅｒｒｙＦｌｕｃ細胞のいずれかを皮下注射した。腫瘍サイズが少なくとも５×５ｍｍとなった際に、５０μｌのＰＢＳ（コントロール）、２５μｌのＰＶ−１０、または５０μｌのＰＶ−１０のいずれかを腫瘍に注射した。図７Ａでは、ノギスを使用してＩＭＲ５−ｍＣｈｅｒｒｙＦｌｕｃ腫瘍の成長を測定した。矢印は処理日（６日目）を示す。平均腫瘍サイズと平均の標準誤差とが示されている。アスタリスクは、スチューデントの対応の無いｔ検定による、ｐ＜０．０５水準での有意差を示す。図７Ａ〜７Ｆは、ＰＶ−１０処理がインビボ（in vivo）で腫瘍退縮を誘導することを示す図である。ＣＢ１７ＳＣＩＤマウス（グループあたりｎ＝４）の右脇腹に、ＩＭＲ５−ｍＣｈｅｒｒｙＦｌｕｃ細胞またはＳＫ−Ｎ−ＡＳ−ｍＣｈｅｒｒｙＦｌｕｃ細胞のいずれかを皮下注射した。腫瘍サイズが少なくとも５×５ｍｍとなった際に、５０μｌのＰＢＳ（コントロール）、２５μｌのＰＶ−１０、または５０μｌのＰＶ−１０のいずれかを腫瘍に注射した。図７Ｂでは、Xenogen IVIS（登録商標）200システムを使用して、Ｄ−ルシフェリンを腹腔内注射した後の生物発光シグナルを検出することによりＩＭＲ５−ｍＣｈｅｒｒｙＦｌｕｃ腫瘍の成長を測定した。平均腫瘍サイズと平均の標準誤差とが示されている。図７Ａ〜７Ｆは、ＰＶ−１０処理がインビボ（in vivo）で腫瘍退縮を誘導することを示す図である。ＣＢ１７ＳＣＩＤマウス（グループあたりｎ＝４）の右脇腹に、ＩＭＲ５−ｍＣｈｅｒｒｙＦｌｕｃ細胞またはＳＫ−Ｎ−ＡＳ−ｍＣｈｅｒｒｙＦｌｕｃ細胞のいずれかを皮下注射した。腫瘍サイズが少なくとも５×５ｍｍとなった際に、５０μｌのＰＢＳ（コントロール）、２５μｌのＰＶ−１０、または５０μｌのＰＶ−１０のいずれかを腫瘍に注射した。図７Ｃは、ＩＭＲ５−ｍＣｈｅｒｒｙＦｌｕｃ腫瘍を有するマウスの生存曲線を示している。アスタリスクは、ログランク（マンテル・コックス）検定による、ｐ＜０．０５水準での有意差を示す。図７Ａ〜７Ｆは、ＰＶ−１０処理がインビボ（in vivo）で腫瘍退縮を誘導することを示す図である。ＣＢ１７ＳＣＩＤマウス（グループあたりｎ＝４）の右脇腹に、ＩＭＲ５−ｍＣｈｅｒｒｙＦｌｕｃ細胞またはＳＫ−Ｎ−ＡＳ−ｍＣｈｅｒｒｙＦｌｕｃ細胞のいずれかを皮下注射した。腫瘍サイズが少なくとも５×５ｍｍとなった際に、５０μｌのＰＢＳ（コントロール）、２５μｌのＰＶ−１０、または５０μｌのＰＶ−１０のいずれかを腫瘍に注射した。図７Ｄでは、ノギスを使用してＳＫ−Ｎ−ＡＳ−ｍＣｈｅｒｒｙＦｌｕｃ腫瘍の成長を数十日間経時的に測定した。矢印は処理日（１４日目）を示す。平均腫瘍サイズと平均の標準誤差とが示されている。図７Ａ〜７Ｆは、ＰＶ−１０処理がインビボ（in vivo）で腫瘍退縮を誘導することを示す図である。ＣＢ１７ＳＣＩＤマウス（グループあたりｎ＝４）の右脇腹に、ＩＭＲ５−ｍＣｈｅｒｒｙＦｌｕｃ細胞またはＳＫ−Ｎ−ＡＳ−ｍＣｈｅｒｒｙＦｌｕｃ細胞のいずれかを皮下注射した。腫瘍サイズが少なくとも５×５ｍｍとなった際に、５０μｌのＰＢＳ（コントロール）、２５μｌのＰＶ−１０、または５０μｌのＰＶ−１０のいずれかを腫瘍に注射した。図７Ｅでは、Xenogen IVIS（登録商標）200システムを使用して、Ｄ−ルシフェリンを腹腔内注射した後の生物発光シグナルを検出することにより、処理後０日目、１２日目、および１５日目のＳＫ−Ｎ−ＡＳ−ｍＣｈｅｒｒｙＦｌｕｃ腫瘍の成長を測定した。平均腫瘍サイズと平均の標準誤差とが示されている。図７Ａ〜７Ｆは、ＰＶ−１０処理がインビボ（in vivo）で腫瘍退縮を誘導することを示す図である。ＣＢ１７ＳＣＩＤマウス（グループあたりｎ＝４）の右脇腹に、ＩＭＲ５−ｍＣｈｅｒｒｙＦｌｕｃ細胞またはＳＫ−Ｎ−ＡＳ−ｍＣｈｅｒｒｙＦｌｕｃ細胞のいずれかを皮下注射した。腫瘍サイズが少なくとも５×５ｍｍとなった際に、５０μｌのＰＢＳ（コントロール）、２５μｌのＰＶ−１０、または５０μｌのＰＶ−１０のいずれかを腫瘍に注射した。図７Ｆは、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ−ｍＣｈｅｒｒｙＦｌｕｃ腫瘍を有するマウスの生存曲線を示している。図７Ａ〜７Ｆで説明した各実験グループの一連のマウス写真を示す。生物発光画像は、各実験グループ（ＰＢＳコントロール、用量２５μＬのＰＶ−１０、および用量５０μＬのＰＶ−１０）の処理後６日目、１２日目、および１７日目の活動的な脇腹の腫瘍を示す。

本発明は、ローズベンガル（ＲＢ、４，５，６，７−テトラクロロ−２’，４’，５’，７’−テトラヨードフルオレセイン二ナトリウム）等のハロゲン化キサンテンまたはその薬学的に許容される塩を腫瘍抑制に有効な量含有する医薬組成物を、腫瘍内に（病巣内）投与することで小児固形腫瘍を治療する方法を企図する。ローズベンガル含有組成物は単独の治療薬として利用可能であるが、いくつかの好ましい実施形態では、ＲＢは、好ましくは、小分子（非タンパク性、約１０００グラム／モル未満）、抗体や酵素などのタンパク性分子、電離放射線療法、またはいわゆるチェックポイント阻害抗体療法であり得る全身性抗がん剤などの、別の抗腫瘍モダリティと組み合わされる。本明細書に示されるように、これらの組み合わせのいくつかは、小児腫瘍に対して相乗的な毒性を示している。

ハロゲン化キサンテン
特に好適であるローズベンガル（４，５，６，７−テトラクロロ−２’，４’，５’，７’−テトラヨードフルオレセイン）等の企図されるハロゲン化キサンテン、または、エリスロシンＢ、フロキシンＢ、４，５，６，７−テトラブロモ−２’，４’，５’，７’−テトラヨードフルオレセイン、２’，４，５，６，７−ペンタクロロ−４’，５’，７’−トリヨードフルオレセイン、４，４’，５，６，７−ペンタクロロ−２’，５’，７’−トリヨードフルオレセイン、２’，４，５，６，７，７’−ヘキサクロロ−４’，５’−ジヨードフルオレセイン、４，４’，５，５’，６，７−ヘキサクロロ−２’，７’−ジヨードフルオレセイン、２’，４，５，５’，６，７−ヘキサクロロ−４’，７’−ジヨードフルオレセイン、４，５，６，７−テトラクロロ−２’，４’，５’−トリヨードフルオレセイン、４，５，６，７−テトラクロロ−２’，４’，７’−トリヨードフルオレセイン、４，５，６，７−テトラブロモ−２’，４’，５’−トリヨードフルオレセイン、および４，５，６，７−テトラブロモ−２’，４’，７’−トリヨードフルオレセインを含むその他のハロゲン化キサンテンは、適切な医薬組成物中に溶解または分散して存在する。

好ましい形態であるローズベンガル二ナトリウムは、以下の構造式で表される：

この企図される組成物に関する好適な実施形態の詳細は、その開示全体が本明細書に組み込まれる特許文献１、４、５、および６に記載されている。

企図される組成物中のハロゲン化キサンテン成分の送達は、組成物が生理学的ｐＨ（すなわち、約ｐＨ７）に近いｐＨ値を有する場合、特に、ｐＨ値が約４より大きい場合に行われることが最も好ましく、これによりハロゲン化キサンテンは、組成物中において確実に二塩基の形態を維持する。従って、好適な実施形態において、組成物のｐＨ値は約４〜約１０であり、より好ましくは約５〜約９であり、最も好ましくは約ｐＨ６〜約ｐＨ８である。

ハロゲン化キサンテン成分の組織への分配性を最大化するための薬剤としては、親水性賦形剤が適している。したがって、好適な実施形態では、賦形剤中において、このような分配を妨害しうる非親水性成分の含有量は最小限である。

したがって、組成物の好適な製剤は、親水性の、好ましくは水含有の賦形剤中に以下を含む：適切な医薬組成物中の、特に好適であるローズベンガル（４，５，６，７−テトラクロロ−２’，４’，５’，７’−テトラヨードフルオレセイン）等のハロゲン化キサンテン、または、エリスロシンＢ、フロキシンＢ、４，５，６，７−テトラブロモ−２’，４’，５’，７’−テトラヨードフルオレセイン、２’，４，５，６，７−ペンタクロロ−４’，５’，７’−トリヨードフルオレセイン、４，４’，５，６，７−ペンタクロロ−２’，５’，７’−トリヨードフルオレセイン、２’，４，５，６，７，７’−ヘキサクロロ−４’，５’−ジヨードフルオレセイン、４，４’，５，５’，６，７−ヘキサクロロ−２’，７’−ジヨードフルオレセイン、２’，４，５，５’，６，７−ヘキサクロロ−４’，７’−ジヨードフルオレセイン、４，５，６，７−テトラクロロ−２’，４’，５’−トリヨードフルオレセイン、４，５，６，７−テトラクロロ−２’，４’，７’−トリヨードフルオレセイン、４，５，６，７−テトラブロモ−２’，４’，５’−トリヨードフルオレセイン、および４，５，６，７−テトラブロモ−２’，４’，７’−トリヨードフルオレセインを含むその他のハロゲン化キサンテン。

好ましい形態であるローズベンガル二ナトリウムは、以下の化学式で表される：

この医薬組成物に関する好適な実施形態の詳細は、その開示全体が本明細書に組み込まれる特許文献１、４、５、および６に記載されている。

企図されるハロゲン化キサンテン含有組成物は、典型的には、水性媒体中に約０．１％（ｗ／ｖ）から約２０％（ｗ／ｖ）の濃度でハロゲン化キサンテンを含有する。医薬ハロゲン化キサンテン含有組成物は、好ましくは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、およびマグネシウムからなる群より選択される少なくとも１つのカチオンと、塩化物、リン酸塩、および硝酸塩からなる群より選択される少なくとも１つのアニオンとを含む水溶性電解質を含み、この電解質の濃度は約０．１％（ｗ／ｖ）〜約２％（ｗ／ｖ）である。

３番目の成分は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、リン酸塩、および硝酸塩から選択される水溶性電解質である。この電解質は、約０．１〜約２重量％の濃度で存在する、または代わりに、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇ超〜約６００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を提供するのに十分なレベルで存在する。より好ましくは、薬剤組成物の浸透圧は、２５０ｍＯｓｍ／ｋｇより大きく、最も好ましくは、約３００〜５００ｍＯｓｍ／ｋｇである。電解質は、好ましくは塩化ナトリウムである。電解質は、好ましくは約０．５〜約１．５％の濃度で、さらにより好ましくは約０．８〜約１．２％の濃度で、そして最も好ましくは生理食塩水中に存在するように約０．９％の濃度で存在する。

組成物の水性媒体は、好ましくは、注射での使用の基準を満たす水のみを含有する。賦形剤の最大約２０体積パーセントを、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、第２ブタノール、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，２−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、エリトリトール、トレイトール、トリメチロールプロパン、ソルビトールなどの、１つ以上のＣ_１−Ｃ_６１価または多価アルコールとすることができる。より好ましくは、アルコールは、賦形剤の約１０体積パーセント未満、さらにより好ましくは約５体積パーセント未満で企図される組成物中に存在する。

代替的な観点では、本発明は、下記の化学式１の化合物を使用し、化学式１中、Ｒ_１は独立的にＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｈ、またはＣ_１−Ｃ_４のアルキル基であり、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、およびＲ_５は独立的にＣｌ、Ｈ、またはＩであり、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、およびＲ_５から選択される少なくとも１つの置換基はＩであるとともに、少なくとも１つの置換基はＣｌまたはＨであり、Ｒ_６は独立的にＨまたはＣ_１−Ｃ_４のアルキル基であり、Ｒ_１１はＨまたはＣ_１−Ｃ_４のアルキル基であり、Ｒ_１２はＨまたはＣ_１−Ｃ_７のアシル基である。また、本発明は、（ａ）互変異性形態、（ｂ）アトロプ異性体、（ｃ）下記の化学式２に示される閉鎖したラクトン形態、（ｄ）化学式２に示されるラクトン形態の鏡像異性体、および（ｅ）それらの薬学的に許容可能な塩の全てを使用する。

「生理的に許容可能な塩」および「薬学的に許容可能な塩」という語句、およびその様々な文法形態の語句は、当技術分野で公知の方法により調整可能な、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウム、およびプロタミン亜鉛塩を含め、製薬業界で一般的に使用される、アルカリ金属、アルカリ土類金属、およびアンモニウム塩等のあらゆる非毒性カチオンを指す。企図されるカチオンは、水溶性キサンテン塩を提供する。好ましくは、塩は一塩基塩または二塩基塩形態の、ナトリウム、カリウム、カルシウム、およびアンモニウムである。医薬化合物と共に生理的に許容可能な塩を形成する、一般的に使用される生理的に（または薬学的に）許容可能な酸および塩基のリストについて、読者はBerge、J. Pharm. Sci. 1977 68(1)：1-19を参照されたい。

ハロゲン化キサンテン医薬組成物のｐＨ値は、当業者に公知のあらゆる適切な手段によって制御または調整することができる。酸や塩基等の追加により、組成物を中和するか、またはｐＨ値を調整することができる。ハロゲン化キサンテンまたはその生理的に許容可能な塩は弱酸であるから、ハロゲン化キサンテンの濃度および／または電解質の濃度によっては、組成物のｐＨ値のために中和剤および／またはｐＨ値調整剤を使用せずにすむ可能性がある。しかしながら、組成物は、投与されてから生体環境に適合できるよう、いかなる中和剤も含まないことが特に好ましい。

好ましくは、医薬組成物はいかなる防腐剤も含まない。防腐剤は、その多くが医薬組成物またはその製剤を有害にも妨害し得る、または、ハロゲン化キサンテン組成物の活性成分の送達を複雑にするか、相互作用を生じるか、または妨害する可能性のあるものである。防腐剤を用いる限りにおいては、イミド尿素が、医薬組成物中においても投与後においても、ハロゲン化キサンテンと相互作用を起こさないので好ましい防腐剤である。

企図される治療方法は、それを必要とする哺乳動物に対して使用される。治療される哺乳動物は、ヒトなどの霊長類、チンパンジーまたはゴリラなどの類人猿、カニクイザルまたはマカクなどのサル、ラット、マウスまたはウサギなどの実験動物、犬、猫、馬などのコンパニオン動物、あるいは、雌牛または去勢雄牛、羊、子羊、ブタ、ヤギ、ラマなどの食用動物であり得る。

企図される各組成物は、典型的には、治療された固形がん性腫瘍が検出されなくなる等の所望の程度まで縮小するまで、それを必要とする哺乳動物にインビボで繰り返し投与される。したがって、組成物を必要とする哺乳動物への投与は、治療を行う医師の指示の下で、１日に複数回、または毎日、毎週、毎月、あるいは数ヶ月から数年の期間にわたって行われ得る。

企図されるハロゲン化キサンテン化合物は、腫瘍内に直接注射された場合、通常、がん細胞のリソソームによって取り込まれ、リソソームに蓄積し、アポトーシスまたは別のメカニズムによる細胞死を誘導する。がん細胞死を引き起こす際に、細胞は崩壊またはアブレーションされる。細胞断片のアブレーションは、哺乳動物の免疫系を、アブレーションされた細胞断片に提示される抗原に対して特異的に刺激し、その結果、腫瘍内（病巣内）注射の部位から離れた腫瘍も認識されて殺傷されると考えられている。

上記でも述べた通り、ハロゲン化キサンテンまたはその薬学的に許容される塩の好適な企図された組成物は、ＰＶ−１０（登録商標）と呼ばれる。ＰＶ−１０（登録商標）は、０．９％生理食塩水中のローズベンガル（ＲＢ、４，５，６，７−テトラクロロ−２’，４’，５’，７’−テトラヨードフルオレセイン二ナトリウム）の１０％無菌溶液である。

ハロゲン化キサンテンとの併用で相乗的な細胞毒性を提供する、腫瘍抑制に有効な量の全身性抗がん剤は、それを必要とする哺乳動物対象に対して投与されるものであり、通常の液体、ゲル、固体、または他の形態を使用して処方することができる。したがって、全身性抗がん剤は、例示的に、錠剤または液体組成物による経口投与、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、腹腔内注射、電離放射線、または有効量の抗がん剤を哺乳動物対象へ提供する任意の他の方式によって投与可能であることが理解されるべきである。

全身性抗がん剤
小分子（非タンパク性、約１０００グラム／モル未満）またはより大きなタンパク性分子である全身性抗がん剤は、ハロゲン化キサンテンの病巣内投与によって行われる局所投与と比較して、薬剤が治療対象の哺乳動物の全身に行きわたるように哺乳動物に投与される。例示的な小分子抗がん剤には、本明細書で使用したドキソルビシン、エトポシド、ビンクリスチン、シスプラチン、イリノテカン、およびシタラビンが含まれ、また、例示的なタンパク性分子はアスパラギナーゼである。これらの薬剤のうち、ドキソルビシン、エトポシド、およびビンクリスチンは、致死量以下の用量のＰＶ−１０による治療と相乗作用するようであり、好ましい。

小分子の全身性抗がん剤の有用な有効量は、ＦＤＡ、国内機関、または国際機関が承認した薬剤のラベル情報に記載されている用量である。一般的に、モノセラピーの投与計画は、早期臨床試験における最大耐性量（ＭＴＤ）の決定により設定される。ＭＴＤ（またはそのバリエーションである近似の量）は、有効性の評価と、安全性のより詳細な評価のために、後期臨床試験にも適用される（ｐｒｏｍｕｌｇａｔｅｄ）。これらのＭＴＤは、臨床試験が完了すると、確立された治療量となることが多い。しかしながら、小分子の全身性抗がん剤はＰＶ−１０との併用が企図されているため、ＭＴＤが使用される最大量であり、その量は通常の手順に従って漸減され得る。

本発明において局所ＰＶ−１０療法と組み合わせることが可能な各種の全身性抗がん剤の投与計画例を、下記の表Ａに示す。なお、以下に挙げる薬剤のいくつかは、上記で定義されている「小分子」であるのに対し、他の薬剤は、抗体などの大きなタンパク性分子である。それでもなお、これらは全身投与される。

下記のタンパク性抗がん剤は、通常、ＴＮＦファミリやインターロイキンファミリなどのケモカインによって引き起こされる炎症反応を抑制する。

本発明の併用療法および治療方法では、全身性薬剤を下記のような局所療法と組み合わせて使用するとき、相加的または相乗的効果によって、当該全身性薬剤を表Ａに記載されているような全身性薬剤の典型的な投与計画のレベル以下で使用することが一般的に可能となる。しかしながら、表Ａに示される投与計画は、治療を開始する際の有用な指針を提供するものであり、そこから、個々の患者を担当する医師が適切と考える量へ投与量を減量することが可能である。

電離放射線治療
本明細書で報告された結果は、ＰＶ−１０による治療を電離放射線と組み合わせることでも、治療全体の細胞毒性を増強したことを示している。このインビトロ研究では、まず最初に神経芽細胞腫細胞を致死量以下のＰＶ−１０と４時間接触させ、次に０．５、１、または２グレイの電離放射線を照射した。

この治療レジメンは一例であり、この治療の組み合わせの概念を証明したものであることが理解されるべきである。通常の労働者はこれらの効果を利用し、それに応じて治療を変更することが可能である。

チェックポイント抗体阻害剤
さらに別の併用治療レジメンでは、ＰＶ−１０の投与と、特別な全身性抗がん剤と見なすことができるチェックポイント抗体阻害剤の投与とを利用する。有用なチェックポイント抗体阻害剤は、投与されることで、免疫系ががん細胞を異物として認識し、このがん細胞を体から排除する手助けを行うことを可能にする、ヒト化モノクローナル抗体である。

一部のチェックポイント阻害抗体は、Ｔ細胞表面のＰＤ−１（プログラム細胞死タンパク質１）受容体またはその受容体のリガンドＰＤ−Ｌ１を標的とする。これらのモノクローナル抗体の例は、ＰＤ−１を阻害するペンブロリズマブおよびニボルマブである。ＰＤ−Ｌ１を標的とする２つの抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブ、およびデュルバルマブである。チェックポイント阻害モノクローナル抗体の別のグループには、免疫系を下方制御するタンパク質受容体であるＣＴＬＡ−４を標的とする、イピリムマブおよびトレメリムマブが含まれる。

これらの抗がん剤も通常、全身的に使用される。これらの薬剤のパッケージラベルに記載されているＭＴＤも、前述のように、試験中に漸減されることが一般的な開始用量であり得る。

投薬
ＰＶ−１０併用全身性薬剤は、受容対象者によって必要とされるかまたは耐容される回数だけ投与することができる。小分子薬は通常、インビボ半減期が比較的短く、数分から数日である。一方、チェックポイント阻害抗体のインビボ半減期は、多くの場合１週間〜３週間である。

ローズベンガルのインビボでの生物学的耐用期間は、ラットでは数分であると理解されている。ただし、病巣内ＰＶ−１０投与は、Ｔ細胞性免疫の増強を誘導することが知られているため、ＰＶ−１０投与の効果は、メモリーＴ細胞を介して数ヶ月以上持続する可能性がある。

組成薬剤の半減期が様々であることから、最初にＰＶ−１０で治療し、次に１つまたは複数の併用薬剤で治療することが好ましい。併用薬剤は、誘導性免疫活性化が少なくとも開始し得るように、ＰＶ−１０投与の約１週間〜約４週間後に投与することが好ましい。

全身性抗がん剤による前治療も有用となり得る。この場合、全身性抗がん剤は、後のＰＶ−１０による治療によって増強される免疫反応を開始することができる。この時、最初の２つの治療の間の期間は、約１週間から約４週間であることも好ましい。

２つの薬剤は、ほぼ同時期に並行して投与することも可能であり、互いの約１週間以内に同時に投与することが可能である。

結果
ＰＶ−１０は小児固形腫瘍細胞株の成長を阻害する
ユーイング肉腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、正常線維芽細胞株、および正常初代骨髄サンプルを、様々な濃度のＰＶ−１０（３．１２５〜４００μＭ）で９６時間処理し、alamarBlue（登録商標）を使用して細胞生存率を測定することで（図１Ａ〜１Ｅ）、小児固形腫瘍に対するＰＶ−１０の効果を判定した。ＰＶ−１０は、試験を行ったすべての細胞株で濃度依存的に細胞生存率を低下させた。検査したすべての固形腫瘍細胞株についてＩＣ_５０値を算出した。以下の表１は、処理後９６時間のＰＶ−１０処理小児固形腫瘍細胞株の値を示す。表１に示される通り、値は４５〜１０８μＭの範囲であり、平均は７０μＭであった。

一方で、正常線維芽細胞株および正常初代骨髄サンプルのＩＣ_５０値はより高く、７３〜１４３μＭの範囲であり、平均は１０４μＭであった（下記の表２）。表２は、処理後９６時間のＰＶ−１０処理正常線維芽細胞株およびＰＶ−１０処理正常初代骨髄サンプルの半数阻害濃度（ＩＣ_５０）値を示す。

ＰＶ−１０は神経芽細胞腫細胞株に対して細胞毒性である
ＰＶ−１０が小児固形腫瘍細胞株に対して細胞毒性であることを特定した後、小児で最も一般的な頭蓋外がんであることから、神経芽細胞腫に着目した。ＰＶ−１０が神経芽細胞腫細胞株に対して細胞毒性または細胞増殖抑制性であるかを調べた。次の４つの異なる細胞株を研究のために選択した；すなわち、異なる変異を有するとともに、ＩＣ_５０値に基づいてＰＶ−１０に対する感受性が異なる３つの神経芽細胞腫細胞株［ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、およびＩＭＲ５］と、ＩＣ_５０値に基づいてＰＶ−１０に対する感受性が非常に高い神経上皮腫細胞株［ＳＫ−Ｎ−ＭＣ］１つとを選択した。

細胞をＰＢＳ（コントロール）、５０μＭのＰＶ−１０、または１００μＭのＰＶ−１０のいずれかで９６時間処理し、位相差光学顕微鏡解析により観察した（図２Ａ）。ＰＢＳで処理した細胞はコンフルエントになるまで成長した。５０μＭのＰＶ−１０で処理した細胞はコンフルエントになるまで成長しなかったが、死細胞はほとんど観察されなかった。

対照的に、１００μＭのＰＶ−１０による処理後には、プレートに付着した細胞はほとんどなく、１００μＭのＰＶ−１０がすべての細胞株に対して細胞毒性であったことを示している。ただし、ＰＶ−１０に対する感受性は細胞株によって異なるようであり、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞は処理に対して最も耐性があり、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞は処理に対して最も感受性が高かった。

神経芽細胞腫細胞株は、ＰＶ−１０に対して異なる感受性を示す
経時的顕微鏡動画解析を使用して、１００μＭのＰＶ−１０による処理の１２時間後、２４時間後、３６時間後、および４８時間後にプレートに付着していた細胞の割合を定量化することで、４つの細胞株（ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、ＩＭＲ５、およびＳＫ−Ｎ−ＭＣ）のＰＶ−１０に対する感受性の違いを調べた。処理後に付着していた細胞の数は、ゼロ時間での細胞数に対して正規化された（図２Ｂ）。

ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞は処理に対して最も耐性があり、１２時間後に細胞の８９％、４８時間後に細胞の４１％が付着していた。ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞は処理に対して最も感受性が高く、１２時間後に細胞の３．５％、４８時間後に細胞の０％が付着していた。ＩＭＲ５細胞は、１２時間後および２４時間後の時点（それぞれ細胞の１６％および７％が付着）では、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）細胞（細胞の５４％および１４％が付着）よりも処理に対する感受性が高かったが、３６時間後の時点までには、両方の細胞株において同様の割合の細胞が付着していた（ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）細胞の３％、ＩＭＲ５細胞の２％）。

これらのデータは、処理後の早い時期には、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞が処理に対して最も感受性が高く、ＩＭＲ５細胞はＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）細胞よりも処理に対して感受性が高く、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞は処理に対して最も耐性があったことを示した。

ＰＶ−１０による処理はリソソームを破壊する
以前に、ＰＶ−１０はリソソームの完全性の喪失を誘導することが示されていた［非特許文献６］。したがって、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）細胞、およびＩＭＲ５細胞を、ＰＢＳ（コントロール）または１００μＭのＰＶ−１０のいずれかで１６時間処理した。酸性の細胞小器官に濃縮されて蛍光を発する核酸染色剤であるHoechst 33342およびLysoTracker（登録商標）Green DND-26で生細胞を染色し、これらの細胞を蛍光顕微鏡解析により観察した（図３）。

ＰＢＳ処理細胞およびＰＶ−１０処理ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞では、リソソームが明確な病巣として視認された。しかし、ＰＶ−１０処理ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）細胞およびＰＶ−１０処理ＩＭＲ５細胞では、これらの病巣はもはや視認されなかった。

ＰＶ−１０処理は、細胞周期のＧ１期にあるＩＭＲ５細胞の割合を増加させる
細胞周期に対するＰＶ−１０の効果をフローサイトメトリにより解析し（図４Ａ）、ＰＶ−１０による標的調節をさらに解明した。最も耐性のある神経芽細胞腫細胞株（ＳＫ−Ｎ−ＡＳ）および最も感受性の高い神経芽細胞腫細胞株（ＩＭＲ５）を、ＰＢＳ（コントロール）、５０μＭのＰＶ−１０、または１００μＭのＰＶ−１０のいずれかで１６時間または２４時間処理した。

ＰＶ−１０は、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞の細胞周期に影響を与えなかった。対照的に、１００μＭのＰＶ−１０は、Ｇ１期のＩＭＲ５細胞の割合を増加させた。１６時間処理を行った群では、１００μＭのＰＶ−１０で処理した後のＧ１期のＩＭＲ５細胞の割合が、ＰＢＳで処理した細胞と比較して２８％増加した。同様に、２４時間処理を行った群では、１００μＭのＰＶ−１０で処理した後のＧ１期の細胞が、未処理の細胞と比較して３０％増加した。

ＰＶ−１０による処理はアポトーシスを誘導する
次に、ウエスタンブロット分析を実施して、ＰＶ−１０処理細胞がアポトーシスを起こしているかどうかを調べた。ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）細胞、ＩＭＲ５細胞、およびＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を、ＰＢＳ（コントロール）、７５μＭのＰＶ−１０、または１００μＭのＰＶ−１０のいずれかで２４時間処理した。全細胞抽出物をウエスタンブロットで分析して、総および切断ポリＡＤＰリボース（ＰＡＲＰ）、総および切断カスパーゼ３、総および切断カスパーゼ７、およびアクチン（ローディングコントロール）のレベルを検出した（図４Ｂ）。

ＰＶ−１０処理は、濃度依存的なＰＡＲＰの切断を示した。１００μＭのＰＶ−１０による処理は、すべての細胞株でＰＡＲＰの切断を誘導し、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞（ＰＶ−１０に対する感受性が最も高い細胞株）では総タンパク質のレベルおよび総ＰＡＲＰのレベルがより低かった。７５μＭのＰＶ−１０で処理したＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞およびＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）細胞では、１００μＭのＰＶ−１０で処理した細胞よりもＰＡＲＰの切断が少なかったのに対し、ＩＭＲ５細胞は、７５μＭおよび１００μＭのＰＶ−１０で処理した場合に、同様のレベルのＰＡＲＰの切断を示した。７５μＭのＰＶ−１０で処理したＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞では、１００μＭで処理した細胞と比較して、より多くの総ＰＡＲＰが存在していた。

カスパーゼ３、７、および９の活性化は、ＰＶ−１０の濃度と細胞株に依存していた。切断カスパーゼ３は、１００μＭのＰＶ−１０で処理したＩＭＲ５細胞中に存在していた。総カスパーゼ７のレベルは、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）細胞でより低かった。

ＩＭＲ５細胞およびＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を７５μＭのＰＶ−１０および１００μＭのＰＶ−１０の両方で処理し、切断カスパーゼ７は、１００μＭのＰＶ−１０で処理したＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞およびＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）細胞、ならびに７５μＭおよび１００μＭのＰＶ−１０で処理したＩＭＲ５細胞で検出された。総カスパーゼ９のレベルは、７５μＭおよび１００μＭのＰＶ−１０で処理したＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）細胞でより低く、切断カスパーゼ９は、７５μＭおよび１００μＭのＰＶ−１０で処理したＩＭＲ５細胞で検出された。これらのデータは、ＰＶ−１０がアポトーシスによる細胞死を誘導していたことを示した。

ＰＶ−１０は様々な抗がん剤と相乗的である
一般的に使用される小分子全身性抗がん剤のうち、ＰＶ−１０と組み合わせることで細胞毒性を高めることができるものを解明するために、まず、神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、およびＩＭＲ５、神経上皮腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ならびに正常線維芽細胞株ＢＪを、異なる作用機序を有する７つの従来の化学療法剤のパネルに対してスクリーニングした（図５）。すべての薬剤は、０．１μＭの単独で、および細胞毒性以下の濃度である５０μＭのＰＶ−１０との併用でスクリーニングされた。処理の９６時間後に、alamarBlue（登録商標）アッセイを使用して細胞生存率を判定した。

これらの結果に基づいて、組み合わせたときに細胞毒性が最も増加し、かつＢＪ細胞への影響がより少なかった薬剤を、組み合わせ指数（ＣＩ）と相乗効果を判定するためのさらなる研究のために選択した［非特許文献１８］。ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）細胞、ＩＭＲ５細胞、およびＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞においてＣＩ研究のために評価された薬剤は、ドキソルビシン、エトポシド、およびビンクリスチンであった。

以下の表３は、ドキソルビシン、エトポシド、またはビンクリスチンのいずれか単独で、または５０μＭのＰＶ−１０との併用で９６時間処理した神経芽細胞腫細胞株（ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、およびＩＭＲ５）および神経上皮腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣについての組み合わせ指数を示す。

測定を行った各細胞株において、すべての薬剤が５０μＭのＰＶ−１０との相乗作用を示した。表３に示される通り、ＣＩ値の範囲はドキソルビシンで０．４２〜０．７７、エトポシドで０．１７〜０．６６、ビンクリスチンで０．１〜０．４３であった。

ＰＶ−１０は神経芽細胞腫細胞株において放射線感受性を誘導する
一般的に使用される化学療法に加えて、ＰＶ−１０がＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞（図６Ａ）およびＩＭＲ５細胞（図６Ｂ）において電離放射線（ＩＲ）による治療の効果を増強するかどうかを調べた。細胞をＰＢＳ（コントロール）または５０μＭのＰＶ−１０のいずれかで４時間前処理し、次に０．５、１、または２グレイ（Ｇｙ）のいずれかの放射線を細胞に照射した。最初の処理の９６時間後に、細胞生存率をalamarBlue（登録商標）で測定した。

５０μＭのＰＶ−１０による前処理は、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞とＩＭＲ５細胞の両方でＩＲの効果を増強した。ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞の場合、細胞をＰＶ−１０で４時間前処理した後に０．５Ｇｙ、１Ｇｙ、または２Ｇｙのいずれかの放射線を照射すると、細胞生存率はそれぞれ５４．８％、５８．７％、および６０％低下した。ＩＭＲ５細胞の場合、細胞をＰＶ−１０で４時間前処理した後に０．５Ｇｙ、１Ｇｙ、または２Ｇｙのいずれかの放射線を照射すると、細胞生存率はそれぞれ２４％、２１％、および１３％低下した。

ＰＶ−１０はインビボで腫瘍退縮を誘導する
ＰＶ−１０がインビボでも活性であるかどうかを判断するために、ＣＢ１７ＳＣＩＤマウスの皮下ＳＫ−Ｎ−ＡＳ腫瘍および皮下ＩＭＲ腫瘍に対するＰＶ−１０腫瘍内注射の効果を特徴づけた。２５μｌまたは５０μｌのＰＶ−１０を腫瘍に１回注射し［非特許文献８］、毎日観察した。

ＩＭＲ５腫瘍は、ＰＶ−１０による処理に対して非常に感受性が高かった（図７Ａおよび７Ｂ）。コントロール腫瘍の場合、腫瘍サイズは、処理後である６日目の２５．６ｍｍ^２から処理後である２３日目の１７２．９ｍｍ^２まで増大した。一方で、２５μｌのＰＶ−１０で処理した腫瘍は、２６．６ｍｍ^２から４１．２ｍｍ^２まで増大し、５０μｌのＰＶ−１０で処理した腫瘍は、２７．９ｍｍ^２から４７．３ｍｍ^２まで増大した。Ｄ−ルシフェリンの腹腔内注射後に腫瘍から放出される生物発光シグナルを測定するXenogen IVIS（登録商標）200システムを使用して、腫瘍の成長の定量化も行った。

腫瘍サイズは、２５μｌおよび５０μｌのＰＶ−１０による処理後に縮小し、処理後１７日目の時点で小さいままであった。ＰＶ−１０による処理は、生存率も用量依存的に向上させた（図７Ｃ）。

コントロール処理マウスの生存期間中央値は２５．５日であったのに対し、２５μｌのＰＶ−１０処理マウスは中央値として４１．５日生存し、５０μｌのＰＶ−１０処理マウスは中央値として７６日生存した。さらに、５０μｌのＰＶ−１０で処理したマウスのうちの２匹は完全な腫瘍退縮を起こし、処理後１２０日間腫瘍がないままであった。

ＳＫ−Ｎ−ＡＳ腫瘍もＰＶ−１０による処理に反応した（図７Ｄおよび７Ｅ）。コントロール腫瘍の場合、腫瘍サイズは、処理後６日目の２８．９ｍｍ^２から処理後１８日目の１７９．３ｍｍ^２まで増大した。一方で、２５μｌのＰＶ−１０で処理した腫瘍は、２５．３ｍｍ^２から９２．１ｍｍ^２まで増大し、５０μｌのＰＶ−１０で処理した腫瘍は、２９．３ｍｍ^２から５７．５ｍｍ^２まで増大した。Xenogen IVIS（登録商標）200システムを使用して測定したところ、腫瘍サイズは２５μｌおよび５０μｌのＰＶ−１０による処理後に縮小し、処理後１５日目の時点でコントロール処理腫瘍よりも小さいままであった。

ＰＶ−１０による処理は生存率も向上させた（図７Ｆ）。コントロール処理マウスの生存期間中央値は２９日であったのに対し、２５μｌのＰＶ−１０処理マウスは中央値として３７日生存し、５０μｌのＰＶ−１０処理マウスは中央値として３６日生存した。さらに、５０μｌのＰＶ−１０で処理したマウスのうちの１匹は完全な腫瘍退縮を起こし、処理後８０日間腫瘍がないままであった。

考察
小児固形腫瘍の小児の全生存率は、血液悪性腫瘍の小児の全生存率よりも低い［非特許文献１］。再発または転移性のユーイング肉腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、および横紋筋肉腫の小児の全生存率は、３０％未満である［非特許文献１］。

これらのがんのうち、神経芽細胞腫は最も一般的であり、１歳〜４歳の小児の主要な死因である［非特許文献２］。小児固形腫瘍患者の生存率が低いこと、および、高リスク患者ならびに再発患者に投与される集中的な治療レジメンに関連する副作用（ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）を考慮すると、これらのがん患者のための新しい治療アプローチおよび初期段階の臨床試験の開発が緊急に必要とされている。

ＰＶ−１０は、０．９％生理食塩水中のローズベンガル（ＲＢ、４，５，６，７−テトラクロロ−２’，４’，５’，７’−テトラヨードフルオレセイン二ナトリウム）の１０％無菌溶液であり、様々な成人がんで細胞死を誘導するが、小児がんでの使用についてはこれまで検討されていない［非特許文献７〜１１］。ＰＶ−１０は様々な成人がんで細胞死を誘導し、いくつかの臨床試験で評価されているため［非特許文献１０、１２、１４、１５、１６］、様々な小児固形腫瘍細胞株（ユーイング肉腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、および横紋筋肉腫）に対するＰＶ−１０の効果を調べた。

ＰＶ−１０は、濃度依存的に小児固形腫瘍細胞株の細胞生存率を低下させた。予想通り、正常線維芽細胞株および初代骨髄サンプルは、ＰＶ−１０に対する感受性がより低かった。これらのデータは、以前に発表された成人がんに関するデータ［非特許文献７、９、１１］と類似しており、ＰＶ−１０が複数の小児固形腫瘍に対して効果的な治療法となり得ることを示している。

ＰＶ−１０による標的調節を特徴づけるために、これらの研究では、小児に見られる最も一般的な頭蓋外固形悪性腫瘍である神経芽細胞腫、および密接に関連する神経上皮腫に焦点を合わせた。位相差顕微鏡解析により、ＰＶ−１０は神経芽細胞腫細胞に対して細胞毒性であることがわかり、また、ＩＣ_５０値と合致して、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞がＰＶ−１０処理に対して最も耐性があり、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞がＰＶ−１０処理に対して最も感受性が高いことが確認された。これらの発見は、経時的顕微鏡動画解析によって検証され、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞が処理に対して最も耐性があり、ＳＫ−Ｎ−ＭＣが処理に対して最も感受性が高いことが再び示された。

さらに、ＩＭＲ５細胞は、１２時間後および２４時間後の時点ではＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）細胞よりも処理に対する感受性が高いことがわかったが、３６時間後の時点までには、どちらのタイプの細胞もほとんど残っていなかった。初期においては１００μＭのＰＶ−１０に対する感受性に違いがあるものの、この濃度は９６時間後の時点でほとんどのＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞に対して依然として細胞毒性であり、２００μＭに用量を増やすことでＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞死がさらに増加した。これらのデータは、一部のサブタイプに対しては用量を増やす必要があり得るものの、ＰＶ−１０はすべての神経芽細胞腫に対して効果的な治療法となり得ることを示唆している。

ＰＶ−１０に対する感受性の違いは、細胞株の遺伝的背景の違い、および細胞株が単離された腫瘍の過程の違い（患者に対する治療の違い、および原発性であるか再発性であるか）に起因する可能性がある。神経芽細胞腫は遺伝的に不均一な疾患であり、その不均一性を反映するために様々な細胞株を選択した。

神経芽細胞腫で最も一般的な発がん原因は、患者の約２５％に見られるＭＹＣＮ増幅、患者の約１０％〜１５％に見られる未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）変異および増幅、ならびに再発時に獲得したＴＰ５３の変異である［非特許文献２］。がん関連体細胞変異データベース（ＣＯＳＭＩＣ）の細胞株プロジェクト［非特許文献２０］を使用して、以下のことが決定された：ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞はＮＲＡＳおよびＦＬＴ３に変異を有していた；ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）のクローンは、ＴＰ５３のホモ接合変異とともに、ＡＬＫ、ＡＫＴ、およびＭＹＣＮを過剰発現していた；ＩＭＲ５細胞は、ｍＴＯＲのホモ接合変異とともにＡＫＴおよびＭＹＣＮの過剰発現を示した；ＳＫ−Ｎ−ＭＣのクローンは、ＭＹＣＮの過剰発現およびＴＰ５３のヘテロ接合変異を示した。さらに、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞株、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）細胞株、およびＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞株はすべて、治療歴の異なる転移性腫瘍に由来していた一方で、ＩＭＲ５細胞株は原発性腫瘍に由来していた。

ＰＶ−１０はリソソームを破壊することによって作用し、細胞死を引き起こすことがこれまでに示されている［非特許文献６］。がん細胞では代謝が変化しており、急速な成長および分裂の産物である凝集タンパク質や損傷した細胞小器官などの除去、および栄養素のリサイクルをリソソームに依存している可能性があるため、リソソームの破壊は、がん細胞の生存に特に影響を及ぼす［非特許文献２１］。さらに、リソソームの破壊により、壊死またはアポトーシスの誘導を引き起こし得るカテプシンプロテアーゼが放出される［非特許文献２１］。

神経芽細胞腫でのリソソームに対するＰＶ−１０の効果を調べるために、酸性の細胞小器官に濃縮されて蛍光を発するLysoTracker（登録商標）Green DND-26で染色された細胞を観察した。以前の結果と同様に、リソソームはＰＢＳ処理細胞では明確な病巣として現れたが、ＰＶ−１０で処理したＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）細胞およびＩＭＲ５細胞ではリソソームは存在しないことが確認された。興味深いことに、より耐性のあるＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞では、リソソームは処理後でも破壊されずに明確な病巣として現れた。

１００μＭのＰＶ−１０による処理は、ＩＭＲ５細胞ではＧ１期の細胞周期停止を誘導したが、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞では誘導せず、また用量依存的および細胞株依存的にアポトーシスを誘導した。成人のがんでは、ＰＶ−１０はアポトーシスまたは壊死のいずれかによって細胞死を誘導することが以前に示されている［非特許文献７、９、１１、１４］。細胞が壊死によって死ぬことを確認した研究では、ＰＶ−１０は細胞死の前にＧ２期／Ｍ期の細胞周期停止を誘導しており［非特許文献７］、ＰＶ−１０は異なるがん由来の細胞株に対して異なる作用機序を有している可能性があることを示唆している。

単剤ＰＶ−１０による治療は、成人腫瘍を対象とした臨床試験および前臨床試験で有効性が実証されているが、高リスク神経芽細胞腫患者は、再発後は複数の化学療法および放射線療法で治療されている［非特許文献２］。したがって、一般的に使用される化学療法剤との併用治療レジメンにおけるＰＶ−１０の使用可能性を調べた。

最初のスクリーニングの後、細胞毒性以下の用量のＰＶ−１０（５０μＭ）は、研究を行ったすべての細胞株において、ドキソルビシン、エトポシド、およびビンクリスチンと相乗的であることが判明した。さらに、放射線照射前にＰＶ−１０で前処理を行ったところ、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞およびＩＭＲ５細胞の両方において放射線治療の有効性が向上した。これらのデータは、第ＩＩ相臨床試験において、悪性黒色腫患者に対するＰＶ−１０での前治療およびその後の放射線療法が、細胞毒性を大幅に増加させることなく腫瘍退縮を誘導したという以前のデータと一致している［非特許文献１３］。これらの結果は、ＰＶ−１０を様々な一般的に使用される治療法と効果的に組み合わせることで、再発性神経芽細胞腫を有する高リスクの患者に利益をもたらすことができることを示している。

ＰＶ−１０がインビトロで小児固形腫瘍細胞株に対して細胞毒性であることを確認した後、マウスの皮下神経芽細胞腫異種移植片を使用して、インビボでのＰＶ−１０の活性を調べた。薬理学的に適切な用量［非特許文献１２、１３、１６］のＰＶ−１０は、用量依存的および腫瘍依存的に腫瘍の退縮を誘導し、生存率を向上させることが判明した。２５μｌおよび５０μｌのＰＶ−１０の病巣内注射は、早期腫瘍退縮を誘導し、５０μｌのＰＶ−１０は、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ腫瘍またはＩＭＲ５腫瘍のいずれかを有するマウスの全生存率を向上させた。これらのデータは、ＰＶ−１０の腫瘍内注射が皮下同系結腸腫瘍［非特許文献７］、同系皮下乳房腫瘍および悪性黒色腫［非特許文献１４、８］の退縮を誘導した、動物モデルを使用した以前の研究のデータと類似している。

要約すると、本研究は、小児固形腫瘍（ユーイング肉腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、および横紋筋肉腫）を良好に治療する際のＰＶ−１０の有効性に関する前臨床概念実証データを提供する。神経芽細胞腫に焦点を当てることにより、ＰＶ−１０はリソソームを破壊し、細胞周期のＧ１期で細胞を停止させ、アポトーシスを誘導することによって作用することが判明している。一般的に使用される治療法のうち、ＰＶ−１０が相乗作用を示す治療法がいくつか特定されている。さらに、神経芽細胞腫異種移植マウス研究を使用して、インビボでのＰＶ−１０治療の有効性が実証されている。

代表的な細胞株およびインビボ免疫不全マウスで得られた発見により、直接的な細胞毒性の可能性に関する証拠がもたらされるとともに、この薬剤ががん細胞において標的調節効果を誘導することができるメカニズムが解明されている。組み合わせることで治療の相乗効果を生み出すことができる薬剤も特定されており、初期段階の臨床試験を策定するための枠組みを提供している。これは、前述の予期された免疫刺激効果に加えて、ＰＶ−１０中心レジメンを免疫チェックポイント阻害剤などの薬剤と組み合わせることで、再発または難治性の小児固形腫瘍の患者における薬剤の活性をさらに高めることができるという潜在的なアプローチの根拠を提供している。

材料および方法
細胞株および組織の培養
細胞株（ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、ＩＭＲ５、ＬＡＮ１、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＨＥＰ、ＢＪ、ＢＪｈＴＥＲＴ、ＷＩ３８、ＷＩ３８ｈＴＥＲＴ、Ｈｓ６８ｈＴＥＲＴ、ＲＤ、ＲＨ３０、１４３Ｂ、ＨＯＳ、ＳＫ−ＥＳ、およびＳＫ−ＰＮ−ＤＷ）は、５％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Gibco、オンタリオ州、カナダ）、１００ユニット／ｍｌペニシリン、および１００ユニット／ｍｌストレプトマイシン（Gibco）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Gibco）で培養した。細胞培養物は、５％ＣＯ_２の加湿インキュベータ内で３７℃に維持した。初代骨髄サンプルは、地域の研究倫理委員会（ＲＥＢ）による承認および書面によるインフォームドコンセントを得た後に採取した（倫理ＩＤ＃１７１８４）。これまでに記載されているように［非特許文献１７］、Ficoll-Paque Plus（ＧＥヘルスケアライフサイエンス、オンタリオ州、カナダ）を使用した密度勾配遠心分離により、骨髄サンプルからリンパ球を分離した。

材料および試薬
ＰＶ−１０（０．９％生理食塩水中のローズベンガル二ナトリウムの１０％溶液）は、プロヴェクタスバイオファーマスーティカルズインク．（ノックスヴィル、テネシー州、ＵＳＡ）から提供を受けて、室温で暗所に保管した。ドキソルビシン、エトポシド、ビンクリスチン、シスプラチン、ＰＥＧアスパラギナーゼ、イリノテカン、およびシタラビンのストック溶液は、アルバータ州立小児病院の薬局（カルガリー、アルバータ州、カナダ）から入手し、室温で暗所に保管した。その後の研究のために、薬品は添加剤含有ＤＭＥＭで適切な濃度に希釈した。

細胞毒性アッセイ
９６ウェルプレート（Greiner Bio-One、ノースカロライナ州、ＵＳＡ）の各ウェルに、１００μｌのＤＭＥＭ中の５×１０^３細胞を播種し、２４時間培養した。単独のＰＶ−１０またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１３７ｍＭＮａＣｌ、２．７ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、１．８ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．２５）（コントロール）をＤＭＥＭで希釈し、１００μｌを各ウェルに添加して処理を行った。各処理で添加した薬剤の最終濃度は３．１２５〜４００μＭの範囲であり、各処理は３回ずつ行われた。

プレートを９６時間培養した。ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、２００μｌの新鮮なＤＭＥＭを各ウェルに添加し、alamarBlue（登録商標）（Invitrogen、オンタリオ州、カナダ）を製造元の指示に従って使用して細胞毒性アッセイを行い、細胞生存率を評価した。CompuSynソフトウェア（ComboSyn Inc.）を使用して、半数阻害濃度（ＩＣ_５０）を算出した。

光学顕微鏡解析
６ウェルプレート（Corning Inc.、ニューヨーク州、ＵＳＡ）の各ウェルに２×１０^５細胞を播種し、２４時間培養した。細胞をＰＢＳ（コントロール）またはＰＶ−１０のいずれかで処理し、９６時間培養した。Zeiss AxioVision Se64ソフトウェアを使用して、Zeiss AxioCam MRm Rev.3 FireWireカメラを備えたZeiss Axiovert 200M顕微鏡で位相差画像を撮像した。Adobe Photoshop（Adobe Creative Cloud 2017）を使用して画像の処理を行った。

経時的顕微鏡動画解析
９６ウェルプレート（Greiner Bio-One）の各ウェルに５×１０^３細胞を播種し、２４時間培養した。細胞をＰＢＳ（コントロール）またはＰＶ−１０のいずれかで処理した。IncuCyte（登録商標）Zoom顕微鏡およびIncuCyte（登録商標）Zoomソフトウェア（エッセンバイオサイエンス、ミシガン州、ＵＳＡ）を使用して、３７℃、５％ＣＯ_２の加湿インキュベータ内で、ウェルあたり３枚の画像を３０分ごとに４８時間撮像した。ImageJソフトウェアを使用して各ウェルの細胞数を計測し、０時間での細胞数に対して正規化した。各実験の各処理ごとに、少なくとも３５０個の細胞を計測した。

リソソームの検出および蛍光顕微鏡解析
６ウェルプレート（Corning）内の滅菌カバースリップ上に、未処理細胞の場合は２×１０^５細胞／ウェル、処理細胞の場合は６×１０^５細胞／ウェルで細胞を播種し、２４時間培養した。細胞をＰＢＳ（コントロール）またはＰＶ−１０のいずれかで１６時間処理した。ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、２．５μｇ／ｍｌのHoechst 33342染色剤（Invitrogen）を含む２ｍｌのＤＭＥＭを各ウェルに添加した。細胞を３７℃で１０分間インキュベートした後、LysoTracker（登録商標）Green DND-26（Invitrogen）を最終濃度５００ｎＭで培地に添加した。細胞を３７℃で１５分間インキュベートし、撮像時にカバースリップをスライドガラス上に載せ、Zeiss AxioVision Se64ソフトウェアを使用して、Zeiss AxioCam MRm Rev.3 FireWireカメラを備えたZeiss Axiovert 200M顕微鏡で撮像を行った。Adobe Photoshop（Adobe Creative Cloud 2018）を使用して画像の処理を行った。

フローサイトメトリ
細胞周期の変化を分析するために、細胞を１００ｍｍディッシュ（Corning）に播種して、処理後に最低２×１０^６細胞を収集できるようにした。細胞を２４時間培養し、ＰＢＳ（コントロール）またはＰＶ−１０のいずれかで処理し、１６時間または２４時間培養した。細胞をトリプシン処理によって収集し、ＰＢＳで洗浄し、４０μｍナイロンセルストレーナ（Falcon、Corning、ニューヨーク州、ＵＳＡ）でろ過し、トリパンブルー染色を使用して血球計算盤により細胞数を計測し、０．９％（ｗ／ｖ）滅菌ＮａＣｌに再懸濁し、氷冷９０％（ｖ／ｖ）エタノールで固定した。サンプルを室温で３０分間インキュベートした後、−２０℃で保管した。

分析のために、サンプルを１４００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。次に、細胞を３００μｌの標識緩衝液（０．１％Triton X-100含有ＰＢＳ中に、１０μｇ／ｍｌＤＡＰＩ（Sigma、オンタリオ州、カナダ）および２００μｇ／ｍｌＲＮａｓｅＡ（Sigma）を含有）中、３７℃で２０分間インキュベートした。Diva 6.1.3ソフトウェア（BD Bioscience）を使用して、BD Bioscience LSR IIサイトメータでサンプルを解析した。ModFitLT（登録商標）3.3ソフトウェア（Verity Software House）を使用して結果を分析した。

細胞抽出物の調製
細胞を１００ｍｍディッシュ（Corning）に１×１０^６で播種し、２４時間培養した。次に、細胞をＰＢＳ（コントロール）またはＰＶ−１０のいずれかで処理し、２４時間培養した。細胞培養物から培地を回収し、細胞をＰＢＳで洗浄して、トリプシン処理後に収集した。細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、１２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。上清を除去し、１％（ｖ／ｖ）ホスファターゼ阻害剤（Sigma）および１％（ｖ／ｖ）プロテアーゼ阻害剤（Sigma）を添加した放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０、０．５％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム、０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））にペレットを再懸濁した。サンプルを１．５ｍｌチューブに移し、氷上で１０分間インキュベートし、ボルテックスし、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を全細胞溶解液として収集し、すぐに使用するか、または−２０℃で保管した。

ウエスタンブロット
これまでに記載された通りの方法で［非特許文献１７］ウエスタンブロットを行った。簡単に説明すると、Trans-Blot（登録商標）Turbo（商標）Transfer System（BioRad、ケベック州、カナダ）を使用してタンパク質をニトロセルロース膜に転写し、ポンソーＳ染色液（５％（ｖ／ｖ）酢酸中０．１％（ｗ／ｖ））を使用して転写を確認し、０．１％（ｖ／ｖ）Tween（登録商標）-20を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ；５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）Tween（登録商標）-20）中の５％脱脂粉乳で、膜を室温で２時間ブロッキングした。次に、ＴＢＳ−Ｔ中の５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳で希釈した下記の一次抗体とともに、膜を４℃で一晩（約１８時間）インキュベートした：抗ＰＡＲＰ抗体（１：３０００、Cell Signaling、9542S）、抗カスパーゼ３抗体（１：５００、Cell Signaling、9662S）、抗カスパーゼ７抗体（１：１０００、Cell Signaling、9492S）、抗カスパーゼ９抗体（１：１０００、Cell Signaling、9502S）、および抗βアクチン抗体（１：５０００、Cell Signaling、8457L）。膜をＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、抗ウサギ二次抗体（１：３０００、Cell Signaling、7074S）と共にインキュベートし、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、Western Lightning Plus-ECL試薬（Perkin-Elmer、MA、USA）で２分間インキュベートし、ChemiDoc MP Imaging System（BioRad）の化学発光設定を使用して現像した。

組み合わせスクリーニング
細胞毒性アッセイの項目で記載した方法にて細胞を培養した。試験薬剤（ドキソルビシン、エトポシド、ビンクリスチン、シスプラチン、ＰＥＧアスパラギナーゼ、イリノテカン、シタラビン）を、ＰＢＳ（コントロール）またはＰＶ１０（最終５０μＭ）のいずれかを含む培地で最終濃度０．１μＭにて調製した。細胞に対し３回処理を行った。細胞毒性アッセイの項目で記載した方法にて、プレートを培養し、洗浄し、細胞生存率をalamarBlue（登録商標）で解析した。

組み合わせ研究
細胞毒性アッセイの項目で記載した方法にて細胞を培養した。３つの試験薬剤（ドキソルビシン、エトポシド、ビンクリスチン）の希釈系列を、ＰＢＳ（コントロール）またはＰＶ１０（最終５０μＭ）のいずれかを含むＤＭＥＭで調製し、細胞に３回添加した。細胞毒性アッセイの項目で記載した方法にて、プレートを培養し、洗浄し、細胞生存率をalamarBlue（登録商標）で解析した。CompuSynソフトウェア（ComboSyn Inc.）を使用して、５０μＭのＰＶ−１０と組み合わせた試験薬剤のＩＣ_５０に基づく組み合わせ指数（ＣＩ）を算出した。ＣＩ値を以下の基準に従って評価した：ＣＩ＜１は相乗的活性を示し、ＣＩ＝１は相加的活性を示し、ＣＩ＞１は相乗的活性を示した［非特許文献１８］。

放射線感受性アッセイ
細胞を６０ｍｍディッシュ（Corning）に５×１０^４で播種し、２４時間インキュベートし、ＰＢＳ（コントロール）または５０μＭのＰＶ−１０のいずれかで処理し、３７℃で４時間インキュベートした。Gammacell（登録商標）1000 Elite（MDS Nordion、オンタリオ州、カナダ）を使用して、細胞に０．５、１、または２グレイ（Ｇｙ）のいずれかの放射線を照射し、９２時間培養した。処理は３回行った。細胞毒性アッセイの項目で記載したように、ディッシュをＰＢＳで２回洗浄し、細胞生存率をalamarBlue（登録商標）で解析した。

インビボ異種移植モデル
動物に対するすべての処置は、カナダ動物管理協会のガイドライン、および実験動物の管理および使用に関するＮＩＨガイドラインに従って行われた。すべての実験計画は、カルガリー大学の動物管理委員会によって検討および承認された（計画承認番号：ＡＣ１６−０２４３）。

本動物実験では、ＩＭＲ５−ｍＣｈｅｒｒｙＦｌｕｃ細胞およびＳＫ−Ｎ−ＡＳ−ｍＣｈｅｒｒｙＦｌｕｃ細胞を使用した。これらの細胞株は、マウス幹細胞ウイルス（ｍｓｃｖ）由来の内部Ｕ３領域、増強ホタルルシフェラーゼ（ｅｆｆＬｕｃ）、脳心筋炎ウイルス（ｅｍｃｖ）由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）要素、およびｍＣｈｅｒｒｙをコードする自己不活化レンチウイルスベクター上の増強ホタルルシフェラーゼおよびｍＣｈｅｒｒｙを安定して発現した。

６〜８週齢の雌ＣＢ１７ＳＣＩＤマウス（Charles River Laboratories、ケベック州、カナダ）の右脇腹に、０．１ｍｌのMatrigel（登録商標）Matrix（Fischer Scientific、オンタリオ州、カナダ）に懸濁した２．５×１０^６細胞（ＳＫ−Ｎ−ＡＳｍＣｈｅｒｒｙＦｌｕｃまたはＩＭＲ５ｍＣｈｅｒｒｙＦｌｕｃ）を皮下注射した（０日目）。腫瘍注射の７日後、少なくとも５×５ｍｍの検出可能な腫瘍成長を示した動物を無作為に複数の処理グループに分けた。以前に確立されたプロトコル［非特許文献８］に従って、各グループを５０μｌのＰＢＳ（コントロール）、５０μｌのＰＶ−１０、または２５μｌのＰＶ−１０のいずれかで腫瘍内（病巣内）注射により処理した。動物を毎日観察し、腫瘍面積をノギスで測定した。腫瘍が既定のエンドポイントである１５×１５ｍｍに達した時点で、マウスを安楽死させた。腫瘍のないままであった動物は、処理後１２０日間飼育された。

Xenogen IVIS（登録商標）200システム（Xenogen Corporation、カリフォルニア州、ＵＳＡ）を使用した腫瘍の成長の観察も行われた。Ｄ−ルシフェリン（Gold Biotechnology、ミズーリ州、ＵＳＡ）の腹腔内注射後、腫瘍から放出される生物発光シグナルを記録するためにマウスを画像化した。データは、確立された方法［非特許文献１９］に従って、対象領域の総放射光子束（光子／秒）を特定することによって分析した。

引用文献
１．Chen X, Pappo A, Dyer MA. Pediatric solid tumor genomics and developmental pliancy. Oncogene. 2015;34:5207. doi: 10.1038/onc.2014.474.
２．Moreno L, Caron H, Geoerger B, Eggert A, Schleiermacher G, Brock P et al. Accelerating drug development for neuroblastoma - New Drug Development Strategy: an Innovative Therapies for Children with Cancer, European Network for Cancer Research in Children and Adolescents and International Society of Paediatric Oncology Europe Neuroblastoma project. Expert opinion on drug discovery. 2017;12(8):801-11. doi: 10.1080/17460441.2017.1340269.
３．Cheung N-KV, Dyer MA. Neuroblastoma: Developmental Biology, Cancer Genomics, and Immunotherapy. Nature reviews Cancer. 2013;13(6):397-411. doi: 10.1038/nrc3526.
４．Park JR, Bagatell R, London WB, Maris JM, Cohn SL, Mattay KK et al. Children's Oncology Group's 2013 blueprint for research: neuroblastoma. Pediatric blood ＆ cancer. 2013;60(6):985-93. doi: 10.1002/pbc.24433.
５．Yvart J, Moati F, Alvarez F. Odievre M. Degrez A. ¹³¹ I Rose Bengal: Its Use in the Evaluation of Infantile Jaundice. European Journal of Nuclear Medicine. 1981; 6:355-359.
６．Wachter, E., Dees, C., Harkins, J., Fisher, W., Scott, T. 2002. Functional imaging of photosensitizers using multiphoton microscopy. Proceedings of SPIE, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences II, Periasamy, A. and So, P.T.C. (eds), Bellingham, Washington: 4620: 143-147.
７．Qin J, Kunda N, Qiao G, Calata JF, Pardiwala K, Prabhakar BS et al. Colon cancer cell treatment with Rose Bengal generates a protective immune response via immunogenic cell death. Cell Death &Amp; Disease. 2017;8:e2584. doi: 10.1038/cddis.2016.473
８．Toomey P, Kodumudi K, Weber A, Kuhn L, Moore E, Sarnaik AA et al. Intralesional Injection of Rose Bengal Induces a Systemic Tumor-Specific Immune Response in Murine Models of Melanoma and Breast Cancer. PLoS ONE. 2013;8(7):e68561. doi: 10.1371/journal.pone.0068561.
９．Koevary SB. Selective toxicity of Rose Bengal to ovarian cancer cells in vitro. International journal of physiology, pathophysiology and pharmacology. 2012;4(2):99-107.
１０．Thompson JF, Hersey P, Wachter E. Chemoablation of metastatic melanoma using intralesional Rose Bengal. Melanoma research. 2008;18(6):405-11. doi: 10.1097/CMR.0b013e32831328c7.
１１．Zamani Taghizadeh Rabe S, Mousavi SH, Tabasi N, Rastin M, Zamani Taghizadeh Rabe S, Siadat Z et al. Rose Bengal suppresses gastric cancer cell proliferation via apoptosis and inhibits nitric oxide formation in macrophages. Journal of immunotoxicology. 2014;11(4):367-75. doi: 10.3109/1547691x.2013.853715.
１２．Thompson JF, Agarwala SS, Smithers BM, Ross MI, Scoggins CR, Coventry BJ et al. Phase 2 Study of Intralesional PV-10 in Refractory Metastatic Melanoma. Annals of surgical oncology. 2015;22(7):2135-42. doi: 10.1245/s10434-014-4169-5.
１３．Foote M, Read T, Thomas J, Wagels M, Burmeister B, Smithers BM. Results of a phase II, open-label, non-comparative study of intralesional PV-10 followed by radiotherapy for the treatment of in-transit or metastatic melanoma. Journal of surgical oncology. 2017;115(7):891-7. doi:10.1002/jso.24580.
１４．Liu H, Innamarato PP, Kodumudi K, Weber A, Nemoto S, Robinson JL et al. Intralesional Rose Bengal in melanoma elicits tumor immunity via activation of dendritic cells by the release of high mobility group box 1. Oncotarget. 2016;7(25):37893-905. doi: 10.18632/oncotarget.9247.
１５．Lippey J, Bousounis R, Behrenbruch C, McKay B, Spillane J, Henderson MA et al. Intralesional PV-10 for in-transit melanoma-A single-center experience. Journal of surgical oncology. 2016;114(3):380-4. doi: 10.1002/jso.24311.
１６．Ross MI. Intralesional therapy with PV-10 (Rose Bengal) for in-transit melanoma. Journal of surgical oncology. 2014;109(4):314-9. doi: 10.1002/jso.23554.
１７．Jayanthan A, Ruan Y, Truong TH, Narendran A. Aurora kinases as druggable targets in pediatric leukemia: heterogeneity in target modulation activities and cytotoxicity by diverse novel therapeutic agents. PLoS One. 2014;9(7):e102741. doi: 10.1371/journal.pone.0102741.
１８．Chou T-C. Drug Combination Studies and Their Synergy Quantification Using the Chou-Talalay Method. Cancer Research. 2010;70(2):440.
１９．Lun X, Ruan Y, Jayanthan A, Liu DJ, Singh A, Trippett T et al. Double-deleted vaccinia virus in virotherapy for refractory and metastatic pediatric solid tumors. Molecular oncology. 2013;7(5):944-54. doi: 10.1016/j.molonc.2013.05.004.
２０．Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC). https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic. 検索日：２０１７年１０月３０日
２１．Fennelly C, Amaravadi RK. Lysosomal Biology in Cancer. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). 2017;1594:293-308. doi: 10.1007/978-1-4939-6934-0_19.

Claims

腫瘍細胞のアブレーションを誘発する量のハロゲン化キサンテンまたはその薬学的に許容される塩を病巣内に投与することを含む、哺乳動物対象の小児がん性固形腫瘍を治療する方法。
前記ハロゲン化キサンテンの分子はローズベンガル二ナトリウムである、請求項１に記載の方法。
前記哺乳動物はヒトである、請求項１に記載の方法。
（１）腫瘍細胞のアブレーションを誘発する量のハロゲン化キサンテンまたはその薬学的に許容される塩を病巣内に投与すること、および（２）前記ハロゲン化キサンテンと相乗的な細胞毒性を提供する、腫瘍抑制に有効な量の全身性抗がん剤を投与することを含む、哺乳動物対象の小児がん性固形腫瘍を治療する方法。
前記全身性抗がん剤は、小分子、タンパク性分子、電離放射線療法、およびチェックポイント阻害抗体からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
前記小分子の抗がん剤は細胞の有糸分裂を阻害する、請求項５に記載の方法。
前記タンパク性分子の抗がん剤は炎症性ケモカイン活性を阻害する、請求項５に記載の方法。
前記チェックポイント阻害抗体は、ＰＤ−１受容体、ＰＤ−Ｌ１リガンド、またはＣＴＬＡ−４受容体を阻害する、請求項５に記載の方法。
前記全身性抗がん剤は電離放射線によって提供される、請求項４に記載の方法。
前記ハロゲン化キサンテンの分子はローズベンガル二ナトリウムである、請求項４に記載の方法。
前記ハロゲン化キサンテンまたはその薬学的に許容される塩の病巣内投与は、前記全身性抗がん剤の投与の前に行われる、請求項４に記載の方法。
前記ハロゲン化キサンテンまたはその薬学的に許容される塩の病巣内投与は、前記全身性抗がん剤の投与の後に行われる、請求項４に記載の方法。
前記ハロゲン化キサンテンまたはその薬学的に許容される塩の病巣内投与は、前記全身性抗がん剤の投与と同時に行われる、請求項４に記載の方法。
前記哺乳動物はヒトである、請求項４に記載の方法。