CN115916343A - 卤代呫吨在肿瘤学和病毒学中的新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种治疗哺乳动物受试者的病毒感染的方法，其包括向该哺乳动物受试者施用病毒抑制量的如本文所公开的卤代呫吨、其药学上可接受的盐、烷基酯或酰胺或芳族酯或酰胺衍生物。一种在呈现微生物感染、癌性肿瘤或血液恶性肿瘤的哺乳动物受试者中诱导I型干扰素反应的方法，其包括施用一定量的有效诱导I型干扰素反应的如上所述的卤代呫吨。一种增强哺乳动物免疫原特异性免疫反应的方法，其包括使哺乳动物细胞在体内或存在于哺乳动物细胞生长支持培养基中与佐剂有效量的如上所述的卤代呫吨和待对其加强该反应的免疫原接触。

Description

卤代呫吨在肿瘤学和病毒学中的新用途
发明领域
本发明涉及卤代呫吨分子的治疗用途，该分子在选定的肿瘤学和病毒学条件下表现出治疗或免疫治疗特性。
背景技术
肿瘤学和病毒学是相切相关的领域，它们在动物、特别是人的先天性和适应性免疫系统中相交叉。尽管疾病的病因和表现通常是不同的，但这种交叉为将一个领域的发现应用于另一个领域提供了共同的基础。在这里，我们通过融合在每个领域独立做出的新发现，综合了适用于这两个领域的新方法。
冠状病毒(CoV)是有包膜的正义病毒，含有单链核糖核酸(ssRNA)基因组。它们于20世纪60年代被发现，天然存在于多种哺乳动物和鸟类物种中。近几十年来，在从天然宿主物种向人交叉时，冠状病毒已多次对全球健康构成威胁(例如，2003年的SARS-CoV、2012年的MERS-CoV以及自2019年底以来的现在的SARS-CoV-2)。在人中，它们会引起从轻微到致命的呼吸道感染。归因于这些CoV的人疾病分别是严重急性呼吸系统综合症(SARS)、中东呼吸系统综合症(MERS)和2019年CoV病(COVID-19)。
CoV是多形的球形颗粒(直径约12nm)，具有多个球状表面突起(形成刺突样包膜突起的表面蛋白)。病毒包膜由锚定这些包膜突起的脂质双层组成。包膜内部是核衣壳，其结合病毒RNA基因组的多个拷贝。在宿主细胞外时，包膜、膜蛋白和核衣壳一起保护病毒基因组。
当包膜突起附着于嗜性细胞(能够支持病毒感染和生长的细胞)上的互补宿主细胞受体并且病毒或病毒成分进入宿主生物体时，感染就开始了。附着后，宿主细胞的蛋白酶切割并活化受体附着的包膜突起。根据宿主细胞蛋白酶的可用性，切割和活化允许通过内吞作用或病毒包膜与宿主膜的直接融合进入细胞。一旦进入细胞，病毒RNA就会被宿主细胞的核糖体转录，导致病毒复制。由此产生的后代CoV颗粒通过胞吐作用从宿主细胞中释放出来。
人感染依赖于CoV包膜突起与互补宿主细胞受体的相互作用。这决定了给定病毒的组织嗜性和传染性。
饶子和及其同事报道的工作指出，I、II、III和IV四种病毒组的主要蛋白酶(Mpro)蛋白的底物结合位点的三维形状的相似性但不是蛋白质测序的相似性[Yang et al.,PLoSBiology 3(10):e324(2005).]。Mpro通过复制酶多蛋白的蛋白水解加工在病毒基因表达和复制中发挥关键作用，因此是抗CoV药物设计的一个有吸引力的靶标[Zhang et al.,Science 10.1126/science.abb3405(March 20,2020).]。Mpro在每个CoV组内显示出较高的序列相似性。Mpro是一种同二聚体，其首要作用之一是切割其自身蛋白质之一的N端部分。
饶的小组使用计算建模方法，还报道了一种称为N3的缀合含有羰基的迈克尔受体分子的肽模拟物的制备和使用，它在对病毒复制和转录至关重要的点与表面结构共价结合并抑制CoV组代表的活性。自杀抑制剂序列基于CoV TGEV Mpro的N端自加工位点的P1-P4序列[Yang et al.,PLoS Biology 3(10):e324(2005).]。
三年后，饶的小组报道了使用其他CoV株的进一步研究，并提供了晶体学证据证明其先前的抑制剂和改进的抑制剂的抑制作用。一种改进的抑制剂(N27)将缬氨酸残基替换为异亮氨酸残基，而另一种改进的抑制剂(H16)将N3异亮氨酸2-丁基侧链替换为叔丁基侧链[Xue et al.,J Virol 82(5):2515-2527(2008).]。
饶及其同事发表了有关新型SARS-CoV-2的Mpro的未经同行评审的工作[Jin etal.,BioRxiv February 05,2020.]。他们提供了与Mpro结合口袋共价结合的抑制剂N3的晶体学信息，并报道了N3以及其他已知化合物抑制Mpro活性，IC50值为0.67至21.4μM。
在这些抑制剂化合物中，双硫仑和卡莫氟是美国食品和药品管理局批准的药物，而依布硒啉、紫草素、tideglusib、PX-12和TDZD-8目前正处于临床试验或正在进行临床前研究中。依布硒啉对Mpro活性具有最强的抑制作用，IC50为0.67μM。然而，在基于去污剂的测定中，发现TDZD-8是一种基于聚集体的抑制剂，可能不会特异性抑制Mpro，因此没有进一步考虑它。
发现依布硒啉仅部分修饰了Mpro病毒半胱氨酸，而其他抑制剂如卡莫氟则完全修饰了该半胱氨酸。鉴于依布硒啉是最强的抑制剂，作者认为该化合物和其他化合物也通过亲和力(非共价方式)抑制Mpro。
COVID-19是一种由SARS-CoV-2感染引起的高度传染性疾病并且以SARS为特征。常见症状包括发烧、咳嗽和气短。尽管大多数病例似乎没有症状或症状轻微，但有些病例会进展为重症肺炎、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、呼吸衰竭、感染性休克、多器官衰竭和死亡。据估计，美国的死亡率约为1.8％[COVID-19 Dashboard by the Center for SystemsScience and Engineering at Johns Hopkins University,1:26P.M.,March 22,2021；coronavirus.jhu.edu/map]，但高度依赖于年龄：与5-17岁的参考组相比，美国疾病控制和预防中心估计30-39岁的死亡率为45倍，而85岁以上的死亡率则为7,900倍。这表明，除了潜在发病率的贡献外，免疫系统功能下降可能是严重程度的一个重要因素。
肺是受SARS-CoV-2影响最大的器官，因为该病毒通过受体血管紧张素转换酶2(ACE2)进入宿主细胞，而ACE2在肺的II型肺泡细胞中最为丰富。该病毒使用其包膜突起(钮样结构或刺突)连接到ACE2并进入宿主细胞。
每种组织中ACE2的密度与该组织中疾病的严重程度相关，一些人认为降低ACE2活性可能具有保护作用，但是另一种观点则认为使用血管紧张素II受体阻滞剂药物增加ACE2可能具有保护作用。随着肺泡疾病的进展，可发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和呼吸衰竭。ACE2在心脏细胞中也很常见，可能是急性心脏损伤的途径。
瑞德西韦于2020年10月被批准用于治疗需要住院的COVID-19患者。市售的瑞德西韦被命名为
Figure BDA0003956005960000041
用于注射或用于静脉使用(
Figure BDA0003956005960000042
标签)。它被认为是目前唯一被批准用于抑制SARS-CoV-2复制的药物。否则，患者将接受支持性护理(例如，如果需要，提供流体和氧气支持)并监测和支持其他受影响的重要器官。几种研究性COVID-19治疗正在进行临床前和/或临床研究，包括：洛匹那韦/利托那韦；硝唑尼特；氯喹和羟氯喹；和托珠单抗。
对于成人和12岁及以上且体重至少40公斤(kg)的儿科患者，瑞德西韦的推荐剂量是在第1天单次负荷剂量200mg，然后从第2天开始每天一次维持剂量100mg输注30到120分钟。
Figure BDA0003956005960000043
以装在小瓶中的100mg冻干粉的形式提供，在稀释到100mL或250mL0.9％氯化钠输液袋中之前，需要用无菌注射用水复溶。以100mg/20mL[5mg/mL]溶液形式提供的
Figure BDA0003956005960000044
注射液必须在250mL0.9％氯化钠输液袋中稀释。
对于不需要有创机械通气和/或体外膜肺氧合(ECMO)的患者，推荐的总治疗持续时间为5天。如果患者没有表现出临床改善，治疗可另外延长至多5天，总治疗持续时间至多10天(
Figure BDA0003956005960000045
标签)。
瑞德西韦是作为埃博拉病毒和马尔堡病毒感染的抗病毒药物开发的，并已被证明具有抗ssRNA病毒的活性。它是一种前药，可代谢为活性形式GS-441524，其干扰病毒RNA依赖性RNA聚合酶的作用，减少病毒RNA的产生。在扩散到细胞中后，瑞德西韦转化为GS441524单磷酸盐，后者被磷酸化为瑞德西韦的活性三磷酸核苷酸形式(RTP)[Padhi et al.,bioRxiv,p.4,于2020年6月29日发布.]。瑞德西韦的半衰期约为0.89小时，而GS-441524的半衰期约为25小时[Tempestilli et al.,J Antimicrob Chemother,doi:10.1093/jac/dkaa239(于2020年5月14日接受)]。
University of Alberta的Gotte小组和其他人最近发表的文章[Tchesnokov etal.,J Biol Chem 295(47):16156-16165(November 20,2020)]提供了第二种抑制机制，即模板依赖性抑制。
洛匹那韦/利托那韦(LPV/r)是洛匹那韦和低剂量利托那韦的组合，其开发用于治疗和预防人免疫缺陷病毒感染/获得性免疫缺陷综合征(HIV/AIDS)。这两种药物都是蛋白酶抑制剂类的抗逆转录病毒药物。LPV/r相对乌米诺韦(一种用于流感的吲哚衍生物，其阻断病毒与嗜性细胞之间的接触以抑制病毒膜融合)相对无抗病毒药物的三向探索性随机研究显示，抗SARS-COV-2的活性没有差异[Li et al.,medRxiv March 19,2020.]。
硝唑尼特是一种广谱抗寄生虫和广谱抗病毒药物。它是噻唑类药物的原型成员，这是一类合成的具有抗寄生虫和抗病毒活性的硝基噻唑基水杨酰胺衍生物。它在针对流感、慢性乙型肝炎病毒(HBV)和慢性丙型肝炎病毒(HCV)的临床试验中显示出一定的前景；它也正在被研究用于治疗轮状病毒和诺如病毒胃肠炎。抗病毒活性似乎是通过选择性阻断宿主转录因子，例如病毒血凝素的成熟，损害血凝素细胞内运输和蛋白质插入宿主质膜。
磷酸氯喹被认为通过增加能够干扰病毒-细胞融合过程的内体pH值而具有抗病毒功能。它还可以作为锌离子载体，从而允许细胞外锌进入细胞内部并抑制病毒RNA依赖性RNA聚合酶。
羟氯喹增加抗原呈递细胞中溶酶体pH值。在炎症条件下，它阻断浆细胞样树突细胞(PDC)上的toll样受体(TLR)，减少TLR信号传导，减少树突细胞(DC)的活化，并减少炎症过程。
世界卫生组织(WHO)于2020年3月20日宣布了一项大型全球试验，以评估(a)瑞德西韦、(b)氯喹和羟氯喹、(c)LPV/r或(d)LPV/r与干扰素β(IFN-β)是否可用于治疗COVID-19[Kupferschmidt and Cohen,Science March 22,2020.]。此外，2020年在创纪录的时间内进行了四项大型随机对照试验(RCT)，提供了可靠的数据：(1)美国国立卫生研究院(NIH)RCT包括全球60家参与医院，并显示了瑞德西韦在减少COVID-19肺炎住院成人的康复时间方面的功效；(2)已完成三项大型RCT，分别为羟氯喹、地塞米松和洛匹那韦和利托那韦。这些试验是在University of Oxford领导的“Recovery”项目的综合体下完成的。该项目包括英国176家参与医院，旨在验证用于COVID-19的一些治疗方法的有效性[Ortolani et al.,Clin Mol Allergy 18:17(2020)]。
这三项“Recovery”RCT明确得出以下结论：(a)羟氯喹治疗对COVID-19住院患者没有益处；(b)地塞米松治疗使机械通气的COVID-19患者的死亡减少了三分之一，仅接受氧气的患者的死亡减少了五分之一；和(c)洛匹那韦和利托那韦的组合不能有效降低COVID-19住院患者的死亡率[Ortolani et al.,Clin Mol Allergy 18:17(2020)]。
托珠单抗(也称为atlizumab)是一种针对白细胞介素6受体(IL-6R)的免疫抑制人源化单克隆抗体。IL-6是一种细胞因子，可在免疫反应中发挥关键作用并与许多疾病的发病机制有关。一些医疗社区已经报告说，使用托珠单抗治疗COVID-19患者在一些症状严重的患者中有所改善；但是，目前没有确切的数据。
最近发布的一项初步研究(Horby et al.,medRxiv,February 11,2021)表明，一项涉及约4000名住院患者的患者研究表明，临床证据显示进行性COVID-19[定义为室内空气中的氧饱和度<92％或接受氧疗法和C反应蛋白(CRP)≥75mg/L]表明分配给托珠单抗与28天死亡率成比例降低13％相关(死亡率之比0.86,95％ CI 0.77-0.96，p＝0.007)。报道的数据表明，在缺氧并有全身性炎症证据的COVID-19患者中，使用全身性皮质类固醇加托珠单抗联合治疗预计可将接受简单氧疗法的患者的死亡率降低约三分之一，而那些接受有创机械通气的患者的死亡率降低近一半。
这些结果支持使用托珠单抗，但也可以使用其他IL-6拮抗剂。尽管另一种单克隆抗体IL-6拮抗剂sarilumab(其中只有48名患者接受了sarilumab)的效果与使用托珠单抗的效果相似，但两项进一步的研究已经完成，但尚未发表报告。
这些解决病毒感染或病毒感染影响的努力(无论是来自SARS-CoV-2还是其他病毒)突出了一些可用的策略：
阻断病毒附着至宿主细胞；
阻断病毒基因和可能的酶释放到宿主细胞中；
使用宿主细胞机制阻断病毒成分的复制；
阻断病毒成分组装成完整的病毒颗粒；
阻断感染新的宿主细胞的病毒颗粒的释放；和
阻断对病毒感染的炎症反应。
病毒附着至宿主细胞。
病毒必须经过一系列步骤才能渗入靶细胞，首先是与宿主细胞表面的特定受体位点结合。如果发生结合，具有脂质包膜的病毒也必须将其包膜与靶细胞融合，或与将它们运输到细胞中的囊泡融合。一旦进入细胞，病毒就会将其自身脱壳(uncoat)并释放其内容物。可以通过两种方式抑制此过程：
1)使用模拟病毒相关蛋白(VAP)并与宿主细胞上的细胞受体结合的药剂；和
2)使用模拟细胞受体并与病毒上的VAP结合的药剂。
病毒基因和可能的酶释放到宿主细胞中。
抑制病毒脱壳已证明对流感和鼻病毒感染有用。方法包括阻断在病毒表面上控制脱壳过程的口袋；这种结构在一系列鼻病毒(RV)和肠道病毒(EV)中都是保守的。
使用宿主细胞机制复制病毒成分。
阻断病毒基因组的逆转录可以通过使病毒RNA或脱氧核糖核酸(DNA)的合成失活来实现。阻断病毒DNA整合到宿主基因组中可以有效对抗DNA病毒。阻断对RNA转录起始至关重要的转录因子可以阻断病毒成分的复制。用于阻断病毒劫持宿主细胞机制的其他功能靶标包括翻译/反义、翻译/核酶和蛋白酶抑制。
病毒成分组装成完整的病毒颗粒。
利福平是一种抗生素，已证明其对牛痘病毒有一定的疗效。虽然它的主要作用方式是通过某些RNA聚合酶抑制RNA合成，但针对牛痘，它可逆地阻断病毒颗粒在感染细胞中的细胞质组装。这种功能似乎是通过干扰关键病毒膜成分的四级结构而赋予的，抑制自组装成完整的病毒颗粒。
释放病毒颗粒感染新的宿主细胞。
扎那米韦和奥司他韦这两种药物通过阻断神经氨酸酶来阻止病毒颗粒从感染细胞中释放来治疗流感，神经氨酸酶存在于流感病毒表面并且似乎在一系列流感病毒株中都具有保守性。
对病毒感染的炎症反应。
嗜性宿主细胞的猖獗病毒感染能够引发严重的局部或全身炎症反应，因为受感染细胞释放炎症信号传导成分(例如，细胞因子、趋化因子和与先天性免疫反应有关的损伤相关分子模式[DAMP]；和T细胞和适应性免疫反应的其他功能成分)，导致感染的局部或全身症状。治疗此类疾病表现的方法，例如减少严重的肺炎症反应，可以能够提供重要的疾病控制，直到患者能够通过抗病毒药物疗法和/或适应性免疫反应产生适当的抗病毒反应。
尽管有若干药剂可能有助于控制病毒性疾病，通过预防嗜性细胞的病毒感染或病毒在受感染的嗜性细胞内的功能活性，或通过在病毒感染期间调节不受控制的炎症反应，显然需要对抗病毒药剂的新选择。缺乏能够控制CoV和减轻CoV对全球社会的巨大影响(例如COVID-19)的令人满意的药剂，突显了这一迫切需求。
干扰素
干扰素(IFN)是一类信号传导蛋白(即细胞因子)，是细胞防御病毒、传染性微生物和肿瘤细胞的核心[Andrea et al.,Eur J Paed Neurol 6Suppl A(6):A41–A46(2002).]。例如，病毒感染的细胞会释放IFN，向附近的细胞发出信号以增强其抗病毒防御能力。干扰素因其通过保护细胞免受病毒感染而“干扰”病毒复制的能力而得名[Parkin et al.,Lancet 357(9270):1777–1789(2001).]。
除了直接的抗病毒作用外，IFN还可以活化免疫细胞(例如自然杀伤细胞和巨噬细胞)，并通过增加主要组织相容性复合物(MHC)抗原的表达来上调抗原呈递。IFN分类为以下三组：
·I型IFN，其由IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ和IFN-ω组成，是为响应病毒而产生的，并在与细胞受体结合后抑制病毒RNA和DNA的复制；I型IFN在应对癌症的免疫信号传导中具有类似的作用；
·II型IFN(IFN-γ)由白细胞介素12(IL-12)活化并由细胞毒性T细胞和辅助性T细胞释放；和
·III型IFN与对一些类型的病毒和真菌感染的免疫反应有关。
STING活化和免疫活化
干扰素基因刺激物(STING)是一种驻留在内质网(ER)中的跨膜蛋白，其为先天性免疫的重要调节因子并且由Ishikawa et al.,Nature 455(7213):674-678(2008)首次报告。这些作者发现STING诱导I型IFN并在表达后发挥有效的抗病毒状态，而STING的缺失能够使细胞极易受到病毒感染。
更具体地，STING通过与cGMP-AMP(cGAMP)等的环状二核苷酸结合而被活化，当cGAMP合酶识别细胞溶质DNA时，cGMP-AMP作为细胞内第二信使产生。与cGAMP结合会导致STING二聚化并从ER易位到高尔基体。重新定位后，STING募集丝氨酸/苏氨酸激酶，即TANK结合激酶1(TBK1)，导致干扰素调节因子3[IRF3]的磷酸化以及I型IFN和IFN刺激基因(包括IFN-β和CXCL10)的上调[Motani et al.,J Biol Chem 293(20):7717–7726(2018).]。
Ishikawa et al.,Nature 461(8):788-793(2009)表明，由于缺乏成功的I型IFN反应，小鼠的STING缺陷会产生对1型单纯疱疹病毒(HSV-1)感染的致命易感性。
当细胞被细胞内病原体感染时，STING会诱导I型IFN的产生，它通过与分泌它的同一细胞(即自分泌信号传导)和附近的细胞(即旁分泌信号传导)结合来保护受感染的细胞和附近的细胞免受局部感染。I型干扰素(IFN-I)反应可能对于提供针对病毒感染的有效保护至关重要。
宿主传感器识别病原体相关分子模式(PAMP)，例如病毒核酸，会迅速触发IFN-I的产生。IFN-I诱导的信号传导集中至转录因子上，转录因子会迅速诱导数百个称为干扰素刺激基因(ISG)的基因表达[综述于Schoggins,Annu Rev Virol.6(1):567–584(2019)]。这种抗病毒信号传导级联反应几乎发生在所有暴露于IFN-I的细胞类型中。
ISG与其他受IFN-I控制的下游分子(包括促炎细胞因子)一起，具有多种功能，从直接抑制病毒复制到募集和活化各种免疫细胞。因此，通常需要稳健的、适时的和局部的IFN-I反应作为抵御病毒感染的第一道防线，因为它促进病毒清除、诱导组织修复并触发针对病毒的长期适应性免疫反应。Sa Ribero et al.,Plos Pathog 16(7):e1008737(July29,2020)。
Sun et al.,Proc Natl Acad Sci,USA,105(21):8653-8658(2009)表明，STING的二聚化对这种先天性免疫系统信号传导至关重要。Abe et al.,Mol Cell 50:5-15(2013)表明，保护功能需要急性STING活化(通过二聚化)，而慢性活化可导致反作用的炎症反应和自身免疫性疾病。
在一些情况下，STING充当(例如从宿主细胞核和传染性病原体泄漏的)外源和内源DNA的细胞内传感器。这种内源DNA可能导致自身炎症性疾病，如系统性红斑狼疮(SLE)或Aicardi-Goutières综合征(AGS)[Barber,Nat Rev Immunol 15(12):760-770(December2015).]。有趣的是，正如上文的Abe et al.所述，关于抗病毒活性，似乎保护功能需要急性STING活化(通过二聚化)，而慢性活化则可能导致免疫下调。
上文的Barber指出针对逆转录病毒和RNA病毒的复制具有相似的活性。因此，STING的表达和二聚化在对抗所有主要病毒类别的感染方面发挥着关键的细胞防御作用。
上文的Barber还描述了除了其抗病毒作用外的一种类似的抗细菌感染功能。在该综述中，Barber指出，他们的研究强调了适当的免疫反应和炎症之间的微妙平衡，这种平衡可能会被微生物利用。Barber进一步指出，这些发现可能对STING靶向佐剂的开发和旨在诱导稳健、持久的适应性免疫反应的疫苗设计产生重要影响。
这些观察结果表明，STING的急性活化对抗微生物活性(即抗病毒、抗细菌、抗真菌或抗寄生虫)至关重要。
最近的研究表明，STING同二聚体与细胞质多核苷酸、特别是与病毒相关的单链和双链DNA(ssDNA和dsDNA)分子复合。除了I型IFN之外，发现这种含有二聚化STING的复合物对于HSV-1介导的各种各样的先天性免疫和促炎基因的转录活化是必不可少的[Abe etal.,Mol Cell 50:5-15(2013).]。
某些细胞类型中的STING活化会触发细胞死亡，包括细胞凋亡和坏死。这种作用对于预防不必要或过度的炎症事件和维持宿主免疫稳态至关重要。除了以IFN和肿瘤坏死因子(TNF)的产生为代表的典型免疫反应外，STING信号传导还能够在各种细胞类型中诱导细胞死亡事件。
目前，已经开发出几种STING激动剂来治疗难治性恶性肿瘤。参见例如，Ramanjuluet al.,Nature 564:439-443(December 20/27 2018)中使用基于连接的氨基苯并咪唑(ABZI)的化合物。
Sali et al.,(PLoS Pathog,pages 1-30,December 8,2015)报道了一种能够通过转录因子IFN调节因子3(IRF3)活化I型IFN反应的小分子STING活化剂的鉴定。该分子也称为G10，在人成纤维细胞中触发了IRF3/IFN相关的转录。
对该分子的细胞反应的进一步研究揭示了多个IRF3依赖性抗病毒效应基因以及I型和III型IFN亚型的表达。这导致建立了这样的细胞状态，其阻止了包括基孔肯亚病毒、委内瑞拉马脑炎病毒和辛德毕斯病毒在内的新的ssRNA甲病毒种类的复制。这些作者报道说，G10分子不直接与STING结合，而是作为人STING依赖性表型的间接活化剂。
Guo et al.,[Antimicrob Agents Chemother 59(2):1273–1281(2015)]报道了合成的小分子5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(DMXAA)可激活STING依赖性信号传导通路，在小鼠巨噬细胞中诱导I型IFN为主的细胞因子反应，从而通过减少细胞质病毒核衣壳的量而有效抑制培养的小鼠肝细胞中和在小鼠的肝脏中的HBV复制。DMXAA之前已被确定为鼠STING的激动剂。人STING未能与DMXAA结合或响应于DMXAA而发出信号[Conlon et al.,JImmunol 190:5216–5225(2013).]。STING在这个级联反应中的直接作用似乎是对作为先天性和适应性系统之间的中介的树突细胞(DC)的作用。
STING已被认为是TBK1/IRF3和NF-κB通路以及随后的IFN和TNF产生的免疫反应活化剂。STING被认为通过诱导促炎细胞因子在宿主防御、自身免疫性疾病和肿瘤免疫中发挥关键作用。还研究了靶向STING途径在癌症免疫疗法中的应用[Liu et al.,MediatInflamm(2018)Article ID 1202797,(4pages).]。
Barber[Nat Rev Immunol 15(12):760-770(December 2015)]综述了STING依赖性先天性免疫信号传导在病毒学中的作用，这在很大程度上与病毒学相似。STING活化导致I型IFN的活化，这对适应性免疫系统具有启动作用(通过DC交叉呈递肿瘤抗原来活化肿瘤抗原特异性T细胞)。在小鼠中消除STING会消除T细胞对黑色素瘤的反应以及免疫检查点抑制剂的活性，并且Barber指出，正如在病毒学中所观察到的，慢性STING活化可能在促进肿瘤发生中发挥作用。
作者最后指出以下结论：“越来越明显的是，STING在促进抗肿瘤免疫反应方面发挥着关键作用。此外，刺激肿瘤微环境中的STING活性可能构成一种新的帮助治疗恶性疾病的免疫治疗策略”[Barber,Nat Rev Immunol 15(12):768(2015)]。
正如Simon et al.,Proc R Soc B 282:20143085(2015)所述，免疫功能在儿童早期迅速增加，并在整个成年期一直到高龄开始均保持一致。这些作者指出，随着人衰老，免疫系统会经历强烈的重塑和衰退。这种免疫衰老使老年人患急性病毒和细菌感染的风险更高。
虽然似乎很少有关于STING表达和活化随年龄变化的直接数据，但是很可能其与高龄开始(即60岁或以上)的先天性免疫总体下降的模式吻合，特别是考虑到STING在介导先天性抗病毒免疫中的核心作用。这些作者指出，随着年龄的增长(即工业化国家开始的中位年龄约为70岁)，癌症发病率平行增加，这也可能归因于STING表达和活化随着年龄的增长而下降。
此外，对急性STING活化的有效结果和慢性STING活化在传染病和肿瘤学中的反作用结果的一致观察表明，急性STING活化在治疗传染病和肿瘤学中的核心作用。
卤代呫吨(HX)化合物
我们之前的研究已经鉴定了卤代呫吨(HX)化合物，特别是玫瑰红[4,5,6,7-四氯-2',4',5',7'-四碘荧光素](RB，在本文中有时称为PV-10，它是RB的可注射水性制剂)作为新的治疗剂，在肿瘤内注射或局部施用后具有强效活性。玫瑰红是Singer et al.在在美国专利第8,530,675号、第9,273,022号和第9,422,260号中所述的HX化合物类分子的原型成员。
这些分子具有若干医疗用途，包括作为Eagle et al.在美国专利第9,107,887号、第9,808,524号和第9,839,688号中所述的可注射肿瘤药物以及作为Dees et al.在美国专利第8,974,363号中所述的局部皮肤病药物。尽管RB已显示出作为癌症的免疫活化疗法[Liu et al.,Oncotarget 7:37893(2015)]和作为炎症性皮肤病的免疫调节疗法[Kruegeret al.,Psoriasis from Gene to Clinic 2018]的前景，但是这些分子在先天性免疫的直接活化中尚无建议的作用。
新发现的与SARS-CoV-2病毒Mpro可利用口袋结合的高亲和力(在下文中进行详细讨论)可能部分源于RB和其他HX化合物对生物分子、特别是糖蛋白的高亲和力。例如，有许多已发表的报道描述了在静脉内施用(IV)时RB与大鼠和兔血浆蛋白的高水平结合[Tsaoet al.,Drug Metab Dispos,16(3):482-489(1988)；和Luxon et al.,J Pharmacol ExpTher 289(1):296-305(1995)]。
使用平衡透析，超过99.8％的RB结合在缺乏血清白蛋白的大鼠的血清中，这表明涉及几种蛋白质。在正常大鼠中，75-80％的RB从白蛋白级分中回收，其余20-25％从其他蛋白质级分中回收[Tsao et al.1988，同上；和Meurman,Acta medica Scan,Supp 167,Chapters I,III,V,VII,X and XII(1960)]。我们已经证实，使用超速离心法，RB在大鼠血浆中表现出高度的血浆蛋白结合，在1μM观察到99.0％的血浆蛋白结合，在10μM观察到99.2％的血浆蛋白结合；并且这种亲和力在人血浆中更高，在1μM到10μM分别观察到99.8％到99.9％的血浆蛋白结合。
这种对生物分子、特别是糖蛋白的亲和力似乎是两亲性HX化合物独特的物理化学性质的结果。例如，RB在水中的溶解度至少为10％(100mg/mL)，在乙醇中的溶解度为3％(30mg/mL)，而在2-甲氧基乙醇中的溶解度为6％(60mg/mL)[Floyd J.Green,Sigma-Aldrich Handbook of Stains,Dyes and Indicators,Aldrich Chemical Company,Inc.,Milwaukee,WI,pages 637-638(1990)]。
当通过静脉内方法(IV)对人施用时，HX化合物未经代谢通过胆汁排泄，循环半衰期约为30分钟；这导致历史上用作肝功能的IV诊断。从Delprat et al.,Arch Intern Med34:533-541(1924)的初步临床证明开始，静脉内RB开始常规用作基于差异排泄的肝损伤诊断。在20世纪50年代引入131I放射性标记的RB将用途扩展为成像剂[Taplin et al.,J LabClin Med 45(5):665-678(1955)]，其允许通过伽马射线检测对肝进行直接成像。
在临床使用中，放射性碘化RB经常用非放射性标记RB稀释。在美国批准的适应症是用作确定肝功能障碍的诊断辅助工具以及用于肝成像，剂量为至多25μCi的131I RB(约12mg RB)和阻断剂量的非放射性标记RB(在放射性标记产品给药前10分钟给予100mg)以延缓放射性标记产品的排泄率，从而为肝扫描留出更多时间。我们已经用非放射性标记RB重复了这个程序，以使用现代临床工具和标准确认全身施用RB的安全性和药代动力学特性。
Yoshimoto et al.,J Food Hyg Soc Japan,25(4):352-355(1984)报道了溶解在蒸馏水中的玫瑰红以300mg/kg/天对年轻雄性Wistar大鼠的影响的研究。这些工作者报道，RB对生长速度没有影响，但导致相对肝重量显著下降。没有发现有关H3-UTP掺入RNA或肝核中RNA含量的影响。据报道，相似浓度的Ponceau 3R或Amaranth可刺激体内RNA合成。
发明概述
本发明考虑了与卤代呫吨(HX)化合物、其药学上可接受的盐、其氮原子未被取代、被一个或两个相同或不同的C1-C4烷基取代或所述烷基与酰胺氮原子一起形成5-或6-元环的酰胺、C1-C4烷基酯、其芳族衍生物(酰胺或酯)的医药用途相关的若干概念，其中芳族衍生物是由具有包含0、1或2个独立为氮、氧或硫的杂环原子的5-或6-元芳环或5,6-或6,6-稠合芳环系统的醇或单取代胺形成的酯或酰胺。玫瑰红是优选的HX化合物，并且其二钠盐玫瑰红二钠是最优选的。
本发明更具体地考虑了卤代呫吨(HX)化合物、特别是玫瑰红在哺乳动物受试者被病毒、细菌、真菌和寄生虫以及SARS-家族病毒感染，特别是引起COVID-19的冠状病毒(SARS-CoV-2)感染以及STING诱导I型干扰素(IFN)免疫反应以及与其他抗癌性肿瘤药物全身施用时的辅助免疫学效应的过程中的相互作用。
更具体地，一个实施方案考虑了一种用于治疗哺乳动物受试者例如人的冠状病毒感染的方法，该方法包括向该哺乳动物受试者施用冠状病毒复合(病毒结合)量的如上所述的卤化呫吨、药学上可接受的盐、酰胺、酯或芳族酰胺或酯衍生物。特别针对治疗考虑的冠状病毒被称为SARS-CoV-2，它是COVID-19呼吸道疾病的病原体。使用的卤代呫吨分子优选是玫瑰红二钠。还优选重复施用一次或多次。
在该实施方案的一个相关方面，HX化合物与冠状病毒复合(病毒结合)量的瑞德西韦一起施用。这两种药物可以通过从单一的水性药物组合物例如生理盐水输注，或通过分开的水性药物组合物输注来施用，或者一种药物卤代呫吨可以口服施用，而瑞德西韦通过输注施用。
另一实施方案考虑了一种在公认需要治疗的哺乳动物受试者(优选人)、例如存在微生物感染的受试者中诱导I型干扰素反应的方法，该方法包括施用可有效诱导I型干扰素反应的一定量的如上所述的卤化呫吨、药学上可接受的盐、酰胺、酯或芳族酰胺或酯衍生物。优选的卤代呫吨是玫瑰红二钠。当使用C1-C4烷基酯卤代呫吨时，优选C2(乙基)酯。当使用芳族衍生物时，优选苄基、苯基或2-、3-或4-吡啶基(吡啶基)酯或酰胺，但也考虑如下文所述的其他芳族衍生物。微生物感染可以是病毒感染、细菌感染、真菌感染或单细胞寄生虫感染，例如疟疾的病原体疟原虫(Plasmodium)。
还考虑了一种增强哺乳动物免疫原特异性免疫反应的方法。该方法包括使存在于哺乳动物细胞生长支持培养基中、例如体外培养板或哺乳动物体内的哺乳动物细胞与佐剂有效量的如上所述的卤化呫吨、药学上可接受的盐、酰胺、酯或芳族酰胺或酯衍生物和待针对其增强免疫反应的免疫原接触。
这种免疫原性反应不同于如美国专利第7,648,695号、第8,557,298号和第9,107,877号、第10,130,658号、美国专利公开2019-0350893A1及其一个或多个的子专利或专利公开所示的通过将RB病灶内注射到肿瘤中或使恶性血液细胞与RB接触获得的免疫原性反应。上述专利和申请中接触的哺乳动物癌性细胞优先摄取RB，RB则杀死癌细胞并导致所产生的消融细胞碎片充当自身疫苗以诱导远距离免疫反应。在这种免疫原性反应中，HX化合物如RB起到刺激STING反应的作用。玫瑰红二钠是优选的HX化合物。
通过体内或体外技术比较适当的免疫分子或细胞，例如细胞因子、趋化因子、抗体、B细胞和/或T细胞，能够确定免疫反应的增强。也能够通过比较本领域通常使用的肿瘤大小、病毒血症程度等来进行这种比较。
另一实施方案考虑了一种在患有实体癌性肿瘤或恶性血液病的哺乳动物受试者(优选人)中诱导I型干扰素反应的方法。在此，考虑的方法包括全身施用可有效诱导哺乳动物受试者的STING二聚化并由此诱导I型干扰素反应的如前所述的卤代呫吨、药学上可接受的盐、酰胺、酯或芳族衍生物。卤代呫吨的量低于哺乳动物受试者中存在的癌性肿瘤或恶性血液病的IC50。优选的卤代呫吨是玫瑰红二钠。当使用C1-C4烷基酯卤代呫吨时，优选C2(乙基)酯。当使用芳族衍生物时，优选苄基、苯基、2-、3-或4-吡啶基(吡啶基)酯或酰胺，但也考虑如上文和下文更全面地讨论的其他芳族衍生物。
进一步的实施方案考虑了一种药物组合物，其包含冠状病毒复合量的以下中的每一种：(a)瑞德西韦和(b)如上所述的卤代呫吨(HX)、药学上可接受的盐、酰胺、酯或芳族衍生物，其溶解或分散在生理可接受的水性载体中。HX化合物优选作为药学上可接受的盐存在于药物组合物中，并且该HX药学上可接受的盐最优选为玫瑰红二钠。
还考虑了治疗哺乳动物受试者的冠状病毒感染的方法。在该方面，将冠状病毒复合量的瑞德西韦和如上所述的卤代呫吨(HX)化合物、药学上可接受的盐、酰胺、酯或芳族衍生物中的每一种施用于所述哺乳动物受试者。两种药物都可以通过输注(IV施用)肠胃外施用。这种施用可以使用上一段的组合物来完成，或者两种药物可以分开输注。或者，可以肠胃外施用瑞德西韦而口服施用HX化合物。无论递送方式如何，HX化合物优选作为药学上可接受的盐即玫瑰红二钠存在。
附图简要说明
在构成本公开内容的一部分的附图中
图1A和图1B是分别与RB接触30分钟和1、2、4和24小时以及2、4、6和8小时的THP-1急性单核细胞白血病(AML)细胞的蛋白质印迹的注释照片，分别导致出现由特异性抗体检测到的新的70-KD STING二聚体带(虚线框)。图1B使用比图1A更长的胶片曝光时间来突出STING二聚体的存在；图1C至1R提供了RB与THP-1 AML细胞接触之前以及之后6、24和48小时的所标注的细胞因子和趋化因子的所测定的量的图；
图2A和2B是与Yang et al.,PLoS Biology 3(10):e324(2005)的N3抑制剂(图2A)和“参考”化合物(图2B)复合的SARS-CoV-2主要蛋白酶(Mpro)结合位点(PDB：6LU7)的计算机制备的模型。图2C显示了具有RB作为与主要蛋白酶(Mpro)结合位点复合的示例性卤代呫吨分子的类似模型，并进一步举例说明了如下文所述的可容纳RB衍生物的可利用口袋区域。使用AutoDock Vina[Dr.Oleg Trott,Molecular Graphics Lab,Scripps ResearchInstitute,LaJolla,CA]和BIOVIA Discovery Studio[Dassault Systèmes BIOVIA,Discovery Studio Modeling Environment,Release 2017,San Diego,CA]平台在计算机上执行灵活的配体-受体对接并基于原子间距离确定总体结合能来制备这些模型；
图3A和3B显示了复合(对接)SARS-CoV-2刺突蛋白(左侧)和人ACE2蛋白(右侧)之间的界面的计算机生成模型的结果，其中在图3A中这两种蛋白质之间的裂缝中结合有玫瑰红(RB)分子。图3B显示了玫瑰红的结构式以及通过氨基酸残基三字母代码和蛋白质序列位置编号标识的刺突蛋白(浅灰色)和ACE2蛋白(深灰色)的残基；
图4A和4B是这样的计算机制备的模型，其中图4A显示了使用空间填充对蛋白质进行建模的英国变体N501Y突变的SARS-CoV-2病毒刺突蛋白(左侧)和人ACE2蛋白(右侧)，其中在这两种蛋白质之间的裂缝中结合有玫瑰红(RB)分子，而图4B显示了使用带状模型对各个蛋白质部分的同样的相互作用。在图4B中，叠加箭头指向N501Y的位置；
图5A和5B是复合SARS-CoV-2刺突蛋白(左侧)和人ACE2蛋白(右侧)之间的界面的计算机制备的模型，其中在这两种蛋白质之间裂缝中结合有玫瑰红(RB)分子，其中图5A显示了使用空间填充模型的南非变体N501Y和K417N突变的SARS-CoV-2病毒刺突蛋白(左侧)和人ACE2(右侧)，而图5B显示了对各个蛋白质部分使用带状建模的同样的相互作用。在图5B中，下方的叠加箭头指向N501Y突变的位置，而上方的箭头指向K417N突变的位置；
图6A是显示SARS-CoV-2病毒感染的Vero细胞活力(三角形)和病毒滴度(圆圈)随着RB浓度变化的图，其中观察到病毒滴度完全抑制并且细胞活力保持恒定直到约50μM的浓度。图6B是在0.01到100μM的较宽浓度范围内的类似的图。图6C显示了在图6B所示的RB浓度范围内重复研究的数据；
图7A是显示扩增病毒核酸所需的逆转录循环数并因此是病毒存在量的指标的循环阈值(ct)的数据图；数据显示，在病毒吸附之前或期间的各种条件下，用0.6μM RB处理的病毒的ct值更高，并且与对照相比，病毒产生减少；在病毒与细胞已经一起孵育后再添加RB对病毒产生没有影响。显示了病毒拷贝数的图7B的数据进一步证明了由RB以干扰后续病毒附着和复制的方式与病毒相互作用所介导的基因拷贝数的减少；
图8A是SARS-CoV-2感染细胞随着瑞德西韦浓度变化的抑制生长曲线。与DMSO处理的细胞比较了抑制百分比(±标准偏差)。图8B是与图8A相似的曲线，举例说明了与DMSO处理的细胞相比，随着瑞德西韦浓度变化的蚀斑形成单位百分比(±标准偏差)。图8C是显示在几种浓度的瑞德西韦存在下传染性病毒颗粒(蚀斑形成单位)的定量(±标准偏差)的条形图；和
图9A是这样的条形图，其显示了在存在或不存在0.15μM瑞德西韦和1、5、20或50μMRB的情况下，滴定板的蚀斑形成单位/孔(±标准偏差)。图9B是这样的表格，其显示了与DMSO处理的细胞相比，每种处理的抑制百分比和蚀斑形成单位百分比(SD＝标准偏差)。图9C是这样的图，其显示在单独与RB接触2小时后(圆圈)以及其中RB与0.15μM瑞德西韦组合的相同2小时接触时间的SARS-CoV-2感染细胞随着RB浓度变化的生长抑制，从中计算它们各自的IC50值：单独的RB＝67.0μM，而RB加0.15μM瑞德西韦＝47.4μM。
优选实施方案的详述
卤代呫吨与SARS-COV-2Mpro紧密结合
除了在作为免疫佐剂中使用HX化合物的直接影响外，通过下文详述的STING途径，我们还研究了HX化合物作为病毒抑制剂的进一步潜在用途。Jin et al.[bioRxivFebruary 05,2020]报道了一项国际多学科努力的早期结果，旨在鉴定和筛选针对SARS-CoV-2的潜在抗病毒药物，SARS-CoV-2是之前提到的COVID-19的病原体。
我们使用了Jin et al.2020描述的SARS-CoV-2药物靶标(Mpro)使用AutoDockVina和BIOVIA Discovery Studio平台对SARS-CoV-2 Mpro上RB的结合特性进行建模；这使我们能够对灵活的配体-受体对接进行建模并基于原子间距离确定总体结合能。作为该建模的对照，我们使用了N3和另一种抗病毒候选药物(“参考”分子，Jin et al.2020的工作中测试的10,000个文库分子之一，并显示具有纳摩尔结合效率和广谱抗病毒活性)。
2005年、2008年和2020年2月的该文献表明，N3和“参考”分子(如下所示)结合在SARS-CoV-2 Mpro的催化袋中，并在结合后表现出对病毒复制的抑制活性。我们的建模表明，RB与SARS-CoV-2 Mpro的结合比N3更强，表明它是比N3更好的针对SARS-CoV-2的抗病毒候选物。
Figure BDA0003956005960000201
这些建模结果示于图2A-2C中，分别代表与N3(图2A)、“参考”分子(图2B)和RB(图2C)复合的SARS-CoV-2主蛋白酶Mpro的结合腔。由于HX化合物的卤素组成可以变化，这种拟合可以通过改变卤素含量进行优化(例如用氟或溴或其混合物取代位置4-、5-、6-或7-处的一个或多个氯部分)，和/或通过用氟或溴或其混合物取代位置2'-、4'-、5'-或7'-处的一个或多个碘部分)，或通过在这些位置中一个或多个处的脂肪族取代。
RB已被类似地通过计算机建模与SARS-COV-2刺突蛋白及其人细胞表面结合伴侣人ACE2蛋白的界面结合(复合)(图3A)。图3B显示了单独RB的化学式以及与RB相互作用的刺突和人ACE2蛋白的氨基酸残基。计算得到RB以约-12.5kcal/mol结合(复合)未突变的SARS-COV-2刺突和ACE2蛋白袋。
使用计算机建模发现N501Y突变的SARS-COV-2刺突蛋白和ACE2蛋白的相似结合效率显示出在约-13kcal/mol的大约相同的效率。RB以约-17.5kcal/mol结合人ACE2-南非K417N突变的变体刺突蛋白。在以下图中举例说明了这些计算机模型：在图4A和4B中为UK变体N501Y突变的SARS-COV-2刺突蛋白，而在图5A和5B中使用南非变体N501Y和K417N突变的SARS-COV-2刺突蛋白。
使用HX化合物(例如RB)作为抗SARS-CoV-2的抗病毒剂的另一个优点是，存在于体内的未复合HX化合物可以通过STING刺激治疗受试者的I型干扰素免疫反应，从而无需分开用药即可获得免疫增强的优势。在以下段落中更详细地讨论了该特征。
对抗病毒感染的常用备选方法是使用疫苗。这些药物传统上基于在暴露于活病毒之前将患者的免疫系统暴露于减弱或灭活的病毒或病毒抗原。该过程使患者能够产生适应性免疫反应，能够防止嗜性组织在暴露于病毒后受到严重感染。病毒基因组的阐明允许基于对病毒结构(即表面蛋白)建模进行合成疫苗开发，以指导新抗病毒策略的鉴定或合成[Graham et al.,Ann Rev Med 70:91-104(2019)]。特征性SARS-COV-2表面刺突(S)糖蛋白结构的公开为此类重点开发提供了重要靶标[Wrapp et al.,Science 367:1260-1263(2020)]。
2020年初，美国国立卫生研究院(NIH)的国家过敏和传染病研究所(NIAID)正在资助开发一种合成候选疫苗，该候选疫苗使用信使RNA平台生产以复制这些病毒刺突蛋白(NIAID网站,Jan 31,2020)。这种合成方法可以引发功能性免疫反应，同时避免患者接触实际病毒。2019年初，流行病学准备联盟(CEPI)推出了一种类似的方法，以开发“分子钳”疫苗平台，该平台基于使用合成病毒表面蛋白在感染期间附着在宿主细胞上并将它们“钳”成形；这可以增强免疫系统识别(CEPI网站,Jan.23,2020)。
这种独特的CoV刺突蛋白为禁用病毒功能(即防止附着到嗜性细胞或病毒解包装和复制)或通过增加病毒对宿主免疫系统的抗原性作为免疫佐剂提供了备选靶标。特别是，RB及其HX化合物类似物对糖蛋白的极高亲和力具有以下潜力：通过抑制CoV与嗜性细胞的附着或通过抑制病毒在感染细胞内的解包装和复制来禁用病毒功能；并通过与CoV刺突糖蛋白结构复合后增加病毒对宿主免疫系统的抗原性作为免疫佐剂。在广泛感染开始之前的早期暴露期间可以使用增加的抗原性来增强宿主免疫反应。
通过阻碍病毒相互作用组中的宿主蛋白来阻断病毒活性的功能是另一种抗病毒方法，也是Gordon et al.[bioRxiv March 22,2020]努力评估潜在小分子候选药物的相互作用的主题。这些作者指出，他们的目标是鉴定靶向SARS-CoV-2相互作用组中人蛋白质的小分子。
他们利用化学信息学数据库和分析，寻找已知与人蛋白质相互作用的配体，通常直接但也通过途径和复合物相互作用。对文献的化学信息学检索得到了15个获批药物、4个研究新药(临床)和18个临床前候选药物，而专业知识显示了12个获批药物、10个研究新药(临床)和10个临床前候选药物。
这些努力举例说明了基于可利用的病毒过程和结构的结构、功能和基因组引导的药物设计的价值。
RB及其HX化合物类似物对糖蛋白的极高亲和力具有通过抑制与对病毒相互作用组至关重要的宿主蛋白相互作用来禁用病毒功能的潜力。
玫瑰红-SARS-CoV-2复合物形成
和病毒滴度/活力研究
在该实施方案的相关方面，Vero细胞和源自肺腺癌胸腔积液的肺上皮细胞系Calu-3(ATCC HTB-55)用于这些研究。Tseng et al.,J Virol 79(15):9470-9479(2005)先前的研究表明，冠状病毒(SARS-CoV)可以有效感染Calu-3细胞，引起细胞病变效应，这一过程反映了其肺感染的自然过程。这些细胞已显示在顶端表面表达SARS-CoV的功能性受体血管紧张素转换酶2(ACE-2)，并且ACE-2和病毒共同定位于受感染细胞的顶端区域。
用如在以前的研究中证明是最佳的病毒浓度在有和没有不同浓度的玫瑰红的情况下处理细胞。在第一项研究中，就浓度范围约为1至100μM的玫瑰红(RB)研究了与RB接触48小时后Vero细胞中的细胞活力和病毒滴度。在该研究中，在至多约50μM观察到病毒滴度完全抑制而细胞活力保持正常。这表明RB能够在对细胞活力没有影响的浓度下阻断病毒复制(图6A)。
下一项研究也在Vero细胞中进行，包括扩大较低浓度以鉴定滴定数据。在该研究中，注意到病毒滴度的剂量依赖性降低，从0.01μM到约100mM RB与受感染的Vero细胞接触48小时，在这些浓度下，未观察到对细胞活力的影响(图6B和6C)。48小时后获得的抑制值为EC50＝0.054μM、CC50＝174.8μM和SI＝3211。在Calu-3细胞中进行的48小时RB接触研究中也看到了类似的结果；(EC50＝0.015μM)。这些发现表明RB能够在这些细胞中实现病毒结合抑制和随后的复制。
半数最大有效浓度(EC50)是指在特定暴露时间后，在基线和最大值之间引起半数反应的药物、抗体或毒物的浓度。50％细胞毒性浓度(CC50)定义为使细胞活力降低50％所需的化合物浓度(μg/mL)。选择性指数(SI＝CC50/EC50))提供了衡量化合物是否对病毒或宿主细胞具有选择性的量度。EC50、CC50和SI值是根据添加RB后48小时获得的数据计算的。
使用瑞德西韦进行的研究
在该实施方案的另一方面，从图8A、8B和8C中的数据可以看出，SARS-CoV-2感染的Vero C1008细胞显示出对瑞德西韦治疗敏感。由添加RB和瑞德西韦后2小时测量的抑制数据确定IC50和EC50值各自为0.86μM。
SARS-CoV-2感染的Vero C1008细胞也与浓度增加的RB和恒定浓度的瑞德西韦(0.15μM)接触，并且在没有瑞德西韦的情况下分别接触。从图9A、9B和9C中的数据可以看出，发现受感染的细胞对单独的RB敏感，并且在RB和瑞德西韦同时存在的情况下更敏感。与RB接触2小时后，计算单独的RB抑制的IC50值为67.0μM，而RB加0.15μM瑞德西韦在相同的2小时接触时间后的IC50值为47.4μM。
因此，瑞德西韦和RB似乎都有两种不同的抑制SARS-CoV-2病毒复制的机制：瑞德西韦似乎直接抑制病毒RNA依赖性RNA聚合酶以及模板链，而RB似乎抑制主要蛋白酶(Mpro)以及主要负责病毒进入被感染的细胞的病毒S蛋白和人ACE2蛋白之间的结合。有趣的是，这四种机制都是不同的并且彼此正交，因此它们不会相互干扰，这可以从两者一起使用减少病毒复制的事实中看出。
瑞德西韦通常通过肠胃外施用，如通过输注施用。如在下文中更充分讨论的，考虑的HX化合物、盐、酰胺或酯也优选肠胃外施用。这些药物中的每一种的冠状病毒结合量可以组合溶解或分散在单一药学上(或生理学)可接受的稀释剂中以形成药物组合物。每一种也可以作为单独的药物组合物肠胃外施用。或者，可以肠胃外施用瑞德西韦，而可以通过分开的药物组合物口服施用考虑的HX化合物。
卤代呫吨活化STING
我们使用成熟的急性单核细胞白血病(AML)细胞系(THP-1)作为研究STING体外活化的模型，已经发现玫瑰红(RB)是STING二聚化和由此产生的I型干扰素反应的促进剂。用RB处理细胞，并使用环磷酸鸟苷-磷酸腺苷(cGAMP)作为阳性对照，通过蛋白质印迹分析评估STING的诱导。
使用100μM RB或约0.01％ RB进行这些研究。在将RB添加到细胞培养基之前(0)以及之后的8、24和48小时进行细胞因子测定。
通过免疫沉淀纯化在RB存在下与STING相关的蛋白质，并通过质谱(LC-MS/MS)进行分析。使用
Figure BDA0003956005960000251
基于多重珠基测定系统(Bio-Rad Laboratories,Inc.)对RB处理细胞的培养上清液中的一组42种免疫细胞因子进行探测。
THP-1 AML细胞暴露于RB导致出现由特异性抗体检测到的新的约70-KD STING二聚体条带，图1A和1B(图中凝胶中的虚线框)。与cGAMP对照相比，没有发现PDL-1的诱导。对这些细胞中STING免疫沉淀物的质谱分析显示热休克蛋白(HSP)60、70和90以及多聚腺苷酸结合蛋白1(PABP1)与二聚STING复合物存在。
趋化因子测定显示一组不同的促炎和细胞毒性T细胞募集细胞因子的特异性上调(图1C-1R)。因此，如图所示，在24小时(>2倍)观察到单核细胞趋化蛋白3(MCP-3)和IFNγ的诱导峰值，在暴露于RB后24小时在IL-6、IL-8和干扰素γ诱导的蛋白10(IP-10)中的每一种中则可见约10倍增加。还注意到MCP-1水平显著增加。
这些结果表明RB诱导的STING二聚化和HSP结合导致急性促炎和免疫反应(即，在24-48小时内)。其他体外研究证实，RB在溶液中诱导STING二聚化(即，该作用不依赖于癌细胞内的作用)。
AML模型和随后的研究表明，HX化合物、例如RB能够诱导急性STING二聚化。这在肿瘤学中具有重要意义，其中STING介导的免疫活化能够在抗肿瘤治疗中的先天性和适应性免疫系统反应中发挥关键作用，无论是作为单剂免疫治疗，如采用Dees et al.的美国专利第7,648,695号描述的注射肿瘤药物，还是其中如Eagle et al.的美国专利第9,107,887号所述的此类药物与其他药物一起用于联合治疗。
这些结果还表明，基于HX化合物诱导的STING二聚化在病毒学中具有重要意义，其中STING介导的免疫活化能够在抗病毒治疗中的先天性和适应性免疫系统反应中发挥关键作用，无论是作为单剂抗病毒药物还是与其他抗病毒药物联合治疗。如前所述，HX分子或盐(化合物)的佐剂量是诱导STING二聚化的量(即STING二聚化诱导量)，并且进一步定义为小于细胞毒性量并且优选小于细胞毒性量的约75％的HX化合物的量。细胞毒性量是肿瘤学适应症(例如，神经母细胞瘤、白血病、黑色素瘤或其它肿瘤)的IC50量，而对于传染病，细胞毒性量是正常组织(例如，培养的成纤维细胞、肾细胞等)的IC50量。
HX化合物的短的人循环半衰期(约30分钟)有助于有效应用这些分子进行急性STING活化，使先天性免疫信号传导潜力最大化，同时避免可能导致反作用的炎症反应、可能的自身免疫性疾病或促进肿瘤发生的慢性活化。从图1C–1R所示的体外结果可以看出，在16种细胞因子中的每一种中，RB对增强细胞因子产生的影响在48小时内发生。
施用一种或多种全身剂量对于启动免疫反应可能特别有效，特别是在免疫能力降低的患者中。如下文所讨论的，这种方法同样适用于将HX化合物用作癌症或微生物感染的免疫佐剂。
卤代呫吨作为免疫原佐剂
对抗病毒感染的常用备选方法是使用疫苗。这些药物传统上基于在经感染暴露于活病毒之前将患者的免疫系统暴露于减弱或灭活的病毒或病毒抗原。该过程使患者能够产生适应性免疫反应，能够防止嗜性组织在暴露于病毒后受到严重感染。
病毒基因组的阐明允许基于对病毒结构(即表面蛋白)建模进行合成疫苗开发，以指导新抗病毒策略的鉴定或合成[Graham et al.,Ann Rev Med 70:91-104(2019)]。特征性SARS-COV-2表面刺突(S)糖蛋白结构的公开为此类重点开发提供了重要靶标[Wrapp etal.,Science 367:1260-1263(2020)]。
这种独特的CoV刺突蛋白为禁用病毒功能(即防止附着到嗜性细胞或病毒解包装和复制)或通过增加病毒对宿主免疫系统的抗原性作为免疫佐剂提供了备选靶标。由于CoV表面刺突在CoV中在很大程度上是保守的，因此其作为抗CoV药物和疫苗开发的潜在广谱靶标特别有吸引力。
特别是，RB及其HX化合物类似物对糖蛋白的极高亲和力具有以下潜力：通过抑制CoV与嗜性细胞的附着或通过抑制病毒在感染细胞内的解包装和复制来禁用病毒功能；并通过与病毒表面糖蛋白结构、例如CoV刺突糖蛋白复合后增加病毒对宿主免疫系统的抗原性作为免疫佐剂。在广泛感染开始之前的早期暴露期间可以使用增加的抗原性来增强宿主免疫反应。
卤代呫吨为肿瘤学和病毒学提供新的、广泛的适用性
上述讨论举例说明，RB及其HX化合物类似物在肿瘤学和病毒学中具有以前未被构思或公开的新作用。由于这类分子对STING二聚化的影响，在肿瘤学和病毒学中都有作为免疫佐剂的作用。此外，如前所述，对生物分子的高结合亲和力以及RB和其他HX化合物的独特化学结构导致其作为对抗病毒复制的阻断剂的作用。
这种亲和力还能够通过与病毒包膜突起(即阻断细胞受体结构)或其他病毒表面结构的结合来阻断病毒附着。由于HX化合物的卤素组成可以变化，针对特异性靶标的3维拟合可以通过改变卤素含量进行优化(例如用氟或溴或其混合物取代位置4-、5-、6-或7-处的一个或多个氯原子)，和/或通过用氟或溴或其混合物取代位置2'-、4'-、5'-或7'-处的一个或多个碘原子)，或通过在这些位置中一个或多个处的脂肪族取代。或者，这类分子能够抑制病毒功能(通过与病毒表面刺突糖蛋白或其他病毒表面结构或与病毒相互作用组中的宿主蛋白的复合来抑制对嗜性细胞的附着或病毒的解包装和复制)或通过这种复合增加病毒的抗原性。
除了作为利用SARS-CoV-2表面刺突糖蛋白多肽作为SARS-CoV-2疫苗的一部分的疫苗的有用佐剂外，RB和其他HX化合物还能够用作针对其他感染因子(例如其他病毒、细菌、真菌和单细胞寄生虫)的佐剂，特别是使用这些感染因子的蛋白质免疫原。示例性病毒包括流感、甲型、乙型、丙型和丁型肝炎病毒、疱疹病毒如水痘带状疱疹(Varicellazoster)(水痘)、1型和2型单纯疱疹(HSV1和HSV2)、人乳头瘤病毒(HPV)等。示例性细菌病原体包括大肠杆菌、粪杆菌(E.faecalis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)等。示例性的单细胞寄生虫是恶性疟原虫(P.falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、伯氏疟原虫(P.bergeii)或约氏疟原虫(P.yoelli)的疟疾孢子体。示例性真菌感染因子包括白色念珠菌(Candidaalbicans)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、热带念珠菌(Candida tropicalis)和克鲁斯念珠菌(Candida krusei)。
示例性蛋白质免疫原和疾病相关标志物分子肽在WO 2020028532中公开，并引用了其已发表的来源。
美国专利第6,942,866号包括以下肽表位：
疟疾B细胞表位
恶性疟原虫
间日疟原虫
伯氏疟原虫
约氏疟原虫
疟疾通用T细胞表位
恶性疟原虫
间日疟原虫
约氏疟原虫
美国专利第8,017,127号包括以下肽表位：
甲型流感M2蛋白B细胞表位
如美国专利第8,017,127号中所述，M2蛋白在被甲型流感病毒株感染的细胞中表达。M2蛋白的N端残基1-24通过受感染细胞的膜延伸。该蛋白的细胞外部分被称为M2e。因此，使用甲型流感的该蛋白的细胞外M2e部分作为免疫原性标志物能够提供对所有流感毒株的保护。因此，能够避免流感疫苗选择的年际变化。
美国专利第4,599,231号包括以下肽表位：
乙型肝炎病毒表面抗原
乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)提供B细胞和T细胞多肽表位。美国专利第4,599,231号中公开的每种表位类型的许多列在下面的表中，以及它们的肽名称，以及来自N端的括号序列位置，如该专利中引用的基于来自ayw供体(P49)和adw供体(P72和P73)的DNA。
B细胞表位
美国专利第5,180,806号包括以下表位：
人乳头瘤病毒(HPV)标志物肽
乳头瘤病毒诱导皮肤或粘膜上皮的良性、异型增生和恶性过度增生。已经鉴定了超过50种人乳头瘤病毒(HPV)类型(毒株)。在人中，已知不同的乳头瘤病毒类型会引起不同的疾病。例如，HPV的1型和2型引起寻常疣，6型和11型引起尖锐湿疣和生殖器扁平疣。相比之下，HPV的16、18和33型在大多数宫颈癌中携带，不会引起通常的尖锐湿疣，而是弥漫性地持续在宫颈内皮中，仅表现出最小的病理变化。据认为，与宫颈癌相关的HPV类型在最初感染后数年内在宫颈内皮组织中维持潜伏状态，然后在某些情况下进展导致宫颈癌。
美国专利第5,180,806号公开了诱导抗体产生的几种肽序列。与16型HPV序列相关的示例性肽标志物公开于美国专利第5,180,806号中。该专利还公开了18型和33型的肽序列，以及由HPV的6、11、18和33型的E2 ORF编码的序列。
卤代呫吨的体内用途
Swift et al.,OncoTargets and Ther 12:1293-1307(2019)中提供的数据举例说明，在体外细胞毒性测定中RB针对几种小儿实体瘤癌细胞系(培养的SK-N-AS、SK-N-BE(2)、IMR5、LAN1、SHEP和SK-N-SH神经母细胞瘤细胞，以及SK-N-MC神经上皮瘤细胞)发挥其最大抑制作用的一半的浓度(IC50值)在49至85μM的范围内。这些作者还报道了RB针对正常对照细胞(原代骨髓和正常成纤维细胞)的IC50值为93至143μM。
使用一组用RB处理的11种市售可得的衍生自原发性或复发性小儿白血病患者的白血病细胞系进行的体外细胞培养活力测定，示例的平均IC50值原代细胞系为92.8μM，难治性细胞系为122.5μM。[Swift et al.,Blood,132,No.Suppl 1:5207(November 21,2018).]
本文提供的数据还表明，当THP-1 AML细胞暴露于浓度为100μM的RB时，观察到STING二聚化；并且在这种接触时在这样的细胞中观察到细胞因子和趋化因子的产生。
基于RB二钠的分子量为1018g/mole，通过给予100mg RB作为单次IV推注对标准血容量约5L的成年人进行RB的经典IV诊断使用，在血液中达到约20mg/L的浓度，或约20μMRB。如上述的Swift et al.2019或Swift et al.2018的结果所示，在这样的水平下暴露对实体瘤或恶性血液病的直接细胞毒性作用最小。
在PV-10(注射用生理盐水中10％的RB二钠)的临床研究中，当肿瘤内递送时，RB在进入血管内渗时以1500mg的推注剂量耐受；这相当于在血液中约300mg/L的暴露量(300μMRB)。
因此，RB可以通过全身途径施用，例如静脉(IV)输注，其水平(即约50至100μM或更低)不太可能引起可引起STING二聚化(即高达约50至100μM)的很大一部分肿瘤组织的直接细胞毒性。
避免对肿瘤细胞的直接细胞毒性对于避免可能由快速杀死的肿瘤细胞负荷引起的毒性反应(即肿瘤裂解综合征)可能更可取。Howard et al.,N Engl J Med 364(19):1844–1854(May 12,2011)报道了肿瘤裂解综合征是治疗血液癌的医生遇到的最常见的与疾病相关的紧急情况。
由于RB从人循环中快速清除(t1/2约30分钟)，连续输注可用于在单次施用期间维持循环中RB的峰值水平(即，长达数小时或更长时间)。
HX化合物的短的循环半衰期有助于有效应用这些分子进行急性STING活化，使先天性免疫信号传导潜力最大化，同时避免可能导致反作用的炎症反应和可能的自身免疫性疾病的慢性活化。
施用一种或多种全身剂量对于启动免疫系统反应可能特别有效，特别是在免疫能力降低的患者中。这种方法同样适用于将HX化合物用作癌症或微生物感染的免疫佐剂。
全身或区域施用可以通过IV施用、缓慢IV输注、连续IV输注、口服施用、气溶胶吸入或建立皮下库或类似手段来实现。通过可切割的键，例如与纳米颗粒、可注射填料或类似载体的酯化，可以将HX化合物与未吸收或缓慢吸收的载体复合，从而实现从库中延长释放。
患有微生物感染，例如病毒或细菌感染，或癌症，例如白血病、神经母细胞瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌等，需要治疗(哺乳动物受试者)并且可向其施用含有HX化合物或其药学上可接受的盐或RB二钠的药物组合物的哺乳动物受试者，可以是灵长类动物如人，猿类如黑猩猩或大猩猩，猴子如食蟹猴或猕猴，实验动物如大鼠、小鼠或兔子，伴侣动物如狗、猫、马，或食用动物如牛或驯鹿、绵羊、羔羊、猪、山羊、美洲驼等。
如上所述，避免在单次治疗期间通过细胞毒性直接杀死大部分癌细胞是有利的。因此，本发明可以提供一种用于启动I型IFN免疫反应和下游活化适应性免疫反应并且毒性反应的风险最小的工具。
除了指导肿瘤学的剂量选择外，这些浓度范围还为选择RB和相关HX化合物的抗病毒使用的临床参数建立了公认范围。具体而言，要注意的是，浓度为300μM及更低是耐受的，浓度为100μM及更低是优选的，以避免对正常组织的潜在毒性发作。
下面列出的类似有用的卤代呫吨化合物及其药学上可接受的盐可以具有彼此相差约三倍的分子量(参见美国专利第7,390,688号表3的第15-16列)。优选的是，要使用的特定HX化合物的确切量是根据每种此类化合物或RB的分子量计算的。
考虑的HX化合物包括特别优选的玫瑰红(4,5,6,7-四氯-2’,4',5',7'-四碘-荧光素；RB)、赤藓红B、荧光桃红B、4,5,6,7-四溴-2’,4',5',7'-四碘-荧光素、2’,4,5,6,7-五氯-4',5',7'-三碘荧光素、4,4’,5,6,7-五氯-2',5',7'-三碘荧光素、2’,4,5,6,7,7’-六氯-4’,5’-二碘荧光素、4,4’,5,5’,6,7-六氯-2’,7’-二碘荧光素、2’,4,5,5’,6,7-六氯-4’,7’-二碘荧光素、4,5,6,7-四氯-2’,4’,5’-三碘荧光素、4,5,6,7-四氯-2’,4’,7’-三碘荧光素、4,5,6,7-四溴-2’,4’,5’-三碘荧光素和4,5,6,7-四溴-2’,4’,7’-三碘荧光素。
读者请阅读Berge,J.Pharm.Sci.1977 68(1):1-19，了解常用的药学上可接受的酸和碱的清单，这些酸和碱与药物化合物(例如上述卤代呫吨)形成药学上可接受的盐。示例性阳离子包括碱金属如钠、钾，以及铵盐和碱土盐，如镁和钙。玫瑰红的二钠盐是特别优选的。
也可以使用上述卤代呫吨化合物之一的C1-C4烷基酯，其中C2即乙酯，是优选的。因此，使用RB、乙基红3(赤藓红乙酯；2',4',5',7’-四碘-荧光素乙酯)、4,5,6,7-四溴-2',4',5',7’-四碘荧光素和乙基-荧光桃红B(4,5,6,7-四氯-2',4',5',7’-四溴荧光素乙酯)中的每一种的体外研究对CCL-142肾腺癌表现出相似的抗肿瘤活性。当使用芳族酯时，优选苄基或苯基酯。
HX化合物的羧基也可用于形成酰胺基团。酰胺氮原子可以是未取代的[-C(O)-NH2]、用C1-C4烷基[-C(O)-NHR1，其中R1是C1-C4烷基]单取代、或者用两个独立选择的C1-C4烷基[-C(O)-NR1R2，其中R1和R2各自独立地为相同或不同的C1-C4烷基]二取代。或者，R1和R2基团与酰胺氮原子一起形成5-或6-元环。
此外，HX化合物羧基能够形成芳族衍生物，即酯或单取代酰胺。此类衍生物的芳环是包含0、1或2个独立为氮、氧或硫的杂环原子的单个5-或6-元芳环或5,6-或6,6-稠合芳环系统。
其芳环部分是苯基、苄基或2-、3-或4-吡啶基(吡啶基)的芳族衍生物是目前优选的。然而，可以考虑其它含芳族单环和稠环的酯和酰胺。这种芳族酯和酰胺衍生物基团的示例性实例如下图所示并命名，其中Z为O或NH，线-Z表示环氧或环氮可以来自环的任何可用碳，并且与波浪线交叉的Z-线表示所描绘的烷氧基或氨基是另一分子即酯化或酰胺化的HX分子的一部分。
Figure BDA0003956005960000321
Figure BDA0003956005960000331
还可以使用上述HX化合物之一的脂肪族或芳族衍生物，例如由Singer et al.的美国专利第8,530,675号中的图1表示的2,3,4,5-四氯-6-(6-羟基-2,4,5-三碘-7-异丙基-3-氧代-3H-呫吨-9-基)苯甲酸二钠[4,5,6,7-四氯-2’,4',5'-三碘-7’-异丙基荧光素]，和通过在2、3、4、5、2'、4'、5'或7'的一个或多个位置上附着一个或多个脂族或芳香族部分而形成的类似的脂肪族或芳族衍生物。
RB的优选形式是玫瑰红二钠，其结构式如下：
Figure BDA0003956005960000332
含有上述HX化合物的药物组合物的医药用途的进一步细节描述于美国专利第5,998,597号、第6,331,286号、第6,493,570号、第7,390,688号、第7,648,695号、第8,974,363号、第9,107,887号、第9,808,524号、第9,839,688号、第10,130,658号和第10,471,144号，其公开内容通过引用全文并入本文。
考虑的HX或其药学上可接受的盐通常溶解或分散在水性药物组合物中使用。HX化合物通常在水性0.9％生理盐水药物组合物中以0.1至约20％(w/v)存在。
因为考虑的药物组合物通常旨在用于通过IV方法进行肠胃外施用，这样的组合物应含有电解质，并且优选具有近似的生理渗透压和pH值。在药学上可接受的水性介质中，单独带电荷的电解质离子的优选浓度为约0.5至约1.5％(w/v)，更优选在约0.8至约1.2％(w/v)下，最优选为浓度为约0.9％(w/v)。约0.9％(w/v)浓度是特别优选的，因为它对应于近似等渗水性溶液。在进一步的优选实施方案中，考虑的药物组合物中的电解质是氯化钠。
电解质在这样的水平上增加药学上可接受的水性介质的渗透压。因此，作为指定电解质浓度范围的备选方法，渗透压可用于部分表征组合物的电解质水平。优选的是，组合物的渗透压大于约100mOsm/kg，更优选组合物的渗透压大于约250mOsm/kg，并且最优选为约300至约500mOsm/kg。
优选的是，药学上可接受的水性介质的pH值为约4至约9，以产生HX化合物在水性载体中的最大溶解度并确保与生物组织的相容性。特别优选的pH值为约5至约8，并且更优选为约6至约7.5。在这些pH值下，卤代呫吨通常保持二元形式，而不是在低pH值下形成的不溶于水的内酯。
可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法进行调节或调整药学上可接受的水性介质的pH值。组合物可以通过加入酸或碱等来缓冲或调节pH值。由于卤代呫吨或其生理上可接受的盐是弱酸，因此取决于卤代呫吨的浓度和/或电解质的浓度，组合物的pH值可能不需要使用缓冲液和/或pH修饰试剂。然而，特别优选的是，组合物中不含任何缓冲液(不含缓冲液或无缓冲液)，允许其在施用后符合生物环境。
考虑的适于口服施用、吸入或其它非胃肠外施用途径的备选药物组合物，可以使用本领域标准的方法配制和递送用于此类施用途径。
在本发明中，施用的HX化合物如RB或RB二钠的具体量被认为不如将组合物在肿瘤内注射到肿瘤中的情况那么重要，因为这里的目的是最终向患病细胞的环境提供治疗活性浓度的HX化合物，并且在其中这些患病细胞可以与HX化合物在足够水平上接触，以通过STING活化或依赖于特定适应症的抗病毒活性来诱发治疗效果。
在抗病毒适应症中可用于与HX化合物联合治疗的第二种治疗剂是抗体或抗体混合物(mixture)(有时称为“抗体混合物(cocktail)”)。此类抗体的示例是这样的单克隆抗体，其与病毒刺突蛋白发生免疫反应，从而抑制病毒与人细胞的结合。通过输注施用这些单克隆抗体。
一种对病毒刺突蛋白具有免疫反应性的抗体即单克隆抗体bamlanivimab，于2021年3月17日在美国加利福尼亚州、亚利桑那州和内华达州获得美国FDA的紧急使用授权(EUA)的作为单一药剂解除，原因是存在对bamlanivimab抗药的所谓“加利福尼亚”变体(突变逃逸)。制造商Eli Lilly and Company的发言人当天报道，当bamlanivimab与单克隆抗体etesevimab一起使用时，对该变体的中和作用得以维持。
由Regeneron Pharmaceuticals以商品名REGN-COV出售的另一对刺突蛋白反应性单克隆抗体即casirivimab和imdevimab，于2020年11月21日从美国食品和药品监督管理局获得EUA。这些单克隆抗体在两个不同位置与病毒刺突蛋白发生免疫反应，并且当如此结合时，阻止病毒进入人体细胞。以含有等量每一种的混合物施用这些单克隆抗体。
如下文所示，由于HX化合物可以与病毒刺突蛋白复合，HX化合物与此类刺突蛋白反应性单克隆抗体的组合能够通过进一步干扰病毒结合来增强抗病毒活性，从而增加此类抗体的治疗活性并阻止突变逃逸。
完整的单克隆抗体，以及它们的含互补位的部分(含结合位点的部分)，如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv区域，以及单链抗体肽结合序列可能是有用的。如从包装说明书中可以看出的，完整的人源化单克隆抗体在人体中的半衰期约为一到三周。使用免疫检查点抑制剂作为说明，例如，
Figure BDA0003956005960000351
(伊匹单抗)终末t1/2＝15.4天；包装说明书12/2013；
Figure BDA0003956005960000352
(派姆单抗)终末t1/2＝23天；包装说明书03/2017]。单链抗体结合位点寡核苷酸或多肽在体内的半衰期往往较短。
瑞德西韦和上述讨论的单克隆抗体等药物的量、条件和时间均按照其美国FDA批准的包装说明书中规定的量、条件和时间进行施用。这些量被视为有效量。例如，对于12岁及以上且体重至少40kg的人，瑞德西韦在第1天以单次负荷剂量200mg施用，然后从第2天开始每天一次维持剂量100mg输注30到120分钟。对于不需要有创机械通气和/或体外膜氧合(ECMO)的患者，推荐的总治疗持续时间为5天。如果患者没有表现出临床改善，治疗可另外延长至多5天。
如上所述，HX化合物与瑞德西韦或单克隆抗体在同一天施用。两种药物即HX化合物如RB和单克隆抗体优选以分开的组合物施用。优选在几分钟至约8小时内施用两种类型的药物。更优选地，两者都在另一个不到一小时的内施用。换句话说，这两种类型的药物是按重叠的时间表施用的，最好在彼此的一小时内施用。
如本文所用，“施用”用于表示治疗方案的开始。因此，吞咽片剂或其他口服剂型是治疗方案的开始，就像IV输液开始的时间一样。当第一和第二抗癌剂一起存在于相同的单一组合物中时，当该单一组合物进入受试者的身体时，施用开始。
方法和结果
复合物形成的计算机建模
使用AutoDock Vina[Dr.Oleg Trott,Molecular Graphics Lab,ScrippsResearch Institute,La Jolla,CA]和BIOVIA Discovery Studio[Dassault SystèmesBIOVIA,Discovery Studio Modeling Environment,Release 2017,San Diego,CA]平台在计算机上执行灵活的配体-受体对接并基于原子间距离确定总体结合能来制备计算机模型。
基于先前讨论的与图6A-6C相关的发现，设计了一组研究，使用基于编码病毒包膜蛋白(E基因产物)的病毒RNA(vRNA)的定量聚合酶链反应(qPCR)的测定，以提供这些数据背后的某些特异性方面。在这些研究中，在添加到细胞之前，用RB预孵育病毒。实验条件如下表1所述。
表1
qPCR处理概述
细胞预处理：
·用RB预处理细胞(0.6μM，1小时)，除去RB，加入病毒(1小时)，洗涤细胞，加入生长培养基
病毒预处理：
·用RB预处理病毒(0.6μM，1小时)，将病毒+RB混合物添加到细胞(1小时)，洗涤细胞，加入生长培养基
病毒+RB吸附：
·将病毒+RB添加到细胞(1小时)，洗涤细胞，加入生长培养基
正常：
·将病毒添加到细胞(1小时)，洗涤细胞，加入RB/生长培养基
吸附后加入RB：
·将除去添加到细胞(1小时)，除去病毒，加入生长培养基(1小时)，除去，加入RB/生长培养基(2小时)
(+)对照：
·将病毒添加到细胞(1小时)，洗涤细胞，加入生长培养基。
所有条件孵育16小时，然后收获病毒上清(sups)，提取vRNA并进行qPCR
抑制后，通过PCR测量细胞病毒E基因表达的拷贝数。图7B中给出的结果表明，当用RB预处理病毒时，观察到较低的拷贝数，可能在与随后与细胞受体相互作用之前阻断的病毒区域的结合方面领先一步(p<0.05)。
与对照组相比，同时添加病毒和RB仍然显示出减少，但减少较少，表明RB至少部分与病毒成分相互作用的可能性。通过观察进一步证实了这一点，即在病毒与细胞孵育后添加RB没有效果，从而确认E基因拷贝数的减少是由RB与病毒的相互作用介导的，其方式是干扰随后的病毒附着和复制。
作为对照，在新病毒有机会繁殖之前，在感染后16小时检查亚基因组病毒RNA的水平(图7A)。循环阈值(ct，扩增病毒核酸所需的逆转录循环数)指示存在病毒的量，数据显示用RB处理的病毒的ct值较高，证实了图7B中直接测量结果中看到的趋势，并且RB对病毒复制产生不利影响。增加RB浓度和孵育时间的研究正在进行中，以确定是否能实现更好地阻断病毒传染性。
材料与方法
在37℃与5％CO2下，将Vero C1008细胞(
Figure BDA0003956005960000382
CRL-1586TM)维持在推荐的生长培养基(补充有10％FBS(
Figure BDA0003956005960000383
30-2020TM)、10单位青霉素/10μg/ml链霉素(GibcoTM15140148)的伊格尔氏最低限度基本培养基(
Figure BDA0003956005960000381
30-2003TM))中。从BEIResources(NR-52281)获得严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)分离株USA-WA1/2020。
蚀斑减少测定
将细胞以浓度为4x105个细胞/孔(2ml/孔)接种在6孔板(FalconTM353046)中的补充有10％FBS的生长培养基中，并在37℃与5％CO2下孵育过夜(约18小时)。
为了测试SARS-CoV-2对瑞德西韦(GS-5734TM，MedKoo Biosciences,Inc.)的敏感性，除去生长培养基，用PBS(CorningTM21031CV)洗涤细胞一次，并在补充有2％FBS的生长培养基中感染约60个蚀斑形成单位(PFU)的SARS-CoV-2，一式三份。孵育1小时后，每15分钟摇动一次，除去SARS-CoV-2，随后用3ml含有0.4％微晶纤维素和DMSO或递增量的瑞德西韦(0.156、0.312、0.625、1.25和2.5μM)的培养基覆盖细胞，并在37℃与5％CO2下孵育。孵育96小时后允许蚀斑形成，除去覆盖物并用10％缓冲的福尔马林磷酸盐(1ml；Fisher SF100)固定细胞单层1小时，用水洗涤一次，用1％结晶紫(600μl；Sigma C3886，在20％甲醇中稀释)染色10分钟。除去结晶紫后，用水洗涤细胞一次，并计数蚀斑。
为了评估RB与瑞德西韦联合使用针对SARS-CoV-2的治疗效果，在感染后依次施用药物，首先是RB，然后是固定剂量的瑞德西韦。用PBS洗涤一次细胞，并在补充有2％FBS的生长培养基中感染约60PFU的SARS-CoV-2。孵育1小时后，每15分钟摇动一次，除去SARS-CoV-2，并加入2ml含有1、5、20和50μM的RB和适当的对照组(仅0.9％生理盐水或培养基)，一式三份。孵育2小时后，除去RB，用PBS洗涤细胞一次，并用3ml含有0.4％微晶纤维素和0.15μM或DMSO的培养基覆盖细胞。孵育96小时以允许蚀斑形成后，如上所述观察蚀斑。该测定一式两份进行。
为了更好地模仿SARS-CoV-2体内感染的RB治疗，在感染期间连续施用RB(细胞的感染前处理，感染期间和感染后处理，直到研究结束)。洗涤细胞并用2ml含有递增浓度的RB和对照(仅培养基或0.9％生理盐水)的培养基孵育2小时，一式三份。
测试的第一次重复的浓度为0.5、1、5、10、20、50、75和100μM RB，第二次重复则调整为0.5、1、5、10、20、30、40和50μM。除去培养基，然后加入RB和约60PFU的SARS-CoV-2混合物1小时，每15分钟摇动一次。之后，除去病毒-药物混合物并用含RB的覆盖物代替。孵育96小时以允许蚀斑形成后，如上所述观察蚀斑。
作为阳性对照，在SARS-CoV-2感染期间和覆盖物中向孔中加入5μM瑞德西韦96小时。该测定一式两份进行。
使用RB的所有步骤都是在红灯下进行的。通过GraphPad Prism 8.0软件计算IC50和EC50值(非线性回归分析)。
冠词“a”和“an”在本文中用于指代冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，至少一个)。举例来说，“一个元件”是指一个元件或多于一个元件。本文引用的每篇专利、专利申请和文章均通过引用并入本文。

Claims (34)

1.一种用于治疗哺乳动物受试者的冠状病毒感染的方法，该方法包括向所述哺乳动物受试者施用冠状病毒复合量的卤代呫吨(HX)、其药学上可接受的盐、其氮原子未被取代、被一个或两个相同或不同的C1-C4烷基取代或所述烷基与酰胺氮一起形成5-或6-元环的酰胺、其C1-C4烷基酯、其芳族衍生物，其中芳族衍生物是由具有包含0、1或2个独立为氮、氧或硫的杂环原子的5-或6-元芳环或5,6-或6,6-稠合芳环系统的醇或单取代胺形成的酯或酰胺。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述HX是玫瑰红二钠。
3.根据权利要求1所述的方法，其中重复进行所述施用。
4.一种在出现微生物感染的哺乳动物受试者中诱导I型干扰素(IFN)反应的方法，该方法包括施用有效诱导STING二聚化的一定量的卤代呫吨(HX)、其药学上可接受的盐、其氮原子未被取代、被一个或两个相同或不同的C1-C4烷基取代或所述烷基与酰胺氮一起形成5-或6-元环的酰胺、其C1-C4烷基酯、其芳族衍生物，其中芳族衍生物是由具有包含0、1或2个独立为氮、氧或硫的杂环原子的5-或6-元芳环或5,6-或6,6-稠合芳环系统的醇或单取代胺形成的酯或酰胺。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述HX是玫瑰红二钠。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述C1-C4烷基酯是C2酯。
8.根据权利要求4所述的方法，其中所述微生物感染是病毒感染。
9.根据权利要求4所述的方法，其中所述微生物感染是细菌感染。
10.根据权利要求4所述的方法，其中所述微生物感染是真菌感染。
11.一种在患有癌性肿瘤的哺乳动物受试者中诱导I型干扰素(IFN)反应的方法，该方法包括全身施用有效诱导STING二聚化的一定量的卤代呫吨(HX)、其药学上可接受的盐、其氮原子未被取代、被一个或两个相同或不同的C1-C4烷基取代或所述烷基与酰胺氮一起形成5-或6-元环的酰胺、其C1-C4烷基酯、其芳族衍生物，其中芳族衍生物是由具有包含0、1或2个独立为氮、氧或硫的杂环原子的5-或6-元芳环或5,6-或6,6-稠合芳环系统的醇或单取代胺形成的酯或酰胺。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述HX是玫瑰红二钠。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述C1-C4烷基酯是C2酯。
15.一种在患有恶性血液病的哺乳动物受试者中诱导I型干扰素(IFN)反应的方法，该方法包括向所述哺乳动物受试者全身施用有效诱导STING二聚化的低于细胞毒性量的卤代呫吨(HX)、其药学上可接受的盐、其C1-C4烷基酯、其或其他脂肪族或芳族衍生物、其氮原子未被取代、被一个或两个相同或不同的C1-C4烷基取代或所述烷基与酰胺氮一起形成5-或6-元环的酰胺、其C1-C4烷基酯、其芳族衍生物，其中芳族衍生物是由具有包含0、1或2个独立为氮、氧或硫的杂环原子的5-或6-元芳环或5,6-或6,6-稠合芳环系统的醇或单取代胺形成的酯或酰胺。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述HX是玫瑰红二钠。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述C1-C4烷基酯是C2酯。
19.一种增强哺乳动物免疫原特异性免疫反应的方法，该方法包括使存在于体内的哺乳动物细胞与佐剂有效量的卤代呫吨(HX)、其药学上可接受的盐、其氮原子未被取代、被一个或两个相同或不同的C1-C4烷基取代或所述烷基与酰胺氮一起形成5-或6-元环的酰胺、其C1-C4烷基酯、其芳族衍生物和待针对其增强免疫反应的免疫原接触，其中芳族衍生物是由具有包含0、1或2个独立为氮、氧或硫的杂环原子的5-或6-元芳环或5,6-或6,6-稠合芳环系统的醇或单取代胺形成的酯或酰胺。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述卤代呫吨是玫瑰红二钠。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述免疫原是病毒蛋白质肽序列。
22.一种用于治疗哺乳动物受试者的冠状病毒感染的方法，该方法包括向所述哺乳动物受试者施用有效量的瑞德西韦和冠状病毒复合量的卤代呫吨(HX)、其药学上可接受的盐、其氮原子未被取代、被一个或两个相同或不同的C1-C4烷基取代或所述烷基与酰胺氮一起形成5-或6-元环的酰胺、其C1-C4烷基酯、其芳族衍生物，其中芳族衍生物是由具有包含0、1或2个独立为氮、氧或硫的杂环原子的5-或6-元芳环或5,6-或6,6-稠合芳环系统的醇或单取代胺形成的酯或酰胺。
23.根据权利要求22所述的方法，其中瑞德西韦和HX均为胃肠外施用。
24.根据权利要求23所述的方法，其中瑞德西韦和HX均由同一组合物施用。
25.根据权利要求22所述的方法，其中肠胃外施用瑞德西韦而口服施用HX。
26.根据权利要求22所述的方法，其中所述HX作为药学上可接受的盐存在于所述药物组合物中，该盐是玫瑰红二钠。
27.一种药物组合物，其包含冠状病毒复合量的以下中的每一种：瑞德西韦和卤代呫吨(HX)、其药学上可接受的盐、其氮原子未被取代、被一个或两个相同或不同的C1-C4烷基取代或所述烷基与酰胺氮一起形成5-或6-元环的酰胺、其C1-C4烷基酯、其芳族衍生物，其中芳族衍生物是由具有包含0、1或2个独立为氮、氧或硫的杂环原子的5-或6-元芳环或5,6-或6,6-稠合芳环系统的醇或单取代胺形成的酯或酰胺，其溶解或分散在生理可接受的水性载体中。
28.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述HX作为药学上可接受的盐存在于所述药物组合物中。
29.根据权利要求28所述的药物组合物，其中所述HX的药学上可接受的盐是玫瑰红二钠。
30.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述芳族衍生物是由选自苄基、苯基、吡啶基、噻吩基、呋喃基、噁唑基、噻唑基、萘基、喹啉基、喹喔啉基、苯并呋喃基、苯并[b]噻吩基和苯并噁嗪基的醇或胺中的一种或多种的醇或单取代胺形成的酯或酰胺。
31.一种用于治疗哺乳动物受试者的冠状病毒感染的方法，该方法包括向所述哺乳动物受试者施用有效量的与冠状病毒刺突蛋白结合的完整抗体或其含有互补位的部分和冠状病毒复合量的卤代呫吨(HX)化合物、其药学上可接受的盐、其氮原子未被取代、被一个或两个相同或不同的C1-C4烷基取代或所述烷基与酰胺氮一起形成5-或6-元环的酰胺、其C1-C4烷基酯、其芳族衍生物，其中芳族衍生物是由具有包含0、1或2个独立为氮、氧或硫的杂环原子的5-或6-元芳环或5,6-或6,6-稠合芳环系统的醇或单取代胺形成的酯或酰胺。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述HX化合物或其药学上可接受的盐为玫瑰红或玫瑰红二钠。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述抗体是完整抗体。
34.根据权利要求1、3、4、6、8-11、13、15、17、19、22-25、31或33中任一项所述的方法，其中所述芳族衍生物是由选自苄基、苯基、吡啶基、噻吩基、呋喃基、噁唑基、噻唑基、萘基、喹啉基、喹喔啉基、苯并呋喃基、苯并[b]噻吩基和苯并噁嗪基的醇或胺中的一种或多种的醇或单取代胺形成的酯或酰胺。
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