KR20200124661A - 종양 성장을 감소시키기 위한 미나프린의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암을 앓고 있는 환자에게 투여될 때 종양 성장을 감소시키기 위한 미나프린 디하이드로클로라이드 및 이의 유사체의 용도에 관한 것이다.

Description

종양 성장을 감소시키기 위한 미나프린의 용도

본 발명은 암을 앓고 있는 환자에게 투여될 때 종양 성장을 감소시키기 위한 미나프린 디하이드로클로라이드(Minaprine dihydrochloride) 및 이의 유사체의 용도에 관한 것이다.

방사선 요법은 암 치료에 사용되는 가장 일반적인 항-종양 전략 중 하나이다. 암 환자의 절반 이상이 방사선 요법으로 치료된다. 방사선 요법의 사용(단독으로 또는 수술 및 화학요법과 병용하여)은 두경부, 유방, 폐, 전립선, 소화 및 자궁 경부암의 종양을 관리하는 데 중추적이다¹. 종양 조직의 이온화 방사선(IR)에의 노출은 아폽토시스(apoptosis), 자가포식 세포사(autophagic cell death), 유사분열 카타스트로피(mitotic catastrophe) 또는 노쇠(senescence)와 같은 다양한 치명적 과정을 유발한다. 이러한 메카니즘은 조사된 조직에서 암 세포의 파괴에 기여하지만, 또한 조사된 종양 세포의 면역원성을 유도할 수 있고^2,3, 종양 미세환경을 변형시키고, 위험 신호(아데노신 트리포스페이트 및 HMGB1 단백질)^4,5의 방출, 푸린 수용체(특히, P2X7 및 P2Y2)⁴, TLR4 수용체^2,3 및 NLRP3 인플라마솜⁴의 활성화와 관련된 항-종양 면역 반응의 개발을 가능하게 할 수 있다. 국소적 종양 반응과 면역계의 자극 사이의 관계는 조사되지 않은 암 세포에 대한 원격 효과를 설명함으로써 예시된다. 또한, 압스코팔 효과(abscopal effect)로도 공지된 이러한 역설적 효과는 환자뿐만 아니라 상이한 뮤린 종양 모델에서 수년 동안 연구되어 왔다^6-9.

이의 검출은 인터페론(IFN) 감마 생성 T 세포의 다량의 전염증성 사이토카인(예: TNF α)의 존재와 긍정적으로 상관 관계가 있고, 효과적인 면역학적 반응의 개발이 관찰될 것을 필요로 한다^10,11. 이 효과는 또한 면역조절제(예: 이필리무맙 또는 인터류킨-2)와 병용하여 방사선 요법으로 치료된 환자에서 관찰된다. 압스코팔 효과의 설명은 방사선 요법에 대한 반응에 대한 면역계의 다양한 성분의 주요 기여의 많은 동물 모델에서 최근 설명을 보강한다. 면역 세포(종양-관련 대식세포, T 림프구 세포 및 수지상 세포 포함)의 중심 역할은 최근 면역학적 체크포인트의 조절제(예: CTLA4 또는 PD1에 대한 모노클로날 항체의 사용)에 의한 이들의 치료적 조절의 영향 또는 대식세포 활성화(CSF1R에 대해 지시된 모노클로날 항체에 의해)에 의해 연구되고 강조되었다. 항종양 치료 무기고에서 방사선 요법의 중심적 역할에도 불구하고, 종양 세포의 제거와 관련된 생물학적 방법이 여전히 부분적으로 정의되고 논쟁의 여지가 있다. 방사성-유도 종양 세포사에 대한 초기 연구는 비교적 오래되었고, 새로운 세포사 과정의 최근의 발견뿐만 아니라 조사 후 종양 세포의 제거에서 면역계의 중심적 역할의 발견 이전에 발생했다.

최근 수년간 과학적 및 기술적 진보는 세포사의 몇몇 과정의 존재를 보여주었다. 주로 형태학적 및 기능적 기준에 구축된 세포사 양식의 분류가 제안되어 왔고¹³, 치명적인 과정을 3개의 별개의 유형, 즉 유형 I 세포사(아폽토시스로도 공지됨), 유형 II 세포사 (또는 자가포식) 및 유형 III 세포사 (또는 괴사)로 세분했다. 초기에 유형 I 및 III 세포사 양식 사이, 조절되거나 우연히 유도된 과정 사이에 또는 생체내에서 방관자 염증 반응의 유도와 관련되는 세포사를 침묵 또는 관용원성을 생각하는 치명적인 과정과 구별함으로써 명백한 차이가 조직되었고, 유형 II 세포사를 자가포식(이는 주로 세포 항상성 유지에 필요한 세포내 생존 메카니즘임)으로 여전히 잘못 명명된 이 분류는 괴사성 사멸의 소질이 최근 네크롭토시스의 최근 분자 특성화에 의해 밝혀진 바와 같이 유전자 제어되거나 면역원성임을 반영하지 않았다^14,15. 또한, 이러한 정형화된 형태학적, 대사적 및 생화학적 변형(예: 유사분열 사멸 및 각질화)을 나타내지 않거나 부분적으로 나타내는 세포사 서브루틴은 덜 연구되었고, 비정형적 세포사 서브그룹으로도 공지된 세포사 양식의 불량하게 정의된 서브그룹으로 그룹화되었다¹³.

최근 몇 년간, 몇몇 새로운 세포사 메카니즘(예: 엔토시스(entosis) 또는 엠페리토시스(emperitosis))이 기재되어 있고, 이러한 무시된 세포사 양식의 서브그룹에 관련되어 있다^16,17. 이러한 비정형적 사멸 양식의 특성화는 세포 자율적 방식으로 전형적인 세포사 양식과 같이 달성되지 않지만, 이웃 세포에 의한 생세포의 흡입 후에 유도되는 세포사 과정의 존재를 강조했다. 수십 년 동안, 비-세포 자율적 사멸(NCAD)이 일시적으로 관찰되어 연구되어 왔다. 초기에 파곱토시스(phagoptosis)^18,19 또는 엠페리폴레시스(emperipolesis)²⁰로 지칭되는 이들 과정은 적혈구, 호중구, 혈소판 또는 T 세포 항상성의 조절에 관여되고^18,21,22, 따라서 신체에서 주요 생리학적 형태의 세포사로서 제안되었다¹⁸. 세포내 세포 구조(cell-in-cell structure)로서 검출된 NCAD는 또한 1차 세포²³의 생체외 배양 동안 또는 생리학적 과정(예: 배아 이식²⁴ 및 자가반응성 T 세포²⁵의 간내 고갈) 또는 인간 질환(암²³, 염증성 증후군²³, 감염성 질환^26,27 동안 포함)의 조직학적 분석 동안 관찰되었다. 주로 인간 종양(유방, 자궁경부 및 결장 암종 또는 흑색종을 포함)의 악성 세포 사이의 동형 상호작용 후에 검출된 NCAD는 또한 종양 세포와 기질 세포²⁸, 종양 세포와 면역 이펙터(예: 림프구²⁹ 및 NK 세포³⁰) 사이의 이형 상호작용 후에 검출되지만, 또한 면역 이펙터 및 상피 세포 사이의 상호작용(흉선 간호사 세포³¹ 내의 T 세포 또는 간²⁵에서의 자가반응성 T 세포의 파괴에 의해 밝혀진 바와 같음) 후에 관찰될 수 있다. 최근에, NCAD는 또한 감염성 질환과 관련되었다. 감염되지 않은 세포에 의한 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV-l)또는 엡스타인 바(Epstein barr) 바이러스(EBV) 감염 세포의 흡입은 시험관내 공배양 동안 검출되었고, 감염된 세포와 숙주 세포^26,27 사이의 바이러스 송신의 새로운 세포-대-세포 모드의 제1 단계로서 제안된 내재화된 감염 세포의 분해는 또한 미생물 병인에 기여하는 NCAD의 능력을 강조한다.

비-세포 자율적 사멸 프로그램의 제1 단계는 막 부착 수용체(예: E- 또는 P-카드헤린) 또는 스트레스 수용체(예: 지단백질 수용체-관련 단백질)를 통한 2개의 세포 파트너의 상호작용으로 시작하고, 상호작용 세포 모두에서 신호전달 경로를 활성화시키는 상호작용 세포 사이에 부착성 접합의 형성이 이어지고, 작은 GTPase(예: Rho³² 및 Cdc42³³) 및 ROCK 키나제¹⁶를 포함할 수 있다. 이어서, "표적" 세포의 수준에서 액토미오신 수축성의 조절 및 액틴 세포골격의 재구성이 숙주 세포^32,34로의 침습을 선호하는 것으로 나타났다. 이 과정은 숙주 세포 상의 특정 신호 전달 경로(예: 세포골격 리모델링 세포 분할 사이클 42(CDC42), 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 1(CXCL1) 또는 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 6(CXCL6))을 포함하는 파고사이토시스 관련 신호 전달 경로)의 활성화를 통해 NCAD를 또한 유발할 수 있는 세포성 카니발리즘과 별개이고, 표적 세포³³의 활동적 흡입을 유도한다. 일단 내재화되면, 흡입된 세포는 "숙주" 리소좀 효소(예: 카텝신 및 그랜자임)에 의해 표적화될 수 있고, 전형적인 세포사의 몇몇 조절제(예: 사이토크롬 c, 카스파제 또는 자가포식 관련(ATG) 단백질)를 포함할 수 있는 별개의 치명적 메카니즘을 통해 제거될 수 있다. 초기에, 유방암 세포들 사이의 동형 상호작용 후에 기재된 비-세포 자율적 사멸인 엔토시스는 흡입된 세포를 제거하기 위해 카스파제의 활성화를 필요로 하지 않는 세포내 세포 침습 메카니즘이다¹⁶. 반대로, 종양 세포에 의한 자연 살해 세포(NK)의 흡입은 카스파제 3 활성화 및 DNA 단편화³⁰를 필요로 하는 프로그램된 세포내 세포 사멸인 엠페리토시스를 개시하여 흡입된 세포가 카스파제-의존적 또는 카스파제-독립적 과정을 통해 제거될 수 있음을 나타낸다.

항암 치료와 관련된 세포 및 생화학적 과정을 더 잘 특성화하기 위해 구현된 집중적인 생물학적 및 약제학적 연구에도 불구하고, 클리닉에서 사용되는 가장 빈번한 항암 치료 중 하나인 방사선 요법의 치료 효과를 담당하는 치명적인 메카니즘은 여전히 공지되어 있지 않다. 이온화 방사선에 반응하여 검출된 치명적인 과정(예: 아폽토시스 및 유사분열 카타스트로피)은 치료 효율³⁵에 직접적으로 관련되지 않았으며, 이는 여전히 공지되지 않은 추가의 세포사 양식이 방사선 요법의 치료 효과에 기여할 수 있음을 시사한다.

이와 관련하여, 암을 앓고 있는 환자에서 종양 성장을 감소시키기 위한 새로운 치료법을 동정할 필요가 항상 존재한다.

본 발명은 RI 또는 다른 항암 치료 후에 다른 것들에 의해 검출되지 않았던 새로운 세포사 메카니즘(세포성 카니발리즘)의 발견을 개시한다. 일반적으로, 종양 백신접종 실험에서, 암 세포를 세포의 70%가 혈장 막의 외부 리플릿 상의 포스파티딜세린을 노출시킬 때까지 시험관내에서 세포독성 항암 치료에 노출시켰다⁴⁸. 흥미롭게도, 본 결과는 IR-매개된 세포성 카니발리즘(IRCCE)을 향상시키는 능력에 기초하여 선택된 화학적 화합물이 암 세포를 항종양 면역 반응을 자극하는 백신으로 전환시킨다는 것을 나타낸다. 보다 구체적으로, 본 결과는 IRCCE + IR의 조합이 처리되고 조사된 세포의 사멸의 유의한 증가 없이 IR-매개된 항암 면역 반응을 유도한다는 것을 처음으로 나타내고(도 5a), 이는 세포성 카니발리즘 또는 세포성 카니발리즘-관련 신호전달 경로가 조사 후 종양 면역원성의 유도에 기여한다는 것을 시사한다.

조사는 일반적으로 암을 치료하는데 사용된다. 종종 화학요법 및/또는 수술과 조합된 조사 요법은 국소 및 전신 투여 뿐만 아니라 방사성-면역요법을 포함하는 다수의 새로운 진보를 포함한다. 신생물 세포에 대한 조사의 세포독성 효과는 세포 내부의 DNA 분자의 한쪽 또는 양쪽 가닥에서 파열을 일으키는 조사의 능력으로부터 발생한다. 세포 주기의 모든 단계의 세포는 이러한 효과에 영향을 받기 쉽다. 그러나, DNA 손상은 DNA 손상을 덜 복구할 수 있기 때문에 암성 세포에서 치명적일 가능성이 더 높다. 기능성 세포 주기 체크포인트 단백질 및 복구 효소를 갖는 건강한 세포는 치료 후 정상적으로 방사선 손상 및 기능을 복구할 수 있는 가능성이 훨씬 더 높다. 그럼에도 불구하고, 조사는 환자에 대한 부담인 부작용을 야기한다.

조사의 부작용은 화학요법의 부작용과 유사하며, 동일한 이유로, 즉 건강한 조직의 손상이 발생한다. 조사는 일반적으로 화학요법보다 더 국소적이지만, 이러한 치료는 여전히 이전에 건강한 조직에 대한 손상에 수반된다. 많은 부작용은 불쾌하고, 조사는 또한 화학요법과 돌연변이유발성, 발암성 및 기행 발생성의 단점을 자체적으로 공유한다. 정상 세포는 일반적으로 치료 2시간 이내에 치료로부터 회복되기 시작하지만, 건강한 세포의 유전자에 돌연변이가 유도될 수 있다. 이러한 위험은 생식계 내의 것들과 같은 특정 조직에서 높아진다. 또한, 상이한 사람들은 상이하게 조사를 허용한다는 것이 밝혀졌다. 한 개체에서 새로운 암을 유발하지 않을 수 있는 투여량은 사실상 다른 개체에서 추가의 암을 생성할 수 있다. 이는 세포 주기 체크포인트 단백질 또는 복구 효소에서 기존의 돌연변이로 인한 것일 수 있지만, 현재의 관행은 특정 개인이 어떤 투여량으로 위험에 처해 있는지를 예측할 수 없을 것이다. 조사의 일반적인 부작용은 방광 자극, 피로, 설사, 낮은 혈구수, 구강 자극, 미각 변경, 식욕 부진, 탈모증, 피부 자극, 폐 기능의 변화, 장염, 수면 장애 등을 포함한다.

조사와 함께 상승 효과를 유발하여 환자가 조사 요법에 덜 노출되도록 하는 강화제를 환자에게 제공하는 것이 매우 유리하다. 이것은 사실 개선된 유익한 결과를 달성하면서 상기 언급된 부작용을 감소시킨다.

전체적으로, 조사된 암 세포의 제거에 대한 세포성 카니발리즘의 강조된 중요성 및 조사에 대한 종양 반응에서 면역 반응의 중요성의 증가를 감안하면, 세포성 카니발리즘은 조사된 암 세포를 효율적으로 제거하기 위해 암 치료 동안 선호되어야 하는 "바람직한" 사멸이다는 것이 개시되어 있다. 이는 하기 실험 부분에서 본 발명자들에 의해 입증된 바와 같은 세포성 카니발리즘 인핸서를 환자에게 투여함으로써 달성될 수 있다.

정의

용어 "조사 요법"은 당업계에서 내부 및 외부 방사선 요법, 방사성-면역요법을 포함하는 다양한 유형의 방사선 요법, 및 X-선, 감마선, 알파 입자, 베타 입자, 광자, 전자, 중성자, 방사성 동위원소, 및 다른 형태의 이온화 방사선을 포함하는 다양한 유형의 방사선의 사용을 지칭하기 위해 일반적으로 사용된다. 본원에 사용된 용어 "조사 요법", "방사선 요법", "방사선 요법", "방사선" 및 "조사"는 달리 명시되지 않는 한, 이러한 유형의 방사선 요법 모두를 포함한다. 약간 상이한 양식으로 작동하는 상이한 유형의 방사선 요법 기계가 존재한다. 방사선 요법 세션의 수 및 지속기간은 암의 유형 및 그것이 신체에 위치하는 장소에 의존한다. 표피성 피부 암은 단지 소수의 짧은 치료만을 필요로 할 수 있는 반면, 신체에서 더 깊은 암은 더 연장된 치료를 필요로 할 수 있다.

용어 "종양 성장을 억제하는", "종양 성장을 치료하는" 및 "암을 치료하는" 등은 종양 성장 속도를 감소시키는 것, 종양 성장을 완전히 중단시키는 것, 기존 종양 크기의 퇴행을 야기하는 것, 기존 종양을 근절시키는 것 및/또는 본 개시내용의 조성물, 키트 또는 방법으로 치료시 추가의 종양의 발생을 방지하는 것을 지칭한다. 종양 세포 성장을 "억제하는"은 다음 상태 중 어느 하나 또는 모두를 의미한다: 종양 성장의 서행, 지연 및 정지뿐만 아니라 종양 수축. 종양의 "발달을 지연시키는"은 질환의 발병을 연기, 방해, 서행, 지연, 안정화 및/또는 연기시키는 것을 의미한다. 이 지연은 치료되는 질환 및/또는 개인의 병력에 따라 다양한 길이의 시간일 수 있다. 종양 세포 성장은 종양 크기를 측정하는 것, 종양 세포가 ³H-티미딘 포함 검정을 사용하여 증식하는지의 여부를 결정하는 것, 또는 종양 세포를 계수하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 평가될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 방사선과 함께 본 개시내용의 화합물의 병용 투여를 언급할 때 "시너지" 또는 "시너지 효과"는 조합의 효과가 화합물(들) 및 방사선 단독 투여와 비교할 때 부가적인 것 이상임을 의미한다.

"강화하다"는, 본 출원의 맥락에서, 예를 들어, 방사선 요법 치료의 효과를 증강시키거나 증가시키는 것, 또는, 예를 들어, 생화학적 또는 생리학적 작용 또는 효과를 촉진시키거나 강화시키는 것을 의미한다.

"유효량"은 본 개시내용과 관련된 암을 치료하는데 치료적으로 효과적일 수 있는 본원에 기재된 화합물의 양을 지칭한다. 필요한 이들 화합물의 정확한 양은 사용되는 특정 화합물 또는 유도체, 치료될 대상체의 연령 및 상태, 및 상태의 성질 및 중증도에 따라 달라질 것이다. 그러나, 유효량은 통상적인 실험만으로 당업자에 의해 결정될 수 있다. 방사선의 유효량은 당업자에 의해 과도한 실험 없이 결정될 수 있다. 방사선 파라미터, 예를 들어, 조사량 및 빈도는 당업계에 익히 공지되어 있다.

"약제학적으로 허용되는"은 안전한 의학적 판단 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 합리적인 이점/위험 비율에 비례하는 다른 문제 합병증 없이 사람 및 동물의 조직과 접촉하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.

"약제학적으로 허용되는 염"은 모 화합물이 이의 산 또는 염기 염을 제조함으로써 변형되는 개시된 화합물의 유도체를 지칭한다. 본 개시내용의 화합물은 광범위한 유기 및 무기 산 및 염기와 산 및 염기 부가염을 형성하며, 약화학에서 종종 사용되는 생리학적으로 허용되는 염을 포함한다. 이러한 염도 또한 본 개시내용의 일부이다. 이러한 염을 형성하는데 사용되는 전형적인 무기산은 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 질산, 황산, 인산, 차인산 등을 포함한다. 유기산, 예를 들어, 지방족 모노 및 디카복실산, 페닐 치환된 알칸산, 하이드록시알칸산 및 하이드록시알칸디오산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 설폰산으로부터 유도된 염도 또한 사용될 수 있다. 따라서, 이러한 약제학적으로 허용되는 염은 아세테이트, 페닐아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 아크릴레이트, 아스코르베이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 메틸벤조에이트, o-아세톡시벤조에이트, 나프탈렌-2-벤조에이트, 브로마이드, 이소부티레이트, 페닐부티레이트, β-하이드록시부티레이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥신-1,4-디오에이트, 카브레이트, 카프릴레이트, 클로라이드, 신나메이트, 시트레이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글리콜레이트, 헵타노에이트, 히푸레이트, 락테이트, 말레이트, 말레에이트, 하이드록시말레에이트, 말로네이트, 만델레이트, 메실레이트, 니코티네이트, 이소니코티네이트, 니트레이트, 옥살레이트, 프탈레이트, 테라프탈레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐포스페이트, 디하이드로겐포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 프로피올레이트, 프로피오네이트, 페닐프로피오네이트, 살리실레이트, 세바케이트, 석시네이트, 수베레이트, 설페이트, 바이설페이트, 피로설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 설포네이트, 벤젠-설포네이트, p-브로모벤젠설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 에탄설포네이트, 2-하이드록시에탄설포네이트, 메탄설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 크실렌설포네이트, 타르타렐 등을 포함한다. 염의 형성에 통상적으로 사용되는 염기는 수산화암모늄 및 알칼리 및 알칼리 토금속 수산화물, 탄산염뿐만 아니라 지방족 및 1급, 2급 및 3급 아민, 지방족 디아민을 포함한다. 부가 염의 제조에 특히 유용한 염기는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 탄산칼륨, 메틸아민, 디에틸아민 및 에틸렌 디아민을 포함한다.

대안적인 구현예는, 활성 성분을 제어된 비-인스턴트 양식, 시간-의존적 양식으로 주변으로 방출할 수 있는 "서방형 제형"의 투여를 포함하는, 기재된 바와 같은 방사선 요법 암 치료를 강화하는 방법을 제공한다. 이 서방형 제형은, 예를 들어, 락트산의 단독중합체; 글리콜산의 단독중합체; 폴리-D,L-락트산 및 글리콜산의 공중합체; 황체화 호르몬-방출 호르몬(LHRH) 유사체의 수불용성 펩티드 염;폴리(포스포에스테르); 세박산 공중합체를 갖는 비스(p-카복시페녹시)프로판(CPP); 폴리언하이드라이드 중합체; 폴리(락티드)-코-글리콜라이드)폴리에틸렌 글리콜 공중합체; 및 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생분해성 중합체를 포함할 수 있다.

상기 방법의 일부 특정 구현예에서, 서방형 제형은 4주 이상, 대안적으로 1주 이상 동안, 또는 대안적으로 수 시간 이상 동안 IRCCE 약물을 방출한다.

본원에 기재된 방법, 조성물 제형 및 용도는 인간 및 동물 모두, 바람직하게는 포유동물에 적합하다.

따라서, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 마우스, 래트, 돼지, 원숭이 및 말을 포함하는 임의의 포유동물에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 그것은 인간을 지칭한다. 본 발명의 문맥에서 "이를 필요로 하는 대상체" 또는 "환자"는 본 발명의 방법 및 약제학적 조성물로부터 이익을 얻거나 이익을 얻을 수 있는 임의의 대상체를 포함하는 것으로 의도된다. 대상체는 초기 비침습성 암일 수 있거나 체내에서 전이를 형성하도록 이미 진행된 후기 단계 암일 수 있도록 임의 단계의 암을 앓을 수 있다.

본원에서 "환자"는 포유동물, 바람직하게는 인간을 포함하는 동물을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "암"은 임의의 형태의 암 또는 종양을 포함하는 것으로 의도된다. 암의 비제한적인 예는 뇌암(brain cancer)(예: 신경교종(glioma)), 위암(gastric cancer), 두경부암(head-and-neck cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 소세포 폐암(small cell lung cancer), 전립선암(prostate cancer), 결장암(colon cancer), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 육종(sarcoma), 고환암(testicular cancer), 급성 비림프구성 백혈병(acute non-lymphocytic leukemia) 및 유방암(breast cancer)을 포함한다. 특정 구현예에서, 뇌암은 성상세포종(astrocytoma)이고, 보다 특히 다형성 교아종(glioblastoma multifore)이고; 폐암은 소세포 폐 암종(small cell lung carcinoma) 또는 비소세포 폐 암종(non-small cell lung carcinoma)이고, 두경부암은 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma) 또는 선암종(adenocarcinoma)이다.

본 발명은 공지된 약물 및 공지되지 않은 약물이 종양-보유 동물에서 시험관내 및 생체내에서 IR-매개된 세포성 카니발리즘을 향상시킬 수 있음을 개시한다.

본원에 사용된 용어 "세포성 카니발리즘 유도 약물", "세포성 카니발리즘 유도제", "세포성 카니발리즘 유도 화합물" 및 "세포성 카니발리즘 인핸서"는 세포성 카니발리즘을 유발하기 위한 조사능을 향상시킬 수 있는 화합물을 나타낸다. 이들 용어는 IR-매개된 세포성 카니발리즘(이하, IRCCE라 칭함)을 향상시킬 수 있는 화합물을 나타낸다. 선택된 세포성 카니발리즘 조절제의 화학적 구조는 표 1 및 표 2에 제시된다.

전체적으로, 본 발명자들은 16개의 효율적인 세포성 카니발리즘 인핸서 화합물, 즉, 8-아자구아닌, 멥하이드롤라인 1,5-나프탈렌 디설포네이트 염, 플루르비프로펜, 미나프린 디하이드로클로라이드, 미리세틴, 디곡신, 디지톡신, 라나토사이드, 독소루비신 하이드로클로라이드, LOPA87, VP331, RN-1-026, SG6163F, VP450, VP43을 발견했다. 다수의 흥미로운 화합물도 또한 동정되었다. 그들은, 예를 들어, LOPA87의 유사체(LOPA90, LOPA93, LOPA 94, LOPA 101, LOPA104, LOPA105, LOPA106) 및 SG6143F의 유사체(SG6144, SG6146 및 SG6149)이다.

미나프린 디하이드로클로라이드(C₁₇H₂₂N₄O, 아미노-페닐피리다진 항우울제). 미나프린 디하이드로클로라이드는 다양한 우울 상태의 치료에 효과적인 것으로 입증된 정신병 약물이다. 대부분의 항우울제와 같이, 미나프린은 행동 절망(behavioral despenair)을 길항한다. 미나프린은 비교적 심장 독성, 졸음, 및 체중 증가가 없는 것으로 보고된 아미노-페닐피리다진 항우울제이다. 보다 구체적으로, 미나프린은 비교적 심장 독성, 졸음, 및 체중 증가가 없는 것으로 보고된 아미노-페닐피리다진 항우울제이다. 다른 항우울제 치료와 유사하게, 미나프린은 β-아드레날린성 수용체 기능을 감쇠시킨다. 연구는 또한 미나프린이 기억 공고화를 개선시키고 반복된 약물 투여가 이러한 효과를 강화시킨다는 것을 나타냈다. 더욱이, 기억 공고화에 대한 미나프린의 효과는 이의 도파민 작용과 관련된다. 미나프린은 세로토닌 유형 2 수용체 및 도파민 Dl 및 D2 유형 수용체에 결합한다. 그것은 또한 세로토닌 재흡수 펌프에 결합한다. 따라서, 미나프린은 도파민 및 세로토닌 모두의 재흡수를 차단한다. 그것은 또한 약간 콜린 자극성이다. 따라서, 그것은 기분-밝아짐 및 뇌보약 특성 모두를 나타낼 수 있다. 그것은 또한 MAO-A의 가역적 억제제(RIMA)로서 작용한다. 그것은 또한 아세틸콜린에스테라제를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 이 화합물의 제조는 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제4,169,158호에 예시되어 있다.

스크리닝된 라이브러리로부터 수득된 화학적 화합물

LOPA87, VP331, RN-1026, SG6163F, VP450 및 VP43은 CEA 라이브러리로부터 입수했다. LOPA87의 7개 유사체(LOPA90, LOPA93, LOPA 94, LOPA 101, LOPA104, LOPA105, LOPA106) 및 SG6163F의 3개 유사체(SG6144, SG6146 및 SG6149)가 또한 동정되었다.

미나프린 디하이드로클로라이드의 유사체:

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 미나프린 디하이드로클로라이드의 유사체는 하기 화학식의 3-아미노알킬아미노-4-알킬-6-아릴-피리다진이다:

상기 화학식에서,

R1은 수소 원자 또는 저급 알킬 그룹이고;

R2는 아릴 또는 치환된 아릴 그룹이고;

N은 2 또는 3이고;

Y 및 Z는 동일하거나 상이한 저급 알킬 그룹일 수 있거나,

는 헤테로사이클릭 라디칼이고, 여기서 Z 및 Y는 알킬렌 그룹과 각각의 알킬렌 그룹의 대향하는 말단에 부착된 질소 원자 사이에 연결된 산소 원자를 함유하는 환을 형성하기 위해 사이클릭화된 저급 알킬렌 그룹이다.

화학식 I에서, 저급 알킬 그룹은 적합하게는 1 내지 3개의 탄소 원자를 함유할 수 있고, 저급 알킬렌 그룹은 각각 2개의 탄소를 함유하고, R1이 저급 알킬 그룹인 경우, 그것은 바람직하게는 메틸 그룹이다. 그룹 R2는 페닐, 치환된 페닐 또는 나프틸 그룹일 수 있다.

가 헤테로사이클릭 라디칼인 경우, 그것은 적합하게는 모르폴리노, 피페리디노 또는 피롤리디노 그룹일 수 있다.

유사체는 또한 염기와 적합한 유기 또는 무기산, 예를 들어, 이 그룹의 2개의 익히 공지된 대표적인 산을 명명하는 타르타르산 또는 염산의 반응에 의해 형성된 화학식 I의 화합물의 산 부가염을 포함한다.

모노아민 옥시다제 A의 다른 억제제가 미나프린 하이드로클로라이드의 유사체로서 사용될 수 있다. 그들은, 예를 들어, 모클로베마이드 또는 톨록사톤이다. 비선택적인 IMAO가 또한 사용될 수 있다: 이소카복사지드, 니알아마이드, 페넬진, 트라닐사이프로민, 이프로니아지드, 또는 이프로클로지드.

본 발명의 측면

본 발명은 암 세포의 IR-매개된 세포성 카니발리즘(IRCCE)을 향상시키기 위한 상기-동정된 화합물(표 1 및 2에서 강조됨)의 시험관내 사용을 개시한다.

본 발명의 이 부분은 시험관내에서 수행된다. 본원에 개시된 바와 같이, 용어 "시험관내" 및 "생체외"는 동등하며, 통상의 숙주 유기체(예: 동물 또는 인간)로부터 단리된 생물학적 성분(예: 세포 또는 세포 집단)을 사용하여 수행된 연구 또는 실험을 지칭한다. 이러한 단리된 세포는 추가로 정제되고, 배양되거나 직접 분석되어 돌연변이체 단백질의 존재를 평가할 수 있다. 이들 실험은, 예를 들어, 튜브, 플라스크, 웰, 에펜도르프(eppendorf) 등과 같은 실험실 재료에서 실시하기 위해 감소될 수 있다. 대조적으로, 용어 "생체내"는 전체 살아있는 유기체에 대해 수행되는 연구를 지칭한다.

IR-매개된 세포 카니발리즘은 임의의 통상적인 수단에 의해 평가될 수 있다. 특히, 이 활성은 현미경하(면역형광 또는 면역조직화학)에서 세포를 연구하고, 세포 흡입 이벤트 또는 세포내 세포 시스템을 시각적으로 검출함으로써 평가될 수 있다. 대안적으로, 그것은 상기 세포에서, p53, p53β, p53γ, 및 N-말단 트랜스활성화 도메인, 예를 들어, △40TP53 및 △133TP53이 결여된 p53의 N-말단 이소폼으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질의 발현 수준을 측정하거나, 또는 퓨린성 P2Y2 수용체의 발현 수준 또는 활성을 측정하고/하거나, 본원에 참고로 인용된 W02014/006227에 개시된 바와 같이, 상기 세포에 의해 분비된 세포외 ATP를 측정함으로써 평가될 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 생체내에서 사용될 수 있다.

이 경우, 본 발명의 화합물은 약제학적으로 허용되는 보조제를 추가로 함유하는 약제학적 조성물로 환자에게 투여될 수 있다. 따라서, "본 발명의 약제학적 조성물"은 본 발명의 화합물 중 적어도 하나(참조: 상기 표 1 & 2, 예를 들어, 미나프린 디하이드로클로라이드), 또는 이의 유사체, 및 약제학적으로 허용되는 보조제 또는 담체의 유효량을 함유한다. 비-수성 보조제의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 및 에틸올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르이다. 다른 약제학적으로 허용되는 보조제는 염, 방부제, 완충제 등을 포함하는 수용액 및 비독성 부형제를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충제를 포함한다. 조성물은 또한 방부제, 예를 들어, 항균제, 산화방지제, 킬레이트제 및 불활성 기체를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물의 다양한 성분의 pH 및 정확한 농도는 익히 공지된 파라미터에 따라 조정될 수 있다.

본 발명의 화합물(특히, 미나프린 디하이드로클로라이드) 또는 (미나프린 디하이드로클로라이드 함유하는)본 발명의 조성물의 생체내 투여는 암을 앓고 있는 대상체에서 종양 성장을 감소시키는 것으로 의도된다.

그것은 또한 방사선 요법 치료를 받을 또는 받은 대상체에서 종양 면역원성을 향상시킬 수 있다. 임의의 특정 이론에 결부시키지 않는 반면, 이들 화합물은 세포성 카니발리즘을 선호함으로써 상당한 보호적 항암 면역 반응을 유도하는 특정 에피토프의 노출에 의해 방사선 요법과 상승적으로 작용하는 것으로 생각된다.

본 개시내용은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하고자 하는 약제학적 조성물을 제조하기 위한 상기 표 1 & 2에 개시된 화합물(특히, 미나프린 디하이드로클로라이드), 또는 이들의 유사체의 용도를 표적으로 한다.

또한, 이를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 상기 표 1 & 2에 개시된 화합물(특히, 미나프린 디하이드로클로라이드), 또는 이들의 유사체의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 다음을 위한 상기 표 1 및 2의 화합물(특히, 미나프린 디하이드로클로라이드) 또는 이들의 유사체, 또는 이를 함유하는 임의의 약제학적 조성물을 개시한다:

· 암을 앓고 있는 환자에서 IR-매개된 세포성 카니발리즘을 향상시키기 위한 이들의 용도,

· 방사선 요법 치료를 받을 또는 받은 대상체에서 종양 면역원성을 향상시키는 이들의 용도,

· 방사선 요법 치료를 받을 또는 받은 대상체에서 유의한 보호적 항암 면역 반응을 유도하는 이들의 용도,

· 이를 필요로 하는 대상체에서 방사선 요법 치료를 강화시키는 이들의 용도,

·이를 필요로 하는 대상체에서, 방사선 요법과 병용하여 암을 치료하는 이들의 용도.

중요하게는, 본 발명의 조성물을 투여하면 조사량(dose of irradiation)을 감소시킬 수 있고, 따라서 방사선 치료에 의해 초래된 부작용을 완화시킨다.

미나피린 디하이드로클로라이드를 함유하는 본 발명의 약제학적 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사가능한 조성물의 형태(예: 정맥내, 근육내, 피하 및 관절내)로 투여될 수 있고; 주사 전 액체 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 이들 제제는 또한 유화될 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 또한 경구, 비강, 직장, 국소, 종양내, 정맥내, 근육내, 피하, 설하, 경막내, 복강내, 관절내 또는 피내와 같은 다른 경로로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 투여 경로는 정맥내, 동맥내 또는 경구이다. 바람직하게는, 약제학적 조성물은 정맥내 또는 동맥내 투여된다. 보다 바람직하게는, 그들은 종양내 투여된다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물이 경구 투여용인 경우, 본 발명의 조성물은 정제, 용액 또는 캡슐, 예를 들어, 연질 겔 캡슐로 존재한다. 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물이 경구 투여용인 경우, 그것은 장용 코팅을 갖는다. 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물이 경구 투여용인 경우, 그것은 유성 시럽이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 화합물은 서방형 제형으로 투여된다.

본 발명의 조성물은 암을 치료하기에 충분한 양 및 빈도로 투여된다. 대상체의 진행은 암 마커의 농도의 변화를 측정하고 관찰함으로써, 경시적으로 종양의 실제 크기를 측정함으로써 및/또는 당업계에 익히 공지된 임의의 다른 관련된 임상적 마커를 결정함으로써 결정될 수 있다. 임상적 진행과 관련된 이러한 특성 및 마커의 결정, 측정 및 평가는 당업자에게 익히 공지되어 있다.

도 6 및 도 7에 도시된 바와 같이, 본 발명자들은 미나프린 디하이드로클로라이드 단독 투여가 종양 발생에 대한 고유 보호 효과를 갖는다는 것을 관찰했다. 결과적으로, 미나프린 디하이드로클로라이드는 방사선 요법 치료와 조합될 필요가 없으며, 자체로 효율적이다. 미나프린 디하이드로클로라이드가 항우울 약물로서 공지되어 있고, 이 약물에 대한 항종양 효과는 보고된 적이 없기 때문에, 이는 매우 놀라운 결과이다.

제3 측면에서, 본 발명은 따라서

· 암을 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 이의 용도

· 암 환자에서 유의한 보호적 항암 면역 반응을 유도하기 위한 이의 용도를 위한 미나피린 디하이드로클로라이드, 또는 이를 함유하는 임의의 약제학적 조성물을 다룬다.

또한, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 예방하거나 치료하기 위한 의약을 제조하기 위한 미나프린 디하이드로클로라이드의 용도에 관한 것이다.

이 제3 측면에서, 미나프린 디하이드로클로라이드는 바람직하게는 방사선 요법 치료(제3 유형의 항암 치료가 존재하든 존재하지 않든)와 조합하여 사용되지 않는다. 미나프린 디하이드로클로라이드는 방사선 요법 이외의 하나 이상의 항암 치료(들)(예: 화학요법 및/또는 면역요법)와 조합하여 사용될 수 있으며, 단 방사선 요법은 사용되지 않는다. 그러나, 하나의 구현예에서, 미나프린 디하이드로클로라이드는 임의의 다른 항암 치료와 조합하여 사용되지 않으며, 따라서 암을 앓고 있는 환자에게 투여된 항암 효능을 갖는 유일한 화합물이다.

경구로 투여될 때, 인간에게 안전하게 투여될 수 있는 미나프린 디하이드로클로라이드의 유효량은 1일당 50mg 내지 500mg, 바람직하게는 1일당 100mg 내지 400mg, 더 바람직하게는 1일당 약 200mg으로 구성된다.

종양내로 투여될 때, 인간에 안전하게 투여될 수 있는 미나프린 디하이드로클로라이드의 유효량은 0.3mg/kg 내지 30mg/kg으로 구성된다.

약제학적 조성물에 대해 상기 개시된 모든 구현예는 이러한 특정 용도로 전이 가능하다.

치료 방법

본 발명은 또한 유효량의 미나프린 디하이드로클로라이드, 또는 이를 함유하는 임의의 약제학적 조성물을 암 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 암 환자를 치료하는 방법을 표적화한다. 사실상, 상기 항우울 약물은 자체로 유의한 보호적 항암 면역 반응을 갖는 것으로 본 발명자들에 의해 밝혀졌다.

바람직하게는, 상기 방법은 방사선 요법 치료(제3 유형의 항암 치료가 존재하든 존재하지 않든)와 조합하여 미나프린 디하이드로클로라이드를 사용하지 않으며, 따라서 방사선 요법 단계를 포함하지 않는다. 상기 방법은 미나프린 디하이드로클로라이드를 방사선 요법 이외의 하나 이상의 항암 치료(들)(예: 화학요법 및/또는 면역요법)와 조합할 수 있고, 단 방사선 요법은 사용되지 않는다. 그러나, 상기 방법의 일부 구현예에서, 미나프린 디하이드로클로라이드는 임의의 다른 항암 치료와 조합하여 사용되지 않으며, 따라서 본 방법은 미나피린 디하이드로클로라이드 이외의 다른 항암 치료를 투여하는 임의의 단계를 포함하지 않는다. 따라서 이러한 방법에서, 미나프린 디하이드로클로라이드는 암을 앓고 있는 환자에게 투여된 항암 효과를 갖는 유일한 화합물이다.

도 1 정량적 영상화 유세포 분석법에 의한 세포사 프로파일링. (A) 정량적 유동 영상화에 의한 세포사 프로파일링의 원리. (B) 감마선 조사에 의해 유도된 정량적 영상화 유세포 분석법에 의한 세포사 양식의 다중매개변수적 및 동시 검출의 확인. 공배양 전에, 처리된 HCT116 세포 및 비-처리된 HCT116 세포를 각각 CMFDA(녹색/밝은 회색) 또는 CMTMR(적색/어두운 회색) 형광 바이탈 프로브로 표지했다. 공배양 24시간 후에, HCT116 세포를 (CMTMR- 또는 CMFDA-표지된 HCT116 세포의 흡입을 검출함으로써) 비-세포 자율적 사멸(NCAD)에 대해, (비오틴-아넥신V 및 BV786-스트렙타비딘을 사용하여) 포스파티딜세린(PS) 노출에 대해, (DRAQ7 흡수에 따라) 혈장 완전성의 손실에 대해 및 (Hoechst 33342를 사용하여) DNA 함량에 대해 분석했다. 정량적 유세포 분석법을 사용하여, 비-처리된 및 처리된 HCT116 세포 모두에 대한 NCA 사멸 및 전형적 세포사(유형 I, II 및 III)의 동시 검출은 암 치료 후에 수득된 세포사 프로파일링을 결정할 것이다. 대표적인 이미지가 도시되어 있다(스케일, 20㎛).
도 2 정량적 영상화 유세포 분석법에 의한 γ-조사-유도된 세포 자율적 사멸 양식의 검출. (A-E) 미처리된(적색/어두운 회색) CMTMR-표지된 HCT116 세포 및 미처리된 (녹색/밝은 회색) CMFDA-표지된 HCT116 세포(A, C-E)의 24시간 공배양 후, 일시적으로 혼합된 미처리된 (적색/어두운 회색) CMTMR-표지된 HCT116 세포 및 미처리된 (녹색/밝은 회색) CMFDA-표지된 HCT116 세포(C-E)의 24시간 공배양 후 또는 4그레이의 γ-이온화 방사선으로 조사된 (녹색/밝은 회색) CMFDA-표지된 HCT116 세포(녹색)와 미처리된 (적색/어두운 회색) CMTM-표지된 HCT116 세포의 24시간 공배양 후 관찰된 혈장 막 완전성 손실 및 PS 노출의 검출 및 정량화. 공배양은 지시된 약리학적 사멸 이펙터 억제제의 존재 또는 부재하에 수행되었다. 혈장 막 완전성(DRAQ7 사용) 및 PS 노출(BV786-스트렙타비딘/아넥신 V 비오틴을 사용)의 검출이 미처리된 (적색/어두운 회색) CMTMR⁺ HCT116 세포, 미처리된 (녹색/밝은 회색) CMFDA⁺ HCT116 세포, 처리된 (녹색/밝은 회색) CMFDA⁺ HCT116 세포 및 총 세포 집단(CMTMR⁺ 또는 CMFDA⁺ HCT116 세포)에 대해 분석되었다. 대표적인 도트 플롯(A,B) 및 정량적 데이터(C-E)가 도시되어 있다(평균 ± SEM, n = 3). (F,G) 미처리된 (적색/어두운 회색) CMTMR⁺ HCT116 세포, 미처리된 (녹색/밝은 회색) CMFDA⁺ HCT116 세포, 처리된 (녹색/밝은 회색) CMFDA⁺ HCT116 세포 및 미처리된 (적색/어두운 회색) CMTMR-표지된 HCT116 세포와 미처리된 (녹색/밝은 회색) CMFDA-표지된 HCT116 세포의 24시간 공배양 후(F, H-J), 일시적으로 혼합된 미처리된 (적색/어두운 회색) CMTMR-표지된 HCT116 세포와 미처리된 (녹색/밝은 회색) CMFDA-표지된 HCT116 세포의 24시간 공배양 후(H-J) 또는 4그레이의 γ-이온화 방사선으로 조사된 (녹색/밝은 회색) CMFDA-표지된 HCT116 세포 (녹색/밝은 회색)와 미처리된 (적색/어두운 회색) CMTM-표지된 HCT116 세포의 24시간 공배양 후(G-J) 수득된 총 세포 집단(CMTMR⁺ 또는 CMFDA⁺ HCT116 세포)의 대표적인 세포 주기 분포가 도시된다. 세포 주기 분석의 정량적 데이터는 (H-J)에 도시된다(평균 ± SEM, n = 3). * 또는 # 또는 $는 p<0.05를 나타내고, ## 또는 $$는 p<0.01을 나타내고, *** 또는 ###는 p<0.001을 나타낸다.
도 3 정량적 영상화 유세포 분석법 및 공초점 형광 현미경에 의한 γ-조사-유도된 비-세포 자율적 사멸 양식의 검출. (A-G) 세포내 세포 구조 및 표적 세포 분해는 4 그레이의 γ-이온화 방사선으로 조사된 (녹색/밝은 회색) CMFDA-표지된 HCT116 세포와 미처리된 (적색/어두운 회색) CMTM-표지된 HCT116 세포의 24시간 공배양(A), 미처리된 (적색/어두운 회색) CMTMR-표지된 HCT116 세포와 미처리된 (녹색/밝은 회색) CMFDA-표지된 HCT116 세포의 공배양(B, C) 또는 일시적으로 혼합된 미처리된 (녹색/밝은 회색) CMFDA-표지된 HCT116 세포와 CMTMR 표지된 (적색/어두운 회색) HCT116 세포에 대한 공배양 후(B, C) 정량적 영상화(A-C) 및 공초점 형광 현미경(D-G)에 의해 결정되었다. 전술한 바와 같이, 세포는 BV786-스트렙타비딘-아넥신 V 비오틴, DRAQ7 및 Hoechst 33342와 같은 특정 형광 프로브와 함께 공배양 후에 순차적으로 표지되었다. 이어서, (적색/어두운 회색) CMTMR-표지된 HCT116 세포 내재화 (녹색/밝은 회색) CMFDA-표지된 HCT116 세포(주시된 R(G)) 및 (녹색/밝은 회색) CMFDA-표지된 HCT116 세포 내재화 (적색/어두운 회색) CMTMR-표지된 HCT116 세포(주시된 G(R))가 검출되었다. 대표적인 이미지는 (A)에 도시된다(스케일, 20㎛). 세포내 세포 구조(B) 및 표적 세포 분해(C)의 빈도가 기록된다(평균 ± SEM, n = 3). 미처리된 (적색) CMTMR-표지된 HCT116 세포와 미처리된 또는 γ-조사된 (녹색) CMFDA-표지된 세포의 공배양 동안 검출된 세포내 세포 구조(백색 화살표)(D) 및 표적 세포 분해(백색 점선 화살표)(E)의 대표적인 공초점 이미지가 도시되어 있다(스케일 바 = 10㎛). (F-G) (적색/어두운 회색)) CMTMR-표지된 세포 내재화 (녹색/밝은 회색) CMFDA-표지된 세포(주시된 R(G)) 및 (녹색/밝은 회색) CMFDA-표지된 세포 내재화 (적색/어두운 회색) CMTMR-표지된 세포(지시된 G(R))를 나타내는 세포내 세포 구조(F) 및 표적 세포 분해(G)의 빈도가 결정되었고(평균 ± SEM, n = 3); # 또는 $는 p<0.05를 나타내고, ## 또는 $$는 p<0.01을 나타내고, *** 또는 $$$ 또는 ###는 p<0.001을 나타낸다.
도 4 이온화 방사선에 의해 유발된 카니발리즘 조절자의 동정. 프레스트윅(Prestwick)(A) 및 CEA(F) 라이브러리로부터의 화합물을 이온화 방사선 후 세포성 카니발리즘을 유도하는 그들의 용량에 대해 시험했다. 10μM의 프레스트윅(A) 및 CEA(E) 라이브러리 화합물의 존재 또는 부재하에 8그레이 γ-조사 HCT116 세포의 동형 배양 후에 카니발리즘 세포를 검출했다. 각 도트는 하나의 화합물을 나타낸다. 대표적인 이미지가 (B, G)에 도시되어 있다. (C, H) HCT116 세포를 지시된 약물로 처리했다. 치료 24시간 후, 3,3-디헥실옥사카보시아닌 요오다이드(DiOC₆(3)) 및 PI로 염색함으로써 세포사를 모니터링하였고, 염색(DiOC₆(3)^저 PI^-, 개방 바) 및 죽은(DiOC₆(3)^저 PI⁺, 폐쇄된 바) 세포의 백분율을 세포형광측정법에 의해 결정했다. 형광 현미경에 의한 카니발리즘 유도제의 확인. 대표적인 이미지(D, I) 및 정량화(E, J)가 도시되어 있다. 결과는 3중 결정의 평균 ± s.e.m.이다.
도 5. 면역원성 세포사 유도제로서 카니발리즘 조절제의 동정. MCA205(A) 또는 CT26(E, I, M, Q) 세포를 지시된 약물로 처리했다. 지시된 치료로 24시간 공배양 후, 세포사를 DiOC₆(3) 및 PI로 염색하여 모니터링하고, 염색(DiOC₆(3)^저 PI^-, 개방 막대) 및 죽은(DiOC₆(3)^저 PI⁺, 폐쇄된 막대) 세포의 백분율을 세포 형광 측정법으로 결정했다. 지시된 화합물로 x 조사 후 공배양된 (B-D) MCA205 세포 또는 (F-H, J-L, N-P, R-T) CT26 세포를 각각 C56BL/6 또는 BALB/c 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 접종했다. 7일 후에, 마우스를 대향하는 옆구리에 주사된 생세포로 재도전하였고, 종양 성장을 모니터링했다(그룹당 5 마리의 마우스).
도 6. 종양 백신접종 실험. CT26 세포를 10μM VP331(A, F, K), 10μM 미나프린(B, G, L), 10μM Lopa87(C, H, M), 10μM SG6163F(D,I,N), 10μM 아자구아닌-8(8-아자)(E,J,O) 단독으로 또는 8Gy 이온화 방사선과 조합하여 24시간 동안 처리하고, 면역적격성 BALB/c 마우스에 접종하고(피하), 이를 동일한 암 세포로 7일 후에 대향하는 옆구리에서 재도전했다. 종양 부재 마우스의 백분율을 다음 38 일 동안 1주일에 3회 평가했다. 총 종양 부재 마우스(A-E), 제1 주사 부위(F 내지 J, P) 또는 제2 주사 부위(K 내지 O, Q)에서 종양 부재 마우스의 백분율이 도시되어 있다. (^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001, 2원 ANOVA).
도 7. 미나프린은 종양내 또는 복강내 주사 후 면역적격성 마우스에서 종양 성장을 감소시킨다. (A-C) 3 10⁶ CT26 세포를 면역적격성 BALB/c 마우스에 이식했다. 6일 후에 감지 가능한 종양에 10μM의 미나프린 (또는 대조군)을 주사했다. 이어서, 종양 성장 용적을 이어지는 38일 동안 1주일에 3회 결정했다(A 및 B). 마우스의 생존율을 또한 결정했다(C). (D-I) 5 10⁵ CT26 세포를 면역적격성 BALB/c 마우스에 이식했다. 12일 후, 종양 보유 마우스에 대조군(D 및 I), 0.3mg/kg(E 및 I), 1mg/kg(F 및 I), 3mg/kg(G 및 I) 또는 10mg/kg(H 및 I)의 미나프린을 복강내 주사했다. 종양 성장 용적(A-J) 및 복강내 주사 후 종양 용적의 배수 변화(D-I)를 분석했다. 종양 성장 용적은 다음 38일 동안 1주일에 3회 결정했다.

실시예

I. 재료 및 방법

화학물질, 세포주 및 배양 조건

달리 지시되지 않는 한, 화학물질은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 구입했다. 항생물질, 배지, 세포 배양용 보충물을 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)로부터 입수했다. 벤질옥시카보닐-Val-Ala-Asp(OMe)-플루오로메틸케톤(Z-VAD-fmk)은 바켐(Bachem)으로부터, 재조합 마우스 TNF-알파는 R&D 시스템즈(R&D systems)로부터 입수했다. 인간 결장 암종 HCT116 세포를 McCoy's 5A 배지에서, 뮤린 섬유육종 세포주 L929를 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's medium)에서 배양했다. 모든 배지를 10% 열-불활성화된 태아 소 혈청(FBS), 10mM HEPES 완충액, 2mM L-글루타민, 10U/mL 페니실린 나트륨 및 10㎍/mL 스트렙토마이신 설페이트로 보충했다.

조사

세포를 6-웰 플레이트, l2-웰 플레이트 또는 25cm² 플라스크에 씨딩하고, 감마선 조사기 IBL-637(Cs¹³⁷, 1 Gy/분, 감마 CIS-BioInternational, IBA, Saclay, France)로 지시된 선량으로 조사했다.

CellTracker™ 형광 프로브 표지

배양 배지의 제거시, HCT116 세포를 10μM의 5-클로로메틸플루오레세인 디아세테이트(CMFDA, 녹색 형광) 또는 5-(및-6)-(((4-클로로메틸)벤조일)아미노)테트라메틸로다민(CMTMR, 적색 형광)(몰레큘라 프로브스-라이프 테크놀로지(Molecular Probes-Life Technologie))을 함유하는 예열된 배지로 37℃에서 45분 동안 배양했다.

그 후, HCT116 세포를 예열된 배지로 2회 세정하고, 37℃에서 1시간 동안 배양했다. 염색된 세포를 지시된 바와 같이 처리하고 세포사 프로파일링 분석을 위해 배양했다.

정량적 유동 영상화에 의한 세포사 프로파일링

미처리된 HCT116 세포는 CMFDA(녹색 형광, CMFDA⁺) 또는 CMTMR(적색 형광, CMTMR⁺)로, 처리된 HCT116 세포는 CMFDA(녹색 형광, CMFDA⁺)로 표지화했다. 다음 세포 혼합물을 수행했다: 미처리된 CMTMR⁺ HCT116 세포를 미처리된 CMFDA⁺ HCT116 세포와 혼합하거나, 미처리된 CMTMR⁺ HCT1l6 세포를 처리된 CMFDA⁺ HCT116 세포와 혼합했다. 이어서, 세포를 ROCK의 약리학적 억제제, Y27632(30μM), pan-카스파제 억제제, Z-VAD-fmk(ZVAD, 100μM), 카스파제-1의 억제제, Ac-YVAD-cmk(YVAD, 100μM), 네크롭토시스 억제제, 네크로스타틴-1(NEC1, 30μM), 자가포식을 억제하는 액포 유형 H(+)-ATPase(V-ATPase)의 억제제, 바필로마이신 A1(BafA1, 50nM), 항-유사분열 활성을 갖는 Cdks의 억제제, 로스코비틴(Rosco, 10μM)의 존재 또는 부재하에 24시간 동안 공배양했다. 공배양 24시간 후, 탈착 세포 및 부착 세포를 모두 수집하고, 가온된 완전 배지에서 37℃에서 1시간 동안 Hoechst 33345(10㎍/mL)로 염색했다. 포스파티딜세린(PS) 노출 및 혈장 막 투과도를 검출하기 위해, 표지된 HCT116 세포를 25℃에서 15분 동안 제조업자에 의해 권장된 비오틴-아넥신V(BD Pharmingen), 0.5㎍ BV786-스트렙타비딘(BD Biosciences) 및 3μM DRAQ7(BioStatus)로 연속적으로 배양했다. PBS 용액으로 세척한 후, 샘플을 영상화 유세포 분석기 FlowSight®(Amnis®, EMD Millipore의 부품)를 사용하여 즉시 분석했다. 데이터를 INSPIRE 소프트웨어를 사용하여 20x 배율로 획득했다.

405nm, 488nm 및 561nm 레이저를 여기용으로 사용했다. 명시야, 아넥신 V-BV786, DRAQ7, CMFDA, CMTMR 및 Hoechst 33345 염색은 420-480nm, 745-800nm, 642-745nm, 480-560nm, 595-642nm 및 430-505nm에 대한 각각 채널을 사용하여 검출되었다. 샘플당 세포의 적어도 1000건의 이벤트가 분석되었다. 상이한 채널에 걸쳐 형광 신호를 정규화하기 위해 추가의 단일-표지된 대조군을 제조했다. 획득된 데이터는 IDEAS 분석 소프트웨어(v6.1; Merck-Millipore))를 사용하여 분석되었다. 게이팅 전략은 다음과 같다. 세포를 구배 RMS 특징을 사용하여 집중된 세포에 대해 게이팅했다. 세포를 종횡비 및 면적 특징을 사용하여 단일 세포에 대해 게이팅했다. 카니발리즘 검출을 위해, 세포를 이중 양성 CMFDA⁺ 및 CMTMR⁺ 염색에서 게이팅했다.

유세포 분석법 및 공초점 형광 현미경 검사

PS 노출, 혈장 막 투과도 및 세포 주기 진행을 검출하기 위해, 세포를 공배양 후 특이적 형광 프로브(예: FITC-접합된 아넥신V, 요오드화프로피듐 및 Hoechst 33342)로 순차적으로 표지화하고, 유세포 분석법에 의해 분석했다. 탈착 세포 및 부착 세포 모두를 수집하고, 가온된 완전 배지에서 37℃에서 1시간 동안 Hoechst 33345(1O㎍/ml)로 염색했다. PBS로 세척한 후, 제조업자의 지침에 따라, HCT116 세포를 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-접합된 아넥신 V(BD Biosciences) 및 요오드화프로피듐(PI, 1㎍/mL)(Sigma)이 보충된 1X 결합 완충액에 현탁시켰다. 이어서, 샘플을 LSRII 유세포 분석기(Becton Dickinson) 및 FlowJo 소프트웨어 v1O을 사용하여 분석했다. 공초점 형광 현미경 검사를 위해, HCT116 세포를 공배양 후 15분 동안 3,7% 파라포름알데히드-PBS에서 고정시키고, 15분 동안 1㎍/mL Hoechst 33342(Invitrogen)로 대비염색제로 착색시켰다. 이어서, Apochromat 63x 1.3 NA 및 63x 1.15 NA 오일 침지 대물렌즈가 장착된 공초점 SPE 현미경으로 세포를 분석했다. Leica Aplication Suite(LAS) 소프트웨어가 사용되었다(Leica Microsystems).

웨스턴 블롯

전체 세포 단백질을 용해 완충액(1% NP40, 20mmol/L HEPES, 10mmol/L KC1, 1mmol/L EDTA, 10% 글리세롤, 프로테아제 및 포스파타제 억제제 정제 함유)에서 추출했다. 단백질 추출물(30㎍)을 4-12% NuPAGE® Novex® Bis-Tris 겔(Life Technologies)에서 작동시키고, 4℃에서 임모빌론 폴리비닐디플루오라이드(PVDF)막(Thermo Scientific)으로 옮겼다. 차단 후, 막을 4℃에서 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)로부터 입수된 카스파제-3(#9662), 절단된 카스파제-3(Aspl75)(#9661), 미오신 경쇄 2(MLC2)(#3672), 포스포-MLC2(Serl9)(#3675), LC3 A/B(#4108), p-(S)-CDK 기질(#9477)에 특이적인 1차 항체로 밤새 배양했다. GAPDH(#MAB374)에 대한 항체를 밀리포어(Millipore)로부터 구입했다. 이어서, 서양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 염소 항-마우스 또는 항-토끼(서던 바이오테크놀로지(Southern Biotechnology)) 항체를 1시간 동안 배양하고, ImageQuant LAS 4000 소프트웨어-보조 영상 장치(GE Healthcare)를 사용하여 SuperSignal West Pico® 시약(Thermo Fisher Scientific) 또는 ECL^TM 프라임 웨스턴 블롯팅 검출 시스템(GE Healthcare)으로 나타내었다.

통계적 분석

각 실험은 적어도 3회 반복하여 필적할 만한 결과를 산출했다. 달리 지시되지 않는 한, 도면은 하나의 대표적인 실험으로부터의 정량적 데이터를 예시한다(평균 ± SEM, n = 3). 데이터는 프리즘 v. 5.03(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)에 의해 분석되었다. 통계적 유의성은 2-테일드 스튜던츠 t-테스트(two-tailed Student's t-test)에 의해 평가되었다. 모든 실험에서, p 값 < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

II. 결과

다중스펙트럼 영상화 유세포 분석법을 사용하는 세포사 프로파일링 분석은 비-세포 자율적 및 세포 자율적 사멸 양식의 동시 검출을 가능하게 한다. NCA 과정을 통해 죽는 세포의 능력은 개념적인 관점에서 세포사 과정을 고려하는 본 방법론적 접근법을 재고하도록 한다. 실제로, 세포사를 검출하기 위해 사용될 기술적 접근법 뿐만 아니라 고려될 형태학적 및/또는 생화학적 파라미터의 선택은 예상될 결과를 사전에 미리 정의하며, 세포성 카니발리즘 또는 엔토시스와 같은 새로운 치명적인 과정을 동정하는 것을 허용하지 않거나 매우 드물게 한다. 방사선 요법 분야도 또한 이러한 문제에 직면한다. 실제로, 조사가 아폽토시스, 자가포식 세포사, 괴사 또는 유사분열 사멸과 같은 많은 치명적인 과정을 유발할 수 있다는 것이 별도의 연구에서 밝혀졌다^35,36. 최근에, 동일한 선량으로 동일한 세포 유형을 조사하면 아폽토시스³⁷ 뿐만 아니라 유사분열 사멸³⁸을 유발할 수 있다는 것이 별도의 연구에서 밝혀졌다. 이전의 연구에서, 조사 후 매우 신속하게 관찰된 아폽토시스 및 유사분열 사멸의 개시가 더 긴 기간에 관찰된 클론원성 생존과 관련되지 않는다는 것이 밝혀졌다³⁵. 이들 연구는 조사된 세포의 제거에 관련되는 공지되지 않은 치명적인 과정의 존재를 강조했다. 더욱이, 종양 성장의 조절 및 전이성 세포의 제거에서 세포성 카니발리즘 및 엔토시스의 영향을 나타내는 증가하는 수의 공보는 NCAD의 이 과정의 개시를 따르도록 촉구한다.

비-세포 자율적 및 세포 자율적 세포사 양식을 잠재적으로 개시할 수 있는 치명적인 자극의 다양성 및 두 과정을 제어하는 신호전달 경로(카스파제, 카텝신 또는 그랜자임을 포함 또는 (포함하지 않음))의 복잡성을 고려하여, IR에 의해 유발된 비-세포 자율적 및 세포 자율적 사멸 양식을 동시에 검출하기로 결정되었다. 치명적인 손상 후 세포 집단이 세포-자율적 또는 비-세포 자율적 양식으로 실행될 수 있는 직접적 및/또는 방관자 세포 사멸을 동시에 겪을 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, 세포사 프로파일링 분석은 5-클로로메틸플루오레세인 디아세테이트(CMFDA, 녹색) 형광 바이탈 프로브로 표지된 HCT116 세포의 공배양에 기초하여 설계되고, 5-(및-6)-(((4-클로로메틸)벤조일)아미노)테트라메틸로다민(CMTMR, 적색) 형광 바이탈 프로브에 의해 표지된 동종 동계 HCT116 세포를 갖는 이온화 방사선(γ-선)에 의해 처리되었다. 공배양 24시간 후, 처리된 CMFDA⁺ 세포, 미처리된 CMTMR⁺ 세포 및 총 (CMFDA⁺ 세포 및 CMTMR⁺ 세포) 세포 집단을 포스파티딜 세린(PS)노출, 혈장 막 완전성의 손실 및 DNA 함량에 대해 분석하여 처리된 세포 및 (미처리된) 이웃하는 세포 둘 다의 세포사 유도를 동시에 검출했다. 검출된 세포사 양식의 실행에 관여하는 분자 메카니즘을 특성화하기 위해, 공배양은 각각 세포 흡입(엔토시스¹⁶, 엠페립토시스¹⁷ 및 세포성 카니발리즘¹⁶을 개시하는 과정), (아폽토시스³⁹, 유사분열 사멸^38,40 또는 엠페리포시스¹⁷의 실행에 기여하는) 카스파제-3 또는 카스파제-7의 단백질분해 절단 또는 (파이롭토시스⁴¹에 필요한) 카스파제-1의 단백질분해 절단, 네크롭토시스⁴²에 기여하는 프로-네크롭토틱 키나제 RIP1 키나제의 활성화, 자가포식 및 자가포식-관련 세포사⁴³ 동안 자가포식 액포들의 성숙을 손상시키는 오토파고솜과 리소좀 사이의 융합 및 마지막으로, 사이클린-의존성 키나제 1(Cdk1)-사이클린 B 활성 및 유사분열 사멸^40,44과 같은 유사분열 관련 사멸에 필요한 유사분열을 통한 진행을 억제하는 것으로 공지된 세포사 조절제(예: ROCK1 억제제(Y27632), pan-카스파제 억제제(ZVAD-fmk), 카스파제-1 억제제(YVAD-fmk), 네크로스타틴(NEC1), 바필로마이신 A1(BafAl) 및 로스코비틴(Rosco))의 존재하에 수행되었다. PS 노출, 혈장 막 완전성의 손실, 세포사 조절제의 약리학적 억제와 조합된 세포성 파트너의 DNA 함량의 동시 검출은 다중스펙트럼 영상화 유세포 분석법의 사용을 통해 공배양 동안 표적화 세포 및 이웃하는 세포 상의 적어도 9가지 세포사 양식(아폽토시스, 유사분열 사멸, 파이롭토시스, 자가포식 세포사, 괴사, 네크롭토시스, 엔토시스, 엠페리토시스 및 세포성 카니발리즘을 포함)의 실행을 검출하여(도 1A-B) 세포 자율적 사멸로부터 비세포 자율적 사멸과 방관자 치명적 영향으로부터 직접 세포 사멸을 구별할 수 있도록 한다. 이 방법론은 IR에 의해 유발된 세포사 프로파일링을 정의할 수 있도록 한다.

이온화 방사선-유도된 세포사 프로파일링은 조사된 암 세포 및 조사되지 않은 암 세포 모두에서 세포사의 유도를 강조한다. 항암 치료와 관련된 세포성 및 생화학적 과정을 더 잘 특성화하기 위해 구현된 집중적인 생물학적 및 약제학적 연구에도 불구하고, 클리닉에서 사용되는 가장 빈번한 항암 치료 중 하나인 방사선 요법의 치료 효과를 담당하는 치명적인 메카니즘은 여전히 공지되어 있지 않다. 이온화 방사선에 반응하여 검출된 치명적인 과정(예: 아폽토시스 및 유사분열 카타스트로피)은 치료 효율에 직접 관련되지 않았으며³⁵, 이는 여전히 공지되지 않은 추가의 세포사 양식이 방사선 요법의 치료 효과에 기여할 수 있음을 시사한다. 이 맥락에서 조사된 암 세포의 세포사 프로파일링이 결정되었다. 상기한 방법론에 따라, CMFDA-표지된 세포는 4그레이로 조사되거나 조사되지 않고, 24시간 후에 CMTMR-표지된 세포와 1:1 비율로 함께 혼합하고, 각각의 지시된 억제제(보충 도면 1A-1E)의 존재하에 24시간 동안 배양했다. 이어서, 각 세포 파트너의 PS 노출, 막 완전성 및 DNA 함량을 각각 아넥신V-BV786, DRAQ7 및 Hoechst 33342 염색법을 사용하여 결정했다. 아폽토틱 및 괴사성 세포사(아넥신V⁺DRAQ7^- 및 DRAQ7⁺ 세포의 분석에 의해 밝혀진 바와 같음)의 유의한 증가가 이웃하는 세포 집단(CMTMR⁺ 세포)(도 2A, 2B 및 2D) 및 미처리된 대조군 세포 집단(도 2A, 2D 및 2E)에 대해 관찰되지 않았음에도 불구하고, 총 세포 집단(CMFDA⁺ 및 CMTMR⁺ 세포 집단을 고려함으로써 밝혀진 바와 같음)(도 2A-2C) 및 조사된 세포 집단(CMFDA⁺ 세포)(도 2B 및 2E)에 대한 이들 두 유형의 사멸의 유의한 증가가 24시간의 공배양 후 검출되어 본 방법론이 조사되지 않은 세포 및 조사된 세포 모두의 세포사 양식을 검출할 수 있도록 한다는 것을 입증한다. 또한, pan-카스파제 억제제 Z-VAD-fmk 및 약리학적 사이클린-의존성 키나제 억제제 로스코비틴(Rosco)이 조사된 CMFDA⁺ 세포(도 2E)의 외부 혈장 막 상에 PS의 노출을 억제하여 이미 공개된 바와 같이^45,46, 조사된 CMFDA⁺ 세포가 카스파제 활성화 및 유사분열을 통해 죽음으로의 진행 둘 다를 필요로 한다는 것을 확인했음이 또한 관찰되었다. 또한, 바필로마이신 Al(BafAl)에 의한 자가포식 융합의 손상은 총 세포 집단(CMFDA⁺ 및 CMTMR⁺ 세포)(도 2C)에서, 조사되지 않은 CMTMR⁺ 세포(도 2D) 및 조사된 CMFDA⁺ 세포(도 2E)에서 염색 세포(아넥신V⁺DRAQ7^- 및 DRAQ7⁺ 세포)의 빈도를 증가시키고, 따라서 자가포식이 사멸로부터 조사되지 않은 세포 및 조사된 세포 둘 다를 구조하는데 기여하는 이온화 방사선에 의해 유도된 생존 세포 메카니즘임을 나타낸다. 또한, 이들의 세포 사이클을 통한 처리된 세포 및 미처리된 세포의 진행의 동시 분석은 세포사 유도가 Gl 정지로부터 조사된 CMFDA⁺ 세포의 유출과 연관되며, S 및 G2/M 상(도 2F, 2G, 2J)에서 이들의 축적을 유도한다는 것을 보여주었다. 총 또는 CMTMR⁺ 세포 집단에 대해 세포 주기의 변화가 검출되지 않고, 세포 주기 변화가 조사된 세포(도 2F, 2G 및 2I)에서만 검출된다는 것을 강조한다. 고적적인 유세포 분석법 분석(보충 도면 2A-2B)에 의해 또한 확인된 이러한 결과는 이온화 방사선 이후 조사된 암 세포 및 조사되지 않은 암 세포 모두가 카스파제-l 의존성 세포사를 겪는다는 것을 입증했다. 전체적으로, 이들 결과는 직접적인 세포 사멸과 방관자 효과를 통해 암 세포를 동시에 제거하는 항암제의 능력을 강조했다.

이온화 방사선-유도된 세포사 프로파일링은 또한 비-세포-자율적 사멸 양식의 유도를 나타낸다. 동시에, 동일한 공배양에서, 유도성 세포성 카니발리즘 관련 세포사(예: 세포성 카니발리즘, 엠페리토시스 또는 파곱토시스) 또는 세포내 세포 침습-유도 세포사(예: 엔토시스)에 필요한 2개의 세포 과정인 조사된 CMFDA⁺ 세포의 이웃 세포를 흡입하거나 침범하는 능력이 결정되었다. 다중스펙트럼 영상화 유세포 분석법 분석은 감마-조사된 CMFDA⁺ 세포가 이웃하는 세포의 흡입을 유발했다(감마-조사된 CMFDA⁺ 세포(도 3A 및 3B)에 의한 "표적" CMTMR⁺ 세포의 내재화에 의해 나타낸 바와 같이)는 것을 나타냈다. pan-카스파제 억제제 Z-VAD-fmk에 의해 영향을 받지 않은 이 과정은 ROCK1의 억제제(Y27632)(도 3B)에 의해 억제되고, 따라서, 검출된 세포내 세포 내재화가 아폽토틱 세포의 식세포 흡수와 구별되고 ROCK1 활성이 일어나는 것을 요구한다는 것을 나타낸다. 감마-조사된 세포의 카니발리즘 활성은 또한 공초점 현미경 검사(도 3D-3F)에 의해 확인되었다. 흥미롭게도, 세포사 프로파일링 분석은 또한 바필로마이신 A1(도 3B)에 의한 치료로 아폽토시스의 유도에 연속적인 살아 있는 CMTMR⁺ 세포에 의해 아폽토틱 CMFDA⁺ 세포의 파고사이토시스로부터 생세포 흡입을 구별하도록 허용했다. 이어서, 흡입된 CMTMR⁺ 세포 및 조사된 흡입되는 CMFDA⁺ 세포의 세포 운명을 평가했다. 거의 모든 흡입된 CMTMR⁺ 세포가 세포 분해의 징후를 나타냈다(다중스펙트럼 영상화 유세포 분석법(도 3A) 및 공초점 현미경 검사(도 3D 및 3E)로 검출된 내재화된 세포의 DNA 함량 손실에 의해 나타낸 바와 같이)는 것이 관찰되었다. 이 과정은 pan-카스파제 억제제 Z-VAD-fmk 및 카스파제-1 억제제 YVAD-fmk의 존재하에 상당히 감소되어 흡입된 세포의 IR-매개된 사멸은 카스파제가 발생하는 것을 필요로 하고 파이롭토시스로서 공지되기도 한 카스파제-1 의존성 아폽토시스를 통해 실행될 수 있다. 또한, 90% 의 카니발리즘 세포는 PS를 노출시키지 않거나, 그들의 혈장 막의 완전성의 손실을 나타내지 않아(보충 도면 2C) IR-매개된 세포 흡입 후, 내재화된 세포가 카니발리즘 세포의 생존력을 조절하지 않고 사멸한다는 것을 강조한다는 것이 또한 나타났다. 전체적으로, 이들 결과는 이온화 방사선이 직접 세포 사멸, 방관자 치명적 효과 및 세포성 카니발리즘 관련 세포사의 조합된 효과를 통해 암 세포를 동시에 제거한다는 것을 입증했다. 이러한 결과는 치명적인 과정 동안 비-세포 자율적 및 세포 자율적 사멸 서브루틴의 유도를 동시에 측정해야 하는 긴박한 필요성을 강조한다.

화학적 라이브러리 스크리닝은 IR-매개된 세포성 카니발리즘 인핸서의 동정을 유도한다. 이어서, IR-매개 세포성 카니발리즘을 유도할 수 있는 화합물을 동정하기 위해 화학적 화합물의 라이브러리의 스크리닝이 개발되었다. 따라서, 8 그레이의 방사선 선량으로 처리된 HCT116 세포를 오렌지 CMTMR 세포 추적기 또는 녹색 CMFDA 세포 추적기로 염색하고, 10μM의 화학적 화합물의 존재하에 배양했다. 배양 24시간 후, 세포를 핵 염료(37℃에서 1시간 동안 5㎍/ml의 Hoechst 33342)로 염색하고, 세포성 카니발리즘에 대해 FlowSight® 영상화 유세포 분석기를 사용하여 분석했다. 이들 화합물 각각은 그들의 Z-스코어⁴⁷에 따라 분류되고, 각각 13개 및 11개 후보 화합물(도 4A, 4B, 4F 및 4G)을 동정했다. 이어서, 동정된 화합물은 유세포 분석 접근법(내부 미토콘드리아 막의 탈분극화와 처리된 세포의 혈장 막 투과도를 동시에 모니터링함으로써 세포독성 화합물을 제거하기 위해)을 공초점 현미경 검사 접근법(후보 화합물에 의한 IR-유도된 세포성 카니발리즘의 조절을 확인하기 위해)을 조합하여 확인했다(도 4C-E 및 4H-J). 3개의 독립적인 실험의 완료 후, 효과가 없는 화학적 화합물(예: 펜벤다졸 또는 카비마졸) 또는 높은 세포독성을 나타내는 화학적 화합물(예: RN-1-183)이 제거되었다. 마지막으로, 세포성 카니발리즘을 유발하기 위한 IR의 능력을 향상시킬 수 있는 16개의 화학적 화합물이 동정되었다(도 4e 및 4J, 표 1 & 2).

IRCCE와 IR의 조합은 효율적인 항종양 면역력을 유도한다. 면역원성 세포사(ICD) 유도제가 IRCCE로서 동정되었다(예: 디곡신, 디지톡신, 라나토사이드 C 또는 독소루비신 하이드로클로라이드)^3,4,48-51)는 것을 고려하여, 방사선 요법 후 항종양 면역력을 유도하는 이들 화합물의 능력이 평가되었다. 먼저, 전임상 접근법이 암종(결장 CT26 암종 및 섬유육종 MCA205)의 2마리 마우스 모델에 대한 IRCCE의 면역학적 효과를 연구하기 위해 개발되었다. 초기에, 특정 항-종양 면역 반응을 유발하는 IRCCE+IR의 조합의 능력은 항-종양 백신접종 검정을 통해 면역적격성 마우스를 사용하여 인식되었다. 이전에 공개된 연구⁵²에 따르면, 면역원성 세포사(ICD)에 굴복하는 암 세포의 면역적격성 마우스에의 주사는 종양 항원에 특이적인 보호성 면역 반응을 유도해야 한다. 따라서, 3x10⁵ MCA205 세포를 먼저 10μM의 SG6163F로 24 시간 동안 처리했다. 이어서, 처리된 세포를 200㎕의 PBS에서 8주령 암컷 C57BL/6 마우스의 하부 옆구리에 피하 접종했다. 1주일 후에, 3x10⁴ 미처리된 대조군 세포를 마우스의 대측성 옆구리에 접종했다. 종양은 공통 캘리퍼를 사용하여 매주 평가했다. 20-25% 체질량을 초과하는 종양 보유 동물은 안락사시켰다. IR 또는 SG6163F 단독으로 처리된 마우스는 시험관내 세포사의 상당한 증가를 유도할 수 없다는 것이 관찰되었다(도 5A). 사실상, 그들은 미처리된 세포의 접종 후 보호 반응을 나타내지 않아 사용된 방사선의 선량 및 SG6163F의 농도가 항암 면역 반응을 자극하기에 충분하지 않았다(도 5B)는 것을 나타낸다. 이들 결과는 암 세포가 세포의 70%가 혈장 막의 외부 리플릿 상의 포스파티딜세린을 노출할 때까지 시험관내에서 세포독성 항암 치료에 노출될 때만 보호 반응이 검출되는 것을 입증하는 이전에 공개된 결과와 일치했다⁴⁸. 놀랍게도, 8 Gy의 IR 및 10μM의 SG6163F와 MCA205 세포의 조합된 치료가 주사된 5마리의 마우스 중 3마리에서 보호 반응을 유도했다는 것이 관찰되었다(도 5B). 이들 결과는 IRCCE+IR의 조합이 처리되고 조사된 세포의 사멸의 상당한 증가 없이 IR-매개된 항암 면역 반응을 유도할 수 있어(도 5A), 세포성 카니발리즘 또는 세포성 카니발리즘 관련 신호전달 경로가 종양 면역원성의 유도에 기여할 수 있음을 시사한다는 것을 처음으로 나타냈다. 이어서, 3x10⁶ CT26 세포를 10μM의 SG6163F(도 5E 및 5F), VP331(도 5I 및 5J), 미나프린 디하이드로클로라이드(도 5M 및 5N) 또는 LOPA87(도 5Q 및 5R)의 존재하에 24시간 동안 8Gy로 조사했다. 이어서, 세포를 이전에 기재된 바와 같이 200㎕ PBS에서 8주령 암컷 BALB/c 마우스의 하부 옆구리에 피하 접종했다. 1주일 후에, 5x10⁵ 미처리된 대조군 세포를 마우스의 대측성 옆구리에 접종하고, 종양을 공통 캘리퍼를 사용하여 매주 평가했다. 전술한 바와 같이, 20-25% 체질량을 초과하는 종양 보유 동물은 안락사시켰다. 각 조건에서 염색 세포의 백분율을 DiOC(6)3/IP 염색으로 결정함으로써 평가했다(도 5E, 5I, 5M 및 5Q). 마지막으로, 조사되고 처리된 암 세포의 주사 7일 후에 주사된 암 세포 성장을 억제하는 이들 화합물의 능력이 인식되었다. IR 및 화학적 화합물로 처리된 암 세포의 주사후 보호 반응을 보이는 마우스의 빈도의 현저한 증가가 관찰되었다(도 5H, 5L, 5P 및 5T).

제2 항-종양 백신접종 검정을 전술한 바와 같이 암종의 CT26 마우스 모델에서 수행했다. 요약하면, CT26 세포를 10μM의 VP331(도 6A, 6F, 6K), 미나프린 디하이드로클로라이드(도 6B, 6G, 6L), LOPA87(도 6C, 6H, 6M), SG6163F(도 6D, 6I, 6N), 또는 아자구아닌-8(8-아자)(도 6E, 6J, 6O)의 존재하에 24시간 동안 8Gy로 조사했다. 이어서, 세포를 먼역적격성 BALB/c 마우스에 전술한 바와 같이 접종했다. 마지막으로, 조사되고 처리된 암 세포의 주사 7일 후에 주사된 암 세포의 성장을 억제하는 이들 화합물의 능력이 인식되었다. 이전의 결과가 확인되었다. IR 및 화학적 화합물로 처리된 암 세포의 주사 후 보호 반응을 나타내는 마우스의 빈도의 현저한 증가가 관찰되었다(도 6P 및 6Q). 흥미롭게도, 미나피린 디하이드로클로라이드(도 6B, 6G, 6L, 6P 및 6Q) 및 아자구아닌-8(도 6E, 6J, 6O, 6P 및 6Q)은 단독으로 암 세포의 주사 후 보호 반응의 증가를 유도한다.

전체적으로, 이들 결과는 보호적 항암 면역 반응을 유도하는 본 플랫폼으로 동정된 화학적 화합물의 능력을 나타냈다.

미나프린 디하이드로클로라이드 자체의 항-종양 효과의 확인

본 발명자들은 미나프린이 세포성 카니발리즘으로도 공지된 유형 IV 세포사 양식의 유도를 선호한다는 것을 이전에 밝혀냈다. 암 세포가 미나프린으로 처리될 때 검출되는 이 비-세포-자율적 사멸은 이온화 방사선(IR)의 존재하에 상당히 증가되고, 따라서 종래의 항암 치료(예: 방사선 요법)에 반응하여 유도된 비-세포-자율적 암 세포 사멸을 향상시키는 미나프린의 능력을 나타낸다.

미나프린은 또한 면역원성 특성을 나타내며, 항종양 백신접종 검정에 의해 밝혀진 바와 같이 생체내에서 특정 항종양 면역 반응을 자극한다(상기 참조).

미나프린의 면역조절 효과를 추가로 특성화하기 위해, 본 발명자들은 마우스 암 세포의 성장에 대한 미나프린의 종양내 및 복강내 주사의 영향을 연구했다.

재료 및 방법

화학물질, 세포주 및 배양 조건

미나프린은 Jean-Christophe Cintran으로부터 입수했다. CT26 종양 세포를 10% 열-불활성화된 태아 소 혈청(FBS), 10mM HEPES 완충액, 2mM L-글루타민, 10U/mL 페니실린 나트륨 및 10㎍/mL 스트렙토마이신 설페이트로 보충된 RPMI 배지에서 배양했다.

면역적격성 마우스에서 종양 성장

종양내 주사를 위해, 3 10⁶ Balb/c-유도된 CT26 종양 세포를 8주령 Balb/c 마우스(Janvier Laboratories)에 피하 이식했다. 6일 후, 10μM의 미나프린 또는 대조군 인산염 완충 식염수(PBS)를 종양(20㎕)에 주사하고, 종양 용적을 1주일에 3회 평가했다. 복강내 주사를 위해, 5 10⁵ Balb/c-유도된 CT26 종양 세포를 8주령 Balb/c 마우스(Janvier Laboratories)에 피하 이식했다. 12일 후, 종양-보유 마우스는 상이한 농도의 미나프린(0.3, 1, 3 및 10mg/kg) 또는 PBS를 복강내 주사했다. 또한, 종양 용적을 1주일에 3회 평가했다. 실험은 랜덤화하고, EU 지침 63/2010에 따라 수행하였고, Gustave Roussy Cancer Campus의 윤리 위원회(CEEA IRCIV/IGR n°26)에 의해 승인받았다.

통계 및 재현성

샘플 크기를 추정하거나 샘플을 포함하거나 배제하기 위해 통계적 방법 또는 기준은 사용되지 않았다. 실험 및 결과 평가 동안 조사자는 그룹 할당에 맹검화되지 않았다. 결과는 평균값 ± SEM으로 표현된다. 통계적 유의성을 결정하기 위해, 2원 ANOVA(도 7A) 및 로그 랭크(Mantel-Cox)(도 7I) 시험이 P 값 계산용으로 사용되었다. 프리즘 6 소프트웨어가 생존 그래프의 생성 및 통계적 유의성을 위해 사용되었다. 통계적 유의성은 ^** p 값 < 0.01 또는 ^*p 값 < 0.05로 제시되었다.

결과

본 발명자들은 먼저 면역적격성 Balb/c 마우스에 3 10⁶ Balb/c-유도된 CT26 결장암 세포를 피하 이식했다. 6일 후, 종양-보유 마우스를 무작위화하고, 10μM의 미나프린(3mg/kg)을 종양에 주사했다. 종양 성장은 38일 동안 분석했다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 3mg/kg의 미나프린의 종양내 주사가 종양 성장을 유의하게 감소시킨다는 것을 관찰했다(도 7A 및 7B). 이 과정은 미처리된 대조군 마우스와 비교하여 처리된 마우스의 생존률 증가와 관련되며(도 7C), 따라서 종양 성장을 감소시키는 미나프린의 종양내 주사의 능력을 나타낸다.

이어서, 본 발명자들은 미나프린의 복강내 주사가 종양 성장에 영향을 미칠 수 있는지의 여부를 결정했다. 따라서, 5 10⁵ Balb/c-유도된 CT26 세포를 면역적격성 Balb/c 마우스에 이식했다. 12일 후, 종양-보유 마우스를 무작위화하고, 대조군(도 7D 및 7I) 또는 미나프린을 상이한 농도로(도 7E-7I) 복강내 주사했다. 미나프린의 종양내 주사로 관찰된 바와 같이, 본 발명자들은 1mg/kg, 3mg/kg 및 1Omg/kg의 미나프린의 복강내 주사가 대조군(도 7d 및 7i) 또는 0.3mg/kg의 미나프린으로 처리된 종양(도 7e 및 7i)과 비교하여 처리된 종양의 성장을 유의하게 감소시켜 미나프린의 종양내 주사가 또한 종양 성장에 영향을 미친다는 것을 나타냄을 관찰했다.

전체적으로, 이들 결과는 종양 성장을 감소시키는 미나피린의 종양내 및 복강내 주사 모두의 능력을 강조한다.

참고문헌

1 Tobias JS. Clinical practice of radiotherapy. Lancet 1992; 339: 159-163.

2 Apetoh L, Ghiringhelli F, Tesniere A el al. The interaction between HMGB1 and TLR4 dictates the outcome of anticancer chemotherapy and radiotherapy. Immunol Rev 2007; 220:47-59.

3 Apetoh L, Ghiringhelli F, Tesniere A et al. Toll-like receptor 4-dependent contribution of the immune system to anticancer chemotherapy and radiotherapy. Nature medicine 2007; 13: 1050-1059.

4 Ghiringhelli F, Apetoh L, Tesniere A et al. Activation of the NLRP3 inflammasome in dendritic cells induces IL-l beta-dependent adaptive immunity against tumors. Nature medicine 2009; 15: 1170-1178.

5 Michaud M, Martins I, Sukkurwala AQ et al. Autophagy-dependent anticancer immune responses induced by chemotherapeutic agents in mice. Science 2011; 334: 1573-1577.

6 Kingsley DP. An interesting case of possible abscopal effect in malignant melanoma. The British journal of radiology 1975; 48:863-866.

7 Ohba K, Omagari K, Nakamura T et al. Abscopal regression of hepatocellular carcinoma after radiotherapy for bone metastasis. Gut 1998; 43:575-577.

8 Postow MA, Callahan MK, Barker CA et al. Immunologic correlates of the abscopal effect in a patient with melanoma. The New England journal of medicine 2012; 366:925-931.

9 Rees GJ, Ross CM. Abscopal regression following radiotherapy for adenocarcinoma. The British journal of radiology 1983; 56:63-66.

10 Demaria S, Ng B, Devitt ML et al. Ionizing radiation inhibition of distant untreated tumors (abscopal effect) is immune mediated. International journal of radiation oncology, biology, physics 2004; 58:862-870.

11 Meng Y, Becket MA, Liang H et al. Blockade of tumor necrosis factor alpha signaling in tumor-associated macrophages as a radiosensitizing strategy. Cancer research 2010; 70:1534-1543.

12 Dewan MZ, Galloway AE, Kawashima N et al. Fractionated but not single-dose radiotherapy induces an immune-mediated abscopal effect when combined with anti-CTLA-4 antibody. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 2009; 15:5379-5388.

13 Kroemer G, Galluzzi L, Vandenabeele P et al. Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Commitee on Cell Death 2009. Cell death and differentiation 2009; 16:3-11.

14 Vanden Berghe T, Vanlangenakker N, Parthoens E et al. Necroptosis, necrosis and secondary necrosis converge on similar cellular disintegration features. Cell death and differentiation 2010; 17:922-930.

15 Aaes TL, Kaczmarek A, Delvaeye T et al. Vaccination with Necroptotic Cancer Cells Induces Efficient Anti-tumor Immunity. Cell reports 2016; 15:274-287.

16 Overholtzer M, Mailleux AA, Mouneimne G et al. A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell- in-cell invasion. Cell 2007; 131:966-979.

17 Wang S, He MF, Chen YH et al. Rapid reuptake of granzyme B leads to emperitosis: an apoptotic cell- in-cell death of immune killer cells inside tumor cells. Cell death & disease 2013;4:e856.

18 Brown GC, Neher JJ. Eaten alive! Cell death by primary phagocytosis: 'phagoptosis'. Trends in biochemical sciences 2012; 37:325-332.

19 Brown GC, Vilalta A, Fricker M. Phagoptosis - Cell Death By Phagocytosis - Plays Central Roles in Physiology, Host Defense and Pathology. Current molecular medicine 2015; 15:842-851.

20 Sierro F, Tay SS, Warren A el al. Suicidal emperipolesis: a process leading to cell-in-cell structures, T cell clearance and immune homeostasis. Current molecular medicine 2015; 15:819-827.

21 Khandelwal S, van Rooijen N, Saxena RK. Reduced expression of CD47 during murine red blood cell (RBC) senescence and its role in RBC clearance from the circulation. Transfusion 2007; 47:1725-1732.

22 Lagasse E, Weissman IL. bcl-2 inhibits apoptosis of neutrophils but not their engulfiment by macrophages. The Journal of experimental medicine 1994; 179:1047-1052.

23 Overholtzer M, Brugge JS. The cell biology of cell-in-cell structures. Nat Rev Mol Cell Biol 2008; 9:796-809.

24 Li Y, Sun X, Dey SK. Entosis allows timely elimination of the luminal epithelial barrier for embryo implantation. Cell reports 2015; 11:358-365.

25 Benseler V, Warren A, Vo M el al. Hepatocyte entry leads to degradation of autoreactive CD8 T cells. Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108:16735-16740.

26 Ni C, Huang L, Chen Y el al. Implication of cell-in-cell structures in the transmission of HIV to epithelial cells. Cell research 2015; 25:1265-1268.

27 Ni C, Chen Y, Zeng M el al. In-cell infection: a novel pathway for Epstein-Barr virus infection mediated by cell-in-cell structures. Cell research 2015; 25:785-800.

28 Bartosh TJ, Ullah M, Zeitouni S, Beaver J, Prockop DJ. Cancer cells enter dormancy after cannibalizing mesenchymal stem/stromal cells (MSCs). Proc Natl Acad Sci U S A 2016; 113:E6447-E6456.

29 Lugini L, Matarrese P, Tinari A el al. Cannibalism of live lymphocytes by human metastatic but not primary melanoma cells. Cancer research 2006; 66:3629-3638.

30 Wang S, Guo Z, Xia P el al. Internalization of NK cells into tumor cells requires ezrin and leads to programmed cell-in-cell death. Cell research 2009; 19:1350-1362.

31 He MF, Wang S, Wang Y, Wang XN. Modeling cell- in-cell structure into its biological significance. Cell death & disease 2013; 4:e630.

32 Sun Q, Cibas ES, Huang H, Hodgson L, Overholtzer M. Induction of entosis by epithelial cadherin expression. Cell research 2014; 24: 1288-1298.

33 Cano CE, Sandi MJ, Hamidi T et al. Homotypic cell cannibalism, a cell-death process regulated by the nuclear protein 1, opposes to metastasis in pancreatic cancer. EMBO molecular medicine 2012; 4:964-979.

34 Sun Q, Luo T, Ren Y el al. Competition between human cells by entosis. Cell research 2014;24:1299-1310.

35 Abend M. Reasons to reconsider the significance of apoptosis for cancer therapy. International journal of radiation biology 2003; 79:927-941.

36 Gudkov AV, Komarova EA. The role of p53 in determining sensitivity to radiotherapy. Nature reviews Cancer 2003; 3: 117-129.

37 Zhang P, Castedo M, Tao Y el al. Caspase independence of radio-induced cell death. Oncogene 2006; 25:7758-7770.

38 Castedo M, Perfettini JL, Roumier T, Andreau K, Medema R, Kroemer G. Cell death by mitotic catastrophe: a molecular definition. Oncogene 2004; 23:2825-2837.

39 Garcia-Calvo M, Peterson EP, Leiting B, Ruel R, Nicholson DW, Thomberry NA. Inhibition of human caspases by peptide-based and macromolecular inhibitors. The Journal of biological chemistry 1998; 273:32608-32613.

40 Castedo M, Perfettini JL, Roumier T el al. The cell cycle checkpoint kinase Chk2 is a negative regulator of mitotic catastrophe. Oncogene 2004; 23:4353-4361.

41 Miao EA, Leaf IA, Treuting PM el al. Caspase-l -induced pyroptosis is an innate immune effector mechanism against intracellular bacteria. Nature immunology 2010; 11:1136-1142.

42 Degterev A, Huang Z, Boyce M el al. Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury. Nature chemical biology 2005; 1:112-119.

43 Yamamoto A, Tagawa Y, Yoshimori T, Moriyama Y, Masaki R, Tashiro Y. Bafilomycin Al prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell structure and function 1998; 23:33-42.

44 Meijer L, Borgne A, Mulner O et al. Biochemical and cellular effects of roscovitine, a potent and selective inhibitor of the cyclin-dependent kinases cdc2, cdk2 and cdk5. European journal of biochemistry 1997; 243:527-536.

45 Lowe SW, Schmitt EM, Smith SW, Osborne BA, Jacks T. p53 is required for radiation- induced apoptosis in mouse thymocytes. Nature 1993; 362:847-849.

46 Vakifahmetoglu H, Olsson M, Zhivotovsky B. Death through a tragedy: mitotic catastrophe. Cell death and differentiation 2008; 15:1153-1162.

47 Zhang XD, Yang XC, Chung N el al. Robust statistical methods for hit selection in RNA interference high-throughput screening experiments. Pharmacogenomics 2006; 7:299-309.

48 Menger L, Vacchelli E, Adjemian S et al. Cardiac glycosides exert anticancer effects by inducing immunogenic cell death. Science translational medicine 2012; 4:l43ral99.

49 Obeid M, Panaretakis T, Joza N et al. Calreticulin exposure is required for the immunogenicity of gamma-irradiation and UVC light-induced apoptosis. Cell death and differentiation 2007; 14:1848-1850.

50 Obeid M, Tesniere A, Ghiringhelli F et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature medicine 2007; 13:54-61.

51 Casares N, Pequignot MO, Tesniere A et al. Caspase-dependent immunogenicity of doxorubicin-induced tumor cell death. The Journal of experimental medicine 2005; 202: 1691-1701.

52 Green DR, Ferguson T, Zitvogel L, Kroemer G. Immunogenic and tolerogenic cell death. Nat Rev Immunol 2009; 9:353-363.

Claims (6)

1. 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 예방 또는 치료하기 위해 사용하기 위한 미나프린 디하이드로클로라이드(Minaprine dihydrochloride).
2. 제1항에 있어서, 상기 대상체가 뇌암(brain cancer), 위암(gastric cancer), 두경부암(head-and-neck cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 소세포 폐암(small cell lung cancer), 전립선암(prostate cancer), 결장암(colon cancer), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 육종(sarcoma), 고환암(testicular cancer), 급성 비림프구성 백혈병(acute non-lymphocytic leukemia) 또는 유방암(breast cancer)을 앓고 있는 것인, 사용하기 위한 미나프린 디하이드로클로라이드.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 미나프린 디하이드로클로라이드가 주사가능한 약제학적 조성물의 형태인, 사용하기 위한 미나프린 디하이드로클로라이드.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미나프린 디하이드로클로라이드가 전신 또는 종양내 투여되는 주사가능한 약제학적 조성물의 형태인, 사용하기 위한 미나프린 디하이드로클로라이드.
5. 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 예방 또는 치료하기 위한 의약을 제조하기 위한 미나프린 디하이드로클로라이드의 용도.
6. 암을 예방하거나 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 유효량의 미나프린 디하이드로클로라이드를 함유하는 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.

Images