ES2898681T3 - Amplificadores del canibalismo celular para la utilización para sensibilizar tumores a la terapia de radiación - Google Patents

Amplificadores del canibalismo celular para la utilización para sensibilizar tumores a la terapia de radiación Download PDF

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Eric Deutsch
Catherine Brenner
Jean-Christophe Cintrat
Frédéric Taran
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Abstract

Método in vitro de identificación de un compuesto que puede potenciar un tratamiento de radioterapia en un sujeto, comprendiendo dicho método las etapas de: (a) añadir un compuesto candidato a un cultivo de células tumorales, (b) tratar dicho cultivo de células tumorales con una dosis de radiación de 1 a 20 Gray, (c) medir el canibalismo celular mediado por irradiación (IR) que se produce en dicho cultivo celular, en el que un compuesto que amplifica el canibalismo celular mediado por IR en comparación con los niveles de control será capaz de potenciar un tratamiento de radioterapia.

Description

DESCRIPCIÓN
Amplificadores del canibalismo celular para la utilización para sensibilizar tumores a la terapia de radiación
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a la utilización de los compuestos señalados en las tablas 1 y 2 y análogos de los mismos, para amplificar (“enhancing”) el canibalismo celular mediado por IR en las células de cáncer. Dichos compuestos se denominan en la presente memoria "amplificadores del canibalismo celular mediado por RI". Pueden utilizarse para amplificar la inmunogenicidad tumoral y/o para inducir una respuesta inmunitaria anticancerosa protectora significativa en sujetos que recibirán o que han recibido un tratamiento de radioterapia. Es decir, dichos compuestos pueden utilizarse para potenciar un tratamiento de radioterapia en un sujeto que lo necesita. Dichos compuestos se seleccionan preferentemente de entre el grupo que consiste en: sal 1,5-naftaleno disulfonato de mebhidrolina, flurbiprofeno, dihidrocloruro de minaprina, miricetina, digoxina, digitoxina, lanatósido, LOPA87, VP331, RN-1-026, SG6163F, VP450 y VP43.
La presente invención se expone en el juego adjunto de reivindicaciones.
Antecedentes de la invención
La radioterapia es una de las estrategias antitumorales de utilización más habitual en los tratamientos del cáncer. Más de la mitad de los pacientes con cánceres son tratados con radioterapia. La utilización de radioterapia (sola o en combinación con cirugía y quimioterapia) resulta crucial en la gestión de los tumores de cabeza y cuello, mama, pulmón, próstata, digestivo y cáncer cervical1. La exposición a radiación ionizante (RI) de los tejidos tumorales desencadena diversos procesos letales, tales como apoptosis, muerte celular autofágica, catástrofe mitótica o senescencia. Estos mecanismos contribuyen a la destrucción de las células de cáncer en los tejidos irradiados, aunque asimismo pueden inducir la inmunogenicidad de las células tumorales irradiadas 2, 3, modificar el microambiente tumoral y permitir el desarrollo de una respuesta inmunitaria antitumoral que implica la liberación de señales de peligro (adenosín trifosfato y proteína HMGB1)4, 5, la activación de receptores purinérgicos (especialmente P2X7 y P2Y2)4, el receptor de TLR42, 3 y el inflamasoma NLRP34 La relación entre la respuesta tumoral local y la estimulación del sistema inmunitario se ilustra mediante la descripción de un efecto remoto sobre las células de cáncer no irradiadas. Este efecto paradójico, asimismo conocido como efecto abscopal, ha sido estudiado desde hace muchos años en diferentes modelos murinos de tumor, así como en pacientes 6-9 Su detección se correlaciona positivamente con la presencia de una cantidad elevada de citocinas proinflamatorias (tales como TNF alfa), de células T productoras de interferón (IFN) gamma y requiere la observación de que se desarrolla una respuesta inmunitaria eficaz 10, 11. Dicho efecto asimismo se observa en pacientes tratados con radioterapia en combinación con agentes inmunomoduladores (tales como Ipilimumab o Interleucina-2)12 La descripción del efecto abscopal refuerza las recientes descripciones en muchos modelos animales de una contribución importante de diversos componentes del sistema inmunitario a la respuesta a la radioterapia. El papel central de las células inmunitarias (incluyendo los macrófagos asociados a tumor, las células T linfoides y las células dendríticas) ha sido estudiada y subrayada recientemente por la influencia de su modulación terapéutica con moduladores de puntos de comprobación inmunitaria (tales como la utilización de anticuerpos monoclonales contra CTLA4 o PD1) o la activación de macrófagos (con anticuerpos monoclonales dirigidos contra CSF1R). A pesar del papel central de la radioterapia en el arsenal terapéutico antitumoral, los procesos biológicos implicados en la eliminación de las células tumorales todavía no se han definido por completo y siguen siendo controvertidos. Los primeros estudios sobre la muerte de células tumorales radioinducida son relativamente antiguos y se produjeron antes de la reciente identificación de nuevos procesos de muerte celular, así como del papel central del sistema inmunitario en la eliminación de las células tumorales después de la irradiación.
Los avances científicos y tecnológicos en los últimos años han revelado la existencia de varios procesos de muerte celular. Se ha propuesto una clasificación de las modalidades de muerte celular construida sobre criterios morfológicos y funcionales 13 y se han subdividido los procesos letales en tres tipos diferentes: muerte celular de tipo I (asimismo conocida como apoptosis), muerte celular de tipo II (o autofagia) y muerte celular de tipo III (o necrosis). Inicialmente organizada en la aparente distinción entre las modalidades de muerte celular de tipo I y III, entre procesos que están regulados o que resultan inducidos accidentalmente, o mediante la diferenciación de muertes celulares que están asociadas a la inducción de una respuesta inflamatoria espectadora (“bystander”) in vivo y procesos letales que se creían silenciosos o tolerógenos, dicha clasificación que todavía identificaba erróneamente la muerte celular de tipo II como autofagia (que es principalmente un mecanismo intracelular de supervivencia requerido para el mantenimiento de la homeostasis celular) no reflejaba la aptitud de las muertes necróticas de ser genéticamente controladas o de ser inmunógenas, tal como pone de manifiesto la reciente caracterización molecular de la necroptosis 14, 15 Además, las subrutinas de muerte celular que no revelan, o que revelan parcialmente, dichas modificaciones morfológicas, metabólicas y bioquímicas estereotipadas (tales como la muerte celular y la cornificación) han sido menos estudiadas y se han agrupado en un mal definido subgrupo de modalidades de muerte celular asimismo conocido como subgrupo de muerte celular atípica 13
En los últimos años, se han descrito varios mecanismos nuevos de muerte celular (tales como la entosis o la emperitosis) y que se han asociado a este grupo olvidado de modalidades de muerte celular 16’ 17 La características de dichas modalidades de muerte atípicas subrayan la existencia de procesos de muerte celular que no se alcanzan al igual que las modalidades de muerte celular típicas, de una manera autónoma por la célula, sino que resultan inducidos después de la endocitos de células vivas por células vecinas. Durante décadas, las muertes no autónomas celulares (NCAD) se han observado y estudiado periódicamente. Denominada inicialmente fagoptosis 18, 19 o emperipolesis20, estos procesos se han implicado en el control de la homeostasis de eritrocitos, neutrófilos, plaquetas o células T 18, 21, 22 y, de esta manera, se han propuesto como formas fisiológicas principales de muerte celular en el cuerpo 18 Detectadas como estructuras de célula en célula, los NCAD asimismo se han observado durante el cultivo ex vivo de células primarias 23 o durante análisis histológicos de procesos fisiológicos (tales como la implantación de embriones 24 y el agotamiento intrahepático de células T autorreactivas 25) o enfermedades humanas (incluyendo el cáncer 23 y síndromes inflamatorios 23 durante enfermedades infecciosas 26, 21). Las NCAD se han detectado principalmente después de interacciones homotípicas entre células malignas en tumores humanos (incluyendo carcinomas de mama, cervicales y de colon, o melanomas) y asimismo se han detectado después de interacciones heterotípicas entre células tumorales y células estromales 28, células tumorales y efectores inmunitarios (tales como linfocitos 29 y células NK 30), aunque asimismo pueden observarse después de interacciones entre efectores inmunitarios y células epiteliales (tal como revela la destrucción de células T en células nodriza tímicas 31 o células T autorreactivas en el hígado 25). Recientemente, NCAD asimismo se ha asociado a enfermedades infecciosas. La endocitosis del virus 1 de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) o las células infectadas por el virus de Epstein-Barr (VEB) por células no infectadas se ha detectado durante el cocultivo in vitro y la degradación de células infectadas internalizadas propuesta como la primera etapa de un nuevo modo célula a célula de transmisión vírica entre células infectadas y células huésped 26, 27, subrayando la capacidad de las NCAD de contribuir asimismo a la patogénesis microbiana.
La primera etapa de la muerte celular no autónoma se inicia con la interacción de dos parejas celulares mediante receptores de adhesión membranaria (tales como cadherinas E o P) o receptores de estrés (tal como proteína relacionada con receptor de lipoproteína) y le sigue la formación de uniones adherentes entre células interactuantes que activan rutas de señalización en ambas células interactuantes y puede implicar pequeñas GTPasas (tales como Rho 32 y Cdc4233) y cinasas ROCK 16 A continuación, la modulación de la contractilidad de actomiosina y la reorganización del citoesqueleto de actina al nivel de células "diana" se muestra que favorece su invasión de células huésped 32, 34 Dicho proceso es diferente del canibalismo celular que asimismo puede inducir las NCAD mediante la activación de rutas específicas de señalización (tales como las rutas de señalización relacionadas con la fagocitosis que implican la proteína de división celular 42 de remodelado citoesquelético (CDC42), el ligando 1 (CXCL1) de quimiocina (motivo C-X-C) o el ligando 6 (CXCL6) de quimiocina (motivo C-X-C) sobre células huésped y conduce a una endocitosis activa de las células diana 33 Una vez internalizadas, las células endocitadas pueden ser dianas de enzimas lisosómicas "del huésped" (tales como catepsinas y granzimas) y resultar eliminadas mediante diferentes mecanismos letales que pueden implicar varios moduladores de la muerte celular típica (tales como citocromo c, caspasas o proteínas relacionadas con la autofagia (ATG)). La entosis, una muerte no autónoma celular, inicialmente descrita después de interacciones homotípicas entre células de cáncer de mama, es un mecanismo de invasión célula en célula que no requiere la activación de las caspasas para eliminar las células endocitadas 16 A la inversa, la endocitosis de las células asesinas naturales (NK) por células tumorales inicia la emperitosis, una muerte célula en célula programada que requiere la activación de la caspasa 3 y la fragmentación del ADN 30, revelando que las células endocitadas pueden ser eliminadas mediante procesos dependientes de caspasa o independientes de caspasa.
Wardman et al.53 da a conocer compuestos que resultan útiles para potenciar un tratamiento de radioterapia.
Sin embargo, a pesar de los considerables esfuerzos, los enfoques desarrollados durante los últimos 10 años para amplificar la efectividad de la radioterapia no han alcanzado el éxito clínico esperado. Entre los motivos para los fracasos de los enfoques anteriores, puede señalarse que la mayoría de los enfoques desarrollados hasta el momento presentan características diferentes de las del proyecto actual. Además, dichos enfoques no se han desarrollado utilizando enfoques racionales basándose en la caracterización de los mecanismos de muerte celular y resistencia a la terapia. Específicamente, nunca han considerado el impacto del sistema inmunitario sobre la eliminación de las células tumorales. Finalmente, meramente han traspuesto aplicaciones de radioterapia procedente del campo de la oncología médica sin considerar los mecanismos específicos de muerte celular posteriores a la irradiación.
En este contexto, existe una necesidad de identificar y caracterizar cuáles son los moduladores de la muerte celular posteriores a la irradiación de radioterapia y evaluar cuáles son las consecuencias inmunitarias de administrar dichos moduladores en los pacientes de cáncer.
Descripción de la invención
A pesar de la intensa investigación biológica y farmacéutica realizada para caracterizar mejor los procesos celulares y bioquímicos asociados a los tratamientos anticancerosos, todavía se desconocen cuáles son los mecanismos letales responsables de los efectos terapéuticos de la radioterapia, que es uno de los tratamientos anticancerosos más frecuentemente utilizados clínicamente. Los procesos letales (tales como la apoptosis y la catástrofe mitótica) que se han detectado en respuesta a la radiación ionizante no se han asociado directamente a la eficiencia del tratamiento 35, sugiriendo que modalidades de muerte celular adicionales que todavía se desconocen podrían contribuir a los efectos terapéuticos de la radioterapia.
El presente proyecto se basa en la identificación de un nuevo mecanismo de muerte celular (el canibalismo celular) que no ha sido detectado antes por otros posterior a la IR o a otros tratamientos anticancerosos. Habitualmente, en los experimentos de vacunación tumoral, las células de cáncer han sido expuestas a un tratamiento anticanceroso citotóxico in vitro hasta que 70% de las células exponen fosfatidilserina sobre la cara externa de la membrana plasmática 48 Resulta interesante que los presentes resultados revelan que los compuestos químicos seleccionados basándose en su capacidad de amplificar el canibalismo celular mediado por IR (IRCCE) convierten las células de cáncer en una vacuna que estimula las respuestas inmunitarias antitumorales. Más específicamente, los presentes resultados revelan por primera vez que la combinación de IRCCE+IR induce una respuesta inmunitaria anticancerosa mediada por IR en ausencia de un incremento significativo de muerte de las células tratadas e irradiadas (figura 5A), sugiriendo que el canibalismo celular o rutas de señalización asociadas a canibalismo celular contribuyen a la inducción de la inmunogenicidad tumoral posterior a irradiación.
La irradiación se utiliza habitualmente para tratar el cáncer. Con frecuencia en combinación con quimioterapia y/o cirugía, la terapia de irradiación comprende la administración tanto local como en todo el cuerpo, así como varios avances nuevos, incluyendo la radioinmunoterapia. El efecto citotóxico de la irradiación sobre las células neoplásicas aparece a partir de la capacidad de la irradiación de causar una rotura en una o ambas cadenas de la molécula de ADN dentro de las células. Son susceptibles a dicho efecto las células en todas las fases del ciclo celular. Sin embargo, el daño al ADN es más probable que resulte letal en células cancerosas porque son menos capaces de reparar el daño al ADN. Las células sanas, con proteínas de punto de comprobación del ciclo celular y enzimas de reparación funcionales es mucho más probable que reparen el daño por radiación y funcionen normalmente después del tratamiento. Sin embargo, la irradiación comporta efectos secundarios que son una carga para los pacientes. Los efectos secundarios de la irradiación son similares a los de la quimioterapia y aparecen por el mismo motivo, es decir, el daño en los tejidos sanos. La irradiación habitualmente es más localizada que la quimioterapia, aunque este tratamiento todavía es acompañado por daños en tejido previamente sano. Muchos de los efectos secundarios son desagradables y la irradiación asimismo comparte con la quimioterapia la desventaja de ser mutágeno, carcinógeno y teratógeno por sí mismo. Aunque las células normales habitualmente empiezan a recuperarse del tratamiento dentro de las dos horas siguientes al tratamiento, pueden inducirse mutaciones en los genes de las células sanas. Dichos riesgos son elevados en determinados tejidos, tales como los del sistema reproductor. Además, se ha encontrado que diferentes personas toleran la irradiación de manera diferente. Las dosis que pueden no conducir a nuevos cánceres en un individuo pueden de hecho generar cánceres adicionales en otro individuo. Lo anterior podría deberse a mutaciones preexistentes en las proteínas de punto de comprobación del ciclo celular o en enzimas de reparación, aunque la práctica actual no es capaz de predecir a qué dosis se encontrará en riesgo un individuo particular. Entre los efectos secundarios habituales se incluyen irritación de la vejiga, fatiga, diarrea, bajos recuentos sanguíneos, irritación de la boca, alteración del gusto, inapetencia, alopecia, irritación de la piel, cambios en la función pulmonar, enteritis, trastornos del sueño y otros.
Resultaría altamente ventajoso proporcionar a los pacientes un agente potenciador que indujese un efecto sinérgico con la irradiación, permitiendo de eta manera que el paciente fuese menos expuesto a la terapia de irradiación. Lo anterior en efecto reduciría los efectos secundarios anteriormente indicados, consiguiendo simultáneamente un resultado beneficioso mejorado. Lo anterior asimismo es un aspecto de la presente exposición.
En general, se propone que, dada la importancia señalada del canibalismo celular sobre la eliminación de las células de cáncer irradiadas y la creciente importancia de la respuesta inmunitaria en la respuesta tumoral a la irradiación, el canibalismo celular es una muerte "deseable" que debería favorecerse durante los tratamientos del cáncer a fin de eliminar eficientemente las células de cáncer irradiadas. Lo anterior puede conseguirse mediante la administración en los pacientes de amplificadores del canibalismo celular, tal como demuestran los presentes inventores en la parte experimental, posteriormente.
Definiciones
La expresión "terapia de irradiación" se utiliza habitualmente en la técnica para referirse a múltiples tipos de terapia de radiación, incluyendo la terapia de radiación interna y externa, la radioinmunoterapia y la utilización de diversos tipos de radiación, incluyendo los rayos X, los rayos gamma, las partículas alfa, las partículas beta, los fotones, los electrones, los neutrones, los isótopos radioactivos y otras formas de radiación ionizante. Tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "terapia de irradiación", "terapia de radiación", "radiación" e "irradiación" son inclusivas de la totalidad de dichos tipos de terapia de radiación, a menos que se especifique lo contrario. Existen diferentes tipos de máquinas de radioterapia, que funcionan de maneras ligeramente diferentes. El número y duración de las sesiones de radioterapia depende del tipo de cáncer y dónde se localiza en el cuerpo. Un cáncer de piel superficial puede requerir únicamente unos cuantos tratamientos cortos, mientras que un cáncer localizado más profundamente en el cuerpo puede requerir un tratamiento más prolongado.
Las expresiones "supresión del crecimiento tumoral", "tratamiento del crecimiento tumoral" y "tratamiento del cáncer" y similares se refieren a reducir la tasa de crecimiento de un tumor, a detener el crecimiento tumoral por completo, a causar una regresión del tamaño de un tumor existente, a erradicar un tumor existente y/o a evitar la aparición de tumores adicionales mediante el tratamiento con las composiciones, kits o métodos de la presente exposición. "Suprimir" el crecimiento de las células tumorales se refiere a todos y cada uno de los estados siguientes: enlentecer, retrasar y detener el crecimiento tumoral, así como el encogimiento del tumor. La expresión "retrasar el desarrollo" de un tumor se refiere a diferir, enlentecer, retardar, estabilizar y/o posponer el desarrollo de la enfermedad. Dicho retraso puede ser de duración variable, dependiendo de la historia de la enfermedad y/o del individuo bajo tratamiento. El crecimiento de las células tumorales puede evaluarse mediante cualesquiera medios conocidos de la técnica, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, la medición del tamaño tumoral, la determinación de si las células tumorales son proliferantes utilizando un ensayo de incorporación de 3H-timidina o el recuento de las células tumorales.
Tal como se utiliza en la presente memoria, "sinergia" o "efecto sinérgico" en referencia a la administración en combinación de un compuesto de la presente exposición junto con radiación significa que el efecto de la combinación es más que aditivo en comparación con la administración del compuesto o compuestos y radiación por separado.
El término "potenciar" significa, en el contexto de la presente solicitud, amplificar o incrementar el efecto de, por ejemplo, un tratamiento de radioterapia o promover o fortalecer, por ejemplo, una acción o efecto bioquímico o fisiológico.
La expresión "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de un compuesto tal como se indica en la presente memoria que puede resultar terapéuticamente eficaz en el tratamiento de un cáncer asociado a la presente exposición. La cantidad precisa de dichos compuestos requerida variará con los compuestos o derivados particulares utilizados, la edad y la condición del sujeto que debe tratarse y la naturaleza y severidad de la condición. Sin embargo, la cantidad eficaz puede ser determinada por el experto ordinario en la materia utilizando únicamente experimentación rutinaria. La cantidad eficaz de radiación puede ser determinada por el experto ordinario en la materia sin necesidad de experimentación indebida. Los parámetros de la radiación, tales como la cantidad de dosis y la frecuencia, son bien conocidos en la técnica.
La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosis que resultan, dentro del ámbito del criterio médico razonable, adecuados para la utilización en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otros problemas o complicaciones, proporcionales a una relación razonable de beneficio/riesgo.
La expresión "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a derivados de los compuestos dados a conocer, en los que el compuesto parental se modifica mediante la preparación de sales de ácido o base de los mismos. Los compuestos de la presente exposición forman sales de adición de ácido o base con una amplia diversidad de ácidos y bases orgánicos e inorgánicos, e incluye las sales fisiológicamente aceptables que se utilizan con frecuencia en la química farmacéutica. Dichas sales asimismo forman parte de la presente exposición. Entre los ácidos inorgánicos típicos utilizados para formar dichas sales se incluyen clorhídrico, bromhídrico, yodhídrico, nítrico, sulfúrico, fosfórico, hipofosfórico y similares. Asimismo pueden utilizarse sales derivadas de ácidos orgánicos, tales como ácidos monocarboxílicos y dicarboxílicos alifáticos, ácidos aldónicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoico e hidroxialcandioico, ácidos aromáticos, y ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos. De esta manera, entre dichas sales farmacéuticamente aceptables se incluyen acetato, fenilacetato, trifluoroacetato, acrilato, ascorbato, benzoato, clorobenzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, benzoato de metilo, o-acetoxibenzoato, naftalén-2-benzoato, bromuro, isobutirato, fenilbutirato, p-hidroxibutirato, butín-1,4-dioato, hexín-1,4-dioato, cabrato, caprilato, cloruro, cinamato, citrato, formato, fumarato, glicolato, heptanoato, hipurato, lactato, malato, maleato, hidroximaleato, malonato, mandelato, mesilato, nicotinato, isonicotinato, nitrato, oxalato, ftalato, tereftalato, fosfato, monohidrogenofosfato, dihidrogenofosfato, metafosfato, pirofosfato, propiolato, propionato,fenilpropionato, salicilato, sebacato, succinato, suberato, sulfato, bisulfato, pirosulfato, sulfito, bisulfito, sulfonato, benceno-sulfonato, p-bromobencenosulfonato, clorobencenosulfonato, etanosulfonato, 2-hidroxietanosulfonato, metanosulfonato, naftalén-1-sulfonato, naftalén-2-sulfonato, p-toluensulfonato, xilensulfonato, tartarato y similares. Entre las bases utilizadas comúnmente para la formación de sales se incluyen hidróxido amónico e hidróxidos de metal alcalino y alcalino-térreo, carbonatos, así como aminas alifáticas y primarias, secundarias y terciarias, y diaminas alifáticas. Entre las bases especialmente útiles en la preparación de sales de adición se incluyen hidróxido sódico, hidróxido potásico, hidróxido amónico, carbonato potásico, metilamina, dietilamina y etilendiamina.
Las formas de realización alternativas proporcionan un método para potenciar el tratamiento de radioterapia del cáncer tal como se ha indicado, que comprende la administración de una "formulación de liberación lenta" que es capaz de liberar el principio activo a su medio circundante de una manera no instantánea controlada, dependiente del tiempo. Dicha formulación de liberación lenta puede comprender un polímero biodegradable, por ejemplo seleccionado de entre el grupo que consiste en un homopolímero de ácido láctico, un homopolímero de ácido glicólico, un copolímero de ácido poli-D,L-láctico y ácido glicólico, una sal peptídica insoluble en agua de un análogo de hormona liberadora de hormona lutenizante (LHRH), un poli(fosfoéster), un bis(p-carboxifenoxi)propano (CPP) con copolímero de ácido sebácico, un polímero de polianhídridos, copolímeros de poli(láctido)-coglicólido)polietilenglicol y un copolímero de etileno-acetato de vinilo.
En algunas formas de realización específicas del método, la formulación de liberación lenta libera el fármaco IRCCE durante un periodo de cuatro o más semanas, alternativamente durante un periodo de una semana o más, o alternativamente durante un periodo de unas cuantas horas o más.
Los métodos, composiciones, formulaciones y utilizaciones indicados en la presente memoria resultan adecuados tanto para seres humanos como animales, preferentemente mamíferos.
De esta manera, tal como se utiliza en la presente memoria, el término "sujeto" se refiere a cualquier mamífero, incluyendo un ratón, rata, cerdo, mono y caballo. En una forma de realización específica, se refiere a un ser humano. Un "sujeto que lo necesita" o un "paciente" en el contexto de la presente exposición pretende incluir cualquier sujeto que se beneficiará o es probable que se beneficie de los métodos y composiciones farmacéuticas de la presente exposición. El sujeto puede sufrir un cáncer de cualquier estado, de manera que podría ser un cáncer no invasivo temprano o podría ser un cáncer en estadio avanzado que ya ha avanzado para formar metástasis en el cuerpo.
El término "paciente" en la presente memoria se refiere a animales, incluyendo mamíferos, preferentemente seres humanos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "cáncer" pretende incluir cualquier forma de cáncer o tumores. Entre los ejemplos no limitativos de cánceres se incluyen cáncer cerebral (por ejemplo, glioma), cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pancreático, cáncer pulmonar no microcítico, cáncer pulmonar microcítico, cáncer de próstata, cáncer de colon, linfoma no hodgkiniano, sarcoma, cáncer testicular, leucemia no linfocítica aguda y cáncer de mama. En una forma de realización particular, el cáncer cerebral es un astrocitoma y, más particularmente, es glioblastoma multiforme; el cáncer de pulmón es un carcinoma pulmonar microcítico o un carcinoma pulmonar no microcítico, y el cáncer de cabeza y cuello es carcinoma celular escamoso o adenocarcinoma.
La presente exposición se basa en el resultado de que fármacos conocidos y no conocidos son capaces de amplificar el canibalismo celular mediado por IR in vitro e in vivo en animales portadores tumorales.
Tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "fármacos inductores de canibalismo celular", "agentes inductores de canibalismo celular", "compuestos inductores de canibalismo celular" e "amplificadores del canibalismo celular" designan compuestos que son capaces de amplificar la capacidad de la irradiación de inducir canibalismo celular. Bajo dichas expresiones se designan compuestos que son capaces de amplificar el canibalismo celular mediado por IR (en adelante en la presente memoria denominado IRCCE). Las estructuras químicas de los moduladores seleccionados de canibalismo celular se presentan en las tablas 1 y 2.
Tabla 1
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Tabla 2
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En total, los presentes inventores han identificado 16 compuestos amplificadores del canibalismo celular eficientes: 8-azaguanina, sal disulfonato de mebhidrolín-1,5-naftaleno, flurbiprofeno, dihidrocloruro de minaprina, miricetina, digoxina, digitoxina, lanatósido, hidrocloruro de doxorrubicina, LOPA87, VP331, RN-1-026, SG6163F, VP450 y VP43. Asimismo se han identificado varios compuestos interesantes. Son, por ejemplo, análogos de LOPA87 (LOPA90, LOPA93, LOPA 94, LOPA 101, LOPA104, LOPA105, LOPA106) y análogos de SG6143F (SG6144, SG6146 y SG6149). Por lo tanto, en una forma de realización preferida, los amplificadores de canibalismo celular de la invención se seleccionan de entre el grupo que consiste en: 8-azaguanina, sal disulfonato de mebhidrolín-1,5-naftaleno, flurbiprofeno, dihidrocloruro de minaprina, miricetina, digoxina, digitoxina, lanatósido, hidrocloruro de doxorrubicina, LOPA87, v P331, RN-1-026, SG6163F, VP450 y VP43, las estructuras de los cuales se muestran en las tablas 1 y 2. En una forma de realización más preferida, los amplificadores de canibalismo celular de la invención se seleccionan de entre el grupo que consiste en: sal 1,5-naftaleno disulfonato de mebhidrolina, flurbiprofeno, dihidrocloruro de minaprina, miricetina, digoxina, digitoxina, lanatósido, LOPA87, VP331, RN-1-026, SG6163F, VP450 y VP43. En una forma de realización todavía más preferida, los amplificadores de canibalismo celular de la invención se seleccionan de entre el grupo que consiste en: 8-azaguanina, dihidrocloruro de minaprina, LOPA87, VP331 y SG6163F.
Asimismo pueden ser análogos de LOPA87, tales como LOPA90, LOPA93, LOPA 94, LOPA 101, LOPA104, LOPA105 y LOPA106.
Asimismo pueden ser análogos de SG6163F, tales como SG6144, SG6146 y SG6149.
8-Azaguanina (C4H4N6O, análogo de purina). La 8-azaguanina es un análogo de purina con actividad antineoplásica potencial. La 8-azaguanina interfiere con la modificación del ácido ribonucleico de transferencia (ARNt) mediante la competición con guanina para la incorporación en el ARNt catalizado por el enzima ARNtguanín-ribosiltransferasa (ARNt-guanina transglucosilasa). La modificación de guanina alterada del ARNt se ha implicado en la diferenciación celular y transformación neoplásica. La 8-azaguanina inhibe además la formación de los complejos de iniciación 43S y 80s , interfiriendo de esta manera con el inicio de la traducción e inhibiendo la síntesis de proteínas. Dicho agente inhibe el crecimiento de las células tumorales y estimula la diferenciación celular.
La sal disulfonato de mebhidrolín-1,5-naftaleno (Ci9H20N2V 2Ci0H8O6S2, un antagonista de receptor de histamina H1. La mebhidrolina (napadisilato) es un antihistamínico, utilizada para el alivio sintomático de síntomas alérgicos causados por la liberación de histaminas, incluyendo alergias nasales y dermatosis alérgica.
Flurbiprofeno (Ci5Hi3FO2, derivado del ácido fenilalcanoico de la familia de los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE). El flurbiprofeno se utiliza para aliviar el dolor, la sensibilidad, la hinchazón y la rigidez causados por la osteoartritis (artritis causada por una degradación del revestimiento de las articulaciones) y la artritis reumatoide (artritis causada por la hinchazón del revestimiento de las articulaciones). El flurbiprofeno se encuentra en una clase de medicamentos denominadas AINE (agentes antiinflamatorios no esteroideos). Funciona mediante la detención de la producción corporal de una sustancia que causa dolor, fiebre e inflamación. Dicho agente antiinflamatorio no esteroideo de la clase del ácido propiónico está estructural y farmacológicamente relacionado con el fenoprofeno, ibuprofeno y ketoprofeno, y presenta acciones farmacológicas similares a las de otros AINE prototípicos. El flurbiprofeno muestra actividades antiinflamatoria, analgésica y antipirética. El flurbiprofeno disponible comercialmente es una mezcla racémica de enantiómeros S (+)- y R (-). El enantiómero S aparentemente posee la mayor parte de la actividad antiinflamatoria, mientras que ambos enantiómeros poseen actividad analgésica. De manera similar a otros AINE, el efecto antiinflamatorio del flurbiprofeno se produce mediante la inhibición reversible de la ciclooxigenasa (COX), el enzima responsable de la conversión del ácido araquidónico en prostaglandina G2 (PGG2) y de PGG2 en prostaglandina H2 (PGH2) en la ruta de síntesis de las prostaglandinas. Lo anterior reduce eficazmente la concentración de prostaglandinas implicadas en la inflamación, dolor, hinchazón y fiebre. El flurbiprofeno es un inhibidor no selectivo de COX e inhibe la actividad de tanto COX-1 como COX-2. Asimismo es uno de los AINE más potentes en términos de actividad inhibidora de prostaglandinas.
Dihidrocloruro de minaprina (C17H22N4O, antidepresivo amino-fenilpiridazina). El dihidrocloruro de minaprina es un fármaco psicotrópico que ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de diversos estados depresivos. Al igual que la mayoría de antidepresivos, la minaprina antagoniza la desesperanza conductual. La minaprina es un antidepresivo amino-fenilpiridazina de la que que se informa que se encuentra relativamente libre de cardiotoxicidad, somnolencia y ganancia de peso. Más específicamente, la minaprina es un antidepresivo aminofenilpiridazina de la que que se informa que se encuentra relativamente libre de cardiotoxicidad, somnolencia y ganancia de peso. De manera similar a otros tratamientos antidepresivos, la minaprina atenúa la función de los receptores beta-adrenérgicos. Los estudios han mostrado que la minaprina mejora la consolidación de la memoria y que la administración repetida del fármaco conduce a la potenciación de este efecto. Además, los efectos de la minarina sobre la consolidación de la memoria están relacionados con su acción dopaminérgica. La minaprina se une a los receptores de tipo 2 de la serotonina y a receptores de tipo D1 y D2 de la dopamina. Se une además a la bomba de recaptación de la serotonina. Por lo tanto, la minaprina bloquea la recaptación de tanto la dopamina como la serotonina. Asimismo es, en un grado leve, colinomimética. De esta manera, puede mostrar propiedades tanto de mejora del humor como nootrópicas. Actúa además como inhibidor reversible de MAO-A (RIMA). Se ha encontrado además que inhibe la acetilcolinesterasa.
Miricetina (C15H10O8, benzopiranos, molécula pequeña). La subunidad catalítica fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato 3-cinasa isoforma gamma ha sido propuesta como diana celular.
Digoxina (C41H64O14, glucósido cardiaco). La digoxina, un glucósido cardiaco similar a la digitoxina, se utiliza para tratar la insuficiencia cardíaca congestiva y las arritmias supraventriculares debidas a mecanismos de reentrada y para controlar la tasa ventricular en el tratamiento de la fibrilación auricular crónica.
Digitoxina (C41H64O13, glucósido cardiaco). La digitoxina es un glucósido cardiaco soluble en lípidos que inhibe la ATPasa de sodio-potasio de la membrana plasmática, conduciendo a niveles intracelulares incrementados de sodio y calcio y niveles intracelulares disminuidos de potasio. En los estudios, el calcio intracelular incrementado precede a la muerte celular y el potasio intracelular disminuido, a la activación de la caspasa y la fragmentación del ADN, causando apoptosis e inhibición del crecimiento de las células de cáncer.
Lanatósido C (C49H76O20, glucósido cardiaco). El lanatósido C, aislado a partir de diversas especies de digital, se utiliza en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca congestiva y las arritmias cardiacas.
Hidrocloruro de doxorrubicina (C27H29NO11, quimioterapia del cáncer). El hidrocloruro de doxorrubicina es la sal hidrocloruro de la doxorrubicina, un antibiótico antraciclina con actividad antineoplásica. La doxorrubicina, aislada a partir de la bacteria Streptomyces peucetius var. caesius, es el congénere hidroxilado de la daunorrubicina. La doxorrubicina se intercala entre pares de bases en la hélice del ADN, impidiendo de esta manera la replicación del ADN e inhibiendo en última instancia la síntesis de proteínas. Además, la doxorrubicina inhibe la topoisomerasa II, dando como resultado un complejo de unión de enzima de escisión-ADN incrementado y estabilizado durante la replicación del ADN y posteriormente impide la ligación de la cadena de nucleótidos después de la rotura de la doble cadena. La doxorrubicina forma además radicales de oxígeno libre que resulta en citotoxicidad secundaria a la peroxidación de lípidos de los lípidos de la membrana celular, la formación de radicales de oxígeno libre contribuye además a la toxicidad de los antibióticos antraciclina, es decir, los efectos vasculares cardiacos y cutáneos.
Compuestos químicos obtenidos de la biblioteca cribada
LOPA87, VP331, RN-1026, SG6163F, VP450 y VP43 han sido obtenidos de la biblioteca CEA. Asimismo se identificaron 7 análogos de LOPA87 (LOPA90, LOPA93, LOPA 94, LOPA 101, LOPA104, LOPA105, LOPA106) y 3 análogos de SG6163F (SG6144, SG6146 y SG6149).
Aspectos de la invención y divulgación
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a la utilización in vitro de los compuestos anteriormente identificados (señalados en las tablas 1 y 2) para amplificar el canibalismo celular mediado por IR (IRCCE) en las células de cáncer.
Dicho aspecto de la invención se lleva a cabo in vitro. Tal como se da a conocer en la presente memoria, las expresiones "in vitro" y "ex vivo" son equivalentes y se refieren a estudios o experimentos que se llevan a cabo utilizando componentes biológicos (por ejemplo, células o poblaciones de células) que han sido aisladas de sus organismos huésped habituales (por ejemplo, animales o seres humanos). Dichas células aisladas pueden purificarse adicionalmente, cultivarse o analizarse directamente con el fin de evaluar la presencia de las proteínas mutantes. Dichos experimentos pueden, por ejemplo, reducirse a la práctica en materiales de laboratorio, tales como tubos, matraces, pocillos, tubos Eppendorf, etc. En contraste, la expresión "in vivo" se refiere a estudios que se llevan a cabo en organismos vivos completos.
El canibalismo celular mediado por IR puede evaluarse mediante cualesquiera medios convencionales. En particular, dicha actividad puede evaluarse mediante el estudio de las células bajo el microscopio (mediante inmunofluorescencia o inmunohistoquímica) y mediante la detección visual de sucesos de endocitosis celular o sistemas célula-en-célula. Alternativamente, puede evaluarse mediante la medición, en dicha célula, del nivel de expresión de una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en p53, p53p, p53Y, e isotermas N-terminales de p53 que no presentan el dominio transactivador N-terminal, tales como A40TP53 y A133TP53, o mediante la medición del nivel de expresión o la actividad del receptor de P2Y2 purinérgico y/o mediante la medición del ATP extracelular secretado por dichas células, tal como se da a conocer en el documento US2015/185202/WO2014/006227.
Compuestos para la utilización in vivo
En este caso, los compuestos se administran preferentemente en los pacientes en una composición farmacéutica que contiene además adyuvantes farmacéuticamente aceptables. Por lo tanto, la "composición farmacéutica de la exposición" contiene una cantidad eficiente de por lo menos uno de los compuestos (ver las tablas 1 y 2, anteriormente) o análogos de los mismos, y adyuvantes o portadores farmacéuticamente aceptables. Son ejemplos de solventes no acuosos, propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Entre otros adyuvantes farmacéuticamente aceptables se incluyen soluciones acuosas y excipientes no tóxicos, incluyendo sales, conservantes, tampones y similares. Entre los vehículos intravenosos se incluyen reabastecedores de líquidos y nutrientes. Las composiciones pueden incluir además conservantes, tales como agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes. El pH y la concentración exacta de los diversos componentes de la composición farmacéutica pueden ajustarse según parámetros bien conocidos.
La administración in vivo de los compuestos está destinada a amplificar la inmunogenicidad tumoral en sujetos que se someterán o que han sido sometidos a un tratamiento de radioterapia. Aunque sin restringirse a ninguna teoría en particular, se cree que dichos compuestos funcionan sinérgicamente con la terapia de radiación al favorecer el canibalismo celular y, de esta manera, la exposición de epítopos particulares que inducen una respuesta inmunitaria anticancerosa protectora significativa.
La presente exposición presenta como objetivo la utilización de los compuestos dados a conocer en las tablas 1 y 2, anteriormente, o sus análogos, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la administración antes o después de la radioterapia en un sujeto que lo necesita.
Se refiere además a la utilización de los compuestos dados a conocer en las tablas 1 y 2, anteriormente, o sus análogos, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a potenciar el tratamiento de radioterapia en un sujeto que lo necesita.
Finalmente se refiere a la utilización de los compuestos dados a conocer en las tablas 1 y 2, anteriormente, o sus análogos, para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento del cáncer, en combinación con radioterapia, en un sujeto que lo necesita.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a los compuestos dados a conocer en las tablas 1 y 2, anteriormente, o sus análogos, o cualquier composición farmacéutica que los contiene, para su utilización para amplificar el canibalismo celular mediado por IR en pacientes que sufren de cáncer. En formas de realización de la invención, dichos compuestos pueden utilizarse:
- para amplificar la inmunogenicidad tumoral en sujetos que recibirán o que han recibido un tratamiento de radioterapia, y/o
- para inducir una respuesta inmunitaria anticancerosa protectora significativa en sujetos que recibirán o que han recibido un tratamiento de radioterapia.
Pueden utilizarse además para potenciar un tratamiento de radioterapia en un sujeto que lo necesita, o para tratar el cáncer, en combinación con radioterapia, en un sujeto que lo necesita.
Resulta importante que la administración de los compuestos permitirá reducir la dosis de irradiación y, por lo tanto, dará como resultado el alivio de los efectos secundarios producidos por el tratamiento de radiación.
Las composiciones farmacéuticas de la presente exposición pueden administrarse en forma de composiciones inyectables (por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraarticular), en forma de soluciones líquidas o suspensiones; asimismo pueden prepararse formas sólidas adecuadas para la solución o suspensión en líquido antes de la inyección. Dichas preparaciones asimismo pueden emulsionarse.
Dichas composiciones farmacéuticas asimismo pueden administrarse por otras vías, tales como oral, nasal, rectal, tópica, intravenosa, intramuscular, subcutánea, sublingual, intratecal, intraperitoneal, intraarticular o intradérmica. Preferentemente, la vía de administración es intravenosa, intraarterial u oral. Preferentemente, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intravenosa o intraarterial.
En formas de realización específicas, en el caso de que la composición de la presente exposición esté destinada a la administración oral, la composición de la exposición se encuentra en un comprimido, una solución o cápsula, tal como una cápsula de gel blando, por ejemplo. En otras formas de realización específicas, en el caso de que la composición de la presente exposición esté destinada a la administración oral, presenta un recubrimiento entérico. En otras formas de realización específicas, en el caso de que la composición de la presente exposición esté destinada a la administración oral, es un jarabe de base aceite.
En una situación particular, los compuestos pueden administrarse en una formulación de liberación lenta.
Los compuestos se administran en cantidades y a frecuencias suficientes para tratar el cáncer, en combinación con un tratamiento de radioterapia. Puede determinarse el progreso de un sujeto mediante la medición y observación de los cambios en la concentración de marcadores de cáncer, mediante la medición del tamaño real del tumor con el tiempo y/o mediante la determinación de cualesquiera otros marcadores clínicos relevantes que son bien conocidos en la técnica. La determinación, medición y evaluación de dichas características y marcadores asociados al progreso clínico son bien conocidos por el experto ordinario en la materia.
En una forma de realización, los compuestos se administran antes de la radioterapia. El tiempo de administración dependerá de la formulación específica y del tiempo necesario para que el amplificador de canibalismo celular alcance las células diana. El tiempo de administración se seleccionará de manera que proporcione la concentración óptima de amplificador de canibalismo celular en el momento de la irradiación.
En otra forma de realización, los compuestos se administran después de aplicar el tratamiento de radioterapia en el paciente.
En otra forma de realización, la administración de los compuestos y el tratamiento de radioterapia se aplican concomitantemente en el paciente.
Los presentes inventores han observado que la administración de dihidrocloruro de minaprina solo presenta efectos protectores intrínsecos contra el desarrollo tumoral (ver las figuras 6B, 6G, 6L, 6P y 6Q). En consecuencia, el dihidrocloruro de minaprina no necesita combinarse con un tratamiento de radioterapia; resulta eficiente por sí solo. Lo anterior es un resultado inesperado, ya que el dihidrocloruro de minaprina es conocido como fármaco antidepresivo y no se ha informado de un efecto antitumoral para este fármaco.
La presente exposición se refiere además al dihidrocloruro de minaprina, o cualquier composición farmacéutica que contiene el mismo,
- para su utilización para el tratamiento de pacientes que sufren de cáncer,
- para su utilización para inducir una respuesta inmunitaria anticancerosa protectora significativa en pacientes de cáncer.
- Para su utilización en el tratamiento del cáncer en combinación con un tratamiento de radioterapia, quimioterapia o inmunoterapia.
Toda la información dada a conocer anteriormente para las composiciones farmacéuticas es transponible a dicho uso particular.
Métodos de tratamiento (no reivindicados)
La presente exposición proporciona además métodos destinados a amplificar el canibalismo celular mediado por IR (IRCCE) en pacientes que sufren de cáncer, amplificar la inmunogenicidad tumoral en sujetos que recibirán o que han recibido un tratamiento de radioterapia, inducir una respuesta inmunitaria anticancerosa protectora significativa en sujetos que recibirán o que han recibido un tratamiento de radioterapia, potenciar un tratamiento de radioterapia en un sujeto que lo necesita, y/o tratar el cáncer, en combinación con radioterapia, en un sujeto que lo necesita.
En dichos métodos, los compuestos (ver las tablas 1 y 2, y análogos de los mismos, tal como se han detallado anteriormente) o las composiciones farmacéuticas (tal como se han dado a conocer anteriormente) se administran en dichos sujetos antes, después o concomitantemente con el tratamiento de radioterapia.
La presente exposición presenta como objeto adicional un método de tratamiento de pacientes de cáncer, que comprende administrar en dichos pacientes una cantidad eficaz de dihidrocloruro de minaprina, o cualquier composición farmacéutica que contiene el mismo. De hecho, los inventores han mostrado que dicho fármaco antidepresivo presenta una respuesta inmunitaria anticancerosa protectora significativa por sí mismo.
Métodos de cribado
En otra forma de realización, la presente invención se refiere a un método in vitro de identificación de un compuesto que puede potenciar un tratamiento de radioterapia en un sujeto, en el que dicho método comprende las etapas de:
(a) añadir un compuesto candidato a un cultivo de células tumorales,
(b) tratar dicho cultivo de células tumorales con una dosis de radiación de 1 a 20 Gray,
(c) medir el canibalismo celular mediado por irradiación (RI) que se produce en dicho cultivo celular,
en el que un compuesto que amplifica el canibalismo celular mediado por IR en comparación con los niveles de control es capaz de potenciar un tratamiento de radioterapia.
Tal como se ha indicado anteriormente, el canibalismo celular mediado por IR puede evaluarse mediante cualesquiera medios convencionales. En particular, dicha actividad puede evaluarse mediante el estudio de las células bajo el microscopio (mediante inmunofluorescencia o inmunohistoquímica) y mediante la detección visual de sucesos de endocitosis celular o sistemas célula-en-célula. Alternativamente, puede evaluarse mediante la medición, en dicha célula, del nivel de expresión de una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en p53, p53p, p53Y, e isoformas N-terminales de p53 que no presentan el dominio transactivador N-terminal, tales como A40TP53 y A133TP53, o mediante la medición del nivel de expresión o la actividad del receptor de P2Y2 purinérgico y/o mediante la medición del ATP extracelular secretado por dichas células, tal como se da a conocer en el documento US2015/185202 / WO2014/006227.
Alternativamente, el tratamiento del cultivo celular con irradiación puede llevarse a cabo antes de añadir el compuesto candidato al cultivo celular.
En un caso preferido, la dosis de radiación utilizada en la etapa b) está comprendida entre 1 y 10 Gray, típicamente es de 8 Gray.
En un caso preferido, el cultivo de células tumorales se trata con el compuesto candidato durante por lo menos 12 horas, más preferentemente durante por lo menos 20 horas, todavía más preferentemente durante 24 horas, antes o después de producirse la irradiación.
Dicho cultivo de células tumorales puede ser un cultivo de células HCT116, de células de carcinoma CT26 o de células de fibrosarcoma MCA205.
La confirmación del efecto potenciador del compuesto candidato puede llevarse a cabo tal como se indica en los ejemplos, posteriormente, es decir, mediante tratamiento de los cultivos de células tumorales apropiados con los compuestos durante por lo menos 12 horas, y la aplicación de un tratamiento de irradiación y después la inyección de dichas células en ratones inmunocompetentes, con el fin de confirmar que se ha inducido una respuesta inmunitaria protectora.
Según la parte experimental, posteriormente, los compuestos dados a conocer en las tablas 1 y 2, anteriormente, y sus análogos, se designan en la presente memoria como ejemplos de "amplificadores de canibalismo celular mediado por RI".
Leyendas de figura
Figura 1. Perfilado de muerte celular mediante citometría de flujo de obtención de imágenes cuantitativas. (A) Principio de perfilado de muerte celular mediante obtención de imágenes de flujo cuantitativas. (B) Validación de la detección multiparamétrica y simultánea de modalidades de muerte celular mediante citometría de flujo de obtención de imágenes cuantitativas inducida mediante irradiación gamma. Antes del cocultivo, células HCT116 tratadas y células HCT116 no tratadas se marcaron respectivamente con sondas vitales fluorescentes CMFDA (verde/gris claro) o CMTMR (rojo/gris oscuro). Tras 24 horas de cocultivo, las células HCT116 se analizaron para muerte células no autónoma (NCAD) (mediante detección de endocitosis de las células HCT116 marcadas con CMTMR o CMFDA), para exposición a fosfaditilserina (PS) (utilizando biotina-anexina V y BV786-estreptavidina), para pérdida de la integridad plasmática (mediante el seguimiento de la incorporación de DRAQ7) y para el contenido de ADN (utilizando Hoechst 33342). Mediante la utilización de citometría de flujo, la detección simultánea de muertes NCA y de muertes celulares típicas (tipos I, II y III) tanto en células HCT116 no tratadas como tratadas determinará el perfilado de muerte celular obtenido después del tratamiento del cáncer. Se muestran imágenes representativas (escala, 20 pm).
Figura 2. Detección de modalidades de muerte celular autónoma inducida por irradiación y mediante citometría de flujo de obtención de imágenes cuantitativas. (A-E) Detección y cuantificación de la pérdida de la integridad de la membrana plasmática y exposición a PS observada tras 24 horas de cocultivo de células HCT116 marcadas con CMTMR (rojo/gris oscuro) no tratadas y células HCT116 marcadas con CMFDA (verde/gris claro) no tratadas (A, C-E), de células HCT116 marcadas con CMTMR (rojo/gris oscuro) no tratadas y células HCT116 marcadas con CMFDA (verde/gris claro) no tratadas que han sido mezcladas extemporáneamente (C-E) o después de 24 horas de cocultivo de células HCT116 marcadas con CMTM (rojo/gris oscuro) no tratadas con células HCT116 (verde) marcadas con CMFDA (verde/gris claro) que han sido irradiadas con 4 grays de radiación ionizante y (B-E). Los cocultivos se llevaron a cabo en presencia o en ausencia de los inhibidores de efector de muerte farmacológica. La detección de la integridad de la membrana plasmática (con DRAQ7) y la exposición a PS (con BV786-estreptavidina/anexina V biotina) se analizó para las células HCT116 CMTMR+ (rojo/gris oscuro) no tratadas, para células HCT116 CMFDA+ (verde/gris claro) no tratadas, para células HCT116 CMFDA+ (verde/gris claro) tratadas y para la población celular total (células HCT116 CMTMR+ o CMFDA+). Se muestran gráficos de puntos representativos (A, B) y datos cuantitativos (C-E) (medias ± SEM, n=3). (F,G) Distribuciones de ciclo celular representativas de células HCT116 CMTMR+ (rojo/gris oscuro) no tratadas, células HCT116 CMFDA+ (verde/gris claro) no tratadas, células HCT116 CMFDA+ (verde/gris claro) tratadas y para la población celular total (células HCT116 CMTMR+ o CMFDA+) obtenidas tras 24 horas de cocultivo de células HCT116 marcadas con CMTMR (rojo/gris oscuro) no tratadas con células HCT116 marcadas con CMFDA (verde/gris claro) no tratadas (F, H-J), de células HCT116 marcadas con CMTMR (rojo/gris oscuro) no tratadas y células HCT116 marcada con CMFDA (verde/gris claro) no tratadas que han sido extemporáneamente mezcladas (H-J) o después de 24 horas de cocultivo de células HCT116 marcadas con CMTM (rojo/gris oscuro) no tratadas con células HCT116 marcadas con CMFDA (verde/gris claro) que han sido irradiadas con 4 grays de radiación ionizante y (G-J). Los datos cuantitativos de análisis del ciclo celular se muestran en (H-J) (medias ± SEM, n=3). * o # o $ representa p<0.05, ## o $$ p<0.01, *** o ### p<0.001.
Figura 3. Detección de modalidades de muerte celular no autónoma inducida por irradiación y mediante citometría de flujo de obtención de imágenes cuantitativas y microscopía confocal de fluorescencia. (A-G) Las estructuras de célula-en-célula y la degradación de células diana se determinaron mediante obtención de imágenes cuantitativas (A-C) y microscopía confocal de fluorescencia (D-G) después de 24 horas de cocultivo de células HCT116 marcadas con CMTM (rojo/gris oscuro) no tratadas con células HCT116 marcadas con CMFDA (verde/gris claro) que habían sido irradiadas con 4 grays de radiación ionizante y (A), cocultivo de células HCT116 marcadas con CMTMR (rojo/gris oscuro) no tratadas con células HCT116 marcadas con CMFDA (verde/gris claro) no tratadas (B, C) o sobre células HCT116 marcadas con CMTMR (rojo/gris oscuro) y células HCT116 marcadas con CMFDA no tratadas (verde/gris claro) que habían sido mezcladas extemporáneamente (B, C). Tal como se ha indicado anteriormente, las células se marcaron secuencialmente después del cocultivo con sondas fluorescentes específicas, tales como BV786- estreptavidina-anexina V biotina, DRAQ7 y Hoechst 33342. A continuación, se detectaron células HCT116 marcadas con CMTMR (rojo/gris oscuro) que internalizaban células HCT116 marcadas con CMFDA (verde/gris claro) (indicadas R(G)) y células HCT116 marcadas con CMFDA (verde/gris claro) que internalizaban células HCT116 marcadas con CMTMR (rojo/gris oscuro) (indicadas G(R)). Se muestran imágenes representativas en (A) (escala, 20 pm). Se informa de las frecuencias de las estructuras célula-en-célula (B) y la degradación de las células diana (C) (medias ± SEM, n=3). Se muestran imágenes confocales representativas de estructuras de célula-en-célula (flecha blanca) (D) y degradación de células diana (flecha de puntos blanca) (E) detectadas durante el cocultivo de células HCT116 marcadas con CMTMR (rojo) no tratadas con células marcadas con CMFDA no tratadas o irradiadas con y (verde) (barra de escala=10 pm). (F-G) Frecuencias de estructuras de célula-en-célula que muestran células marcadas con CMTMR (rojo/gris oscuro) que internalizan células marcadas con CMFDA (verde/gris claro) (indicadas como R(G)) y células marcadas con CMFDA (verde/gris claro) que internalizan células marcadas con CMTMR (rojo/gris oscuro) (indicadas como G(R)) y degradación de las células diana (G) (medias ± SEM, n=3); # o $ representa p<0.05, ## o $$, p<0.01, *** o $$$ o ###, p<0.001.
Figura 4. Identificación de moduladores de canibalismo inducidos por radiación ionizante. Se sometieron a ensayo compuestos de las bibliotecas Prestwick (A) y CEA (F) para sus capacidades de inducir canibalismo celular después de radiación ionizante. Se detectaron células caníbales tras cultivos homotípicos de células HCT116 irradiadas con 8 grays de radiación y en presencia o en ausencia de 10 pM de los compuestos de biblioteca Prestwick (A) y CEA (E). Cada punto representa un compuesto. Se muestran imágenes representativas en (B, G). (C, H) Se trataron células HCT116 con los fármacos indicados. Tras 24 h de tratamiento, se monitorizó la muerte celular mediante tinción con yoduro de 3,3-dihexiloxacarbocianina (DiOC6(3)) y PI, y el porcentaje de células moribundas (DiOC6(3)low PI-, columnas blancas) y muertas (DiOC6(3)low PI+, columnas negras) se determinó mediante citofluorimetría. Validación de los inductores de canibalismo mediante microscopía fluorescente. Se muestran imágenes representativas (D, I) y la cuantificación (E, J). Los resultados son medias ± s.e.m. de determinaciones por triplicado.
Figura 5. Identificación de moduladores de canibalismo como inductores inmunógenos de muerte celular. Se trataron MCA205 (A) o CT26 (E, I, M, Q) con los fármacos indicados. Tras 24 h de cocultivo con el tratamiento indicado, se monitorizó la muerte celular mediante tinción con DiOC6 (3) y PI y se determinó el porcentaje de células moribundas (DiOC6(3)low PI-, columnas blancas) y muertas (DOC6(3)low PI+, columnas negras). (B-D) células MCA205 o (F-H, J-L, N-P, R-T) células CT26 cocultivadas después de la irradiación x con los compuestos indicados se inocularon por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones C56BL/6 o BALB/c, respectivamente. Siete días después, los ratones fueron nuevamente retados con células vivas inyectadas en el flanco contrario y se monitorizó el crecimiento tumoral (cinco ratones en cada grupo).
Figura 6. Experimentos de vacunación tumoral. Se trataron células CT26 durante 24 horas con VP331 10 pM (A, F, K), minaprina 10 pM (B, G, L), Lopa87 10 pM (C, H, M), SG6163F 10 pM (D, I, N), azaguanina-8 (8-aza) 10 pM (E, J, O), solos o en combinación con 8 Gy de radiación ionizante y se inocularon (s.c.) en ratones BALB/c inmunocompetentes, que se retaron nuevamente en el flanco contrario 7 días después con las mismas células de cáncer. Se evaluó el porcentaje de ratones libres de tumor tres veces a la semana durante los 38 días siguientes.
Se muestra el porcentaje de ratones libres de tumores en total (A-E), ratones libres de tumores en el primer sitio de inyección (F a J, P) o en el segundo sitio de inyección (K a O, Q). (*P< 0.05, **P<0.01, ***P<0. 001, ANOVA bidireccional).
Ejemplos
I. Materiales y métodos
Compuestos químicos, líneas celulares y condiciones de cultivo
A menos que se indique lo contrario, los compuestos químicos se adquirieron de Sigma-Aldrich. Los antibióticos, medios y complementos para cultivo celular se obtuvieron de Life Technologies. La benciloxicarbonil-Val-Ala-Asp(OMe)-fluorometilcetona (Z-VAD-fmk) se obtuvo de Bachem y TNF-alfa de ratón recombinante se obtuvo de R&D Systems. las células HCT116 de carcinoma de colon humano se cultivaron en medio de McCoy 5A y la línea celular de fibrosarcoma murino L929, en medio de Eagle modificado por Dulbecco. Todos los medios se complementaron con suero de feto bovino (FBS) inactivado por calor al 10%, tampones HEPES 10 mM, L-glutamina 2 mM, 10 U/ml de penicilina sódica y 10 pg/ml de sulfato de estreptomicina.
Irradiación
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos, en placas de 12 pocillos o en matraces de 25 cm2 y se irradiaron a la dosis indicada con irradiador de rayos gamma IBL-637 (Cs137, 1 Gy/min, gamma CIS-BioInternational, IBA, Saclay, Francia).
Marcaje con sondas fluorescentes CellTracker™
Tras la eliminación del medio de cultivo, las células HCT116 se incubaron con medio precalentado que contenía 10 pM de diacetato de 5-clorometilfluoresceína (CMFDA, fluorescencia verde) o 5-(y 6)-(((4-clorometil)benzoil)amino)tetrametilrodamina (CMTMR, fluorescencia roja) (Molecular Probes-Life Technologies) durante 45 min a 37°C. Después, las células HCT116 se enjuagaron dos veces con medio precalentado y se incubaron durante 1 hora a 37°C. Las células teñidas se trataron tal como se ha indicado y se cultivaron para el análisis de perfilado de muerte celular.
Perfilado de muerte celular mediante obtención de imágenes de flujo cuantitativas
Las células HCT116 no tratadas se marcaron con CMFDA (fluorescencia verde, CMFDA+) o CMTMR (fluorescencia roja, CMTMR+) y las células HCT116 tratadas con CMFDA (fluorescencia verde, CMFDA+). Se llevaron a cabo las mezclas celulares siguientes: se mezclaron células HCT116 CMTMR+ no tratadas con células HCT116 CMFDA+ no tratadas, o se mezclaron células HCT116 CMTMR+ no tratadas con células HCT116 CMFDA+ tratadas. A continuación, las células se cocultivaron durante 24 horas en presencia o en ausencia del inhibidor farmacológico de ROCK Y27632 (30 pM), el inhibidor pan-caspasa, Z-VAD-fmk (ZVAD, 100 pM), el inhibidor de caspasa-1, Ac-YVAD-cmk (YVAD, 100 pM), el inhibidor de necroptosis, necrostatina-1 (NEC1, 30 pM), el inhibidor de la autofagia inhibidora de H(+)-ATPasa (V-ATPasa) de tipo vacuolar, bafilomicina A1 (BafA1, 50 nM), el inhibidor de Cdk con actividad antimitótica, Roscovitina (Rosco, 10 pM). Tras 24 horas de cocultivo, se recogieron tanto células desprendidas como adherentes y se tiñeron con Hoechst 33345 (10 pg/ml) durante 1 hora a 37°C en medio completo caliente. Para detectar la exposición a fosfatidilserina (PS) y la permeabilidad de la membrana plasmática, las células HCT116 marcadas se incubaron sucesivamente con Biotina-AnexinaV (BD Pharmingen) tal como recomienda el fabricante, 0.5 pg de BV786-estreptavidina (BD Biosciences) y 3 pM de DRAQ7 (BioStatus) durante 15 minutos a 25°C. Tras el lavado con solución de PBS, las muestras se analizaron inmediatamente utilizando un citómetro de flujo de obtención de imágenes FlowSight® (Amnis®, parte de EMD Millipore). Los datos se adquirieron a una ampliación de 20x, utilizando el software INSPIRE. Se utilizaron los láseres de 405 nm, 488 nm y 561 nm para la excitación. Se detectaron las tinciones de campo brillante, anexina V-BV786, DRAQ7, CMFDA, CMTMR y Hoechst 33345 utilizando los canales respectivos, de 20-480 nm, 745-800 nm, 642-745 nm, 480-560 nm, 595-642 nm y 430-505 nm. Se analizaron por lo menos 1000 sucesos de células por muestra. Se prepararon controles de marcaje único adicionales para normalizar las señales fluorescentes en todos los diferentes canales. Los datos adquiridos se analizaron utilizando el software de análisis IDEAS (v6.1, Merck-Millipore). La estrategia de selección fue la siguiente. Se seleccionaron las células enfocadas utilizando la función de gradiente de RMS. Se seleccionaron células individuales utilizando las funciones de relación de aspecto y superficie. Para la detección de canibalismo, las células se seleccionaron para la doble tinción CMFDA+ y CMTMR+.
Citometría de flujo y microscopía confocal fluorescente
Para detectar la exposición a PS, la permeabilidad de la membrana plasmática y la progresión del ciclo celular, las células después del cocultivo se marcaron secuencialmente con sondas fluorescentes específicas (tales como anexinaV conjugada con FITC, yoduro de propidio y Hoechst 33342) y se analizaron mediante citometría de flujo. Se recogieron tanto células desprendidas como adherentes y se tiñeron con Hoechst 33345 (10 pg/ml) durante 1 hora a 37°C en medio completo caliente. Tras el lavado con PBS, las células HCT116 se suspendieron en 1X tampón de unión complementado con anexina V conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (BD Biosciences) y yoduro de propidio (PI, 1 pg/ml) (Sigma) siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación, se analizaron las muestras utilizando el citómetro de flujo LSRII (Becton Dickinson) y el software FlowJo v10. Para la microscopía confocal de fluorescencia, se fijaron las células HCT116 después del cocultivo en paraformaldehído al 3.7%-PBS durante 15 minutos y se contratiñeron con 1 pg/ml de Hoechst 33342 (Invitrogen) durante 15 minutos. A continuación, las células se analizaron con un microscopio SPE confocal dotado de objetivos de inmersión en aceite Apochromat 63* 1.3 NA y 63x 1.15 NA. Se utilizó el software Leica Application Suite (LAS) (Leica Microsystems).
Transferencias western
Se extrajeron las proteínas celulares totales en tampón de lisis (que contenía NP40 al 1%, HEPES 20 mmoles/l, KCl 10 mmoles/l, EDTA 1 mmol/l, glicerol al 10%, y comprimidos de inhibidor de proteasa y fosfatasa). Los extractos de proteínas (30 pg) se hicieron migrar en geles de Bis-Tris NuPAGE® Novex® al 4-12% (Life Technologies) y se transfirieron a 4°C sobre membranas de polivinildifluoruro (PVDF) Immobilon (Thermo Scientific). Tras el bloqueo, las membranas se incubaron a 4°C durante la noche con anticuerpos primarios específicos para: caspasa-3 (n° 9662), caspasa-3 cortada (Asp175) (n° 9661), miosina cadena ligera 2 (MLC2) (n° 3672), fosfo-MLC2 (Ser19) (n° 3675), LC3 A/B (n° 4108), sustrato de p-(S)-CDK (n° 9477) fueron obtenidos de Cell Signaling Technology. Los anticuerpos contra GAPDH (n° MAB374) se adquirieron de Millipore. A continuación, se incubaron anticuerpos antirratón o anticonejo conjugados con peroxidasa de rábano picante (Southern Biotechnology) durante 1 h y se revelaron con el reactivo SuperSignal West Pico® (Thermo Fisher Scientific) o el sistema de detección de transferencia western ECL™ Prime (GE Healthcare) utilizando un generador de imágenes ImageQuant LAS 4000 asistido por software (GE Healthcare).
Análisis estadísticos
Se repitió cada experimento por lo menos tres veces, proporcionando resultados comparables. A menos que se indique lo contrario, las figuras ilustran datos cuantitativos de un experimento representativo (medios ± SEM, n=3). Los datos se analizaron mediante Prism v. 5.03 (software GraphPad, La Jolla, CA, EE.UU.). Se evaluó la significancia estadística mediante pruebas t de Student de dos colas. En todos los experimentos, los valores de p <0.05 se consideraron estadísticamente significativos.
II. Resultados
El análisis de perfilado de muerte celular utilizando la citometría de flujo de obtención de imágenes multiespectrales permite la detección simultánea de modalidades de muerte celular no autónoma y celular autónoma. La capacidad de las células de morir mediante procesos NCA condujo a los presentes inventores a reconsiderar desde un punto de vista conceptual el enfoque metodológico de consideración de los procesos de muerte celular. En efecto, la elección de los parámetros morfológicos y/o bioquímicos que deben considerarse, así como el enfoque tecnológico que debe utilizarse para detectar la muerte celular predefine por adelantado los resultados que deben esperarse y no permite, o permite raramente, la identificación de nuevos procesos letales, tales como el canibalismo celular o la entosis. El campo de la radioterapia asimismo se enfrenta a dicho problema. En efecto, se ha revelado en estudios separados que la irradiación puede inducir muchos procesos letales, tales como apoptosis, muerte celular autofágica, necrosis o muerte mitótica 35, 36 Recientemente se ha mostrado en estudios separados que la irradiación sobre el mismo tipo celular con las mismas dosis podría inducir la apoptosis 37, aunque asimismo la muerte mitótica 38 En estudios anteriores se ha revelado que la aparición de apoptosis y muerte mitótica que se observan muy rápidamente después de la irradiación, no correlacionan con la supervivencia clonógena observada a largo plazo 35 Dichos estudios subrayan la existencia de procesos letales desconocidos que participan en la eliminación de las células irradiadas. Además, el creciente número de publicaciones que revelan la influencia de canibalismo celular y entosis en el control del crecimiento tumoral y en la eliminación de las células metastásicas urge a realizar un seguimiento de este proceso de NCAD.
Considerando la diversidad de estímulos letales que pueden potencialmente iniciar las modalidades de muerte celular tanto no autónoma como autónoma, y la complejidad de las rutas de señalización (que implican (o no) caspasas, catepsinas o granzimas) que controlan ambos procesos, se ha decidido detectar simultáneamente ambas modalidades de muerte celular, no autónoma y autónoma, inducidas por la RI. Con el fin de determinar si después de los insultos letales, una población celular puede experimentar eliminación celular simultáneamente directa y/o espectadora que puede ejecutarse de una manera celular autónoma o celular no autónoma, se diseñó un análisis de perfilado de la muerte celular basado en el cocultivo de células HCT116 que habían sido marcadas con sonda vital fluorescente de diacetato de 5-clorometilfluoresceína (CMFDA, verde) y tratadas con radiación ionizante (rayos y) con células HCT116 isógenas que habían sido marcadas con sonda vital fluorescente 5- (y 6)-(((4-clorometil)benzoil)amino)tetrametilrodamina (CMTMR, rojo). Tras 24 horas de cocultivo, las células CMFDA+ tratadas, las células CMTMR+ no tratadas y la población celular total (células CMFDA+ y células CMTMR+) para exposición a fosfatidilserina (PS), pérdida de la integridad de la membrana plasmática y contenido del ADN para detectar simultáneamente la inducción de muerte celular de tanto células tratadas como células vecinas (no tratadas). Con el fin de caracterizar los mecanismos moleculares implicados en la ejecución de las modalidades de muerte celular detectadas, se llevaron a cabo cocultivos en presencia de moduladores de muerte celular (tales como inhibidor de ROCK1 (Y27632), inhibidor de pan-caspasa (ZVAD-fmk), inhibidor de caspasa-1 (YVAD-fmk), necrostatina (NEC1), bafilomicina A1 (BafA1) y roscovitina (Rosco)), que se conoce respectivamente que inhiben la endocitosis celular (un proceso que inicia la entosis 16, emperiptosis 17 y el canibalismo celular16), el corte proteolítico de caspasa-3 o caspasa-7 (que contribuye a la ejecución de apoptosis 39, muerte mitótica 38, 40 o emperiposis 17) o de la caspasa-1 (que resulta necesaria para la piroptosis 41), la activación de la cinasa RIP1 pronecroptótica (RIPK1), que contribuye a la necroptosis 42, la fusión entre autofagosomas y lisosomas que de esta manera altera la maduración de las vacuolas autofágicas durante la autofagia y muerte celular asociada a autofagia 43) y finalmente, la actividad de la cinasa 1 dependiente de ciclina (Cdkl)-ciclina B y la progresión mediante mitosis que resulta necesaria para muertes asociadas a mitosis, tales como la muerte mitótica 40, 44 La detección simultánea de la exposición a PS, la pérdida de la integridad de la membrana plasmática, el contenido de ADN de parejas celulares combinado con la inhibición farmacológica de moduladores de muerte celular nos permitió detectar durante cocultivos mediante la utilización de citometría de flujo de obtención de imágenes multiespectrales por lo menos 9 modalidades de muerte celular (incluyendo apoptosis, muerte mitótica, piroptosis, muerte celular autofágica, necrosis, entosis, emperitosis y canibalismo celular) de las células diana y de células vecinas (figura 1, A-B), discriminando de esta manera las muertes celulares no autónomas de las muertes celulares autónomas y las eliminaciones celulares directas por efectos letales de tipo espectador. Dicha metodología permitió definir el perfilado de muerte celular inducido por la RI.
El perfilado de muerte celular inducida por radiación ionizante subraya la inducción de la muerte celular en células de cáncer tanto irradiadas como no irradiadas. A pesar de la intensa investigación biológica y farmacéutica realizada para caracterizar mejor los procesos celulares y bioquímicos asociados a los tratamientos anticancerosos, todavía se desconocen cuáles son los mecanismos letales responsables de los efectos terapéuticos de la radioterapia, que es uno de los tratamientos anticancerosos más frecuentemente utilizados clínicamente. Los procesos letales (tales como la apoptosis y la catástrofe mitótica) que se han detectado en respuesta a la radiación ionizante no se han asociado directamente a la eficiencia del tratamiento 35, sugiriendo que modalidades de muerte celular adicionales que todavía se desconocen podrían contribuir a los efectos terapéuticos de la radioterapia. En este contexto se determinó el perfilado de la muerte celular de las células de cáncer irradiadas. Según la metodología anteriormente indicada, se irradiaron o no con 4 grays, células marcadas con CMFDA, se mezclaron tras 24 horas juntas en una proporción 1:1 con células marcadas con CMTMR, y se cultivaron durante 24 horas en presencia de cada uno de los inhibidores indicados (figuras complementarias 1A-1E). A continuación, se determinaron la exposición a PS, la integridad de la membrana y el contenido de ADN de cada pareja celular, respectivamente, utilizando las tinciones anexinaV-BV786, DRAQ7 y Hoechst 33342. A pesar de que no se ha observado ningún incremento significativo de las muertes celulares apoptótica y necrótica (según revela el análisis de las células anexinaV+DRAQ7‘ y DRAQ7+) sobre la población celular vecina (células CMTMR+) (figuras 2A, 2B y 2D) y sobre la población celular de control no tratada (figuras 2A, 2D y 2E), se detectó un incremento significativo de ambos tipos de muerte sobre la población celular total (según revela la consideración de la población celular CMFDA+ y CMTMR+) (figuras 2A-2C) y sobre la población celular irradiada (células CMFDA+) (figuras 2B y 2E) después de 24 horas de cocultivo, demostrando que la presente metodología permite detectar las modalidades de muerte celular de células tanto no irradiadas como irradiadas. Asimismo se observó que el inhibidor de pan-caspasa Z-VAD-fmk y el inhibidor farmacológico dependiente de ciclina, roscovitina (Rosco), inhibía la exposición de PS sobre la membrana plasmática externa de células CMFDA+ irradiadas (figura 2E), confirmando, tal como se ha publicado anteriormente 45, 46, que las células CMFDA+ irradiadas requieren tanto la activación de caspasa como la progresión a través de la mitosis para morir. Además, el deterioro del flujo autofágico con bafilomicina A1 (BafA1) incrementó la frecuencia de células moribundas (células anexinaV+DRAQ7‘ y DRAQ7+) en la población celular total (células CMFDA+ y CMTMR+) (figura 2C), en células CMTMR+ no irradiadas (figura 2D) y en células CMFDA+ irradiadas (figura 2E), revelando de esta manera que la autofagia es un mecanismo celular de supervivencia inducido por radiación ionizante que contribuye al rescate de la muerte tanto de células no irradiadas como de células irradiadas. Además, el análisis simultáneo de la progresión de células tratadas y no tratadas durante sus ciclos celulares mostró que las inducciones de muerte celular estaban asociadas al escape de las células CMFDA+ irradiadas de la parada en G1 y condujo a su acumulación en las fases S y G2/M (figuras 2F, 2G y 2J). No se detectó ninguna alteración del ciclo celular sobre las poblaciones celulares total o CMTMR+, subrayando que las alteraciones del ciclo celular solo se detectan sobre las células irradiadas (figuras 2F, 2G y 2I). Estos resultados, que asimismo se confirmaron mediante análisis clásico de citometría de flujo (figuras complementarias 2A-2B), demostraron que después de la radiación ionizante, las células de cáncer tanto irradiadas como no irradiadas experimentan muerte celular dependiente de caspasa-1. Globalmente estos resultados subrayan la capacidad de los agentes anticancerosos de eliminar simultáneamente las células de cáncer mediante eliminación celular directa y efectos de tipo espectador.
El perfilado de la muerte celular inducida por radiación ionizante reveló además la inducción de modalidades de muerte celular no autónoma. En paralelo, en el mismo cocultivo se determinó la capacidad de las células CMFDA+ irradiadas de endocitar o de invadir células vecinas, dos procesos celulares requeridos para la inducción de muertes celulares asociadas a canibalismo celular (tal como canibalismo celular, emperitosis o fagoptosis) o muertes celulares inducidas por invasión de células-en-célula (tal como entosis). El análisis de citometría de flujo de obtención de imágenes multiespectrales reveló que las células CMFDA+ irradiadas con rayos gamma indujeron la endocitosis de células vecinas (tal como revela la internalización de las células CMTMR+ "diana" por las células CMFDA+ irradiadas con rayos gamma (figuras 3A y 3B)). Este proceso, que no resultó afectado por el inhibidor de pan-caspasa Z-VAD-fmk, resulta reprimido por el inhibidor de ROCK1 (Y27632) (figura 3B), revelando de esta manera que la internalización de célula-en-célula detectada es diferente de la incorporación fagocítica de las células apoptóticas y que requiere actividad de ROCK1 para producirse. Asimismo se confirmó la actividad caníbal de las células irradiadas con rayos gamma mediante microscopía confocal (figuras 3D-3F). Resulta interesante que el análisis de perfilado de muerte celular asimismo permitió distinguir entre la endocitosis de células vivas y la fagocitosis de células CMFDA+ apoptóticas por células CMTMR+ vivas que es consecuencia de la inducción de apoptosis por el tratamiento con bafilomicina A1 (figura 3B). A continuación, se evaluaron los destinos celulares de las células CMTMR+ endocitadas y células CMFDA+ agentes de endocitosis irradiadas. Se observó que prácticamente la totalidad de las células CMTMR+ endocitadas mostraban signos de degradación celular (según revela la pérdida de contenido de ADN de las células internalizadas detectado mediante citometría de flujo de obtención de imágenes multiespectrales (figura 3A) y la microscopía confocal (figuras 3D y 3E)). Dicho proceso se vio significativamente reducido en presencia del inhibidor de pan-caspasa Z-VAD-fmk y el inhibidor de caspasa-1 YVAD-fmk, revelando que la muerte mediada por IR de las células endocitadas requiere caspasas para producirse y puede ejecutarse mediante apoptosis dependiente de caspasa-1, que asimismo se conoce como piroptosis. Además, se reveló además que el 90% de las células caníbales no exponía PS o mostraba pérdida de integridad de su membrana plasmática (figura complementaria 2C), subrayando que tras la endocitosis celular mediada por RI, las células internalizadas se precipitan a morir sin modular la viabilidad de las células caníbales. Globalmente estos resultados demuestran que la radiación ionizante elimina simultáneamente las células de cáncer mediante los efectos combinados de eliminación celular directa, efecto letal de tipo espectador y muerte celular asociada a canibalismo celular. Estos resultados subrayan la necesidad urgente de medir simultáneamente la inducción de subrutinas de muerte celular no autónoma y autónoma durante los procesos letales.
El cribado de bibliotecas químicas conduce a la identificación de amplificadores de canibalismo celular mediado por RI. A continuación, se desarrolló el cribado de una biblioteca de compuestos químicos a fin de identificar los compuestos capaces de inducir canibalismo celular mediado por RI. De esta manera, se tiñeron células HCT116 que habían sido tratadas con una dosis de radiación de 8 Gray con rastreador de células CMTMR naranja o rastreador de células CMFDA verde y se cultivaron en presencia de 10 pM de compuestos químicos. Tras 24 horas de cultivo, las células se habían teñido con pigmento nuclear (5 pg/ml de Hoechst 33342 durante 1 h a 37°C) y se analizaron utilizando el citómetro de flujo de obtención de imágenes FlowSight® para canibalismo celular. Se clasificó cada uno de dichos compuestos según su puntuación Z 47 y se identificaron, respectivamente, 13 y 11 compuestos candidatos (figuras 4A, 4B, 4F y 4G). A continuación, se validaron los compuestos identificados mediante combinación de enfoques de citometría de flujo (con el fin de eliminar compuestos citotóxicos mediante monitorización simultánea de la despolarización de la membrana mitocondrial interna y la permeabilidad de la membrana plasmática de las células tratadas) con enfoques de microscopía confocal (para confirmar la modulación del canibalismo celular inducido por IR por compuestos candidatos) (figuras 4C-E y 4H-J). Tras completar tres experimentos independientes, se eliminaron los compuestos químicos sin ningún efecto (tales como fenbendazol o carbimazol) o que mostraban elevada citotoxicidad (tales como RN-1-183). Finalmente, se identificaron 16 compuestos químicos que eran capaces de amplificar la capacidad de la IR de inducir canibalismo celular (figuras 4E y 4J, tablas 1 y 2).
La combinación de IRCCE e IR induce una inmunidad antitumoral eficiente. Considerando la identificación de inductores inmunógenos de muerte celular (ICD) (tales como digoxina, digitoxina, lanatósido C o hidrocloruro de doxorrubicina)3, 4, 48'51) como IRCCE, se evaluó la capacidad de dichos compuestos de inducir una inmunidad antitumoral tras la radioterapia. En primer lugar, se desarrollaron enfoques preclínicos para estudiar los efectos inmunitarios de IRCCE sobre dos modelos de ratón de carcinoma (carcinoma de colon CT26 y fibrosarcoma MCA205). Inicialmente, se apreció la capacidad de la combinación de IRCCE+IR de inducir una respuesta inmunitaria antitumoral específica mediante la utilización de ratones inmunocompetentes mediante ensayos de vacunación antitumoral. De acuerdo con estudios anteriormente publicados 52, la inyección de células de cáncer que sucumben a una muerte celular inmunógena (MCI) en ratones inmunocompetentes debe inducir una respuesta inmunitaria protectora que es específica para los antígenos tumorales. De esta manera, en primer lugar, se trataron 3x105 células MCA205 con 10 pM de SG6163F durante 24 horas. A continuación, las células tratadas se inocularon por vía subcutánea en 200 pl de PBS en el flanco inferior de ratones C57BL/6 hembra de 8 semanas de edad. Una semana después, se inocularon 3x104 células de control no tratadas en el flanco contralateral de los ratones. Los tumores se evaluaron semanalmente utilizando un calibrador común. Los animales portadores de tumores que excedían 20% a 25% de la masa corporal fueron eutanasiados. Se observó que los ratones tratados con IR o SG6163F solo no eran capaces de inducir un incremento significativo de muertes celular in vitro (figura 5A). De hecho, no mostraban una respuesta protectora después de la inoculación de células no tratadas, revelando que la dosis de radiación y la concentración de SG6163F no resultan suficientes para estimular una respuesta inmunitaria anticancerosa (figura 5B). Estos resultados son consistentes con los resultados anteriormente publicados que demuestran que sólo se detecta una respuesta protectora cuando las células de cáncer se exponen a tratamiento anticanceroso citotóxico in vitro hasta que el 70% de las células exponen fosfatidilserina en la cara externa de la membrana plasmática 48 Inesperadamente se observó que el tratamiento combinado de células MCA205 con 8 Gy de IR y 10 pM de SG6163F indujo una respuesta protectora en 3 de 5 ratones que habían sido inyectados (figura 5B). Estos resultados revelan por primera vez que la combinación de IRCCE+IR puede inducir una respuesta inmunitaria anticancerosa mediada por IR en ausencia de un incremento significativo de muerte de células tratadas e irradiadas (figura 5A), sugiriendo que el canibalismo celular o las rutas de señalización asociadas a canibalismo celular podría contribuir a la inducción de inmunogenicidad tumoral. A continuación, se irradiaron 3x106 células CT26 con 8 Gy en presencia de 10 pM de SG6163F (figuras 5E y 5F), VP331 (figuras 5I y 5J), dihidrocloruro de minaprina (figuras 5M y 5N) o LOPA87 (figuras 5Q y 5R) durante 24 horas. A continuación, las células se inocularon tal como se ha indicado anteriormente por vía subcutánea en 200 pl de PBS en el flanco inferior de ratones BALB/c hembra de 8 semanas de edad. Una semana después, se inocularon 5x105 células de control no tratadas en el flanco contralateral de los ratones y se evaluaron los tumores semanalmente utilizando un calibrador común. Tal como se ha indicado anteriormente, los animales portadores de tumores que excedían 20% a 25% de la masa corporal fueron eutanasiados. El porcentaje de células moribundas en cada condición se evaluó mediante la determinación de la tinción DiOC(6)3/lP (figuras 5E, 5I, 5M y 5Q). Finalmente, se observó la capacidad de dichos compuestos de reprimir el crecimiento de las células de cáncer que habían sido inyectadas 7 días después de la inyección de células de cáncer irradiadas y tratadas. Se observó un incremento significativo de la frecuencia de ratones que mostraban una respuesta protectora después de la inyección de las células de cáncer que habían sido tratadas con IR y compuestos químicos (figuras 5H, 5L, 5P y 5T).
Se llevó a cabo un segundo ensayo de vacunación antitumoral en modelos de ratón CT26 de carcinoma, tal como se ha indicado anteriormente. Brevemente, se irradiaron células CT26 con 8 Gy en presencia de 10 pM de VP331 (figuras 6A, 6F y 6K), dihidrocloruro de minaprina (figuras 6B, 6G y 6L), LOPA87 (figuras 6C, 6H y 6M), SG6163F (figuras 6D, 6I y 6N) o azaguanina-8 (8-aza) (figuras 6E, 6J y 6O) durante 24 horas. A continuación, las células se inocularon tal como se ha indicado anteriormente en ratones BALB/c inmunocompetentes. Finalmente, se observó la capacidad de dichos compuestos de reprimir el crecimiento de las células de cáncer que habían sido inyectadas 7 días después de la inyección de células de cáncer irradiadas y tratadas. Se confirmaron los resultados anteriores. Se observaron incrementos significativos de la frecuencia de ratones que mostraban una respuesta protectora después de la inyección de células de cáncer que habían sido tratadas con IR y compuestos químicos (figuras 6P y 6Q). Resulta interesante que el dihidrocloruro de minaprina (figuras 6B, 6G, 6L, 6P y 6Q) y la azaguanina-8 (figuras 6E, 6J, 6O, 6P y 6Q) por sí solos indujeron un incremento de la respuesta protectora tras la inyección de células de cáncer.
Globalmente, estos resultados revelan la capacidad de los compuestos químicos identificados con la presente plataforma de inducir una respuesta inmunitaria anticancerosa protectora.
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Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Método in vitro de identificación de un compuesto que puede potenciar un tratamiento de radioterapia en un sujeto, comprendiendo dicho método las etapas de:
(a) añadir un compuesto candidato a un cultivo de células tumorales,
(b) tratar dicho cultivo de células tumorales con una dosis de radiación de 1 a 20 Gray,
(c) medir el canibalismo celular mediado por irradiación (IR) que se produce en dicho cultivo celular, en el que un compuesto que amplifica el canibalismo celular mediado por IR en comparación con los niveles de control será capaz de potenciar un tratamiento de radioterapia.
2. Utilización in vitro de los compuestos destacados en las tablas 1 y 2 y análogos de los mismos seleccionados de entre el grupo que consiste en: LOPA90, LOPA93, LOPA 94, LOpA 101, LOPA104, LOPA105 y LOPA106, SG6144, SG6146 y SG6149, para amplificar el canibalismo celular mediado por IR en células cancerosas.
3. Compuestos divulgados en las tablas 1 y 2 o sus análogos seleccionados de entre el grupo que consiste en: LOPA90, LOPA93, LOPA 94, LOPA 101, LOPA104, LOPA105 y LOPA106, SG6144, SG6146 y SG6149, o cualquier composición farmacéutica que contiene los mismos, para la utilización en amplificar el canibalismo celular mediado por IR en pacientes que sufren de cáncer.
4. Compuesto para la utilización según la reivindicación 3, para amplificar la inmunogenicidad tumoral en sujetos que recibirán o que han recibido un tratamiento de radioterapia.
5. Compuesto para la utilización según la reivindicación 3 o 4, para inducir una respuesta inmunitaria anticancerosa protectora significativa en sujetos que recibirán o que han recibido un tratamiento de radioterapia.
6. Compuesto para la utilización según las reivindicaciones 3 a 5, en el que se selecciona de entre el grupo que consiste en: sal 1,5-naftaleno disulfonato de mebhidrolina, flurbiprofeno, dihidrocloruro de minaprina, miricetina, digoxina, digitoxina, lanatósido, LOPA87, VP331, RN-1-026, SG6163F, VP450 y VP43.
7. Compuesto para la utilización según las reivindicaciones 3 a 5, en el que se selecciona de entre el grupo que consiste en: dihidrocloruro de minaprina, LOPA87, VP331 y SG6163F.
8. Compuesto para la utilización según las reivindicaciones 3 a 7, en el que dicho sujeto o paciente sufre de cáncer cerebral, cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pancreático, cáncer pulmonar no microcítico, cáncer pulmonar microcítico, cáncer de próstata, cáncer de colon, linfoma no hodgkiniano, sarcoma, cáncer testicular, leucemia no linfocítica aguda o cáncer de mama.
9. Compuesto para la utilización según las reivindicaciones 3 a 8, en el que se administra antes de un tratamiento de radioterapia, preferentemente 24 horas antes del tratamiento de radioterapia.
10. Compuesto para la utilización según las reivindicaciones 3 a 8, en el que se administra después de un tratamiento de radioterapia.
11. Compuesto para la utilización según las reivindicaciones 3 a 8, en el que se administra de manera concomitante a un tratamiento de radioterapia.
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