ES2906406T3 - Minaprina para la utilización en la reducción del crecimiento tumoral - Google Patents

Abstract

Dihidrocloruro de minaprina para la utilización en la prevención o el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita, en el que dicho fármaco no se combina con un tratamiento de radioterapia.

Description

DESCRIPCIÓN

Minaprina para la utilización en la reducción del crecimiento tumoral

Sumario

La presente invención se refiere al dihidrocloruro de minaprina para la utilización en la prevención o el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite.

Antecedentes de la técnica

La radioterapia es una de las estrategias antitumorales más comunes utilizadas en los tratamientos del cáncer. Más de la mitad de los pacientes con cáncer se tratan con radioterapia. El uso de radioterapia (sola o en combinación con cirugía y quimioterapia) es fundamental para el manejo de los tumores de cáncer de cabeza y cuello, de mama, de pulmón, de próstata, digestivo, y de cuello uterino1. La exposición a radiaciones ionizantes (IR) de los tejidos tumorales desencadena diversos procesos letales tales como la apoptosis, la muerte celular autofágica, la catástrofe mitótica, o la senescencia. Estos mecanismos contribuyen a la destrucción de las células cancerosas en los tejidos irradiados, pero asimismo pueden inducir la inmunogenicidad de las células tumorales irradiadas 23, modificar el microambiente tumoral y permitir el desarrollo de una respuesta inmunitaria antitumoral que implica la liberación de señales de peligro (trifosfato de adenosina y proteína HMGB1) 45, la activación de receptores purinérgicos (especialmente P2X7 y P2Y2) 4, el receptor TLR423 y el inflamasoma NLRP34 La relación entre la respuesta local del tumor y la estimulación del sistema inmunitario se ilustra al describir un efecto remoto sobre las células cancerosas no irradiadas. Este efecto paradójico, asimismo conocido como efecto abscopal, se ha estudiado durante muchos años en diferentes modelos de tumores murinos así como en pacientes 6-9 Su detección correlaciona positivamente con la presencia de una alta cantidad de citocinas proinflamatorias (tal como TNF alfa), de células T productoras de interferón (IFN) gamma, y requiere el desarrollo de una respuesta inmunológica eficaz para poder observarse 1011. Este efecto asimismo se observa en pacientes tratados con radioterapia en combinación con agentes inmunomoduladores (tal como ipilimumab o interleucina-2). La descripción del efecto abscopal refuerza las descripciones recientes en muchos modelos animales de una importante contribución de diversos componentes del sistema inmunitario a la respuesta a la radioterapia. El papel central de las células inmunitarias (incluyendo los macrófagos asociados a tumores, las células linfoides T, y las células dendríticas) se ha estudiado recientemente y se ha destacado por la influencia de su modulación terapéutica con moduladores de los puntos de control inmunológicos (tal como el uso de anticuerpos monoclonales frente a CTLA4 o PD1) o la activación de macrófagos (con anticuerpos monoclonales dirigidos contra CSF1R). A pesar del papel central de la radioterapia en el arsenal terapéutico antitumoral, los procesos biológicos implicados en la eliminación de las células tumorales todavía están parcialmente definidos y son controvertidos. Los primeros estudios sobre la muerte de células tumorales inducida por radio son relativamente antiguos, y ocurrieron antes del descubrimiento reciente de nuevos procesos de muerte celular, así como del papel central del sistema inmunitario en la eliminación de células tumorales tras la irradiación.

Los avances científicos y tecnológicos en años recientes revelaron la existencia de diversos procesos de muerte celular. Se ha propuesto una clasificación de las modalidades de muerte celular basada principalmente en criterios morfológicos y funcionales 13, y se subdividieron los procesos letales en tres tipos distintos: muerte celular de tipo I (asimismo conocida como apoptosis), muerte celular de tipo II (o autofagia), y muerte celular de tipo III (o necrosis). Inicialmente organizada sobre la aparente distinción entre las modalidades de muerte celular de tipo I y III, entre procesos que están regulados o inducidos accidentalmente, o distinguiendo las muertes celulares que están asociadas con la inducción de una respuesta inflamatoria testigo in vivo con procesos letales que se pensaba que eran silenciosos o tolerogénicos, esta clasificación que todavía denominó mal la muerte celular de tipo II como autofagia (que es principalmente un mecanismo de supervivencia intracelular requerido para el mantenimiento de la homeostasis celular) no reflejaba la aptitud de las muertes necróticas para ser controladas genéticamente o inmunógenas, tal como reveló la reciente caracterización molecular de la necroptosis 1415. Además, las subrutinas de muerte celular que no revelaron o revelaron parcialmente estas modificaciones morfológicas, metabólicas y bioquímicas estereotipadas (tales como la muerte mitótica y la cornificación) se han estudiado menos, y se agruparon en un subgrupo mal definido de modalidades de muerte celular, asimismo conocido como subgrupo de muerte celular atípica 13

En años recientes, se han descrito varios mecanismos de muerte celular nuevos (tal como la entosis o la emperitosis) y se han asociado a este subgrupo desatendido de modalidades de muerte celular 16, 17 La caracterización de estas modalidades de muerte atípicas destacó la existencia de procesos de muerte celular que no se logran como las modalidades típicas de muerte celular, de una manera autónoma de la célula, sino que se desencadenan después de la engullición de las células vivas por las células vecinas. Durante décadas, se han observado y estudiado de forma episódica muertes no autónomas de la célula (NCAD). Inicialmente referidos como fagoptosis 18, 19 o emperipolesis 20, estos procesos se han implicado en el control de la homeostasis de eritrocitos, neutrófilos, plaquetas o células T 18, 21,22, y de este modo, se han propuesto como las principales formas fisiológicas de muerte celular en el cuerpo 18 Detectadas como estructuras de célula en célula, las NCAD asimismo se han observado durante el cultivo ex vivo de células primarias 23 o durante análisis histológicos de procesos fisiológicos (tales como la implantación de embriones 24 y el agotamiento intrahepático de células T autorreactivas 25) o enfermedades humanas (incluyendo cáncer 23, síndromes inflamatorios 23, durante enfermedades infecciosas 26, 27). Principalmente detectadas tras interacciones homotípicas entre células malignas en tumores humanos (incluyendo carcinomas o melanomas de mama, cuello uterino y colon), las NCAD asimismo se detectan después de interacciones heterotípicas entre células tumorales y células del estroma 28, células tumorales y efectores inmunitarios (tales como linfocitos 29 y células NK 30), pero asimismo pueden observarse después de interacciones entre efectores inmunitarios y células epiteliales (tal como lo revela la destrucción de las células T en las células nodriza del timo 31 o células T autorreactivas en el hígado 25). Recientemente, la NCAD asimismo se asoció con enfermedades infecciosas. La engullición de células infectadas por el virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) o por el virus de Epstein barr (EBV) por células no infectadas se ha detectado durante el cocultivo in vitro, y la degradación de las células infectadas internalizadas se ha propuesto como la primera etapa de un nuevo modo célula a célula de transmisión viral entre células infectadas y células hospedantes 26, 27, lo que subraya la capacidad de las NCAD para contribuir asimismo a la patogénesis microbiana.

La primera etapa de los programas de muerte no autónoma de la célula comienza con la interacción de dos socios celulares a través de receptores de adhesión a la membrana (tales como las cadherinas E o P) o receptores de estrés (tal como la proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas), y es seguida por la formación de uniones adherentes entre células que interactúan que activan las rutas de señalización en ambas células que interactúan, y pueden implicar pequeñas GTPasas (tales como Rho 32 y Cdc4233) y ROCK cinasas 16 Después, se demostró que la modulación de la contractibilidad de la actomiosina y la reorganización del citoesqueleto de actina a nivel de las células “diana” favorecían su invasión en las células hospedantes 32, 34 Este proceso es distinto del canibalismo celular, que asimismo puede desencadenar las NCAD a través de la activación de rutas de señalización específicas (tales como rutas de señalización relacionadas con la fagocitosis que implican el ciclo 42 de división celular de remodelación del citoesqueleto (CDC42), el ligando 1 de quimiocina (motivo C-X-C) (CXCL1) o el ligando 6 de quimiocina (motivo C-X-C) (CXCL6)) en células hospedantes y conduce a una engullición activa de las células diana 33 Una vez internalizadas, las células engullidas pueden ser atacadas por enzimas lisosomales “hospedante” (tales como catepsinas y granzimas), y se pueden eliminar mediante distintos mecanismos letales que pueden implicar varios moduladores de las muertes celulares típicas (tales como el citocromo c, las caspasas o las proteínas relacionadas con la autofagia (ATG)). La entosis, una muerte no autónoma de la célula, descrita inicialmente después de interacciones homotípicas entre células de cáncer de mama, es un mecanismo de invasión de célula en célula que no requiere la activación de caspasas para eliminar las células engullidas 16 A la inversa, la engullición del asesino natural (NK) por las células tumorales inicia la emperitosis, una muerte programada de célula en célula que requiere la activación de la caspasa 3 y la fragmentación del ADN 30, revelando que las células engullidas pueden eliminarse mediante procesos dependientes de caspasa o independientes de caspasa.

A pesar de la exhaustiva investigación biológica y farmacéutica implementada para caracterizar mejor los procesos celulares y bioquímicos asociados con los tratamientos contra el cáncer, aún se desconocen los mecanismos letales responsables de los efectos terapéuticos de la radioterapia, que es uno de los tratamientos contra el cáncer más frecuentes utilizados en la clínica. Los procesos letales (tales como la apoptosis y la catástrofe mitótica) que se han detectado en respuesta a la radiación ionizante no estaban directamente implicados en la eficacia del tratamiento 35, lo que sugiere que las modalidades adicionales de muerte celular que aún se desconocen pueden contribuir a los efectos terapéuticos de la radioterapia.

En este contexto, siempre existe la necesidad de identificar nuevos tratamientos para reducir el crecimiento tumoral en pacientes que padecen cáncer. El documento US2015/185202 describe compuestos para tratar el cáncer induciendo el canibalismo celular.

Descripción

La presente invención se expone en el juego de reivindicaciones adjunto.

La presente invención se refiere a dihidrocloruro de minaprina para la utilización en la prevención o el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite, en el que dicho fármaco no se combina con un tratamiento de radioterapia.

En una forma de realización particular, dicho sujeto padece cáncer de cerebro, cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de próstata, cáncer de colon, linfoma no de Hodgkin, sarcoma, cáncer de testículo, leucemia aguda no linfocítica, o cáncer de mama.

En una forma de realización particular, dicho dihidrocloruro de minaprina se encuentra en forma de composición farmacéutica inyectable.

En una forma de realización particular, dicho dihidrocloruro de minaprina está en forma de una composición farmacéutica inyectable que se administra por vía sistémica o intratumoral.

La administración in vivo de dihidrocloruro de minaprina o de la composición de la invención que contiene dihidrocloruro de minaprina está destinada a reducir el crecimiento tumoral en sujetos que padecen cáncer. El dihidrocloruro de minaprina se puede administrar a los pacientes en una composición farmacéutica que contiene además adyuvantes farmacéuticamente aceptables. La “composición farmacéutica de la invención” (siempre para la utilización según la reivindicación 1) contiene por lo tanto una cantidad eficaz de por lo menos uno del compuesto de la invención (dihidrocloruro de minaprina), y adyuvantes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de adyuvantes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Otros adyuvantes farmacéuticamente aceptables incluyen disoluciones acuosas y excipientes no tóxicos que incluyen sales, conservantes, amortiguadores, y similares. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de líquidos y nutrientes. Las composiciones asimismo pueden incluir conservantes tales como agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, y gases inertes. El pH y la concentración exacta de los diversos componentes de la composición farmacéutica se pueden ajustar según parámetros bien conocidos.

Análogos de dihidrocloruro de minaprina: (divulgación)

Los análogos de dihidrocloruro de minaprina son 3-aminoalquilamino-4-alquil-6-aril-piridazinas de la fórmula:

en la que:

R1 es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo inferior;

R2 es un grupo arilo o arilo sustituido;

n es 2 o 3; y

Y y Z pueden ser grupos alquilo inferior iguales o diferentes, o

Z

/

— N

\ Y

es un radical heterocíclico, en el que Z e Y son grupos alquileno inferior ciclados para formar un anillo que contiene un átomo de oxígeno unido entre los grupos alquileno y el átomo de nitrógeno unido al extremo opuesto de cada grupo alquileno. En la fórmula (I), los grupos alquilo inferior pueden contener adecuadamente de 1 a 3 átomos de carbono, y los grupos alquileno inferior, 2 carbonos cada uno; y cuando R1 es un grupo alquilo inferior, preferentemente es un grupo metilo. El grupo R2 puede ser un grupo fenilo, fenilo sustituido, o naftilo. Cuando z

/

— N

\ Y

es un radical heterocíclico, puede ser adecuadamente un grupo morfolino, piperidino, o pirrolidino. Los análogos asimismo incluyen las sales de adición de ácido de los compuestos de fórmula (I) formadas por reacción de la base con un ácido orgánico o inorgánico adecuado, tal como ácido tartárico o ácido clorhídrico, por nombrar dos ácidos representativos bien conocidos de este grupo. Otros inhibidores de la monoamina oxidasa A son análogos del hidrocloruro de minaprina. Son, por ejemplo, moclobemida o toloxatona. Los IMAO no selectivos son: isocarboxazida, nialamida, fenelzina, tranilcipromina, iproniazida, o iproclozida.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención que contienen dihidrocloruro de minaprina se pueden administrar en forma de composiciones inyectables (por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, e intraarticular), ya sea como disoluciones o suspensiones líquidas; asimismo se pueden preparar formas sólidas adecuadas para disolución o suspensión en líquido antes de la inyección. Estas preparaciones asimismo se pueden emulsionar.

Dichas composiciones farmacéuticas asimismo pueden administrarse por otras vías tales como por vía oral, nasal, rectal, tópica, intratumoral, intravenosa, intramuscular, subcutánea, sublingual, intratecal, intraperitoneal, intraarticular, o intradérmica. Preferentemente, la vía de administración es intravenosa, intraarterial, u oral. Preferentemente, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intravenosa o intraarterial. Más preferentemente, se administran por vía intratumoral.

En formas de realización específicas, cuando la composición de la presente invención es para administración oral, la composición de la invención está en un comprimido, una disolución, o cápsula tal como, por ejemplo, una cápsula de gel blanda. En otras formas de realización específicas, cuando la composición de la presente invención es para administración oral, tiene un recubrimiento entérico. En otras formas de realización específicas, cuando la composición de la presente invención es para administración oral, es un jarabe a base de aceite.

En una forma de realización particular, los compuestos de la invención se administran en una formulación de liberación lenta.

Las composiciones de la presente invención se administran en cantidades y frecuencias suficientes para tratar el cáncer. El progreso de un sujeto se puede determinar midiendo y observando cambios en la concentración de marcadores de cáncer; midiendo el tamaño real del tumor a lo largo del tiempo, y/o determinando cualquier otro marcador clínico relevante que sea bien conocido en la técnica. La determinación, medida y evaluación de tales características y marcadores asociados con el progreso clínico son bien conocidas por los expertos ordinarios en la materia.

Como se muestra en las figuras 6 y 7, los presentes inventores observaron que la administración de dihidrocloruro de minaprina solo tiene efectos protectores intrínsecos contra el desarrollo de tumores. En consecuencia, el dihidrocloruro de minaprina no necesita combinarse con un tratamiento de radioterapia; es eficaz por sí solo. Este es un resultado muy sorprendente, ya que el dihidrocloruro de minaprina se conoce como un fármaco antidepresivo, y nunca se ha informado de ningún efecto antitumoral para este fármaco.

Por lo tanto, la presente invención se refiere al dihidrocloruro de minaprina, o cualquier composición farmacéutica que lo contenga,

• para su utilización en el tratamiento de pacientes que padecen cáncer,

• para su utilización para inducir una respuesta inmunitaria protectora significativa contra el cáncer en pacientes con cáncer.

Asimismo describe la utilización de dihidrocloruro de minaprina para preparar un medicamento destinado a prevenir o tratar el cáncer en un sujeto que lo necesite.

En la invención, el dihidrocloruro de minaprina no se usa en combinación con el tratamiento de radioterapia (esté o no presente un tercer tipo de tratamiento contra el cáncer). El dihidrocloruro de minaprina se puede utilizar en combinación con uno o más tratamientos contra el cáncer distintos de la radioterapia (por ejemplo, quimioterapia y/o inmunoterapia), siempre que no se utilice radioterapia. Sin embargo, en una forma de realización, el dihidrocloruro de minaprina no se usa en combinación con ningún otro tratamiento contra el cáncer, y de este modo es el único compuesto con eficacia contra el cáncer administrado al paciente que padece cáncer.

Las dosis eficaces de dihidrocloruro de minaprina que se pueden administrar con seguridad a seres humanos cuando se administra por vía oral están comprendidas entre: 50 mg y 500 mg por día, preferentemente entre 100 mg y 400 mg por día, más preferentemente de aproximadamente 200 mg por día.

Las dosis eficaces de dihidrocloruro de minaprina que se pueden administrar con seguridad a seres humanos cuando se administra por vía intratumoral están comprendidas entre: 0,3 mg/kg y 30 mg/kg.

Definiciones

La expresión “terapia de irradiación” se usa comúnmente en la técnica para referirse a múltiples tipos de terapia de radiación, incluyendo la terapia de radiación interna y externa, la radioinmunoterapia, y el uso de diversos tipos de radiación, incluyendo rayos X, rayos gamma, partículas alfa, partículas beta, fotones, electrones, neutrones, radioisótopos, y otras formas de radiación ionizante. Como se usa en la presente memoria, los términos “terapia de irradiación”, “terapia de radiación”, “radioterapia”, “radiación” e “irradiación” incluyen todos estos tipos de terapia de radiación, a menos que se especifique lo contrario. Existen diferentes tipos de equipos de radioterapia, que funcionan de formas ligeramente diferentes. El número y la duración de las sesiones de radioterapia dependen del tipo de cáncer y de la ubicación en el cuerpo. Un cáncer de piel superficial puede necesitar solo algunos tratamientos cortos, mientras que un cáncer más profundo en el cuerpo puede necesitar un tratamiento más prolongado.

Las expresiones “suprimir el crecimiento tumoral”, “tratar el crecimiento tumoral”, y “tratar el cáncer”, y similares, se refieren a reducir la tasa de crecimiento de un tumor, detener el crecimiento del tumor por completo, causar una regresión en el tamaño de un tumor existente, erradicar un tumor existente, y/o prevenir la aparición de tumores adicionales tras el tratamiento con las composiciones, kits o métodos de la presente divulgación. “Suprimir” el crecimiento de células tumorales significa cualquiera o todos los siguientes estados: ralentizar, retrasar, y detener el crecimiento del tumor, así como la contracción del tumor. “Retrasar el desarrollo” de un tumor significa aplazar, obstaculizar, ralentizar, retrasar, estabilizar, y/o posponer el desarrollo de la enfermedad. Este retraso puede ser de diferentes períodos de tiempo, dependiendo de la historia de la enfermedad y/o del individuo que está siendo tratado. El crecimiento de las células tumorales se puede evaluar por cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, medir el tamaño del tumor, determinar si las células tumorales están proliferando usando un ensayo de incorporación de 3H-timidina, o contar las células tumorales.

Como se usa en la presente memoria, “sinergia” o “efecto sinérgico”, cuando se hace referencia a la administración combinada de un compuesto de la presente divulgación junto con radiación, significa que el efecto de la combinación es más que aditivo en comparación con la administración del compuesto o compuestos y la radiación solos.

“Potenciar” significa, en el contexto de esta solicitud, mejorar o aumentar el efecto de, por ejemplo, un tratamiento de radioterapia, o promover o fortalecer, por ejemplo, una acción o efecto bioquímico o fisiológico.

“Cantidad eficaz” se refiere a una cantidad de un compuesto como se describe en la presente memoria que puede ser terapéuticamente eficaz para tratar un cáncer asociado con la presente divulgación. La cantidad precisa de estos compuestos requerida variará con los compuestos o derivados particulares utilizados, la edad y el estado del sujeto que se debe tratar, y la naturaleza y gravedad de la afección. Sin embargo, la cantidad eficaz puede ser determinada por un experto ordinario en la materia con solo experimentación de rutina. Una cantidad eficaz de radiación puede ser determinada por un experto ordinario en la materia sin experimentación excesiva. Los parámetros de radiación, tales como la cantidad y frecuencia de dosificación, son bien conocidos en la técnica.

“Farmacéuticamente aceptable” se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones, y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del juicio médico sólido, son adecuados para el contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica, u otras complicaciones problemáticas acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.

“Sales farmacéuticamente aceptables” se refiere a derivados de los compuestos descritos, en los que el compuesto original se modifica obteniendo sales de ácidos o de bases del mismo. Los compuestos de la presente divulgación forman sales de adición de ácidos y bases con una amplia variedad de ácidos y bases orgánicos e inorgánicos, e incluyen las sales fisiológicamente aceptables que se utilizan a menudo en química farmacéutica. Tales sales asimismo forman parte de la presente divulgación. Los ácidos inorgánicos típicos usados para formar tales sales incluyen clorhídrico, bromhídrico, yodhídrico, nítrico, sulfúrico, fosfórico, hipofosfórico, y similares. Asimismo se pueden usar sales derivadas de ácidos orgánicos, tales como ácidos mono- y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos e hidroxialcanodioicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos, alifáticos y aromáticos. Tales sales farmacéuticamente aceptables incluyen así acetato, fenilacetato, trifluoroacetato, acrilato, ascorbato, benzoato, clorobenzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, metilbenzoato, o-acetoxibenzoato, naftaleno-2-benzoato, bromuro, isobutirato, fenilbutirato, p-hidroxibutirato, butino-1,4-dioato, hexino-1,4-dioato, caprato, caprilato, cloruro, cinamato, citrato, formiato, fumarato, glicolato, heptanoato, hipurato, lactato, malato, maleato, hidroximaleato, malonato, mandelato, mesilato, nicotinato, isonicotinato, nitrato, oxalato, ftalato, teraftalato, fosfato, monohidrogenofosfato, dihidrogenofosfato, metafosfato, pirofosfato, propiolato, propionato, fenilpropionato, salicilato, sebacato, succinato, suberato, sulfato, bisulfato, pirosulfato, sulfito, bisulfito, sulfonato, benceno-sulfonato, p-bromobencenosulfonato, clorobencenosulfonato, etanosulfonato, 2-hidroxietanosulfonato, metanosulfonato, naftaleno-1-sulfonato, naftaleno-2-sulfonato, ptoluenosulfonato, xilenosulfonato, tartrato, y similares. Las bases comúnmente utilizadas para la formación de sales incluyen hidróxido de amonio e hidróxidos de metales alcalinos y alcalino-térreos, carbonatos, así como aminas alifáticas y primarias, secundarias y terciarias, diaminas alifáticas. Las bases especialmente útiles en la preparación de sales de adición incluyen hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de amonio, carbonato de potasio, metilamina, dietilamina, y etilendiamina.

Las formas de realización alternativas proporcionan un método para potenciar el tratamiento del cáncer con radioterapia como se describe, que comprende la administración de una “formulación de liberación lenta” que es capaz de liberar el principio activo al entorno de una manera controlada, no instantánea, y dependiente del tiempo. Esta formulación de liberación lenta puede comprender un polímero biodegradable, por ejemplo seleccionado de entre el grupo que consiste en un homopolímero de ácido láctico; un homopolímero de ácido glicólico; un copolímero de poli-D,L-(ácido láctico y ácido glicólico); una sal peptídica insoluble en agua de un análogo de la hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH); un poli(fosfoéster); un copolímero de bis(pcarboxifenoxi)propano (CPP) con ácido sebácico; un polímero de polianhídridos; copolímeros de poli(láctida)-coglicolida)polietilenglicol; y un copolímero de etileno-acetato de vinilo.

En algunas formas de realización específicas del método, la formulación de liberación lenta libera el fármaco IRCCE durante un período de cuatro o más semanas; alternativamente, durante un período de una semana o más; o alternativamente, durante un período de pocas horas o más.

Los métodos, formulaciones de composiciones y utilizaciones descritos en la presente memoria son adecuados tanto para seres humanos como para animales, preferentemente mamíferos.

De este modo, como se usa en la presente memoria, el término "sujeto” se refiere a cualquier mamífero, incluyendo un ratón, rata, cerdo, mono, y caballo. En una forma de realización específica, se refiere a un ser humano. Un "sujeto que lo necesite” o un "paciente”, en el contexto de la presente invención, pretende incluir cualquier sujeto que se beneficiará o que probablemente se beneficie de los métodos y composiciones farmacéuticas de la presente invención. El sujeto puede sufrir un cáncer en cualquier etapa, de manera que podría ser un cáncer temprano no invasivo, o podría ser un cáncer en etapa tardía que ya ha progresado para formar metástasis en el cuerpo. "Paciente” en la presente memoria se refiere a animales, incluyendo mamíferos, preferentemente seres humanos. Como se usa en la presente memoria, el término "cáncer” está destinado a incluir cualquier forma de cáncer o tumores. Los ejemplos no limitativos de cánceres incluyen cáncer de cerebro (por ejemplo, glioma), cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de próstata, cáncer de colon, linfoma no de Hodgkin, sarcoma, cáncer testicular, leucemia aguda no linfocítica, y cáncer de mama. En una forma de realización particular, el cáncer de cerebro es un astrocitoma, y más particularmente, es glioblastoma multiforme; el cáncer de pulmón es un carcinoma de pulmón microcítico o un carcinoma de pulmón no microcítico; y el cáncer de cabeza y cuello es un carcinoma de células escamosas o adenocarcinoma. El documento WO2018/134443 mostró que los fármacos conocidos y desconocidos pueden mejorar el canibalismo celular mediado por IR in vitro e in vivo en animales portadores de tumores.

Como se usa en la presente memoria, las expresiones "fármacos inductores de canibalismo celular” , "agentes inductores de canibalismo celular”, "compuestos inductores de canibalismo celular” y "potenciadores del canibalismo celular” designan compuestos que son capaces de mejorar la capacidad de irradiación para desencadenar el canibalismo celular. Bajo estas expresiones se designan compuestos que pueden mejorar el canibalismo celular mediado por IR (en adelante denominado IRCCE). En la tabla 1 y la tabla 2 se presentan las estructuras químicas de los moduladores del canibalismo celular seleccionados.

Tabla 1

Tabla 2

En total, se descubrieron 16 compuestos potenciadores del canibalismo celular eficientes, a saber: 8-azaguanina, sal de 1,5-naftalenodisulfonato de mebhidrolina, flurbiprofeno, dihidrocloruro de minaprina, miricetina, digoxina, digitoxina, lanatósido, hidrocloruro de doxorubicina, LOPA87, VP331, RN-1-026, SG6163F, VP450, VP43. Asimismo se han identificado varios compuestos interesantes. Son, por ejemplo, análogos de LOPA87 (LOPA90, LOPA93, LOPA 94, LOPA 101, LOPA104, LOPA105, LOPA106), y análogos de SG6143F (SG6144, SG6146 y SG6149).

Dihidrocloruro de minaprina (C-17H22N4O, antidepresivo de amino-fenilpiridazina). El dihidrocloruro de minaprina es un fármaco psicotrópico que ha demostrado su eficacia en el tratamiento de diversos estados depresivos. Al igual que la mayoría de los antidepresivos, la minaprina antagoniza la desesperanza conductual. La minaprina es un antidepresivo de amino-fenilpiridazina que, según se informa, está relativamente libre de cardiotoxicidad, somnolencia, y aumento de peso. Más específicamente, la minaprina es un antidepresivo de amino-fenilpiridazina que, según se informa, está relativamente libre de cardiotoxicidad, somnolencia, y aumento de peso. Al igual que otros tratamientos antidepresivos, la minaprina atenúa la función del receptor beta-adrenérgico. Los estudios asimismo han mostrado que la minaprina mejora la consolidación de la memoria, y que la administración repetida del fármaco conduce a la potenciación de este efecto. Además, los efectos de la minaprina sobre la consolidación de la memoria están relacionados con su acción dopaminérgica. La minaprina se une a los receptores de serotonina tipo 2 y a los receptores de dopamina tipo D1 y D2. Asimismo se une a la bomba de recaptación de serotonina. Por lo tanto, la minaprina bloquea la recaptación tanto de dopamina como de serotonina. Asimismo es, en cierto grado, colinomimético. De este modo, puede exhibir propiedades nootrópicas y que mejoran el estado de ánimo. Asimismo actúa como inhibidor reversible de MAO-A (RIMA). Asimismo se ha descubierto que inhibe la acetilcolinesterasa. La preparación de este compuesto se ilustra en la patente US n° 4.169.158.

Compuestos químicos obtenidos de la biblioteca seleccionada

LOPA87, VP331, RN-1026, SG6163F, VP450 y VP43 se han obtenido de la biblioteca CEA. Asimismo se identificaron 7 análogos de LOPA87 (LOPA90, LOPA93, LOPA 94, LOPA 101, LOPA104, LOPA105, LOPA106) y 3 análogos de SG6163F (SG6144, SG6146 y SG6149)

Otras divulgaciones

Los siguientes aspectos no están de acuerdo con la invención, y están presentes únicamente a título ilustrativo.

Enseñanza del documento WO2018/134443

El documento WO2018/134443 describió el descubrimiento de un nuevo mecanismo de muerte celular (el canibalismo celular), que nunca se ha detectado por otros después de RI u otros tratamientos contra el cáncer. Por lo general, en los experimentos de vacunación de tumores, las células cancerosas se expusieron a un tratamiento citotóxico contra el cáncer in vitro hasta que 70% de las células exponen la fosfatidilserina en la cara exterior de la membrana plasmática 48 Curiosamente, los presentes resultados revelan que los compuestos químicos seleccionados sobre la base de su capacidad para potenciar el canibalismo celular mediado por IR (IRCCE) convierten las células cancerosas en una vacuna que estimula las respuestas inmunitarias antitumorales. Más específicamente, los presentes resultados revelan por primera vez que la combinación de IRCCE+IR provoca una respuesta inmunitaria contra el cáncer mediada por IR en ausencia de un aumento significativo de la muerte de las células tratadas e irradiadas (figura 5A), lo que sugiere que el canibalismo celular o las rutas de señalización asociadas al canibalismo celular contribuyen a la inducción de inmunogenicidad tumoral después de la irradiación.

La irradiación se usa normalmente para tratar el cáncer. A menudo, combinada con quimioterapia y/o cirugía, la terapia de irradiación comprende la administración tanto local como total del cuerpo, así como una serie de nuevos avances, incluyendo la radioinmunoterapia. El efecto citotóxico de la irradiación sobre las células neoplásicas surge de la capacidad de la irradiación para provocar una rotura en una o ambas hebras de la molécula de ADN dentro de las células. Las células en todas las fases del ciclo celular son susceptibles a este efecto. Sin embargo, es más probable que el daño del ADN sea letal en las células cancerosas debido a que son menos capaces de reparar el daño del ADN. Es mucho más probable que las células sanas, con proteínas de punto de control del ciclo celular en funcionamiento y enzimas reparadoras, puedan reparar el daño de la radiación y funcionen normalmente después del tratamiento. Sin embargo, la irradiación comporta efectos secundarios que son una carga para los pacientes.

Los efectos secundarios de la irradiación son similares a los de la quimioterapia, y surgen por la misma razón, es decir, el daño de los tejidos sanos. La irradiación suele ser más localizada que la quimioterapia, pero este tratamiento aún se acompaña de daños en tejidos previamente sanos. Muchos de los efectos secundarios son desagradables, y la irradiación asimismo comparte con la quimioterapia la desventaja de ser mutágena, carcinógena y teratógena por derecho propio. Si bien las células normales generalmente comienzan a recuperarse del tratamiento dentro de las dos horas posteriores al tratamiento, se pueden inducir mutaciones en los genes de las células sanas. Estos riesgos son elevados en ciertos tejidos, tales como aquellos en el sistema reproductivo. Además, se ha descubierto que diferentes personas toleran la irradiación de manera diferente. Las dosis que pueden no dar lugar a nuevos cánceres en un individuo pueden, de hecho, generar cánceres adicionales en otro individuo. Esto podría deberse a mutaciones preexistentes en proteínas de punto de control del ciclo celular o enzimas de reparación, pero la práctica actual no podría predecir a qué dosis está en riesgo un individuo particular. Los efectos secundarios comunes de la irradiación incluyen irritación de la vejiga, fatiga, diarrea, recuentos sanguíneos bajos, irritación de la boca, alteración del gusto, pérdida del apetito, alopecia, irritación de la piel, cambios en la función pulmonar, enteritis, trastornos del sueño, y otros.

Es muy ventajoso proporcionar a los pacientes un agente potenciador que desencadene un efecto sinérgico con la irradiación, lo que permite que el paciente esté menos expuesto a la terapia de irradiación. De hecho, esto reduce los efectos secundarios mencionados anteriormente, al tiempo que se logra un resultado beneficioso mejorado.

En conjunto, se describió que, dada la importancia destacada del canibalismo celular en la eliminación de las células cancerosas irradiadas y la importancia cada vez mayor de la respuesta inmunitaria en la respuesta tumoral a la irradiación, el canibalismo celular es una muerte “deseable” que debe favorecerse durante los tratamientos contra el cáncer a fin de eliminar eficazmente las células cancerosas irradiadas. Esto se puede lograr administrando a los pacientes potenciadores del canibalismo celular, como se demuestra en la parte experimental a continuación.

El documento WO2018/134443 describió el uso in vitro de los compuestos identificados anteriormente (resaltados en las tablas 1 y 2) para potenciar el canibalismo celular mediado por IR (IRCCE) de células cancerosas.

Como se describe en la presente memoria, las expresiones “in vitro’’ y “ex vivo" son equivalentes, y se refieren a estudios o experimentos que se llevan a cabo utilizando componentes biológicos (por ejemplo, células o población de células) que se han aislado de sus organismos hospedantes habituales (por ejemplo, animales o seres humanos). Estas células aisladas pueden además purificarse, cultivarse, o analizarse directamente para evaluar la presencia de las proteínas mutantes. Estos experimentos se pueden reducir, por ejemplo, a la práctica en materiales de laboratorio tales como tubos, matraces, pocillos, eppendorf, etc. En cambio, la expresión “in vivo" se refiere a estudios que se llevan a cabo en organismos vivos completos. El canibalismo celular mediado por IR puede evaluarse por cualquier medio convencional. En particular, esta actividad puede evaluarse estudiando las células bajo el microscopio (por inmunofluorescencia o inmunohistoquímica) y detectando visualmente eventos de engullición celular o sistemas célula en célula. Alternativamente, se puede evaluar midiendo, en dicha célula, el nivel de expresión de una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en: p53, p53p, p53Y, e isoformas N-terminales de p53 que carecen del dominio transactivante N-terminal, tales como A40TP53 y A133TP53, o midiendo el nivel de expresión o la actividad del receptor P2Y2 purinérgico, y/o midiendo el ATP extracelular segregado por dichas células, como se describe en el documento WO2014/006227.

Estos compuestos asimismo se pueden utilizar in vivo.

En este caso, los compuestos se pueden administrar a los pacientes en una composición farmacéutica que contiene además adyuvantes farmacéuticamente aceptables. Por tanto, la “composición farmacéutica de la invención” contiene una cantidad eficaz de por lo menos uno del compuesto (ver las tablas 1 y 2 anteriores, tal como dihidrocloruro de minaprina), o análogos del mismo, y adyuvantes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de adyuvantes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal, y ésteres orgánicos inyectables tal como oleato de etilo. Otros adyuvantes farmacéuticamente aceptables incluyen disoluciones acuosas y excipientes no tóxicos que incluyen sales, conservantes, amortiguadores, y similares. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de líquidos y nutrientes. Las composiciones asimismo pueden incluir conservantes tales como agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, y gases inertes. El pH y la concentración exacta de los diversos componentes de la composición farmacéutica se pueden ajustar según parámetros bien conocidos.

La administración in vivo de los compuestos de la invención (entre los cuales, dihidrocloruro de minaprina) o de la composición de la invención (que contiene dihidrocloruro de minaprina) está destinada a reducir el crecimiento tumoral en sujetos que padecen cáncer.

Asimismo puede potenciar la inmunogenicidad del tumor en sujetos que se someterán o que se han sometido a un tratamiento de radioterapia. Aunque no se está ligado a ninguna teoría particular, se cree que estos compuestos funcionan sinérgicamente con la terapia de radiación al favorecer el canibalismo celular y, de ese modo, la exposición de epítopos particulares que inducen una respuesta inmunitaria protectora significativa contra el cáncer.

El documento WO2018/134443 asimismo describe los compuestos en las tablas 1 y 2 anteriores (entre los cuales, dihidrocloruro de minaprina) o sus análogos, o cualquier composición farmacéutica que los contiene,

• para su utilización para potenciar el canibalismo celular mediado por IR en pacientes que padecen cáncer,

• para su utilización para potenciar la inmunogenicidad tumoral en sujetos que recibirán o que han recibido un tratamiento de radioterapia,

• para su utilización para inducir una respuesta inmunitaria protectora significativa contra el cáncer en sujetos que recibirán o que han recibido un tratamiento de radioterapia,

• para su utilización para potenciar un tratamiento de radioterapia en un sujeto que lo necesite,

• para su utilización en el tratamiento del cáncer, junto con radioterapia, en un sujeto que lo necesite.

De forma importante, la administración de estas composiciones permitió reducir la dosis de irradiación, y por lo tanto dio como resultado el alivio de los efectos secundarios provocados por el tratamiento de radiación.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en forma de composiciones inyectables (por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, e intraarticular), como disoluciones o suspensiones líquidas; asimismo se pueden preparar formas sólidas adecuadas para disolución o suspensión en líquido antes de la inyección. Estas preparaciones asimismo pueden emulsionar.

Dichas composiciones farmacéuticas asimismo pueden administrarse por otras vías tales como por vía oral, nasal, rectal, tópica, intratumoral, intravenosa, intramuscular, subcutánea, sublingual, intratecal, intraperitoneal, intraarticular, o intradérmica. Preferentemente, la vía de administración es intravenosa, intraarterial, u oral. Preferentemente, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intravenosa o intraarterial. Más preferentemente, se administran por vía intratumoral.

Las composiciones se administran en cantidades y frecuencias suficientes para tratar el cáncer. El progreso de un sujeto se puede determinar midiendo y observando cambios en la concentración de marcadores de cáncer; midiendo el tamaño real del tumor a lo largo del tiempo, y/o determinando cualquier otro marcador clínico relevante que sea bien conocido en la técnica. La determinación, medida, y evaluación de tales características y marcadores asociados con el progreso clínico son bien conocidas por los expertos ordinarios en la materia.

Leyendas de las figuras

Figura 1. Perfiles de muerte celular mediante citometría de flujo de formación de imágenes cuantitativa. (A) Principio del perfil de muerte celular mediante formación de imágenes por citometría de flujo cuantitativa. (B) Validación de la detección multiparamétrica y simultánea de modalidades de muerte celular mediante citometría de flujo de formación de imágenes cuantitativa inducida por irradiación gamma. Antes del cocultivo, las células HCT116 tratadas y las células HCT116 sin tratar se marcaron respectivamente con sondas vitales fluorescentes CMFDA (verde/gris claro) o CMTMR (rojo/gris oscuro). Después de 24 horas de cocultivo, las células HCT116 se analizaron para determinar la muerte no autónoma de la célula (NCAD) (mediante la detección de la engullición de células HCT116 marcadas con CMTMR o CMFDA), para la exposición a fosfatidilserina (PS) (utilizando Biotina-AnexinaV y BV786-Estreptavidina), para determinar la pérdida de la integridad del plasma (mediante seguimiento con captación de DRAQ7), y para determinar el contenido de ADN (utilizando Hoechst 33342). Usando citometría de flujo cuantitativa, la detección simultánea de muertes NCA y de muertes celulares típicas (tipo I, II y III) en células HCT116, tanto sin tratar como tratadas, determinará el perfil de muerte celular obtenido después del tratamiento del cáncer. Se muestran imágenes representativas (escala, 20 pm).

Figura 2. Detección de modalidades de muerte autónoma de la célula provocada por irradiación y mediante citometría de flujo de formación de imágenes cuantitativa. (A-E) Detección y cuantificación de la pérdida de integridad de la membrana plasmática y exposición a PS observadas después de 24 horas de cocultivo de células HCT116 marcadas con CMTMR sin tratar (rojo/gris oscuro) y células HCT116 marcadas con CMFDA sin tratar (verde/gris claro) (A, C-E), de células HCT116 marcadas con CMTMR sin tratar (rojo/gris oscuro) y células HCT116 marcadas con CMFDA sin tratar (verde/gris claro) que se han mezclado extemporáneamente (C-E), o después de 24 horas de cocultivo de células HCT116 marcadas con CMTM sin tratar (rojo/gris oscuro) con células HCT116 marcadas con CMFDA (verde/gris claro) (verde) que se han irradiado con 4 grays de radiación ionizante y (B-E). Los cocultivos se han realizado en presencia o en ausencia de los inhibidores de efectores de muerte farmacológicos indicados. La detección de la integridad de la membrana plasmática (con DRAQ7) y la exposición a PS (con BV786-estreptavidina/biotina-Anexina V) se han analizado para las células HCT116 CMTMR+ sin tratar (rojo/gris oscuro), para las células HCT116 c Mf DA+ sin tratar (verde/gris claro), para las células HCT116 CMFDA+tratadas (verde/gris claro), y para la población celular total (células HCT116 CMTMR+ o CMFDA+). Se muestran (medias ± SEM, n = 3) gráficos de puntos representativos (A, B) y datos cuantitativos (C-E). (F, G) Se muestran distribuciones representativas del ciclo celular de células HCT116 CMTMR+ sin tratar (rojo/gris oscuro), células HCT116 CMFDA+ sin tratar (verde/gris claro), células HCT116 CMFDA+ tratadas (verde/gris claro), y para la población celular total (células HCT116 CMTMR+ o CMFDA+) obtenida después de 24 horas de cocultivo de células HCT116 marcadas con CMTMR sin tratar (rojo/gris oscuro) con células HCT116 marcadas con CMFDA sin tratar (verde/gris claro) (F, H-J), de células HCT116 marcadas con CMTMR sin tratar (rojo/gris oscuro) y células HCT116 marcadas con CMFDA sin tratar (verde/gris claro) que se han mezclado extemporáneamente (H-J), o después de 24 horas de cocultivo de células HCT116 marcadas con CMTM sin tratar (rojo/gris oscuro) con células HCT116 marcadas con CMFDA (verde/gris claro) que se han irradiado con 4 grays de radiación ionizante y (G-J). Los datos cuantitativos del análisis del ciclo celular se muestran en (H-J) (medias ± SEM, n = 3). * o # o $ representa p<0.05, ## o $$ p<0.01, ***o ### p <0.001.

Figura 3. Detección de modalidades de muerte no autónoma de la célula provocada por irradiación y mediante citometría de flujo de formación de imágenes cuantitativa y microscopía de fluorescencia confocal. (A-G) Las estructuras célula en célula y la degradación de la célula diana se determinaron mediante formación de imágenes cuantitativa (A-C) y microscopía de fluorescencia confocal (D-G) después de 24 horas de cocultivo de células HCT116 marcadas con CMTM sin tratar (rojo/gris oscuro) con células HCT116 marcadas con CMFDA (verde/gris claro) que se han irradiado con 4 grays de radiación ionizante y (A), cocultivo de células HCT116 marcadas con CMTMR sin tratar (rojo/gris oscuro) con células HCT116 marcadas con CMFDA sin tratar (verde/gris claro) (B, C), o en células HCT116 marcadas con CMTMR (rojo/gris oscuro) y células HCT116 marcadas con CMFDA sin tratar (verde/gris claro) que se han mezclado extemporáneamente (B, C). Como se describió anteriormente, las células se marcaron secuencialmente después de cocultivos con sondas fluorescentes específicas como BV786-estreptavidina-anexina V biotina, DRAQ7, y Hoechst 33342. Después, se detectaron células HCT116 marcadas con CMTMR (rojo/gris oscuro) que internalizan células HCT116 marcadas con CMFDA (verde/gris claro) (señaladas R(G)), y células HCT116 marcadas con CMFDA (verde/gris claro) que internalizan células HCT116 marcadas con CMTMR (rojo/gris oscuro) (señaladas G(R)). Las imágenes representativas se muestran en (A) (escala, 20 pm). Se dan a conocer las frecuencias de estructuras de célula en célula (B) y la degradación de la célula diana (C) (medias ± SEM, n = 3). Se muestran las imágenes confocales representativas de estructuras de célula en célula (flecha blanca) (D) y la degradación de la célula diana (flecha punteada blanca) (E) detectadas durante el cocultivo de células HCT116 marcadas con CMTMR sin tratar (rojo) con células marcadas con CMFDA sin tratar o irradiadas con y (verde) (barra de escala = 10 |jm). (F-G) Se han determinado las frecuencias de las estructuras de célula en célula que muestran células marcadas con CMTMR (rojo/gris oscuro) que internalizan células marcadas con CMFDa (verde/gris claro) (señaladas R(G)) y células marcadas con CMFDA (verde/gris claro) que internalizan células marcadas con CMTMR (rojo/gris oscuro) (señaladas G(R)) (F), y la degradación de la célula diana (G) (medias ± SEM, n = 3); # o $ representa p<0.05, ## o $$ p<0.01, *** o $$$ o ### p<0.001.

Figura 4. Identificación de moduladores de canibalismo provocados por radiación ionizante. Los compuestos de las bibliotecas Prestwick (A) y CEA (F) se evaluaron para determinar sus capacidades para inducir el canibalismo celular después de la radiación ionizante. Se detectaron células caníbales después de cultivos homotípicos de células HCT116 irradiadas con 8 grays de y en presencia o ausencia de 10 jM de los compuestos de la biblioteca de Prestwick (A) y CEA (E). Cada punto representa un compuesto. Las imágenes representativas se muestran en (B, G). (C, H) Las células HCT116 se trataron con los fármacos indicados. Después de 24 h de tratamiento, la muerte celular se monitorizó mediante tinción con yoduro de 3,3 dihexiloxacarbocianina (DiOC6(3)) y PI, y el porcentaje de células que mueren (DiOC6(3)low PI-, barras en blanco) y de células muertas (DOC6(3)low PI+, barras en negro) se determinó mediante citofluorometría. Validación de los inductores de canibalismo mediante microscopía fluorescente. Se muestran las imágenes representativas (D, I) y la cuantificación (E, J). Los resultados son medias ± s.e.m. de determinaciones por triplicado.

Figura 5. Identificación de moduladores de canibalismo como inductores de muerte celular inmunógena. Las células MCA205 (A) o CT26 (E, I, M, Q) se trataron con los fármacos indicados. Después de 24 h de cocultivo con el tratamiento indicado, la muerte celular se monitorizó mediante tinción con DiOC6(3) y PI, y el porcentaje de células que mueren (DiOC6(3)low PI-, barras en blanco) y de células muertas (DiOC6(3)low PI+, barras en negro) se determinó mediante citofluorometría. (B-D) Las células MCA205 o (F-H, J-L, N-P, R-T), las células CT26, cocultivadas tras la irradiación x con los compuestos indicados, se inocularon por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones C56BL/6 o BALB/c, respectivamente. Siete días después, los ratones se volvieron a exponer con células vivas inyectadas en el flanco opuesto, y se monitorizó el crecimiento del tumor (cinco ratones por grupo).

Figura 6. Experimentos de vacunación tumoral. Las células CT26 se trataron durante 24 horas con VP331 10 jM (A, F, K), minaprina 10 jM (B, G, L), Lopa87 10 jM (C, H, M), SG6163F 10 jM (D, I, N), azaguanina-8 (8-aza) 10 jM (E, J, O), solos o combinados con radiación ionizante de 8 Gy, y se inocularon (s.c.) en ratones BALB/c inmunocompetentes, que se volvieron a exponer en el flanco opuesto 7 días después con las mismas células cancerosas. El porcentaje de ratones libres de tumores se evaluó tres veces por semana durante los siguientes 38 días. Se muestra el porcentaje del total de ratones libres de tumor (A-E), ratones libres de tumor en el primer sitio de inyección (F a J, P) o en el segundo sitio de inyección (K a O, Q). (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ANOVA de dos vías).

Figura 7. La minaprina reduce el crecimiento tumoral en ratones inmunocompetentes después de inyecciones intratumorales o intraperitoneales. (A-C) Se implantaron 3 106 células CT26 en ratones BALB/c inmunocompetentes. Los tumores palpables se inyectaron con minaprina 10 jM (o control) después de 6 días. A continuación, se determinó el volumen de crecimiento del tumor tres veces por semana durante los siguientes 38 días (A y B). Asimismo se determinó el porcentaje de supervivencia de los ratones (C). (D-I) Se implantaron 5 105 células CT26 en ratones BALB/c inmunocompetentes. Después de 12 días, a ratones portadores de tumores se les inyectó intraperitonealmente control (D e I), 0.3 mg/kg (E e I), 1 mg/kg (F e I), 3 mg/kg (G e I) o 10 mg/kg (H e I) de minaprina. Se analizaron los volúmenes de crecimiento tumoral (A-J) y el cambio de veces en los volúmenes tumorales después de la inyección intraperitoneal (D-I). Los volúmenes de crecimiento tumoral se determinaron tres veces por semana durante los siguientes 38 días.

Ejemplo de documento WO2018/134443

I. Material y métodos

Productos químicos, estirpes celulares y condiciones de cultivo.

A menos que se indique lo contrario, los productos químicos se adquirieron de Sigma-Aldrich. Los antibióticos, los medios y los suplementos para el cultivo celular se obtuvieron de Life Technologies. Benciloxicarbonil-Val-Ala-Asp(OMe)-fluorometilcetona (Z-VAD-fmk) se obtuvo de Bachem, y TNF-alfa de ratón recombinante procedía de R&D systems. Unas células HCT116 de carcinoma de colon humano se cultivaron en medio 5A de McCoy, y la estirpe celular de fibrosarcoma murino L929 se cultivó en medio de Eagle modificado de Dulbecco. Todos los medios se suplementaron con suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor al 10%, amortiguadores HEPES 10 mM, L-glutamina 2 mM, penicilina sódica 10 U/ml, y sulfato de estreptomicina 10 jg/ml.

Irradiación

Las células se sembraron en placas de 6 pocilios, placas de 12 pocilios, o matraces de 25 cm2, y se irradiaron a la dosis indicada con irradiador de rayos gamma IBL-637 (Cs137, 1 Gy/min, gamma CIS-Biolnternational, IBA, Saclay, Francia).

Marcaje con sondas fluorescentes CellTracker™

Tras la eliminación del medio de cultivo, las células HCT116 se incubaron con medio precalentado que contenía 10 |jM de diacetato de 5-clorometilfluoresceína (CMFDA, fluorescencia verde) o 5-(y -6)-(((4-clorometil)benzoil)amino)tetrametilrodamina (CMTMR, fluorescencia roja) (Molecular Probes-Life Technologie) durante 45 min a 37°C. Posteriormente, las células HCT116 se enjuagaron dos veces con medio precalentado, y se incubaron durante 1 hora a 37°C. Las células teñidas se trataron como se indicó, y se cultivaron para el análisis de perfil de muerte celular.

Perfiles de muerte celular mediante formación de imágenes de flujo cuantitativa

Las células HCT116 sin tratar se marcaron con CMFDA (fluorescencia verde, CMFDA+) o CMTMR (fluorescencia roja, CMTMR+), y las células HCT116 tratadas se marcaron con CMFDA (fluorescencia verde, CMFDA+). Se realizaron las siguientes mezclas de células: Las células HCT116 CMTMR+ sin tratar se mezclaron con células HCT116 CMFDA+ sin tratar, o las células HCT116 CMTMR+ sin tratar se mezclaron con células HCT116 CMFDA+ tratadas. Después, las células se cocultivaron durante 24 horas en presencia o ausencia del inhibidor farmacológico de ROCK, Y27632 (30 j M), el inhibidor de pan-caspasa, Z-VAD-fmk (ZVAD, 100 j M), el inhibidor de caspasa-1, Ac-YVAD-cmk (YVAD, 100 j M), el inhibidor de necroptosis, necrostatina-1 (NEC1, 30 j M), el inhibidor de la H(+)-ATPasa de tipo vacuolar (V-ATPasa) que inhibe la autofagia, bafilomicina A1 (BafA1, 50 nM), el inhibidor de las Cdk con actividad antimitótica, roscovitina (Rosco, 10 j M). Después de 24 horas de cocultivo, tanto las células desprendidas como las adherentes se recogieron y se tiñeron con Hoechst 33345 (10 jg/m l) durante 1 hora a 37°C en medio completo calentado. Para detectar la exposición a la fosfatidilserina (PS) y la permeabilidad de la membrana plasmática, las células HCT116 marcadas se incubaron sucesivamente con Biotina-Anexina V (BD Pharmingen) según lo recomendado por el fabricante, 0,5 jg de BV786-estreptavidina (BD Biosciences), y DRAQ7 3 j M (BioStatus), durante 15 minutos a 25°C. Después de lavar con disolución de PBS, las muestras se analizaron inmediatamente usando un citómetro de flujo de formación de imágenes FlowSight® (Amnis®, parte de EMD Millipore). Los datos se adquirieron con un aumento de 20x, utilizando el software INSPIRE. Para la excitación, se usaron láseres de 405 nm, 488 nm, y 561 nm. Se detectaron tinciones de campo brillante, Anexina V-BV786, DRAQ7, CMFDA, CMTMR, y Hoechst 33345, utilizando respectivamente canales para 420-480 nm, 745-800 nm, 642-745 nm, 480-560 nm, 595-642 nm y 430-505 nm. Se analizaron por lo menos 1000 eventos de células por muestra. Se prepararon controles adicionales de un solo marcaje para normalizar la señal fluorescente a través de diferentes canales. Los datos adquiridos se analizaron utilizando el software de análisis IDEAS (v6.1; Merck-Millipore). La estrategia de selección de poblaciones fue la siguiente. Las células se agruparon para las células enfocadas utilizando la función Gradient RMS. Las células se agruparon para células individuales usando las características de área y de relación de aspecto. Para la detección de canibalismo, las células se agruparon en la tinción doble positiva CMFDA+ y CMTMR+.

Citometría de flujo y microscopía fluorescente confocal

Para detectar la exposición a PS, la permeabilidad de la membrana plasmática y la progresión del ciclo celular, las células se marcaron secuencialmente después del cocultivo con sondas fluorescentes específicas (tales como Anexina V conjugada con FITC, yoduro de propidio, y Hoechst 33342), y se analizaron mediante citometría de flujo. Tanto las células desprendidas como las adherentes se recogieron y se tiñeron con Hoechst 33345 (10 ug/ml) durante 1 hora a 37°C en medio completo calentado. Después de lavar con PBS, las células HCT116 se suspendieron en amortiguador de unión 1X suplementado con anexina V conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (BD Biosciences) y yoduro de propidio (PI, 1 jg/m l) (Sigma), según las instrucciones del fabricante. A continuación, las muestras se analizaron utilizando un citómetro de flujo LSRII (Becton Dickinson) y el software FlowJo v10. Para la microscopía de fluorescencia confocal, las células HCT116 se fijaron después del cocultivo en paraformaldehído-PBS al 3,7% durante 15 minutos, y se contratiñeron con 1 jg/m l de Hoechst 33342 (Invitrogen) durante 15 minutos. Después, las células se analizaron mediante microscopio confocal SPE equipado con objetivos de inmersión en aceite Apochromat 63X 1.3 NA y 63X 1.15 NA. Se utilizó el software Leica Aplication Suite (LAS) (Leica Microsystems).

Transferencias western

Las proteínas celulares totales se extrajeron en amortiguador de lisis (que contenía NP40 al 1%, HEPES 20 mmol/l, KCl 10 mmol/l, EDTA 1 mmol/l, glicerol al 10%, comprimidos de inhibidor de proteasas y fosfatasas). Los extractos de proteínas (30 jg ) se procesaron en geles NuPAGE® Novex® Bis-Tris al 4-12% (Life Technologies), y se transfirieron a 4°C sobre membranas de polidifluoruro de vinilo (PVDF) Immobilon (Thermo Scientific). Después del bloqueo, las membranas se incubaron a 4°C durante la noche con anticuerpos primarios específicos para: caspasa-3 (# 9662), caspasa-3 escindida (Asp175) (# 9661), cadena ligera de miosina 2 (MLC2) (# 3672), fosfo-MLC2 (Ser19) (# 3675), LC3 A/B (# 4108), sustrato p-(S)-CDKs (# 9477), obtenidos de Cell Signaling Technology. Los anticuerpos contra GAPDH (# MAB374) se adquirieron de Millipore. Los anticuerpos de cabra antirratón o anticonejo conjugados con peroxidasa de rábano picante (Southern Biotechnology) se incubaron entonces durante 1 h, y se revelaron con el reactivo SuperSignal West Pico® (Thermo Fisher Scientific) o el sistema de detección de transferencia Western ECL™ Prime (GE Healthcare) utilizando un dispositivo de formación de imágenes asistido por software ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare).

Análisis estadísticos

Cada experimento se repite por lo menos tres veces, obteniendo resultados comparables. A menos que se indique lo contrario, las figuras ilustran datos cuantitativos de un experimento representativo (medias ± SEM, n = 3). Los datos se analizan mediante Prism v. 5.03 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). La significancia estadística se evalúa mediante pruebas de la t de Student de dos colas. En todos los experimentos, los valores p<0.05 se consideraron estadísticamente significativos.

II. Resultados

El análisis de perfiles de muerte celular mediante citometría de flujo de imágenes multiespectrales permite la detección simultánea de modalidades de muerte no autónoma de la célula y autónoma de la célula. La capacidad de las células para morir a través de procesos NCA llevó a reconsiderar desde un punto de vista conceptual el presente enfoque metodológico para considerar los procesos de muerte celular. De hecho, la elección de los parámetros morfológicos y/o bioquímicos que se deben considerar, así como el enfoque tecnológico que se utilizará para detectar la muerte celular, predefinen de antemano los resultados que se deben esperar, y no permiten o muy raramente identificar nuevos procesos letales tales como canibalismo celular o entosis. El campo de la radioterapia asimismo se enfrenta a este problema. De hecho, se reveló en estudios separados que la irradiación puede desencadenar muchos procesos letales tales como apoptosis, muerte celular autofágica, necrosis, o muerte mitótica 3536. Recientemente, se ha mostrado en estudios separados que la irradiación del mismo tipo de células con las mismas dosis podría desencadenar la apoptosis 37, pero asimismo la muerte mitótica 38 En estudios anteriores, se reveló que el inicio de la apoptosis y muerte mitótica observadas muy rápidamente después de la irradiación no correlacionan con la supervivencia clonogénica observada a más largo plazo 35 Estos estudios destacaron la existencia de procesos letales desconocidos implicados en la eliminación de células irradiadas. Además, el creciente número de publicaciones que revelan la influencia del canibalismo celular y la entosis en el control del crecimiento tumoral y en la eliminación de células metastásicas insta a seguir el inicio de este proceso de NCAD.

Considerando la diversidad de estímulos letales que pueden iniciar potencialmente las modalidades de muerte celular tanto no autónoma de la célula como autónoma de la célula, y la complejidad de las rutas de señalización (que implican (o no) caspasas, catepsinas o granzimas) que controlan ambos procesos, se decidió detectar simultáneamente modalidades de muerte no autónoma de la célula y autónoma de la célula provocadas por IR. Para determinar si después de una agresión letal una población celular puede sufrir simultáneamente una muerte directa o/y de célula testigo que se puede ejecutar de manera autónoma o no autónoma de la célula, se diseñó un análisis de perfil de muerte celular basado en el cocultivo de células HCT116, que se habían marcado con sonda vital fluorescente de diacetato de 5-clorometilfluoresceína (CMFDA, verde), y se habían tratado por radiaciones ionizantes (rayos y), con células HCT116 isógenas que se habían marcado con la sonda vital fluorescente 5- (y -6)-(((4-clorometil)benzoil)amino)tetrametilrodamina (CMTMR, rojo). Después de 24 horas de cocultivo, las células CMFDA+ tratadas, las células CMTMR+ sin tratar y la población celular total (células CMFDA+ y células CMTMR+) se analizaron para determinar la exposición a fosfatidilserina (PS), la pérdida de la integridad de la membrana plasmática, y el contenido de ADN, para detectar simultáneamente la inducción de la muerte celular tanto de las células tratadas como de las células vecinas (sin tratar). Para caracterizar los mecanismos moleculares implicados en la ejecución de las modalidades de muerte celular detectadas, los cocultivos se llevaron a cabo en presencia de moduladores de muerte celular (tales como inhibidor de ROCK1 (Y27632), inhibidor de pan-caspasa (ZVAD-fmk), inhibidor de caspasa-1 (YVAD-fmk), necrostatina (NEC1), bafilomicina A1 (BafA1), y roscovitina (Rosco)) que es conocido que inhiben, respectivamente, la engullición celular (un proceso que inicia la entosis 16, emperiptosis 17, y canibalismo celular 16), la escisión proteolítica de caspasa-3 o caspasa-7 (que contribuye a la ejecución de la apoptosis 39, muerte mitótica 38, 40 o emperiposis 17) o de caspasa-1 (que es necesaria para la piroptosis 41), la activación de la cinasa pronecroptótica RIP1 cinasa (RIPK1) que contribuye a la necroptosis 42, la fusión entre autofagosomas y lisosomas, afectando así la maduración de las vacuolas autófagas durante la autofagia y la muerte celular asociada a la autofagia 43), y finalmente, la actividad de la cinasa 1 dependiente de ciclina (Cdk1)-ciclina B y la progresión a través de la mitosis, que se requiere para las muertes asociadas a la mitosis, tal como la muerte mitótica 40, 44. La detección simultánea de la exposición a PS, de la pérdida de integridad de la membrana plasmática, del contenido de ADN de los socios celulares, combinado con la inhibición farmacológica de los moduladores de la muerte celular, permitió detectar durante los cocultivos, mediante el uso de citometría de flujo de imágenes multiespectrales, la ejecución de por lo menos 9 modalidades de muerte celular (que incluyen apoptosis, muerte mitótica, piroptosis, muerte celular autófaga, necrosis, necroptosis, entosis, emperitosis, y canibalismo celular) en células diana y en células vecinas (figura 1, A-B), discriminando así las muertes no autónomas de la célula de las muertes autónomas de la célula, y las muertes celulares directas de los efectos letales testigos. Esta metodología permitió definir el perfil de muerte celular provocado por IR.

El perfil de muerte celular provocada por radiación ionizante destaca la inducción de muerte celular en células cancerosas tanto irradiadas como no irradiadas. A pesar de la exhaustiva investigación biológica y farmacéutica implementada para caracterizar mejor los procesos celulares y bioquímicos asociados a los tratamientos contra el cáncer, aún se desconocen los mecanismos letales responsables de los efectos terapéuticos de la radioterapia, que es uno de los tratamientos contra el cáncer más frecuentes utilizado en la clínica. Los procesos letales (tales como la apoptosis y la catástrofe mitótica) que se han detectado en respuesta a la radiación ionizante no estaban directamente implicados en la eficacia del tratamiento 35, lo que sugiere que las modalidades adicionales de muerte celular que aún se desconocen pueden contribuir a los efectos terapéuticos de la radioterapia. En este contexto, se determinó el perfil de muerte celular de las células cancerosas irradiadas. Según la metodología descrita anteriormente, las células marcadas con CMFDA se irradiaron o no con 4 grays, se mezclaron después de 24 horas en una proporción de 1:1 con células marcadas con CMTMR, y se cultivaron durante 24 horas en presencia de cada uno de los inhibidores indicados (figuras complementarias 1A-1E). Después, se determinaron respectivamente la exposición a PS, la integridad de la membrana y el contenido de ADN de cada socio celular utilizando tinciones de anexinaV-BV786, DRAQ7 y Hoechst 33342. A pesar de que no se observó un aumento significativo de las muertes celulares apoptóticas y necróticas (como lo revela el análisis de células anexinaV+DRAQ7- y DRAQ7+) en la población de células vecinas (células CMTMR+) (figuras 2A, 2B y 2D) y en la población de células de control sin tratar (figuras 2A, 2D y 2E), se detectó un aumento significativo de estos dos tipos de muerte en la población celular total (como se revela al considerar la población de células CMFDA+ y CMTMR+) (figuras 2A-2c ) y en la población celular irradiada (células CMFDA+) (figuras 2B y 2E) después de 24 horas de cocultivo, demostrando que la presente metodología permite detectar modalidades de muerte celular tanto de células irradiadas como no irradiadas. Asimismo se observó que el inhibidor de pan-caspasa Z-VAD-fmk y el inhibidor farmacológico de cinasas dependientes de ciclina roscovitina (Rosco) inhibieron la exposición de PS en la membrana plasmática externa de células CMFDA+ irradiadas (figura 2E), confirmando, como se publicó anteriormente 45, 46, que las células CMFDA+ irradiadas requieren tanto la activación de la caspasa como la progresión a través de la mitosis para morir. Además, la alteración del flujo autófago con bafilomicina A1 (BafA1) aumentó la frecuencia células que mueren (células anexinaV+DRAQ7- y DRAQ7+) en la población celular total (células CMFDA+ y CMTMR+) (figura 2C), en células CMTMR+ no irradiadas (figura 2D) y en células CMFDA+ irradiadas (figura 2E), revelando así que la autofagia es un mecanismo celular de supervivencia provocado por la radiación ionizante que contribuye a rescatar de la muerte a células tanto no irradiadas como irradiadas. Además, el análisis simultáneo de la progresión de las células tratadas y sin tratar a través de sus ciclos celulares mostró que las inducciones de muerte celular están asociadas con el escape de células CMFDA+ irradiadas de la detención G1, y condujeron a sus acumulaciones en las fases S y G2/M (figuras 2F, 2G y 2J). No se detecta alteración del ciclo celular en poblaciones celulares totales o de células CMTMR+, subrayando que las alteraciones del ciclo celular solo se detectan en células irradiadas (figuras 2F, 2G y 2I). Estos resultados, que asimismo se confirmaron por análisis de citometría de flujo clásica (figuras complementarias 2A-2B), demostraron que, después de la radiación ionizante, tanto las células cancerosas irradiadas como las no irradiadas sufren muerte celular dependiente de caspasa-1. En conjunto, estos resultados destacaron la capacidad de los agentes anticancerígenos para eliminar simultáneamente las células cancerosas mediante la destrucción celular directa y los efectos testigos.

El perfil de muerte celular provocada por radiación ionizante asimismo revela la inducción de modalidades de muerte no autónoma de la célula. Paralelamente, en el mismo cocultivo se determinó la capacidad de células CMFDA+ irradiadas para engullir o invadir células vecinas, dos procesos celulares necesarios para la inducción de muertes celulares asociadas al canibalismo celular (tal como canibalismo celular, emperitosis o fagoptosis) o muertes celulares provocadas por invasión célula en célula (tal como entosis). El análisis de citometría de flujo de imágenes multiespectrales reveló que las células CMFDA+ irradiadas con rayos gamma desencadenaron la engullición de las células vecinas (como revela la internalización de células CMTMR+ “diana” por células CMFDA+ irradiadas con rayos gamma (figuras 3A y 3B)). Este proceso, que no fue afectado por el inhibidor de pan-caspasa Z-VAD-fmk, es reprimido por el inhibidor de ROCK1 (Y27632) (figura 3B), revelando así que la internalización célula en célula detectada es distinta de la captación fagocítica de células apoptóticas, y requiere que se produzca la actividad de ROCK1. La actividad caníbal de las células irradiadas con rayos gamma asimismo se confirmó mediante microscopía confocal (figuras 3D-3F). Curiosamente, el análisis de perfiles de muerte celular asimismo permitió distinguir entre la engullición de células vivas y la fagocitosis de células CMFDA+ apoptóticas por células CMTMR+ vivas, que es consecutiva a la inducción de apoptosis por el tratamiento con bafilomicina A1 (figura 3B). Después, se evaluaron los destinos celulares de células CMTMR+ engullidas y células CMFDA+ irradiadas que engullen. Se observó que casi todas las células CMTMR+ engullidas exhibieron signos de degradación celular (como revela la pérdida de contenido de ADN de células internalizadas detectada con citometría de flujo de imágenes multiespectrales (figura 3A) y microscopía confocal (figuras 3D y 3E)). Este proceso se reduce significativamente en presencia del inhibidor de pan-caspasa Z-VAD-fmk y del inhibidor de caspasa-1 YVAD-fmk, lo que revela que la muerte de células engullidas mediada por IR requiere que aparezcan caspasas y puede ejecutarse a través de apoptosis dependiente de caspasa-1, que asimismo se conoce como piroptosis. Además, asimismo se reveló que 90% de las células caníbales no expusieron PS ni exhibieron pérdida de la integridad de su membrana plasmática (figura complementaria 2C), subrayando que, después de la engullición celular mediada por IR, las células internalizadas se precipitan hasta la muerte sin modular la viabilidad de las células caníbales.

En conjunto, estos resultados demostraron que la radiación ionizante elimina simultáneamente las células cancerosas a través de los efectos combinados de la muerte celular directa, el efecto letal testigo, y la muerte celular asociada al canibalismo celular. Estos resultados destacan la necesidad urgente de medir simultáneamente la inducción de subrutinas de muerte no autónoma de la célula y autónoma de la célula durante procesos letales.

El cribado de bibliotecas químicas conduce a la identificación de potenciadores del canibalismo celular mediado por IR. Después, se desarrolló el cribado de una biblioteca de compuestos químicos para identificar compuestos capaces de inducir canibalismo celular mediado por IR. De este modo, las células HCT116 que se han tratado con una dosis de radiación de 8 grays se tiñeron con un rastreador de células CMTMR naranja o un rastreador de células CMFDA verde, y se cultivaron en presencia de 10 pM de compuestos químicos. Después de 24 horas de cultivo, las células se tiñeron con colorante nuclear (5 pg/ml de Hoechst 33342 durante 1 h a 37°C), y se analizaron con el citómetro de flujo de imágenes FlowSight® para detectar canibalismo celular. Cada uno de estos compuestos se clasificó según su puntuación Z 47 y se identificaron respectivamente 13 y 11 compuestos candidatos (figuras 4A, 4B, 4F y 4G). Después, los compuestos identificados se validaron combinando enfoques de citometría de flujo (con el fin de eliminar compuestos citotóxicos monitorizando simultáneamente la despolarización de la membrana mitocondrial interna y la permeabilidad de la membrana plasmática de las células tratadas) con enfoques de microscopía confocal (para confirmar la modulación del canibalismo celular inducido por IR mediante los compuestos candidatos) (figuras 4C-E y 4H-J). Después de la finalización de tres experimentos independientes, se eliminaron los compuestos químicos sin efecto (tales como fenbendazol o carbimazol) o que exhiben citotoxicidad elevada (tal como RN-1-183). Finalmente, se identificaron 16 compuestos químicos que pueden potenciar la capacidad de IR para desencadenar el canibalismo celular (figuras 4E y 4J, tablas 1 y 2).

La combinación de IRCCE con IR induce inmunidad antitumoral eficaz. Considerando que se identificaron inductores de muerte celular inmunógena (ICD) (tales como digoxina, digitoxina, lanatósido C o hidrocloruro de doxorrubicina) 3, 4, 48-51) como IRCCE, se evaluó la capacidad de estos compuestos para inducir una inmunidad antitumoral después de la radioterapia. Primero, se desarrolló un enfoque preclínico para estudiar los efectos inmunológicos de IRCCE en dos modelos de carcinoma de ratón (carcinoma de colon CT26 y fibrosarcoma MCA205). Inicialmente, se apreció la capacidad de la combinación de IRCCE+IR para desencadenar una respuesta inmunitaria antitumoral específica utilizando ratones inmunocompetentes mediante ensayos de vacunación antitumoral. Según estudios publicados previamente 52, la inyección de células cancerosas que sucumben a una muerte celular inmunógena (ICD) en ratones inmunocompetentes debe provocar una respuesta inmunitaria protectora que es específica para los antígenos tumorales. De este modo, 3X105 células MCA205 se trataron primero con 10 pM de SG6163F durante 24 horas. Después, las células tratadas se inocularon por vía subcutánea en 200 pl de PBS en el flanco inferior de ratones C57BL/6 hembras de 8 semanas. Una semana después, se inocularon 3X104 células de control sin tratar en el flanco contralateral de los ratones. Los tumores se evaluaron semanalmente utilizando un calibre común. Los animales que presentaban tumores que excedían el 20-25% de la masa corporal fueron sacrificados. Se observó que los ratones tratados con IR o SG6163F solos no son capaces de inducir un aumento significativo de la muerte celular in vitro (figura 5A). De hecho, no mostraron una respuesta protectora después de la inoculación de células sin tratar, revelando que la dosis de radiación y la concentración de SG6163F utilizadas no fueron suficientes para estimular una respuesta inmunitaria contra el cáncer (figura 5B). Estos resultados fueron consistentes con los resultados publicados anteriormente que demuestran que solo se detecta una respuesta protectora cuando las células cancerosas se expusieron a un tratamiento citotóxico contra el cáncer in vitro hasta que 70% de las células exponen la fosfatidilserina en la capa exterior de la membrana plasmática 48 Sorprendentemente, se observó que el tratamiento combinado de células MCA205 con 8 Gy de IR y 10 pM de SG6163F indujo una respuesta protectora en 3 de 5 ratones que habían sido inyectados (figura 5B). Estos resultados revelaron por primera vez que la combinación de IRCCE+IR puede provocar una respuesta inmunitaria contra el cáncer mediada por IR en ausencia de un aumento significativo de muerte de células tratadas e irradiadas (figura 5A), lo que sugiere que el canibalismo celular o las rutas de señalización asociadas al canibalismo celular pueden contribuir a la inducción de inmunogenicidad tumoral. Después, 3X106 células CT26 se irradiaron con 8 Gy en presencia de 10 pM de SG6163F (figuras 5E y 5F), VP331 (figuras 5I y 5J), dihidrocloruro de minaprina (figuras 5M y 5N), o LOPA87 (figuras 5Q y 5R), durante 24 horas. Después, las células se inocularon como se describió anteriormente por vía subcutánea en 200 pl de PBS en el flanco inferior de ratones BALB/c hembras de 8 semanas. Una semana después, se inocularon 5X105 células de control sin tratar en el flanco contralateral de ratones, y los tumores se evaluaron semanalmente utilizando un calibre común. Como se mencionó anteriormente, los animales que presentaban tumores que excedían 20-25% de la masa corporal fueron sacrificados. El porcentaje de células moribundas en cada condición se evaluó determinando con tinción DiOC(6)3/IP (figuras 5E, 5I, 5M y 5Q). Finalmente, se apreció la capacidad de estos compuestos para reprimir el crecimiento de células cancerosas que se han inyectado 7 días después de la inyección de células cancerosas irradiadas y tratadas. Se observó un aumento significativo en la frecuencia de ratones que muestran una respuesta protectora después de la inyección de células cancerosas que se han tratado con IR y compuestos químicos (figuras 5H, 5L, 5P y 5T).

Se realizó un segundo ensayo de vacunación antitumoral en modelos de carcinoma de ratón CT26 como se describió previamente. Brevemente, las células CT26 se irradiaron con 8 Gy en presencia de 10 pM de VP331 (figuras 6A, 6F, 6K), dihidrocloruro de minaprina (figuras 6B, 6G, 6L), LOPA87 (figuras 6C, 6H, 6M), SG6163F (figuras 6D, 6I, 6N), o azaguanina-8 (8-aza) (figuras 6E, 6J, 6O), durante 24 horas. Después, las células se inocularon como se describió anteriormente en ratones BALB/c inmunocompetentes. Finalmente, se apreció la capacidad de estos compuestos para reprimir el crecimiento de células cancerosas que se han inyectado 7 días después de la inyección de células cancerosas irradiadas y tratadas. Se confirmaron los resultados anteriores. Se observaron aumentos significativos en la frecuencia de ratones que muestran una respuesta protectora después de la inyección de células cancerosas que se han tratado con IR y compuestos químicos (figuras 6P y 6Q). Curiosamente, el dihidrocloruro de minaprina (figuras 6B, 6G, 6L, 6P y 6Q) y la azaguanina-8 (figuras 6E, 6J, 6O, 6P y 6Q) solos inducen un aumento de la respuesta protectora después de la inyección de células cancerosas.

En conjunto, estos resultados revelaron la capacidad de los compuestos químicos identificados con la presente plataforma para inducir una respuesta inmunitaria protectora contra el cáncer.

Ejemplo de la invención

Confirmación del efecto antitumoral del dihidrocloruro de minaprina por sí solo

Se menciona anteriormente que la minaprina favorece la inducción de la modalidad de muerte celular de tipo IV, asimismo conocida como canibalismo celular. Esta muerte no autónoma de la célula, que se detecta cuando las células cancerosas se tratan con minaprina, aumenta significativamente en presencia de radiación ionizante (IR), revelando así la capacidad de minaprina para potenciar la destrucción de células cancerosas no autónoma de la célula provocada en respuesta a los tratamientos convencionales contra el cáncer (tal como la radioterapia).

La minaprina asimismo exhibe propiedades inmunógenas, y estimula la respuesta inmunitaria antitumoral específica in vivo según lo revelado por los ensayos de vacunación antitumoral (ver anteriormente).

Para caracterizar aún más los efectos inmunomoduladores de minaprina, se estudia el impacto de la inyección intratumoral e intraperitoneal de minaprina sobre el crecimiento de células cancerosas de ratón.

Material y métodos

Sustancias químicas, estirpes celulares y condiciones de cultivo.

La minaprina se obtuvo de Jean-Christophe Cintrat. Las células tumorales CT26 se cultivaron en medio RPMI suplementado con suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor al 10%, amortiguadores HEPES 10 mM, L-glutamina 2 mM, penicilina sódica 10 U/ml, y sulfato de estreptomicina 10 pg/ml.

Crecimiento tumoral en ratones inmunocompetentes.

Para la inyección intratumoral, 3 106 células tumorales CT26 derivadas de ratones Balb/c se implantaron por vía subcutánea en ratones Balb/c de 8 semanas (Janvier Laboratories). Después de 6 días, se inyectaron 10 pM de minaprina o disolución salina tamponada con fosfato de control (PBS) en los tumores (20 pl), y se evaluó el volumen tumoral 3 veces por semana. Para la inyección intraperitoneal, 5105 células tumorales CT26 derivadas de Balb/c se implantaron por vía subcutánea en ratones Balb/c de 8 semanas (Janvier Laboratories). Después de 12 días, se inyectaron intraperitonealmente a ratones portadores de tumores diferentes concentraciones de minaprina (0.3, 1, 3 y 10 mg/kg) o PBS. El volumen tumoral asimismo se evaluó 3 veces por semana. Los experimentos se aleatorizaron, realizados según la Directiva de la UE 63/2010, y se aprobaron por el Comité Ético en el Gustave Roussy Cancer Campus (CEEA IRCIV/IGR n°26).

Estadística y reproducibilidad.

No se utilizaron métodos o criterios estadísticos para estimar el tamaño de la muestra o para incluir/excluir muestras. Los investigadores no conocían la asignación de grupos durante los experimentos y la evaluación de resultados. Los resultados se expresan como valor medio ± SEM. Para determinar la significancia estadística, se utilizaron las pruebas ANOVA de dos vías (figura 7A) y de rango logarítmico (Mantel-Cox) (figura 7I) para el cálculo de los valores de P. Se utilizó el software Prism 6 para la generación de gráficos de supervivencia y significancia estadística. La significancia estadística se dio como valor **p<0.01 o valor *p<0.05.

Resultados

En primer lugar, se implantan subcutáneamente 3 106 células de cáncer de colon CT26 derivadas de Balb/c en ratones Balb/c inmunocompetentes. Después de 6 días, los ratones portadores de tumores se aleatorizaron, y se inyectaron 10 pM de minaprina (3 mg/kg) en los tumores. Se analizó el crecimiento tumoral durante 38 días. Curiosamente, se observa que la inyección intratumoral de 3 mg/kg de minaprina disminuye significativamente el crecimiento de tumores (figuras 7A y 7B). Este proceso está asociado con el aumento de la supervivencia de los ratones tratados en comparación con los ratones de control sin tratar (figura 7C), revelando así la capacidad de la inyección intratumoral de minaprina para reducir el crecimiento tumoral.

A continuación, se determina si las inyecciones intraperitoneales de minaprina asimismo podrían afectar al crecimiento del tumor. De este modo, 5 105 células CT26 derivadas de Balb/c se implantaron en ratones Balb/c inmunocompetentes. Después de 12 días, los ratones portadores de tumores se aleatorizaron, se inyectaron intraperitonealmente con control (figuras 7D y 7I) o con minaprina a diferentes concentraciones (figuras 7E-7I). Como se observó con la inyección intratumoral de minaprina, se observa que la inyección intraperitoneal de 1 mg/kg, 3 mg/kg y 10 mg/kg de minaprina disminuyó significativamente el crecimiento de los tumores tratados en comparación con el control (figuras 7D y 7I) o los tumores tratados con 0.3 mg/kg de minaprina (figuras 7E y 7I), lo que indica que la inyección intratumoral de minaprina asimismo afecta al crecimiento del tumor.

En conjunto, estos resultados destacan la capacidad de las inyecciones tanto intratumorales como intraperitoneales de minaprina para reducir el crecimiento tumoral.

Referencias bibliográficas

1 Tobias JS. Clinical practice of radiotherapy. Lancet 1992; 339:159-163.

2 Apetoh L, Ghiringhelli F, Tesniere A et al. The interaction between HMGB1 and TLR4 dictates the outcome of anticancer chemotherapy and radiotherapy. Immunol Rev 2007; 220:47-59.

3 Apetoh L, Ghiringhelli F, Tesniere A et al. Toll-like receptor 4-dependent contribution of the immune system to anticancer chemotherapy and radiotherapy. Nature medicine 2007; 13:1050-1059.

4 Ghiringhelli F, Apetoh L, Tesniere A et al. Activation of the NLRP3 inflammasome in dendritic cells induces IL-1beta-dependent adaptive immunity against tumors. Nature medicine 2009; 15:1170-1178.

5 Michaud M, Martins I, Sukkurwala AQ et al. Autophagy-dependent anticancer immune responses induced by chemotherapeutic agents in mice. Science 2011; 334:1573-1577.

6 Kingsley DP. An interesting case of possible abscopal effect in malignant melanoma. The British journal of radiology 1975; 48:863-866.

7 Ohba K, Omagari K, Nakamura T et al. Abscopal regression of hepatocellular carcinoma after radiotherapy for bone metastasis. Gut 1998; 43:575-577.

8 Postow MA, Callahan MK, Barker CA et al. Immunologic correlates of the abscopal effect in a patient with melanoma. The New England journal of medicine 2012; 366:925-931.

9 Rees GJ, Ross CM. Abscopal regression following radiotherapy for adenocarcinoma. The British journal of radiology 1983; 56:63-66.

10 Demaria S, Ng B, Devitt ML et al. Ionizing radiation inhibition of distant untreated tumors (abscopal effect) is immune mediated. International journal of radiation oncology, biology, physics 2004; 58:862-870.

11 Meng Y, Beckett MA, Liang H et al. Blockade of tumor necrosis factor alpha signaling in tumor-associated macrophages as a radiosensitizing strategy. Cancer research 2010; 70:1534-1543.

12 Dewan MZ, Galloway AE, Kawashima N et al. Fractionated but not single-dose radiotherapy induces an immune-mediated abscopal effect when combined with anti-CTLA-4 antibody. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 2009; 15:5379-5388.

13 Kroemer G, Galluzzi L, Vandenabeele P et al. Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell death and differentiation 2009; 16:3-11.

14 Vanden Berghe T, Vanlangenakker N, Parthoens E et al. Necroptosis, necrosis and secondary necrosis converge on similar cellular disintegration features. Cell death and differentiation 2010; 17:922-930.

15 Aaes TL, Kaczmarek A, Delvaeye T et al. Vaccination with Necroptotic Cancer Cells Induces Efficient Anti­ tumor Immunity. Cell reports 2016; 15:274-287.

16 Overholtzer M, Mailleux AA, Mouneimne G et al. A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell-in-cell invasion. Cell 2007; 131:966-979.

17 Wang S, He MF, Chen YH et al. Rapid reuptake of granzyme B leads to emperitosis: an apoptotic cell-in-cell death of immune killer cells inside tumor cells. Cell death & disease 2013; 4:e856.

18 Brown GC, Neher JJ. Eaten alive! Cell death by primary phagocytosis: 'phagoptosis'. Trends in biochemical Sciences 2012; 37:325-332.

19 Brown GC, Vilalta A, Fricker M. Phagoptosis - Cell Death By Phagocytosis - Plays Central Roles in Physiology, Host Defense and Pathology. Current molecular medicine 2015; 15:842-851.

20 Sierro F, Tay SS, Warren A et al. Suicidal emperipolesis: a process leading to cell-in-cell structures, T cell clearance and immune homeostasis. Current molecular medicine 2015; 15:819-827.

21 Khandelwal S, van Rooijen N, Saxena RK. Reduced expression of CD47 during murine red blood cell (RBC) senescence and its role in RBC clearance from the circulation. Transfusion 2007; 47:1725-1732.

22 Lagasse E, Weissman IL. bcl-2 inhibits apoptosis of neutrophils but not their engulfment by macrophages. The Journal of experimental medicine 1994; 179:1047-1052.

23 Overholtzer M, Brugge JS. The cell biology of cell-in-cell structures. Nat Rev Mol Cell Biol 2008; 9:796-809.

24 Li Y, Sun X, Dey SK. Entosis allows timely elimination of the luminal epithelial barrier for embryo implantation. Cell reports 2015; 11:358-365.

25 Benseler V, Warren A, Vo M et al. Hepatocyte entry leads to degradation of autoreactive CD8 T cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2011; 108:16735-16740.

26 Ni C, Huang L, Chen Y et al. Implication of cell-in-cell structures in the transmission of HIV to epithelial cells. Cell research 2015; 25:1265-1268.

27 Ni C, Chen Y, Zeng M et al. In-cell infection: a novel pathway for Epstein-Barr virus infection mediated by cell-in-cell structures. Cell research 2015; 25:785-800.

28 Bartosh TJ, Ullah M, Zeitouni S, Beaver J, Prockop DJ. Cancer cells enter dormancy after cannibalizing mesenchymal stem/stromal cells (MSCs). Proc Natl Acad Sci U S A 2016; 113:E6447-E6456.

29 Lugini L, Matarrese P, Tinari A et al. Cannibalism of live lymphocytes by human metastatic but not primary melanoma cells. Cancer research 2006; 66:3629-3638.

30 Wang S, Guo Z, Xia P et al. Internalization of NK cells into tumor cells requires ezrin and leads to programmed cell-in-cell death. Cell research 2009; 19:1350-1362.

31 He MF, Wang S, Wang Y, Wang XN. Modeling cell-in-cell structure into its biological significance. Cell death & disease 2013; 4:e630.

32 Sun Q, Cibas ES, Huang H, Hodgson L, Overholtzer M. Induction of entosis by epithelial cadherin expression. Cell research 2014; 24:1288-1298.

33 Cano CE, Sandi MJ, Hamidi T et al. Homotypic cell cannibalism, a cell-death process regulated by the nuclear protein 1, opposes to metastasis in pancreatic cancer. EMBO molecular medicine 2012; 4:964-979.

34 Sun Q, Luo T, Ren Y et al. Competition between human cells by entosis. Cell research 2014; 24:1299-1310.

35 Abend M. Reasons to reconsider the significance of apoptosis for cancer therapy. International journal of radiation biology 2003; 79:927-941.

36 Gudkov AV, Komarova EA. The role of p53 in determining sensitivity to radiotherapy. Nature reviews Cancer 2003; 3:117-129.

37 Zhang P, Castedo M, Tao Y et al. Caspase independence of radio-induced cell death. Oncogene 2006; 25:7758-7770.

38 Castedo M, Perfettini JL, Roumier T, Andreau K, Medema R, Kroemer G. Cell death by mitotic catastrophe: a molecular definition. Oncogene 2004; 23:2825-2837.

39 Garcia-Calvo M, Peterson EP, Leiting B, Ruel R, Nicholson DW, Thornberry NA. Inhibition of human caspases by peptide-based and macromolecular inhibitors. The Journal of biological chemistry 1998; 273:32608-32613.

40 Castedo M, Perfettini JL, Roumier T et al. The cell cycle checkpoint kinase Chk2 is a negative regulator of mitotic catastrophe. Oncogene 2004; 23:4353-4361.

41 Miao EA, Leaf IA, Treuting PM et al. Caspase-1-induced pyroptosis is an innate immune effector mechanism against intracellular bacteria. Nature immunology 2010; 11:1136-1142.

42 Degterev A, Huang Z, Boyce M et al. Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury. Nature chemical biology 2005; 1:112-119.

43 Yamamoto A, Tagawa Y, Yoshimori T, Moriyama Y, Masaki R, Tashiro Y. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell structure and function 1998; 23:33-42.

44 Meijer L, Borgne A, Mulner O et al. Biochemical and cellular effects of roscovitine, a potent and selective inhibitor of the cyclin-dependent kinases cdc2, cdk2 and cdk5. European journal of biochemistry 1997; 243:527-536.

45 Lowe SW, Schmitt EM, Smith SW, Osborne BA, Jacks T. p53 is required for radiation-induced apoptosis in mouse thymocytes. Nature 1993; 362:847-849.

46 Vakifahmetoglu H, Olsson M, Zhivotovsky B. Death through a tragedy: mitotic catastrophe. Cell death and differentiation 2008; 15:1153-1162.

47 Zhang XD, Yang XC, Chung N et al. Robust statistical methods for hit selection in RNA interference highthroughput screening experiments. Pharmacogenomics 2006; 7:299-309.

48 Menger L, Vacchelli E, Adjemian S et al. Cardiac glycosides exert anticancer effects by inducing immunogenic cell death. Science translational medicine 2012; 4:143ra199.

49 Obeid M, Panaretakis T, Joza N et al. Calreticulin exposure is required for the immunogenicity of gammairradiation and UVC light-induced apoptosis. Cell death and differentiation 2007; 14: 1848-1850.

50 Obeid M, Tesniere A, Ghiringhelli F et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature medicine 2007; 13:54-61.

51 Casares N, Pequignot MO, Tesniere A et al. Caspase-dependent immunogenicity of doxorubicin-induced tumor cell death. The Journal of experimental medicine 2005; 202:1691-1701.

52 Green DR, Ferguson T, Zitvogel L, Kroemer G. Immunogenic and tolerogenic cell death. Nat Rev Immunol 2009; 9:353-363.

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Dihidrocloruro de minaprina para la utilización en la prevención o el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita, en el que dicho fármaco no se combina con un tratamiento de radioterapia.

2. Dihidrocloruro de minaprina para la utilización según la reivindicación 1, en el que dicho sujeto padece cáncer de cerebro, cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de próstata, cáncer de colon, linfoma no de Hodgkin, sarcoma, cáncer de testículo, leucemia no linfocítica aguda, o cáncer de mama.

3. Dihidrocloruro de minaprina para la utilización según la reivindicación 1 a 2, en el que dicho dihidrocloruro de minaprina está en forma de una composición farmacéutica inyectable.

4. Dihidrocloruro de minaprina para la utilización según la reivindicación 3, en el que dicho dihidrocloruro de minaprina se administra por vía sistémica o intratumoral.