KR20200141946A - 세포 배양 플레이트, 그 제조 방법 및 물질 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 웰을 2 이상의 구획으로 분할하는 하나 이상의 배리어를 포함하는 하나 이상의 세포 배양 웰(들)을 포함하며; 배리어가 나노피브릴 셀룰로스 하이드로겔을 포함하는, 세포 배양 플레이트, 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 물질 검출 방법에 관한 것이다.

Description

세포 배양 플레이트, 그 제조 방법 및 물질 검출 방법 {CELL CULTURE PLATE, METHOD FOR PREPARING THEREOF AND METHOD FOR DETECTING A SUBSTANCE}
본 출원은 플레이트의 세포 배양 웰을 2 이상의 구획으로 분할하는 나노피브릴 셀룰로스 배리어를 포함하는 세포 배양 플레이트, 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 출원은 물질 검출 방법 및 세포에 대한 물질의 효과를 평가하는 방법에 관한 것이다.
일부 세포 배양 방법에서는 페트리 디쉬 또는 멀티-웰 플레이트의 웰과 같은 세포 배양 영역을 2 이상의 구획으로 분할하는 것이 필요할 수 있다. 영역을 구획으로 분할하기 위해 배리어가 제공될 수 있다. 일부 물질은 배리어를 침투할 수 있지만, 세포는 통과하지 못하는 것이 요망될 수도 있다.
다공성 플라스틱 인서트가 배리어로서 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 인서트는 살아있는 세포에 대해 완전히 친화적일 수 없으며, 구멍을 통한 물질 확산이 최적이 아닐 수 있다. 살아있는 물질에 매우 적합하고, 원하는 확산 특성을 제공하며, 취급하기 용이한 배리어 물질을 입수하는 것이 바람직하다.
본 발명에서는, 나노피브릴 셀룰로스가 세포 배양 용도에서 배리어 특성을 제공하는 이상적인 물질이라는 것을 알게 되었다. 나노피브릴 셀룰로스는 세포가 배리어를 통과하지 못하게 하지만, 더 작은 분자, 심지어 세포외 소낭 (vesicle)은 통과시킨다. 또한, 농도 및 화학적 형태를 조정함으로써 나노피브릴 셀룰로스의 배리어 특성을 조절하는 것도 가능하다.
본 출원인은 웰을 2 이상의 구획으로 분할하기 위해 하나 이상의 배리어를 포함하는 하나 이상의 세포 배양 웰(들)을 포함하며; 배리어가 나노피브릴 셀룰로스 하이드로겔을 포함하는, 세포 배양 플레이트를 제공한다.
또한, 본 발명은,
- 하나 이상의 세포 배양 웰(들)을 포함하는 세포 배양 플레이트를 제공하는 단계,
- 나노피브릴 셀룰로스, 바람직하게는 0.8-2.5% (w/w)의 나노피브릴 셀룰로스를 포함하는 수성 분산물을 제공하는 단계,
- 하나 이상의 세포 배양 웰에서 웰을 2 이상의 구획으로 분할하기 위해 나노피브릴 셀룰로스로부터 하나 이상의 배리어를 형성하는 단계를 포함하는, 세포 배양 플레이트의 제조 방법을 제공한다. 수득되는 세포 배양 플레이트는 본원에 기술된 임의의 세포 배양 플레이트일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 물질 검출 방법을 제공한다:
- 제1 구획에 제1 세포를 포함하는 세포 배양 플레이트를 제공하는 단계, 및
- 다른 구획에서 하나 이상의 물질을 검출하는 단계.
독립항에서 주요 구현예들이 특정된다. 종속항에 다양한 구현예들이 기술된다. 청구항 및 명세서에 언급된 구현예 및 실시예는 명시적으로 달리 언급되지 않은 한 상호 자유롭게 조합 가능하다.
하이드로겔로서 존재하는 나노피브릴 셀룰로스는, 무독성, 생체적합성 또한 생분해성을 갖춘, 친수성 매트릭스를 제공한다. 매트릭스는, 예를 들어, 셀룰라제를 첨가함으로써, 효소적으로 분해할 수 있다. 다른 한편으로, 하이드로겔은 생리학적 조건에서 안정적이며, 부가적인 물질을 이용해 가교하지 않아도 된다. 나노피브릴 셀룰로스 하이드로겔의 투과성 등의 특성을 나노피브릴 셀룰로스의 화학적 특성 및/또는 물리적 특성을 조정함으로써 조절할 수 있다.
나노피브릴 셀룰로스를 포함하는 하이드로겔의 일부 유익한 특성으로는 유연성, 탄성 및 리몰더빌리티 (remouldability)를 포함한다. 하이드로겔은 물을 다량 함유하므로, 분자 투과성이 우수하다. 본 구현예의 하이드로겔은 높은 수분 보유력 및 분자 확산성 속도 (molecule diffusion property speed)를 제공한다.
본원에 기술된 나노피브릴 셀룰로스 하이드로겔은 나노피브릴 셀룰로스를 포함하는 물질이 살아있는 물질 (living matter)과 접촉하는 의료 및 과학 용도로 이용가능하다. 본원에 기술된 나노피브릴 셀룰로스를 포함하는 생산물은 살아있는 물질에 대한 생체적합성이 우수하고, 몇가지 유익한 효과를 제공한다. 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 매우 높은 비표면적, 즉 높은 수 보유력을 가진 고 친수성 나노피브릴 셀룰로스를 포함하는 하이드로겔은, 세포에 적용되었을 경우, 나노피브릴 셀룰로스를 포함하는 하이드로겔과 세포들 간에 유익한 촉촉한 환경을 제공해준다. 나노피브릴 셀룰로스의 많은 유리 하이드록시 기는, 나노피브릴 셀룰로스와 수 분자들 간에 수소 결합을 형성하여, 겔 형성 및 나노피브릴 셀룰로스의 높은 수 보유력을 가능하게 할 수 있다. 나노피브릴 셀룰로스 하이드로겔은 물을 다량 함유하고 있으며, 또한 유체 및/또는 물질의 이동을 가능케 할 수 있다.
나노피브릴 셀룰로스는 세포에 대해 매트릭스로서 사용되어, 세포를 보호하고 세포의 생존성을 유지하는데 도움이 되는 환경을 제공할 수 있다. 나노피브릴 셀룰로스 물질의 한가지 이점은, 셀룰로스 나노섬유의 피브릴 네트워크의 차원이 콜라겐 나노섬유의 천연 ECM 네트워크에 매우 가깝다는 것이다. 또한, 셀룰로스 나노섬유는 비-동물성 물질이어서, 질환 전달 위험이 없다. 본 발명의 물질을 사용해, 세포에 대해 투명한 다공성 매트릭스를 수득할 수 있으며, 이 물질은 대안제들 보다 취급이 용이하다. 셀룰로스 나노섬유는 형광 백그라운드 (fluorescence background)가 매우 약하다. 셀룰로스 나노섬유 하이드로겔은 또한 3D 및 2D 세포 보관 또는 배양 매트릭스로서 사용하기에 최적인 탄성, 강도, 전단 응력, 기계적 부착성 (mechanical adhesion) 및 다공성을 가진다.
나노피브릴 셀룰로스 하이드로겔 배리어는 세포가 배리어 통과하지 못하게 할 수 있지만, 더 작은 물질의 이동은 허용할 수 있으므로, 다양한 세포 평가 방법에 이용할 수 있다. 한가지 이상의 세포 타입을 자체 구획에서 분리할 수 있으며, 구획으로 제공된 및/또는 세포에 의해 분비된 하나 이상의 물질(들)을 동일 구획에서 또는 배리어 뒤편의 다른 구획에서 조사할 수 있다. 이런 방식으로, 세포와의 직접 접촉을 없앨 수 있다. 예를 들어, 제1 세포에 의해 분비된 대사산물과 같은 물질에 의해 제2 세포에 제공되는 효과 또는 물질을 연구하는 것도 가능하다. 세포가 서로 다른 구획에 있을 경우, 서로 물리적으로 분리되어 있어, 직접 상호작용하는, 즉 물리적으로 접촉하는 세포 효과를 없앨 수 있다. 따라서, 의료 및 과학 연구에서 이용가능한 생산물을 입수할 수 있다.
나노피브릴 셀룰로스는 통상적인 셀룰로스와 다른 특이적인 나노스케일의 물질이므로, 통상적인 생산물과 다른 특성을 나타내는 재료 및 생산물을 제조할 수 있다. 이러한 생산물은 하이드로겔 물질을 원하는 형태로 출력할 수 있는 디바이스, 예를 들어 적층 가공 (additive manufacturing), 즉 3D 인쇄를 이용하는 디바이스를 사용해 제조할 수 있다.
도 1은 48웰 플레이트에서 직선 벽 형상의 배리어를 도시한 것이다.
도 2는 6웰 플레이트에서 원 형상의 배리어를 도시한 것이다. 상단 배리어는 1.5% GrowDex, lot 11878로 구축된 것이고, 하단 배리어는 0.65% GrowDex, lot 11898로 구축된 것이다. 색은 세포 배양 배지에서 기원한 것이다.
도 3은 GrowDex 배리어로 분할된 웰에서의 0.2% 트리판 블루의 분포를 도시한 것이다.
도 4는 웰 A1 및 B1에 구축된 1.5% GrowDex 배리어, 웰 A3 및 웰 B3에 구축된 0.65% GrowDex 배리어를 도시한 것이다.
도 5는 1.5% GrowDex 배리어 쪽으로의 NR8383 세포의 이동을 보여주는 100x 배율의 사진이다. 적색 화살 표시는 배리어를 가리킨다. 검정색 화살 표시는 세포가 적용된 배리어의 안쪽 (no GrowDex)을 가리킨다.
도 6은 400x 배율도이다. 좌: 1.5% GrowDex 배리어 쪽으로 이동하는 NR8383 세포. 우: GrowDex 배리어 내 NR8383 세포.
도 7은 0.65% GrowDex 배리어 쪽으로의 NR8383 세포의 이동을 보여주는 사진이다. 검정색 화살 표시는 세포가 적용된 배리어의 안쪽을 가리킨다 (GrowDex에 세포가 부착되지 않음). 우측 화살표는 배리어를 가리킨다.
도 8은 100x 배율도이다. 좌: 0.65% GrowDex 배리어 안쪽의 NR8383 세포. 검정색 화살 표시는 세포가 적용된 배리어의 안쪽을 가리킨다 (GrowDex에 세포가 부착되지 않음). 우: 0.65% GrowDex 배리어 내 NR8383 세포.
도 9는 0.65% GrowDex 배리어 바깥쪽의 NR8383 세포 (청색 화살 표시)를 보여주는 100x 배율의 사진이다. 적색 화살 표시는 배리어를 가리킨다.
도 10은 인간 BJ 섬유모세포의 생존성에 대한 셀레길린 (selegiline) 및 파라세타몰 (paracetamol)의 효과를 나타낸 것이다.
도 11은 나노피브릴 셀룰로스 배리어를 사용해 웰을 동일한 크기의 2개의 구획으로 분할하는 개략적인 예를 나타낸 것이다.
도 12는 bright GrowDex를 사용해 만들 배리어를 도시한 것이다. 우측 3개의 컬럼에서 "분홍색" 배리어는 2.0% GrowDex이다. 좌측 컬럼에서 2개의 "분홍색" 배리어는 ~1.7-1.9% GrowDex이다. 분홍색 매질이 없는 웰 2개 (좌측 상단)는 ~1.5% GrowDex이다.
도 13은 배리어 좌측에서 촬영된 HepaRG 세포 (좌)와 배리어의 우측에서 촬영된 BJ 섬유모세포 (우)를 나타낸 것이다.
도 14는 GrowDex 배리어에 의해 2개의 구획으로 분할된 (24웰 플레이트) 웰의 멀티포인트 흡광 측정 결과를 나타낸 것이다. HepaRG 세포는 배리어의 좌측에, BJ 섬유모세포는 배리어의 우측에 존재한다.
도 15는 24웰 플레이트에서 갓 제작된 GrowDex 배리어를 나타낸 것이다.
도 16은 24웰 플레이트에서 갓 제작된 GrowDex 배리어를 나타낸 것이다.
도 17은 24웰 플레이트에서 갓 제작된 GrowDex 배리어를 나타낸 것이다.
도 18은 인간 BJ 섬유모세포의 생존성에 대한 파라세타몰 직접 노출 효과 또는 HepaRG-컨디셔닝화된 (HepaRG-conditioned) 파라세타몰 노출 효과를 나타낸 것이다. 각각의 막대는 평균±SEM, N=12 (대조군), N=18 (500 ㎍/ml 파라세타몰)이다. 통계학적 차이 (statistical difference)는 t-검정 (SigmaPlot)으로 조사하였다.
도 19는 1.5% GrowDex (A, B) 및 2.0% GrowDexT (C)를 사용하여 인쇄된 울퉁불퉁한 배리어 구조체를 나타낸 것이다.
도 20은 멀티-웰 플레이트 (하단 도)로 옮기기 전 필름 위에 수행된 1차 3D-인쇄 (상단 도) 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 여러가지 비히클에서의 배리어 구조체의 안정성을 나타낸 것이다: (좌에서 우측 방향으로): 1% CaCl2 1 hr, 1% CaCl2 밤새, MEM 밤새, 및 밤새 건조 처리 후 2% CaCl2 첨가.
도 22는 여러가지로 코팅 (및 비-코팅) 처리하고 여러가지 비히클 (A, B) 내에서 유지된 웰 내 1.5% GrowDex 배리어를 도시한 것이다. 피브리노겐-코팅된 웰과 비-코팅 웰에 구축된 배리어는, 플레이트를 45° 기울였을 때 아래로 미끌어졌다. 폴리-D-라이신 및 젤라틴 위의 배리어는 플레이트에 부착된 채 유지되었다 (C).
도 23은 여러가지 코팅 위에 구축되고 여러가지 비히클 내에서 유지되는 2.0% GrowDexT 배리어를 도시한 것이다.
도 24는 플레이트에서 2.0% GrowDexT (상단 사진) 및 1.5% GrowDex (하단 사진)로부터 구축된 배리어를 나타낸 것이다. 인쇄 프로토콜 및 인쇄 자체는 성공적이었다.
도 25는 24웰 플레이트 상에 2.0% GrowDexT (상단 사진) 및 1.5% GrowDex (하단 사진)로부터 구축된 배리어를 나타낸 것이다.
도 26은 화합물에 24시간 노출 및 2.5시간 WST-1과의 인큐베이션을 수행한 후, 12웰 플레이트의 450 nm 흡광도 측정 결과를 나타낸 것이다. 도 26a는 1.5% GrowDex 배리어이고, 도 26b는 2.0% GrowDex 배리어이다.
도 27은 화합물에 24시간 노출 및 2.5시간 WST-1과의 인큐베이션을 수행한 후, 12웰 플레이트의 450 nm 흡광도 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 28은 화합물에 24시간 노출 및 2.5시간 WST-1과의 인큐베이션을 수행한 후, 12웰 플레이트의 450 nm 흡광도 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 29는 BJ 세포 접종 및 노출하기 전 (상단 사진)과, 노출 및 WST-1 시약 첨가를 수행한 이후 (하단 사진)의, 1.5% GrowDex 배리어를 나타낸 것이다.
도 30은 24시간 화합물 노출 및 2시간 WST-1 인큐베이션을 수행한 후, 12웰 플레이트의 450 nm 흡광도 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 31은 블랭크: MEM 중의 1.5% GrowDex 배리어 (우측) 및 PBS 중의 1.5% GrowDex 배리어 (좌측)의 450 nm 흡광도 측정 결과를 나타낸 것이다.
본 명세서에서, 명시적으로 달리 언급되지 않은 한, 퍼센트 값은 중량 (w/w)을 기준으로 한다. 임의의 수치 범위가 제시된다면, 범위는 더 높은 값 및 더 낮은 값을 포함한다. 열린 의미의 용어인 "포함한다"는 한가지 옵션으로서 "로 구성되는"이라는 닫힌 의미의 용어도 포괄한다.
본원에서 언급되는 재료 및 생산물은 생명 과학 재료 및 생산물과 같은 의료용 및/또는 과학 재료 및 생산물일 수 있으며, 본원에 기술된 바와 같은 생활성 재료 또는 물질 및/또는 살아있는 세포가 참여하는 방법 및 용도에 이용될 수 있다. 재료 또는 생산물은 세포 배양, 세포 보관 및/또는 세포 실험 재료 또는 생산물일 수 있거나 또는 이와 관련 있을 수 있으며, 세포를 배양, 보관, 유지, 수송, 제공, 변형, 검사 및/또는 의료 또는 과학적 목적으로 사용할 수 있는 방법, 또는 기타 관련 방법 및 이용가능한 방법에 사용될 수 있다.
본원은 하나 이상의 세포 배양 웰(들)을 포함하는 세포 배양 플레이트를 제공한다. 세포 배양 플레이트는, 웰 또는 상응하는 구조와 같이 세포를 수용하기 위한 하나 이상의 특정 영역을 포함하는, 임의의 적절한 세포 배양 플레이트 또는 지지체일 수 있다. 세포 배양 플레이트의 일 예는 간단히 세포 배양 디쉬로도 지칭되는 페트리 디쉬이며, 이것은 일반적으로 세포 배양 영역을 둘러싼, 즉 웰을 형성하는 돌출형 에지 (protruding edge)를 가진 둥근 디쉬이다. 세포 배양 플레이트의 다른 예는 마이크로플레이트, 멀티플레이트, 마이크로타이터 플레이트, 마이크로웰 플레이트 또는 멀티-웰로도 지칭되는 멀티-웰 플레이트로서, 이는 예를 들어 2:3의 사각형 매트릭스로 정렬될 수 있는, 샘플 웰 6, 12, 24, 48, 96 또는 384개 등의 복수개의 웰을 가진, 평평한 플레이트이다. 웰 하나는 수십 nL에서 수 mL의 액체 및/또는 기타 이용가능한 물질을 수용할 수 있다. 세포 배양 플레이트에는, 예를 들어 인큐베이션 또는 세포 배양 중에 기체 교환을 허용하는, 느슨한 탈착식 (loose removable) 뚜껑이 장착될 수 있다.
세포 배양 플레이트는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 제조될 수 있다. 대부분의 광학 검출 마이크로플레이트에 사용되는 폴리스티렌이 가장 일반적이지만, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 사이클로-올레핀 및 기타 열가소성 또는 열경화성 폴리머도 사용될 수 있다. 재료는 바람직하게는 육안으로 또는 플레이트를 광학적으로 판독하기 위한 특수 장치, 특히 멀티-웰 플레이트를 이용해 웰을 가시적으로 검경할 수 있도록 투명하다.
하나 이상의 웰은 웰을 적어도 2개의 구획으로 분할하기 위한 하나 이상의 배리어를 포함하며, 배리어는 나노피브릴 셀룰로스 하이드로겔을 포함한다. 구획(들)은 바람직하게는 세포, 액체, 겔, 현탁물, 분산물 및/또는 기타를 수용하도록 설계된다. 하나 이상의 구획은 세포를 수용하도록 설계되며, 이는 구획에 세포를 적용하거나, 인큐베이션하거나 및/또는 배양할 수 있음을 의미할 수 있다. 세포, 세포 현탁물, 액체 또는 기타를 수용할 수 있는 구획의 크기 또는 체적은 배리어의 높이, 및 배리어 및 선택적으로 기타 배리어 구조, 예를 들어 웰 벽에 의해 정의되는 면적에 의해 규정되며, 인큐베이션, 배양, 검사 등의 활동과 같은 본원에 기술된 활동을 수행하는데 적합하다.
배리어 특성, 예를 들어, 특정 물질, 세포 소기관 또는 세포의 투과성을 제어 및 조정하기 위해, 나노피브릴 셀룰로스를 특정 퍼센트로 및/또는 특정 화학적 형태로 제공하는 것이 필수적일 수 있다. 또한, 다른 물질 또는 첨가제를 포함하거나, 또는 배리어 구조를 특정 형태로 형성하는 것도 가능하다. 나노피브릴 셀룰로스는 배리어 내 유일한 유기, 폴리머 또는 셀룰로스 물질일 수 있다. 그러나, 일부 예에서, 기타 다당류 예를 들어 알기네이트, 전분, 글리코겐, 비-피브릴화 (non-fibrillated) 셀룰로스 등과 같은, 기타 보강 폴리머 또는 기타 유기 물질 또는 화합물이, 배리어의 건조물 (dry substance)의 1-50% (w/w)의 함량으로, 예를 들어, 1-20% (w/w) 또는 1-10% (w/w)의 함량으로 포함될 수도 있다.
나노피브릴 셀룰로스는 화학적으로 변형되거나 또는 화학적으로 비-변형될 수 있다. 일 구현예에서, 나노피브릴 셀룰로스는 비-변형된 나노피브릴 셀룰로스, 음이온성으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스 (anionically modified nanofibrillar cellulose) 및 산화된 나노피브릴 셀룰로스 (oxidized nanofibrillar cellulose), 예를 들어 TEMPO 산화된 나노피브릴 셀룰로스로부터 선택된다. 나노피브릴 셀룰로스는 또한 효소적으로 변형될 수도 있다. 바람직한 나노피브릴 셀룰로스 형태에 대한 예로는 음이온성으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스 및 화학적으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스, 바람직하게는 목재 셀룰로스 (wood cellulose)로부터 수득되는 음이온성으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스 및 화학적으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스 등이 있다.
배리어 내 나노피브릴 셀룰로스의 농도는 조정할 수 있으며, 0.8-3.0% (w/w) 범위일 수 있다. 일 구현예에서, 나노피브릴 셀룰로스 하이드로겔은 나노피브릴 셀룰로스를 0.8-2.5% (w/w)로 포함한다. 일 구현예에서, 나노피브릴 셀룰로스 하이드로겔은 나노피브릴 셀룰로스를 0.8-2.1% (w/w)로 포함한다. 검사에서, 나노피브릴 셀룰로스 농도 1.0-2.1% (w/w), 예를 들어 1.4-2.1% (w/w) 또는 1.5-2.0% (w/w)가 대부분의 경우에 사용하기 바람직한 것으로 확인되었다. 이러한 농도는, 배리어가 자체 모양 및 형태를 유지시키게 하며, 또한 배리어를 통한 대상 물질의 이동을 허용하게 해준다. 배리어 내 나노피브릴 셀룰로스의 농도는 출발 물질 내 나노피브릴 셀룰로스 농도와 동일할 수 있지만, 사용될 준비가 된, 생성되는 배리어, 특히 최종 배리어 내 농도가, 예를 들어 건조, 취급 또는 기타 이유로 인해, 더 높을 수도 있다.
나노피브릴 셀룰로스는, 물질이 유변학적 특성 및/또는 피브릴 또는 피브릴 번들의 직경에 의해 특정될 수 있는, 적합한 피브릴화도 (fibrillation degree)로 제공될 수 있다. 일 구현예에서, 나노피브릴 셀룰로스는, 물에 분산시, 20℃±1℃, 컨시스턴시 (consistency) 0.8% (w/w) 및 10 rpm에서 측정하였을 때, 적어도 3000 mPaㆍs, 예를 들어 적어도 10000 mPaㆍs와 같은 적어도 2000 mPaㆍs의 브록필드 점도 (Brookfield viscosity)를 나타낸다. 일 구현예에서, 나노피브릴 셀룰로스는, 물에 분산시, 수성 매질 내 컨시스턴시 0.5% (w/w) 및 22℃±1℃에서 회전 레오미터에 의해 측정하였을 때, 3-15 Pa 범위와 같은 1-50 Pa 범위의 항복 응력 (yield stress)과, 5000-50000 Paㆍs 범위와 같은 1000-100000 Paㆍs 범위의 제로 전단 점도 (zero shear viscosity)를 나타낸다. 나노피브릴 셀룰로스는 1-200 nm 범위와 같이 200 nm 이하의 평균 피브릴 직경 (average fibril diameter)을 가질 수 있다. 본원에서, "피브릴"은 피브릴 번들을 포함할 수 있다. 이러한 피브릴화도가 높은 나노피브릴 셀룰로스를 이용함으로써 배리어의 형성을 용이하게 할 수 있으며, 또한 배리어의 내구성을 구현할 수 있다. 높은 피브릴화도는 또한 특이적인 투과성 특성과 하이드로겔과 세포 간의 상호작용에 영향을 미친다. 피브릴화도를 특정하는 그외 적합한 유변학적 특성 및 기타 특징들이 본원에 기술된다.
하나 이상의 접착 물질(들)을 포함함으로써 세포 배양 플레이트의 표면에의 나노피브릴 셀룰로스 겔의 부착을 강화하는 것도 가능하다. 세포 배양 플레이트 또는 웰의 표면을 이러한 접착 물질(들)로 코팅하거나 또는 이로 처리하거나, 또는 나노피브릴 셀룰로스 상에 접착 물질(들)을 적용하거나, 또는 나노피브릴 셀룰로스와 혼합할 수 있다.
일 구현예에서, 세포 배양 플레이트는 세포 배양 플레이트와 나노피브릴 셀룰로스 하이드로겔 사이에 접착 물질을 포함한다. 접착 물질은, 예를 들어, 콜라겐계 접착 물질, 피브리노겐계 접착 물질, 젤라틴계 접착 물질 또는 라이신계 접착 물질, 예를 들어, 이의 폴리머일 수 있다. 검사에서, 폴리-D-라이신 및 젤라틴, 또는 이를 포함하는 접착 물질이 특히 효과적인 것으로 확인되었다.
배리어는 직선형으로 또는 실질적으로 직선형으로 (도 11, 12, 15, 16, 17), 또는 하나 이상의 만곡을 가진 곡선 형태로 만들어질 수 있으며, 이들 선이 세포 배양 웰을 2 이상의 구획으로 분할한다. 이 경우, 선은 웰 벽의 한 지점으로부터 시작하여, 웰 벽의 다른 지점에서 끝날 수 있다. 그러나, 이 경우, 배리어가 웰과 만나는 지점에서 배리어 누출 (barrier leak)이 발생할 위험이 있을 수 있다.
이러한 위험 또는 문제를 해결하기 위해, 배리어는 세포 배양 웰의 표면 상에 하나 이상의 영역을 정의하는 형태로 형성될 수 있으며, 즉, 나노피브릴 셀룰로스 배리어 단독으로 영역의 배리어를 형성하고, 영역을 규정한다. 영역이 하나의 구획을 형성할 수 있으며, 다른 구획은 규정된 영역의 바깥쪽을 형성할 수 있다. 배리어는, 예를 들어, 원형, 난형, 사각형, 삼각형, 다각형 또는 하나 이상의 영역을 둘러싼 기타 형태, 예를 들어 울퉁불퉁한 원형, 난형, 사각형, 삼각형, 다각형 등의 형태로 존재할 수 있다. 용어 "원형"은 본원에서 일반적으로 원-유사 형태 (circle-like form) 또는 닫힌 형태 또는 배리어로서 지칭될 수 있는 임의의 이러한 형태를 지칭할 수 있거나, 또는 원형은 기타 형태로 대체될 수 있다. 원-유사 배리어의 예는 도 2 및 19-25에 도시된다. 일 구현예에서, 하나 이상의 배리어는 세포 배양 웰 상에서 하나 이상의 영역을 둘러싼다. 이러한 배리어는 웰 벽과 접촉하지 않는 방식으로 세포 배양 웰 상에 위치할 수 있으며, 배리어는 균일하고 어떠한 불연속 지점을 포함하지 않으므로, 특히 벽과 연결되지 않아, 누출 문제를 해소시킬 수 있다. 이 경우, 예를 들어 도 2에 나타낸 바와 같이, 배리어는 하나의 영역을 둘러싼 배리어 안쪽 구획을 형성하고, 배리어 바깥쪽은 다른 구획을 형성하며, 다른 구획은 세포 배양 웰의 벽으로 둘러싸인다.
배리어는 웰의 바닥부로부터 돌출되거나 또는 올라가, 따라서 배리어 벽의 높이 및 두께를 가진다. 배리어의 높이는 배리어에 의해 규정된 구획(들) 안에 세포, 액체 및 기타 물질을 수용하기에 충분한 높이를 가져야 한다. 웰의 바닥 표면으로부터 측정되는 배리어의 높이는 적어도 50 ㎛, 적어도 100 ㎛, 적어도 200 ㎛, 적어도 500 ㎛, 또는 바람직하게는 적어도 1 mm, 적어도 2 mm 또는 적어도 3 mm, 예를 들어 0.5-6 mm, 0.5-5 mm, 0.5-3 mm, 1-5 mm, 2-5 mm, 1-4 또는 1-3 mm일 수 있다. 배리어의 높이와 배리어에 의해 규정되는 영역 (구획의 면적)은 일반적으로 구획의 유용 또는 이용가능한 체적을 정의한다. 그러나, 구획이 겔 또는 비슷한 점성 물질 또는 표면 장력이 높은 물질로 채워진다면, 구획으로부터 물질이 넘치지 않도록 구획의 체적 보다 더 적은 양을 적용하는 것이 가능할 수 있다. 구획의 체적은, 예를 들어, 50-5000 ㎕ 범위일 수 있으며, 이는 일반적으로 웰의 크기 (또한 플레이트의 웰의 개수)에 따라 결정된다. 예를 들어, 24웰 플레이트의 경우, 구획의 체적은 50-300 ㎕ 범위, 예를 들어 50-200 ㎕일 수 있다. 검사에서, 고리와 같은 배리아의 안쪽에는 더 작은 체적, 약 50 ㎕가 형성되었으며, 배리어의 바깥쪽에는 더 큰 체적, 약 200 ㎕가 형성되었다. 하지만, 구획들의 체적은 동일하거나 또는 실질적으로 동일할 수 있다.
웰 상에 적용하였을 때, 배리어의 벽 두께, 즉 수직 배리어의 두께는 예를 들어 0.5-1.5 mm와 같이 0.5-2 mm 범위일 수 있다. 0.5 mm 미만의 벽 두께는 내구성이 없을 수 있으며, 붕괴될 수 있다. 한편, 벽 두께가 너무 두꺼우면, 벽을 통한 원하는 물질의 이동을 불필요하게 지연시키거나 또는 심지어 방해할 수 있다.
액체, 겔, 현탁물, 분산물 또는 기타 적용가능한 형태로 존재할 수 있는 세포 및/또는 기타 물질을 하나 이상의 구획(들) 안에 적용할 수 있다. 먼저, 구획들을 비울 수 있으며, 즉 구획에는 어떠한 물질이 수용되어 있지 않거나 및/또는 충전되어 있지 않거나, 또는 액체, 예를 들어 세포 배양 배지 또는 기타 매질로 일부 또는 가득 채워질 수 있다. 하나 이상의 구획(들)은 또한 나노피브릴 셀룰로스 하이드로겔, 아가 겔 또는 기타 적합한 겔과 같은 겔로 채워질 수 있으며, 겔은 하이드로겔일 수 있으며, 세포를 수용하도록 배치될 수 있으며, 배리어와 비교해 다른 컨시스턴시 (consistency), 농도 및/또는 조성, 예를 들어 더 낮은 농도를 가질 수 있으며, 바람직하게는 배리어에 접촉된다. 구획 내 겔의 농도는 예를 들어 1.5% (w/w) 미만, 1.2% (w/w) 미만, 1% (w/w) 미만, 0.8% (w/w) 미만, 0.7% 미만 (w/w), 0.6% (w/w) 미만 또는 0.5% (w/w) 미만일 수 있다. 나노피브릴 셀룰로스 하이드로겔은 세포 배양 물질로서, 예를 들어 2% (w/w) 이하, 바람직하게는 1% (w/w) 이하, 또는 0.8% (w/w) 이하, 또는 0.7% (w/w) 이하의 컨시스턴시로 사용될 수 있다. 세포는 더 낮은 컨시스턴시의 하이드로겔에서 배양할 수 있으며, 배리어가 더 높은 컨시스턴시를 가지므로, 세포는 배리어로 진입할 수 없다. 세포 배양 겔에서, 세포의 배양을 뒷받침하는 조건 등의 여러가지 조건을 제공하는 것이 가능하며, 조건은 배리어에서의 조건과 상이하다. 하나 이상의 구획 내 나노피브릴 셀룰로스 하이드로겔과 배리어를 포함하는 세포 배양 플레이트는 제품으로서 제공될 수 있다. 또한, 하나 이상의 구획 내에 이미 세포를 포함하는 것도 가능하며, 이러한 제품을 세포 시스템으로 칭할 수 있다.
이러한 겔에 세포가 공급될 수 있으며, 세포-함유 겔은 구획 안에 적용된다. 대안적으로, 세포없이 겔만 구획 안에 적용되고, 이후 구획 안의 겔에 세포를 적용할 수 있다. 세포를 수용하도록 설계된 겔은, 예를 들어, 파이펫, 시린지 또는 유사 어플리케이터를 사용해 세포를 적용하기에 충분하게 희석할 수 있으며, 선택적으로, 적용된 세포는 겔에 잘 분산되도록 겔과 혼합될 수 있다. 따라서, 여러가지 제품, 세포를 함유한 제품 또는 세포 결핍 제품이 제조 및/또는 공급될 수 있다.
일 구현예에서, 하나 이상의 구획(들)은, 배리어와 비교해, 0.7% (w/w) 이하, 예를 들어 0.2-0.7% (w/w) 또는 0.2-0.5% (w/w) 농도와 같이, 나노피브릴 셀룰로스 농도가 더 낮은 나노피브릴 셀룰로스 하이드로겔을 포함한다. 이러한 나노피브릴 셀룰로스는 화학적으로 변형되거나 또는 화학적으로 변형되지 않을 수 있다. 일 예로, 이는 산화된 나노피브릴 셀룰로스와 같이 음이온성으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스이다.
본원은 또한 본원에 기술된 세포 배양 플레이트의 제조 방법을 제공한다. 본원에 기술된 바와 같이, 하나 이상의 세포 배양 웰(들)을 포함하는 세포 배양 플레이트가 제공된다. 나노피브릴 셀룰로스는, 예를 들어, 나노피브릴 셀룰로스를 0.8-2.5% (w/w)로 포함하는 수성 분산물로서 및/또는 하이드로겔 형태로 제공된다. 본 방법은 또한 서로 다른 컨시스턴시를 가진 나노피브릴 셀룰로스 또는 건조된 나노피브릴 셀룰로스로부터 수성 분산물을 제조하는 것을 포함할 수 있다. 그 후, 본 방법은 웰을 2 이상의 구획으로 분할하기 위해 하나 이상의 세포 배양 웰 상에 하나 이상의 배리어를 나노피브릴 셀룰로스로부터 형성하는 것을 포함한다. 나노피브릴 셀룰로스 하이드로겔은 노즐, 시린지, 니들, 파이펫 또는 하이드로겔을 분출 (outputting) 또는 공급하기 위한 유사 수단을 사용함으로써 적용할 수 있으며, 적용된 하이드로겔은 바람직하게는 원하는 구조 및/또는 형태를 가진 배리어로 형성될 수 있다. 배리어는 수동으로, 또는 하나 이상의 제조 디바이스(들), 장치(들), 기계(들), 몰드(등) 등의 기구를 사용해 구축할 수 있다. 제조 디바이스는 컴퓨터 제어될 수 있으며, 컴퓨터 운영시 원하는 배리어 구조를 형성하기 위한 컴퓨터-판독가능한 지침과 함께 제공될 수 있다. 예를 들어, 배리어의 형태 또는 형상은 컴퓨터-이용 설계 (computer-aided design, CAD) 프로그램 등과 같은 컴퓨터 프로그램을 사용해 설계할 수 있으며, 배리어 구조를 제조하기 지침은 프로그램으로부터 출력된다.
일 구현예에서, 세포 배양 플레이트의 제조 방법은, 하나 이상의 배리어를 형성 또는 적용하는 등과 같이 제공하기 전에, 하나 이상의 세포 배양 웰(들), 바람직하게는 웰의 바닥부를 접착 물질로 코팅 또는 처리하는 것을 포함한다. 웰과 배리어 사이에 접착제를 적용할 수 있다. 이는 배리어가 세포 웰, 특히 웰의 바닥부에 부착하는 것을 보조할 수 있을뿐 아니라 필요한 경우 웰의 벽에 부착하는 것을 도울 수 있다. 이러한 접착 층이 없으면, 특히 세포 배양 플레이트를 움직이거나, 예를 들어 기울였을 때, 배리어가 웰 안에서 움직일 수 있거나 또는 분리될 수 있다. 적절한 접착제가 적용되는 경우, 이송 및/또는 포장과 같은 취급시 안전한 제품이 만들어진다.
접착 물질은 임의의 적합한 상용적인 접착 물질, 바람직하게는 유기 및/또는 생물 제제, 통상적으로 콜라겐계, 피브리노겐계, 젤라틴계 또는 라이신계 접착 물질과 같은 폴리머 물질일 수 있다. 검사에서 확인된 바람직한 접착 물질은 폴리-D-라이신 및 젤라틴이었다.
또한, 나노피브릴 셀룰로스의 균질성 (homogeneity)이 유용한 배리어를 형성하는데 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 배리어 구조에서 심지어 일부 울퉁불퉁한 영역 또는 층이 전체 구조를 망칠 수 있다. 따라서, 물질을 3D 인쇄와 같은 최종 사용에 공급하기 전에 균질화 단계를 제공함으로써, 나노피브릴 셀룰로스 물질을 제조하는 것이 필수적일 수 있다. 균질화 단계는 비-피브릴화 균질화 (non-fibrillating homogenization), 리파이닝 (refining), 분산 (dispersing) 또는 기타 처리 단계일 수 있으며, 이는 바람직하게는 셀롤로스를 나노피브릴 셀룰로스로 분해 (피브릴화)한 이후에 수행된다. 따라서, 방법의 일 구현예에서, 이러한 비-피브릴화 균질화 단계로부터 나노피브릴 셀룰로스를 수득한다.
보관 유체 또는 매질과 같은 적절한 액체 및/또는 완충제 용액, 예를 들어, 예를 들어 칼슘 클로라이드, 소듐 클로라이드와 같은 클로라이드 염 또는 기타 염을, 예를 들어 1-2% (w/w)로 및 선택적으로 완충제, 보존제(들) 및/또는 기타 물질(들) 중 하나 이상을 함유한 액체를, 완충화된 염수 또는 세포 배양 배지, 예를 들어, PDS 또는 MEM과 같이, 보관성을 높이기 위해, 배리어를 함유한 웰에 적용할 수 있다. 배리어 구조는 상기한 액체 중에 개별 제품으로서 보관 및 공급될 수 있다. 액체는 사용 전에 세포 배양 배지와 같은 다른 액체로 교체될 수 있다.
나노피브릴 셀룰로스
배리어를 형성하기 위한 출발 물질은 나노셀룰로스로도 지칭되는 나노피브릴 셀룰로스이며, 이는 단리된 셀룰로스 피브릴 또는 셀룰로스 원 재료로부터 유래되는 피브릴 번들을 지칭한다. 나노피브릴 셀룰로스는 자연계에 풍부한 천연 폴리머를 기반으로 한다. 나노피브릴 셀룰로스는 수중에서 점성의 하이드로겔을 형성할 수 있는 능력을 가지고 있다. 나노피브릴 셀룰로스 제조 기술은 펄프 섬유 (pulp fiber)의 수성 분산물을 분쇄 (grinding)하여 나노피브릴화된 셀룰로스를 수득하는 등의, 섬유 원료 물질의 분해 (disintegrating) 공정을 기반으로 할 수 있다. 분쇄 또는 균질화 과정 후, 수득되는 나노피브릴 셀룰로스 물질은 점탄성의 하이드로겔 희석물이다.
수득되는 물질은 통상적으로 분해 조건으로 인해 수중에 균질하게 분산된 상대적으로 저 농도로 존재한다. 출발 물질은 0.2-10% (w/w), 예를 들어 0.2-5% (w/w) 농도의 수성 겔일 수 있다. 나노피브릴 셀룰로스는 섬유 원료 물질의 분해를 통해 직접 수득할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 나노피브릴 셀룰로스 하이드로겔의 일 예는 UPM 사의 GrowDex®이다.
나노피브릴 셀룰로스는, 이의 나노 크기의 구조로 인해, 통상적인 셀룰로스에 의해 제공될 수 없는 기능성을 발휘할 수 있는 고유한 특성들을 가진다. 그러나, 나노 크기 구조로 인해, 나노피브릴 셀룰로스는 또한 고 난이도 물질이다. 예를 들어, 나노피브릴 셀룰로스의 탈수 (dewatering) 또는 취급이 어려울 수 있다.
나노피브릴 셀룰로스는 식물 기원의 셀룰로스 원료 물질로부터 제조하거나, 또는 특정 박테리아 발효 공정으로부터 유래될 수 있다. 나노피브릴 셀룰로스는 바람직하게는 식물 물질로 제조된다. 원료 물질은 셀룰로스를 함유한 임의의 식물 물질을 기반으로 할 수 있다. 일 예로, 피브릴은 비-실질 식물 물질로부터 수득된다. 이 경우, 피브릴은 2차 세포벽으로부터 수득할 수 있다. 이러한 셀룰로스 피브릴이 풍부한 한가지 소스는 나무 섬유 (wood fibre)이다. 나노피브릴 셀룰로스는 화학 펄프 (chemical pulp)일 수 있는 나무-유래 섬유 원료 물질을 균질화함으로써 제조할 수 있다. 셀룰로스 섬유를 분해하여, 평균 직경이 불과 수 나노미터인 피브릴을 제조하며, 이는 대부분의 경우 200 nm 이하일 수 있으며, 피브릴 수 분산물이 수득된다. 이차 세포벽으로부터 기원하는 피브릴은 기본적으로 55% 이상의 결정화도를 가진 결정질이다. 이러한 피브릴은 일차 세포벽으로부터 기원한 피브릴과는 다른 특성을 가질 수 있으며, 예를 들어 이차 세포벽으로부터 기원한 피브릴은 탈수하기가 더 어려울 수 있다. 일반적으로, 사탕무, 감자 덩이줄기 및 바나나 꽃대와 같이 일차 세포벽으로부터 기원하는 셀룰로스 소스의 경우, 나무 유래 피브릴 보다 섬유 매트릭스 (fibre matrix)로부터 마이크로피브릴을 분리하기 더 쉬우며, 분해하는데 소모되는 에너지가 더 적게 든다. 그러나, 이들 물질은 여전히 다소 혼성형 (heterogeneous)이며, 거대 피브릴 번들로 구성된다.
비-나무 재료는 농업 잔존물 (agricultural residues), 풀 또는 기타 식물 물질, 예를 들어, 목화, 옥수수, 밀, 귀리, 호밀, 보리, 벼, 아마, 삼, 마닐라삼, 사이잘삼, 황마, 모시풀 (ramie), 케나프 (kenaf), 바가스, 대나무 또는 갈대 (reed)로부터 유래되는 짚, 잎, 수피, 종자, 외피 (hull), 꽃, 채소 (vegetables) 또는 열매로부터 유래할 수 있다. 셀룰로스 원료 물질은, 또한 셀룰로스-생산 미생물로부터 유래할 수도 있다. 미생물은 아세토박터 (Acetobacter), 아그로박테리움 (Agrobacterium), 리조븀 (Rhizobium), 슈도모나스 (Pseudomonas) 또는 알칼리게네스 (Alcaligenes) 속의 것일 수 있으며, 바람직하게는 아세토박터 속, 더 바람직하게는 아세토박터 크실리누모르 (Acetobacter xylinumor) 또는 아세토박터 파스테리아누스 (Acetobacter pasteurianus) 종일 수 있다.
목재 셀룰로스로부터 수득된 나노피브릴 셀룰로스는 본원에 기술된 의료 또는 과학 생산물에 바람직한 것으로 밝혀졌다. 목재 셀룰로스는 다양하게 이용가능하며, 목재 셀룰로스에 대해 개발된 제조 방법으로 제품에 적합한 나노피브릴 물질을 생산할 수 있다. 식물 섬유, 특히 나무 섬유의 피브릴화에 의해 수득되는 나노피브릴 셀룰로스는 미생물로부터 수득되는 나노피브릴 셀룰로스와 구조적으로 다르며, 서로 다른 특성을 가진다. 예를 들어, 박테리아 셀룰로스와 비교해, 나노피브릴화된 목재 셀룰로스는 균질하고 더욱 다공성이며, 느슨한 물질이며, 이는 살아있는 세포를 수반하는 용도에 유용하다. 박테리아 셀룰로스는 일반적으로 식물 셀룰로스에서와 비슷한 피브릴화 없이 그대로 사용되며, 이 물질은 이런 측면에서 상이하다. 박테리아 셀룰로스는 작은 스페로이드를 쉽게 형성하는 농축된 물질이며, 따라서 물질의 구조가 불연속적이고, 이 물질은 살아있는 세포와 관련한 용도로, 특히 물질의 균질성이 요구되는 경우에 사용하기 적절하지 않다.
나무는 가문비나무, 소나무, 전나무, 낙엽송, 더글러스-퍼 (douglas-fir) 또는 솔송나무 (hemlock)와 같은 침엽수 (softwood tree), 또는 자작나무, 백양 (aspen), 포플러, 앨더 (alder), 유칼립투스, 참나무, 너도밤나무 또는 아카시아와 같은 활엽수로부터 유래할 수 있거나, 또는 침엽수와 활엽수의 혼합물로부터 유래할 수 있다. 일 예에서, 나노피브릴 셀룰로스는 목재 펄프로부터 수득한다. 나노피브릴 셀룰로스는 활엽수 펄프로부터 수득할 수 있다. 일 예에서, 활엽수는 자작나무이다. 나노피브릴 셀룰로스는 침엽수 펄프로부터 수득할 수 있다. 일 예에서, 목재 펄프는 화학 펄프 (chemical pulp)이다. 화학 펄프는 본원에 기술된 생산물에 바람직할 수 있다. 화학 펄프는 순수한 물질이며, 매우 다양한 용도로 사용할 수 있다. 예를 들어, 화학 펄프에는 기계 펄프 (mechanical pulp)에 존재하는 피치 (pitch) 및 수지산 (resin acid)이 없으며, 더욱 무균성 (sterile)이거나 또는 쉽게 살균 처리가 가능하다. 나아가, 화학 펄프는 보다 유연하며, 예를 들어 의료 및 과학 재료에 유익한 특성을 제공한다. 예를 들어, 매우 균질한 나노피브릴 셀룰로스 물질은 과도한 가공없이 또는 특수 장치나 노동 집약적인 가공 단계 없이 제조할 수 있다.
셀룰로스 피브릴 및/또는 피브릴 번들을 비롯한 나노피브릴 셀룰로스는 높은 종횡비 (길이/직경)를 특징으로 한다. 나노피브릴 셀룰로스의 평균 길이 (피브릴 또는 피브릴 번들과 같은 입자의 길이 중앙값)는 1 ㎛를 초과할 수 있으며, 대부분의 경우 50 ㎛ 이하이다. 엘리멘터리 피브릴 (elementary fibril)들이 서로 완전히 분리되어 있지 않다면, 엉켜있는 피브릴 (entangled fibril)은 평균 총 길이가 예를 들어 1-100 ㎛, 1-50 ㎛ 또는 1-20 ㎛ 범위일 수 있다. 그러나, 나노피브릴 물질이 고도로 피브릴화된다면, 엘리멘터리 피브릴들은 완전히 또는 거의 완전히 분리될 수 있으며, 평균 피브릴 길이는 1-10 ㎛ 또는 1-5 ㎛와 같이 더 짧다. 이는 특히 예를 들어 화학적으로, 효소적으로 또는 기계적으로 단축 또는 분해 처리되지 않은 천연 등급의 피브릴에 특히 해당된다. 그러나, 현저하게 유도체화된 나노피브릴 셀룰로스는 0.3-50 ㎛, 0.3-20 ㎛, 예를 들어 0.5-10 ㎛ 또는 1-10 ㎛ 범위와 같이 더 짧은 평균 피브릴 길이를 가질 수 있다. 특히 효소적으로 또는 화학적으로 분해 처리된 피브릴 또는 기계적으로 처리된 물질과 같이 단축화된 피브릴은 0.1-1 ㎛, 0.2-0.8 ㎛ 또는 0.4-0.6 ㎛과 같이 1 ㎛ 미만의 평균 피브릴 길이를 가질 수 있다. 피브릴 길이 및/또는 직경은 현미경 분석으로, 예를 들어 CRYO-TEM, SEM 또는 AFM 이미지를 이용해 추정할 수 있다.
나노피브릴 셀룰로스의 평균 직경 (너비)은 1-500 nm 범위와 같이 1 ㎛ 미만 또는 500 nm 이하이며, 바람직하게는 200 nm 이하, 심지어 100 nm 이하 또는 50 nm 이하, 예를 들어 1-200 nm, 2-200 nm, 2-100 nm 또는 2-50 nm 범위이며, 고도로 피브릴화된 물질의 경우 심지어 2-20 nm이다. 본원에 언급된 직경은 피브릴 및/또는 피브릴 번들을 지칭할 수 있다. 가장 작은 피브릴은 엘리멘터리 피브릴 크기이며, 평균 직경은 전형적으로 2-12 nm 범위이다. 피브릴의 치수 및 크기 분포는 리파이닝 방법 및 효율에 따라 결정된다. 고도로 리파이닝된 천연 나노피브릴 셀룰로스의 경우, 피브릴 번들을 비롯하여, 평균 피브릴 직경이 2-200 nm 또는 5-100 nm 범위, 예를 들어 10-50 nm 범위일 수 있다. 나노피브릴 셀룰로스는 높은 비표면적과 강력한 수소 결합력을 특징으로 한다. 수 분산물에서, 나노피브릴 셀룰로스는 전형적으로 연한 또는 흐린 겔-유사 물질로 나타난다. 섬유 원료 물질에 따라, 식물, 특히 나무로부터 수득되는 나노피브릴 셀룰로스는 또한 헤미셀룰로스 또는 리그닌과 같은 기타 식물 성분, 특히 나무 성분을 소량 함유할 수 있다. 함량은 식물 소스에 따라 결정된다.
일반적으로, 셀룰로스 나노물질은 셀롤로스 나노물질에 대한 표준 용어를 제시하는 TAPPI W13021에 따른 카테고리로 분류할 수 있다. 이들 물질들이 모두 나노피브릴 셀룰로스인 것은 아니다. 주 카테고리 2종은 "나노 물체 (Nano objects)"와 "나노 구조 물질 (Nano structured material)"이다. 나노 구조 물질은 직경이 10-12 ㎛이고 길이:직경의 비가 (L/D) <2인 "셀룰로스 미세결정" (때때로 CMC로 지칭됨)과, 직경이 10-100 nm이고 길이가 0.5-50 ㎛인 "셀룰로스 마이크로피브릴"을 포함한다. 나노 물체는, 직경이 3-10 nm이고 L/D가 >5인 "셀룰로스 나노결정" (CNC)과 직경이 5-30 nm이고 L/D가 >50인 "셀룰로스 나노피브릴" (CNF 또는 NFC)로 분류될 수 있는, "셀룰로스 나노섬유"를 포함한다.
여러가지 등급의 나노피브릴 셀룰로스는 3가지 주요 특성에 따라 분류할 수 있다: (i) 크기 분포, 길이 및 직경, (ii) 화학적 조성, 및 (iii) 유변학적 특성. 등급을 충분히 기술하기 위해, 특성들을 동시에 사용할 수 있다. 여러가지 등급의 예로는 천연 (또는 화학적으로 비-변형된) NFC, 산화된 NFC (고 점성), 산화된 NFC (저 점성), 카르복시메틸화된 NFC 및 양이온성화된 NFC 등이 있다. 이러한 주 등급들에서, 또한 하위-등급이, 예를 들어 고도로 피브릴화된 것 대비 중간 수준으로 피브릴화된 것, 고 치환도 대 저 치환도, 저 점성 대 고 점성 등이 존재한다. 피브릴화 기법과 화학적 예비-변형이 피브릴 크기 분포에 영향을 미친다. 전형적으로, 비-이온성 등급은 더 넓은 평균 피브릴 직경 (예, 10-100 nm 또는 10-50 nm 범위)을 가지는 반면, 화학적으로 변형된 등급은 더 좁다 (lot thinner)(예, 2-20 nm 범위). 변형된 등급 역시 분포 범위가 더 좁다. 특정 변형, 특히 TEMPO-산화로 더 짧은 피브릴이 수득된다.
원료 소스에 따라, 예를 들어 활엽수 펄프 대 침엽수 펄프에 따라, 최종 나노피브릴 셀룰로스 생산물에는 서로 다른 다당류 조성이 존재하게 된다. 통상적으로, 비-이온성 등급은 표백 처리된 자작나무 펄프 (bleached birch pulp)로부터 제조되며, 크실렌 함량이 높게 (25 중량%) 수득된다. 변형된 등급은 침엽수 또는 활엽수 펄프로부터 제조된다. 이러한 변형된 등급의 경우, 셀룰로스 도메인과 더불어 헤미셀룰로스도 변형된다. 거의 아마도, 변형은 균질하지 않으며, 즉 일부분은 다른 것보다 더 변형된다. 따라서, 변형된 산물은 여러가지 다당류 구조들로 된 복합적인 혼합물이므로, 상세한 화학적인 분석이 일반적으로 가능하지 않다.
수성 환경에서, 셀룰로스 나노섬유 분산물은 점탄성 하이드로겔 네트워크를 형성한다. 이 겔은 분산 및 수화된 엉켜있는 피브릴에 의해 예를 들어 0.05-0.2% (w/w)의 비교적 낮은 농도에서도 이미 형성된다. NFC 하이드로겔의 점탄성은 예를 들어 동적 진동 유변학적 측정 (dyna-mic oscillatory rheological measurements)으로 특정화할 수 있다.
나노피브릴 셀룰로스 하이드로겔은 특징적인 유변학적 특성을 나타낸다. 예를 들어, 이는 전단-박화 (shear-thinning) 또는 유사가소성 (pseudoplastic) 물질이며, 요변성 거동의 특수 사례로서 간주될 수 있는데, 이는 이의 점성이 물질이 변형되는 속도 (또는 힘)에 의해 좌우되는 것을 의미한다. 회전 레오미터에 의해 점성을 측정할 경우, 전단-박화 거동은 전달 속도 증가에 따라 점성이 감소하는 것으로 보인다. 하이드로겔은 소성 거동을 나타내는데, 이는 물질이 쉽게 흐르기 시작하기 전에 특정 전단 응력 (힘)이 필요하다는 것을 의미한다. 이러한 임계 전단 응력을 종종 항복 응력이라 한다. 항복 응력은 응력 조절 레오미터를 사용해 측정된 정지상 유도 곡선 (steady state flow curve)으로부터 결정할 수 있다. 점성을 적용된 전단 응력의 함수로서 그래프로 작성하였을 때, 임계 전단 응력을 넘어선 다음 점성이 급격하게 감소하는 것으로 관찰된다. 제로 전단 점도와 항복 응력은 물질의 현탁 분말 (suspending power)을 설명하기 위한 가장 중요한 유변학적 파라미터이다. 이들 2가지 파라미터는 매우 명확하게 서로 다른 등급을 구분하므로, 등급을 분류할 수 있다.
피브릴 또는 피브릴 번들의 치수는, 예를 들어, 원료 물질, 분해 방법 및 분해 횟수에 따라 결정된다. 셀룰로스 원료 물질의 기계적 분해는 리파이너 (refiner), 분쇄기, 분산기 (disperser), 호모게나이저, 콜라이더 (colloider), 마찰 분쇄기 (friction grinder), 핀 밀 (pin mill), 로터-로터 분산기 (rotor-rotor dispergator), 초음파 발생기 (ultrasound sonicator), 마이크로유화기 (microfluidizer), 마크로유화기 (macrofluidizer) 또는 유화기-타입의 호모게나이저와 같은 유화기 (fluidizer) 등의 임의의 적절한 장치를 사용해 수행할 수 있다. 분해 처리는 섬유들 간의 결합을 방지하기 위해 물이 충분히 존재하는 조건에서 수행된다.
일 예에서, 분해는 하나 이상의 로터, 블레이드 또는 비슷하게 움직이는 기계 부품을 가진 분산기, 예를 들어 2 이상의 로터를 가진 로터-로터 분산기를 사용해 수행한다. 분산기에서, 분산물 내 섬유 물질은, 블레이드가 회전 속도로, 그리고 반대 방향으로 반경 (회전 축까지의 거리)에 의해 결정되는 주변 속도 (peripheral speed)로 회전할 때, 반대 방향으로부터 이를 타격하는 로터의 리브 (rib) 또는 블레이드에 의해 반복적으로 충격을 받게 된다. 섬유 물질은 반경 방향으로 바깥쪽으로 이동하므로, 블레이드의 넓은 표면, 즉 리브에 충돌해, 반대 방향으로부터 높은 주변 속도로 차례대로 오게 되며; 다시 말해, 반대 방향으로부터 연속적인 충격을 수차례 받게 된다. 또한, 블레이드의 넓은 표면, 즉 리브의 에지에서, 에지는 다음 로터 블레이드의 맞은편 에지와 블레이드 갭을 형성하며, 전단력이 발생되어, 섬유 분해 및 피브릴의 탈착에 기여하게 된다. 충격 횟수는 로터의 회전 속도, 로터의 개수, 각 로터의 블레이드 개수 및 디바이스 전체에서의 분산물의 유속에 의해 결정된다.
로터-로터 분산기 (rotor-rotor dispergator)에서, 섬유 물질은, 물질이 여러가지 역-회전 로터의 작용에 의해 전단력 및 충격력에 반복적으로 노출되면서 동시에 피브릴화되는 방식으로, 로터의 회전 축에 대해 반경 방향으로 바깥쪽으로 역-회전 로터를 통해 도입된다. 로터-로터 분산기의 일 예는 Atrex 디바이스이다.
적합한 분해용 디바이스에 대한 다른 예는 다중-주변 핀 밀 (multi-peripheral pin mill)과 같은 핀 밀이다. 이러한 디바이스의 일 예는 하우징과 내부에 충돌 표면이 구비된 제1 로터; 제1 로터와 반대 반향으로 회전하게 배치되며, 제1 로터와 중심이 동일하고 충돌 표면이 구비된 제2 로터; 또는 제1 로터와 중심이 동일하며 충돌 표면이 구비된 스테이터 (stator)를 포함한다. 디바이스는 로터들 또는 로터 및 스테이터의 센터에의 개구부 및 하우징 내 공급 오리피스와 로터들 또는 로터의 센터에의 개구부, 그리고 최외측 로터 또는 스테이터의 주변부에의 개구부 및 하우징 벽부 상에 배출 오리피스를 포함한다.
일 예에서, 분해는 호모게나이저를 사용해 수행된다. 호모게나이저에서, 섬유 물질은 압력 작용에 의해 균질화를 거치게 된다. 섬유 물질 분산물에서 나노피브릴 셀룰로스로의 균질화는 분산물의 강제된 스루-플로우 (forced through-flow)에 의해 유발되며, 그래서 섬유 물질이 피브릴로 분해된다. 섬유 물질 분산물은 좁은 스루-플로우 갭을 통해 소정의 압력 하에 통과하게 되며, 이곳에서 분산물의 선형적인 속도 증가로 인해 분산물에 전단력과 충격력이 가해져, 섬유 물질로부터 피브릴의 해리 (removal)가 이루어진다. 섬유 단편들은 피브릴화 단계에서 피브릴로 분해된다.
본원에서, 용어 "피브릴화"는 일반적으로 입자에 적용되는 작업에 의해 기계적으로 섬유 물질을 분해하여, 셀룰로스 피브릴이 섬유 또는 섬유 단편들로부터 분리되는 것을 의미한다. 이러한 작업은 분쇄, 파쇄 또는 전단 및 이들의 조합, 또는 입자의 크기를 줄이는 다른 상응하는 작동과 같은 다양한 작용을 기반으로 할 수 있다. "분해" 또는 "분해 처리"라는 표현은 "피브릴화"와 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
피브릴화를 거친 섬유 물질 분산물은 섬유 물질과 물의 혼합물이며, 본원에서 "펄프"로도 지칭된다. 섬유 물질 분산물은 일반적으로 홀 섬유 (whole fiber), 이로부터 분리된 일부분 (단편), 피브릴 번들 또는 피브릴과 물의 혼합물을 지칭할 수 있으며, 전형적으로 섬유 물질 수성 분산물은 이들 성분들의 혼합물이며, 성분 비는 가공도 (degree of processing) 또는 처리 단계, 예를 들어, 동일 배치의 섬유 물질의 운영 (run) 또는 "통과 (pass)" 횟수에 따라 결정된다.
나노피브릴 셀룰로스를 특징짓는 한가지 방식은 나노피브릴 셀룰로스를 함유한 수용액의 점도를 이용하는 것이다. 점도는 예를 들어 브록필드 점도 또는 제로 전단 점도일 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 비점도는 나노피브릴 셀룰로스를 비-나노피브릴 셀룰로스와 구분한다.
일 예에서, 나노피브릴 셀룰로스의 겉보기 점도는 브록필드 점도계 (브록필드 점도) 또는 상응하는 다른 장치를 사용해 측정한다. 적합하게는, 베인 스핀 (vane spindle) (number 73)를 사용한다. 모두 동일한 원리에 기초한, 겉보기 점도를 측정하기 위한 시판 브록필드 점도계가 수종 있다. 적합하게는, 장치에 RVDV 스프링 (Brookfield RVDV-III)을 사용한다. 나노피브릴 셀룰로스 샘플을 물에 0.8 중량% 농도로 희석하여, 10분간 혼합한다. 희석한 샘플을 250 ml 비이커에 넣고, 온도를 20℃±1℃로 조정하고, 필요에 따라 가열하고, 혼합한다. 낮은 회전 속도 10 rpm을 적용한다. 일반적으로, 브록필드 점도는 20℃±1℃, 컨시스턴시 0.8% (w/w) 및 10 rpm에서 측정할 수 있다.
나노피브릴 셀룰로스, 예를 들어 본 방법에서 출발 물질로서 제공되는 나노피브릴 셀룰로스는, 수용액에 제공되는 점도로 특정될 수 있다. 점도는, 예를 들어, 나노피브릴 셀룰로스의 피브릴화도를 나타낸다. 일 예에서, 나노피브릴 셀룰로스는, 물에 분산시, 20℃±1℃, 컨시스턴시 0.8% (w/w) 및 10 rpm에서 측정하였을 때, 적어도 3000 mPaㆍs과 같이 적어도 2000 mPaㆍs의 브록필드 점도를 제공한다. 일 예에서, 나노피브릴 셀룰로스는, 물에 분산시, 20℃±1℃, 컨시스턴시 0.8% (w/w) 및 10 rpm에서 측정하였을 때, 적어도 10000 mPaㆍs의 브록필드 점도를 제공한다. 일 예에서, 나노피브릴 셀룰로스는, 물에 분산시, 20℃±1℃, 컨시스턴시 0.8% (w/w) 및 10 rpm에서 측정하였을 때, 적어도 15000 mPaㆍs의 브록필드 점도를 제공한다. 물에 분산시, 나노피브릴 셀룰로스의 브록필드 점도 범위의 예는, 20℃±1℃, 컨시스턴시 0.8% (w/w) 및 10 rpm에서 측정하였을 때, 2000-20000 mPaㆍs, 3000-20000 mPaㆍs, 10000-20000 mPaㆍs, 15000-20000 mPaㆍs, 2000-25000 mPaㆍs, 3000-25000 mPaㆍs, 10000-25000 mPaㆍs, 15000-25000 mPaㆍs, 2000-30000 mPaㆍs, 3000-30000 mPaㆍs, 10000-30000 mPaㆍs, 및 15000-30000 mPaㆍs를 포함한다.
나노피브릴 셀룰로스는 또한 평균 직경 (또는 너비) 또는 브록필드 점도 또는 제로 전단 점도와 같은 점도와 함께 평균 직경으로 특정될 수 있다. 일 예에서, 본원에 기술된 생산물에 사용가능한 나노피브릴 셀룰로스는 1-200 nm 또는 1-100 nm 범위의 평균 피브릴 직경을 가진다. 일 예에서, 나노피브릴 셀룰로스의 평균 피브릴 직경은 1-50 nm, 예를 들어 2-20 nm 또는 5-30 nm이다. 일 예에서, 나노피브릴 셀룰로스의 평균 피브릴 직경은 TEMPO 산화된 나노피브릴 셀룰로스의 경우에서와 같이 2-15 nm 범위이다.
피브릴의 직경은 현미경 검경과 같은 몇가지 기법으로 측정할 수 있다. 피브릴 두께 및 너비 분포는 전계 방출 주사 전자 현미경 (FE-SEM), 투과 전자 현미경 (TEM), 예를 들어 극저온 투과 전자 현미경 (cryo-TEM), 또는 원자력 현미경 (AFM)으로부터 수득한 이미지를 이미지 분석함으로써, 측정할 수 있다. 일반적으로, AFM 및 TEM이 피브릴 직경 분포 범위가 좁은 나노피브릴 셀룰로스 등급에 가장 적합하다.
나노피브릴 셀룰로스 분산물의 레오미터 점도는, 30 mm 직경의 실린더형 샘플 컵 안에 좁은 갭 베인 구조 (직경 28 mm, 길이 42 mm)가 설치된 응력 조절형 회전 레오미터 (AR-G2, TA Instruments, UK)를 사용해 22℃에서 측정할 수 있다. 샘플을 레오미터에 로딩한 후, 5분간 휴지기를 둔 후 측정을 개시한다. (인가된 토크에 비례하여) 전단 응력을 점진적으로 높이면서 정상 상태 점도를 측정하고, (각속도에 비례하여) 전단 속도를 측정한다. 특정 전단 응력에서 기록하는 점도 (=전단 응력/전단 속도)는, 일정한 전단 속도에 도달한 후 또는 최대 2분 후, 기록한다. 전단 속도 1000 s- 1를 초과하면, 측정을 중단한다. 이 방법은 제로-전단 점도를 측정하기 위해 사용할 수 있다.
일 예에서, 예를 들어, 본 방법에 출발 물질로서 제공되는 나노피브릴 셀룰로스는, 물에 분산시, 수성 매질 중의 컨시스턴시 0.5% (w/w) 및 22℃±1℃에서 회전 레오미터에 의해 측정하였을 때, 1000-100000 Paㆍs, 예컨대 5000-50000 Paㆍs 범위의 제로 전단 점도 (약한 전단 응력 적용시, 일정한 점도의 "안정 상태 (plateau)"), 및 1-50 Pa, 예컨대 3-15 Pa 범위의 항복 응력 (전단 박화 개시시의 전단 응력)을 제공한다. 이러한 나노피브릴 셀룰로스는 또한 200 nm 이하, 예컨대 1-200 nm 범위의 평균 피브릴 직경을 가질 수 있다.
탁도는 일반적으로 육안으로 보이지 않는 개별 입자 (현탁 또는 용해된 전체 고체)에 의해 발생되는 유체의 흐림도 (cloudiness) 또는 탁한 정도 (haziness)이다. 탁도를 측정하는 실무적인 방식들이 몇가지 있으며, 가장 직접적인 방식은 샘플의 물 기둥을 통과함에 따른 빛의 감소 (즉, 세기 저하)를 측정하는 것이다. 대안적으로 사용되는 Jackson Candle 방법 (단위: 잭슨 탁도 단위 또는 JTU)은 기본적으로 물 기둥을 통해 보이는 양초 불꽃을 완전히 가리는데 필요한 물 기둥의 길이의 역수 (inverse measure)이다.
탁도는 광학 탁도를 측정하는 장치를 사용해 정량적으로 측정할 수 있다. 탁도를 정량적으로 측정하는데 사용가능한 상업적인 탁도계가 여러개 있다. 본 경우에는, 네펠로법 (nephelometry)에 기반한 방법을 이용한다. 보정된 네펠로미터의 탁도 단위를 네펠로미터 탁도 단위 (NTU)라 한다. 측정 장치 (탁도계)를 보정하고, 표준 보정 샘플로 조정한 다음 NFC 희석 샘플의 탁도를 측정한다.
한가지 탁도 측정 방법에서, 나노피브릴 셀룰로스 샘플을 물에 나노피브릴 셀룰로스의 겔화점 미만의 농도로 희석하고, 희석 샘플의 탁도를 측정한다. 나노피브릴 셀룰로스 샘플의 탁도 측정 농도는 0.1%이다. 탁도 측정에 50 ml 측정 용기가 구비된 HACH P2100 탁도계를 사용한다. 나노피브릴 셀룰로스 샘플의 건물량 (dry matter)을 측정하고, 건물량으로 계산된 샘플 0.5 g을 측정 용기에 로딩하고, 여기에 수돗물을 500 g까지 충진한 후 약 30초간 셰이킹에 의해 왕성하게 혼합한다. 지연없이, 수성 혼합물을 측정 용기 5개로 나누어 담아 이를 탁도계에 장착한다. 각 용기에 대해 3번씩 측정한다. 수득한 결과들로부터 평균값 및 표준 편차를 계산하고, 최종 결과를 NTU 단위로 나타낸다.
나노피브릴 셀룰로스를 특정하는 한가지 방법은 점도와 탁도를 모두 정의하는 것이다. 작은 피브릴은 빛 산란도가 낮기 때문에, 낮은 탁도는 작은 크기의 피브릴, 예를 들어 작은 직경의 피브릴을 의미한다. 일반적으로, 피브릴화도가 높을 수록, 점도는 증가하고, 동시에 탁도는 감소한다. 이 현상은 특정 지점까지 발생한다. 피브릴화가 더욱 계속되면, 피브릴은 최종적으로 부서지기 시작해 더 이상 강한 네트워크를 형성할 수 없다. 따라서, 그 시점 이후에는, 탁도와 점도 둘다 감소하기 시작한다.
일 예에서, 음이온성 나노피브릴 셀룰로스의 탁도는, 수성 매질 중에 컨시스턴시 0.1% (w/w)에서, 네펠로법에 의해 측정하였을 때, 90 NTU 이하, 예를 들어 3-90 NTU, 예를 들어 5-60 NTU, 예를 들어 8-40 NTU이다. 일 예로, 네이티브 (native) 나노피브릴의 탁도는, 20℃±1℃에서, 수성 매질 중의 컨시스턴시 0.1% (w/w)에서, 네펠로법에 의해 측정하였을 때, 심지어 200 NTU 이상, 예를 들어 10-220 NTU, 예를 들어 20-200 NTU, 예를 들어 50-200 NTU일 수 있다. 나노피브릴 셀룰로스를 특정하기 위해, 이들 범위는, 물에 분산시, 20℃±1℃, 컨시스턴시 0.8% (w/w) 및 10 rpm에서 측정하였을 때, 적어도 2000 mPaㆍs, 적어도 3000 mPaㆍs, 적어도 5000 mPaㆍs, 예를 들어 적어도 10000 mPaㆍs, 예를 들어 적어도 15000 mPaㆍs의 브록필드 점도를 제공하는 나노피브릴 셀룰로스와 같이, 나노피브릴 셀룰로스의 점도 범위와 조합될 수 있다.
나노피브릴 셀룰로스는 비-변형된 나노피브릴 셀룰로스이거나 또는 이를 포함할 수 있다. 비-변형된 나노피브릴 셀룰로스의 배수성 (drainage)은, 예를 들어 음이온성 등급의 것과 비교해 현저하게 더 빠르다. 비-변형된 나노피브릴 셀룰로스는 일반적으로 20℃±1℃, 컨시스턴시 0.8% (w/w) 및 10 rpm에서 측정하였을 때 2000-10000 mPaㆍs 범위의 브록필드 점도를 가진다. 바람직하게는, 나노피브릴 셀룰로스는, 전기전도도 적정 (conductometric titration)에 의한 측정시, 0.6-1.4 mmol COOH/g 범위, 예를 들어 0.7-1.2 mmol COOH/g 범위, 또는 0.7-1.0 mmol COOH/g 또는 0.8-1.2 mmol COOH/g 범위와 같이, 적절한 카르복시산 함량을 가진다.
분해된 셀룰로스 섬유 원료 물질은 변형된 섬유 원료 물질일 수 있다. 변형된 섬유 원료 물질은 섬유가 처리에 의해 영향을 받아 셀룰로스 나노피브릴이 섬유로부터 더 쉽게 해리되는 원료 물질을 의미한다. 변형은 일반적으로 액체 중의 현탁물로서 존재하는 셀룰로스 섬유 원료 물질, 즉, 펄프에 대해 수행된다.
섬유에 대한 변형 처리는 화학적, 효소적 또는 물리적일 수 있다. 화학적 변형의 경우, 셀룰로스 분자의 화학 구조가 화학 반응 (셀룰로스의 "유도체화")에 의해 달라지며, 바람직하게는 셀룰로스 분자의 길이에는 변화가 없지만 폴리머의 β-D-글루코피라노스 유닛에 관능기가 부가된다. 셀룰로스의 화학적 변형은, 반응제의 양 및 반응 조건에 따라 결정되는 특정 변환 수준에서 이루어지며, 원칙적으로 완전하지 않아, 셀룰로스는 피브릴로서 고체 형태로 유지될 것이고 물에 용해되지 않는다. 물리적인 변형에서는, 음이온성, 양이온성 또는 비-이온성 물질 또는 이들의 임의 조합이 셀룰로스 표면에 물리적으로 흡착된다.
섬유의 셀룰로스는 특히 변형 후 이온성으로 하전될 수 있다. 셀룰로스의 이온 전하는 섬유의 내부 결합을 약화시키고, 향후 나노피브릴 셀룰로스로의 분해를 촉진할 것이다. 이온 전하는 셀룰로스의 화학적 또는 물리적 변형에 의해 달성될 수 있다. 섬유는 변형 후 출발 원료 물질과 비교해 더 높은 음이온성 또는 양이온성 전하를 띠게 될 수 있다. 음이온 전하를 생성하기 위해 가장 널리 사용되는 화학적 변형법은 하이드록시 기가 알데하이드와 카르복시기로 산화되는 산화, 설폰화 및 카르복시메틸화이다. 나노피브릴 셀룰로스와 생활성 분자 간에 공유 결합을 형성하는데 참여할 수 있는 카르복시 기와 같은 기를 도입하는 화학적 변형이 바람직할 수 있다. 이후 4급 암모늄 기와 같은 양이온성 기를 셀룰로스에 부착함으로써 양이온화 (cationization)에 의해 양이온성 전하를 화학적으로 구축할 수 있다.
나노피브릴 셀룰로스는 음이온성으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스 또는 양이온성으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스와 같은 화학적으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스를 포함할 수 있다. 일 예에서, 나노피브릴 셀룰로스는 음이온성으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스를 포함한다. 일 예에서, 음이온성으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스는 산화된 나노피브릴 셀룰로스이다. 일 예에서, 음이온성으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스는 설폰화된 나노피브릴 셀룰로스이다. 일 예에서, 음이온성으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스는 카르복시메틸화된 나노피브릴 셀룰로스이다. 셀룰로스를 음이온성으로 변형하여 수득되는 물질을 음이온성 셀룰로스로 지칭할 수 있으며, 이는 카르복시 기와 같은 음이온성 기의 함량 또는 비율이 변형에 의해 비-변형된 물질에 비해 증가된 물질을 지칭한다. 또한, 카르복시 기 대신 또는 아울러, 포스페이트 기 또는 설페이트 기와 같은 다른 음이온성 기를 셀룰로스에 도입하는 것도 가능하다. 이들 기의 함량은 본원에 카르복시산에 대해 기술된 바와 동일한 범위일 수 있다.
셀룰로스는 산화될 수 있다. 셀룰로스 산화에서, 셀룰로스의 일차 하이드록시 기는, N-옥실 매개 촉매 산화를 통해서와 같이, 헤테로사이클릭 니트록실 화합물, 예를 들어 일반적으로 "TEMPO"로 지칭되는 2,2,6,6-테트라메틸피페리디닐-1-옥시 유리 라디칼에 의해, 촉매적으로 산화될 수 있다. 셀룰로스의 β-D-글루코피라노스 유닛의 일차 하이드록시 기 (C6-하이드록시 기)는 카르복시 기로 선택적으로 산화된다. 일차 하이드록시 기로부터 일부 알데하이드 기도 형성된다. 낮은 산화도는 효과적인 충분한 피브릴화를 허용하지 않고 높은 산화도가 기계적 파괴 처리 후 셀룰로스의 열화 (degradation)를 유발한다는 발견과 관련하여, 셀룰로스는 산화된 셀룰로스의 카르복시산 함량이 전기전도도 적정에 의한 측정에서 0.5-2.0 mmol COOH/(펄프) g, 0.6-1.4 mmol COOH/ (펄프) g 또는 0.8-1.2 mmol COOH / (펄프) g, 바람직하게는 1.0-1.2 mmol COOH/ (펄프) g 범위의 수준으로 산화될 수 있다. 이렇게 수득되는 산화된 셀룰로스의 섬유를 수중에 분해할 경우, 예를 들어 3-5 nm 너비일 수 있는 개별화된 (individualized) 셀룰로스 피브릴로 된 안정적인 투명한 분산물이 수득된다. 출발 물질로서 산화된 펄프를 사용하여, 컨시스턴시 0.8% (w/w)에서 측정되는 브록필드 점도가 적어도 10000 mPaㆍs, 예를 들어 10000-30000 mPaㆍs 범위인, 나노피브릴 셀룰로스를 수득할 수 있다.
촉매 "TEMPO"가 본원에 언급된 도처에서, "TEMPO"가 참여하는 모든 측정 및 조작이, TEMPO의 임의 유도체 또는 셀룰로스에서 C6 탄소의 하이드록시 기의 산화를 선택적으로 촉매할 수 있는 임의의 헤테로사이클릭 니트록실 라디칼에 동등하고 유사하게 적용됨은 자명한 일이다.
본원에 기술된 나노피브릴 셀룰로스의 변형은 본원에 기술된 다른 피브릴 셀룰로스 등급에도 적용될 수 있다. 예를 들어, 또한 고도로 라파이닝된 셀룰로스 또는 마이크로피브릴 셀룰로스도 마찬가지로 화학적으로 또는 효소적으로 변형될 수 있다. 그러나, 예를 들어, 물질의 최종 피브릴화도에는 차이가 존재한다.
일 예에서, 이러한 화학적으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스는, 물에 분산시, 20℃±1℃, 컨시스턴시 0.8% (w/w) 및 10 rpm에서 측정하였을 때, 10000 mPaㆍs 이상의 브록필드 점도를 제공한다. 일 예에서, 이러한 화학적으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스는, 물에 분산시, 20℃±1℃, 컨시스턴시 0.8% (w/w) 및 10 rpm에서 측정하였을 때, 15000 mPaㆍs 이상의 브록필드 점도를 제공한다. 일 예에서, 이러한 화학적으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스는, 물에 분산시, 20℃±1℃, 컨시스턴시 0.8% (w/w) 및 10 rpm에서 측정하였을 때, 18000 mPaㆍs 이상의 브록필드 점도를 제공한다. 사용되는 음이온성 나노피브릴 셀룰로스의 예들은, 피브릴화도에 따라, 13000-15000 mPaㆍs 또는 18000-20000 mPaㆍs 범위, 또는 심지어 최대 25000 mPaㆍs의 브록필드 점도를 가진다.
일 예에서, 나노피브릴 셀룰로스는 TEMPO 산화된 나노피브릴 셀룰로스이다. 이는 낮은 농도에서 높은 점도, 예를 들어, 20℃±1℃, 컨시스턴시 0.8% (w/w) 및 10 rpm에서 측정하였을 때, 20000 mPaㆍs 이상, 심지어 25000 mPaㆍs 이상의 브록필드 점도를 제공한다. 일 예에서, TEMPO 산화된 나노피브릴 셀룰로스의 브록필드 점도는 20℃±1℃, 컨시스턴시 0.8% (w/w) 및 10 rpm에서 측정하였을 때 20000-30000 mPaㆍs 범위, 예를 들어 25000-30000 mPaㆍs 범위이다.
일 예에서, 나노피브릴 셀룰로스는 화학적으로 비-변형된 나노피브릴 셀룰로스를 포함한다. 일 예에서, 이러한 화학적으로 비-변형된 나노피브릴 셀룰로스는, 물에 분산시, 20℃±1℃, 컨시스턴시 0.8% (w/w) 및 10 rpm에서 측정하였을 때, 2000 mPaㆍs 이상 또는 3000 mPaㆍs 이상의 브록필드 점도를 제공한다.
생산물의 제조 공정을 보강하거나 또는 특성을 개선 또는 조정하기 위한 보조제가 나노피브릴 셀룰로스 분산물에 포함될 수 있다. 이러한 보조제는 분산물의 액상에 용해성일 수 있어서 에멀젼을 형성할 수 있거나, 또는 이는 고체일 수 있다. 보조제는 나노피브릴 셀룰로스 분산물의 제조시 원료 물질에 미리 첨가될 수 있거나, 또는 제조된 나노피브릴 셀룰로스 분산물 또는 겔에 첨가될 수 있다. 보조제는 또한 최종 생산물에, 예를 들어, 함침 (impregnating), 분무, 침액 (dipping), 침지 (soaking) 또는 유사 방식에 의해 첨가될 수 있다. 보조제는 일반적으로 나노피브릴 셀룰로스와 공유 결합하지 않으므로, 나노셀룰로스 매트릭스로부터 해리될 수 있다. 매트릭스로서 NFC를 사용할 경우, 이러한 보조제의 조절 방출 및/또는 지속 방출 (sustained release)을 달성할 수 있다. 보조제의 예로는 치료학적 (약제학적) 물질과, 그외 활성 물질의 특성 또는 생산물의 특성에 영향을 미치는 물질, 예를 들어, 완충제, 계면활성제, 가소제, 유화제 또는 기타 물질을 포함한다. 일 예로, 분산물은, 제조 공정에서 생산물로부터 수분 제거를 촉진하기 위해 또는 최종 생산물의 특성을 강화하기 위해 첨가될 수 있는, 하나 이상의 염을 함유한다. 염의 예로는 소듐 클로라이드, 칼슘 클로라이드 및 포타슘 클로라이드와 같은 클로라이드 염을 포함한다. 염은 분산물에 건물량 0.01-1.0% (w/w) 범위의 함량으로 포함될 수 있다. 최종 생산물은 또한 약 0.9% 소듐 클로라이드 수용액과 같은 소듐 클로라이드 용액에 침액 또는 침지될 수 있다. 최종 생산물의 바람직한 염 함량은 젖은 생산물 (wet product)에 대해 0.5-1 부피%, 예를 들어 약 0.9 부피% 범위일 수 있다. 염, 완충제 등의 물질은 생리학적 조건을 달성하기 위해 제공될 수 있다.
나노피브릴 셀룰로스의 비-공유적 가교를 달성하기 위해 다가 양이온이 포함될 수 있다. 일 예는 특히 나노피브릴 셀룰로스, 특히 음이온성으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스, 및 다가 금속 양이온과 같은 다가 양이온, 예를 들어, 칼슘, 마그네슘, 아연, 알루미늄, 금, 플라티늄 및 티타늄으로부터 선택되는 다가 양이온을 포함하며, 나노피브릴 셀룰로스가 다가 양이온에 의해 가교된, 나노피브릴 셀룰로스 생산물이 제공된다. 다가 양이온의 함량은 하이드로겔의 건물량으로부터 계산되는 0.1-3% (w/w) 범위, 예를 들어 0.1-2% (w/w) 범위일 수 있다.
일 예는, 펄프를 제공하는 단계, 나노피브릴 셀룰로스가 수득될 때까지 펄프를 분해하는 단계 및 나노피브릴 셀룰로스로부터 하이드로겔을 형성하는 단계를 포함하는, 하이드로겔의 제조 방법을 제공한다.
나노피브릴 셀룰로스는 원하는 피브릴화도로 피브릴화되고, 원하는 수분량으로 조정될 수 있거나, 또는 변형되어, 본원에 기술된 원하는 특성을 가진 겔을 만들 수 있다. 일 예에서, 하이드로겔 내 나노피브릴 셀룰로스는 음이온성으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스이다.
의료용 또는 과학적 하이드로겔로서 사용할 하이드로겔은 균질하여야 한다. 따라서, 하이드로겔의 제조 방법은 나노피브릴 셀룰로스를 포함하는 하이드로겔을, 바람직하게는 본원에 기술된 것과 같은 균질화 디바이스를 사용해 균질화하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 바람직한 비-피브릴화 균질화 단계를 이용함으로써, 겔로부터 불연속적인 부분을 없앨 수 있다. 용도에 더 적합한 특성을 가진 균질한 겔이 수득된다. 하이드로겔은, 예를 들어 열 및/또는 방사선 조사를 이용하거나, 및/또는 항미생물제와 같은 살균제를 첨가함으로써, 추가적으로 살균 처리할 수 있다.
적층 가공 (additive manufacturing)
일 구현예에서, 적어도 배리어의 형성은 적층 가공에 의한 배리어 제조를 포함한다. 3D 인쇄로도 지칭되는 적층 가공은, 물질을 컴퓨터 제어 하에 결합 또는 고체화하여 3차 구조의 물체를 제조하는 공정이다. 이는 몰드없이 수행할 수 있다. 물질을 층층이 첨가할 수 있으며, 예를 들어, 물질을 공급 또는 분출하기 위한 하나 이상의 노즐을 사용함으로써 층층이 첨가할 수 있다. 일 예로, 한 동작으로 원형 또는 실질적으로 원형의 배리어를 형성시킬 수 있어 원을 형성하기 위해 노즐을 이동시킬 필요가 없는, 링 노즐이 사용된다. 적층 가공을 이용할 경우, 고 품질의 균일한 물질을 요구하는 검사에 사용할 수 있는, 고 품질의 균일한 배리어를 수득하는 것이 가능하다.
나노피브릴 셀룰로스는, 바람직하게는, 배리어에 요망되는 컨시스턴시에서, 3D 프린터와 같은 제조 장치에 공급된다. 나노피브릴 셀룰로스는 0.8-2.5% (w/w) 또는 0.8-2.1% (w/w) 농도의 분산물 또는 하이드로겔로서 제공될 수 있거나, 또는 농도가 이보다 더 높거나 또는 낮을 수 있으며, 제조 장치에 부속되도록 설계될 수 있는, 용기에 또는 용기 내에, 예를 들어, 시린지, 앰플, 바틀, 튜브, 카세트 또는 유사물에 제공된다. 그러나, 특히 적층 가공시, 나노피브릴 셀룰로스 하이드로겔의 컨시스턴시는 바람직하게는 1.0% (w/w) 초과, 예를 들어 1.1-2.5% (w/w), 1.1-2.1% (w/w), 1.4-2.1% (w/w) 또는 1.5-2.0% (w/w)이어야 하는 것으로, 밝혀졌다.
나노피브릴 셀룰로스의 3D 인쇄는 공정이 통상적인 3D 인쇄 공정과 다르다. 셀룰로스는 가열시 용융되지 않으므로, 플라스틱, 금속 등과 같은 물질을 프린팅하는데 사용되는 방법 및 장치는 이용가능하지 않을 수 있다. 하나 이상의 시린지를 이용할 수 있는 시린지-기반의 장치와 같은 특정 제조 장치를 사용하여야 할 수 있다. 이러한 장치는 액체, 페이스트, 겔 또는 슬러리를 취급 및 인쇄할 수 있으므로, 나노피브릴 셀룰로스 하이드로겔 물질에 적합하다. 제조 장치는 장치를 제어하도록 구성된 제어 유닛에 작동가능하게 저장된 소프트웨어를 포함할 수 있거나, 또는 장치는 소프트웨어를 포함하는, 컴퓨터와 같은 외부 제어 유닛과 연결될 수 있다.
나노피브릴 셀룰로스는 전단-박화 또는 요변성 물질로서 적층 가공에 사용되는 기존 물질과는 다른 방식으로 거동한다. 물질에 전단력이 적용되면, 예를 들어 물질이 혼합, 가압 및/또는 노즐을 통해 밀려지게 되며, 나노피브릴 셀룰로스 겔은 타겟으로의 물질의 흐름을 용이하게 하는 박화 거동 (thinning behavior)을 나타내게 된다. 그러나, 물질이 인쇄되었거나 또는 제조 장치로부터 분출되었을 때에는, 점도가 다시 이전 상태의 더 높은 점도로 되돌아갈 것이다. 이는 지지체에 원하는 배리어 구조를 형성할 때 문제가 될 수 있지만, 3D 인쇄 공정과 원하는 구조의 성형을 용이하게 할 수도 있다. 예를 들어, 하이드로겔의 전단 박화 또는 요변성은, 성형되어 원하는 구조가 형성될 수 있는 적절한 오픈 시간 (open time)을 물질에 제공할 수 있다. 일반적으로, 온도 제어는 필요하지 않으며, 예를 들어 성형 또는 세팅 목적으로 물질을 가열 및/또는 냉각하여야 하는 것은 아니며, 공정은 실온 또는 주위 온도에서 수행할 수 있다.
배리어 구조는, 세포 배양 플레이트 또는 웰일 수 있는 지지체, 또는 금속, 플라스틱 또는 그외 적절한 재료일 수 있거나, 또는 플라스틱 멤브레인, 페이퍼 등으로 코팅될 수 있는, 다른 또는 별개의 지지체 상에 제조 또는 인쇄될 수 있다. 특히 본원에 기술된 바와 같이, 영역을 둘러싸거나 및/또는 규정하는 구조 형태, 예를 들어, 링 또는 원 형태 또는 유사 형태로 제조되는 최종 배리어 구조를, 따라서 웰 안의 최종 위치 상에 직접 형성시킬 수 있거나, 또는 최종 배리어 구조를 지지체로부터 취하여 웰에 적용할 수 있다. 3D 인쇄된 최종 배리어 구조는 별도로 제조 및 보관할 수 있으며, 본원에 기술된 방법으로 세포 배양 웰에 적용하도록 제공될 수 있다.
분출된 물질은 반드시 건조가 필요할 수 있으며, 따라서 본 방법은 건조 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 구조를 형성하거나 및/또는 이를 건조하기 위해 진공 또는 감압하 진공, 및/또는 동결 및/또는 가열을 이용할 수 있다. 건조는 최종 구조에 대해서만 수행할 수 있거나, 또는 2회 이상 반복할 수 있다. 적층 가공이 2층 이상을 제공함으로써 수행되는 경우, 물질은 새로운 층을 적용하기 전 10-30분, 예를 들어 약 15분간 건조하여야 할 수도 있다. 층을 수동으로 적용한다면, 예를 들어 시린지 및 주사 바늘을 사용해 수동으로 적용한다면, 새로운 층을 적용하기 전 30-60분 등의 보다 긴 시간 동안 층 건조가 필요할 수도 있다.
제조 장치의 노즐 등과 같은 분출 수단 역시 중요한 역할을 담당할 수 있다. 분출 장치의 일예는 시린지이며, 바람직하게는 매번 새로운 미-사용 시린지를 사용하여야 하는 것으로 밝혀졌다. 바늘, 바람직하게는 금속 바늘이 노즐로서 작동할 수 있다. 바늘은 주사 바늘 등일 수 있으며, 예를 들어 공칭 내경이 1.194 mm인 약 16 게이지 바늘, 또는 내경이 0.413 mm인 22 게이지 바늘일 수 있다. 일반적으로, 노즐은 0.2-3.0 mm 범위, 예를 들어 0.2-2.0 mm, 예를 들어 0.2-1.5 mm, 0.3-2.0 mm, 0.4-1.5 mm 또는 0.4-1.3 mm의 내경을 가질 수 있다. 주사 바늘 등은 예를 들어 14G-28G, 예로 16G-22G의 크기를 가질 수 있다.
적층 가공 후, 물질, 즉 배리어를, 예를 들어 적어도 30분간 또는 적어도 60분간 건조하여야 할 수도 있다. 배리어는, 제조 후, 특히 10℃ 미만, 예를 들어 2-10℃ 또는 4-8℃와 같은 냉장고 온도에서 보관시, 적어도 2주간 보관할 수 있다.
적층 가공에 의한 세포 배양 플레이트의 제조 방법은,
- 하나 이상의 세포 배양 웰(들)을 포함하는 세포 배양 플레이트를 제공하는 단계,
- 나노피브릴 셀룰로스의 수성 분산물을 제공하는 단계,
- 적층 가공을 위한 제조 장치를 제공하는 단계,
- 제조 장치를 이용해 웰을 2 이상의 구획으로 분할하기 위해 하나 이상의 세포 배양 웰에 나노피브릴 셀룰로스로부터 하나 이상의 배리어를 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 하나 이상의 배리어의 형성은 2 이상의 단계 등의 하나 이상의 단계로 수행할 수 있다. 각 단계에서 층 또는 이와 유사한 부분 구조가 만들어진다. 각 단계들 사이에, 예를 들어 10-60분, 예컨대 10-30분 또는 10-20분의 건조 단계 및/또는 일시 정지 단계가 배치될 수 있다. 건조 단계는, 나노피브릴 셀룰로스의 원하는 컨시스턴시가 달성되는 방식으로 및/또는 달성되는 시간 동안 수행될 수 있다. 수득되는 세포 배양 플레이트는 본원에 기술된 임의의 세포 배양 플레이트일 수 있다.
본원에 기술된 세포 배양 플레이트는 의료용 생산물일 수 있다. 용어 "의료"는 생산물, 즉 구현예의 NFC를 포함하는 생산물을 의료 목적 또는 과학적 목적, 예를 들어 연구 목적으로 사용하거나 또는 이에 적합한 생산물 또는 용도를 지칭한다. 의료용 생산물은 예를 들어 온도, 압력, 수분, 화학제, 방사선 또는 이들의 조합을 이용하여 살균 처리될 수 있거나 또는 살균 처리가능하다. 생산물, 바람직하게는 부착된 분자(들)를 포함하는 하이드로겔은, 예를 들어, 자동살균 처리될 수 있거나, 또는 고온을 이용한 기타 방법이 적용될 수 있으며, 이 경우 생산물은 100℃보다 높은 온도, 예를 들어 적어도 121℃ 또는 134℃에 내열성이어야 한다. 일 예에서, 생산물은 121℃에서 15분간 자동 살균 처리된다. 또한, 의료용 생산물은 발열원 결핍 상태이며, 부적절한 단백질 잔류물 또는 기타 물질을 함유하지 않는 것이 바람직하다. 의료용 생산물은 바람직하게는 타겟에 무독성이다. 또한, UV 살균 처리 또는 감마서 조사도 이용할 수 있다.
본원에 기술된 및/또는 본원에 기술된 바와 같이 제조되는 세포 배양 플레이트는 포장된 제품, 특히 포장된 의료 제품과 같은 상업적인 제품으로서 공급될 수 있다. 세포 배양 플레이트는 살균 처리된 포장과 같은 포장 안에 포장될 수 있거나, 또는 제품이 포장된 상태로 살균 처리될 수 있다. 세포 배양 플레이트는 세포 배양 웰(들)을 덮는 멤브레인, 필름 또는 기타 덮개를 포함할 수 있다. 덮인 웰은 보관, 수송 및 취급시 미생물, 습도, 가스, 입자 등과 같은 주변 환경으로부터 보호된다. 덮개는 적절한 접착제에 의해 세포 배양 플레이트에 부착된 스트립으로서 제공 또는 제시될 수 있다. 스트립은 제거가능할 수 있으며, 예를 들어 플레이트가 사용할 준비를 하도록 뜯거나 또는 벗겨내어 세포 배양 웰(들)을 노출시킬 수 있다. 세포 배양 플레이트는 본원에 기술된 바와 같이 배리어만, 예를 들어 사용 농도에서 또는 다른 예로 건조된 형태로 포함할 수 있다. 세포 배양 플레이트 또는 웰(들)은 보호 기체를 포함할 수도 있다. 세포 배양 플레이트에는 또한 웰(들) 및/또는 구획(들) 안에 저장액, 배양 배지 및/또는 겔이 제공될 수도 있다. 세포 배양 플레이트는 세포없이 또는 세포와 함께 제공될 수 있다.
세포 연구 방법
배리어를 함유한 세포 배양 플레이트는 살아있는 세포를 수반하는 방법 등의 다양한 과학적 및 의학적 방법에 이용할 수 있다.
세포 연구 방법 및 연구용 제품의 경우, 특정 타입의 세포가 제공된다. 세포는 박테리아 세포와 같은 원핵 생물 세포 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 진핵생물 세포는 식물 세포, 효모 세포 또는 동물 세포일 수 있다. 진핵생물 세포의 예로는 줄기 세포와 같이 이식가능한 세포를 포함한다. 세포는 동물 세포 또는 인간 세포일 수 있다. 본원에서, 용어 "세포"는 2가지 타입 이상의 세포들의 혼합물, 다세포 구조, 조직-유사 구조 및 조직 및 이를 포함하거나 또는 이로부터 유래된 구조체 또는 물질을 포함할 수 있다. 다세포 및 조직-유사 구조, 구조체 또는 물질은 세포 및 기타 생물학적 물질 및/또는 생물학적으로 적합한 물질(들)을 포함할 수 있으며, 바람직한 방식으로 정렬된 세포를 포함할 수 있다. 이러한 다세포 및 조직-유사 구조 또는 물질을 이용함으로써, 연구 및 검사할 수 있는 생물 시스템 모델, 예를 들어 심혈관 시스템, 간 시스템, 암 시스템 등을 구축 및 제공할 수 있다.
세포에 대한 구체적인 예로는 줄기 세포, 미-분화된 세포, 전구 세포 (precursor cell)뿐 아니라 완전히 분화된 세포 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 예에서, 세포는 각막 세포, 각질 형성 세포, 섬유모세포, 상피 세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 타입을 포함한다. 일부 예에서, 세포는 줄기 세포, 선조 세포 (progenitor cell), 전구 세포, 결합 조직 세포, 상피 세포, 근육 세포, 뉴런 세포, 내피 세포, 섬유모세포, 각질 형성 세포, 평활근 세포, 기질 세포, 간엽 세포, 면역계 세포, 조혈 세포, 수지상 세포, 모낭 세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 세포는 종양 또는 암 세포, 유전자 변형 세포, 예를 들어, 형질전환 세포, 동종유전자 이식 세포 (cisgenic cell) 또는 넉-아웃 세포 또는 병원성 세포일 수 있다. 이러한 세포는, 예를 들어 약물 연구 또는 요법에 사용될 수 있다. 특히 줄기 세포가 치료학적 용도로 사용될 수 있으며, 예를 들어 환자에게 제공될 수 있다.
일 예에서, 세포는 포유류 세포와 같은 진핵생물 세포이다. 포유류 세포에 대한 추가적인 예로는 인간 세포, 마우스 세포, 랫 세포, 토끼 세포, 원숭이 세포, 돼지 세포, 보바인 세포, 닭 세포 등이 있다. 본 발명의 방법 및 제품이 포유류 세포를 연구하는데 최상인 것으로 입증되었지만, 이러한 방법 및 제품은 또한 비-포유류 진핵생물 세포, 효모 세포 또는 원핵생물 세포와 같은 다른 세포를 연구하는데에도 사용될 수 있음에 유념한다.
세포 배양 웰(들) 중 하나 이상은 본원에 기술된 배리어를 포함할 수 있으며, 따라서 웰(들)은 세포 및/또는 기타 물질을 수용하기 위한 2 이상의 구획을 가질 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 타입의 세포가 구획에 적용될 수 있다. 일 예로, 웰 내 2 이상의 구획에 적용되는 세포는 동일한 타입의 세포이다. 일 예로, 웰 내 2 이상의 구획에 적용되는 세포는 서로 다른 타입의 세포이며, 각 구획에는 서로 다른 타입이 세포가 존재할 수 있거나, 또는 적어도 하나의 구획에는 다른 구획(들)과는 다른 타입의 세포가 존재한다. 세포 타입은 세포의 기원을 의미할 수 있으며, 예를 들어, 세포는 서로 다른 유기체로부터 유래할 수 있거나, 및/또는 세포는 서로 다른 조직일 수 있다. 또한, 세포는 정상 또는 건강한 세포이거나, 또는 암 세포와 같은 종양 세포일 수 있다. 하나 이상의 세포 배양 웰 또는 구현예의 구획에 적용되거나, 인큐베이션되거나, 배양되거나 및/또는 검사될 수 있는 세포의 예로는 간 세포 (liver cell), 예컨대 간세포 (hepatocytes), 예를 들어 간세포암 세포, 내피 세포, 지방세포, 심근세포, 신장 세포, 대식세포 및 단핵구와 같은 면역 세포, 또는 신경 세포, 예컨대 신경모세포종 세포, 줄기 세포 또는 임의의 기타 적합한 세포 등이 있다.
일 예에서, 세포는 전능성, 만능성, 다능성, 소능성 (oligopotent) 또는 단능성 (unipotent) 줄기 세포와 같은 줄기 세포이다. 줄기 세포는 세포 분열을 통해 스스로 재생할 수 있으며, 다-계통 세포로 분화할 수 있다. 이러한 세포는 배아 줄기 세포 (ESC), 유도된 만능성 줄기 세포 (iPSC) 및 조직-특이 또는 신체 줄기 세포 (somatic stem cell)로도 지칭되는 성체 줄기 세포로서 분류될 수 있다. 줄기 세포는, 성체 줄기 세포와 같이 비-배아 기원일 수 있는, 인간 줄기 세포일 수 있다. 이는 분화 후 신체 전신에서 발견되는 미분화 세포이다. 이는 예를 들어 장기 재생을 담당하며, 만능성 또는 다능성 상태로 분열하여 분화된 세포 계통으로 분화할 수 있다. 줄기 세포는 예를 들어 Cell Stem Cell. 2008 Feb 7;2(2):113-7에 기술된 바와 같이, 배아 파괴 (embryo destruction)없이 구축되는 인간 배아 줄기 세포 계통일 수 있다. 줄기 세포는 골수, 지방세포 또는 혈액과 같이 자가 성체 줄기 세포의 소스로부터 수득할 수 있다.
줄기 세포의 예로는 간엽 줄기 세포 (MSC), 다능성 성체 선조 세포 (MAPC®), 유도된 만능성 줄기 세포 (iPS) 및 조혈 줄기 세포 등이 있다.
인간 줄기 세포의 경우, 세포는 배아 파괴 없이 수득할 수 있는, hESC와 같은 비-배아성 세포 또는 세포일 수 있다. 인간 배아 줄기 세포의 경우, 세포는 기탁된 세포주로부터 유래되거나 또는 미수정란, 즉 "반수성 (parthenote)" 난 또는 반수성으로 활성화된 난자 (parthenogenetically activated ovum)로부터 구축할 수 있어, 인간 배아를 파괴하지 않는다.
일 예에서, 세포는 간엽 줄기 세포 (MSC)이다. 간엽 줄기 세포 (MSC)는 인간 및 동물 기원으로부터, 예를 들어 포유류로부터 분리할 수 있는 성체 줄기 세포이다. 간엽 줄기 세포는 조골세포, 연골세포, 근세포 및 지방세포 등의 다양한 세포 타입으로 분화할 수 있는 다능성 기질 세포이다. 간충직 (mesenchyme) 자체는 중배엽으로부터 유래하여 조혈 및 결합 조직으로 분화되는 배아 결합 조직이다. 그러나, 간엽 줄기 세포는 조혈 세포로 분화하지 않는다. 용어 간엽 줄기 세포 및 골수 기질 세포 (marrow stromal cell)는 다년간 상호 호환적으로 사용되어 왔지만, 어느 용어도 충분히 설명하는 것은 아니다. 기질 세포는 조직의 기능성 세포가 상주하는 지지 구조를 형성하는 결합 조직 세포이다. 이는 MSC의 한가지 기능을 정확하게 설명하는 것일 뿐, 비교적 최근 밝혀진 조직 회복에서의 MSC 역할은 전달하지 못한다. 이 용어는 태반, 제대혈, 지방세포 조직, 성체 근육, 각막 기질 또는 젖니의 치수 등의 기타 비-골수 조직으로부터 유래되는 다능성 세포를 망라한다. 세포가 전체 장기를 재구성할 능력을 가진 것은 아니다.
국제 세포 요법 협회에서는 MSC를 정의하기 위한 최소 기준을 제시하였다. 이들 세포는 (a) 플라스틱 부착성 (plastic adherence)을 나타내어야 하며, (b) 특정 세포 표면 마커 세트, 즉 분화 (CD)73, D90, CD105 클러스터를 가지고 있어야 하며, CD14, CD34, CD45 및 인간 백혈구 항원-DR (HLA-DR)의 발현은 없어야 하며, (c) 시험관내에서 지방세포, 연골세포 및 조골세포로의 분화력을 가지고 있어야 한다. 다양한 조직 기원으로부터 분리된 MSC들에서 약간의 차이는 존재하지만, 이러한 특징들은 모든 MSC에 유효하다. MSC는 태아 조직뿐 아니라 일부 예외를 제외하고는 다수 성체 조직들에도 존재한다. 유효한 MSC 집단은 골수에서 보고된 바 있다. MSC의 특징을 나타내는 세포는 지방세포 조직, 양수, 양막, 치아 조직, 자궁내막, 지아 (limb bud), 월경혈, 말초혈, 태반 및 태막, 침색, 피부 및 포피, 서브-양막 탯줄 라이닝 멤브레인, 윤활액 및 와튼젤리 (Wharton's jelly)로부터 분리된 바 있다.
인간 간엽 줄기 세포 (hMSC)는 매우 높은 수준의 가소성을 나타내며, 실제 모든 장기에서 발견되며, 골수에서 밀도가 가장 높다. hMSC는 재생가능한 간엽 세포 소스로서 사용되며, 적절한 자극시 시험관내에서, 그리고 이식 후 생체내에서, 조골세포, 연골세포, 지방세포, 골격근 세포, 심근세포, 내피세포 및 뉴런 등의 몇가지 세포 계통으로 분화하는 만능성을 가지고 있다.
일 예에서, 세포는, 골수, 근육 및 뇌로부터 회수될 수 있는 원시 세포 (primitive cell) 집단으로부터 유래되는, 다능성 성체 선조 세포 (MAPC)이다. MAPC는 간엽 줄기 세포 보다 더 원시 상태의 세포 집단으로, 배아 줄기 세포 특징을 모방하면서도 세포 요법에서 성체 줄기 세포 효과를 여전히 가지고 있다. 시험관내에서, MAPC는 지방생성, 골생성, 신경생성, 간생성, 조혈, 근육생성, 연골생성, 상피 및 내피 계통으로의 광범위한 분화능을 나타내었다. MAPC의 주 특징은, 이들 세포가 표현형의 소실없이 시험관내에서 상당한 증식능을 나타낸다는 것이다. MAPC는 허혈성 뇌졸중, 이식 편대 숙주 질환, 급성 심근경색, 장기 이식, 뼈 회복 및 골수이형성증과 같은 다양한 질환을 치료하는데 이용할 수 있다. 또한, MAPC는 뼈 형성을 강화하고, 신생혈관형성을 촉진하며, 면역조절 효과를 가지고 있다.
유도된 만능성 줄기 세포 (iPS)는 성체 세포로부터 직접 구축될 수 있는 만능성 줄기 세포 타입이다. 이는 실제 무한정 증폭할 수 있으며, 뉴런, 심장, 췌장 및 간 세포 등의 신체 모든 기타 세포 타입들을 만들 수 있다. 유도된 만능성 줄기 세포는 성체 조직으로부터 직접 유래될 수 있으며, 환자-매칭 방식으로 구축할 수 있어, 면역 거부 반응의 위험 없이 이식을 제공할 수 있다. 인간 유도된 만능성 줄기 세포가 특히 관심의 대상이며, 이는 예를 들어 인간 섬유모세포, 각질형성 세포, 말초혈 세포, 신장 상피 세포 또는 기타 적절한 세포 타입으로부터 구축할 수 있다.
조혈 줄기 세포 (HSC)는 혈액 줄기 세포라고도 하며, 백혈구 세포, 적혈구 세포 및 혈소판 등의 모든 타입의 혈액 세포로 발달할 수 있는 세포이다. 조혈 줄기 세포는 말초혈 및 골수에서 발견된다. HSC는 혈액 세포의 골수계 및 림프계 둘다를 만든다. 골수계 및 림프구 둘다 수지상 세포 형성에 관여한다. 골수성 세포로는 단핵구, 대식세포, 호중구, 호염구, 호산구, 적혈구 및 거핵세포에서 혈소판을 포함한다. 림프성 세포로는 T 세포, B 세포 및 자연 살상 세포를 포함한다. 조혈 줄기 세포 이식은 암 및 기타 면역계 장애를 치료하는데 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 물질 검출 방법을 제공한다:
- 제1 구획에 제1 세포를 포함하는 본원에 기술된 세포 배양 플레이트를 제공하는 단계, 및
- 다른 구획에서 하나 이상의 물질을 검출하는 단계.
물질 검출 방법은 세포에 대한 대상 물질의 효과를 평가하기 위해 수행할 수 있다. 물질 검출 방법은, 세포 통과는 방지하고 하나 이상의 다른 물질(들)의 통과는 허용하기 위해 배리어를 사용하는, 세포에 의해 분비되는 물질을 검출하는 방법, 세포에서 반응을 유발할 수 있는 물질의 동정 및/또는 정량 방법, 배리어를 통과할 수 있는 물질의 검출 방법, 또는 본원에 기술된 임의의 적용가능한 방법일 수 있다. 일반적으로, 검출은 동정, 정량, 정성화 (qualifying) 등을 지칭할 수 있으며, 또한 검출된 정보 분석 및/또는 결과 제공을 포함할 수 있으며, 작동은 컴퓨터화된 제어 유닛 또는 유사 장치를 사용해 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은,
- 제1 구획에 제1 세포를 포함하는 세포 배양 플레이트를 제공하는 단계,
- 대상 물질을 제1 구획과 같은 구획에 적용하는 단계,
- 세포가 대상 물질에 반응하기에 충분한 시간 동안 세포를 인큐베이션하는 단계,
- 다른 구획에서 하나 이상의 물질을 검출하는 단계, 예를 들어 대상 물질, 세포에서 분비되는 물질, 대상 물질의 반응산물 또는 기타 물질 등의 하나 이상의 물질의 양을 검출하는 단계, 선택적으로 적어도 물질 및/또는 세포의 반응을 제1 구획으로부터 검출하는 단계, 및
- 검출된 물질 (들) 및/또는 세포의 반응을 토대로, 세포에 대한 물질의 효과를 평가하는 단계를 포함하는, 세포에 대한 대상 물질의 효과를 평가하는 방법 등의 물질 검출 방법을 제공한다. 대상 물질이 제1 구획 이외의 다른 구획, 예를 들어 제2 구획에 적용된다면, 방법은 대상 물질을 배리어를 통해 제1 구획으로 확산시키는 것을 포함할 수 있다. 하나 이상의 물질을 제1 세포가 위치한 구획이 아닌 다른 구획에서 검출할 수 있거나, 및/또는 하나 이상의 물질을 대상 물질이 적용된 구획이 아닌 구획으로부터 검출할 수 있다. 일반적으로, 하나 이상의 물질(들)을 하나 이상의 구획(들)에서 검출할 수 있다. 일 예로, 검출된 물질들 중 하나 이상은, 물질이 세포 배양 플레이트에서 하나 이상의 배리어를 통과한 후, 통과한 물질에 대한 반응으로서 분비될 수 있다.
일반적으로, 본원에서 "분비"는 세포로부터 임의의 물질(들) 분비를 비롯하여 광의적으로 간주될 수 있다. 분비는, 예를 들어, 본원에 언급된 대상 물질과 같은 화합물일 수 있는 자극, 환경 또는 조건 변화, 또는 기계적 자극, 전기적 자극, 방사선, 빛 또는 이들의 임의 조합에 대한 반응으로서, 예를 들어 포로좀 (porosome)을 경유해 세포외 공간 또는 기질로 하나 이상의 물질(들)이 세포에 의해 분비되는, 세포의 정상적인 분비 기전을 지칭할 수 있다. 또한, 분비는 배출을 포함할 수도 있다. 분비되는 물질의 예로는 단백질, 효소, 호르몬, 독소 및 세포 신호전달 화합물 등이 있다. 분비는 또한 세포가 파괴 또는 약화되거나 또는 이의 투과성이 조정되는 경우에서와 같이, 예를 들어, 초음파 또는 세포 전체 또는 부분적인 파괴 및 물질, 세포 소기관, 사이토플라즘 등의 방출을 유발하는 유사 작용을 이용함으로써, 예를 들어 세포용해, 기계적 또는 기타 파괴에 의해 달성되는, 하나 이상의 물질이 세포로부터 수득되는 그외 타입의 작용을 포함할 수 있다. 세포 파편은 배리어를 통과할 수 없지만, 그외 물질들 중 일부는 통과할 것이므로, 따라서 하나 이상의 대상 물질을, 검출을 방해할 수 있는 다른 물질 및/또는 기타 반응 또는 세포로부터 분리할 수 있다. 이 경우, 방법은 하나의 구획에서 세포를 파괴하는 것을 포함할 수 있다.
일 예는 하기 단계를 포함하는, 세포에 대한 대상 물질의 효과를 평가하는 방법과 같이, 물질 검출 방법을 제공한다:
- 제1 구획에 제1 세포를 포함하는 세포 배양 플레이트를 제공하는 단계,
- 제1 구획에 대상 물질을 적용하는 단계,
- 세포가 대상 물질에 반응하기에 충분한 시간 동안 세포를 인큐베이션하는 단계,
- 다른 구획에서 하나 이상의 물질을 검출하는 단계, 및
- 검출된 물질(들) 및/또는 세포의 반응을 토대로, 세포에 대한 물질의 효과를 평가하는 단계.
하나 이상의 물질 검출은 하나 이상의 물질의 양적 검출 및/또는 하나 이상의 물질의 존재 검출을 포함할 수 있다.
검출되는 하나 이상의 물질은 대상 물질, 세포에 의해 분비되는 물질, 바람직하게는 대상 물질에 대한 반응으로서 세포에 의해 분비되는 물질, 대상 물질의 반응산물, 예를 들어 세포에 의해 또는 세포에 의해 분비된 물질에 의해 대사된 대사산물 또는 기타 물질일 수 있다. 세포에 의해 분비되는 물질은 바람직하게는 대상 물질에 대한 반응으로서 분비되거나 또는 대상 물질에 대한 반응으로서 다른 세포에 의해 분비되는 다른 물질에 반응하여 분비된다.
대상 물질은 약제 또는 기타 반응성 분자로서 작용하는 능력을 검사하는, 시약, 약제 또는 분자일 수 있다. 따라서, 대상 물질은 대상 의심 물질, 약제, 시약 또는 화합물로 의심되는 기타 물질일 수 있다. 대상 물질은 또한 세포 배양 배지의 pH, 영양분 함량, 염 함량 및/또는 기타 조건을 조정하는데 적합한 하나 이상의 시약(들) 또는 기타 화합물을 포함할 수 있으며, 이러한 조건(들) 변화를 자극으로서 이용할 수 있다.
본 방법은 또한 전술한 물질 등의 적어도 물질, 및/또는 세포 반응을 제1 구획으로부터 검출하는 것을 포함할 수 있다. 세포 반응은 세포에 의해 분비되는 하나 이상의 물질, 세포 또는 구획으로부터 검출되는 효소 활성, 세포의 외양, 대사 또는 기타 특성의 변화 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 구획은, 예를 들어 카메라 또는 기타 광학 장치 또는 시각적 검출 수단을 이용함으로써 시각적으로 모니터링하여, 세포 및/또는 구획의 시각적인 특성에 대해 하나 이상의 변화를 검출할 수 있다. 본 방법은 세포 배양 플레이트에서 하나 이상의 구획(들)을 모니터링하고 하나 이상의 구획(들)에서 하나 이상의 이미지(들)를 수득하기 위해 배치되고, 세포 및/또는 구획의 외양 변화를 검출하기 위한 하나 이상의 이미지(들)를 저장 및/또는 분석하기 위해 배치된 제어 유닛과 연결된, 카메라 또는 기타 적절한 장치 등의 영상화 장치 (imaging device)를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 하나 이상의 이미지는 동영상, 즉 비디오 또는 복수의 후속적인 스틸 사진을 지칭할 수 있다. 본원에 기술된 검출 방법 및 수단은 세포 생존성을 검출하기 위해 사용할 수 있다.
또한, 구획은 화학적으로 모니터링할 수 있으며, 일반적으로 하나 이상의 검출 수단을 사용해, 하나 이상의 화학제(들), 즉 물질을 구획으로부터 검출하는 것을 포함한다. 하나 이상의 구획(들)에서 하나 이상의 물질을 검출하는 것은 구획(들)에 수용된 매질에서와 같이, 하나 이상의 구획(들)에서 하나 이상의 샘플(들)을 취하는 단계, 및 샘플(들)을 분석하는 단계를 포함할 수 있거나, 또는 하나 이상의 적절한 프로브(들), 검사 스트립 또는 특정 물질을 검출하기 위해 배치된 기타 검출 수단을 사용함으로써, 특정 물질을 검출하거나 및/또는 특정 물질에 대응되는 검출가능한 반응을 유발하기 위해 배치된 하나 이상의 적절한 인디케이터(들)를 사용함으로써, 색 반응, 효소 반응, 전기화학적 반응 또는 기타 반응 등의 반응, 바람직하게는 검출 반응을 분석하기 위해 배치된 제어 유닛과 연결된 하나 이상의 프로브, 검출기(들), 영상화 장치(들) 또는 기타 적절한 전기적 수단과 같은 자동화된 수단을 이용함으로써 검출 및/또는 정량할 수 있는 반응을 검출하는 것을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 물질의 존재 및/또는 효과를 나타내는 하나 이상의 결과(들)를 출력하는 것을 포함할 수 있다.
본 방법은
- 제2 구획에 제2 세포를 제공하는 단계,
- 제2 세포에 의해 분비된 하나 이상의 물질 및/또는 제2 세포의 반응을 제2 구획에서 검출하는 단계, 및
- 제2 세포에 의해 분비된 검출된 물질(들) 및/또는 제2 세포의 반응을 토대로, 제1 세포 및/또는 제2 세포에 대한 물질의 효과를 평가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 제2 세포의 반응은 제1 세포에 의해 분비된 물질에 대한 제2 세포의 임의 반응을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 웰은 하나의 구획에 한가지 타입의 세포를, 선택적으로, 하나 이상의 다른 구획에 동일한 및/또는 다른 타입(들)의 세포(들), 예를 들어, 간 세포, 예로 간세포, 예를 들어 간세포암 세포, 내피 세포, 지방세포 세포, 심근세포, 신장 세포, 대식세포 및 단핵구와 같은 면역 세포, 또는 신경 세포, 예로 신경모세포종 세포 및 줄기 세포로부터 선택되는 세포를 수용한다. 이러한 배치는, 다른 구획에 위치된 세포 및/또는 다른 물질을 이용해 추가적으로 검사할 수 있는, 세포에 의해 분비되는 대사산물 및/또는 기타 물질을 검사 또는 모니터링하는 방법에 이용할 수 있다. 이러한 방식으로, 제1 구획 안의 세포는 배리어를 통과 또는 침투할 수 없어 구획 안에 잔류하고, 대사산물 또는 기타 물질, 바람직하게는 세포에 의해 분비된 대사산물 또는 기타 물질만 배리어를 통과하여 제2 또는 다른 구획(들)에 들어갈 수 있으며, 그곳에서 구획 안의 세포와 접촉할 수 있거나, 세포에 대해 효과를 발휘하거나 및/또는 검출될 수 있다.
일 예는
- 제1 구획에 제1 세포를 포함하는 세포 배양 플레이트를 제공하는 단계,
- 제1 세포로부터 대사산물과 같은 물질의 분비를 유발하는 화합물을 제1 구획에 적용하는 단계,
- 물질이 분비되어 배리어를 통해 확산할 수 있는 충분한 시간 동안 세포를 인큐베이션하는 단계,
- 제2 구획에서 물질을 연구하는 단계를 포함하는, 제1 세포에 의해 분비되는 물질을 연구하는 방법을 제공한다. 제2 구획 또는 추가적인 구획은 제2 또는 추가적인 타입의 세포와 같은 세포를 수용할 수 있다. 물질 연구는 제2 세포에 대한 물질의 효과를 실험하는 단계, 및 물질 또는 제1 물질에 대한 반응으로서 제2 또는 추가적인 세포에 의해 분비되는 물질 등의 다른 물질의 반응 카이네틱스를 실험하는 단계를 포함할 수 있다.
일 예는,
- 세포 배양 웰 내 제1 구획에 제1 세포를, 제2 구획에 제2 세포를 포함하는 세포 배양 플레이트를 제공하는 단계,
- 제1 세포로부터 대사산물과 같은 물질의 분비를 유발하는 화합물을 제1 구획에 적용하는 단계,
- 물질이 분비되어 배리어를 통해 확산하기에 충분한 시간 동안 세포를 인큐베이션하는 단계,
- 제2 구획에서 제2 세포에 대한 물질의 효과를 분석하여, 물질의 효과를 평가하는 단계를 포함하는,
제1 세포에 의해 분비된 물질이 제2 세포에 미치는 효과를 평가하는 방법을 제공한다.
본원에서, 제1 세포는 제1 타입의 복수의 세포를 지칭할 수 있다. 마찬가지로, 본원에서 제2 세포는 제2 타입의 복수의 세포를 지칭할 수 있다. 본 방법은 먼저 세포 배양 플레이트를 제공하는 단계 및 제1 구획에 제1 세포(들)를 적용하는 단계, 및/또는 세포 배양 플레이트를 제공하는 단계 및 제2 세포(들)를 제공하는 단계 및 제2 구획에 제2 세포(들)를 적용하는 단계를 포함할 수 있다. 세포, 및 선택적으로 임의의 세포 배양 배지 또는 기타 물질이 수용된 세포 배양 플레이트는 세포 시스템으로써 지칭할 수 있다.
실험을 통해, 나노피브릴 셀룰로스 배리어가 특히 시험관내 검사 시스템에 간 대사 (hepatic metabolism)를 추가하기 위한 효과적인 툴인 것으로 밝혀졌다. 화합물은 간세포 구획에 적용할 수 있으며, 간세포는 배리어를 통한 다른 구획 내 섬유모세포로의 진입 전에 화합물을 대사할 수 있다. 마지막으로, 예를 들어 Ceii-IQ 등의 자동 세포 배양 및 분석 시스템을 사용해, 배리어 양쪽에서 세포 생존성을 분석할 수 있다. 시판 제품을 수득하기 위해, 배리어의 구축은 배리어의 크기와 개별 구획들의 표면적이 일정하여야 하므로, 표준화되어야 한다.
배리어는 뉴런 이동 검사에서 도구로서 사용할 수 있다. 신경 세포 (SH-SY5Y)는 배리어를 통과할 수 없는 것으로 밝혀졌으며, 배리어는 표준화된 방식으로 제거할 수 있었다. 따라서, 배리어 시스템은 뉴런 이동 검사 (발생학적 신경 독성)에 사용될 효력 (potency)을 가진다. 배리어는 본원에 기술된 바와 같이 구축하고, 예를 들어 핀셋을 사용해 제거할 수 있다.
HepaRG 세포 대신 (냉동보존된), 대사 활성이 해동 직후에 가장 우수하고 배양하는데 수일이 걸리지 않는 인간 일차 간세포를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 세포 배양, 즉 세포 배양 방법 또는 세포 배양을 포함하는 방법에서의 본원에 기술된 세포 배양 플레이트의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 물질 검출 방법 또는 본원에 기술된 바와 같은 물질의 효과를 평가하는 방법에서의, 본원에 기술된 세포 배양 플레이트의 용도를 제공한다.
실시예
실시예 1: 화합물의 투과는 허용하나 세포 투과는 허용하지 않는 생물학적 배리어로서 나노피브릴 셀룰로스
본 실험의 목표는, 나노피브릴 셀룰로스 겔을 사용해 세포의 통과는 방지하지만 배리어를 통한 화학적 화합물의 통과는 허용하는, 배리어를 구축할 수 있는 지를 조사하는 것이었다. GrowDex™를 나노피브릴 셀룰로스로 사용하였다.
재료
검사 시스템
ㆍ 인간 간세포암 세포 HepG2 (ATCC*, #HB-8065™)
최종 보고서 제한 공개 (CONFIDENTIAL)
FICAM CT0065/4 6(16)
ㆍ 인간 신경모세포종 세포주 SH-SY5Y (ATCC #CRL-2266™)
ㆍ 랫 폐포 대식세포 NR8383 (ATCC #CRL-2192™)
세포 배양을 위한 GrowDex ™ 하이드로겔
ㆍ GrowDex, 0.65% (UPM, lot 11898) Trials 1-3
ㆍ Grow-Dex, 0.65%, anionic, (UPM, lot 11782) Trial 4
ㆍ GrowDex (세포 배양용 하이드로겔), 1.5%, (UPM, lot 11878) Trials 1-3, 5
ㆍ GrowDex (세포 배양용 하이드로겔), 1.5%, (UPM, lot 11911) Trial 4
시약
ㆍ HepG2 세포 배양 배지, FICAM lot HepG2/CT0065-2/MH/1/120217
ㆍ SH-SY5Y 세포 배양 배지, FICAM lot SH-SY5Y/CT0065-
4/MH/1/120217
ㆍ NR8383 세포 배양 배지, FICAM lot NR8383/CT0065/MV/1/240417
ㆍ TrypLE Express (Gibco Invitrogen 12604, lot 1664940)
ㆍ 0.2% 트리판 블루/등장성 용액, FICAM lot 0.2%TB/SL/17/310518
ㆍ DPBS (Lonza #BE17-513F, lot 5MB178)
ㆍ 플루오레세인 (Sigma #6372, lot 67 43406)
ㆍ 피브리노겐 (Sigma Aldrich #F3879)
ㆍ 소듐 도데실 설페이트 (SDS) (Sigma #L6026, lot SLBF8724V).
ㆍ 아스퍼길러스 나이거 (Aspergillus niger)의 셀룰라제 (Sigma #C1184, lot SLBP8440V)
장치
ㆍ 세포 배양 인큐베이터 (37℃, 5.0% CO2) (Esco CLS CeiSafe CO2)
ㆍ 파지티브 디스플레이스먼트 파이펫 (Mettler Toledo)
ㆍ 도립 현미경 (Zeiss Primovert+ Axiocam ERe 5s) + 디지탈 카메라
ㆍ 96웰 플레이트 (Nunc #167008)
실험 개괄
본 실험에서, 4개의 GrowDex lot (및 2종의 밀도)를 사용해, 원형 및 직선형 웰 형상의 배리어를 구축하여, 세포 배양 웰을 2개의 구분되는 구획으로 분할하였다. 배리어는 6웰 플레이트 (원형 배리어) 및 24웰 및 48웰 플레이트 (직선형 벽 배리어)에 구축하였다. 세포 통과를 방지하는 배리어의 특성을 서로 다른 3종의 세포 타입들, 즉 간모세포종 HepG2 세포, 신경모세포종 SH-SY5Y 세포 및 NR8383 대식세포를 사용해 검사하였다. 화합물의 통과를 허용하는 배리어의 특성은 직접 및 간접 방법 2가지로 검사하였다. 실험 1-5는, 특정 실험에서 수득된 결과 및 경험이 후속 실험에서 활용되었으므로, 시간 순으로 나타내었다. 챕터 7에서, 가장 중요한 결과 및 결론을 요약 개시한다.
실험 절차 및 결과
시험 1: GrowDex 배리어 구축
GrowDex: 0.65%, lot 11898, GrowDex 1.5%, lot 11878
절차
6웰 플레이트와 24 및 48웰 플레이트에 배리어를 구축하고자 여러번 시도하였다. 24웰 및 48웰 플레이트의 경우, 직선형 벽 배리어 구조를 이용해 웰을 2개의 파트로 나누었다 (도 1). 6웰 플레이트의 경우, 원형 구조를 구축하였다 (도 2). 일부 배리어는 글루로서 특이적인 피브리노겐계 코팅제를 사용해 구축하였다. 배리어의 구축을 돕기 위해, 먼저 멀티-웰 플레이트의 바닥부에 배리어의 형태를 그렸다.
결과
0.65% GrowDex, lot 11898은 배리어를 구축하는데 적합하지 않은 것으로 보였다. 겔을 웰의 바닥부 위에 도포하였으며, 배리어로서 기능하기에 매우 충분한 벽을 구축하기가 불가능하였다. 대신 1.5% GrowDex를 사용해 원형 및 직선형 벽 형상의 배리어를 구축할 수 있었다.
시험 2: SH - SY5Y 및 HepG2 세포의 배리어 통과
GrowDex 1.5%, lot 11878
절차
SH-SY5Y 세포: 직선 벽 형상의 GrowDex 배리어를 도 1에 나타낸 바와 같이 48웰 플레이트에 구축하였다. 배리어 구조를 층류 후드에서 뚜껑을 연 상태로 1시간 동안 건조시켰다. 세포 배양 배지 50 ㎕ 중의 SH-SY5Y 세포 325,000개를 배리어의 좌측으로 파이펫팅하였다. 다음날, 세포 배양 배지를 배리어 양쪽에 첨가하였다. 배리어 위로 배지가 넘치지 않도록 배지를 점진적으로 첨가하였다. 세포를 최대 2주간 배양하였다. 주당 2회로 신선한 배지를 첨가하였다.
HepG2 세포: 원 형상의 GrowDex 배리어를 도 2에 나타낸 바와 같이 6웰 플레이트에 구축하였다. 배리어를 층류 후드에서 뚜껑을 연 상태로 1시간 동안 건조시켰다. 세포 배양 배지 50 ㎕ 중의 HepG2 세포 1 07 500개를 배리어의 안쪽에 첨가하였다. 다음날, 세포 배양 배지를 배리어 양쪽에 첨가하였다. 배리어 위로 배지가 넘치지 않도록 배지를 점진적으로 첨가하였다. 세포를 최대 2주간 배양하였다. 주당 2회로 신선한 배지를 첨가하였다.
결과
SH-SY5Y 및 HepG2 세포 집단이 증식되어 구획에 찼지만, 배리어를 통과하진 못하였다.
시험 3: 화합물의 배리어 통과
GrowDex 1.5%, lot 11878
절차
6웰 플레이트 (원 형상의 배리어) 및 24웰 플레이트 (직선형 벽 형상의 배리어)에 배리어를 구축하고, 밤새 건조시켰다. 배리어는 이를 통한 용액의 통과 및 혼합을 수행하기에 매우 충분하였다. 모든 통과 및 혼합은 배리어를 통해 이루어져야 한다.
배리어의 화합물 투과성을 0.2% 트리판 블루를 이용한 육안 검사에 의해, 1 mg/ml 플루오레세인 용액을 이용한 정량적인 측정에 의해, 그리고 독성 화합물인 소듐 도데실 설페이트 (SDS)를 이용한 간접 방법에 의해 검사하였다.
절차
0.2% 트리판 블루 투과성
24웰 플레이트에 둘베코의 PBS를 웰 당 400 ㎕씩 넣었다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하여, GrowDex 배리어를 촉촉하게 하였다. DPBS를 제거한 다음, 배리어의 좌측은 0.2% 트리판 블루 100 ㎕로 교체하고, 배리어의 우측은 동량의 DPBS로 교체하였다. 용액이 배리어를 넘지 않도록 하였다.
1 mg /ml 플루오레세인 투과성
24웰 플레이트에 구축된 배리어를 먼저 전술한 바와 같이 DPBS로 적셨다. DPBS를 제거한 다음, 배리어의 좌측에는 1 mg/ml 플루오레세인 100 ㎕를 첨가하고, 배리어의 우측에는 DPBS 100 ㎕를 첨가하였다. 플루오레세인 용액을 첨가한 지 1시간, 3시간 및 3일 후, 배리어의 양측에서 샘플 50 ㎕를 취하여 96웰 플레이트에 넣고, 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. 1 mg/ml 플루오레세인 샘플 50 ㎕도 측정하였다. 이는 주입시 배리어 좌측의 흡광도를 나타낸다.
SDS 투과성
SDS는 모든 세포 타입들에 유해한 것으로 알려진 디터전트이다. 본 검사의 목표는 한 구획에만 첨가된 SDS가 GrowDex 배리어를 통과하여 양쪽 구획에서 세포를 죽일 수 있는 지를 조사하는 것이었다. 6웰 플레이트에 원형의 배리어를 만들고, 24웰 플레이트에는 직선형 벽의 배리어를 만들었다. SH-SY5Y 세포는 배리어의 양측에 정상적인 세포 배양 배지 중에 325 000 세포/50 ㎕의 밀도로 24웰 플레이트에 접종하였다. HepG2 세포는 원형 배리어의 안쪽과 바깥쪽 둘다에 107 500 세포/50 ㎕의 밀도로 6웰 플레이트에 접종하였다. 다음날, 0.4 mg/ml SDS 스톡을 준비하여, 세포를 이에 노출시켰다.
24웰 플레이트에서 배양한 SH-SY5Y 세포: 0.4 mg/ml SDS 용액 100 ㎕를 배리어의 좌측에 파이펫을 사용해 첨가하였다. SDS 무첨가 배지 100 ㎕를 배리어의 우측에 파이펫을 사용해 첨가하였다.
24웰 플레이트에서 배양한 HepG2 세포: 0.4 mg/ml SDS 용액 400 ㎕를 원형 배리어의 안쪽에 파이펫을 사용해 첨가하고, SDS 무첨가 배지 400 ㎕를 원형 배리어의 바깥쪽에 파이펫을 사용해 첨가하였다.
세포를 세포 배양 인큐베이터에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 생존성을 현미경으로 관찰하였다.
결과
0.2% 트리판 블루 투과성
6시간 후, GrowDex 배리어가 대부분의 블루 색상을 흡수하였다. 다음날, 배리어의 양측에 색이 균일하게 분산되었다. 도 3은 GrowDex 배리어로 분할된 웰 안의 0.2% 트리판 블루의 분포를 보여준다.
플루오레세인 투과성
흡광도 측정 결과는, 플루오레세인이 GrowDex 배리어를 침투하여 배리어의 좌측에 유입되었음을 보여주었다. 1시간 후, 좌측에서 플루오레세인의 47%가 회수되었으며, 우측에는 약 10%가 회수되었다. 2시간 후, 52%가 좌측에서, 우측에서 35%가 회수되었다. 3일 후, 좌측에서 50%가, 우측에서 40%가 회수되었다. 회수되지 않은 플루오레세인은 아마도 GrowDex 배리어에 존재하였다. 대체적으로, 결과에 따르면, 플루오레세인은 첨가 후 수시간 내에 배리어에 침투한다.
소듐 도데실 설페이트 투과성
SH-SY5Y-세포: SDS 첨가 후 24시간 후, 배리어의 좌측에서는 SH-SY5Y 세포들이 모두 사멸하였다. 우측에서는 배리어 옆의 세포는 사멸하였지만, 웰 전체가 그런 것은 아니었다. SDS 첨가 후 48시간 후, 양쪽 구획에서 세포들 모두 사멸하였다. 마찬가지로, 첨가 후 24시간 후, GrowDex 고리의 안쪽에서는 HepG2 세포들 모두 사멸하였으며, GrowDex 배리어 옆의 바깥쪽도 모두 사멸하였다. 48시간 후, 고리 바깥쪽에서 모든 HepG2 세포 (약 95%)가 사멸하였다.
이는 SDS가 배리어를 통과할 수 있다는 간접적인 증거이다.
시험 4: NR8383 대식세포의 배리어 통과
GrowDex 1.5%, lot 11911, GrowDex 0.65% (anionic), lot 11782
절차
둥근 형태의 배리어를 다음과 같이 6웰 플레이트에 구축하였다: 웰 A1 및 B1에는 1.5% GrowDex (lot 11911)를 사용하였다. 웰 A3 및 83에는 0.65% GrowDex (lot 11782)를 사용하였다 (도 4). 각각의 배리어는 3 x 250 ㎕ =750 ㎕ GrowDex를 사용해 구축하였다. 0.65% GD보다 1.5% GD가 배리어 구축하기 더 용이하였다. 0.65%는 퍼지는 경향이 있었다. 배리어를 파이펫을 사용해 구축한 후 층류 후드에서 뚜껑을 연 상태로 건조시켰다.
30 000 NR8383 대식세포를 서클의 중앙에 50 ㎕로 첨가하여, 30분간 부착시켰다. 그런 후, 세포 배양 배지 150 ㎕를 서클의 안쪽에 첨가하고, 서클의 바깥쪽에는 300 ㎕를 첨가하였다. 배지가 배리어를 넘지 않도록 점진적으로 첨가하였다. 세포 배양을 3일간 유지시키고, 사진을 촬영하였다. 배리어의 안쪽과 바깥쪽을 매일 신선한 배지로 교체하였다.
결과
세포 접종 후 2일째에, (세포가 접종된) 서클의 중앙에는 세포가 거의 없고 세포 대부분이 GrowDex 배리어 쪽으로 이동하였으므로, 배리어에 대식세포가 부착하는 것으로 보였다. 3일째, 세포는 배리어의 가장 안쪽 구역에 위치하였다. 그 효과는 양쪽 배리어 구조 (0.65% 및 1.5%)에서 동일하였다 (도 5-8).
세포는 1.5% GrowDex 배리어를 통과하지 못하였으며, 경계를 따라 모여 있었다 (내측)(도 6 및 7).
0.65% GrowDex 배리어는 1.5% GrowDex보다 세포 접근성이 우수하였으며, 3일 후 세포는 0.65% GrowDex 배리어의 바깥쪽에서 발견되었다 (도 9). 이는 배리어의 물리적 파괴, 및/또는 구조체가 1.5% GrowDex에 비해 확산성이 우수하여, 세포 및 배지가 배리어를 통과한 것이 원인일 수 있다.
시험 5: 셀룰라제 처리
절차
실험 종료시, 셀룰라제를 사용해 1.5% GrowDex 배리어를 제거하기 위한 실험을 수행하였다. 10 mg/ml 및 100 mg/ml 셀룰라제 용액을 준비하고, GrowDex 배리어가 존재하는 웰에 셀룰라제 용액을 채워넣었다. 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
결과
셀룰라제 용액은 24시간 내에 배리어를 파괴하지 않았다.
결론
GrowDex로 생물학적 배리어를 구축할 수 있나?
ㆍ lot 11878 및 lot 11911의 2가지 1.5% GrowDex를 사용해 배리어를 구축할 수 있었다. 대신, 0.65% GrowDex (lot 11782 및 lot 11898)의 조성물은 분산되어 구조체를 온전하게 유지 및 보존하는 배리어를 구축할 수 없었다. 하이드로겔은 웰 바닥부에 퍼지는 경향이 보였다.
ㆍ 둥근 배리어는 6웰 플레이트에 가장 적합하였으며, 직선형 벽 형상의 배리어는 24웰 및 48웰 플레이트에 가장 적합하였다. 둥근 배리어는 플라스틱 웰과 GrowDex 배리어 사이에 접합이 (누출 가능성) 없어, 구축하기 더 용이하였다.
ㆍ 세포를 접종하기 전에 1시간 동안 배리어를 건조하는 것이 배리어를 안정화하는 것으로 나타났다. 배리어를 더 길게, 즉 밤새 건조하면, 사용 전 1시간 동안 수분을 공급하여야 한다. 그렇지 않으면, 배리어가 세포로부터 배지를 모두 빨리 흡수하여 세포를 접종하기 어려웠다.
세포가 배리어를 통과하나?
ㆍ 1.5% GrowDex로 구축된 배리어는 세포를 통과시키지 못하였다:
HepG2 및 SH-SY5Y 세포는 세포가 적용된 구획에 머물렀으며, 증식하였다. 대식세포는 1.5% GrowDex 배리어를 통과하진 못했지만, 겔을 "외래 물질"로 인지하여, 아메바 운동 (amoeboid movement)으로 겔 쪽으로 이동하여, 이를 삼키기 시작하였다: GrowDex 배리어에 접근하고 GrowDex 겔에 진입할 때, 세포는 (서클의 중앙의) 둥근형의 개별 세포에서 돌기가 뻗어있는 세포로 형태가 바뀌었다.
ㆍ 세포 접종은, 먼저 세포를 배리어와의 접촉을 피하면서 배지를 소량 첨가하고 30분의 부착 기간 경과 후 배지를 더 첨가할 경우에 가장 원활하였다.
화합물이 배리어를 통과하나?
ㆍ 1.5% GrowDex로 구축된 배리어는 직접 및 간접 방법 둘다에서 확인된 바와 같이 화합물을 통과시킬 수 있었다.
배리어가 안정적이고 상업적으로 실용적인가?
ㆍ 비-코팅 멀티-웰 플레이트에 구축된 1.5% GrowDex 배리어는 1주일간 안정적이었다. 그 후, 탈착되기 시작하였다. 피브리노겐계 코팅제로 코팅 ("글루 처리")된 멀티-웰 플레이트 상에 구축된 배리어는 최대 3주간 안정적이었다.
추가적인 결과
ㆍ 1.5% GrowDex 배리어를 셀룰라제 처리로 제거하고자 하는 시도는 성공하지 못하였다. 그러나, 배리어는 핀셋으로 완전히 제거할 수 있었다.
실시예 2: 약물의 대사-의존적인 독성을 조사하기 위한 나노피브릴 셀룰로스 배리어에 의해 분리된 HepaRG 세포 및 BJ 섬유모세포의 공배양
간세포는 체내 주요 대사 구성성분이다. 모든 시험관내 검사는 물질 자체가 (대사없이) 독성인지 또는 물질이 반응성 및 독성 중간산물(들)로 대사되는 지를 밝히기 위해, 간 대사를 수반한 및 간 대사를 수반하지 않는 검사를 포함하여야 한다. 대사-유도성 독성을 실험하기 위해, 연구자들은 종종 "컨디셔닝화된 배지 (conditioned medium)"를 활용하는데; 간세포에 먼저 화합물을 처리한 다음 이러한 "컨디셔닝화된" 배지를 타겟 세포에 투입한다. 그러나, 이는 힘든 과정이며, 생체내 상황을 모방하진 못한다. 따라서, 간세포 및 타겟 세포를 동시적으로 무독성으로 공배양할 필요성이 남아있는 실정이다.
본 실험의 목표는, 세포독성 평가에 약물-대사가 포함된 검사 모델을 개발하는 것이었다: 약물-대사 성분 (간세포)을 GrowDex로 구축된 배리어에 의해 타겟 BJ 세포로부터 분리하였다. 배리어는 화합물을 통과시키지만, 세포는 통과시키지 않는다. (이전 실험에서, 1.5% GrowDex를 사용해 이러한 특징을 가진 배리어를 구축할 수 있음을 확인함). 시험 화합물을 간세포 구획에 첨가하고, 노출 후 BJ 세포 및 간세포의 생존성을 측정하였다.
재료
검사 시스템
ATCC (FICAM lot 1-BJ/13)에서 입수한 인간 섬유모세포 BJ (Cat No. HB-8065) 및 Thermo Fisher (Life Technologies)에서 입수한 HepaRG 세포 (#HPRGC10, lot 1919332, 분석 결과에 대한 부록 1 참조)를 본 실험에 사용하였다.
GrowDex 세포 배양용 하이드로겔
ㆍ GrowDex, 1.5% lot 119923917h
ㆍ GrowDex, 2.0% lot 119694117
시약
ㆍ BJ 세포 배양 배지 (MEM + 1% NEAA, 1% L-글루타민 및 10% FBS), FICAM lot BJ-test2/VM0013/MPE/1/080318, BJ-test2/VM0014/MPE/1/160418, BJ/CT0065/8/MPE/2/19032018, BJ/CT0065/8/MV/3/270318, BJ/CT0065/MPE/3/070618, BJ/CT0065/8/MH/4/280418, BJ/CT0092/MPE/2/030618, 5%FBS/BJ/CT0065/8/MV/1/270318, 5%FBS/BJ/CT0065/8/MH/2/290418, BJ/CT0065/9/MV/2/200518, BJ/CT0065/13/MV/1/110718
ㆍ BJ 화학 희석 배지 (MEM + 1% NEAA, 1% L-글루타민, 200 IU/ml 페니실린, 200 ㎍/ml 스트렙토마이신) FICAM lot aBJ/CT0065/8/MV/1/270318, aBJ/CT0065/8/MH/2/290418
ㆍ TrypleExpress (Gibco Invitrogen, #12604, lot 1897182)
ㆍ 0.2% 트리판 블루/등장성 용액, FICAM lot 0.2%TB/HMa/19/100418
ㆍ 윌리암스 E 배지 + GlutaMAX™ (Invitrogen #32551, lot 1908835)
ㆍ HepaRG® 해동/접종/일반 용도의 배지 보충제 (Thermo Fisher Scientific, #HPRG670, lot 1919478)
ㆍ HepaRG TOX 배지 보충제 (Gibco #HPRG630, lot 1912376)
ㆍ WST-1 (Takara #MK400, lot AH8P001)
ㆍ 24웰 플레이트 (비-코팅)
검사물
검사물을 표 1에 나타낸다. 공급사는 Sigma Aldrich였다.
표 1. 검사물
화합물 CAS #CAT/lot 독성 대사산물 용매
셀레길린 하이드로클로라이드 14611-51-9 50360000/1.3 L-메트암페타민, L-암페타민 화학 희석 배지
파라세타몰 103-90-2 A7085/SLBM5923V N-아세틸-p-벤조퀴논 이민 (NAPQI)
 화학 희석 배지
장치
ㆍ 배리오스칸 플래시 멀티모드 리더 서모 사이언티픽 (Varioskan Flash Multimode Reader Thermo Scientific)
ㆍ 파지티브 디스플레이스먼트 파이펫 (positive displacement pipette)
실험
일반적인 사항
수행한 실험을 본원에 실험 1, 2, 3 및 4로 기술한다. 실험 1에서, BJ 섬유모세포에 대한 파라세타몰 및 셀레길린의 독성을 조사하였다. 실험 2 및 3에서는, BJ 섬유모세포를 HepaRG 세포를 경유하여 파라세타몰 및 셀레길린에 노출시켰다. 실험 4는 HepaRG 세포의 대사능을 평가하는 방법을 기술한다.
실험을 위한 세포 배양
항상 실험 개시하기 1-2주 전에 인간 BJ 섬유모세포의 배양을 개시하였다. BJ 세포 배양 배지 (일반적인 세포 배양 배지)를 SOP/M/0001-2.2에 따라 준비하고, 세포를 SOP/M/0074-1.0에 따라 배양하였다. BJ 세포는 실험에 접종하기 전 적어도 2번 서브-배양하였다. HepaRG 배지 준비 및 HepaRG 세포 배양은 제조사의 지침서에 따라 엄격하게 수행하였다.
세포 생존성 /세포독성 분석
세포 생존성/세포독성은 항상 WST-1 분석으로 평가하였다. 분석 원리는 미토콘드리아 데하이드로게나제 효소에 의한 테트라졸륨 염 WST-1의 유색 염료로의 변환을 기반으로 한다. 용해성 염이 배지로 방출된다. 소정의 기간 내에, 반응으로 색 변화가 발생하며, 이는 주어진 배양에서 미토콘드리아 데하이드로게나제의 양에 정비례한다. 그 결과, 본 분석은 실제 세포의 총 대사 활성 (net metabolic activity)을 측정한다. 이론적으로, 이는 세포 수를 반영하며, 세포 수가 많을수록, 시약을 환원하는데 이용가능한 데하이드로게나제가 많아진다.
실험 1 ( BJ애 대한 셀레길린 및 파라세타몰의 독성)
목적
실험 1의 목적은 HepaRG-처리없이, BJ 섬유모세포에 대한 파라세타몰 및 셀레길린의 독성을 조사하는 것이었다.
절차
BJ 세포 접종
BJ 세포 현탁액을 BJ 세포 배양 배지에서 40 000 세포/ml의 밀도로 준비하였다. 현탁액 100 ㎕를 96웰 플레이트에 웰 당 세포 4000개가 되도록 파이펫팅하였다.
셀레길린 및 파라세타몰 희석물의 제조
셀레길린 및 파라세타몰 희석물은 사용 당일에 준비하였다. 먼저, 양쪽 약물에 대해 1 mg/ml 스톡을 제조한 다음, 파라세타몰 스톡으로부터 200 및 20 ㎍/ml 희석물을, 셀레길린 스톡으로부터 200, 20, 10, 5 및 2 ㎍/ml 희석물을 준비하였다. 스톡 및 희석물은 BJ 화학 희석 배지에서 제조하였다. 셀레길린은 BJ 섬유모세포에 대한 기존의 독성 데이터가 존재하지 않아, 셀레길린 독성은 파라세라몰보다 더 광범위한 범위에서 조사하였다. 대신, 파라세타몰 독성은 인간 BJ 섬유모세포에서 광범위한 범위에서 조사하였다.
노출
플레이트를 멸균 타월 위에서 조심스럽게 내려놓고 블롯팅하여, BJ 세포 배양 배지를 세포에서 제거하였다. 즉시, BJ 세포 배양 배지 50 ㎕를 웰 모두에 첨가한 다음 검사 희석물 (셀레길린 또는 파라세타몰) 50 ㎕ 또는 비히클 대조군 50 ㎕을 첨가하였다. 그래서, 웰 안의 최종 약물 농도는 500, 100, 10, 2.5 및 1 ㎍/ml이 되었다. BJ 화학 희석 배지를 비히클 대조군으로 사용하였다. 2종의 약물에 대해 동일한 2개의 96웰 플레이트를 준비하였으며, 각 플레이트에서 각 농도 및 비히클 대조군에 대해 6개의 평행 열을 사용하였다. 플레이트 하나는 3시간 동안, 다른 하나는 20시간 동안 인큐베이션하였다.
세포독성/생존성 분석
3시간 또는 20시간 인큐베이션 후, WST-1 시약 10 ㎕를 웰에 첨가하였다. 플레이트를 2시간 인큐베이션한 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
데이터 취급
블랭크 값 (약물을 비롯한 모든 시약 함유, 그러나 세포는 함유하지 않음)을 흡광도 데이터에서 제하였다. 그 결과는 무처리 (비히클) 대조군과 비교하여 생존 세포의 %로 나타내었다. 무처리 대조군과 처리 세포 간의 통계학적 차이는 t-검정 (SigmaPiot)으로 분석하였다.
결과
인간 BJ 섬유모 세포의 생존성에 대한 셀레길린 및 파라세타몰의 효과를 도 1에 나타낸다. 셀레길린은 최고 농도 500 ㎍/ml에서 BJ 세포 생존성을 3시간 및 20시간 노출한 경우 모두에서 ~10% 감소시켰다. 셀레길린은 최저 농도에서 BJ 섬유모세포의 생존성을 ~10% 증가시켰다. 파라세타몰은 BJ 섬유모세포의 생존성을 감소시키진 않았지만, 파라세타몰 최고 농도 500 ㎍/ml에서 3시간 노출시 BJ 세포 생존성이 ~9% 증가하였다.
결론
BJ 섬유모세포 단일배양물 (monocultures)을 셀레길린 및 파라세타몰에 노출시킨 결과, 이들 약물은 BJ 섬유모세포에 독성이 아닌 것으로, 밝혀졌다. 이러한 결과는, GrowDex 배리어에 의해 분리된 BJ 섬유모세포의 공배양 및 간세포 대사를 이용하여 대사-의존적인 셀레길린 및 파라세타몰 독성을 조사하는, 추가적인 실험의 근거를 제공해준다. 인간 BJ 섬유모세포의 생존성에 대한 셀레길린 및 파라세타몰의 효과를 도 10에 나타낸다. 각각의 막대는 평균±SEM, N=6-12이다. 통계학적 차이는 t-검정 (Sigma Plot)으로 조사하였다.
실험 2 HepaRG 세포를 통해 노출한 경우 ( BJ에 대한 셀레길린의 독성)
목적
실험 2의 목적은 제안한 검사 방법, 즉 HepaRG 세포 (대사 구성성분) 및 BJ 섬유모세포 (타겟 세포)를 GrowDex 배리어에 의해 분리된 24웰 플레이트의 웰에서 공배양하는 방법을 사용해, 약물의 대사-의존적인 독성을 인지할 수 있는 지를 조사하고자 하였다. 간 대사를 경유하여 독성이 강해지는 것으로 알려진 셀레길린을 시험 화합물로 사용하였다. 이를 HepaRG 세포에 첨가하고, HepaRG 및 BJ 세포의 생존성을 3시간 후 측정하였다.
절차
GrowDex 배리어 구축
1.5% GrowDex
도 11에 나타낸 바와 같이, GrowDex 배리어를 구축하여, 24웰 플레이트의 웰들을 동일 크기의 2개의 구획으로 나누었다 (회색 영역이 GrowDex 배리어임).
2가지 다른 방법을 사용해 배리어를 구축하였다.
1) GrowDex 250 ㎕를 웰에 (파지티브 디스플레이스먼트 파이펫을 사용하여) 파이펫팅하여, 배리어의 제1 층을 구축하고, 배리어를 실온에서 1시간 동안 뚜껑을 덮고 건조시켰다. 그런 후, 제2 GrowDex 층을 제1 층 위에 파이펫팅하였다. 이 방법으로 8개의 배리어를 구축하였다. 2) GrowDex 250 ㎕+250 ㎕를 웰에 적층 사이에 건조없이 웰에 투입하였다 (사진 참조). 이 방법으로 4개의 배리어를 구축하였다.
배리어를 구축한 후, 층류 후드 하에 실온에서 뚜껑을 연 상태로 1시간 건조시켰다. 그런 후, 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고, 다음날 실험에 사용하기 위해 냉장고 (~+4℃)에 넣었다.
2.0% GrowDex
투명한 2.0% GrowDex를 사용해 배리어를 구축하였다. 배리어는 상기 (1)과 같이 구축하였다. 그러나, 2.0% 농도에서는, GrowDex가 뻑뻑해, "볼더 (boulder)와 거품"없이 배리어를 구축하기가 불가능하였다. 이 조성물은 배지 및 세포가 한쪽에서 다른 쪽으로 통과하는 것을 허용하므로, 의도한 목적으로 사용할 수 없다. 경직성을 줄이기 위해, 2.0% 겔을 하기와 같이 물을 사용해 점진적으로 희석하였다:
50 ㎕ H2O를 2.0% GrowDex 1 ml 당 첨가 - -1.9% GrowDex
+100 ㎕ H2O -> ~1.7% GrowDex
+200 ㎕ H2O -> ~1.5% GrowDex
GrowDex를 희석하는 단계들 사이에 파이펫 팁으로 혼합하였다.
2.0% GrowDex의 희석은 보다 균질한 구조의 배리어를 구축하는데 도움이 되었다. 한편, 배리어가 "느슨"해졌으며, 배지를 웰에 첨가하였을 때 용해되는 것으로 보였다. 그래서, 이 배리어는 실험에 사용할 수 없었으며, 투명한 2.0% GrowDex를 이용한 추가적인 시험은 수행하지 않았다. 도 12는 브라이트 (bright) GrowDex로 구축한 배리어를 도시한다. 우측 열에서 3개의 "분홍색" 배리어: 2.0% GrowDex. 좌측의 2개의 "분홍색" 배리어: ~1.7-1.9% GrowDex. 분홍색 배지가 없는 웰 2개 (상단 좌측): ~1.5% GrowDex
BJ 세포 접종
다음날, BJ 세포 배양 배지 200 ㎕를 배리어 양쪽에 첨가하여, BK 세포 접종하기 전 1시간 동안 배리어에 수분을 공급하였다.
BJ 세포 현탁물을 BJ 세포 배양 배지 중에 40 000 세포/ml의 밀도로 준비하였다. 배리어의 우측편에서 배지를 제거하고, BJ 현탁물 150 ㎕로 교체하여, 6000 BJ 세포/웰로 만들었다. 플레이트를 부드럽게 흔들어, 세포를 고르게 분산시켰다. 그런 후, 배지가 배리어를 넘지 않도록 조심하면서 BJ 세포 배양 배지 50 ㎕를 세포의 정상부에 첨가하였다.
다음날, HepaRG 세포를 접종하기 전에, BJ 세포의 배지를 교체하였다:
기존 배지는 조심스럽게 파이펫팅하여 제거하고, 5% FBS가 첨가된 BJ 세포 배양 배지 200 ㎕로 교체하였다.
HepaRG 세포 접종
다음날, BJ 세포를 접종한 후, 웰을 현미경으로 검경하였다. 배리어의 우측에 접종한 BJ가 배리어의 좌측에서도 발견되어, 배리어 12개 중 4개가 새는 것으로 확인되었다. 그러나, 이때 임의 웰을 제외하지 않고, 실험을 계속 진행하였다.
HepaRG 현탁물을 HepaRG® 해동/접종/범용 배지 670에 2백만개 HepaRG 세포/ml의 밀도로 준비하였다. 배리어의 좌측에서 배지를 제거하고, HepaRG 현탁물 200 ㎕를 첨가하였으며, 즉, 세포 400 000개를 각 웰에 첨가하였다.
플레이트를 앞뒤, 양옆으로 서서히 흔들었으며, 세포의 고른 분산성을 시각적으로 확인하였다 (도 13). 플레이트를 다시 세포 배양 인큐베이터에 넣고, 노출 전 4시간 동안 세포가 회복되게 두었다.
셀레길린 희석물 제조
사용 당일에 셀레길린 희석물을 제조하였다. 먼저, 1 mg/ml 셀레길린 스톡을 HepaRG TOX 배지에서 제조하였다. 그런 후, 스톡과 HepaRG TOX 배지를 사용해 20 ㎍/ml, 10 ㎍/ml 및 2 ㎍/ml 셀레길린 희석물을 제조하였다. HepaRG TOX 배지 단독을 비히클 대조군으로 사용하였다.
노출
(배리어의 좌측) HepaRG 세포에서 배지를 조심스럽게 제거하고, 100 ㎕/웰 HepaRG TOX 배지/웰로 교체하였다. 이는 한번에 웰 하나씩 수행하였다.
모든 웰에서 배지를 교체한 후, 셀레길린 희석물 100 ㎕ 및 비히클 대조군을 HepaRG 세포 위에 첨가하였다. 셀레길린의 최종 농도는 그래서 사용 희석물의 0.5x 농도, 즉 10 ㎍/ml, 5 ㎍/ml 및 1 ㎍/ml이었다. 세포는 WST-1 분석하기 전 3시간 동안 인큐베이션하였다.
세포독성/생존성 분석 (WST -1)
3시간 인큐베이션한 후, WST-1 시약 20 ㎕를 배리어의 양쪽에 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배리어의 양쪽에서 39개의 포인트로부터 흡광도를 측정하는 멀티포인트 측정 프로그램을 사용해 흡광도를 측정하였다. 도 14를 참조한다.
데이터 취급
평균 흡광도를 각각의 웰에서 배리어의 양쪽 모두에서 각각 계산하였다. 데이터의 신뢰성 결정은 각 웰에서 각각 수행하였다. 웰 데이터는, 배리어가 적절하게 기능하는 한, 즉, 450 nm에서 HepaRG 대 BJ 흡광도 비가 >2.0이면, 수용하였다.
이에 따라, 웰 12개 중 6개가 허용되었으며, 이들 웰 6개의 흡광도 데이터를 결과 계산에 이용하였다. 도 15는 배리어 구축 직후를 도시한 것이다. 표 2는 세포 접종 및 셀레길린에의 노출 후 24웰 플레이트의 구성을 보여준다. 계산에서 제외된 웰들은 음영 처리하였다.
Figure pat00001
결과
표 3은, 셀레길린을 HepaRG 세포를 경유해 BJ 세포에 3시간 노출시켰을 때, HepaRG 및 BJ 세포 생존성에 대한 셀레길린의 효과를 요약하여 나타낸다. 셀레길린은 최저 농도, 즉 1 및 5 ㎍/ml에서 HepaRG 및 BJ 생존성 둘다를 높이는 것으로 관찰되었다. 최고 농도, 10 ㎍/ml에서는 HepaRG 및 BJ 생존성이 각각 ~5% 및 ~25% 감소하였다.
표 3. 3시간 노출 후 BJ 및 HepaRG 세포 생존성에 대한 셀레길린 효과. 데이터는 450 nm에서의 흡광도이다. HepaRG 및 BJ 세포를 GrowDex 배리어에 의해 분리하였다. 셀레길린 첨가는 항상 HepaRG 세포를 통해 수행하였다. 처리 당 웰 1/3개에서 결과를 수득하였다. 흡광도 측정은, 배리어 양쪽에서 39 포인트를 측정하는 멀티포인트 측정으로, 수행하였다.
셀레길린 무첨가
(대조군) 		1 μg /ml
셀레길린 		5 μg /ml
셀레길린 		10 μg /ml
셀레길린
HepaRG BJ 세포 HepaRG BJ 세포 HepaRG BJ 세포 HepaRG BJ 세포
평균 3.052 1.010 3.486 1.429 3.344 1.219 2.892 0.760
중앙값 3.165 0.963 3.794 1.539 3.588 1.243 3.078 0.676
STDEV 0.570 0.517 0.636 0.560 0.672 0.596 0.518 0.395
STERR 0.053 0.048 0.102 0.090 0.108 0.096 0.083 0.063
MIN 1.616 0.389 2.309 0.455 1.812 0.421 1.478 0.381
MAX 4.070 2.097 4.297 2.170 4.138 2.193 3.561 1.511
대조군의 % 100.00 100.00 114.23 141.43 109.57 120.69 94.77 75.19
N 117 117 39 39 39 39 39 39
결론
WST-1은 세포 생존성의 인덱스로서 미토콘드리아 활성을 측정하므로, 셀레길린이 최저 농도에서 호르메시스 (hormesis), 즉 HepaRG 및 BJ 세포 둘다의 대사적 활성화를 유발하는 것으로 보인다 (이는 BJ 세포를 이용한 실험 1에서도 관찰되었음). 그러나, 최고 농도에서는 BJ 생존성을 25% 감소시켰다. 이는 HepaRG 세포에 의해 셀레길린으로부터 생성되는 독성 대사산물이 그 원인일 수 있다. 이는 HepaRG 처리없이 셀레길린을 사용하는 경우 BJ 세포 생존성이 감소되지 않았으므로, 실험 1로부터 뒷받침된다.
실험 3 HepaRG 세포를 통해 노출한 경우 ( BJ 세포에 대한 파라세타몰의 독성
목적
실험 3의 목적은 실시예 2와 원칙적으로 동일하며, 즉, 제안된 시험 모델, 즉 GrowDex 배리어에 의해 분리된 24웰 플레이트의 웰에서 HepaRG 세포 (대사 구성성분) 및 BJ 섬유모세포 (타겟 세포)의 공배양이 타겟 세포에 대한 대사-의존적인 독성을 인지하는데 사용할 수 있는 지를 조사하기 위한 것이었다. 실험 2와의 차이는 다음과 같다:
ㆍ 파라세타몰을 시험 화합물로 사용
ㆍ 안정성을 개선하기 위해 더 낮은 GrowDex 배리어를 구축하고, 배리어의 한쪽 사이드의 부피를 200 ㎕에서 150 ㎕로 줄임
ㆍ 웰 안의 BJ 세포의 양을 실험 2에서보다 높임
ㆍ 노출 시간이 4시간 및 20시간임.
절차
GrowDex 배리어 구축
다음과 같이, GrowDex 배리어를 구축하여, 24웰 플레이트의 웰들을 "동일 크기"의 2개의 구획으로 나누었다. GrowDex 250 ㎕를 웰에 (파지티브 디스플레이스먼트 파이펫을 사용하여) 파이펫팅하여, 배리어의 제1 층을 구축하였다. 배리어를 층류 후드에서 뚜껑을 연 상태로 1시간 동안 건조시켰다. 그런 후, 제2 층을 제1 층 위에 파이펫팅하였다. GrowDex (lot11992)의 조성물이 점점 느슨해졌으며, 기포가 생기지 않도록 조심하면서 페트리 디쉬에서 수회 혼합하였다.
모두 배리어 20개를 구축하였다. 배리어 구축 후, 뚜껑을 닫은 상태로 밤새 실온에서 건조시켰다 (실험 2와의 차이는, 플레이트를 밤새 냉장고에 두었다는 것이다).
BJ 세포 접종
다음날, 배리어 20개 중 6개가 붕괴되어, 이를 제외하였다. 사용가능한 배리어 14개에 BJ 세포 배양물 200 ㎕를 배리어 양쪽에 첨가하여, 촉촉하게 만들었다. 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣어 1시간 동안 인큐베이션하였다.
BJ 세포 현탁물을 BJ 세포 배양물에 70 000 세포/ml의 밀도로 준비하고, 이 현탁물 150 ㎕를 배리어의 우측에 파이펫팅하여, 웰 당 세포 10 500개가 되게 하였다.
다음날, HepaRG 세포 접종하기 전, 사용한 배지를 조심스럽게 제거하고 이를 5% FBS가 첨가된 BJ 세포 배양 배지 150 ㎕로 교체하여, BJ 세포의 배지를 교체하였다.
HepaRG 세포 접종
HepaRG 현탁물을 HepaRG® 해동/접종/범용 배지 670에 2백만개 HepaRG 세포/ml의 밀도로 준비하였다. 배리어의 좌측에서 배지를 제거하였다. HepaRG 현탁물 150 ㎕를 첨가하였으며, 즉, 세포 300 000개를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 앞뒤, 양옆으로 서서히 흔들었으며, 세포의 균일한 분산을 시각적으로 확인하였다. 플레이트를 다시 세포 배양 인큐베이터에 넣고, 노출 전 4시간 동안 세포가 회복되게 두었다.
파라세타몰 희석물 제조
사용 당일에 파라세타몰 희석물을 제조하였다. 먼저, 1 mg/ml 파라세타몰 스톡을 HepaRG TOX 배지에서 제조하였다. 그런 후, 스톡과 HepaRG TOX 배지를 사용해 500 ㎍/ml 희석물을 제조하였다. HepaRG TOX 배지 단독을 비히클 대조군으로 사용하였다.
노출
(배리어의 좌측) HepaRG 세포에서 배지를 조심스럽게 제거하고, 75 ㎕/웰 HepaRG TOX 배지/웰로 교체하였다. 이는 한번에 웰 하나씩 수행하였다. 모든 웰에서 배지를 교체한 후, 파라세타몰 희석물 75 ㎕ 및 비히클 대조군을 HepaRG 세포 위에 첨가하였다. 파라세타몰의 최종 농도는 그래서 사용 희석물의 0.5x 농도, 즉 500 ㎍/ml 및 100 ㎍/ml이었다. 세포는 WST-1 분석하기 전 4시간 및 24시간 동안 인큐베이션하였다.
세포독성/생존성 분석 (WST -1)
인큐베이션한 후, WST-1 시약 15 ㎕를 배리어의 양쪽에 첨가하였다. 플레이트를 4시간 노출한 경우 1시간 동안, 20시간 노출한 경우 2시간 동안 인큐베이션하였다. 멀티포인트 측정으로 흡광도를 측정하였다.
데이터 취급
실험 2에 기술된 바와 같이 결과를 계산하였다. (배리어) 웰 6개 중 4개가 4시간 노출시 허용 기준을 통과하였고 (도 16), (배리어) 웰 8개 중 4개는 20시간 노출시 허용 기준을 통과하였다 (도 17).
표 4는 세포 접종 및 파라세타몰에 4시간 노출 후 도 16에 따른 24웰 플레이트의 구성을 표시한다. 계산에서 제외된 웰들은 음영 처리하였다.
Figure pat00002
표 5는 세포 접종 및 파라세타몰에 20시간 노출 후 도 17에 따른 24웰 플레이트의 구성을 표시한다. 계산에서 제외된 웰들은 음영 처리하였다.
Figure pat00003
결과
표 6 및 7은 BJ 세포를 HepaRG를 통해 4시간 (표 6) 및 20시간 (표 7) 노출한 경우의, HepaRG 및 BJ 세포 생존성에 대한 파라세타몰의 효과를 요약 개시한다. 단기간의 노출은 500 ㎍/ml에서 세포 생존성에 영향을 미치진 않았지만, 250 ㎍/ml 파라세타몰은 HepaRG 생존성을 증가시켰으며, BJ 세포 생존성은 ~40% 낮추는 것으로 나타났다. 장시간 노출시, 파라세타몰은 250 ㎍/ml 수준에서 BJ 생존성을 ~30% 증가시키고, 최고 농도에서 HepaRG를 ~10% 감소시켰다.
표 6-7. 4시간 노출 (표 6) 및 20시간 노출 (표 IV) 후 BJ 및 HepaRG 생존성에 대한 파라세타몰의 효과. 데이터는 450 nm에서의 흡광도를 나타낸다. HepaRG 및 BJ 세포를 GrowDex 배리어에 의해 분리하였다. 파라세타몰 첨가는 항상 HepaRG 세포를 통해 이루어졌다. 처리 당 웰 1-2개에서 결과를 수득한다. 흡광도 측정은, 배리어의 양쪽에서 39개의 포인트에서 측정하는, 멀티포인트 측정으로 수행하였다.
파라세타몰 무첨가
(대조군) 		250 μg /ml
파라세타몰 		500 μg /ml
파라세타몰
HepaRG BJ 세포 HepaRG BJ 세포 HepaRG BJ 세포
평균 4.172 1.196 3.571 1.685 4.074 1.188
중앙값 4.327 1.074 3.513 1.777 4.134 1.164
STDEV 0.619 0.529 0.562 0.743 0.422 0.525
STERR 0.070 0.060 0.064 0.084 0.068 0.084
MIN 2.866 0.563 2.554 0.539 3.122 0.607
MAX 6.000 2.244 4.768 3.105 4.680 2.302
대조군의 % 100.00 100.00 85.58 140.89 97.65 99.34
N 78 78 78 78 39 39
파라세타몰 무첨가
(대조군) 		250 μg /ml
파라세타몰 		500 μg /ml
파라세타몰
HepaRG BJ 세포 HepaRG BJ 세포 HepaRG BJ 세포
평균 3.966 1.386 4.196 1.777 3.606 1.356
중앙값 3.928 1.293 4.239 1.801 3.771 1.325
STDEV 0.496 0.599 0.494 0.706 0.563 0.619
STERR 0.056 0.068 0.079 0.113 0.090 0.099
MIN 3.009 0.687 3.355 0.865 2.801 0.632
MAX 4.941 2.496 5.149 2.959 4.483 2.268
대조군의 % 100.00 100.00 105.78 128.23 90.91 97.89
N 78 78 39 39 39 39
실험 4 ( HepaRG 세포의 대사 활성)
목적
HepaRG 세포가 CYP 유도 및 약물 대사 (EURL ECVAM 2012)를 실험하기 위한 좋은 모델로 간주되지만, 파라세타몰의 예상되는 대사-의존적인 독성을 입증하는데 실패하여, 실험 3 이후로, HepaRG 세포의 대사 활성을 의심하게 되었다. 이에, 대사 의존적인 독성을 조사하기 위해 기존에 개발된 방법으로 실험을 수행하였으며, 간세포-컨디셔닝화된 노출 배지 및 비-컨디셔닝화된 배지 둘다를 BJ 세포에 처리하였다.
절차
BJ 섬유모세포 접종
BJ 세포 현탁액을 BJ 세포 배양 배지에서 40 000 세포/ml의 밀도로 준비하였다. 현탁액 100 ㎕를 96웰 플레이트에 웰 당 세포 4000개가 되도록 파이펫팅하였다.
HepaRG 세포 접종
실험 3에서 남은 HepaRG 세포를 25 cm2 세포 배양 플라스크에 접종하여 1주일간 배양하였다. 일주일 동안 배지 (HepaRG 유도 배지)를 2회 교체하였다.
HepaRG 세포를 이용한 파라세타몰의 컨디셔닝
(25 cm2 플라스크에서 배양한) HepaRG 세포에서 배지를 제거하고, HepaRG TOX 배지 2.5 ml로 교체하였다. 그런 후, HepaRG TOX 배지 중에 준비한 1 mg/ml 파라세타몰 2.5 ml을 플라스크에 첨가하였다 (파라세타몰 최종 농도 500 ㎍/ml). HepaRG 세포를 파라세타몰과 함께 20시간 인큐베이션하였다.
파라세타몰 및 HepaRG-처리 파라세타몰에의 BJ 세포 노출
BJ 세포에서 배지를 제거하고, BJ 화학 희석 배지 중의 500 ㎍/ml 파라세타몰 또는 HepaRG TOX 배지 중의 500 ㎍/ml HepaRG-컨디셔닝화된-파라세타몰로 교체하였다. BJ 화학 희석 배지 및 HepaRG TOX 배지를 비히클 대조군으로 사용하였다. 모든 처리는 16개의 병렬 웰에서 검사하였다. 노출 시간은 24시간이었다.
세포독성/생존성 분석
노출 후, WST-1 시약 10 ㎕를 웰에 첨가하였다. 플레이트를 2시간 동안 인큐베이션하고, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
데이터 취급
블랭크 값 (약물을 비롯한 모든 시약 함유, 그러나 세포는 함유하지 않음)을 흡광도 데이터에서 제하였다. 그 결과는 무처리 (비히클) 대조군과 비교하여 생존 세포의 %로 나타내었다. 무처리 대조군과 처리 세포 간의 통계학적 차이는 t-검정 (SigmaPiot)으로 분석하였다.
결과
HepaRG-처리는 BJ 섬유모세포의 생존성에 최소한의 효과를 나타내었다. 도 18은 인간 BJ 섬유모세포의 생존성에 대한 직접적인 파라세타몰 또는 HepaRG-컨디셔닝화된 파라세타몰 노출 효과를 보여준다.
결론
HepaRG 세포는 파라세타몰을 BJ 세포에 독성인 대사산물로 변환하지 않았다. 그래서, 파라세타몰이 HepaRG 세포에 의해 대사되지 않았다는 결론을 내리게 되었다.
고찰
배리어 구조체
GrowDex 배리어를 구축하기 위해 수회 시도하였다. 성공적인 시도와 덜 성공적인 시도 전체를 기반으로, 다음과 같은 결론을 내릴 수 있었다.
내구성 있는 배리어를 구축하는데 도움이 될 수 있는 다음과 같은 관찰 결과들이 수득되었다:
ㆍ 1.5% GrowDex 사용. 브라이트 GrowDex를 사용하지 않음.
ㆍ GrowDex를 시험관 또는 시린지로부터 직접 파이펫팅하지 않음. 대신 겔을 페트리 디쉬에 옮기고, 기포가 생기지 않도록 조심하면서 혼합한다. 이 조성물은, 배리어를 파이펫팅할 때, 매우 균질하다는 점이 매우 중요하다.
ㆍ 배리어를 2개의 층으로부터 제조하고 (24웰 플레이트에서, 2 x 250 ㎕), 제1 층을 0.5-1.0시간 동안 층류 후드 (RT)에서 뚜껑을 연 상태로 건조한 다음 제2 층을 적층한다 (전체 배리어를 한번에 구축할 경우, 이후 24시간 내에 붕괴됨).
ㆍ 제2 층을 층류 후드 (RT)에서 뚜껑을 연 상태로 0.5-1.0시간 동안 건조시킨다.
ㆍ 낮고 넓은 배리어가 높고 좁은 배리어 보다 내구성이 우수하다. 이 둘다 제조 가능하지만, 좁은 배리어는 이후 24시간 내에 붕괴되는 경향이 있다.
ㆍ 배리어를 예를 들어 스파텔 (spatel)을 사용해 기계적으로 고정하고자 시도하지 않는다. 이는 솔깃한 일이지만, 웰에 배리어 부착성을 떨어뜨리고, 세포가 샐 위험을 높인다.
ㆍ 배리어를 밤새 실온에서 뚜껑을 닫은 상태로 보관한다.
ㆍ 사용하기 1시간 전에 세포 접종에 사용되는 것과 동일한 배지로 수분을 제공한다.
(HepaRG:BJ 흡광도 비율에 대한 척도에 따라) 배리어의 약 50%가 새는 것으로 확인되어, GrowDex 배리어를 웰의 표면에 부착하기 위한 더 좋은 방법이 필요하다. 콜라겐-코팅도 웰 표면에 대한 다른 처리도 시도된 바 없다.
HepaRG 세포의 대사 활성
제조사 (Thermo Fisher Scientific)에 따르면, 냉동보존된 HepaRG™ 세포는 해동 및 접종 후 처음 24시간 동안 CYP 활성을 높은 수준으로 유지하며, 이 활성은 세포가 단일층을 형성하면서 감소된 다음 배양 4일째에 회복하여 7-10일에 최고 수준에 도달한다. 그래서, 실험을 처음 24시간 동안 수행함에 따라, HepaRG 세포의 적절한 대사 활성이 예상되었다. BJ 세포에 대한 셀레길린 독성은 HepaRG 처리 후 증가되었음에도 불구하고, 파라세타몰은 독성이 더 강한 화합물로 대사되지 않았다. 냉동보존된 HepaRG 세포의 대사 활성은 실제 배양 10일 후 최고 수준에 도달하지만, 처음 24시간 이내에 대부분의 CYP 효소 활성이 CYP3A4를 제외하고는 낮은 것으로 확인되었다. 파라세타몰 대사에서 CYP3A4의 역할은 논란의 여지가 있으며, 결과는 파라세타몰 대사에서 CYP3A4의 유의한 기여가 없는 수준에서부터 주요 역할 (primary role)에 이르기까지 다양하다. 대신 CYP2B6는 셀레길린 대사에 주된 역할을 담당하며, CYP3A4는 덜 중요하다.
배리어 구축 후 10일간 HepaRG 배양을 유지하기가 어려울 것이다. 이에, 현재 모델에 사용할 수 있는 최상의 선택은 인간 냉동보존된 간세포 또는 일차 간세포일 것이며, 이는 즉시 사용할 수 있으며, 사용하여야 한다. 별도로 동의한다면, FICAM은 이 검사를 기꺼이 수행할 것이다.
노출 시간
셀레길린 및 파라세타몰에 대해 3-4시간 노출 시간을 적용하였으며, 파라세타몰에는 20시간 노출도 적용하였다. 약물 대사가 수시간 이내에 발생하였으며, 셀레길린을 독성 대사산물로 변환하는데 3시간은 실제 충분히 길었다. 배양 시간이 더 길 필요는 없으며, 타겟 세포에 대한 대사 의존적인 독성을 측정하기 위해 배양 시간이 더 길어서는 안된다.
결론
ㆍ 예비 검사 방법 프로토콜, 즉 GrowDex 배리어에 의해 분할된 24웰 플레이트의 웰에서 HepaRG 세포 (대사 구성성분)와 BJ 섬유모세포 (타겟 세포)를 공배양하고 시험 화합물을 HepaRG를 통해 첨가하는 방법을 개발하였다.
이 검사 방법으로, 셀레길린의 대사-의존적인 독성을 입증하는 것이 가능하였다. 그러나, 파라세타몰의 대사-의존적인 독성은 입증하기 불가능하였다.
ㆍ HepaRG는, 효소 활성이 해동 직후에 충분히 높지 않은 것으로 보이므로, 검사 방법에 사용할 최상의 대사 구성성분이 아니다. 한편, 실험에서 하나의 lot만 사용하였으므로, lot에 따라 차이가 있을 수 있다.
ㆍ 배리어의 성공율은 ~50%이었다.
실시예 3: 3D 프린터를 이용한 나노피브릴 셀룰로스 구축
본 실험의 목적은, 3D 프린터를 사용해 나노피브릴 셀룰로스 배리어를 구축할 수 있는 지를 조사하는 것이었다. 2번째 목적은 배리어 특성, 배리어가 서로 다른 구획에 분리된 세포를 유지하면서도 영양분과 화합물은 여전히 하나의 세포 구획에서 다른 구획으로 통과시킬 수 있는 지를 조사하는 것이었다. GrowDexTM을 나노피브릴 셀룰로스로서 사용하였다.
이전 실험에서, 1.5% GrowDex를 사용해 배리어를 수동으로 구축할 수 있음을 확인하였다. 그러나, 이 배리어의 성공율 (배리어 누출/견고성 측면에서)은 약 50%였다. 3D 프린터의 사용은 수동 적용과 비교해 보다 균일한 배리어의 제조 및 자동화 이점을 가져다 줄 것이다.
재료
검사 시스템
ATCC (FICAM lot 1-BJ/13)에서 구입한 인간 섬유모세포 BJ (Cat No. HB-8065)를 실험에 사용하였다.
GrowDex 세포 배양용 하이드로겔
ㆍ GrowDexT, 1.0% (음이온성)
ㆍ GrowDex, 1.5% (화학적으로 비-변형됨)
ㆍ GrowDexT, 2.0% (음이온성)
GrowDex를 시린지에 포장된 형태로 UPM 사에서 입수하였다. 상세 내용 lot 등은 부록 1을 참조한다.
시약, 용액 및 재료
ㆍ 젤라틴 (Sigma #G1890, lot SLBX2973), FICAM lot 2% 젤라틴/MPE/1/110319
ㆍ 0.1 mg/ml 폴리-D-라이신 (Sigma, #P6407, lot 090M8707V)
ㆍ 피브로넥틴 (Promocell #C-43050, lot 439P121)
ㆍ dH2O (Gibco #15230, lots 1641929, 1814133, 1895791)
ㆍ PBS (Lonza #17-516F, lot 708833)
ㆍ CaCl2 (Sigma, #793639, lot MKCG4711
ㆍ MEM (Gibco #21090, lot 1944344)
ㆍ BJ 세포 배양 배지, FICAM lot BJ/CT0097/MPE/1/201118, BJ/CT0097/MPE/2/301118, BJ/CT0097/MPE/3/040119, BJ/CT0097/MPE/4/130119, BJ/CT0097/3/MPE/1/130319
ㆍ 0.2% 트리판 블루, FICAM lot 0.2% TB/HM/20/100419
ㆍ 아미트립틸린 하이드로클로라이드 (CAS 151-21-3) (Sigma # A8404, lot BCBN3158V)
ㆍ SDS (CAS 549-18-8) (Sigma #L6026, lot SLBV9880)
ㆍ WST-1 (Takara #MK400, lot AHXP001)
ㆍ 24웰 플레이트
ㆍ 12웰 플레이트
ㆍ 16G 금속 바늘, BD 정밀 글라이드, REF 301692
ㆍ 플라스틱 루어 팁 (Adhesive Dispensing Ltd: 25G #AD25TT lot 4502063-30; 22G #AD22TT lot 4502004-46; 18G #AD18TT lot 4502335-9)
장치
ㆍ Fab@home v1 3D 프린터
ㆍ 도립 광학 현미경 (Zeiss Primovert + Axiocam ERc 5s) + 디지털 카메라
ㆍ 플레이트 판독기
실험 절차
실험을 2 파트로 나누었다:
1) 제1 파트에서, GrowDex 배리어를 3D 인쇄하기 위한 프로토콜을 구성 및 최적화하였다. 배리어 하부 코팅 효과 및 배리어의 안정성을 검사하였다.
2) 제2 파트에서, 배리어 특성에 대한 예비 조사를 BJ 세포 및 소듐 도데실 설페이트 (SDS)와 기준 화합물로서 아미트립틸린 하이드로클로라이드를 이용해 수행하여, 배리어가 분리된 세포를 서로 다른 구획에서 유지하면서도 여전히 영양분과 화합물을 한 구획에서 다른 구획으로 통과시킬 수 있는 지를 확인하였다. 아미트립틸린은 삼환식 화합물로서, 구체적으로 다이벤조사이클로헵타다이엔 3-(10,11-다이하이드로-5H-다이벤조[a,d]사이클로헵텐-5-일리덴)-N,N-다이메틸프로판-1-아민이며, 이는 화학 구조에 결합된 측쇄와 함께 융합된 고리 3개를 가지고 있다.
3D 프린터를 사용한 12웰 및 24웰 플레이트에 둥근형의 배리어 구축
3D 인쇄를 위한 제조 프로토콜
목적
실험의 제1 파트의 목적은 멀티-웰 플레이트의 웰에 GrowDex를 인쇄하기 위해 3D 프린터를 최적화하는 것이었다. 다음과 같은 문제를 고려하였다:
1. 3D 프린터에 GrowDex 시린지 사용
2. 각각의 GrowDex 농도에서 최적의 프린터 파라미터 탐색
3. GrowDex의 농도 최적화
4. 12웰 및 24웰 포맷으로의 활용성
3D-프린터에 GrowDex 시린지 사용
3D 인쇄에서 직접 5-10 ml GrowDex 시린지의 적합성을 조사하였다. GrowDex가 공급된 시린지, Braun Omnifix를 3D 프린터의 홀더에 맞게 변형하여야 하였다. 이를 위해, 플런저를 연장된 위치에서 수 ml 위로 민 다음 시린지의 정상부를 나이프 얼라인 (knife align)으로 절단하였다. 그런 후, 겔이 팁을 통해 흐르기 시작할 때까지, 플런저를 아래로 밀었다. 그 후, 플런저를 자체 기전으로 밀도록 프린터를 설정하였다.
이차로, 여러가지 시린지 팁과 바늘을 검사하였다. 한가지 중요한 문제가 드러났다; 견고한 잠금 기전 없이는 시린지 헤드와 팁 사이에서 상당한 누출이 발생하였다. 해법은 팁에 루어 잠근 기전을 추가하는 것이었다. 또한, 여러가지 게이지 크기의 바늘 (금속 16G, 플라스틱 25, 22, 18G)도 검사하였다. 금속 16G가 1.5% GrowDex 및 2.0% GrowDexT 둘다를 이용하는데 가장 최상의 선택인 것으로 보였다. 플라스틱 게이지는, 겔이 팁에서 균일하게 나오지 않기 때문에, 금속 게이지처럼 잘 작동하지 않았다.
하이드로겔의 막힘 (clogging) 및 기포 발생 또는 시린지 플러저의 경직성 (rigidity)이 불균일한 인쇄 및 배리어의 품질 저하를 유발하였다 (도 19). 이러한 문제들을 해결하기 위해, 시린지가 이미 개봉되었다면 하이드로겔을 새로운 시린지로 옮겼다. 이는 도움이 되었지만, 심지어 미-개봉 시린지의 플런저도 때때로 경직되는 것으로 나타났다. 그래서, 하이드로겔은 시린지가 미리 개봉되었는 지의 여부에 따라 새로운 시린지로 옮겨야 하였다. 도 19A-C는 1.5% GrowDex (A, B) 및 2.0% GrowDexT (C)를 이용하여 인쇄한 고르지 못한 배리어 구조체를 보여준다.
각 농도에서 최적의 프린터 파라미터 탐색
멀티-웰 플레이트에 인쇄를 개시하기 전에 인쇄 프로토콜을 최적화하였다 (도 20). 여러가지 웰 플레이트 및 하이드로겔 농도에서, 최적의 파라미터는 약간 상이하였으며, 표 8을 참조한다.
표 8. 최적의 프린터 파라미터
1.5% GrowDex, 12웰 플레이트 2.0% GrowDexT, 12웰 플레이트 1.0% GrowDexT, 12웰 플레이트 1.5% GrowDex, 24웰 플레이트 2.0% GrowDexT, 24웰 플레이트
통로 폭 mm 1.0 1.0 1,0 1.0 1
통로 높이 mm 1.0 1.0 1.0 1.1 1.1
분사 s 0.050 0.050 0.200 0.050 0.05
석백 s 0.080 0.080 0.080 0.080 0.08
증착 속도 mm 0.019 0.015 0.017 0.019 0.015
증분 mm 0.500 0.500 0.500 0.500 0.500
통로 속도 mm/s 2 2 2 2 2
배리어를 인쇄하기 위해, 웰의 스테레오리소그라피 (stereolithography, STL) 이미지를 CAD 프로그램을 사용해 준비하였다. 12웰 플레이트의 경우, 횡단면 11 mm, 벽 두께 1.5 mm 및 높이 5 mm의 원 형상의 배리어를 그리고, 24웰 플레이트의 경우, 횡단면 9 mm, 벽 두께 0.5 mm 및 높이 5 mm의 배리어를 각각 그렸다. 각 인쇄 라운드에서, 2개의 하이드로겔 고리를 (중간에 건조없이) 나란히 인쇄하였다. 다음 라운드에서는, 2개의 고리를 2개의 첫번째 고리 위에 인쇄하였다. 4번의 라운드를 통해 8개의 고리를 인쇄하여 하나의 배리어 고리를 구축하였다. 전체 플레이트는 먼저 제1 층으로 인쇄된 다음 제1 벽에서 다시 인쇄를 개시하여 제2 층을 부가하는 방식 등으로 진행되었다. 인쇄하는 동안에 팁이 이전 층에 닿도록 설정하여층을 적층하였다. 이는 배리어를 보다 균일하게 만들며 (벽부에 가능한 결함, 예를 들어 갭을 매끄럽게 만듬), 또한 배리어 벽을 다소 더 넓게/두껍게 만든다. 벽 두께는 벽의 안정성에 영향을 미쳤으며, 매우 얇은 벽은 더 쉽게 붕괴되는 경향을 보인다.
또한, 전술한 바와 같이, 배리어가 기판으로부터 탈착되는 것을 방지하기 위한 코팅뿐 아니라 다른 안정화 조치도 취하였다. 도 20은 멀티-웰 플레이트 (하단 도)로 옮기기 전에 필름 상에 행해진 1차 3D-인쇄 (상단 도)를 보여준다.
하이드로겔의 농도 최적화
1.5% 및 2.0% GrowDexT 2종을 사용해 원형의 배리어를 인쇄하였다. 1.0% GrowDexT를 인쇄하고자 시도하였지만, 성공하진 못하였다. 1.0% GrowDex는 인쇄하기에는 물러, 구축된 배리어의 형상이 잘 잡히지 않았다. 1차 시도 실패 (2018년 12월 5일) 후, 1.0% GrowDexT는 3D 인쇄에 더 이상 사용하지 않았다. 결론적으로, 1.5% GrowDex 및 2.0% GrowDexT 둘다 3D-프린터를 사용해 배리어를 구축하는데 사용할 수 있다.
12웰 및 24웰 포맷에서의 이용가능성
12웰 및 24웰 플레이트 둘다에 인쇄하는 것이 가능하였으며, 이 2가지 웰 플레이트 타입을 세포 어플리케이션에 사용할 수 있다 (배리어의 안쪽 및 바깥쪽에 세포를 위한 열린 공간이 존재함). 기술적인 상세 내용은 표 9에 요약 개시된다. 3D 인쇄를 위한 최적화된 프로토콜은 부록 2로 첨부된다.
표 9. GrowDex 배리어의 3D 인쇄에 대한 기술적인 상세 내용 요약
1.5% GrowDex 2.0% GrowDexT
멀티-웰 플레이트 12 24 12 24
플레이트 당 하이드로겔 사용량 (ml) 5 10 5 10
하이드로겔 부피 (㎕)/고리 417 417 417 417
층 개수/배리어 4 X 2*
층 사이 건조 시간 (분) 15 min
인쇄 시간/플레이트 1 h 1.5 h 1 h 1.5 h
배리어의 높이 (mm) 5
구축 후 건조 1 h
보관 비히클 및 온도 PBS 또는 MEM, 4℃, 파라필름으로 밀봉
안정성 상기와 같이 보관하는 경우, 적어도 2주
워킹 부피 (안쪽) ㎕ 100 50 100 50
워킹 부피 (바깥쪽) ㎕ 400 200 400 200
바늘 16G 금속
* 각 라운드에서, 하이드로겔 고리 2개를 (중간에 건조하지 않고) 나란히 인쇄하였다. 다음 라운드에서, 1차 고리 2개의 상부에 2개의 고리를 인쇄하는 방식으로 진행하였다. 4번의 라운드를 통해 8개의 고리를 인쇄하였다.
배리어의 안정화
본 실험 파트의 목적은 안정화하기 위한, 즉 배리어의 형상을 유지시키기 위한 최선의 방법을 조사하는 것이었다.
절차
12웰 플레이트에 인쇄된 1.5% GrowDex 배리어를 안정화하기 위해 여러가지 비히클 (보관 비히클)을 조사하였다 (사진 3):
ㆍ 1% CaCl2에서 1시간, 2 ml/웰, 이후 밤새 건조.
ㆍ 1% CaCl2에서 밤새, 2 ml/웰
ㆍ MEM에서 밤새, 2 ml/웰
ㆍ 밤새 건조한 다음 2% CaCl2에 보관, 2 ml/웰
밤새 인큐베이션은 4℃에서 수행하였다. 표 10은 12웰 플레이트의 배치를 표시한다: 여러가지 비히클 내에서 1.5% GrowDex 배리어의 안정화.
Figure pat00004
결과 및 결론
검사한 모든 비히클, 즉, 1% CaCl2 및 MEM에서 배리어 구조들이 온전하게 유지되었지만, 배리어가 움직였으며, 즉 웰의 바닥부에 붙어 있지 않았다.
도 21은 여러가지 비히클 내에서의 배리어 구조체의 안정성을 보여준다; (좌에서 우측 방향으로): 1% CaCl2 1 hr, 1% CaCl2 밤새, MEM 밤새, 및 밤새 건조한 다음 2% CaCl2 첨가.
코팅
본 실험 파트의 목적은 배리어 (1.5 % 및 2.0%)를 웰의 바닥부에 붙인 상태로 유지할 수 있는 조건을 찾는 것이었다.
절차 및 결과
배리어를 웰 바닥부에 붙이기 위해, 3D 인쇄하기 전에 웰을 코팅하였다. 폴리-D-라이신, 젤라틴 및 피브로넥틴을 다음과 같이 코팅 물질로 사용하였다:
폴리 -D- 라이신
(PBS 중의) 0.1 mg/ml 폴리-D-라이신 300 ㎕를 웰 (12웰 플레이트) 당 파이펫팅하였다. 플레이트를 실온에서 5분간 인큐베이션하였다. 남아있는 폴리-D-라이신 용액을 웰에서 제거하고, 웰을 증류수로 헹군 다음 2시간 동안 건조시켰다.
젤라틴
(증류수 중에 준비한) 0.2% 젤라틴 300 ㎕을 웰 (12웰 플레이트) 당 파이펫팅하였다. 웰을 실온에서 2시간 동안 건조시켰다. 남아있는 젤라틴 용액을 제거하였다.
피브로넥틴 :
10 ㎍/ml 피브로넥틴 1 ml을 웰 (12웰 플레이트) 당 파이펫팅하고, 2시간 동안 건조시켰다. 남아있는 피브로넥틴 용액을 제거하였다.
1.5% GrowDex
1.5% GrowDex 배리어를 여러가지로 코팅된 (폴리-D-라이신, 젤라틴 또는 피브로넥틴) 및 코팅되지 않은 12웰 플레이트의 바닥부에 인쇄하였다. 인쇄 완료한 후 1시간 경과시, 웰에 1% CaCl2 또는 MEM을 2 ml/웰로 첨가하였다. 제일 밑의 열은 건조시켰다.
다음날, 배리어들 모두 형태는 유지하였지만, 폴리-D-라이신 및 젤라틴 코팅제 위의 배리어만 바닥부에 붙어있었다. 도 22는 여러가지 코팅 (및 비-코팅)된 웰 상에 구축되고, 여러가지 비히클 (A, B) 중에 유지시킨, 1.5% GrowDex 배리어를 보여준다. 피브로넥틴-코팅된 웰과 비-코팅된 웰 상에 구축된 배리어는, 플레이트를 45도 회전시켰을 때 아래로 미끌어졌다. 폴리-D-라이신 및 젤라틴 상의 배리어는 그 위치에서 붙은 상태로 유지되었다 (C).
2.0% GrowDexT
0.1 mg/ml 폴리-D-라이신 및 젤라틴이 1.5% GrowDex에 가장 적합한 코팅제였으므로 (상기 챕터 참조), 이들 코팅제 (피브로넥틴 제외)를 2.0% GrowDexT에 사용하였다.
다음날, 배리어들 모두 그 형태를 유지하였으며, 폴리-D-라이신 및 젤라틴-코팅된 웰의 바닥부에 붙어있었다. 도 23은 여러가지 코팅제 상에 구축하고 여러가지 비히클 중에 유지시킨 2.0% GrowDexT 배리어를 보여준다.
결론
웰의 바닥부에 배리어를 부착시키는데 폴리-D-라이신이 가장 최상의 코팅 물질로서 작용하였다. 이에 추가적인 실험을 위해 이를 선택하였다. 젤라틴 역시 배리어를 바닥부에 부착시켰지만, (본원에 기재하지 않은) 이전 실험들에 따르면, 세포가 젤라틴 코팅을 따라 움직일 수 있어, (세포가 이를 통과하는 것을 방지하는) 배리어 개념이 줄어든다.
배리어 특성: BJ 세포 및 여러가지 참조 화합물을 이용한 누출 검사
검사 1
3D-인쇄된 GrowDex 배리어가 의도한 용도로 적합한지를, 즉 배리어를 통한 세포 통과는 방지하지만 화합물의 통과는 허용하는 지를 조사하였다. 이를 검사하기 위해, BJ 세포를 배리어 바깥쪽에 접종하고, BK 세포에 독성인 것으로 알려진 화합물 (SDS 및 아미트립틸린 하이드로 클로라이드)을 배리어의 안쪽에 적용하였다. 24시간 인큐베이션한 후, 세포가 배리어 바깥쪽에 머무르는지, 배리어의 중앙에 투입된 화합물이 배리어 바깥쪽의 세포를 죽이는 지를 현미경을 사용해 평가하였다. 세포 생존성을 정량하기 위해, WST-1 분석을 이용하였다. WST-1 분석은 이전에 수동 구축된 배리어를 사용해 성공한 바 있어, 이를 선택하였다.
절차
코팅
12웰 플레이트 2개와 24웰 플레이트 2개를 0.1 mg/ml 폴리-D-라이신으로 코팅하였으며; 12웰 플레이트에는 0.3 ml/웰로, 24웰 플레이트에는 0.15 ml/웰로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 5분간 인큐베이션하였다. 그런 후, 폴리-D-라이신 용액을 제거한 다음 플레이트를 멸균 증류수로 헹구고, 실온에서 2시간 건조시켰다.
배리어 구축
2019년 2월 1일에 2.0% GrowDexT (lot 120664618t)를 포함하는 12웰 플레이트를, 2019년 2월 5일에는 1.5% GrowDex (lot 120074418g)를 포함하는 12웰 플레이트를 제작하였다.
2019년 2월 5일에는 1.5% GrowDex (lot1200615189) 및 2.0% GrowDexT (lot 120664618T) 배리어를 가진 24웰 플레이트를 제작하였다. 각각의 배리어는 4개의 인쇄된 GrowDex 층들로 구성된다. 3D-인쇄에 대한 보다 상세한 내용은 부록 1을 참조한다.
시각적으로 판단하였을 때 12웰 플레이트의 인쇄는 성공적이었다. 도 24는 12웰 플레이트에 2.0% GrowDexT (상단 도) 및 1.5% GrowDex (하단 도)로 구축된 배리어를 보여준다. 인쇄 프로토콜 및 인쇄 자체는 성공적이었다.
24웰 플레이트 인쇄시, 하이드로겔 시린지 (1.5% 및 2.0%)의 시린지 플런저가 딱딱해졌으며 (시린지를 이전에 개봉한 바 없었음에도), 하이드로겔을 인쇄하는 도중에 새로운 시린지로 옮겼다. 이는 24웰 플레이트 상의 배리어의 품질을 손상시켰다. 다수 배리어들이 붕괴되고 누출되어, 검사에 사용하지 않았다 (도 25). 이러한 사실을 토대로, 시린지가 이전에 개봉되었는 지 유무에 관계없이, GrowDex를 항상 새로운 잘-작동하는 시린지로 옮겨야하는 것으로 결론내려졌다.
도 25는 24웰 플레이트에서 2.0% GrowDexT (상단 도) 및 1.5% GrowDex (하단 도)로부터 구축된 배리어를 보여준다. 3D 인쇄하는 중에, 2.0% GrowDexT 및 1.5% GrowDex 시린지 플런저가 딱딱해졌으며, 하이드로겔을 인쇄 도중에 새로운 시린지로 옮겨야 했다. 그 결과, 다수의 배리어들이 붕괴되거나, 및/또는 누출되었다.
배리어를 구축한 후 실온에서 1시간 동안 건조한 다음 MEM으로 덮었다. 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고, 사용시까지 4℃에서 보관하였다.
세포 접종 (2019년 2월 13일)
12웰 플레이트: 400 ㎕ BJ 현탁물 (100 000 세포/ml)을 배리어 바깥쪽에 접종하고 (-> 40 000 BJ 세포와 함께), 100 ㎕ BJ 세포 배양 배지를 배리어 안쪽에 파이펫팅하였다.
24웰 플레이트: 200 ㎕의 BJ 현탁물 (100 000 세포/ml)을 배리어의 바깥쪽에 접종하고 (-> 20 000 BJ 세포), 50 ㎕ BJ 세포 배양 배지를 배리어의 안쪽에 파이펫팅하였다.
BJ 세포 밀도는 (배리어없이) FICAM에서 일반적인 세포독성 검사에 사용되는 BJ 세포 밀도와 매칭되게 선택하였다.
노출
화합물 희석물 제조
SDS: 5% FBS가 첨가된 BJ 세포 배양 배지에서 0.8 mg/ml SDS 스톡을 제조하였다. 스톡을 1:10으로 희석하여, 80 ㎍/ml SDS 희석물을 제조하였다. 80 ㎍/ml SDS 희석물을 1:2로 추가적으로 희석하여, 40 ㎍/ml 희석물을 제조하였다. 이들 SDS-희석물, 즉 80 ㎍/ml (C1) 및 40 ㎍/ml (C2)을 노출에 이용하였다.
아미트립틸린 : 5% FBS가 첨가된 BJ 세포 배양 배지에서 2 mg/ml 스톡을 제조하였다. 스톡을 1:100으로 희석하여, 20 ㎍/ml 희석물을 제조하였다. 20 ㎍/ml 희석물을 1:2로 추가적으로 희석하여, 10 ㎍/ml 희석물을 제조하였다. 이들 아미트립틸린 희석물, 즉, 20 ㎍/ml (C1) 및 10 ㎍/ml (C2)을 노출에 이용하였다.
화합물의 농도는 이전의 (배리어없이 수득한) 세포독성 데이터에 따라 선정하였으며, 아미트립틸린 하이드로클로라이드의 IC50은 12 ㎍/ml이었으며, SDS의 경우 47 ㎍/ml이었다. 목적은 세포의 약 절반을 사멸시킬 것으로 예상되는 농도와 이 보다 2배 높은 농도를 적용해, 용량-의존적인 효과를 검출하고자 하는 것이었다.
주입 (Dosing)
12웰 플레이트: 배리어의 안쪽 및 바깥쪽 모두에서 조심스럽게 배지를 제거하였다. 5% FBS가 첨가된 BJ 세포 배양 배지 400 ㎕를 배리어의 (전날 세포가 접종된) 바깥쪽에 파이펫팅하였다. 화합물 희석물 (SDS 또는 아미트립틸린) 100 ㎕을 배리어의 안쪽에 파이펫팅하였다.
24웰 플레이트: 배리어의 안쪽 및 바깥쪽 모두에서 조심스럽게 배지를 제거하였다. 5% FBS가 첨가된 BJ 세포 배양 배지 200 ㎕를 배리어의 (전날 세포가 접종된) 바깥쪽에 파이펫팅하였다. 화합물 희석물 (SDS 또는 아미트립틸린) 50 ㎕을 배리어의 안쪽에 파이펫팅하였다.
노출 시간은 24시간이었다.
WST -1 분석
24시간 노출 후, WST-1 분석을 수행하였다.
12웰 플레이트: WST-1 시약 10 ㎕를 배리어의 안쪽에, 100 ㎕를 배리어의 바깥쪽에 파이펫팅하였다.
24웰 플레이트: WST-1 시약 5 ㎕를 배리어의 안쪽에, 20 ㎕를 배리어의 바깥쪽에 파이펫팅하였다.
플레이트를 2.5시간 인큐베이션한 다음 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 24웰 플레이트에서 웰 당 49회, 12웰 플레이트에서 웰 당 81회 판독하는 멀티포인트 측정으로 측정하였다.
결과
ㆍ 현미경 검경에 따르면, 세포는 예상한 바와 같이 배리어의 바깥쪽에 체류하였다 (주의! 실패한 배리어는 시작 시점에 이미 제외되었으므로, 여기에는 세포를 접종하지 않았다).
ㆍ 화합물 처리 세포 및 무처리 세포들 간에는, 아미트립틸린 하이드로클로라이드 및 SDS가 세포에 유해하지 않았다: (육안 검사에 의한) 형태학적 차이도 (WST-1 분석에 따른) 세포 생존성 차이도 검출되지 않았다. 이는, 수동으로 제조된 GrowDex 배리어를 이용한 이전 실험들에서, 세포 접종시 이들 화합물들이 독성을 유발하였고, 화합물들이 배리어의 다른 쪽으로 주입되었으므로, 예상치못한 결과였다 (FICAM 2018). 3D-인쇄된 배리어가 화합물의 통과를 막았으며, 그래서 수동으로 제조된 것과 차이가 있는 것으로 보인다.
ㆍ 이들 결과는, 배리어 자체가 "히트맵" 가시화 (heatmap visualization)에서 관찰되는 바와 같이 450 nm에서 빛을 흡수한다는 것을 의미한다 (도 26, 27 및 28).
ㆍ 사용하기 2주 전에 제작된 12웰 플레이트 상의 배리어가 적절하게 작동하였다. 다시 말해, 배리어는 적절한 비히클 중에 4℃에서 보관하고 파라필름으로 밀봉하였을 경우 적어도 2주 이상 사용할 수 있다.
표 11은 세포 접종 및 아미트립틸린 (Ami) 및 SDS 노출 후 12웰 플레이트의 배치를 나타낸다. 2개의 VC 웰은 세포 수가 (실수로) 다른 웰 보다 적어 괄호 안에 표시한다.
표 11: 12웰 플레이트의 배치
SDS C1 SDS C2 Ami C1 Ami C2
SDS C1 SDS C2 Ami C1 Ami C2
VC VC (VC) (VC)
도 26은 화합물에 24시간 노출 및 WST-1 2.5시간 인큐베이션 후 12웰 플레이트의 450 nm 흡광도 측정 결과를 도시한 것이다. 흡광도는 진한 색 밀도가 흡광도와 정비례하는 "히트맵"으로 나타낸다. 도 26A는 1.5% GrowDex 배리어이고, 도 26B는 2.0% GrowDex 배리어이다.
표 12는 세포 접종과 아미트립틸린 및 SDS에의 노출 후, 1.5% GrowDex 배리어를 가진 24웰 플레이트의 배치를 나타낸다. 품질이 우수한 배리어만 사용하였으며, 대각선은 실패한 배리어를 표시한다.
Figure pat00005
1.5% GrowDex 배리어
도 27은 화합물에 24시간 노출 및 WST-1 2.5시간 인큐베이션 후 24웰 플레이트의 450 nm 흡광도 측정 결과를 도시한 것이다. 흡광도는 적색 밀도가 흡광도와 정비례하는 "히트맵"으로 나타낸다.
표 13은 세포 접종과 아미트립틸린 및 SDS에의 노출 후, 2.0% GrowDexT 배리어를 가진 24웰 플레이트의 배치를 나타낸다. 품질이 우수한 배리어만 사용하였으며, 대각선은 실패한 배리어를 표시한다.
표 13: 24웰 플레이트 배치 (2.0% GrowDexT)
Figure pat00006
도 28은 화합물에 24시간 노출 및 WST-1 2.5시간 인큐베이션 후 24웰 플레이트의 450 nm 흡광도 측정 결과를 도시한 것이다. 흡광도는 적색 밀도가 흡광도와 정비례하는 "히트맵"으로 나타낸다.
검사 2
검사 2의 목적은 다음과 같다:
1) 세포가 GrowDex 배리어를 통과하지 못하는 것을 검증
2) 약물이 GrowDex 배리어를 통해 실제 통과하지 못하는 지를 확인
3) 배리어에서 관찰되는 높은 흡광도의 이유 확인
이를 위해, 본 발명자들은
ㆍ 세포 수를 검사 1에서 사용된 40 000 세포/웰에서 20 000 세포/웰로 줄이고,
ㆍ 아미트립틸린 농도를 검사 1에서 사용된 10 및 20 ㎍/ml에서 100 및 200 ㎍/ml로 높이고, SDS 농도를 검사 1에서 사용된 40 및 80 ㎍/ml에서 100 및 200 ㎍/ml로 높였다.
[세포 수는 줄이고 화합물 농도는 높임으로써, 검사의 민감도를 높이고자 하였으며, 세포에 대한 더 많은 (측정가능한/가시적인) 영향을 달성할 수 있을 것으로 예상됨]
ㆍ 다음과 같은 블랭크를 포함한다:
⇒ BJ 세포 배양 배지 및 WST-1 중의 폴리-D-라이신으로 코팅된 웰 상의 1.5% GrowDex 배리어, 세포 무첨가
⇒ MEM 중의 1.5% GrowDex 배리어, 비-코팅, 세포 무첨가
⇒ PBS 중의 1.5% GrowDex 배리어, 비-코팅, 세포 무첨가
ㆍ 또한, 멀티포인트 흡광 측정에서 웰 당 측정 횟수는 웰에 대한 밀집된 커버리지 (denser coverage)를 확보하기 위해 웰 당 81회에서 225회로 높였다.
1.5% GrowDex 배리어를 가진 12웰 플레이트 하나를 준비하였다.
절차
배리어 구축 (2019년 2월 19일, lot 11952)
4개의 층으로 구성된 1.5% GrowDex 배리어를 12웰 플레이트에 인쇄하였다. 3D-인쇄에 대한 보다 상세한 내용은 부록 1을 참조한다. 배리어는 구축 후 실온에서 1시간 동안 건조하고, 이후 MEM을 충전하였다. 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고, 사용시까지 4℃에서 보관하였다.
세포 접종
배리어를 구축한 다음날, BJ 섬유모세포를 접종하였다: BJ 현탁물 (50 000 세포/ml) 400 ㎕를 배리어의 바깥쪽에 (20 000 BJ 세포와 함께), BJ 세포 배양 배지 100 ㎕를 배리어의 안쪽에 파이펫팅하였다. 세포는 노출 전 24시간 동안 배양하였다.
노출
화합물 희석물 제조
5% FBS가 첨가된 BJ 세포 배양 배지에서 아미트립틸린 및 SDS의 2.0 mg/ml 스톡을 제조하였다. 스톡을 먼저 1:10으로 희석하여, 200 ㎍/ml 화합물 희석물을 수득하였다. 200 ㎍/ml 화합물 희석물을 1:2로 추가적으로 희석하여, 100 ㎍/ml 화합물 희석물을 수득하였다. 이들 희석물, 즉 200 ㎍/ml 및 100 ㎍/ml을 노출에 사용하였다.
주입
배리어의 안쪽 및 바깥쪽 모두에서 조심스럽게 배지를 제거하였다. 5% FBS가 첨가된 BJ 세포 배양 배지 400 ㎕를 배리어의 (전날 세포가 접종된) 바깥쪽에 파이펫팅하였다. 화합물 희석물 (SDS 또는 아미트립틸린) 100 ㎕을 배리어의 안쪽에 파이펫팅하였다. 노출 시간은 24시간이었다.
블랭크
BJ 세포 배양 배지 및 WST-1 중의 GrowDex 배리어, 세포 무첨가, 폴리-D-라이신으로 코팅된 웰 (표 15 및 도 30)
MEM 중의 GrowDex 배리어, 비-코팅, 세포 무첨가 (도 31)
PBS 중의 GrowDex 배리어, 비-코팅, 세포 무첨가 (도 31)
WST -1 분석
24시간 동안 화합물에 노출시킨 후, WST-1 시약 10 ㎕을 배리어의 안쪽에, 100 ㎕를 배리어의 바깥쪽에 파이펫팅하였다. 플레이트를 30분, 1.5시간 및 2.0시간 동인 인큐베이션한 다음 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 웰 당 225회 측정하는 멀티포인트 측정으로 측정하였다.
데이터 취급
여러가지 처리 후 세포 생존성을 정량하기 위한 시도로, 웰의 바깥쪽 에지 옆에서 측정한 2개의 열의 흡광도로부터 흡광도 평균±STDEV를 계산하였다. 이 영역은 배리어의 바깥쪽으로 가정하였다.
결과
ㆍ 현미경 검경 결과, BJ 섬유모세포는 GrowDex 배리어를 통과하지 못하고 접종된 바깥쪽에서 유지되는 것으로 밝혀졌다.
ㆍ 배리어없이 BJ 세포에 처리하였을 때 IC50이 12 ㎍/ml인 아미트립틸린은 BJ 생존성을 용량-의존적인 방식으로 감소시켰으며 (표 14), 즉, 200 ㎍/ml 노출시 16% 감소, 100 ㎍/ml 노출시 10% 감소를 유발하였다. 세포 및 아미트립틸린은 배리어의 서로 다른 쪽에 적용되었으므로, 이는 아미트립틸린이 배리어를 침투할 수 있다는 증거이다. 그러나, 24시간 노출이 전체 아미트립필린을 구획 2개에서 "평형화"하는데 충분한 것인지 또는 더 많은 시간이 필요한 지는 알지 못한다. 또한, 배리어 자체가 아미트립틸린에 결합하여 그 독성을 줄이는 지도 알지 못한다.
표 14. 배리어의 다른 쪽에 투입된 아미트립틸린 또는 SDS에 24시간 노출 후 BJ 섬유모세포의 생존성.
대조군 200 ㎍ /ml
아미트립틸린 하이드로클로라이드 		100 ㎍ /ml
아미트립틸린 하이드로클로라이드 		200 ㎍ /ml 소듐 도데실 설페이트 100 ㎍ /ml
소듐 도데실 설페이트
평균 흡광도, stdev 1.007±0.423 0.844±0.318 0.911±0.283 1.189±0.406 1.072±0.322
N 144 144 144 144 144
대조군 대비 생존성 % 100% 84% 90% 118% 106%
ㆍ 검사 1과 마찬가지로, 배리어 영역에서 최고 흡광도가 관찰되었다 (도 30). 일차적으로, GrowDex의 흡광도는 미미한 것으로 예상된 바, 이러한 결과는 배리어에 세포 또는 포르마잔 (WST-1 대사산물)의 축적이 원인일 수 있는 것으로 추정되었다. (수동으로 제조한 배리어를 이용한 이전 실험에서, 이는 한가지 사례였음). 그러나, 검사 2에서 세포 수가 검사 2의 세포 수의 절반이었나, 흡광도가 여전히 검사 1보다 검사 2에서 더 높은 것은 논리적으로 맞지 않다.
ㆍ 블랭크 측정; 세포 무첨가한 BJ 세포 배양 배지+WST-1 중의 GrowDex 배리어 (표 15, 도 29-30), 및 세포 및 WST-1을 첨가하지 않은 MEM 또는 PBS 중의 GrowDex 배리어 (도 31) 모두 높은 흡광도를 나타내었으며, 이는 BJ 세포 또는 WST-1 대사산물이 이러한 흡광성의 원인이 아니고, 대신 배리어 구조 자체에 의해 발생한다는 것을 의미한다. 이러한 흡광성은, 겔이 입자들로 구성되어 있기 때문에, 발생되는 비특이적인 산란, 즉 광학 밀도, OD로 인한 것이어야 한다. 따라서, 모든 파장에서 흡광도가 높다. WST-1 측정에서 교란을 극복하기 위한 한가지 방법은, WST-1을 흡수하지 않는 파장 ( >550 nm)에서 기준 측정을 이용하는 것이다. 모든 스팟들을 맵핑함으로써, 흡광성이 WST-1으로부터 실제 기원하였는 지를 살펴볼 수 있다.
표 15. 세포 접종 및 아미트립틸린과 SDS에 노출시킨, 1.5% GrowDex 배리어를 가진 12웰 플레이트의 배치.
SDS C1 SDS C2 Ami C1 Ami C2
SDS C1 SDS C2 Ami C1 Ami C2
VC VC VCb VCb
도 29는 BJ 세포 접종 및 노출 전 (상단 사진)과 노출 및 WST-1 시약 첨가 후 (하단 사진)의 1.5% GrowDex 배리어를 나타낸 것이다.
도 30은 화합물에 24시간 노출 및 WST-1과 2시간 인큐베이션한 후 12웰 플레이트의 450 nm 흡광도 측정 결과를 보여준다. 흡광도는, 적색 강도가 흡광성과 정비례하는, "히트맵"으로 나타낸다.
도 31은 블랭크를 도시한 것이다: PBS 중의 1.5% GrowDex 배리어 (좌), MEM 중의 1.5% GrowDex 배리어 (우)의 450 nm에서의 흡광도. 흡광도는, 적색 강도가 흡광성과 정비례하는, "히트맵"으로 나타낸다.
결론
본 실험의 성과는 다음과 같다:
ㆍ 3D 프린터를 사용해 1.5% GrowDex 및 2.0% GrowDexT로 된 원형의 배리어를 12웰 및 24웰 플레이트 모두에 구축할 수 있다. 다음과 같은 문제를 고려하여야 한다:
⇒ 하이드로겔이 균질한 것이 중요하다. 불균질한 겔은 고르지 않고 사용할 수 없는 배리어를 형성한다. 불균질성은 하이드로겔의 일부 건조로 인해, 예를 들어 동일 시린지의 밀봉 결함, 개봉 및 재사용, 기포를 발생시키는 혼합 등으로 인해 발생할 수 있다. 고르지 못한 하이드로겔 층은 전체 배리어를 망친다.
⇒ 웰의 바닥부에 부착된 배리어를 유지하기 위해, 웰을 먼저 코팅하여야 한다. 검사한 코팅 물질들 중 폴리-D-라이신이 가장 우수하였다.
⇒ 배리어를 구축한 후, 예를 들어 최소 필수 배지 또는 PBS로 충전하고, 파라필름으로 밀봉하여, 냉장고에서 적어도 2주간 보관할 수 있다.
GrowDex 인쇄 프로토콜은 부록 2로 첨부한다. 프로토콜은 각각의 3D-프린터 타입에 맞게 조정하여야 한다.
ㆍ 배리어 특성
⇒ 배리어는 세포를 본래의 구획에서 유지시킬 수 있었으며, 배리어의 누출 또는 배리어 통과는 발생하지 않았다.
⇒ 화합물이 배리어를 통과하는 수준 및 타임라인은 여전히 불명확하다. 3D-인쇄된 배리어는 수동 제작한 배리어와 다르게 구축되므로 (부록 3 참조), 이들의 구조가 상이하며, 수동 제작한 배리어에 최적화된 타임라인 (주로 노출 시간)은 3D-인쇄된 배리어에 최적이 아닐 수 있으므로, 3D-인쇄된 배리어에 맞게 별도로 최적화하여야 한다.
ㆍ 배리어 구조체 단독으로도 높은 백그라운드 흡광성을 나타내므로, 이를 해결하여야 한다. 이러한 흡광성은, 겔이 입자들로 구성되어 있어 유발된 비특이적인 산란, 즉 광학 밀도, OD가 원인이어야 한다. 따라서, 흡광도는 전체 파장 (400 - 600 nm)에서 높다. WST-1 측정에서 교란을 극복하기 위한 한가지 방법은, WST-1이 흡수하지 않는 파장 (>550 nm)에서 기준 측정을 이용하는 것이다. 모든 스팟을 맵핑함으로써, 실제 WST-1로부터 기원한 흡광을 살펴볼 수 있다.
부록
부록 1: GrowDex의 3D 인쇄
일시 GrowDex 타입 Lot # 시린지에 대한 상세 내용 (느슨한/타이트한 뚜껑. 제조사) 보관 온도 인쇄 프로토콜 (툴 파일 및 지오메트리 ) 기타 유의 사항/실험 결과
2018. 11. 29 1.5% 11952 Braun Omnifix +4℃ 5 ml 시린지 16G
12웰		 1 % CaCl2 +
배지 안정성 검사		 배리어가 웰 바닥에 부착되지 않음
2018. 12. 4 1.5% 11952 Braun Omnifix +4℃ 5 ml 시린지 16G 12웰 폴리-D-라이신. 파이브로넥틴 & 젤라틴 코팅 및 안정성 검사 폴리-D-라이신 및 젤라틴으로 코팅된 배리어가 부착되었음
2018. 12. 5 2.0%, 비-멸균 119694117t Braun Omnifix +4℃ 5 ml 시린지 16G 2% 12웰 인쇄 최적화 인쇄 양호
2018. 12. 5 1%, 멸균 119673917t Braun Omnifix +4℃ 5 ml 시린지 16G 1% 12웰 인쇄 최적화 불균일한 인쇄
2018. 12. 11. - 2018. 12. 14 2%, 멸균 119693318t Braun Omnifix +4℃ 5 ml 시린지 16G 2%
12웰		 세포 접종 및 누출 검사 (PDL. 젤라틴). WST 코팅 물질 둘다 누출됨
2018. 12. 14 1.5% 119921918g Braun Omnifix +4℃ 5 ml 시린지 16G 12웰 세포 접종 및 누출 검사 (PDL. 젤라틴). WST 젤라틴 코팅은 누출됨. PDL을 배리어를 부착된 상태로 유지시키고, 배리어 바깥쪽에 세포를 유지시킴
2019. 01. 17 1.5% 119921918g Braun Omnifix +4℃ 5 ml 시린지 16G.
5 ml 시린지 0.41 mm
5 ml 시린지 0.8 mm
5ml 시린지 1.2 mm
12웰
24웰		 PDL 코팅 기존의 프로토콜은 더 이상 사용할 수 없음
2019. 01. 21 2% 1.5% 2%: 119693318t
1.5% 119921918g		 Braun Omnifix +4℃ 5 ml 시린지 16G 2% V2
12웰		 PDL 코팅/프로토콜 검사 분출 값 증가는 효과없음
2019. 01. 23 1.5%
11952
119921918g		 Braun Omnifix +4℃ 5 ml 시린지 16G
12웰		 프로토콜 검사 오리지날 프로토콜은 lot. 11952에는 사용가능하지만,
lot 1199219189에는 작동하지 않음
2019. 01.28 1.5% 11952 Braun Omnifix +4℃ 5 ml 시린지 16G
12웰		 인쇄 최적화
2019. 02. 01 1.5% 120061518g Braun Omnifix
뚜껑 양호		 RT 5 ml 시린지 16G
12웰		 배리어 인쇄 인쇄 작업이 이루어지지 않음
(막힘)
2019. 02. 01 2.0% 120664618t Braun Omnifix
뚜껑 양호		 RT 5 ml 시린지 16G 2.0 %
12웰 		검사 1에 사용되는 배리어 인쇄 프로토콜 및 인쇄 양호
2019. 02. 01 1.5% 119921918g Braun Omnifix 느슨한 뚜껑 +4℃ 5 ml 시린지 16G
12웰		 배리어 인쇄 인쇄 작업이 이루어지지 않음 (막힘)
2019. 02. 01 1.5% 120074418g Braun Omnifix
느슨한 뚜껑		 RT 5 ml 시린지 16G
12웰		 배리어 인쇄 인쇄 작업이 이루어지지 않음 (막힘)
2019. 02. 04 1.5% 120061518g Braun Omnifix RT 5 ml 시린지 16G 혼합 검사 혼합이 원활하지 않음 (버블 및 막힘)
2019. 02. 04 2.0% 119693318t 뚜껑 위에 겔이 마름 + 4C 5 ml 시린지 16G 2 %12 & 24웰 혼합 검사 혼합이 원활하지 않음 (버블 및 막힘)
2019. 02. 05 1.5% 120074418g 느슨한 뚜껑 RT 5 ml 시린지 16G 12웰 이송 검사: 새로운 시린지로 겔 교체. 혼합하지 않음. 검사 1의 노출에 사용 프로토콜 및 인쇄 양호
2019. 02. 05 1.5% 120074418g 느슨한 뚜껑 RT 5 ml 시린지 16G 5 ml 시린지 0.254mm
24웰		 최적화 두꺼운 배리어 -> 프로토콜이 작동되지 않음
2019. 02. 06 1.5% 11952 느슨한 뚜껑 +4 C 5 ml 시린지 16G 5 ml 시린지 0.254 mm
24웰 (pienempi reuna)		 최적화 두꺼운 배리어 -> 프로토콜이 작동되지 않음
2019. 02. 06 2.0% 119693318t 뚜껑 위에 겔이 마름 +4 C 5 ml 시린지 16G 2% 24웰 (paksumpi reuna) 최적화 두꺼운 배리어 -> 프로토콜이 작동되지 않음
2019. 02. 07 2.0% 119693318t 새로운 시린지로 옮김 +4 C 5 ml 시린지 16G 2% V2 24웰 (얇은 벽) 최적화 (배리어 몇개만 인쇄됨. 전체 플레이트가 그런 것은 아님) 프로토콜 및 인쇄 양호
2019. 02. 07 1.5% 11952 새로운 시린지로 옮김 +4 C 5 ml 시린지 16G 1.5% V2 24웰 (얇은 벽) 최적화 (배리어 몇개만 인쇄됨. 전체 플레이트가 그런 것은 아님) 프로토콜 및 인쇄 양호
2019. 02. 11 1.5% 120061518g
 뚜껑 양호 RT 5 ml 시린지 16G 1.5% V2
24웰 V2		 프린트 오리진 배치 (print origin placement) 문제 -> 일시 중지 & 플레이트 장착 후 재개
2019. 02. 12 1.5%; 2.0% 1200615189
120664618T		 시린지가 딱딱해져 중간에 시린지 교체, 그러나 새로운 시린지도 딱딱해짐 -> 시린지들 간의 차이 존재 RT 5 ml 시린지 16G 1.5% V2
5 ml 시린지 16G 2.0% V2
24웰 플레이트		 검사 1 노출에 사용 불균일한 배리어 -> 다수 배리어들이 샘
검사 1
2019. 02. 19 1.5% 11952 주사기 양호 +4 C 5 ml 시린지 16G 12웰 플레이트 검사 2 노출에 사용 배리어 양호
부록 2: 3D 인쇄 프로토콜 (Fab@home 3D 프린터에 대해 최적화됨)
1. GrowDex를 새 시린지로 옮긴다 (플런저가 자유롭게 움직이는 지를 검사함)
2. 플런저를 수 mm 위로 당긴 다음 시린지 제일 윗부분에 맞춰 플런저를 자른다
3. 16G 금속 바늘을 루어 락을 사용해 시린지에 장착한다
4. 겔이 자유롭게 흐를 때까지 플러저를 아래로 민다
5. 시린지를 프린터 홀더에 장착한다
6. 프린터 초기화 프로토콜을 수행한다 (설정, 개시 및 안전 위치 설정)
7. 웰 플레이트 크기와 GrowDex 농도에 따라 프린터 파라미터 설정:
1.5% GrowDex, 12웰 플레이트 2.0% GrowDexT, 12웰 플레이트 1.0% GrowDex, 12웰 플레이트 1.5% GrowDex, 24웰 플레이트 2.0% GrowDexT, 24웰 플레이트
통로 폭 1.0 1.0 1.0 1.0 1
통로 높이 1.0 1.0 1.0 1.1 1.1
분출 0.050 0.050 0.200 0.050 0.05
석백 0.080 0.080 0.080 0.080 0.08
증착율 0.019 0.015 0.017 0.019 0.015
증가분 0.500 0.500 0.500 0.500 0.500
8. 폴리-D-라이신으로 코팅된 적절한 멸균 처리된 멀티-웰 플레이트를 프린터의 스탠드 위에 배치한다.
9. 시린지의 팁을 시작 위치로 이동시킨다.
10. 인쇄할 배리어의 stl 이미지를 프린터 소프트웨어에 로딩한다. 이미지를 stl (스테레오리소그라피) 파일로 저장할 수 있는 임의의 3D 이미징 소프트웨어를 사용할 수 있다.
11. 인쇄를 시작하고, 진행을 모니터링한다 (이동 가장자리 (movement marginal)들이 특히 24웰 플레이트의 경우 가깝다).
12. 인쇄를 마친 후, 배리어를 1시간 동안 건조한다.
13. 웰에 PBS 또는 MEM을 넣는다. 배리어는 PBS 또는 MEM 내에서 적어도 2주간 4℃에서 보관할 수 있다.
부록 3: 수동-제작한 배리어와 3D-인쇄한 1.5% GrowDex 배리어의 차이점
수동 제작 배리어 * 3D 인쇄한 배리어
하이드로겔 1.5% GrowDex 1.5% GrowDex
플레이트 포맷 24웰 플레이트 24웰 플레이트
배리어 형태 웰을 동일한 크기의 2개의 구획으로 나누는 직선형 벽 웰의 가운데에 위치한 고리
코팅 비-코팅 0.1 mg/ml 폴리-D-라이신
고리 또는 벽 하나 당 하이드로겔 ㎕ 500 ㎕ 417 ㎕
층의 개수 2 x 250 ㎕ 4 x (52.125+52.125) ㎕
층 사이의 건조 시간 30-60 min 15 min
높이 (mm) 입수불가 5 mm
작동 체적 양쪽 사이드에서 200 ㎕ 안쪽 50 ㎕, 바깥쪽 200 ㎕
* FICAM CT0065/8-12 데이터

Claims (15)

  1. 세포 배양 플레이트로서,
    웰을 2 이상의 구획으로 분할하는 하나 이상의 배리어 (barrier)를 포함하는 하나 이상의 세포 배양 웰(들)을 포함하며,
    상기 배리어가 나노피브릴 셀룰로스 하이드로겔 (nanofibrillar cellulose hydrogel)을 포함하고,
    상기 배리어의 벽 두께가 0.5-2 mm 범위인, 세포 배양 플레이트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 나노피브릴 셀룰로스 하이드로겔이 나노피브릴 셀룰로스를 0.8-2.5% (w/w), 바람직하게는 1.0-2.1% (w/w)로 포함하는, 세포 배양 플레이트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 세포 배양 플레이트와 상기 나노피브릴 셀룰로스 하이드로겔 사이에, 콜라겐계 접착 물질, 피브리노겐계 접착 물질, 젤라틴계 접착 물질 또는 라이신계 접착 물질, 예를 들어 폴리-D-라이신 또는 젤라틴과 같은, 접착 물질을 포함하는, 세포 배양 플레이트.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 배리어가 상기 세포 배양 웰 상의 하나 이상의 영역을 구획화하고, 예를 들어, 상기 배리어가 원 형태인, 세포 배양 플레이트.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 나노피브릴 셀룰로스가, 물에 분산시, 수성 매질 중의 0.5% (w/w) 컨시스턴시 (consistency)로 22℃±1℃에서 회전 레오미터에 의해 측정하였을 때, 5000-50000 Paㆍs 범위와 같은 1000-100000 Paㆍs 범위의 제로 전단 점도 (zero shear viscosity) 및 3-15 Pa 범위와 같은 1-50 Pa 범위의 항복 응력 (yield stress)을 나타내거나, 및/또는
    상기 나노피브릴 셀룰로스가 1-200 nm 범위와 같은 200 nm 이하의 평균 피브릴 직경 (average fibril diameter)을 가지는, 세포 배양 플레이트.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 나노피브릴 셀룰로스가 비-변형된 나노피브릴 셀룰로스, 음이온성으로 변형된 나노피브릴 셀룰로스 (anionically modified nanofibrillar cellulose) 및 TEMPO 산화된 나노피브릴 셀룰로스와 같이 산화된 나노피브릴 셀룰로스 (oxidized nanofibrillar cellulose)로부터 선택되는, 세포 배양 플레이트.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 상기 구획(들)이, 0.7% (w/w) 이하, 예를 들어 0.2-0.7% (w/w)의 농도와 같이 배리어와 비교해 나노피브릴 셀룰로스의 농도가 낮은 나노피브릴 셀룰로스 하이드로겔과 같은, 배리어와 비교해 농도가 더 낮은 겔을 포함하는, 세포 배양 플레이트.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 웰이 하나의 구획에 한가지 타입의 세포를 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 다른 구획에는 동일한 및/또는 다른 타입(들)의 세포(들)를 포함하며, 세포는 간세포 (hepatocytes), 예를 들어 간세포암 세포와 같은 간 세포 (liver cell), 내피 세포, 지방세포, 심근세포, 신장 세포, 대식세포 및 단핵구와 같은 면역 세포, 또는 신경모세포종 세포와 같은 신경 세포 및 줄기 세포로부터 선택되는, 세포 배양 플레이트.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 세포 배양 플레이트의 제조 방법으로서,
    - 하나 이상의 세포 배양 웰(들)을 포함하는 세포 배양 플레이트를 제공하는 단계,
    - 나노피브릴 셀룰로스를 포함하는, 바람직하게는 0.8-2.5% (w/w), 더 바람직하게 1.0-2.1% (w/w)로 포함하는 수성 분산물을 제공하는 단계,
    - 웰을 2 이상의 구획으로 분할하기 위한 하나 이상의 배리어를 상기 나노피브릴 셀룰로스로부터 하나 이상의 세포 배양 웰에 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    하나 이상의 배리어를 형성하는 단계가 예를 들어 링 노즐 (ring nozzle)을 사용해 적층 가공 (additive manufacturing)함으로써 배리어를 제조하는 것을 포함하는, 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    하나 이상의 배리어를 형성 또는 적용하는 것과 같이 제공하기 전에, 하나 이상의 세포 배양 웰을, 콜라겐계 접착 물질, 피브리노겐계 접착 물질, 젤라틴계 접착 물질 또는 라이신계 접착 물질, 예를 들어 폴리-D-라이신 또는 젤라틴과 같은 접착 물질로 코팅하는 것을 포함하는, 방법.
  12. 하기 단계를 포함하는 물질 검출 방법:
    - 제1 구획에 제1 세포를 포함하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 세포 배양 플레이트를 제공하는 단계, 및
    - 다른 구획에서 하나 이상의 물질을 검출하는 단계.
  13. 제12항에 있어서,
    - 대상 물질을 제1 구획과 같은 구획에 적용하는 단계,
    - 세포가 상기 대상 물질에 반응하기에 충분한 시간 동안 세포를 인큐베이션하는 단계,
    - 다른 구획으로부터 하나 이상의 물질을 검출하는 단계로서, 예를 들어, 상기 대상 물질, 상기 세포에 의해 분비된 물질, 상기 대상 물질의 반응산물 또는 다른 물질과 같은 하나 이상의 물질의 양을 검출하는 단계, 선택적으로 또한 하나 이상의 물질 및/또는 제1 구획으로부터 세포의 반응을 검출하는 단계, 및 바람직하게는,
    - 검출된 물질(들) 및/또는 세포의 반응을 기초로, 상기 물질이 상기 세포에 미치는 효과를 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    - 제2 구획에 제2 세포를 추가로 제공하는 단계,
    - 상기 제2 구획에서 상기 제2 세포에 의해 분비되는 하나 이상의 물질 및/또는 상기 제2 세포의 반응을 검출하는 단계, 및
    - 상기 제2 세포에 의해 분비된 검출된 물질(들) 및/또는 상기 제2 세포의 반응을 기초로, 상기 대상 물질이 상기 제1 세포 및/또는 제2 세포에 미치는 효과를 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 세포 및/또는 상기 제2 세포가 간세포 (hepatocytes), 예를 들어 간세포암 세포와 같은 간 세포 (liver cell), 내피 세포, 지방세포, 심근세포, 신장 세포, 대식세포 및 단핵구와 같은 면역 세포, 또는 신경모세포종 세포와 같은 신경 세포 및 줄기 세포로부터 선택되는, 방법.
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