KR20200130137A

KR20200130137A - 마그놀롤을 유효성분으로 포함하는 근위축증, 근감소증 또는 근조직 손상 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20200130137A
Application number: KR1020200052321A
Authority: KR
Inventors: 배현수; 이찬주
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2019-05-08
Filing date: 2020-04-29
Publication date: 2020-11-18
Also published as: KR20230049590A; KR20240074727A; KR102515929B1

Abstract

본 발명은 마그놀롤을 유효성분으로 포함하는 근육 손상 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 마그놀롤을 유효성분으로 포함하는 근위축증, 근감소증 또는 근조직 손상 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 마그놀롤 및 항암제를 포함하는 항암용 약학적 조성물; 마그놀롤을 유효성분으로 포함하는 근위축증, 근감소증 또는 근조직 손상 예방 또는 완화용 건강기능식품 조성물; 마그놀롤을 유효성분으로 포함하는 분리된 항염증성 대식세포 분화 촉진용 조성물; 마그놀롤을 유효성분으로 포함하는 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 근위축증, 근감소증 또는 근조직 손상 치료방법에 관한 것이다.
본 발명의 물질 마그놀롤을 유효성분으로 포함하는 근위축증, 근감소증 또는 근조직 손상 예방 또는 치료용 조성물은, 약학적 조성물로써 유용하게 사용될 수 있다.

Description

마그놀롤을 유효성분으로 포함하는 근위축증, 근감소증 또는 근조직 손상 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for preventing or treating of muscle atrophy, sarcopenia, or muscle damage comprising magnolol}

본 발명은 마그놀롤을 유효성분으로 포함하는 근위축증, 근감소증 또는 근조직 손상 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 마그놀롤을 유효성분으로 포함하는 근위축증, 근감소증 또는 근조직 손상 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 마그놀롤 및 항암제를 포함하는 항암용 약학적 조성물; 마그놀롤을 유효성분으로 포함하는 근위축증, 근감소증 또는 근조직 손상 예방 또는 완화용 건강기능식품 조성물; 마그놀롤을 유효성분으로 포함하는 분리된 항염증성 대식세포 분화 촉진용 조성물; 마그놀롤을 유효성분으로 포함하는 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 근위축증, 근감소증 또는 근조직 손상 치료방법에 관한 것이다.

근육 소실은 항암 환자에게서 가장 흔히 나타나는 증상으로 암 자체 또는 항암제의 독성에 의해 근육이 염증 상황에 노출되면서 나타난다. 근육의 소실은 환자의 활동과 항암 치료를 제한하고, 삶의 질을 크게 떨어뜨리거나 심하게는 사망에 이르게 하므로 이를 제어하기 위한 연구들이 증가하고 있다.

그러나 현존하는 약물들은 영양 상태를 개선하고 식욕을 증가시켜 증상을 완화시키는 일시적인 해결책에 불과하므로 근육의 소실을 효과적으로 막는 새로운 기술이 필요하다.

마그놀롤 (magnolol)은 목련의 추출물 중 하나로 항산화, 항염증 기능을 가지는 것으로 알려져있다.

상기 마그놀롤을 유효성분으로 포함하여 피부 볼륨증가 및 주름개선에 관하여 개시하고 있는 한국등록특허(10-2046331)가 알려져 있으나, 본 발명의 마그놀롤을 유효성분으로 포함하여 근육 염증을 완화하고, 근위축증, 근감소증 또는 근조직 손상을 완화 또는 개선하는 효능에 관하여는 아직 밝혀진 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 근육의 손상을 예방하고 치료하고자 예의 연구 노력한 결과, 항암제인 시스플라틴으로 근육 손상을 유도한 모델에서 마그놀롤을 투여하여, 항암제에 의한 빠른 체중 감소 및 근육의 손실을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였으며, 또한, 마그놀롤이 대식세포의 침투를 증가시킴과 동시에 근육의 염증을 완화시키는 항염증성 대식세포 형태로 분화를 촉진시킴을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 마그놀롤을 유효성분으로 포함하는 근위축증, 근감소증 또는 근조직 손상 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 마그놀롤 및 항암제를 포함하는 항암용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 마그놀롤을 유효성분으로 포함하는 근위축증, 근감소증 또는 근조직 손상 예방 또는 완화용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 마그놀롤을 유효성분으로 포함하는 분리된 항염증성 대식세포 분화 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 마그놀롤을 유효성분으로 포함하는 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 근위축증, 근감소증 또는 근조직 손상 치료방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태는 마그놀롤을 유효성분으로 포함하는 근위축증, 근감소증 또는 근조직 손상 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발며으이 약학적 조성물은 마그놀롤을 포함하여 근손실 또는 근위축을 예방 또는 개선하는 효과를 갖는 것일 수 있다. 상기 근손실 또는 근위축 등은 항암제 투여에 의한 것일 수도 있고, 또는 노화, 질병, 유전 등의 원인일 수 있으나, 특정 원인에 의한 것으로 제한되지 않고, 본 발명의 약학적 조성물을 마그놀롤에 의해 감소된 근육량, 근력, 근위축증에 대하여 효과를 가지는 한, 원인에 관계없이 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물은 항암제에 의한 부작용을 개선하기 위한 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 약학적 조성물의 항암제에 의한 부작용 개선 효능은 대식세포의 침윤 증가에 의한 것일 수 있고, 대식세포의 분화 촉진에 의한 것일 수 있으며, M1/M2 대식세포의 비율 조절에 의해 이루어지는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 상기 M1/M2 대식세포의 비율 조절은 M1 대식세포의 억제 또는 M2 대식세포의 증가에 의한 것일 수 있으며, M0 대식세포의 분화 조절에 의해 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 항암제는 시스플라틴(cisplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 플루오로유라실(fluorouracil), 이리노테칸(irinotecan), 독소루비신(doxorubicin), 또는 에토포시드(etoposide)인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, “마그놀롤(magnolol)”은 식물에서 발견되는 폴리페놀의 일부인 리그난(lignan)으로 분류되는 유기 화합물로서, 목련 등에서 발견된다고 알려져 있다. 상기 마그놀롤은 항산화, 항염증 기능을 가지는 것으로 알려졌으나, 근육 염증 상태에서 미치는 영향에 대해서는 밝혀진 바가 없다.

본 발명의 용어, “근위축증(Muscular atrophy)”은 근육이 위축되는 질환을 의미한다. 구체적으로, 사지의 근육이 거의 좌우대칭적으로 점점 위축되어 가는 것으로 여러 형태가 있으며, 가장 많은 것은 근위축성 측삭경화증(側索硬化症)과 척수성진행성근위축증이다. 모두 척수에 있는 운동신경섬유 및 세포의 진행성 변성에 의한 것이지만 원인은 불명하다고 알려져 있다.

본 발명의 용어, “근감소증(Sarcopenia)”은 노화 등의 다양한 이유로 근육 섬유의 수 및 단면적의 감소로 인한 골격근의 근육량 감소를 의미한다. 근감소증이 발생하면 낙상, 골절, 입원, 사망 등의 위험이 늘어나며, 삶의 질이 크게 ㄸ?ㄹ어진다. 또한, 신체 회복력이나 면역력도 줄어 폐렴 등 감염병에 걸릴 가능성이 높아진다고 알려져 있다.

본 발명의 용어, “근조직”은 근세포들이 모여서 된 집단으로서, 가로무늬근 조직과 민무늬근 조직, 심근조직 등을 의미하며, 근육과 혼용되어 쓰일 수 있다.

본 발명의 용어, “손상”은 어떤 원인에 의하여 흠이 생긴 것을 의미한다.

본 발명의 용어, “예방”은 본 발명에 따른 마그놀롤을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 근위축증, 근감소증 또는 근조직 손상을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명의 용어, “치료”는 본 발명의 상기 조성물을 근위축증, 근감소증 또는 근조직 손상 의심 개체에 투여하여 근위축증, 근감소증 또는 근조직 손상 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.

또한, 본 발명의 목적상 근위축증, 근감소증, 또는 근조직 손상 등을 일으키는 약물(예를 들어, 항암제)과 함께 투여될 수 있다. 이러한 약물과의 투여는 동시, 순차, 또는 역순으로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, “약학적 조성물”은 단일제제로도 사용할 수 있고, 공인된 근위축증, 근감소증 또는 근조직 손상 치료 효과를 가진다고 알려진 약물을 추가로 포함하여 복합제제로 제조하여 사용할 수 있으며, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

본 발명에서의 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한 되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 담체는 비자연적 담체 (non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.

또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.

또한, 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 마그놀롤을 포함할 수 있다.

본 발명에서의 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여할 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용을 유발하지 않으면서 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에서의 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 시스플라틴을 마우스 모델에 투여하여 근육 손상을 유발한 뒤, 마그놀롤을 투여하여 식이섭취에는 영향을 미치지 않고, 근육 손실량이 억제되고, 신장 기능 이상을 나타내는 마커 BUN 및 클레아티닌의 수치 증가를 억제하는 것을 확인하고(도 1), 근육의 무게, 근섬유의 직경, 및 그립 테스트를 통해 근육 위축으로부터의 보호 효능을 확인하였으며(도 2), 근육 내 대식세포의 침윤 증가를 확인하였다(도 3).

상기 목적을 달성하기 위한 다른 하나의 일 실시 양태는 마그놀롤 및 항암제를 포함하는 항암용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어, “마그놀롤”은 상기에서 서술한 바와 같다.

본 발명의 용어, “항암제”는 암세포의 증식을 억제하기 위하여 사용하는 화학요법 치료제이다. 여기에 외과적 수술의 성공을 높이기 위해 수술 전후에 사용하여 암의 미세 전이를 억제하거나, 재발 방지 및 말기 환자의 생존 기간 연장이나 증상 완화를 위해 사용하는 치료제도 광의적 의미로 포함할 수 있다. 또한, 상기 마그놀롤 및 항암제는 병용 투여할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 구체적인 병용 투여의 양태는 다음과 같다.

본 발명의 약학적 조성물은 마그놀롤 및 항암제가 동시, 순차적 또는 역순으로 병용 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상술한 바와 같이, 상기 병용 투여는 마그놀롤 및 항암제가 혼합된 하나의 혼합물(mixture)로 투여되는 것이거나; 또는 마그놀롤 및 항암제가 분리된 형태로 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 마그놀롤 및 항암제가 분리된 형태일 경우, 마그놀롤 및 항암제가 별개의 제제로 제제화 되어 동시, 개별, 순차, 또는 역순으로 투여될 수 있는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 마그놀롤 및 항암제를 병용 투여하기 위한 것으로, 마그놀롤 및 항암제가 하나의 제제로 제제화된 것이거나, 또는 개별적으로 제제화된 것일 수 있다. 구체적으로, 마그놀롤 및 항암제를 동시, 개별, 순차, 또는 역순으로 투여하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 병용 투여는 단지 동시의 투여를 의미하는 것뿐만 아니라, 마그놀롤 및 항암제가 개체에 함께 작용하여 각 물질이 본연의 기능과 동등하거나 그 이상의 수준을 수행할 수 있는 투여 형태로 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명에서, “병용”이란 용어가 사용될 경우 이는 동시, 개별, 순차, 또는 역순 투여를 나타내는 거승로 이해되어야 한다. 상기 투여가 순차, 역순 또는 개별적인 경우, 투여의 순서는 특별히 제한되지 않고 다만 2차 성분 투여의 간격은 상기 병용의 이로운 효과를 잃지 않도록 하는 것이어야 한다.

본 발명의 용어, “암”이란, 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자라난 종양, 또는 종양을 형성하는 병을 의미한다.

구체적으로, 상기 암은 폐암 (예, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 악성 중피종), 중피종, 췌장암 (예, 췌관암, 췌장 내분비 종양), 인두암, 후두암, 식도암, 위암 (예, 유두 선암, 점액성 선암, 선편평상피암종), 십이지장암, 소장암, 대장암 (예, 결장암, 직장암, 항문암, 가족성 대장암, 유전성 비용종증 대장암, 소화관 간질 종양), 유방암 (예, 침윤성 유관암, 비침윤성 유관암, 염증성 유방암), 난소암 (예, 상피성 난소암종, 고환외 배세포 종양, 난소성 배세포 종양, 난소 저악성도 종양), 고환 종양, 전립선암 (예, 호르몬-의존성 전립선암, 호르몬-비의존성 전립선암), 간암 (예, 간세포암, 원발성간암, 간외 담관암), 갑상선암 (예, 갑상선 수질암종), 신장암 (예, 신세포암종, 신우와 요관의 이행 상피암종), 자궁암 (예, 자궁경부암, 자궁체암, 자궁 육종), 뇌종양 (예, 수모세포종, 신경교종, 송과체 성세포종양, 모양세포성 성세포종, 미만성 성세포종, 퇴형성성 성세포종, 뇌하수체 선종), 망막모세포종, 피부암 (예, 기저세포암, 악성 흑색종), 육종 (예, 횡문근육종, 평활근육종, 연조직 육종), 악성 골종양, 방광암, 혈액암 (예, 다발성 골수종, 백혈병, 악성 림프종, 호지킨병, 만성 골수 증식 질환),원발 미상 암 등 일 수 있으며, 보다 구체적으로, 위암, 난소암, 전립선암, 간암, 유방암, 폐암 및 직장암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

보다 구체적으로, 상기 암은 폐암인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 일 실시 양태는 마그놀롤을 유효성분으로 포함하는 근위축증, 근감소증 또는 근조직 손상 예방 또는 완화용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어, “마그놀롤”, “근위축증”, “근감소증”, “근조직”, “손상”, 및 “예방”은 상기에서 서술한 바와 같다.

본 발명의 용어, “완화”는 상기 조성물을 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미하며, “개선”과 혼용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 용어, “건강기능식품”은 특정보건용 식품(food for special 24-8 health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 비만의 예방 또는 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 식품학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없으며, 예를 들어 각종 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 보조 식품류 등이 있다. 상기 식품 조성물에는 비만의 예방 또는 개선 효과에 방해가 되지 않는 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다.

예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 식품보조첨가제는 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 그 종류가 제한되는 것은 아니다.

이때, 상기 식품에 포함되는 추출물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 식품 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%, 보다 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함될 수 있다.

식품이 음료인 경우에는 100㎖를 기준으로 1 내지 30g, 바람직하게는 3 내지 20g의 비율로 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용된다.

본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 일 실시 양태는 마그놀롤을 유효성분으로 포함하는 분리된 항염증성 대식세포 분화 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어, “항염증”은 염증 발생을 억제하는 것을 의미한다.

본 발명의 용어, “대식세포”는 탐식세포라고도 한다. 면역담당세포의 하나이다. 동물체내의 모든 조직에 분포하며, 이물질 ·세균 ·바이러스 ·체내 노폐세포(老廢細胞) 등을 포식하고 소화하는 대형 아메바상 식세포를 총칭한다.

본 발명의 용어, “분화(differentiation)”는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상을 의미한다. 즉, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다.

본 발명의 용어, “촉진”은 어떤 일을 재촉하여 빠른 시일 내에 일의 과정이 끝나게 하는 행위를 의미한다.

본 발명의 일 실시예에서는, 마그놀롤을 투여한 마우스에서 M1 대식세포 비율을 감소시키고(도 5), 시스플라틴 처리에 의한 M1/M2 대식세포의 비율 변화를 억제하는 것을 확인하였으며(도 6), M0-대식세포의 M2 대식세포로의 분화를 유도하는 것을 확인하였다(도 7).

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 일 실시 양태는 마그놀롤을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 근위축증, 근감소증 또는 근조직 손상 치료방법을 제공한다.

본 발명의 용어, “마그놀롤”, “투여”, “근위축증”, “근감소증”, “근조직”, 및 “손상”은 상기에서 서술한 바와 같다.

본 발명의 용어, “개체”는 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미하고, 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 물질 마그놀롤을 유효성분으로 포함하는 근위축증, 근감소증 또는 근조직 손상 예방 또는 치료용 조성물은, 약학적 조성물로써 유용하게 사용될 수 있다.

도 1A는 마그놀롤 및 시스플라틴 투여 실험을 나타내는 모식도이다.
도 1B는 그룹별 체중량 변화를 나타내는 그래프이다.
도 1C는 그룹별 42일째 근육 회복량을 나타내는 그래프이다.
도 1D는 그룹별 섭취량을 나타내는 그래프이다.
도 1E는 그룹별 맹장, 결장, 및 직장의 상대적 크기를 나타내는 사진이다.
도 1F는 그룹별 혈청 내 BUN 농도를 나타내는 그래프이다.
도 1G는 그룹별 혈청 내 크레아티닌의 농도를 나타내는 그래프이다.
도 2A는 TA 근육 내 근육량을 나타내는 그래프이다.
도 2B는 SOL 근육 내 근육량을 나타내는 그래프이다.
도 2C는 EDL 근육 내 근육량을 나타내는 그래프이다.
도 2D는 그룹별 염색을 통한 TA 근육의 조직학적 분석을 나타내는 사진이다.
도 2E는 TA 근섬유의 직경을 나타내는 그래프이다.
도 2F는 그룹별 마우스의 앞발 그립 테스트 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2G는 그룹별 마우스의 전체 다리의 그립 테스트 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3A는 그룹별 TA 근육 조직의 면역형광염색을 나타내는 사진이다.
도 3B는 그룹별 CD68+ 대식세포의 수를 나타내는 그래프이다.
도 3C는 그룹별 TA 근육 조직 내 qPCR을 통한 IGF-1 mRNA의 발현을 나타내는 그래프이다.
도 3D는 그룹별 TA 근육 조직 내 ELISA를 통한 IGF-1 단백질을 정량화 하는 그래프이다.
도 3E는 그룹별 TA 근육 조직의 면역형광염색을 통해 분석하는 사진이다.
도 4A는 TA 근육 단일 세포의 CD45 또는 IGF-1의 플롯을 나타내는 그래프이다.
도 4B는 전체 세포의 CD45+IGF-1+ 및 CD45-IGF-1+의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 4C는 F4/80의 발현을 나타내는 그래프이다.
도 4D는 F4/80+ 대식세포의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 4E는 F4/80+ 대식세포를 발현하는 IGF-1의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 4F는 F4/80+ 대식세포를 발현하는 IGF-1의 비율을 나타내는 막대그래프이다.
도 4G는 근육 세포의 FACF 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4H는 CD11b+F4/80+ 세포의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 4I는 CD11b+F4/80+ 내 BrdU+ 증식 비율을 나타내는 그래프이다.
도 4J는 CD11b+F4/80+ 내 BrdU+ 증식 비율을 나타내는 막대그래프이다.
도 5A는 대식세포 및 T 세포 서브셋의 분석 전략을 나타내는 사진이다.
도 5B는 CD11b+F4/80+ 대식세포의 플롯을 나타내는 그래프이다.
도 5C는 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 플롯을 나타내는 그래프이다.
도 5D는 그룹별 CD11b+F4/80+ 대식세포의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 5E는 그룹별 CD8+ T 세포의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 5F는 그룹별 CD4+ T 세포의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 5G는 M1, M2a, 및 M2c 대식세포 서브타입의 플롯을 나타내는 그래프이다.
도 5H는 5G는 M1, M2a, 및 M2c 대식세포 서브타입의 플롯을 나타내는 막대그래프이다.
도 6A는 면역염색을 통한 대식세포 표현형을 나타내는 사진이다.
도 6B는 CD163+/CD163-의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 6C는 M1, M2a, M2b, 및 M2c를 유세포 분석기를 통해 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6D는 CD11b+/F4/80+ 세포 내 M1, M2b, 및 M2a/c 대식세포의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 6E는 CD11b+F4/80+ 세포 내 M2c 대식세포의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 6F는 M1/M2c의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 7A는 마그놀롤 처리 및 분화 유도 후 그룹별 세포의 형태 변화를 나타내는 사진이다.
도 7B는 qPCR을 통한 iNOS mRNA를 정량화한 그래프이다.
도 7C는 qPCR을 통한 CD163 mRNA를 정량화한 그래프이다.
도 7D는 qPCR을 통한 MMP-8 mRNA를 정량화한 그래프이다.
도 7E는 qPCR을 통한 IFG-1 mRNA를 정량화한 그래프이다.
도 8A는 농도별 마그놀롤 처리 후 CT-26 종양 세포의 증식 변화를 나타내는 그래프이다.
도 8B는 농도별 마그놀롤 처리 후 LLC 종양 세포의 증식 변화를 나타내는 그래프이다.
도 8C는 그룹별 마우스 내 종양의 크기 변화를 나타내는 그래프이다.
도 8D는 종양-침식 대식세포의 조사 전략을 나타내는 사진이다.
도 8E는 FACS를 통한 CD11b 또는 F4/80의 플롯을 나타내는 그래프이다.
도 8F는 CD45+ 세포 내 CD11b+F4/80+ 대식세포의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 8G는 CD163+CD206+ M2c 대식세포의 플롯을 나타내는 그래프이다.
도 8H는 종양 세포 내 M2c 대식세포의 비율을 나타내는 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실험예 1. 시약

시스플라틴(Cisplatin)은 Sigma-Aldrich에서 구매하여, 1 mg/ml 농도로 식염수에 녹여 사용하였다. 마그놀롤은 Selleckchem (Houston, TX, USA) 및 Sigma-Aldrich에서 구매하였으며, DMSO에 10 mM 농도로 녹여 사용하였다.

실험예 2. 세포

LLC(The murine Lewis lung carcinoma) 세포 라인은 American Type Culture Collection (CRL-1642; VA, USA)로부터 분양 받고, CT-26 (murine colon carcinoma) 세포 라인은 Korean Cell Line Bank (80009; Seoul, Korea)에서 구매하였다. 상기 세포들은 10% 열-비활성화 FBS(), 100U/mL 페니실린, 및 100μg/mL의 스트렙토마이신(15140122; Invitrogen, CA, USA)이 첨가된 DMEM(LM001-05; Welgene, Daegu, Korea)에서 배양하였다. 또한, 온도 37℃, 5% CO₂를 유지하였으며, 컨플루언스(confluence)가 80%가 되거나 2-3일에 한 번씩 계대배양 하였다.

실험예 3. 실험 동물

C57BL/6 야생형 마우스는 DBL (음성군, 충청북도)에서 구매하였으며, 모든 동물은 병원균이 없고, 12시간 낮/밤 주기를 유지하며, 사료와 식수가 자율 배식되는 환경에서 보관하였다. 동물 실험은 경희대학교 동물관리위원회의 승인을 받았다(KHUASP(SE)-18-118). 마우스 모델의 시스플라틴-유도 근육감소증(sarcopenia) 유발을 위하여, 2.5 mg/kg 시스플라틴을 1-5일 째 및 26-30일 째, 총 10회 투여하였다. 과다한 시스플라틴 투여는 지방 분해(lipolysis) 및 거식증(anorexia)을 유발한다고 알려져 있기에, 지방대사 변화를 배제하기 위하여 리포트에 근거한 낮은 용량의 시스플라틴을 사용하였다(Garcia et al., 2013). 마우스는 1, 5, 10 mg/kg의 마그놀롤을 3일에 한 번 복강 내로 주사하여 40일간 투여하였다.

체중량 및 섭취량 조사는 실험 기간 중 3일에 한 번 진행하였다. 실험 종료 후, 마취(2% 이소플루레인, isoflurane) 하에 심장에 구멍을 낸 뒤 혈액을 채취하였으며, 뒷다리 근육(경골근, tibialis anterioris; TA, 외측뒷발가락근, extensor digitalis longus; EDL, 비장근, soleus; SOL)을 채취하였다. 모든 마우스는 이소플루레인 마취 후 자궁경부를 탈구하였다. SONY NEX-5 디지털 카메라를 통해 뒷다리 대표 이미지를 찍었으며, 근육량은 무게 측정을 통해 측정하였다.

실험예 4. 신장 독성 조사

혈액을 3시간 동안 상온에 처리하여 응고하게 한 뒤, 3,000 rpm, 4℃에서 30분간 원심분리 하였다. 상등액을 채취한 뒤, 혈뇨 질소(BUN) 및 크레아티닌(creatinine) 농도를 Genia Inc. (Seongnam, Korea)를 통해 측정하였다.

실험예 5. 그립 테스트 (grip test)

전체 다리 또는 앞다리 악력은 IMADA (DS2-5N)으로부터 얻은 디지털 힘 측정기(Digital force gauge)를 통해 측정하였다. 상기 측정기는 전체 다리를 위하여는 수평적으로, 앞다리를 위하여는 수직으로 사용하였다. 쥐를 격자무늬(grid) 위에 놓거나, 바를 잡게한 뒤, 마우스의 꼬리를 뒤 또는 아래쪽으로 3-5회 당겼다. 가장 높은 피크의 값을 측정하였으며, 모든 실험은 3회 반복하여 평균값을 계산하였다.

실험예 6. 증식 조사

In vitro 암 세포 증식 분석을 위하여, CT-26 및 LLC 세포를 96웰 플레이트에 1 X 10³세포/웰 농도로 접종하였다. 하루 뒤, 세포에 0.1, 1, 및 10μM 마그놀롤을 처리하였다. 24, 48, 및 72시간 후, CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit (Promega, WA, USA)를 제조사의 지시에 따라 수행하여 세포 증식을 측정하였다. In vivo 증식 분석을 위하여, 100μL의 10mg/mL bromodeoxyuridine(BrdU) 용액 (550891; BD bioscience, CA, USA)을 마우스에 복강 내로, 희생 3시간 전에 투여하였다. BrdU-라벨이 된 세포는 항-BrdU 항체를 통해 염색한 뒤, 유세포분석기를 통해 검출하였다.

실험예 7. 유세포분석기(Flow cytometry) 조사

비장세포는 40-um 나일론 메쉬 여과기를 사용하여 단일 세포로 분리하였다. 적혈구는 Pharmlyse buffer (BD bioscence)로 용해한 뒤, 단일 세포는 CD4 T 세포 (CD45+CD4+CD8-), CD8 T 세포 (CD45+CD4-CD8+), 총 대식세포 (CD45+CD11b+F4/80+) 관찰을 위하여, 유동(flowing)의 항체, 항-mCD45-FITC, 항-mCD4-phycoerythrin (PE), 항-mCD8-allophycocyanin (APC), 항-mCD11b-V510, 및 항-mF4/80-V450을 사용하여 4℃에서 1시간동안 염색하였다. M1 (CD206-CD163-), M2a (CD206+CD163-), 및 M2c (CD206+CD163+)는 항-mCD206-APC 및 항-mCD163-PE 유동 항체로 염색하여 CD45+CD11b+F4/80+ 대식세포로 분류하였다. 상기 염색된 세포는 세척 후, BD FACSLyric 기기를 통해 검출하였으며, FlowJo software를 통해 분석하였다.

실험예 8. 조직학적 분석

TA 근육 조직은 10% neutral buffered formalin을 24시간 처리하여 고정하였다. 상기 조직은 70, 80, 90, 및 100%의 에탄올로 탈수한 뒤, ethanol:xylene=1:1 및 xylene에 담지한 뒤, 파라핀에 포매하였다. 상기 티슈는 4μm 굵기의 회전 절단기(rotary microtome)를 통해 절단한 뒤, 파라핀을 제거하고, 다시 수화하였다. H&E 염색을 수행하고, 모든 섹션은 Olympus microscope에서 이미지를 측정하였다. TA 섬유 직경은 ImageJ를 통해 계산하였다.

실험예 9. 면역형광 염색

TA 근육 조직을 수화한 뒤 1.5% BSA(in PBS)에서 1시간 동안, 상온(RT)에서 블락킹하였다. 이후, 상기 섹션은 대식세포의 침윤을 확인하기 위하여 마우스 항-마우스 MHC(1:1,000; R&D) 및 랫트 항-마우스 CD68(1:1,000; Bio-Rad) 1차(primary) 항체와 함께 4℃에서 밤새 반응시켰으며, Alexa Fluor 488이 결합된 항-마우스 IgG 및 Alexa Fluor 594가 결합된 항-랫트 IgG 2차(secondary) 항체를 상온에서 1시간동안 처리하여 시각화 하였다. 대식세포의 수를 카운트하고, 면적 당 수를 계산하였다. M1/M2 대식세포는 토끼 항-마우스 CD68(1:1,000; Santa Cruz), 랫트 항-CD163(1:1,000; ebioscience), Alexa Fluor 488이 결합된 항-토끼 IgG, 및 Alexa Fluor 594가 결합된 항-랫트 IgG로 염색하였다. 형광 세기는 사분면으로 구성(plot)하였다. M1 대식세포는 CD68+CD163- 세포(사분면 #1), M2c 대식세포는 CD68+CD163+(merged) 세포(사분면 #3)로 정의하였다. 상기 M1/M2 비율은 #3의 픽셀 수 분의 #1의 픽셀 수를 나누어 계산하였다. CD68+ 대식세포의 IGF-1 발현을 검출하기 위하여, 섹션을 랫트-항마우스 CD68(1:1,000; Bio-Rad) 및 토끼 항-마우스 IGF-1(1:1,000; R&D) 1차 항체를 처리하였다. 마커는 Alexa Fluor 488이 결합된 항-랫트 IgG 및 Alexa Fluor 594가 결합된 항-토끼 IgG 2차항체로 시각화하였다.

실험예 10. IGF-1 면역검사

TA 근육은 균질기(Precellys® 24; Bertin, France)로 균질화 한 뒤, RIPA 버퍼에 녹인 protease inhibitor cocktails (Roche)를 처리하여 용해하였다. ELISA 키트는 R&D systems에서 구매하여 TA 근육 내 IGF-1의 수치를 확인하는데 사용하였다.

구체적으로, 시료를 항체가 코팅된 96웰 플레이트에 접종하고, 상온에서 2시간 동안 처리하였다. 이후, 플레이트를 세척하고, 검출 항체(detection antibody)를 상온에서 2시간 동안 처리한 뒤, 다시 세척하고, 플레이트를 streptavidin-HRP와 상온에서 1시간 동안 처리하였다. 다시 세척 후, TMB 용액을 상온에서 30분간 처리하고, 1N H₂SO₄ 정지 용액(stop solution) 추가 한 뒤, 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험예 11. 골수-유래 대식세포(BMDM)의 분화

골수 세포는 C57BL/g 마우스의 대퇴골로부터 채취하였다. 적혈구를 용해한 뒤, 세포를 macrophage colony-stimulating factor (M-CSF; 416-ML; R&D systems) 10 ng/ml이 포함된 RPMI1640에서 수거하였다. 상기 세포는 2 X 10⁶ mL 농도로 접종한 뒤, 7일간 M0 대식세포로 분화시켰다. 분화 배양액은 3일마다 교체하였다. 7일 뒤, 세포는 6웰 플레이트로 옮겼으며(1 X 10⁶/웰) M-CSF가 포함된 배양액과 10ng/mL LPS (L4391; Sigma-Aldrich) 또는 20ng/mL murine recombinant IL-4 (404-ML; R&D systems)에 24시간 동안 노출시켜 M1 또는 M2 대식세포로 분화시켰다. 또한, 이와 동시에, 0.1, 1 또는 10 μM의 마그놀롤을 처리하여, 대식세포 표현형에서의 마그놀롤 효능을 관찰하였다.

실험예 12. Real-Time 정량 PCR

BMDM 배양 또는 TA 근육의 전체 RNA를 easy-BLUE™ (17061; iNtRON, Sungnam, Korea). 추출하였다. cDNA 합성은 제조사의 지시에 따라 CycleScript reverse transcriptase (BIONEER, Daejeon, Korea)를 이용하여 수행하였다. 발현 수치는 SYBR Green을 사용한 real-time PCR 증폭을 통해 측정하였다. 세기는 GAPDH 세기를 참고로 하여 표준화한 뒤, standard 2-ddCt를 통해 확인하였다.

또한, 본 발명에서는 하기 프라이머를 사용하였다.

GAPDH

forward: ACC CAG AAG ACT GTG GAT GG (서열번호 1)

reverse: CAC ATT GGG GGT AGG AAC AC (서열번호 2)

Nos2

forward: GGC AGC CTG TGA GAC CTT TG (서열번호 3)

reverse: CAT TGG AAG TGA AGC GTT TCG (서열번호 4)

Cd163

forward: AGGCCACACCTCCTAAACCT (서열번호 5)

reverse: TCTGCCATCTGCTTTCATTG (서열번호 6)

Mmp8

forward: CTTGCACTCTCGATGGACAA (서열번호 7)

reverse: TTGCACAGACACATTGCTGA (서열번호 8)

Igf1

forward: CGATACTCGCTCTGTGTCCA (서열번호 9)

reverse: GTTGGTTTGTGGGTTCTGCT (서열번호 10)

실시예 1. 체중량 손실 및 신장 기능 장애 완화

실시예 1-1. 체중량 손실

시스플라틴은 대표적 항암치료제이며, 급격한 근육 손상을 유발하기에, 시스플라틴을 통해 마우스 모델에서 근육 손상을 유발하고, 마그놀롤을 투여하여 이의 보호 효능을 측정하였다.

실험은 상기 실험예 3의 방법을 통해 수행하였다(도 1A).

그 결과, 도 1B, C에서 볼 수 있듯이, 시스플라틴은 대조군과 비교하여 월등히 체중량의 감소를 유발하였다. 초기 5회의 시스플라틴 투여 후, 급격히 체중량이 감소하였으며, 9일 후, 회복되었다. 그러나 두 번째 시스플라틴 투여 기간에서는 체중량의 회복이 일어나지 않았다(도 1B). 반면, 마그놀롤을 투여한 시스플라틴 투여 마우스에서는 이의 체중량 감소가 완화된 것을 확인하였으며, 두 번째 시스플라틴 투여 기간에서도 체중량 회복이 일어난 것을 확인하였다. 또한, 마그놀롤을 투여한 정산 마우스에서는 아무런 변화가 없는 것을 확인하였다(도 1B, C).

또한, 시스플라틴 또는 마그놀롤의 투여가 거식증을 유발하여 이러한 변화를 가져온 것이 아닌지 확인하기 위하여, 섭취량을 조사한 결과, 모든 그룹에서 차이가 없는 것을 확인하였다(도 1D).

또한, 맹장, 결장, 및 직장을 채취한 뒤, 이의 상대적 크기를 조사한 결과, 시스플라틴 및 마그놀롤 모두 이의 크기에는 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다(도 1E).

실시예 1-2. 신장 기능

염증 반응을 동반한 신장 기능 이상은 현저한 골격근 손상을 유발하기에, BUN의 및 크레아티닌의 수치를 측정하여, 마그놀롤의 신장 기능 이상에 대한 효능을 확인하였다.

실험은 상기 실험예 4의 방법을 통해 수행하였다.

그 결과, 도 1F, G에서 볼 수 있듯이, 시스플라틴을 투여한 마우스에서의 BUN 및 크레아티닌 농도는 현저하게 높은 반면, 마그놀롤을 투여한 그룹에서는 상기의 변화가 완화된 것을 확인하였다.

또한, 모든 그룹에서 실험 모델이 죽는 경우는 일어나지 않았다.

이를 통해, 시스플라틴 투여가 마우스의 근육 손상을 통한 체중량 손실 및 BUN 및 크레아티닌의 수치 증가를 유발하였으나, 마그놀롤이 식이섭취에는 영향이 미치지 않으며, 상기 변화를 현저하게 완화시켜, 우수한 근육 손상 완화 효능이 있음을 확인하였다.

실시예 2. 시스플라틴-유도 근육 위축에 대한 마그놀롤의 보호 효능

근육의 무게, 근섬유의 직경, 및 그립 테스트(악력)를 실시하여, 골격근에 대한 마그놀롤 효능을 확인하였다.

실험은 상기 실험예 3, 5, 및 8의 방법을 통해 수행하였다.

그 결과, 도 2A 내지 C에서 볼 수 있듯이, 시스플라틴 투여한 마우스의 TA, EDL, 및 SOL의 무게를 측정한 결과, 무게가 현저히 감소한 것을 확인하였다. 반면, 마그놀롤을 투여한 마우스에서는 상기 감소가 눈에 띄게 억제되었다.

또한, 도 2D, E에서 볼 수 있듯이, 시스플라틴을 투여한 마우스의 근섬유 직경은 현저하게 감소되었다. 반면, 마그놀롤을 투여한 마우스에서는 상기 감소가 눈에 띄게 억제되었다.

또한, 도 2F, G에서 볼 수 있듯이, 시스플라틴을 투여한 마우스의 악력이 감소한 것을 확인하였다. 반면, 마그놀롤을 투여한 마우스에서는 상기 감소가 눈에 띄게 억제되었다.

반면, 시스플라틴을 투여하지 않고 마그놀롤만 투여한 마우스에서는 정상 대조군과 비교하여 차이가 없음을 확인하였다.

이를 통해, 시스플라틴 투여가 마우스의 근육 손실, 위축, 및 힘을 감소시키는 것을 확인하였으며, 마그놀롤은 상기 감소를 현저하게 억제하여, 우수한 근육 위축으로부터의 보호 효능이 있음을 확인하였다.

실시예 3. 골격근 내 IGF-1 수치 및 대식세포 침윤의 증가

실시예 3-1. 면역염색을 통한 대식세포 침윤 확인

골격근이 손상을 입으면, 호중구 및 대식세포와 같은 백혈구가 손상을 입은 영역으로 빠르게 침윤하고, 재생이 되는 동안 근육 줄기 세포의 활성을 조절한다. 케모카인(chemokines), MMP(matrix metalloproteinases), 및 근육 손상 모델 내 조직 회복을 돕는 다른 조절자들의 중요한 소스가 되는 대식세포가 없으면, 근육 보호가 일어날 수 없다. 이에, 마그놀롤의 보호 효능이 골격근 내 대식세포와 관련된 것인지 확인하였다.

실험은 상기 실험예 9, 10의 방법을 통해 수행하였다.

그 결과, 도 3A, B에서 볼 수 있듯이, 마그놀롤을 처리한 그룹에서는, 시스플라틴의 투여와 상관없이 TA 근육 내 대식세포의 침윤이 현저히 증가한 것을 확인하였다(도 3A, B).

실시예 3-2. 면역염색을 통한 IGF-1 발현 확인

근육발생(myogenesis) 및 단백질 합성과 관련 있는 IGF-1의 발현을 확인하기 위하여 면역염색을 실시하였다. 구체적으로, TA 내 CD68 및 IGF-1의 면역염색은 대식세포의 IGF-1 발현을 나타낸다.

실험은 상기 실험예 7의 방법을 통해 수행하였다.

그 결과, 도 3C, D에서 볼 수 있듯이, IGF-1 mRNA 수치가, 대조군과 비교하여, 마그놀롤을 투여한 마우스 및 시스플라틴 + 마그놀롤을 투여한 마우스에서 증가한 것을 확인하였으나, 통계적으로 큰 차이는 없는 것을 확인하였다.

또한, IGF-1 단백질의 경우, 시스플라틴을 투여한 마우스와 비교하여, 시스플라틴 + 마그놀롤을 투여한 마우스의 TA에서 현저하게 증가한 것을 확인하였으며, 마그놀롤만 투여한 마우스와 정상 대조군 마우스에서는 차이가 없는 것을 확인하였다.

실시예 3-3. 유세포 분석기를 통한 TA 근육 내 IGF-1+ 대식세포 확인

근육발생(myogenesis) 및 단백질 합성과 관련 있는 IGF-1의 발현을 확인하기 위하여 유세포 분석기를 통해 확인하하였다.

그 결과, 도 4A, B에서 볼 수 있듯이, 마그놀롤이 현저하게 IGF-1+CD45+ 세포를 증가시키는 것을 확인하였다. 반면, IGF-1 발현은 CD45- 미오신 세포와 차이가 없음을 확인하였다.

또한, 도 4C,D에서 볼 수 있듯이, 대조군 및 마그놀롤을 투여한 마우스 내 주요 IGF-1+ 면역 세포는 F4/80+ 대식세포임을 확인하여, 마그놀롤에 의해 IGF-1을 생산하는 주요세포가 대식세포에 주로 영향을 미치고 다른 면역세포에는 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.

또한, 도 4E, F에서 볼 수 있듯이, 대조군과 비교하여, CD45+CD11b+ 세포 내 IGF-1+ F4/80+ 대식세포의 비율은 대조군과 비교하여 마그놀롤을 투여한 마우스에서 월등히 높은 것을 확인하여, CD11b+인 대식세포계열 세포 중에서도 F4/80+ 활성화된 대식세포 내에서, 마그놀롤에 의해 IGF-1 생산이 월등히 증가된 것을 확인하였다.

또한, 도 4G, H에서 볼 수 있듯이, 대조군과 비교하여, TA 근육의 대식세포 내 CD45+ 백혈구의 수가 마그놀롤을 투여한 그룹에서 월등히 높아지는 것을 확인하여, 마그놀롤 투여로 근육 내 면역세포(CD45+)가 증가하여, IGF-1을 생산하는 대식세포의 증가가 이루어지는 것을 확인하였다.

또한, 대식세포의 증가가 침윤의 증가에 의한 것인지, 분화의 증가에 의한 것인지 확인하기 위하여, CD11b+F4/80+ 내 BrdU+ 분포를 비교하였다.

그 결과, 도 4 I, J에서 볼 수 있듯이, BrdU를 포함하는 대식세포의 분포는 대조군과 마그놀롤 그룹과 차이가 없었다.

이를 통해, 마그놀롤이 대식세포의 증식에는 영향을 미치지 않고, 대식세포의 침윤을 증가시키는 것을 확인하였다.

실시예 4. 마그놀롤에 의한 대식세포 서브타입의 변화

실시예 4-1. 마그놀롤이 면역세포에 미치는 영향

마그놀롤이 다른 면역세포에도 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 유세포 분석기를 통해 실험을 수행하였다(도 5A).

그 결과, 도 5에서 볼 수 있듯이, 대조군과 비교하여, 시스플라틴을 투여한 마우스의 비장 내 CD45+ 백혈구 중 CD11b+/F4/80+ 대식세포가 현저히 감소한 것을 확인하였다. 반면, 마그놀롤을 투여한 마우스에서는 시스플라틴에 의한 대식세포의 감소가 억제되었으며, 마그놀롤을 단독으로 처리한 마우스 내의 대식세포에서는 변화가 없었다(도 5B 내지 D).

또한, T 세포 서브셋(subset)의 변화를 확인하였으나, CD8 및 CD4 T 세포의 차이는 모든 그룹에서 발견되지 않았다(도 5E, F).

또한, 실험예 7의 방법을 통해, 대식세포 서브셋의 변화를 확인하였다.

그 결과, 도 5G에서 볼 수 있듯이, 대조군과 비교하여, 마그놀롤만 투여한 마우스에서 M1 대식세포가 현저히 감소한 것을 확인하였고, 시스플라틴을 투여한 마우스에서는 M1 대식세포의 비율에 변화가 없음을 확인하였으며, 시스플라틴 + 마그놀롤을 투여한 마우스에서는 시스플라틴 투여 마우스와 비교하여 M1 대식세포의 비율이 현저하게 낮아진 것을 확인하였다.

반면, M2의 경우, 상기와 반대의 결과가 나타나는 것을 확인하였으나, 시스플라틴을 투여한 마우스와 시스플라틴 + 마그놀롤 마우스 간에 차이가 없음을 확인하였다. 또한, 대조군과 비교하여, 마그놀롤 투여가 M2a 대식세포의 수를 증가시켰으나, 시스플라틴 그룹과 차이가 없는 것을 확인하였다(도 5H).

실시예 4-2. 마그놀롤이 대식세포 서브타입의 침윤에 미치는 영향

마그놀롤이 TA 근육 조직 내 대식세포 서브타입의 침윤에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 조직 내로 침투하는 대식세포의 마커로 알려진 CD163 마커를 확인하였다.

실험은 상기 실험예 7 및 9의 방법을 통해 수행하였다.

그 결과, 도 6에서 볼 수 있듯이, 대조군과 비교하여 시스플라틴을 투여한 마우스 내 CD163+/CD163-의 비율 이 현저히 증가한 것을 확인하였다. 반면, 마그놀롤을 투여한 마우스에서는 상기 증가가 억제된 것을 확인하여, 마그놀롤에 의해 조직 내로 침윤하는 염증성 M1 대식세포의 감소가 이루어진 것을 확인하였다.

이를 통해, 시스플라틴 처리에 의해 염증성 M1 대식세포가 다소 증가하였으나, 마그놀롤이 M1 대식세포의 증가를 억제하는 것을 확인하였으며, 시스플라틴에 의해 무너진 M1/M2 비율을 마그놀롤이 완화시키는 것을 확인하였다.

실시예 5. 골수-유래 대식세포의 In vitro 활성 효과

마그놀롤이 대식세포의 표현형에 직접적인 영향을 미치는지를 실험을 통해 확인하였다.

실시예 5-1. 형태 분석

골수 세포는 M-CSF와 함께 7일간 자극하였으며, 상기 세포는 마지막날 24시간 동안, M2a 분화를 위하여 IL-4 또는 M1 분화를 LPS를 마그놀롤과 함께 처리하였다. 보다 구체적으로, 상기 실험예 11의 방법을 통해 수행하였다.

그 결과, 도 7A에서 볼 수 있듯이, M0-대식세포로 분류되는 마그놀롤 처리를 하지 않은 M-CSF 내 세포는 대부분 둥그런 형태를 띄었다. 반면, 마그놀롤을 처리한 M0-대식세포는 방추형의 M2 대식세포와 같은 형태를 띄었다. LPS를 처리한 M1 대식세포는 평평한-원형/달걀후라이와 같은 형태를 띄었으나, 마그놀롤을 처리한 경우, 방추형과 같은 형태를 띄었다. 반면, IL-4를 처리하여 M2a-분화된 대식세포에서는 눈에 띄는 변화를 발견할 수 없었다.

이를 통해, 마그놀롤이 M2 대식세포로의 분화 유도 효능이 있음을 확인하였다.

실시예 5-2. 유전자 발현 분석

상기 표현형의 변화를 유전자 발현 분석을 통하여 분석하였다.

그 결과, 도 7B 내지 D에서 볼 수 있듯이, LPS 처리를 한 결과, M1-특이적 iNOS 발현이 증가하였으며, 마그놀롤을 처리한 경우, 이의 발현 증가가 현저히 억제되었다. 또한, IL-4를 처리한 M2a 그룹에서 마그놀롤을 처리한 후, M2c 분화-특이적 마커인, CD163 및 MMP-8이 현저하게 증가한 것을 확인하였다(도 7B).

또한, LPS를 처리한 M1 그룹에서도 마그놀롤을 처리하자 MMP-8이 현저하게 증가하는 것을 확인하였다(도 7C, D).

또한, IL-4 및 LPS 그룹 모두에서 마그놀롤을 처리하자, IGF-1의 발현이 현저하게 증가한 것을 확인하였다(도 7E).

이를 통해, 마그놀롤이 M0-대식세포의 분화를 조절하고, M1/M2 대식세포의 비율을 조절하는 효능이 있음을 확인하였다.

실시예 6. 암 성장에 대한 마그놀롤 효능

마그놀롤이 대식세포 내 IGF-1을 증사시키는 것을 확인하여, 암 환경 내 M2-유사 대식세포 증가로 인한 암 성장 및 진행에 마그놀롤이 기여하는지 확인하였다.

구체적으로, CT-26 및 LLC 폐 암 세포에 마그놀롤 0.1, 1, 및 10μM 농도로 처리하여 암세포 증식에 미치는 마그놀롤의 효능을 확인하였다. 보다 구체적으로, 종양 세포는 마그놀롤 또는 vehicle만 처리하여 24, 48, 및 72시간동안 배양하였다.

그 결과, 도 8 A, B에서 볼 수 있듯이, 마그놀롤을 처리한 CT26 및 LLC 암 세포에서는 변화가 없는 것을 확인하였다.

또한, 마우스 모델 내 종양에 대한 시스플라틴의 항암 효능에 마그놀롤이 영향을 미치는지를 확인하였다.

그 결과, 도 8 C에서 볼 수 있듯이, 시스플라틴 처리는 현저하게 종양 성장을 감소시켰고, 시스플라틴 + 마그놀롤을 처리한 마우스에서도 현저한 종양 성장 억제가 확인되었다.

또한, 마그놀롤이 종양-관련 대식세포의 침윤을 증가시키는지 확인하였다.

그 결과, 도 8D 내지 F에서 볼 수 있듯이, 대조군 및 시스플라틴을 처리한 마우스와 비교하여, 마그놀롤을 처리한 마우스 및 마그놀롤 + 시스플라틴을 처리한 마우스 모두에서 종양-관련 대식세포의 침윤 비율이 감소한 것을 확인하였다.

또한, CD206+ 및 CD163+ M2-유사 종양-관련 대식세포가 종양의 진행과 관련 있는 것을 확인하여, 마그놀롤이 M2-유사 관련 대식세포를 증가시키는지 확인하였다. 구체적으로, CD11b+F4/80+ 종양-관련 대식세포 내 CD206+CD163+ M2-유사 서브타입의 비율을 조사하였다.

그 결과, 도 8G, H에서 볼 수 있듯이, 모든 그룹에서 차이가 없음을 확인하였다.

이를 통해, 마그놀롤이 종양 진행 및 시스플라틴의 항암 효능에 대하여는 영향을 끼치지 않는 것을 확인하였다.

상기와 같은 시험 결과로부터, 본 발명의 마그놀롤은 항암제의 효능을 감소시키지 않으면서도, 근손실, 근위축, 또는 근감소 등의 부작용을 완화시킬 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Composition for preventing or treating of muscle atrophy, sarcopenia, or muscle damage comprising magnolol <130> KPA190588-KR-P1 <150> KR 10-2019-0053867 <151> 2019-05-08 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 1 acccagaaga ctgtggatgg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 2 cacattgggg gtaggaacac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nos2 forward primer <400> 3 ggcagcctgt gagacctttg 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nos2 reverse primer <400> 4 cattggaagt gaagcgtttc g 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cd163 forward primer <400> 5 aggccacacc tcctaaacct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cd163 reverse primer <400> 6 tctgccatct gctttcattg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mmp8 forward primer <400> 7 cttgcactct cgatggacaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mmp8 reverse primer <400> 8 ttgcacagac acattgctga 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Igf1 forward primer <400> 9 cgatactcgc tctgtgtcca 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Igf1 reverse primer <400> 10 gttggtttgt gggttctgct 20

Claims

마그놀롤을 유효성분으로 포함하는, 근위축증, 근감소증 또는 근조직 손상 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 항암제에 의한 부작용을 개선하기 위한 것인, 약학적 조성물.
제2항에 있어서, 상기 항암제는 시스플라틴, 옥살리플라틴, 플루오로유라실, 이리노테칸, 독소루비신, 또는 에트포시드인 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 근위축증, 근감소증 또는 근조직 손상 예방 또는 치료는, 대식세포의 침윤 증가 또는 분화 촉진에 의한 것인, 약학적 조성물.
마그놀롤 및 항암제를 포함하는, 항암용 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 암은 폐암인 것인, 항암용 약학적 조성물.
마그놀롤을 유효성분으로 포함하는, 근위축증, 근감소증 또는 근조직 손상 예방 또는 완화용 건강기능식품 조성물.
마그놀롤을 유효성분으로 포함하는, 분리된 항염증성 대식세포 분화 촉진용 조성물.
마그놀롤을 유효성분으로 포함하는, 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 근위축증, 근감소증 또는 근조직 손상 치료방법.