KR20200123414A - 거핵구 생성을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

줄기 세포로부터 거핵구 선조세포 (preMK) 및 거핵구 (MK)를 생성하는 방법이 제공된다. 본 개시내용은 preMK 및 MK 및 이들의 용해물을 포함하는 조성물, 및 또한 preMK, MK, 이들의 용해물 및 그의 조성물을 사용하는 방법을 추가로 제공한다.

Description

거핵구 생성을 위한 조성물 및 방법
정부 지원의 진술
이 연구는 미국 국립 보건원으로부터 다음 보조금, 보조금 번호: 1R44HL131050-01, 1R43AI125134-01A1, 및 1SB1HL137591-01에 의해 지원되었다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
관련 출원
본 출원은 2018년 1월 5일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/614,117의 이익 및 우선권을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
분야
본 개시내용은 거핵구 선조세포 및 거핵구의 생성을 위한 방법, 거핵구 선조세포 및 거핵구의 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.
혈소판은 활동적인 출혈 부위에서 혈병 형성 및 혈관 복구를 담당하는 혈액 세포이다. 생리학적으로, 혈소판은 골수에서 세포의 <0.1%를 차지하는 거핵구 (MK)라고 불리는 모 세포에 의해 골수에서 생성된다. 성숙 MK는 골수에서 동모양 혈관 외부에 있고, 프로혈소판이라고 불리는 긴 구조를 순환으로 연장시킨다. 프로혈소판은 혈소판 생성을 위한 어셈블리 라인으로서 기능하고, 순차적으로 이들의 말단으로부터 혈소판을 방출한다.
MK는 골수에서 조혈 줄기 세포로부터 다중 단계 분화 프로세스를 통해 생성된다. 다양한 시토카인, 케모카인, 및 트롬보포이에틴을 포함한 성장 인자에 노출은 조혈 줄기 세포를 다능성 선조 세포로 분화시킨 후, pre-MK라고도 공지된 수임 거핵구 선조 세포로 분화시킨다. 세포의 확대, 증가된 DNA 함량, 핵내분열 및 과립 형성을 포함한 추가 분화 시, 성숙 MK가 생성된다. MK는 이들의 세포괴를 프로혈소판 연장으로 전환시켜, 무핵 혈소판을 생성/방출한다.
낮은 혈소판 카운트는 암 치료, 이식 및 수술을 포함한 치료법 및 다양한 질환의 중요한 결과이며, 혈소판은 비제어된 출혈로 인한 사망을 에방하기 위한 중요한 1차-라인 요법이다. 혈소판 단위 (200-400 mL당 3x10^11 혈소판)는 오직 인간 자원자 공여자로부터 유래되며, 비가역적 활성화를 회피하기 위해 실온에서 저장되어야 한다. 그러나, 이 온도에서 박테리아 성장에 대한 위험이 있으며, 이는 혈소판 단위의 저장 수명을 5일로 제한하며, 이 중 2일은 병원체 스크리닝으로 및 1일은 수송으로 소모된다. 결과적으로, 혈액 센터에는 전형적으로 수혈에 이용가능한 혈소판 재고가 1.5일을 넘지 않아서, 응급 동안 빠르게 고갈된다. 혈소판의 공여자 부족은 특히 중요한 시기에 발생할 수 있다. 민간인 사용 단독의 증가하는 수요는 공급을 ~20%만큼 초과하고, 응급에서 비축이 빠르게 고갈된다. 또한, 단위 및 공여자 사이의 광범위한 기능적 변동성은 효과적인 출혈 제어를 보장하기 위해 과다수혈을 초래한다. 따라서, 혈소판의 공급원을 제공하는 거핵구, 및 거핵구를 생성하는 새로운 개선된 방법이 절실히 요구된다.
본 개시내용은 줄기 세포로부터 거핵구 선조세포 (preMK) 및 거핵구 (MK)를 생성하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 preMK 및 MK 및 이들의 용해물을 포함하는 조성물, 및 또한 preMK, MK, 이들의 용해물 및 그의 조성물을 사용하는 방법을 추가로 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 만능성 줄기 세포를 저점착성 또는 비점착성 조건 하에 및 진탕 하에 확장시키며, 여기서 확장된 만능성 줄기 세포는 자기-응집 스페로이드를 형성하는 것인 단계; 만능성 세포를 제1 배양 배지에서 조혈성 내피 세포로 분화시키는 단계; 조혈성 내피 세포를 제2 배양 배지에서 거핵구 선조세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 거핵구 생성을 위한 방법을 제공한다. 만능성 세포를 조혈성 내피 세포로 분화시키는 단계는 점착성 조건 하에 매트릭스 상에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 만능성 세포를 조혈성 내피 세포로 분화시키는 단계는 조혈성 내피 세포의 자기-응집을 가능하게 하는 저점착성 또는 비점착성 조건 하에 수행된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 만능성 세포를 제1 배양 배지에서 조혈성 내피 세포로 분화시키는 단계; 및 조혈성 내피 세포를 제2 배양 배지에서 거핵구 선조세포로 분화시키는 단계를 포함하며, 여기서 만능성 세포를 분화시키는 단계 및 조혈성 내피 세포를 분화시키는 단계 중 적어도 하나는 매트릭스 코팅된 3차원 구조 상에서 수행되는 것인 거핵구 생성을 위한 방법을 제공한다. 3차원 구조는 마이크로캐리어 또는 마이크로캐리어일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 만능성 세포를 제1 배양 배지에서 조혈성 내피 세포로 분화시키는 단계; 및 조혈성 내피 세포를 제2 배양 배지에서 거핵구 선조세포로 분화시키는 단계를 포함하며, 여기서 만능성 세포를 분화시키는 단계 및 조혈성 내피 세포를 분화시키는 단계 중 적어도 하나는 세포의 자기-응집을 가능하게 하는 저점착성 또는 비점착성 조건 하에 수행되는 것인 거핵구 생성을 위한 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 제1 배양 배지는 골 형태형성 단백질 4 (BMP4), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF) 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 중 하나 이상을 포함한다. 제1 배양 배지는 WNT 조정인자를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 배양 배지는 줄기 세포 인자 (SCF), 트롬보포이에틴 (TPO), Fms-관련 티로신 키나제 3 리간드 (Flt3-L), 인터류킨-3 (IL-3), 인터류킨-6 (IL-6) 및 헤파린 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 만능성 줄기 세포는 인간 유도된 만능성 줄기 세포이다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 만능성 줄기 세포를 매트릭스 코팅된 3차원 구조 상에서 확장시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 거핵구 선조세포를 제3 배양 배지에서 거핵구로 분화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 제3 배지는 줄기 세포 인자 (SCF), 트롬보포이에틴 (TPO), 인터류킨-6 (IL-6), 인터류킨-9 (IL-9) 및 헤파린 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법에 의해 생성된 거핵구 선조세포 또는 거핵구 선조세포의 용해물의 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법에 의해 생성된 거핵구 또는 거핵구의 용해물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 거핵구는 CD42b+, CD61+ 및 DNA+이다.
본 개시내용의 다른 특색 및 장점은 다음의 설명 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
본 개시내용은 예시적인 실시양태의 비제한적인 예에 의해 언급된 다수의 도면을 참조하여 다음의 상세한 설명에서 기재될 것이며, 유사한 참조 번호는 도면의 여러 관점에 걸쳐 유사한 부분을 나타내며, 여기서:
도 1은 iPSC 세포주로부터 거핵구 선조세포 (preMK), 거핵구 (MK) 및 혈소판 (PLT)의 규모가변성 분화에 대한 전체 개략도를 제시한다.
도 2는 2D 매트릭스-의존적 시스템, 예컨대 세포 배양 플레이트 또는 플라스크에서 거핵구로의 만능성 줄기 세포의 예시적인 지시된 분화 프로토콜을 도시한다.
도 3A 및 도 3B는 3개의 예시적인 임상 등급 hiPSC 세포주 (본원에서 PBG1, PBG2, PBG3이라고 지칭됨)의 만능성을 도시한다. 도 3A는 에센셜 8 배지를 사용하여 비트로넥틴 매트릭스 상에서 배양될 때 특징적인 성장 구역을 형성하는 PBG1, PBG2 및 PBG3 iPSC의 저배율 위상차 이미지를 도시한다. 도 3B는 만능성 인자 Oct4 및 Nanog에 대해 면역염색되고 핵 염료로 대조염색된 PBG1, PBG2 및 PBG3 iPSC의 고배율 이미지를 도시한다.
도 4A, 도 4B, 도 4C 및 도 4D는 만능성 줄기 세포로부터 성숙 거핵구로의 지시된 분화 단계를 통해 진행되는 PBG1, PBG2 및 PBG3 iPSC의 배양을 도시한다. 도 4A는 지시된 분화 프로세스의 일반적인 타임라인 개략도를 도시한다. 도 4B는 단계 0 (제0일), 단계 I (제2일 및 제5일), 단계 II (제6+7일) 및 단계 III (제+2일 및 제+4일) 동안 PBG1 배양의 실제 이미지를 제시한다. 도 4C는 단계 0 (제0일), 단계 I (제2일 및 제5일), 단계 II (제6+7일) 및 단계 III (제+2 및 +4일) 동안 PBG2 배양의 실제 이미지를 제시한다. 도 4D는 단계 0 (0일), 단계 I (제2일 및 제5일), 단계 II (제6+7일) 및 단계 III (제+2 및 +4일) 동안 PBG3 배양의 실제 이미지를 제시한다.
도 5는 PBG1, PBG2 및 PBG3 iPSC 세포주의 지시된 분화에 대한 단계 I의 말미에서의 평균 CD31+ 분화 효율을 도시하는 그래프이다.
도 6A, 도 6B 및 도 6C는 PBG1, PBG2 및 PBG3 iPSC 세포주의 지시된 분화의 단계 II 동안 생성된 거핵구 선조세포 (CD43+CD41+)의 순도 및 수율을 제시한다. 도 6A는 제6+6일에 단계 II 배양으로부터 수확된 현탁 세포에 대한 대표적인 CD41/CD43 유동 세포계측법 데이터를 도시한다 (좌측에서 우측으로: PBG1 PBG2, PBG3). 도 6B는 PBG1, PBG2 및 PBG3 iPSC 세포주의 대표적인 단계 II 분화 배양 동안 현탁액으로 방출된 CD41+CD43+ (거핵구 선조세포) 세포의 매일 출력 측정을 제시하는 그래프이다. PBG1 및 PBG2 분화 배양에서 CD41+CD43+ 거핵구 선조세포의 생성은 제6+17일까지 측정한 반면, PBG3 분화 배양에서 CD41+CD43+ 세포의 생성은 제6+8일에 정지시켰다. 도 6C는 CD41+CD43+ 세포/웰의 수로 제시된, 등급 hiPSC 세포주의 단계 II 분화 배양 동안 CD41+CD43+ 세포의 누적 수율을 도시한다.
도 7A, 도 7B 및 도 7C는 궁극적으로 성숙 거핵구를 생성하는, 지시된 분화 프로토콜의 최종 단계인 단계 III을 도시한다. 도 7A는 성숙 거핵구 마커 CD42b를 또한 발현하는 CD41+ 거핵구 계통 세포의 비율에 의해 측정된 바와 같은, 단계 III 배양에서 시간 경과에 따른 PBG1, PBG2 및 PBG3 유래된 세포의 성숙 상태를 도시한다. 도 6B 및 6C는 각각 PBG1 및 PBG2로부터 분화된 단계 III의 제4일에 hiPSC-유래 거핵구의 광학 현미경법 이미지를 도시한다. 프로혈소판 연장의 예는 화살표로 표시된다.
도 8A, 도 8B, 도 8C, 도 8D 및 도 8E는 PBG1, PBG2 및 PBG3 hiPSC의 분화에 의해 유래된 성숙 거핵구의 특징화를 도시한다. 도 8A는 β1-튜불린에 대해 면역염색된 PBG1로부터 유래된 단계 III 세포를 도시하며, 핵을 핵산 염색에 의해 가시화하였다 (상단 패널). PBG1로부터 유래된 거핵구를 또한 전자 현미경법에 의해 분석하였다 (하단 패널). 도 8B는 PBG2 hiPSC의 분화에 의해 유래된 단계 III 세포를 도시한다. PBG2로부터 유래된 거핵구를 β1-튜불린에 대해 면역염색하고, 핵을 핵산 염색에 의해 가시화하였다 (상단 패널). PBG2로부터 유래된 거핵구를 또한 전자 현미경법에 의해 분석하였다 (하단 패널). 도 8C는 PBG3 hiPSC의 분화에 의해 유래된 단계 III 세포를 도시한다. PBG3으로부터 유래된 거핵구를 β1-튜불린에 대해 면역염색하고, 핵을 핵산 염색에 의해 가시화하였다 (상단 패널). PBG3으로부터 유래된 거핵구를 전자 현미경법에 의해 분석하지 않았다 (하단 패널). 도 8D는 세포내 폰 빌레브란트 인자에 대해 양성으로 염색된 PBG1, PBG2 및 PBG3 iPSC로부터 유래된 단계 III 세포의 비율을 도시한다. 도 8E는 세포내 혈소판 인자 4에 대해 양성으로 염색된 PBG1, PBG2 및 PBG3 iPSC 세포주로부터 유래된 단계 III 세포의 비율을 도시한다.
도 9A, 도 9B 및 도 9C는 다양한 성장 배지를 사용하여 재조합 비트로넥틴 상에서 만능성 PBG1 세포의 확장을 도시한다. 도 9A는 에센셜 8 배지에서 PBG1 성장을 제시한다. 도 9B는 스템플렉스(StemFlex) 배지에서 PBG1 성장을 제시한다. 도 9C는 뉴트리스템(Nutristem) XF 배지에서 PBG1 성장을 제시한다.
도 10A, 도 10B 및 도 10C는 다양한 성장 배지를 사용하여 재조합 비트로넥틴 상에서 확장된 PBG1 세포 상의 만능성 마커 Tra-1-60, SSEA5 및 분화 마커 SSEA1의 발현을 평가하는 유동 세포계측법 데이터를 도시한다. 도 10A는 에센셜 8 배지에서 확장된 PBG1 세포로부터의 만능성 마커 데이터를 제시한다. 도 10B는 스템플렉스 배지에서 확장된 PBG1 세포로부터의 만능성 마커 데이터를 제시한다. 도 10C는 뉴트리스템 XF 배지에서 확장된 PBG1 세포로부터의 만능성 마커 데이터를 제시한다.
도 11A, 도 11B 및 도 11C는 3D 교반 탱크 (매트릭스 프리)에서 자기-응집 스페로이드 배양에서 PBG1 iPSC의 확장을 도시한다. 도 11A는 배양에서 시간 경과에 따른 PBG1 스페로이드의 현미경 이미지를 제시한다. 도 11B는 시간 경과에 따른 PBG1 스페로이드 배양에서 세포 밀도의 증가를 도시한다. 도 11C는 3D 배양에서 시간 경과에 따른 평균 PBG1 스페로이드 크기를 도시한다.
도 12A 및 도 12B는 3D 교반 탱크 (매트릭스 프리)에서 자기-응집 스페로이드 배양에서 확장된 PBG1 세포 상의 만능성 마커 Tra-1-60, SSEA5, 및 분화 마커 SSEA1의 발현을 평가하는 유동 세포계측법 데이터를 도시한다. 도 12A는 3D 교반 탱크에서 단일 7-일 확장 후에 PBG1 세포에 대한 만능성 마커 데이터를 제시한다. 도 12B는 3D 교반 탱크에서 4회의 연속 6-7일 확장 후에 PBG1 세포에 대한 만능성 데이터를 제시한다.
도 13A 및 도 13B는 만능성 인자 Oct 4 및 Nanog에 대해 면역염색되고 핵 염료로 대조염색된 PBG1 iPSC를 도시한다. 도 13A는 비트로넥틴 상에서 성장된 PBG-1 iPSC의 2D 콜로니의 부분을 도시한다. 도 13B는 3D 교반된 조건 (매트릭스 프리)에서 성장된 PBG-1 iPSC의 스페로이드를 도시한다.
도 14는 3D 교반 탱크에서 4회의 연속 6-7일 확장 동안 성장된 PBG1 iPSC로부터 중기 염색체 확산의 핵형 분석을 도시하며, 이는 3D 계대배양의 4회 라운드 후 정상적인 핵형을 나타낸다.
도 15는 2D 배양 용기에서 콜라겐 IV 매트릭스 상에서 PBG1 iPSC의 조혈성 내피로의 단계 I 분화의 6일에 걸쳐 발생하는 형태학적 변화를 도시한다.
도 16A 및 도 16B는 PBG1-유래 세포에 대한 대표적인 단계 I 분화 데이터를 도시한다. 도 16A는 분화 제6일에 PBG1-유래 세포의 대표적인 유동 세포계측법 분석을 도시한다. 조혈성 내피 세포는 CD31 및 CD34의 세포 표면 발현을 통해 확인된다. 도 16B는 41개의 독립적인 PBG1 지시된 분화에 걸친 단계 I (제6일) 분화 효율의 평균 및 범위를 도시한다.
도 17A, 도 17B 및 도 17C는 PBG1 분화 배양으로부터의 대표적인 단계 II 데이터를 도시한다. 도 17A는 제6+6일에 단계 II 배양을 제시하며, 조혈성 내피 (HE) 단층이 백그라운드에 있고, 거핵구 선조세포 (preMK)는 단층으로부터 현탁액으로 방출된다. 도 17B는 CD43+ 조혈 선조 세포를 확인하는, 단계 II 현탁 세포의 유동 세포계측법 분석을 제시한다. 도 17C는 CD43+CD41+CD14- 거핵구 선조세포 (preMK)를 확인하는, CD43+ 조혈 세포의 유동 세포계측법 분석을 제시한다. 오염성 CD43+CD14+ 골수성 선조세포가 또한 이 분석에서 확인된다.
도 18A 및 도 18B는 단계 II 현탁 세포의 평균 조성 특징을 도시한다. 도 18A는 단계 II의 10일에 걸쳐 방출된 preMK의 평균 일일 순도 (즉, 생존가능한 현탁 세포의 % CD41+CD43+CD14-)를 도시한다. 도 18B는 단계 II의 10일에 걸친 오염성 골수성 선조세포 (즉, 생존가능한 현탁 세포의 % CD43+CD14+)의 중위수, 사분위수 및 범위를 도시한다. 모든 배양은 2D 용기에서 콜라겐 IV 매트릭스 상에서 PBG1 세포로 개시되었다. 데이터는 41개의 독립적인 분화를 나타낸다.
도 19A 및 도 19B는 방출된 preMK의 수율을 도시한다. 도 19A는 PBG1 iPSC로 개시된 단계 II 지시된 분화 배양 동안 6-웰 당량 (즉, 2 ml의 배지, 9.5 ㎠ 표면적)당 방출된 preMK (즉, 생존가능한 CD41+CD43+CD14-)의 평균 일일 수율을 도시한다. 도 19B는 PBG1 iPSC로 개시된 단계 II 지시된 분화 배양의 제6+4일 및 제6+8일 사이에 6-웰 당량 (즉, 2 ml의 배지, 9.5 ㎠ 표면적)당 방출된 preMK (즉, 생존가능한 CD41+CD43+CD14-)의 누적 수율을 도시한다. 각각의 도트는 2D 배양 용기에서 콜라겐 IV 매트릭스 상의 독립적인 PBG1 지시된 분화 배양을 나타낸다.
도 20A, 도 20B, 도 20C 및 도 20D는 단계 III에서의 MK 분화 및 프로혈소판 생성을 도시한다. 도 20A는 단계 III의 제1일에 PBG1-유래 거핵구 선조세포를 도시한다 (상단 패널: 고배율; 하단 패널: 저배율). 도 20B는 단계 III의 제2일에 성숙 거핵구를 도시한다 (상단 패널: 고배율; 하단 패널: 저배율). 도 20C는 단계 III의 제4일에 성숙 거핵구를 도시한다 (상단 패널: 고배율; 하단 패널: 저배율). 도 20D는 단계 III 배양의 4일 후 성숙 PBG1-유래 MK로부터의 자발적인 프로혈소판 형성을 도시한다.
도 21A, 도 21B 및 도 21C는 PBG1 iPSC로부터 개시된 제3일 단계 III 배양으로부터의 대표적인 유동 세포계측법 분석을 도시한다. 도 21A는 단계 III 세포의 CD61+ (거핵구) 분획을 확인한다. 도 21B는 CD42a+CD42b+ 성숙 MK를 확인하는, CD61+ 거핵구 세포의 유동 세포계측법 분석을 제시한다. 아폽토시스성 CD42a+CD42b- 세포가 또한 이 분석에서 확인될 수 있다. 도 21C는 대표적인 단계 III 배양의 서브세트 내역을 도시한다. 비-MK는 CD61-이고, 미성숙 MK는 CD61+CD42a-CD42b-이고, 아폽토시스성 MK는 CD61+CD42a+CD42b-이고, 성숙 MK는 CD61+CD42a+CD42b+이다.
도 22A 및 도 22B는 PBG1 세포의 지시된 분화의 단계 I에서의 라미닌 521 및 콜라겐 IV의 사용을 제시한다. 도 22A는 4.2 ug/㎠의 인간 콜라겐 IV 상에서의 단계 I 분화의 진행을 제시한다. 도 22B는 0.13 ug/㎠의 재조합 인간 라미닌 521 상에서의 단계 I 분화의 진행을 제시한다.
도 23A, 도 23B 및 도 23C는 PBG1 세포의 지시된 분화의 단계 II에서 거핵구 선조세포의 생성 및 방출을 지지하기 위한 재조합 라미닌 521의 사용을 도시한다. 도 23A는 4.2 ug/㎠ 인간 콜라겐 IV의 지지 매트릭스를 사용한 PBG1 분화 배양의 단계 II로부터의 대표적인 유동 세포계측법 데이터를 도시한다. 도 23B는 0.13 ug/㎠ 재조합 인간 라미닌 521의 지지 매트릭스를 사용한 PBG1 분화 배양의 단계 II로부터의 대표적인 유동 세포계측법 데이터를 도시한다. 도 23C는 4.2 ug/㎠ 인간 콜라겐 IV 또는 0.13 ug/㎠ 재조합 인간 라미닌 521의 지지 매트릭스를 사용한, PBG1 iPSC로 개시된 단계 II 지시된 분화 배양의 제6+4일 및 제6+8일 사이의 6-웰 당량 (즉, 2 ml의 배지, 9.5 ㎠ 표면적)당 방출된 preMK (즉, 생존가능한 CD41+CD43+CD14-)의 누적 수율을 도시한다.
도 24A 및 도 24B는 라미닌 521 배양으로부터 생성된 preMK로부터 분화된 MK로부터의 프로혈소판의 생성을 제시한다. 콜라겐 IV 배양으로부터 preMK로 개시된 단계 III (제6+6+3일) 배양은 도 24A에 제시되고, 라미닌 521 배양으로부터 preMK로 개시된 단계 III (제6+6+3일) 배양은 도 24B에 제시된다. 적색 화살표는 프로혈소판의 예를 나타낸다.
도 25A 및 도 25B는 단계 III (제6+6+3일) 배양의 유동 세포계측법 서브세트 내역을 제시한다. 도 25A는 콜라겐 IV 배양으로부터 preMK로 개시된 단계 III (제6+6+3일) 배양의 유동 세포계측법 서브세트 내역을 제시한다. 도 25B는 재조합 라미닌 521 배양으로부터 preMK로 개시된 단계 III (제6+6+3일) 배양의 유동 세포계측법 서브세트 내역을 제시한다. 비-MK는 CD61-이고, 미성숙 MK는 CD61+CD42a-CD42b-이고, 아폽토시스성 MK는 CD61+CD42a+CD42b-이고, 성숙 MK는 CD61+CD42a+CD42b+이다.
도 26A, 도 26B 및 도 26C는 라미닌 521 상의 제6일 단계 I 배양의 면역형광 현미경법 이미지를 도시한다. 도 26A는 WNT 효능제가 없는 대조군 배양을 도시한다. 도 26B는 0.6 uM의 WNT 효능제 CHIR98014가 단계 I의 처음 48시간 동안 분화 배양물에 첨가된 배양을 도시한다. 도 26C는 6 uM의 WNT 효능제 CHIR99021이 단계 I의 처음 48시간 동안 분화 배양물에 첨가된 배양을 도시한다.
도 27A 및 도 27B는 라미닌 521 상의 제6+4일 단계 II 배양의 면역형광 현미경법 이미지를 도시한다. 도 27A는 WNT 효능제가 없는 대조군 배양을 도시한다. 도 27B는 0.6 uM의 WNT 효능제 CHIR98014가 단계 I의 처음 48시간에 첨가된 배양을 도시한다.
도 28은 3D 매트릭스 의존적 방법인 충전층 생물반응기 전략을 사용하여 PBG1의 거핵구 선조세포로의 예시적인 지시된 분화 프로토콜을 도시하는 개략도이다. 본원에 기재된 실시양태에서, PTFE로 제조된 라미닌 521 코팅된 라시히 링(Raschig ring)은 충전층을 구성하기 위한 매크로캐리어로서 사용된다.
도 29는 제3일 및 제6일에 라미닌521 코팅된 라시히 링 상의 PBG-1 iPSC의 단계 I 분화를 도시한다.
도 30은 제6+0일 및 제6+4일에 라미닌521 코팅된 라시히 링 상의 PBG-1 iPSC의 단계 II 분화를 도시한다.
도 31A, 도 31B 및 도 31C는 라시히 링 기질 상에서 효율적으로 진행되는 PBG1 분화 단계로부터의 유동 세포계측법 데이터를 도시한다. 도 31A는 제6일에 조혈성 내피 마커 CD31 및 CD34에 대한 유동 세포계측법 염색을 사용한 단계 I을 도시한다. 도 31B는 제6+2일에 거핵구 선조세포 마커 CD43 및 CD41에 대한 유동 세포계측법 염색을 사용한 단계 II를 도시한다. 도 31C는 제6+3+3일에 CD61 및 CD42b에 대한 유동 세포계측법 염색을 사용한 단계 III을 도시한다.
도 32는 교반 탱크에서 자기-응집 iPSC-유래 스페로이드를 사용하여 지시된 분화의 예시적인 3D 매트릭스 독립적인 방법의 개략도이다.
도 33A 및 도 33B는 PBG1 iPSC의 자기-응집 스페로이드로 개시된 단계 0 및 단계 I 분화를 도시한다. 도 33A는 제-1일에 단일 세포 해리된 PBG1 세포, 제0일에 자기-응집된 PBG1 iPSC 스페로이드, 제3일에 부분적으로 분화된 스페로이드, 및 제6일에 조혈성 내피 세포를 함유하는 완전히 분화된 스페로이드로 시작하는 일련의 마이크로그래프를 도시한다. 도 33B는 이 접근법을 사용하여 성공적인 CD31+CD34+ 조혈성 내피 분화를 제시하는 제6일 유동 세포계측법 데이터를 도시한다.
도 34A, 도 34B, 도 34C 및 도 34D는 PBG1 iPSC의 자기-응집 스페로이드로 개시된 지시된 분화에서 단계 II를 기술한다. 도 34A는 지시된 분화의 단계 II 동안 제6+4일에 자기-응집된 PBG1-유래 스페로이드를 도시하며, 여기서 preMK는 스페로이드로부터 현탁액으로 방출된다. 도 34B는 preMK 마커 CD41 및 CD43에 대한 염색인 수확된 현탁 세포의 유동 세포계측법 분석을 도시한다. 도 34C는 2개의 상이한 3D 시스템, 궤도형 진탕기 상의 초저점착성 용기 및 스피너 플라스크에서 단계 II에서 시간 경과에 따른 preMK 순도를 도시한다. 도 34D는 2개의 상이한 3D 시스템, 궤도형 진탕기 상의 초저점착성 용기 및 스피너 플라스크에서 단계 II에서 시간 경과에 따른 preMK 수율을 도시한다.
도 35A, 도 35B 및 도 35C는 PBG1 iPSC의 자기-응집 스페로이드로부터 개시된 3D, 매트릭스-독립적 배양물로부터의 단계 III MK 분화를 도시한다. 도 35A는 제3일 단계 III 배양으로부터의 대표적인 유동 세포계측법 분석을 도시하며, 단계 III 세포의 CD61+ (거핵구) 분획을 확인한 후, CD42a+CD42b+ 성숙 MK를 확인한다. 아폽토시스성 CD42a+CD42b- 세포가 또한 이 분석에서 확인될 수 있다. 도 35B는 대표적인 단계 III 배양의 서브세트 내역을 도시한다. 비-MK는 CD61-이고, 미성숙 MK는 CD61+CD42a-CD42b-이고, 아폽토시스성 MK는 CD61+CD42a+CD42b-이고, 성숙 MK는 CD61+CD42a+CD42b+이다. 도 35C는 제3일에 단계 III 배양물 내의 성숙 MK 분획이 2D (매트릭스-의존적) 및 3D (매트릭스-독립적) 접근법을 어떻게 비교하는지를 제시한다.
도 36은 3D 자기-응집 스페로이드 분화 배양물로부터 수확된 성숙 MK의 프로혈소판 연장을 도시한다. 프로혈소판 연장의 예는 화살표로 표시된다.
도 37은 거핵구-특이적 단백질 β1-튜불린에 대해 면역염색된 PBG1-유래 거핵구를 도시한다. 동시에, 핵을 핵산 염색에 의해 가시화하였다.
도 38A, 도 38B, 도 38C, 도 38D, 도 38E 및 도 38F는 α-과립 특이적 단백질 혈소판 인자 4 (PF4), 폰 빌레브란트 인자 (VWF), 뿐만 아니라 거핵구-특이적 세포 표면 마커 CD61, 및 핵에 대해 면역염색된 PBG1-유래 거핵구를 도시한다.
도 39A, 도 39B, 도 39C, 도 39D, 도 39E 및 도 39F는 치밀 과립 특이적 단백질 LAMP1 및 세로토닌, 뿐만 아니라 거핵구-특이적 세포 표면 마커 CD61, 및 핵에 대해 면역염색된 PBG1-유래 거핵구를 도시한다.
도 40A, 도 40B, 도 40C 및 도 40D는 PBG1-유래 거핵구를 제시하는 전자 현미경법 이미지이다. 도 40A는 PBG1-유래 거핵구 생성 마이크로입자 (예를 들어 화살표 참조)를 제시하는 전자 현미경법 이미지이다. 도 40B는 PBG1-유래 거핵구 및 다소포체 (화살표; 삽도에서 확대됨)를 제시하는 전자 현미경법 이미지이다. 도 40C는 다엽 핵, 글리코겐 과립, 알파-과립, 및 함입된 막 시스템을 특징으로 하는 PBG1-유래 거핵구를 제시하는 전자 현미경법 이미지이다. 도 40D는 PBG1-유래 거핵구의 내형질 세망 및 미토콘드리아를 제시하는 전자 현미경법 이미지이다.
도 41A, 도 41B 및 도 41C는 거핵구로의 PBG1 지시된 분화 과정을 통해 발생하는 특징적인 유전자 발현 변화를 도시한다. 모든 발현 분석에 대해, 만능성 PBG1 세포에서의 발현은 1로 설정하고, 모든 다른 발현 값은 상대적 측면에서 표시된다. 도 41A는 만능성 PBG1 세포, 제6일 세포 (단계 I의 말기), 제6+4일 및 제6+5일 (단계 II), 및 제6+5+1일 내지 제6+5+4일 (단계 III)에서의 만능성-연관 유전자인 Oct4의 상대적 유전자 발현을 도시한다. 도 41B는 만능성 PBG1 세포, 제6일 세포 (단계 I의 말기), 제6+4및 및 제6+5일 (단계 II), 및 제6+5+1일 내지 제6+5+4일 (단계 III)에서의 거핵구 성숙에 중요한 전사 인자인 NFE2의 상대적 유전자 발현을 도시한다. 관련 유전자의 패널에 대해 유사한 분석을 수행하였고, 이 분석의 결과는 도 41C에 제시된 열 지도에 요약되어 있으며, 유전자 OCT4, SOX2, NANOG 및 ZFP42는 분화 동안 하향조절되고, 유전자 ZFPM1, NFE2, RUNX1, MEIS1 및 GATA1은 분화 동안 상향조절되고, 유전자 PBX1 및 MYC는 실질적으로 일정한 수준으로 유지된다.
도 42A, 도 42B 및 도 42C는 PBG1 유래된 거핵구의 크기 분포를 제공한다. 도 42A는 PBG1-MK의 크기 측정을 수집하고 다른 공급원으로부터의 MK와 비교하는데 사용된 PBG1 유래된 거핵구의 β1-튜불린 염색의 대표적인 예를 도시한다. 도 42B는 중위수, 사분위수 및 범위를 포함한, PBG1 유래된 거핵구의 크기 분포를 도시한다. 도 42C는 PBG1 유래된 MK의 크기 분포 데이터를 다양한 골수 공급원으로부터의 거핵구와 비교한다.
도 43A 및 도 43B는 PBG1 유래된 거핵구에 대한 배수성 측정을 제공한다. 도 43A는 PBG1 유래된 거핵구에 대해 수행된 DNA 배수성 측정의 대표적인 예를 도시한다. 도 43B는 PBG1-MK의 DNA 배수성 측정을 다른 공급원으로부터의 MK와 비교한다.
도 44는 본 개시내용의 방법에 의해 유래된 hiPSC-MK 거핵구의 용해물 및 특정 대조군에서 다양한 인자의 존재 또는 부재 및 농도 범위의 비교를 제공한다.
도 45A, 도 45B 및 도 45C는 hiPSC 혈소판 생성을 도시한다. 도 45A는 무핵 및 유핵 세포 (상단, 좌측)의 유동 세포계측법 분석을 도시한다. 유핵 세포는 다수의 CD41+CD42+ 거핵구 (상단, 우측)를 함유하였다. CD41+, CD42+ 및 칼세인 AM에 대해 양성인 무핵 세포를 유동 세포계측법을 사용하여 평가하였고, 혈소판을 크기 (1-5 마이크로미터)에 의해 게이팅하였다. 도 45B는 전자 현미경법에 의해 평가된 거핵구 배양물로부터 수확된 혈소판의 예를 제시헌더. 도 45C는 본원에 기재된 지시된 분화 프로토콜의 단계 III 동안 웰당 CD41+CD42+ 칼세인 AM+ 혈소판-크기 입자의 누적 수율을 도시하는 그래프이다.
상기 확인된 도면들은 본원에 개시된 실시양태들을 설명하지만, 논의에서 언급된 바와 같이 다른 실시양태들도 또한 고려된다. 본 개시내용은 예시적인 실시양태를 표시 방식으로 제공하지만 제한하지 않는다. 본원에 개시된 실시양태의 원리의 범위 및 취지 내에 속하는 수많은 다른 변형 및 실시양태가 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 고안될 수 있다.
본 개시내용은 줄기 세포, 예컨대 만능성 줄기 세포, 예를 들어 임상-등급 인간 유도된 만능성 줄기 세포로부터 거핵구 선조세포 (preMK) 및 거핵구 (MK)를 생성하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 연장된 시간 프레임 (최대 8일 또는 그 초과) 동안 조혈성 내피 세포로부터 preMK의 지속적인 생성을 가능하게 하며, 이는 이어서 후속적으로 성숙 MK로 분화될 수 있다. 본 방법에 의해 유래된 preMK 및 MK는 다음 중 하나 이상에 의해 구별될 수 있다: 이들의 크기 범위, 배수성 프로파일, 바이오마커 발현, 유전자 발현, 과립 조성, 및 성장 인자, 시토카인 및 케모카인 조성 또는 이들의 조합. 본 개시내용은 preMK 및 MK 및 이들의 용해물을 포함하는 조성물, 및 또한 preMK 및 MK 및 이들의 용해물 및 그의 조성물을 사용하는 방법을 추가로 제공한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속한 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 다음 참고문헌은 통상의 기술자에게 본 개시내용에 사용된 많은 용어의 일반적인 정의를 제공한다: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). 본원에서 사용된 바와 같이, 다음 용어는 달리 명시되지 않는 한 아래에 언급된 의미를 갖는다.
"작용제"는 임의의 소분자 화학 화합물, 항체, 핵산 분자 또는 폴리펩티드, 또는 그의 단편을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하는 이뮤노글로불린 분자를 지칭한다. 용어 "항체 단편"은 무손상 항체의 일부를 지칭하며, 무손상 항체의 항원 결정 가변 영역을 지칭한다.
"변경" 또는 "변화"는 증가 또는 감소를 의미한다. 변경은 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%만큼 적은, 또는 40%, 50%, 60%만큼, 또는 심지어 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 100%만큼 많은 것일 수 있다.
"생물학적 샘플"은 유기체로부터 유래된 임의의 조직, 세포, 유체 또는 다른 물질을 의미한다.
"포획 시약"은 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 선택하거나 또는 단리하기 위해 핵산 분자 또는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 시약을 의미한다.
"세포 조성물"은 하나 이상의 단리된 세포를 포함하는 임의의 조성물을 의미한다.
"세포 생존"은 세포 생존력을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "임상 등급"은 현행 우수 의약품 제조 관리기준 (GMP: Good Manufacturing Practice)을 사용하여 유래되거나 또는 수득된 세포 또는 세포주를 의미하며, 이는 인간에서 그의 임상적 사용을 허용한다. GMP는 최종 산물이 미리 설정된 사양을 충족하는 것을 보장하도록 제약 산업에서 사용되는 품질 보증 시스템이다. GMP는 최종 산물의 제조 및 시험 둘 모두를 포괄한다. 이는 원료의 추적성을 요구하며, 또한 생산은 인증된 표준 운영 절차 (SOP)를 따른다.
"검출가능한 수준"은 분석물질의 양이 이러한 분석을 수행하기 위해 일상적으로 사용되는 방법을 사용하여 검출하기에 충분한 것을 의미한다.
"검출하다"는 검출될 물체의 존재, 부재 또는 양을 확인하는 것을 지칭한다.
"검출가능한 라벨"은 관심있는 분자에 연결될 때 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단을 통해 후자를 검출가능하게 하는 조성물을 의미한다. 예를 들어, 유용한 라벨은 방사성 동위원소, 자성 비드, 금속성 비드, 콜로이드성 입자, 형광 염료, 전자-치밀 시약, 효소 (예를 들어, ELISA에서 흔히 사용되는 바와 같음), 비오틴, 디곡시게닌 또는 합텐을 포함한다.
"질환"은 세포, 조직 또는 장기의 정상적인 기능을 손상시키거나 또는 방해하는 임의의 상태 또는 장애를 의미한다. 질환의 예는 허혈 상해, 예컨대 뇌졸중, 심근 경색증, 또는 조직 손상을 유발하는 임의의 다른 허혈 사건, 말초 혈관 질환, 상처, 화상, 골절, 둔기 외상, 관절염, 및 염증성 질환을 포함한, 세포 수 또는 생물학적 기능의 저하를 초래하는 임의의 질환 또는 상해를 포함한다.
"유효량"은 의도된 효과를 생성하는데 필요한 작용제의 양을 의미한다.
"단편"은 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 부분을 의미한다. 이 부분은 바람직하게는, 참조 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 전체 길이의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%를 함유한다. 단편은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000개의 뉴클레오티드 또는 아미노산을 함유할 수 있다.
용어 "단리된," "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한"은 그의 천연 상태에서 발견되는 바와 같이 정상적으로 수반되는 구성성분으로부터 다양한 정도로 없는 물질을 지칭한다. "단리하다"는 원래 공급원 또는 주변환경으로부터의 분리 정도를 나타낸다. "정제하다"는 단리보다 높은 분리 정도를 나타낸다. "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한" 단백질은 임의의 불순물이 단백질의 생물학적 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않거나 또는 다른 유해 결과를 유발하지 않도록 다른 물질이 충분히 없다. 즉, 본 발명의 핵산 또는 펩티드는, 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 때 세포 물질, 바이러스 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 또는 화학적으로 합성될 때 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 경우 정제된다. 순도 및 균질성은 전형적으로 분석용 화학 기술, 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 결정된다. 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 본질적으로 하나의 밴드를 생성함을 나타낼 수 있다. 변형, 예를 들어 인산화 또는 글리코실화를 거칠 수 있는 단백질의 경우, 상이한 변형은 상이한 단리된 단백질을 생성할 수 있으며, 이는 별도로 정제될 수 있다.
"단리된 폴리뉴클레오티드"는 본 개시내용의 핵산 분자가 유래된 유기체의 자연-발생 게놈에서 유전자를 플랭킹하는 유전자가 없는 핵산 (예를 들어, DNA)을 의미한다. 그러므로 상기 용어는 예를 들어, 벡터로; 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스로; 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA로 혼입된; 또는 다른 서열과 독립적인 별도의 분자 (예를 들어, PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 소화에 의해 생성된 cDNA 또는 게놈 또는 cDNA 단편)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 또한, 상기 용어는 DNA 분자, 뿐만 아니라 추가 폴리펩티드 서열을 코딩하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA로부터 전사된 RNA 분자를 포함한다.
"단리된 폴리펩티드"는 자연적으로 이를 수반하는 구성성분으로부터 분리된 본 개시내용의 폴리펩티드를 의미한다. 전형적으로, 폴리펩티드는 이와 자연적으로 회합된 단백질 및 자연-발생 유기 분자로부터 적어도 60 중량% 자유로운 경우 단리된다. 바람직하게는, 제제는 본 개시내용의 폴리펩티드의 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 99 중량%이다. 본 개시내용의 단리된 폴리펩티드는 예를 들어, 천연 공급원으로부터의 추출에 의해, 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 핵산의 발현에 의해; 또는 단백질의 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다. 순도는 임의의 적절한 방법, 예를 들어 칼럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 또는 HPLC 분석에 의해 측정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "조혈성 내피 세포"는 조혈 세포 유형 또는 내피 세포 유형을 생성하도록 분화될 수 있고, 임의로 만능성 줄기 세포로부터 유래될 수 있는 세포를 지칭한다. 조혈성 내피 세포는 정상적으로 세포외 매트릭스 단백질 및/또는 다른 조혈성 내피 세포에 점착성이고, 일부 실시양태에서, 마커 CD31 및 CD34의 발현을 특징으로 할 수 있다.
"마커"는 특징 또는 상태와 연관된 발현 수준 또는 활성의 변경을 갖는 임의의 단백질 또는 다른 에피토프를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "거핵구" (MK)는 프로혈소판 및/또는 혈소판을 생성하는 경향을 갖는 큰 (예를 들어, 직경 ≥10 μm) 다배수체 조혈 세포를 지칭한다. 성숙 MK의 하나의 형태학적 특징은 큰 다엽 핵의 발달이다. 성숙 MK는 증식을 정지할 수 있지만, 세포 크기의 평행 증가와 함께 핵내분열을 통해 이들의 DNA 함량을 계속 증가시킬 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "거핵구 선조세포" (preMK)는 거핵구 계통에 개입하고 성숙 거핵구에 대한 전구체인 단핵 조혈 세포를 지칭한다. 거핵구 선조세포는 정상적으로 골수 및 다른 조혈 위치에서 발견되지만 (이에 제한되지는 않음), 또한 만능성 줄기 세포로부터 생성될 수 있으며, 예컨대 만능성 줄기 세포로부터 그 자체 유래된 조혈성 내피 세포의 추가 분화에 의해 생성될 수 있다.
용어 "마이크로입자"는 거핵구 또는 다른 세포로부터 쉐딩된 매우 작은 (<1 마이크로미터) 인지질 소포를 지칭한다. 마이크로입자는 유전 물질, 예컨대 RNA를 함유하고, 이들의 모 세포의 세포외 마커를 발현할 수 있다. 거핵구- 및 혈소판-유래 마이크로입자는 지혈 및 염증을 포함한 다중 경로에서 역할을 할 수 있다.
용어 "혈소판" (PLT)은 핵을 갖지 않지만 RNA를 함유하는, 1-3 마이크로미터의 직경을 갖는 세포를 지칭한다. 혈소판은 그의 세포 표면 상에 CD41, CD42b 및 CD61을 발현할 수 있다. 이는 내부에는 알파 및 치밀 과립을 함유하며, 이는 각각 P-셀렉틴 및 세로토닌과 같은 인자를 함유한다. 혈소판은 또한 개방 소관 시스템을 가지며, 이는 세포외 물질을 세포로 수송하고 과립으로부터 세포외 환경으로 물질을 방출하기 위한 경로인 채널을 지칭한다. 이들은 주로 혈액 응고에 참여함으로써 지혈 조절에서 기능하지만, 또한 염증에서 역할을 하는 것으로 제시된 바 있다.
용어 "프리혈소판"은 핵을 갖지 않지만 RNA를 갖는, 3-10 마이크로미터의 직경을 갖는 세포를 지칭한다. 프리혈소판은 다르게는 혈소판과 형태학적으로 및 초미세구조적으로 유사하며, 세포골격 재배열을 통해 분리되어 개별 혈소판을 형성하는 거핵구에 의해 생성된 중간 세포 단계를 구성한다.
용어 "프로혈소판"은 거핵구로부터의 또는 거핵구로부터 방금 방출된 세포질 연장을 지칭한다. 프로혈소판은 세포골격 재배열을 통해 분리되어, 개별 프리혈소판 및 혈소판을 형성한다.
용어 "만능성 줄기 세포"는 만능성 줄기 세포가 유래된 방법에 상관없이 신체의 모든 세 가지 배엽으로부터 세포를 형성하는 능력을 갖는, 배아 줄기 세포, 배아-유래 줄기 세포, 및 유도된 만능성 줄기 세포 및 다른 줄기 세포를 포함한다. 만능성 줄기 세포는 다음 특징 중 하나 이상을 가질 수 있는 줄기 세포로서 기능적으로 정의된다: (a) 면역결핍된 (SCID) 마우스에 이식될 때 기형종을 유도할 수 있는 특징; (b) 모든 세 가지 배엽의 세포 유형으로 분화할 수 있는 특징 (예를 들어, 외배엽, 중배엽, 및 내배엽 세포 유형으로 분화할 수 있음); 또는 (c) 배아 줄기 세포의 하나 이상의 마커를 발현하는 특징 (예를 들어, Oct 4, 알칼리성 포스파타제. SSEA-3 표면 항원, SSEA-4 표면 항원, SSEA-5 표면 항원, Nanog, TRA-1-60, TRA-1-81, SOX2, REX1 등을 발현함).
용어 "유도된 만능성 줄기 세포" (iPS 세포 또는 iPSC)는 리프로그래밍 인자의 조합을 발현함으로써 체세포를 리프로그래밍함으로써 생성된 만능성 줄기 세포의 유형을 지칭한다. iPSC는 태아, 출생 후, 신생아, 청소년, 또는 성인 체세포를 사용하여 생성될 수 있다. 체세포를 만능성 줄기 세포로 리프로그래밍하는데 사용될 수 있는 인자는 예를 들어, Oct 4 (때로는 Oct 3/4라고 지칭됨), Sox2, c-Myc, 및 Klf4의 조합을 포함한다. 다른 실시양태에서, 체세포를 만능성 줄기 세포로 리프로그래밍하는데 사용될 수 있는 인자는 예를 들어 Oct 4, Sox2, Nanog, 및 Lin28의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 2, 3 또는 4개의 리프로그래밍 인자가 체세포를 리프로그래밍하기 위해 체세포에서 발현된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "예방하다", "예방하는", "예방," "예방적 치료" 등은 장애 또는 상태를 갖지 않지만 장애 또는 상태를 발병할 위험이 있거나 또는 발병하기 쉬운 대상체에서 장애 또는 상태를 발병할 가능성을 저하시키는 것을 지칭한다.
"저하시키다"는 적어도 10%, 25%, 50%, 75% 또는 100%의 음의 변경을 의미한다.
"세포 사멸을 저하시키는 것"은 세포가 사멸될 경향 또는 가능성을 저하시키는 것을 의미한다. 세포 사멸은 아폽토시스성, 괴사성이거나, 또는 임의의 다른 수단에 의한 것일 수 있다.
"저하된 수준"은 샘플 중 분석물질의 양이 상응하는 대조군 샘플 중 분석물질의 양보다 적다는 것을 의미한다.
"참조"는 표준 또는 대조군 조건을 의미한다.
"특이적으로 결합한다"는 본 개시내용의 폴리펩티드를 자연적으로 포함하는 샘플, 예를 들어 생물학적 샘플에서 본 개시내용의 폴리펩티드를 인식하고 결합하지만 다른 분자를 실질적으로 인식하고 결합하지 않는 화합물 또는 항체를 의미한다.
용어 "대상체" 또는 "환자"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 동물을 지칭한다. 단지 예로서, 대상체는 인간 또는 비인간 포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 뮤린, 소, 말, 개, 양 또는 고양이를 포함하나 이에 제한되지는 않는 포유동물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "치료하다", "치료하는", "치료" 등은 장애 또는 이와 연관된 증상을 저하시키거나 또는 호전시키는 것을 지칭한다. 배제되지는 않지만, 장애 또는 상태를 치료하는 것은 장애, 상태 또는 이와 연관된 증상이 완전히 제거될 필요는 없음이 이해될 것이다.
"포함한다", "포함하는", "함유하는" 및 "갖는" 등은 미국 특허법에서 이들에 부여된 의미를 가질 수 있고, "수반한다", "수반하는" 등을 의미할 수 있으며; "본질적으로 이루어진" 또는 "본질적으로 이루어지다"는 마찬가지로 미국 특허법에서 부여된 의미를 갖고, 상기 용어는 개방형으로, 인용된 것의 기본적인 또는 신규 특징이 인용된 것보다 더 많은 것의 존재에 의해 변화되지 않는 한, 인용된 것보다 더 많은 것의 존재를 허용하지만, 종래기술 실시양태를 배제한다.
문맥에서 구체적으로 언급되거나 또는 명백하지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "또는"은 포괄적인 것으로 이해된다. 문맥에서 구체적으로 언급되거나 또는 명백하지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같은 단수형 용어는 단수 또는 복수인 것으로 이해된다.
문맥에서 구체적으로 언급되거나 명백하지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "약"은 관련 기술분야에서 정상적인 허용 범위 이내로, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 이내로 이해된다. 약은 언급된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 또는 0.01% 이내로 이해될 수 있다. 문맥에서 달리 분명하지 않는 한, 본원에 제공된 모든 수치는 용어 약에 의해 변형된다.
본원에서 변수의 임의의 정의에서 화학기의 목록의 언급은 임의의 단일 기 또는 열거된 기들의 조합으로서의 변수의 정의를 포함한다. 본원에서 변수 또는 측면에 대한 실시양태의 언급은 해당 실시양태를 임의의 단일 실시양태로서, 또는 임의의 다른 실시양태 또는 그의 부분과 조합하여 포함한다.
본원에 제공된 임의의 조성물 또는 방법은 본원에 제공된 임의의 다른 조성물 및 방법 중 하나 이상과 조합될 수 있다.
거핵구
인체에서, 거핵구는 골수에 주로 존재하지만 또한 초기 발달 동안 난황낭, 태아 간 및 비장에서 발견되는 CD34+ 조혈 줄기 세포로부터 유래된다. MK 분화 동안, MK 전구체는 핵내분열 기간을 거치며, 이에 의해 MK는 세포 분열 없이 다중 DNA 복제 주기를 통해 다배수체가 되어, DNA의 최대 128n 카피를 갖는 다중소엽화된 핵을 생성한다. MK는 크기가 증가함에 따라, MK는 또한 이들의 전사 및 단백질체 프로파일을 개량하고, α-과립 및 치밀-과립을 포함한 다수의 고도로 특화된 과립을 획득하고, MK 성숙 및 발달의 특징인 고도로 함입된 막 시스템을 발달시킨다.
혈소판을 생성하기 위해, MK는 골수에서 혈관에 인접한 곳으로 이동하며, 이를 통해 프로혈소판이라고 불리는 긴 구조를 순환으로 연장시킨다. 프로혈소판은 혈소판 생성을 위한 어셈블리 라인으로서 기능하며, 이들의 말단으로부터 다중 무핵 혈소판을 순차적으로 방출한다.
혈소판은 활동성 출혈 부위에서 혈병 형성을 주로 담당하지만, 또한 상처 치유, 혈관신생 및 선천 면역에서 유의한 역할을 한다는 것이 점점 명백해지고 있다. 줄기 세포-기반 치료 환경 중에서, 혈소판은 다음과 같은 이유로 이상적인 초기 진입자이다: 혈소판은 1) 이들의 짧은 재고 저장 수명으로 인해 임상적 수요가 높고; 2) 무핵이며, 임의의 오염성 유핵 세포를 사멸시키기 위해 안전하게 방사선조사되어, 이에 의해 기형종 발생을 저하시킬 수 있고; 3) 혈소판 수혈의 대다수 (>90%)에 대해 HLA 또는 혈액형 매칭을 요구하지 않으며, 이는 기성 요법을 위한 동종이계 인간 만능성 줄기 세포 (hPSC)의 대규모 제조를 용이하게 할 것이고; 4) 수명이 짧고 잘 특징화되며, 이는 계획된 임상 시험을 간소화할 것이고; 5) 쉽게 이식되고; 6) 현재 공여자-기반 혈소판 수혈은 본질적으로 박테리아 및 바이러스 오염에 취약하기 때문에 멸균 제조로부터 큰 이익을 얻을 것이다.
현재 혈소판 수요가 ~20%만큼 공급을 초과하고, 혈소판-기반 절차가 더 많이 필요한 성장하는 노령화 집단, 혈소판 카운트를 저하시키는 새로운 약물치료, 및 치유 시간을 개선시키기 위한 혈소판 수혈의 기존 사용의 확장으로 인해, 충족되지 않은 수요는 2022년까지 2배 초과로 증가할 것으로 예상된다. 미국에서 혈액 시장은 과점으로서 효과적으로 운영되며, 미국 적십자사 및 미국의 혈액 센터가 각각 시장의 절반 가까이를 통제하며, HemeXcel은 제3 주요 혈액 제공기관으로서 운영된다.
preMK 및 MK 및 이들의 성장 인자에 대한 수많은 다른 잠재적인 시장이 있다. 예를 들어, preMK, MK 및 이들의 용해물은 세포 배양, 조직 재생, 상처 치유, 약물 전달을 위해 및 피부 회춘을 위한 화장품 산업에서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 거핵구는 많은 성장 인자를 함유하기 때문에, 치료 조성물의 공급원일 수 있고/거나 많은 치료 목적을 위해 사용될 수 있다. 본 개시내용은 인간 iPSC-유래 인간 거핵구 및 그의 산물을 제조하기 위해 규모가변성, 현행 우수 의약품 제조 관리기준 (cGMP)-준수 상업적 플랫폼을 확립함으로써 이들 요구를 해결한다.
신체 외부에서, MK는 다양한 주요 줄기 세포 공급원, 예를 들어 만능성 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 또는 다른 줄기 세포 유형으로부터 합리적으로 유래될 수 있다.
일부 실시양태에서, MK는 배아 줄기 세포 (ESC) (예를 들어, 인간 배아 줄기 세포) 및 유도된 만능성 줄기 세포 (iPSC) (예를 들어, 인간 유도된 만능성 줄기 세포)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 만능성 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. ESC는 배반포라고 불리는 초기-단계 착상전 배아의 내부 세포괴로부터 유래된 만능성 줄기 세포이다. iPSC는 특정 전사 인자의 시한의 발현을 유도함으로써 성인 세포로부터 생성될 수 있는 만능성 줄기 세포의 유형이다. iPSC는 무기한으로 배양에서 확장되고 유지될 수 있으며 MK를 생산하도록 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, MK는 CD34+ 제대혈 줄기 세포 (UCB 세포) (예를 들어, 인간 CD34+ 제대혈 줄기 세포), CD34+ 동원 말초 혈액 세포 (MPB 세포) (예를 들어, CD34+ 인간 동원 말초 혈액), 또는 CD34+ 골수 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 조혈 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. UCB 세포는 출산 후 태반 및 부착된 제대에 남아있는 혈액으로부터 유래된 다능성 줄기 세포이다. MPB 세포는 줄기 세포가 G-CSF 또는 유사한 작용제의 투여에 의해 혈류로 동원된 자원자로부터 유래된 다능성 줄기 세포이다.
일부 실시양태에서, MK는 중간엽 줄기 세포 (MSC) (예컨대, 지방-유래 중간엽 줄기 세포 (AdMSC)) 또는 다른 공급원으로부터의 중간엽 줄기를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 줄기 세포 유형으로부터 유래될 수 있다.
AdMSC는 배아 발달 동안 중배엽으로부터 유래된 백색 지방 조직으로부터 유래되며, 신체 전반에 걸쳐 위치된 모든 포유동물 종에 존재한다. 중배엽-포함 골, 연골, 근육, 및 지방-ASC의 다른 조직 유형으로 분화하는 이들의 광범위한 이용가능성 및 능력으로 인해, 광범위한 적용에 작용할 수 있다.
본 개시내용에서, 줄기 세포 배양물은 이종 병원체로 잠재적으로 오염될 수 있고 인간에서 면역원성 반응에 대한 위험을 증가시킬 수 있는 배아 섬유모세포 피더 세포 및/또는 동물 혈청과 독립적으로 유지된다. 그러므로, 무혈청, 피더-세포 무함유 대안은 안전하고 동물 산물-무함유 조건 및 산물을 보장하기 위해 본 방법에 따라 유래된 preMK 및 MK에 동물 산물이 도입되는 것을 회피하기 위해 본 방법에 사용된다.
생성 방법
도 1은 하나 이상의 만능성 줄기 세포로부터 거핵구 선조세포 (preMK), 거핵구 (MK) 및 혈소판 (PLT)의 규모가변성 분화에 대한 전체 개략도를 제시한다. 그러나, 본 프로세스는 만능성 줄기 세포와 관련하여 기재되지만, 다양한 실시양태에서, 만능성 줄기 세포는 다른 유형의 줄기 세포로 치환되거나 보충될 수 있다는 것을 주목해야 한다.
단계 0: 인간 유도된 만능성 줄기 세포의 확장 및 분화를 위한 준비
매트릭스-의존적 확장 배양
매트릭스-의존적 확장 배양의 경우, 임상 등급 만능성 줄기 세포 (PSC)는 만능성 줄기 세포 배양 배지에서 지지 매트릭스 상에서 피더 세포 없이 배양함으로써 콜로니로서 확장될 수 있다. 지지 매트릭스는 2차원 표면 또는 3차원 구조일 수 있다. 일부 실시양태에서, 임상 등급 인간 유도된 만능성 줄기 세포는 인간 유도된 만능성 줄기 세포 (iPSC), 예컨대 PBG1, PBG2 또는 PBG3일 수 있지만, 다른 유형의 만능성 줄기 세포, 예컨대 배아 줄기 세포, 또는 다른 줄기 세포가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 지지 매트릭스는 비제한적인 예로서, 재조합 비트로넥틴, 재조합 라미닌, 매트리겔(Matrigel) 또는 상기의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 만능성 줄기 세포 배양 배지는 예를 들어, 에센셜(Essential) 8 배지 (써모피셔(ThermoFisher)), 스템플렉스 배지 (써모피셔), 뉴트리스템 배지 (바이올로지칼 인더스트리즈(Biological Industries)), 또는 관련 기술분야에 공지된 만능성 세포의 유지 및 성장을 지지할 수 있는 다른 배지일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 세포는 전면생장에 도달하도록 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 30% 내지 90% 전면생장에 도달하도록 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 최대 60%, 최대 65%, 최대 70%, 최대 75% 전면생장에 도달하도록 배양된다. 예를 들어, 세포는 약 70% 전면생장에 도달하도록 배양된다. 미리 결정된 최대 백분율 전면생장에 도달하면, 세포를 수확한다. 일부 실시양태에서, 세포는 0.1 mM 내지 5 mM EDTA 또는 유사한 킬레이트제 또는 시약을 사용하여 해리에 의해 클럼프로서 수확될 수 있다. 예를 들어, 세포는 약 0.5 mM EDTA를 사용하여 수확될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 단일 세포로서, 예를 들어, 단백질가수분해 효소, 콜라겐분해 효소, 또는 이들의 조합을 사용한 해리에 의해 수확될 수 있다. 예를 들어, 세포는 예를 들어, 재조합 트립신, 예컨대 TrypLE™, 또는 아큐타제(Accutase)™를 사용한 해리에 의해 단일 세포로서 수확될 수 있다. PSC의 유지/확장을 위해, 수확된 세포는 만능성 줄기 세포 배양 배지에서 재현탁될 수 있다.
매트릭스-독립적 3D 확장 배양
매트릭스-독립적 3D 확장 배양의 경우, 임상 등급 PSC는 자기-응집 스페로이드로서 확장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는 단일 세포를 ml당 약 0.1 내지 약 1.5 백만의 밀도로 시딩함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 단일 세포는 ml당 0.5 백만의 밀도로 시딩될 수 있다.
만능성 줄기 세포 배양 배지에서 저점착성 또는 비점착성 조건에서 천천히 교반 또는 온화한 진탕에 의해 세포를 연속 운동시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 피더-무함유, 무혈청 배지가 사용될 수 있다. 만능성 줄기 세포 배양 배지는 예를 들어, 에센셜 8 배지 (써모피셔), 스템플렉스 배지 (써모피셔), 뉴트리스템 배지 (바이올로지칼 인더스트리즈), 또는 관련 기술분야에 공지된 만능성 세포의 유지 및 성장을 지지할 수 있는 다른 유사한 배지일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, PSC 스페로이드는 약 3 내지 약 10 백만 세포/ml의 전체 세포 밀도에 도달할 때까지 및/또는 대략 5-7일 동안 약 150 내지 약 350 μm의 중위수 스페로이드 크기를 달성할 때까지 배양된다. 일부 실시양태에서, PSC 스페로이드는 5 백만 세포/ml의 전체 세포 밀도에 도달할 때까지 배양된다. 일부 실시양태에서, PSC 스페로이드는 세포가 약 250 μm의 중위수 스페로이드 크기를 달성할 때까지 배양된다. 배양 단계는 4, 5, 6, 7 또는 8일 동안 지속될 수 있다. 적용가능한 경우, PSC는 단백질가수분해 효소, 콜라겐분해 효소, 또는 이들의 조합을 사용한 해리에 의해 단일 세포로서 수확될 수 있다. 예를 들어, 세포는 트립신, 재조합 트립신, 예컨대 TrypLE™, 아큐타제™, 또는 관련 기술분야에 공지된 유사한 시약(이에 제한되지는 않음)을 사용한 해리에 의해 단일 세포로서 수확될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 세포는 또 다른 3D 확장 배양 및/또는 지시된 분화 배양을 개시하는데 사용된다.
분화를 위한 준비
일부 실시양태에서, 분화를 위한 준비를 위해, PSC 응집체는 매트릭스-의존적 2D 배양물로부터 PSC 콜로니의 부분적 해리에 의해, 매트릭스-독립적 3D 배양물로부터 PSC 스페로이드의 부분적 해리에 의해, 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생성된 단일 PSC의 자기-응집에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 분화의 개시 전에, 이들 응집체는 만능성 줄기 세포 배양 배지, 예를 들어 에센셜 8 배지 (써모피셔), 스템플렉스 배지 (써모피셔) 또는 뉴트리스템 배지 (바이올로지칼 인더스트리즈) (이에 제한되지는 않음)에 재현탁되고 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 배지는 ROCK 억제제, 예를 들어, Y27632, H1152 또는 이들의 조합 (이에 제한되지는 않음)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 분화의 개시 전에 0 내지 72시간 동안 37℃, 5% CO2, 20% O2에서 배양될 수 있다.
매트릭스-의존적 배양의 경우, 응집체는 표면에 부착하도록 허용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 부착 단계는 약 24시간 동안 진행되도록 허용될 수 있지만, 1시간 내지 24시간 또는 그 초과의 임의의 시간이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면은 콜라겐, 라미닌 또는 임의의 다른 세포외 매트릭스 단백질로 미리 코팅될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 콜라겐 IV는 표면을 코팅하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 매트릭스-코팅된 표면은 2D (예를 들어, 플라스틱 디쉬 또는 플라스크의 하단)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 매트릭스-코팅된 표면은 3D (예를 들어, 평활한 또는 텍스쳐 구형 마이크로캐리어, 매크로캐리어, 예컨대, 라시히 링)일 수 있다. 그 후, 3D 매트릭스 코팅된 표면 상의 세포는 연속 운동과 함께 또는 연속 운동 없이 배양될 수 있다. 예를 들어, 세포는 초저점착성 정적 조건 하에, 롤러 병, 스피너 플라스크, 교반 탱크 생물반응기, 수직 휠 생물반응기, 충전층 생물반응기 또는 유동층 시스템에서 배양될 수 있다.
매트릭스-독립적 배양의 경우, 저점착성 용기에서 천천히 교반 또는 온화한 진탕에 의해 응집체를 연속 운동시킬 수 있다. 세포는 0 내지 72시간 후, 예를 들어 약 24시간 후 분화의 단계 I로 전이될 수 있다.
단계 I. 조혈성 내피 세포의 생성
단계 I에서, 제조된 PSC는 조혈성 내피 세포로 분화될 수 있다. 간략하게, 만능성 줄기 세포 배양 배지는 제거되고 단계 I 분화 배지로 대체된다. 일부 실시양태에서, 단계 I 분화 배지는, 예를 들어, 골 형태형성 단백질 4 (BMP4), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF) 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 포함한 하나 이상의 성장 인자가 보충된, 기본 배지로서 스템스팬(StemSpan)™-ACF (스템셀 테크놀로지스(STEMCELL Technologies), Cat. No. 09855)를 포함하는 동물-구성성분 무함유 배지 (ACF)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 기본 배지는 1 내지 200 ng/ml의 하나 이상의 각각의 BMP4 (예를 들어, 50 ng/ml에서), bFGF (예를 들어, 50 ng/ml에서) 및 VEGF (예를 들어, 50 ng/ml에서)로 보충된다. 세포는 2 내지 6일 동안 저산소 조건 (예를 들어, 37℃, 5% CO2, 5% O2)에서, 이어서 2 내지 6일 동안 정상산소 (37℃, 5% CO2, 20% O2)에서 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시양태에서, WNT 조정인자, 예를 들어 WNT 효능제 또는 길항제는 분화의 초기 기간 동안 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, GSK3 억제제는 분화의 초기 기간 동안 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, GSK3 억제제 또는 WNT 효능제, 예를 들어 CHIR9998014, CHIR99021 또는 이들의 조합은 분화의 초기 기간 동안, 예컨대 1 내지 2일 동안 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, WNT 조정인자는 단계 I의 적어도 일부 동안 하나 이상의 성장 인자를 대체할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, WNT 조정인자가 존재하는 동안, BMP4는 처음 48시간 동안 첨가될 수 있고, 단계 I의 나머지 동안 불필요할 수 있다. 일부 실시양태에서, VEGF 및 bFGF는 WNT 조정인자가 존재하는 동안 처음 48시간 동안 불필요할 수 있다. 일부 실시양태에서, 매일 전체 배지 교환은 소비된 배지를 제거하고 신선한 단계 I 배지로 대체하여 단계 I 전반에 걸쳐 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 부분적 배지 교환은 소비된 배지의 10-95%를 제거하고 동등한 부피의 신선한 단계 I 배지로 대체하여 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 배양물의 총 부피를 증가시키는 순 효과로 추가 부피의 신선한 배지가 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정 배지 구성성분이 신선한 단계 I 배지의 대체 또는 첨가 대신에 배양물로 스파이크된다.
2D 매트릭스-의존적 배양에서, 제2일까지, 콜로니의 형태학은 산재한 신장된 세포 클러스터로 변화된다 (도 15). 제5-6일까지, 점착성 세포 층 내에서 일부 3차원 구조를 갖는 조혈성 내피 세포의 전면생장 점착성 층이 관찰된다 (도 15). 매트릭스-독립적 3D 배양에서, 스페로이드는 단계 I이 진행됨에 따라 더 크고 더 어둡고 덜 균일하게 성장한다 (도 33A). 단계 I 분화의 개시 후 대략 6일에, 조혈성 내피로의 분화가 완료된다. 일부 실시양태에서, 점착성 세포 층 내에서 일부 3차원 구조를 갖는 조혈성 내피 세포의 전면생장 점착성 층이 관찰될 때 분화가 완전한 것으로 간주될 수 있다 (도 4). 성공적인 단계 I 분화를 확인하기 위해, 단백질가수분해 효소, 콜라겐분해 효소, 또는 이들의 조합, 예컨대 아큐타제® (스템셀 테크놀로지스, Cat. No. 07920), TrypLE 셀렉트(Select)™ (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), Cat. No. 12563029), 또는 관련 기술분야에 공지된 유사한 시약을 사용하여 세포의 일부를 단일 세포로서 수확할 수 있으며, 이어서 조혈성 내피-특이적 마커 CD31 및 CD34에 대한 유동 세포계측법 분석을 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조혈성 내피 세포는 또한 CD309 및 CD144 또는 CD309, CD144, CD140a 및 CD235a를 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단계 I은 교반 탱크 생물반응기에서 수행되어 자기-응집 스페로이드를 형성할 수 있다.
단계 II. 조혈성 내피 세포로부터 박리된 거핵구 선조세포 (preMK)의 생성
일부 실시양태에서, 거핵구 선조세포 (단계 II) 분화의 개시는 단계 I의 4 내지 8일 후 수행될 수 있다. 간략하게, 단계 I 배지는 제거되고, 동등한 부피의 단계 II 배지, 예를 들어 스템diff(STEMdiff)™ APEL™2 기본 배지 (스템셀 테크놀로지스, Cat. No. 05275)로 대체된다. 이러한 단계 II 배지는 1 및 200 ng/ml의 하나 이상의 각각의 줄기 세포 인자 (SCF) (예를 들어, 25 ng/ml에서), 트롬보포이에틴 (TPO) (예를 들어, 25 ng/ml에서), Fms-관련 티로신 키나제 3 리간드 (Flt3-L) (예를 들어, 25 ng/ml에서), 인터류킨-3 (IL-3) (예를 들어, 10 ng/ml에서), 인터류킨-6 (IL-6) (예를 들어, 10 ng/ml에서), 및 헤파린 (예를 들어, 5 단위/ml에서)으로 보충될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단계 II 배지는 UM171, UM729, SR-1, SU6656 또는 임의의 이들의 조합으로 추가로 보충될 수 있다.
그 후, 세포를 적어도 7일 및 최대 12일 또는 그 초과 동안 37℃, 5% CO2, 20% O2에서 인큐베이션한다. 예를 들어, 세포를 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17일 동안 인큐베이션할 수 있다. 일부 실시양태에서, 매일 부분적 배지 교환은 소비된 배지의 10-95%를 제거하고 동등한 부피의 신선한 단계 II 배지로 대체하여 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 배양물의 총 부피를 증가시키는 순 효과로 추가 부피의 신선한 배지가 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정 배지 구성성분이 신선한 단계 I 배지의 대체 또는 첨가 대신에 배양물로 스파이크될 수 있다.
단계 II의 개시 후 2-3일 이내에, 작고 둥근 굴절 세포가 점착성 조혈성 내피 세포 내에서 나타나고, 결국 상등액으로 방출된다 (도 17A). CD43 및 CD41의 세포 표면 발현 및 CD14의 발현 결여에 의해 정의된 바와 같은 이들 방출된 세포는 preMK를 함유할 수 있다. 2D 배양에서, 점착성 세포 층의 상단 상에 나타나는 부유하고 약하게 부착된 단계 II 세포는 배지를 온화하게 헹구고 수집함으로써 코니칼 튜브로 매일 수확될 수 있다. 절반-배지 변화는 헹군 점착성 세포 층의 상단 상에 신선한 단계 II 배지의 원래 부피의 절반을 첨가함으로써 개시될 수 있다. 배지 중 수집된 세포의 분취액은 유동 세포계측법에 의한 생존가능한 세포 열거 및 바이오마커 분석을 위해 제거될 수 있다. 그 후, 세포의 나머지는 200xg에서 5분 동안 원심분리될 수 있다. 원심분리 후, 배지 변화는 상등액의 원래 부피의 절반을 점착성 세포 층으로 다시 첨가함으로써 완료될 수 있다. 매트릭스-독립적 3D 배양에서, 방출된 세포는 스페로이드가 용기의 하단에 침강하도록 허용하기 위해 진탕을 일시정지하고, 이어서 현탁 세포와 함께 배지의 최대 90%를 원심분리를 위한 튜브 (예를 들어, 코니칼 튜브)에 수집함으로써 수확될 수 있다. 그 후, 신선한 배지의 원래 부피의 절반을 용기에 첨가하고, 원심분리된 세포의 상등액으로부터 컨디셔닝된 배지로 채울 수 있다. 일부 실시양태에서, 배양물의 총 부피를 증가시키는 순 효과로 추가 부피의 신선한 배지가 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정 배지 구성성분이 신선한 단계 II 배지의 대체 또는 첨가 대신에 배양물로 스파이크될 수 있다. 상등액의 나머지를 버리고, preMK-함유 세포 펠렛은 크리오스터(Cryostor) 10 동결보존 배지에 -180℃에서 저장하거나, 단계 III으로 직접 전이될 수 있다. 단계 II 동안 수집된 거핵구 선조세포는 CD43 및 CD41을 발현하고 CD14의 발현은 결여된 작고 둥근 굴절 세포이다.
단계 III. 거핵구 선조세포로부터 성숙 거핵구 (MK)의 생성
일부 실시양태에서, 성숙 거핵구의 분화는 상기 기재된 바와 같이 생성된 PSC-유래 preMK를 사용하여 개시될 수 있다. 신선한 또는 해동된 거핵구 선조세포는 예를 들어, 스템스팬™-ACF를 포함하는 단계 III 배지에서 비점착성 표면으로 시딩될 수 있다. 비점착성 표면은 대부분의 세포가 이러한 표면에 접착하거나 들러붙도록 의도되지 않지만 대신에 현탁액에 주로 남아있게 하는 표면을 지칭한다. 예를 들어, 이러한 표면은 "초저점착 플라스틱"으로 제조될 수 있거나, 표면에 대한 세포의 점착을 방지하거나 최소화하기 위해 세포외 매트릭스 단백질로 코팅되지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 단계 III 배지는 0 및 200 ng/ml의 하나 이상의 각각의 TPO (예를 들어, 25 ng/ml에서), SCF (예를 들어, 25 ng/ml에서), IL-6 (예를 들어, 10 ng/ml에서), IL-9 (예를 들어, 10 ng/ml에서), 및 헤파린 (예를 들어, 5 단위/ml에서)으로 보충될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단계 III 배지는 또한 UM171, UM729, SR-1, SU6656, 또는 임의의 이들의 조합으로 보충될 수 있다.
그 후, 세포는 37℃ 내지 40℃ (예를 들어, 39℃), 5 내지 20% CO2 (예를 들어, 7% -10%), 및 5 내지 20% O2에서 최대 5일 동안 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시양태에서, 부분적 매일 배지 교환은 소비된 배지의 10-95%를 제거하고 동등한 부피의 신선한 단계 III 배지로 대체하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 비점착성 표면은 6-웰 초저점착성 플레이트이다. 일부 실시양태에서, 비점착성 표면은 기체 투과성 막 (예컨대, G-Rex ®)이다. 일부 실시양태에서, 비점착성 표면은 온화하게 진탕되는 세포 배양 백 또는 용기이다.
일부 실시양태에서, 단계 III 동안, 거핵구 선조세포는 수일 내에 성숙 MK로 분화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 초기에 균일하게 작고 둥글고 굴절성이 있는 세포 (도 21)는 제2-4일에 크기 및 배수성이 증가하기 시작한다 (도 20). 동시에, 프로혈소판-생성 MK가 쉽게 관찰될 수 있다 (도 20). 단계 III의 3-4일까지, 성숙 MK 마커 CD42a 및 CD42b를 공동-발현하는 CD61+ (거핵구 계통) 세포의 비율이 급격하게 증가하고, 출발 hiSPC 세포주에 따라 80-90%의 높은 수준에 도달할 수 있다 (도 21). 단계 III의 제4-5일까지, 혈소판은 성숙 MK에 의해 배양 배지로 방출된다. 이들 혈소판은 유동 세포계측법 및 전자 현미경법에 의해 수집, 정량화 및 평가되어, 진정한 혈소판과의 이들의 동일성을 확인할 수 있다 (도 45).
3D 시스템
충전층 생물반응기
일부 실시양태에서, 3D 규모가변성 충전층 생물반응기는 하나 이상의 preMK, 거핵구, 혈소판, 또는 거핵구 및 혈소판의 생성을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 충전층 생물반응기는 단계 I 및 단계 II 배양을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 충전층 반응기는 PSC를 조혈성 내피 세포로 분화시킨 후 preMK를 생성하는데 사용될 수 있다. 충전층 반응기 담체는 마이크로-크기 또는 매크로-크기일 수 있고, 생체적합성 플라스틱, 금속, 유리, 또는 천연 물질, 예컨대 알기네이트로부터 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 담체는 라시히 링, 예를 들어 1 mm 라시히 링의 형상으로 PTFE로부터 형성된다. 일부 실시양태에서, 담체는 상기 기재된 바와 같이 매트릭스로 코팅될 수 있다. 일부 실시양태에서, 담체는 라미닌, 예컨대 재조합 인간 단백질 라미닌 521로 코팅될 수 있다. 일부 실시양태에서, 만능성 세포는 클럼프로서 담체로 시딩될 수 있다. 일부 실시양태에서, 배지는 매일 배지 교환으로 제거되고 단계 I 배지로 대체될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단계 I 동안, 만능성 세포는 충전층 반응기에서 담체 내부에 성장 구역을 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 조혈성 내피로의 만능성 세포의 초기 분화 (즉, 지시된 분화의 단계 I), 뿐만 아니라 preMK의 추가 분화 및 방출 (즉, 지시된 분화의 단계 II)은 동일한 용기에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 충전층 생물반응기는 만능성 세포, 예를 들어 PBG-1 iPSC로 시딩된 라미닌-521 코팅된 매크로캐리어를 포함할 수 있다. 그 후, 충전층은 조혈성 내피로의 단계 I 분화를 가능하게 하기 위해 연속적인 배지 흐름에 노출될 수 있다. 충전층을 통한 삼출 후, 배지는 컨디셔닝 챔버를 통해 순환될 수 있으며, 여기서 신선한 배지 구성성분이 첨가될 수 있고, 산소/CO2 농도는 배지가 세포로 재순환될 수 있기 전에 살포 또는 다른 수단을 통해 조정될 수 있다.
단계 I의 완료 시, 배지는 단계 II 분화 및 preMK의 생성 및 방출을 허용하도록 스위칭될 수 있다. 적절한 크기 및 형상의 담체, 예컨대 1 mm 라시히 링은 방출된 세포가 수집 및 냉동보존을 위해 충전층을 통해 반응기 밖으로 삼출하는 것을 가능하게 하기에 충분한 배지 유동 및 채널 폭을 가능하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이 설계는 세포에 의해 경험되는 전단력을 감소시킬 수 있고, 그의 관류 기반 설계로 인해 효율적인 배지 사용을 허용할 수 있고, 방출되는 preMK의 연속적인 수집을 가능하게 할 수 있다.
교반 탱크 생물반응기에서 자기-응집 스페로이드
일부 실시양태에서, 특정 프로세스 단계는 규모가변성 3D 솔루션을 사용하여 수행될 수 있으며, 이는 교반된 또는 진탕된 용기에서 현탁된 자기-응집 스페로이드를 사용하여 분화를 수행하는 것을 수반할 수 있다 (도 32). 일부 실시양태에서, 이러한 용기는 저점착성 표면 또는 비점착성 표면, 즉, 표면 상에 특이적 및 비특이적 세포 고정화를 억제하여 세포를 현탁 상태로 강제하기 위해 친수성 또는 중성으로 대전된 코팅으로 코팅된 표면을 포함할 수 있다. 만능성 세포는 단일 세포로 해리되고 만능성 유지 배지에 재현탁될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유지 배지는 Rock 억제제, 예컨대, H1152 또는 다른 ROCK 억제제로 보충될 수 있다. 그 후, 만능성 세포는 저점착성 또는 비점착성 용기에서 인큐베이션될 수 있고, 표준 배양 조건 (예를 들어, 37℃, 5% CO2, 20% O2)에서 진탕될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진탕을 제공하기 위해, 인큐베이션 용기는 궤도형 진탕기, 또는 일정하게 진탕되는 진탕기 플라스크 또는 스피너 플라스크 상에 배치될 수 있거나, 제어된 교반 탱크 생물반응기가 사용될 수 있다. 24시간 이내에, 만능성 세포는 자기-응집하여 대략 50-150 um 직경의 스페로이드를 형성할 수 있다. 진탕이 일시정지됨에 따라, 스페로이드는 용기의 하단으로 침강할 수 있다.
그 후, 배지는 조혈성 내피를 향한 분화를 촉진하기 위해 단계 I 분화 배지로 교환될 수 있고, 진탕은 저산소 조건 (예를 들어, 37℃, 5% CO2, 5% O2)에서 인큐베이션으로 재개될 수 있다. 배지 교환은 정기적으로 (예를 들어, 매일) 수행될 수 있으며, 이 시간 동안 스페로이드가 더 크게 성장하고 특징적인 구조 및 형상을 발달할 수 있다. 예를 들어, 도 33A에 제시된 바와 같이, 스페로이드는 총 6일 (37℃, 5% CO2, 5% O2에서 4일, 이어서 37℃, 5% CO2, 20% O2에서 2일) 동안 배양될 수 있다. 도 33A에 제시된 바와 같이, 제6일에, 스페로이드는 더 크고 더 어둡고, 불규칙한 표면을 갖는다.
단계 II로의 전이를 위해, 진탕은 일시정지될 수 있고, 스페로이드는 용기의 하단으로 침강하도록 허용될 수 있다. 그 후, 배지는 현탁 세포의 분화 및 방출을 용이하게 하기 위해 단계 II 분화 배지로 교환될 수 있다. 그 후 정기적으로 (예를 들어, 매일), 현탁 세포가 수집될 수 있고, 부분적 배지 교환이 수행될 수 있다. 배지가 수집되고 원심분리될 수 있다. 신선한 단계 II 분화 배지의 작업 부피의 대략 절반이 원래 작업 부피를 회복시키기 위해 충분한 부피의 컨디셔닝된 배지 (즉, 원심분리 후 상등액)와 함께 스페로이드에 첨가될 수 있다. 세포 펠렛은 동결보존되거나, 성숙 MK로의 성숙을 위해 단계 III으로 이동될 수 있다.
정적 단계 III 배양으로의 전이 시, 3D 자기-응집 스페로이드 배양물로부터의 preMK는 2D 배양 시스템으로부터 preMK로서 유사한 MK 순도를 생성할 수 있다. 또한, 3D 자기-응집 스페로이드 배양물로부터 생성된 단계 III 분화 배양물은 크기가 급격하게 증가하고 진정한 거핵구와의 이들의 동일성과 일치하는 프로혈소판을 생성할 수 있는 세포를 함유할 수 있다.
단계 III을 위한 규모가변성 시스템으로의 전이
일부 실시양태에서, 상기 언급된 바와 같이, 신선한 또는 해동된 거핵구 preMK는 단계 III 배지에서 저점착성 또는 비점착성 표면으로 시딩될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 비점착성 표면은 기체 투과성 막 (예컨대, G-Rex ®)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 저점착성 또는 비점착성 표면은 온화하게 진탕되는 세포 배양 백 또는 용기이다. 어느 경우에서든, preMK (단계 II 배양물로부터 신선하게 수확되거나, 동결보존된 스톡으로부터 해동됨)는 ml당 0.5-10 백만의 밀도로 단계 III 배지에 현탁되고, 용기에 도입된다. 예를 들어, preMK는 ml당 1 내지 1.5 백만, ml당 1 내지 2 백만, ml당 1 내지 3 백만, 1 내지 4 백만, ml당 2 내지 5 백만, ml당 2 내지 6 백만, ml당 3 내지 7 백만, ml당 3 내지 8 백만, ml당 5 내지 9 백만, 또는 ml당 8 내지 10 백만의 밀도일 수 있다. 세포는 성숙 MK로의 분화를 가능하게 하기 위해 총 1-5일 (예를 들어, 3일) 동안 배양된다. 일부 실시양태에서, 매일 절반 배지 교환은 소비된 배지의 10-95%를 제거하고 동등한 부피의 신선한 단계 III 배지로 대체하여 수행된다. 단계 III 배양의 말미에서, 생성된 세포는 크기 및 배수성이 증가되고, 성숙 거핵구를 표시하는 숙주의 특색을 나타낸다 (예를 들어, 도 34 내지 42에 제시되고 하기 기재된 바와 같이).
거핵구 및 그의 산물
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 PSC 세포 또는 세포주로부터 시험관내 유래된 거핵구 선조세포, 거핵구, 프리혈소판, 프로혈소판 또는 혈소판을 제공한다. 본 개시내용의 측면에 따라, PSC 세포 또는 세포주로부터 유래된 거핵구 선조세포, 거핵구, 프리혈소판, 프로혈소판 또는 혈소판은 미국 특허 번호 9,763,984의 방법 또는 국제 출원 번호 PCT/US2018/021354에 개시된 바와 같은 생물반응기를 사용하여 생성되며, 이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 거핵구 또는 거핵구 선조세포를 포함하는 단리된 세포 집단을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 거핵구 또는 거핵구를 함유하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서, 거핵구, 거핵구 선조세포 또는 그의 산물을 포함하는 조성물이 개시되어 있다.
본 개시내용의 일부 실시양태에 따라, 거핵구, 거핵구 선조세포 또는 그의 산물은 형상, 크기 및/또는 표현형이 균질하다. 본 개시내용의 거핵구, 거핵구 선조세포 또는 그의 산물은 상응하는 인간 세포에서의 변동성과 특징적으로 상이한 바이오마커 발현, 크기, 배수성, 개수 및 순도의 변동성을 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 일부 실시양태에서, 이러한 변동성은 유의하게 더 낮을 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 집단은 원하는 변동성을 갖도록 생성될 수 있으며, 이는 자연-발생 세포의 것보다 더 낮거나 더 높을 수 있다.
일부 실시양태에서, 거핵구 선조세포 (preMK)는 마커 CD43 및 CD41의 발현 및 CD14의 결여 (즉, CD14-, CD41+, CD43+)을 특징으로 한다. CD42b의 추가 발현은 거핵구 선조세포가 성숙 거핵구를 향한 최종 성숙 프로세스에 있음을 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, 분화 배양에서 생성된 거핵구 선조세포는 비점착성이고, 배양 배지에서 자유롭게 부유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 거핵구는 CD42a+, CD42b+, CD41+, CD61+, GPVI+ 및 DNA+ 중 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, 본 거핵구는 CD42a+, CD42b+, CD41+, CD61+ 및 DNA+ 중 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, 본 거핵구는 CD42b+, CD61+ 및 DNA+ 중 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, 본 거핵구는 CD42a+, CD61+ 및 DNA+ 중 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, 본 거핵구는 CD42a+, CD41+ 및 DNA+ 중 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, 본 거핵구는 CD42b+, CD41+, CD61+ 및 DNA+ 중 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, 본 거핵구는 CD42b+, CD42a+, CD61+ 및 DNA+ 중 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, 본 거핵구는 CD42b+, CD42a+, CD41+ 및 DNA+ 중 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, 거핵구는 CD41+CD61+CD42b+GPVI+이다. 일부 실시양태에서, 거핵구는 CD41+CD61+CD42a+GPVI+이다.
일부 실시양태에서, 본 거핵구는 CD61+ 및 DNA+이고, 약 10-50 μm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 거핵구는 10 내지 20 μm, 11 내지 19 μm, 12 내지 18 μm, 13 내지 17 μm, 14 내지 16 μm, 14 내지 15 μm의 평균 크기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 거핵구는 14.5 μm의 평균 크기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 거핵구는 약 10-20 μm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 거핵구는 약 10-30 μm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 거핵구는 약 10-40 μm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 거핵구는 약 10-50 μm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 거핵구는 약 20-40 μm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 거핵구는 약 25-40 μm의 직경을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 본 거핵구는 2N-16N의 배수성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 거핵구는 적어도 4N, 8N, 또는 16N의 배수성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 거핵구는 4N-16N의 배수성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 본 거핵구는 4N 초과의 DNA를 갖는, 72시간의 단계 III 배양에서 CD61+ 세포의 16% +/-11.4%이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 거핵구 집단의 적어도 50%는 CD61+ 및 DNA+이고, 2N 내지 16N의 배수성을 갖는다. 예를 들어, 대표적인 PBG1 분화 배양물로부터의 거핵구 (즉, 베타-1-튜불린 양성 단계 III 세포)는 크기가 약 9 μm 내지 약 27 μm 범위이며, 중위수가 15 μm이다. 이 평균 크기는 다양한 골수 공급원으로부터의 '정상적인' 거핵구와 유사하게 비교된다 (도 41).
일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 50%의 CD42b+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 55%의 CD42b+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 65%의 CD42b+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 60%의 CD42b+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 70%의 CD42b+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 75%의 CD42b+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 80%의 CD42b+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 85%의 CD42b+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 90%의 CD42b+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 95%의 CD42b+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 98%의 CD42b+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다.
일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 50%의 CD42b+ CD41+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 55%의 CD42b+ CD41+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 65%의 CD42b+ CD41+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 60%의 CD42b+ CD41+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 70%의 CD42b+ CD41+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 75%의 CD42b+ CD41+ CD61+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 80%의 CD42b+ CD41+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 85%의 CD42b+ CD41+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 90%의 CD42b+ CD41+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 95%의 CD42b+ CD41+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 98%의 CD42b+ CD41+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다.
일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 50%의 CD42b+ CD42a+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 55%의 CD42b+ CD42a+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 65%의 CD42b+ CD42a+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 60%의 CD42b+ CD42a+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 70%의 CD42b+ CD42a+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 75%의 CD42b+ CD42a+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 80%의 CD42b+ CD42a+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 85%의 CD42b+ CD42a+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 90%의 CD42b+ CD42a+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 95%의 CD42b+ CD42a+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 적어도 98%의 CD42b+ CD41+ CD61+ DNA+ 세포를 함유한다.
일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 4N 이상의 배수성을 갖는 적어도 50% 거핵구를 함유한다. 일부 실시양태에서, 적어도 50% 거핵구는 배수성 4N-16N을 갖는다. 일부 실시양태에서, 적어도 60% 거핵구는 배수성 4N-16N을 갖는다. 일부 실시양태에서, 적어도 70% 거핵구는 배수성 4N-16N을 갖는다. 일부 실시양태에서, 적어도 80% 거핵구는 배수성 4N-16N을 갖는다. 일부 실시양태에서, 적어도 90% 거핵구는 배수성 4N-16N을 갖는다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 4N의 평균 배수성을 갖는 거핵구를 함유한다.
일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 본 개시내용의 거핵구로부터 생성된 프로혈소판, 프리혈소판 또는 혈소판을 함유한다. 일부 실시양태에서, 프로혈소판, 프리혈소판 또는 혈소판은 CD42b+ CD61+ DNA- 세포이다. 일부 실시양태에서, 거핵구는 hiPSC 세포 또는 세포주의 분화에 의해 시험관내에서 생성된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 거핵구는 다음 중 하나 이상을 포함한다: (a) 면역형광 현미경법에 의한 MK 과립의 함량: 알파-과립의 경우 PF4 및 VFW, 치밀-과립의 경우 LAMP-1 및 세로토닌; (b) 유전자 발현 데이터: Oct4-, Nanog-, Sox2-, Zfp42-, Zfpm1+, Nfe2+, Runx1+, Meis1+, Gata1+; (c) 피브리노겐, 세로토닌 및 LDL이 낮거나 없음, 및 (d) 혈장과 함께 인큐베이션될 때 피브리노겐, 세로토닌 및 LDL을 흡수할 수 있음.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 거핵구는 성장 인자, 시토카인, 케모카인 및 관련된 인자의 특징적인 발현 프로파일을 갖는다 (도 44). 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 인자, 예컨대 혈소판 유래 성장 인자 이소형 PDGF-AA 또는 PDGF-BB, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 표피 성장 인자 (EGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (FGF-2), 조혈 성장 인자 Flt3L, G-CSF, GM-CSF, 인터류킨 (IL-1RA, IL-8 또는 IL-16), CXC 케모카인 패밀리 구성원 CXCL1 (GRO 알파) 또는 CXCL12 (SDF-1), TNF 수퍼패밀리 구성원 sCD40L 또는 TRAIL, 또는 CC 케모카인 패밀리 구성원 CCL5 (RANTES), CCL11 (에오탁신-1), CCL21 (6CKine) 또는 CCL24 (에오탁신-2)를 포함할 수 있는 본 거핵구를 포함하는 조성물 또는 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 거핵구의 용해물을 포함하는 조성물 또는 제약 조성물을 제공한다. 이러한 용해물은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예컨대 그의 일체성을 손상시키는 바이러스, 효소 또는 삼투성 메커니즘에 의한 preMK 또는 MK의 막의 분해에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용해물은 추가 작용제를 포함할 수 있거나, 특정 적용의 필요에 따라 상이한 조성물 (액체, 페이스트 등)로 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 조성물은 인자, 예컨대 혈소판 유래 성장 인자 이소형 PDGF-AA 또는 PDGF-BB, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 표피 성장 인자 (EGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (FGF-2), 조혈 성장 인자 Flt3L, G-CSF, GM-CSF, 인터류킨 (IL-1RA, IL-8, 또는 IL-16), CXC 케모카인 패밀리 구성원 CXCL1 (GRO 알파) 또는 CXCL12 (SDF-1), TNF 수퍼패밀리 구성원 sCD40L 또는 TRAIL, 또는 CC 케모카인 패밀리 구성원 CCL5 (RANTES), CCL11 (에오탁신-1), CCL21 (6CKine) 또는 CCL24 (에오탁신-2)를 포함할 수 있다.
사용 방법
일부 실시양태에서, 본 preMK 및 MK 및 이들의 구성성분은 성장 인자, 예컨대 인간 성장 인자의 공급원일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 성장 인자는 세포 배양, 조직 재생, 상처 치유, 골 재생, 코스메슈티칼, 및 지혈 붕대를 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 거핵구 또는 이들의 용해물 또는 그의 조성물은 세포 배양에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 거핵구 또는 이들의 용해물 또는 그의 조성물은 코스메슈티칼로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 거핵구 또는 이들의 용해물 또는 그의 조성물은 치료제로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 거핵구 또는 이들의 용해물 또는 그의 조성물은 생체외에서 세포의 확장을 증가시키고, 생체내에서 골수 재생을 개선시키고, 조직 재생 및 혈관신생을 증가시키고, 방사선 연구에서 동물의 생존율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 preMK 및 MK는 현재 수혈 요구 (예를 들어, 수술, 화학요법, 임신/출산, 외상)를 지지하기 위해 혈소판을 생성하는데 사용될 수 있다. 국가 방위 및 안보 계획은 미국 내에서 최우선 순위이며, 방사선 대책으로서 MK 및 생성된 산물에 대한 큰 잠재적인 시장을 대표한다. 방사선 노출, 예컨대 핵 사고 또는 공격 후 발생하는 방사선 노출은 혈소판 생성을 억제한다. 대규모 방사선학 사건은 응급 외상을 치료하기 위해 기존 현지 재고를 고갈시키는 혈소판에 대한 즉각적인 수요, 이어서 노출 후 6+일에 생존자에서 혈소판에 대한 지속적인 수요를 촉발할 것이다. 영향을 받은 집단이 혈소판감소증이 되었을 때 군대의 준비 격차가 최전방으로부터 사고 후 24-48시간으로 이동함에 따라 혈소판의 전략적 국가 비축이 매우 중요하게 될 것이다. 미국은 전략적 국가 비축에서 혈소판 재고를 유지하지 않으며, 혈소판 카운트를 즉각적으로 증가시키는 허가된 치료제는 없다. 일부 실시양태에 따른 pre-MK 및 MK는 주문형 혈소판 생산에 사용될 수 있다. pre-MK를 연장된 기간 동안 거래하고 주문형 hiPSC-혈소판 생산 능력을 개발하는 능력은 이 계획된 요구를 충족시키는데 중요한 hiPSC-혈소판의 전략적 국가 비축의 확립을 가능하게 할 것이다.
자가 혈소판-풍부 혈장 (PRP) 보충된 배지는 이식을 위해 관류된 장기에서 혈관 일체성의 보존을 개선시키기 위해 미세혈관 내피 세포를 육성하는 것으로 제시된 바 있다. 혈소판은 분비 과립에 생물활성 인자를 저장하며, 이는 거핵구로부터 획득된다. 내용물은 다양한 케모카인 및 성장 인자, 예컨대 혈소판 유래 성장 인자 이소형 (PDGF-AA, -AB 및 -BB), 형질전환 성장 인자-b (TGF-b), 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1), 뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 표피 성장 인자 (EGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF 또는 FGF-2), 간세포 성장 인자 (HGF), 결합 조직 성장 인자 (CTGF) 및 골 형태형성 단백질 2, -4 및 -6 (BMP-2, -4, -6)을 포함한다. 인간 혈소판 용해물은 생체외에서 세포의 확장을 급격하게 증가시키고, 생체내에서 골수 재생을 개선시키고, 방사선 연구에서 동물의 생존율을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 거핵구로부터 생성된 프로혈소판, 프리혈소판 또는 혈소판의 용해물을 포함하는 조성물 또는 제약 조성물을 제공하며, 여기서 이러한 조성물은 인자, 예컨대 혈소판 유래 성장 인자 이소형 PDGF-AA 또는 PDGF-BB, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 표피 성장 인자 (EGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (FGF-2), 조혈 성장 인자 Flt3L, G-CSF, GM-CSF, 인터류킨 (IL-1RA, IL-8, 또는 IL-16), CXC 케모카인 패밀리 구성원 CXCL1 (GRO 알파) 또는 CXCL12 (SDF-1), TNF 수퍼패밀리 구성원 sCD40L 또는 TRAIL, 또는 CC 케모카인 패밀리 구성원 CCL5 (RANTES), CCL11 (에오탁신-1), CCL21 (6CKine) 또는 CCL24 (에오탁신-2)를 포함할 수 있다.
키트
본 개시내용은 본 개시내용의 거핵구 또는 분화된 세포를 포함하는 키트를 제공한다. 한 실시양태에서, 키트는 단리된 거핵구를 포함하는 조성물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 거핵구 또는 그의 전구체를 분화, 배양 및/또는 단리하기 위한 키트를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 혈소판을 생성하기 위한 키트를 제공한다.
일부 실시양태에서, 키트는 세포 조성물을 함유하는 멸균 컨테이너를 포함하며; 이러한 컨테이너는 상자, 앰플, 병, 바이알, 튜브, 백, 파우치, 블리스터-팩, 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 적합한 컨테이너 형태일 수 있다. 이러한 컨테이너는 플라스틱, 유리, 접합가공지, 금속 호일 또는 의약을 보유하기에 적합한 다른 물질로 제조될 수 있다.
원하는 경우, 키트는 거핵구를 생성하기 위한 지침서와 함께 제공된다. 지침서는 일반적으로 거핵구 또는 그의 전구체의 분화, 배양 및/또는 단리에 필요한 조건 및 인자에 대한 정보를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 혈소판을 생성하기 위한 지침서가 포함된다. 지침서는 컨테이너에 직접 인쇄되거나 (존재하는 경우), 또는 컨테이너에 적용된 라벨로서, 또는 컨테이너에 또는 컨테이너와 함께 공급된 별도의 시트, 팜플렛, 카드 또는 폴더로서 인쇄될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 본 개시내용의 실시는 통상의 기술자의 권한 내에 있는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 종래 기술을 사용한다. 이러한 기술은 문헌, 예컨대, 문헌 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991)]에 충분히 설명되어 있다. 이들 기술은 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 생성에 적용가능하고, 이와 같이, 본 개시내용의 제조 및 실시에 고려될 수 있다. 특정 실시양태에 특히 유용한 기술은 다음 섹션에서 논의될 것이다.
하기 실시예는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 본 개시내용의 검정, 스크리닝 및 치료 방법을 제조하고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시되며, 본 발명자들이 이들의 개시내용으로 간주하는 것의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. 임상 등급 hiPSC 세포주로부터 거핵구 선조세포, 거핵구 및 혈소판의 연장된 생성.
도 2의 지시된 분화 프로토콜을 사용하여 거핵구로 분화할 수 있는 이들의 잠재력에 대해 임상 등급 hiPSC 세포주를 연구하였으며, 도 2는 거핵구로의 만능성 줄기 세포의 분화의 시간 경과를 제시하는 개략도이며, 각각의 분화 단계 (단계 0, I, II, III)를 나타내었다. 단계 0-III에서의 세포 유형 및 세포 마커는 타임라인 위에 도시된다. 배지 조성, 매트릭스, 온도 및 기체 조건을 포함한 배양 조건은 타임라인 아래에 제시된다.
상이한 iPSC 세포주는 기능적으로 구별되고, 분화 프로토콜을 진정한으로 최적화하기 위해서는, 프로세스를 위한 최적의 임상 등급 세포주를 확인하는 것이 중요하다. PBG1, PBG2 및 PBG3으로 명명된 3개의 임상 등급 hiPSC 세포주를 수득하였다. PBG1을 NINDS(미국 국립 신경 질환 뇌졸중 연구소(National Institute of Neurological Disorders and Stroke))/NIH(미국 국립 보건원)에서 NINDS 인간 세포 데이터 저장소 (NHCDR: NINDS Human Cell and Data Repository) 보관소로부터 수득하였다. PBG1 (NINDS ID: LiPSC-Gr1.1)은 남성 CD34+ 제대혈 (론자(Lonza))로부터 유래되었다. PBG2 및 PBG3을 후지필름-셀룰라 다이나믹스 인터내셔널(Fujifilm-Cellular Dynamics International)(F-CDI)로부터 수득하였다. PBG2 및 PBG-3은 각각 남성 및 여성 성인 혈액 세포 (F-CDI MyCells iPSC ID 번호: 21525 및 21526)로부터 유래되었다.
분화의 개시 전, 3개의 hiPSC 세포주 모두는 에센셜 8 배지를 갖는 비트로넥틴 상에서 성장될 때 특징적인 콜로니를 형성하였고 (도 3A), 만능성 바이오마커 OCT4 및 NANOG의 발현을 나타내었다 (도 3B, 도 13A). 3개의 임상 등급 hiPSC 세포주는 도 2에 요약되어 있는 다단계 프로토콜을 사용하여 거핵구를 분화하도록 지시되었다. 세포를 지시된 분화 동안 다양한 시점에서 관찰하였다 (도 4A-4D). 조혈성 내피의 마커인 CD31+의 발현을 모니터링함으로써 단계 I 동안 분화 효율을 초기에 관찰하였다 (도 5). 분화 효율은 단계 I 동안 3개의 hiPSC 세포주에 대해 유사하였다. 이론에 구속되지 않고, 분화 프로세스 동안 후에 나타난 거핵구 출력/품질의 차이는 항상 단계 I에서 분화 효율과 상관관계가 있는 것은 아니다. 단계 II에서, CD41+CD43+ 세포의 생성을 모니터링함으로써 거핵구 선조세포를 향한 추가 분화를 관찰하였다 (도 6A). 특히, 임상 등급 세포주 중 일부의 경우, 단계 II 동안 거핵구 선조세포의 생성은 상이한 hiPSC 세포주를 사용한 이전 방법과 비교하여 더 길게 (최대 17일) 연장되었다 (도 6B). 누적 수율은 PBG-1 및 PBG-2 iPSC에 대해 특히 강건하였고, 독립적인 분화 사이에 일부 변동성을 나타내었다 (도 6C). 세포가 지시된 분화 프로토콜의 단계 III으로 전이될 때, CD42b+의 발현은 제1-5일에 걸쳐 증가되었고, 제4-5일에 CD42b+를 발현하는 CD41+ 세포의 백분율은 적어도 약 80%였다 (도 7A). 3개의 임상 등급 iPSC 세포주로부터 수득된 단계 III 세포를 광학 현미경법, 면역형광 현미경법 및 전자 현미경법에 의해 분석하였으며, 이는 PBG1 및 PBG2가 크기, 형태학, 프로혈소판 연장, 거핵구-특이적 단백질 발현 및 초미세구조를 포함한, 성숙 거핵구의 특색과 일치한 특색을 나타냄을 보여주었다 (도 7B-7C, 도 8A-8E).
실시예 2. 만능성 PBG-1 세포의 대규모 확장.
분화 전, 만능성 PBG-1 확장은 고밀도 시드 뱅크(seed bank)에 필요한 많은 수의 세포를 생성할 뿐만 아니라 임상 생성에 적절한 규모로 분화를 개시하기에 충분한 세포 수를 생성하는데 필요하다. PBG-1은 재조합 비트로넥틴 (VTN), + 동물 구성성분 무함유 (ACF), cGMP 적합성 시약, 예컨대 에센셜 8, 뉴트리스템 또는 스템플렉스를 사용하여 2D 배양에서 유지되고 확장될 수 있다. 만능성 마커의 특징적인 콜로니 성장 및 유지가 3개의 성장 조건 모두에서 관찰되었다 (도 9A-9C, 도 10A-10C). 대규모 확장을 가능하게 하기 위해, TrypLE를 사용하여 단일 세포로서 2D 배양물로부터 PBG-1 세포를 수확하고, 교반된 3D 용기, 이 경우에는 300 ml 다스박스(DasBOX) 미니 생물반응기 시스템에서 자기-응집하도록 허용되었다. 처음 24시간 동안, ROCK 억제제, 예컨대 Y27632를 세포에 첨가하여, 교반 탱크에서 6-7일에 걸쳐 초기 응집 동안 세포 생존을 촉진시키고, 생성된 스페로이드는 이들의 직경이 50 마이크로미터로부터 250 마이크로미터로 증가하였고, 전체 세포 밀도는 해당 기간 내에 최대 40배 증가하였다 (도 11A-11C). 이러한 방식으로 성장된 PBG-1 세포는 반복적으로 계대배양하고, 적어도 4회의 연속적인 확장 라운드 동안 이들의 만능성을 유지하였고 (도 12A-12B, 도 13B), 및 정상적인 핵형을 유지할 수 있었다 (도 14).
실시예 3. 2D 배양 용기에서 콜라겐 IV 매트릭스를 사용하여 preMK 및 MK로의 PBG-1 지시된 분화의 심층 특징화
0.5 mM EDTA로 수확하고 4.2 ug/㎠ 인간 콜라겐 IV에 작은 클럼프로서 플레이팅한 경우, PBG-1 세포는 6일의 단계 I 분화 과정을 통해 형태학적 변화의 특징적인 세트를 나타낸다 (도 15). 단계 I의 말미에, 대표적인 웰을 아큐타제를 사용하여 단일 세포로서 수확하고, 조혈성 내피 마커 CD31 및 CD34에 대해 유동 세포계측법에 의해 평가하였다 (도 16A). 다중 독립적인 PBG-1 분화에 걸쳐 (n=41), 평균 제6일 분화 효율은 대략 40% CD31+ (범위: ~20-60%) 및 대략 30% CD31+CD34+ (범위 ~15%-45%)인 것으로 결정되었다 (도 16B).
단계 II의 개시 후 2-3일 이내에 (즉, 제6+2일 내지 제6+3일), 작고 둥근 굴절 세포가 점착성 조혈성 내피 세포 내에서 나타나고, 결국 점착성 조혈성 내피 단층 위의 상등액으로 방출되었다 (도 17A). 이들 방출된 세포는 CD43 및 CD41의 세포 표면 발현 및 CD14의 발현 결여에 의해 정의된 바와 같이 preMK를 함유하였다 (도 17B, 도 17C). 점착성 세포 층의 상단 상에 나타나는 이들 부유하고 약하게 부착된 단계 II 세포를 배지를 온화하게 헹구고 수집함으로써 코니칼 튜브로 매일 수확하고, CD43, CD41 및 CD14의 발현에 대해 매일 분석하였다. 방출된 세포의 순도는 단계 II의 처음 수일 동안 낮았으며, 그 후에 안정기였으며, 제6+6일까지 50-60%의 평균 피크 preMK 순도였다 (도 18A). CD14+ 골수성 세포는 단계 II의 처음 6-7일 동안 PBG-1 지시된 분화 배양에서 주요 오염물질이 아니지만, 그 이후에는 일부 변동성이 있었다 (도 18B). preMK 생성의 동역학은 평균적으로 제6+6일 및 제6+7일에 피크에 도달하고, 그 후에 감소하였다 (도 19A). 다중 독립적인 PBG-1 분화에 걸쳐 (n=41), 평균 누적 preMK (CD43+CD41+CD14-) 수율은 웰당 대략 1 백만 (범위: 0.1 내지 3.3 백만)인 것으로 결정되었다 (도 19B).
이들 배양물로부터의 preMK가 단계 III 조건으로 이동될 때, 이들은 수일 이내에 성숙 MK로 분화하였다. 초기에 균일하게 작고 둥글고 굴절성인 세포 (도 20A)는 제2-4일까지 크기가 증가하기 시작하였다 (도 20B 및 도 20C). 동시에, 프로혈소판-생성 MK는 쉽게 관찰할 수 있었다 (도 20C 및 도 20D). 단계 III의 3-4일까지, 성숙 MK 마커 CD42a 및 CD42b를 공동-발현하는 CD61+ (거핵구 계통) 세포의 비율은 FACS에 의해 결정하고 (도 21A 및 도 21B), 성숙 MK (CD61+CD42a+CD42b+ 세포)의 순도는 배양물에서 모든 유핵 세포의 70-90%만큼 높은 수준에 도달할 수 있었다 (도 21C).
실시예 4. 재조합 라미닌521은 MK로의 PBG-1의 지시된 분화를 지지하기 위해 콜라겐 IV를 대체할 수 있다.
콜라겐 IV는 인간 태반 물질로부터 정제되며, 연구용 시약으로만 이용가능하다. 그러므로, 콜라겐 IV는 PBG-1 유래 거핵구의 cGMP 생성과 적합성이 없으며, 이들 세포를 임상 용도로 사용될 수 있기 전에 대안 전략을 개발해야 한다. 하나의 잠재적인 해결책은 콜라겐 IV를 재조합 공급원으로부터 생성된 재조합 매트릭스 구성성분으로 대체하는 것이다. 여기서, 재조합 라미닌-521이 MK로의 iPSC의 지시된 분화를 위한 콜라겐 IV에 대한 적합한 대안으로서 사용될 수 있는 것으로 제시된다. 0.5 mM EDTA로 수확함으로써 생성된 PBG-1 클럼프는 4.2 ug/㎠ 인간 콜라겐 IV에서와 같이 0.13 ug/㎠의 재조합 라미닌-521 상에 6일의 단계 I 분화 과정을 통해 형태학적 변화의 동일한 특징적인 세트를 나타내었다 (도 22A-22B). 단계 II로 전이될 때, 라미닌-521 배양물은 상응하는 콜라겐 IV 배양물과 유사한 수율 및 순도의 preMK를 생성하였다 (도 23A-23C). 3일의 추가 분화 시, 단계 III에서의 세포는 콜라겐 IV 또는 라미닌-521 상에 생성되는지에 상관없이 프로혈소판 생성에 대한 유사한 크기, 형태학 및 경향을 나타내었다 (도 24A-24B). 성숙 MK 마커 CD42a 및 CD42b를 공동-발현하는 CD61+ (거핵구 계통) 세포의 비율을 또한 측정하고, 매트릭스 상에 생성된 세포에 대해서 유사한 것으로 밝혀졌다 (도 25A-25B).
실시예 5. WNT 조정인자는 단계 I 및 II 분화 효율에 영향을 줄 수 있다.
WNT 신호전달은 발달 동안 중요하다. GSK3 키나제 억제제 CHIR98014 및 CHIR99021은 WNT 효능제로서 작용한다. 본원에 기재된 단계 I 분화 조건 (라미닌 521 매트릭스를 사용함)이 분화의 처음 48시간 동안에만 0.6 uM CHIR98014 또는 6 uM CHIR99021로 증대되었을 때, CD31 및 CD34의 면역형광 염색에 의해 결정된 바와 같이 단계 I 분화 효율의 급격한 증가가 제6일에 관찰되었다 (도 26A-26C). 그 후, 대조군 CHIR98014 배양물을 단계 II로 전이시키고, 여기서 preMK의 생성 및 방출을 CD41 및 CD43의 면역형광 염색에 의해 추적하였다. CD41+ 세포 수의 시각적 추정은 처음 48시간에 WNT 조정인자에 의해 야기된 더 높은 단계 I 효율이 단계 II 동안 더 높은 출력에 상응할 수 있음을 시사한다 (도 27A-27B). 그러므로, WNT 조정인자 첨가의 짧은 기간은 후속 분화 단계에 걸쳐 분화 효율에 영향을 줄 수 있다.
실시예 6. 라미닌 521-코팅된 매크로캐리어를 갖는 충전층 생물반응기.
거핵구 및 혈소판의 임상 생산에 필요한 수율을 가능하게 하기 위해, 전체 분화 프로세스를 소규모 조직 배양 플라스틱 제품 (2D, 매트릭스 의존적)으로부터 3D 규모가변성 솔루션으로 전이하는 것이 중요하다. 여기서, 본 발명자들은 1 mm 라시히 링 형상의 라미닌 521-코팅된 PTFE 매크로캐리어가 PBG-1 세포의 분화의 지지를 제공할 수 있고, 이 매크로캐리어 물질이 개략도에 도시된 바와 같이 충전층 생물반응기에서 사용하기에 적합하다는 증거를 제공한다 (도 28). PTFE 링을 먼저 1.25 ug/ml 라미닌-521과 함께 4℃에서 로커 상에서 밤새 인큐베이션하였다. 사용 전에, PTFE 링을 에센셜 8 배지 + ROCK 억제제인 H1152를 갖는 6-웰 플레이트에서 평형화시켰다. 만능성 PBG-1 iPSC를 0.5 mM EDTA, 재현탁된 에센셜 8 배지 + H1152를 사용하여 수확하고, 클럼프로서 PTFE 링에 시딩하였다. 10분마다, 플레이트를 궤도형 진탕기 상에서 75 rpm으로 30초 동안 실행시켰다. 1시간 후, 플레이트를 밤새 75 rpm에서 연속적으로 진탕하였다. 24시간 후, 매일 배지 교환으로 배지의 90%를 제거하고 단계 I 배지로 대체하였다. 단계 I 동안, PBG-1 세포는 라시히 링의 내부에서 성장 구역을 나타내었고 (도 29), 성장 구역은 2D 배양에서 보이는 것과 유사한 형태학적 특징을 발생시켰다 (도 22). 이들 세포의 유동 세포계측법 분석은 높은 비율의 조혈성 내피 세포를 나타내며, 세포의 ~80%가 CD31을 발현하고, 상기 세포의 절반 초과가 CD34+에 대해 이중 양성임을 나타내었다 (도 31A). 단계 II 배지를 스위칭하고 절반 매일 배지 교환을 개시할 때, 형태학은 일반적으로 편평한 콜로니로부터 3D 스페로이드-유형 구조로 변화하였지만, 이들 구조는 여전히 링-형상 매크로캐리어의 내부의 라미닌 521 코팅에 부착되어 있음에 주목해야 한다 (도 30). 단계 II 동안 방출된 세포는 심지어 제6+2일만큼 초기에 높은 preMK 함량을 가졌으며, 세포의 ~75%는 CD43 및 CD41을 공동-발현하고 (도 31B), 유리하게는 2D 매트릭스-의존적 배양과 비교되는 순도를 가졌다 (도 18A). 제6+3일에 방출된 세포를 수집하고, 초저점착성 플레이트에서 단계 III 배지에서 추가 3일 동안 배양하고, 이들 세포의 ~80%는 CD61 및 CD42b를 공동-발현하였으며 (도 31C), 이는 효율적인 MK 분화가 발생했음을 나타낸다. 이러한 매크로캐리어는 조혈성 내피로의 iPSC의 초기 분화 (즉, 지시된 분화의 단계 I), 뿐만 아니라 preMK의 추가 분화 및 방출 (즉, 지시된 분화의 단계 II)이 동일한 용기에서 발생할 수 있는 충전층 생물반응기를 위한 물질로서 사용하기에 적합하다 (도 28). 이 설계에서, 충전층 생물반응기는 만능성 PBG-1 iPSC로 신선하게 시딩된 라미닌-521 코팅된 매크로캐리어로 설정하였다. 그 후, 조혈성 내피로의 단계 I 분화를 가능하게 하기 위해 충전층을 연속적인 배지 흐름에 노출시켰다. 충전층을 통한 삼출 후, 컨디셔닝 챔버를 통해 배지를 순환시켰으며, 여기서 신선한 배지 구성성분을 첨가하고, 배지를 세포로 재순환시키기 전에 살포 또는 다른 수단을 통해 산소/CO2 농도를 조정하였다. 단계 I의 완료 시, 단계 II 분화 및 preMK의 생성 및 방출을 허용하도록 배지를 스위칭시켰다. 적절한 크기 및 형상의 매크로캐리어 기질, 예컨대 1 mm 라시히 링은, 방출된 세포가 수집 및 냉동보존을 위해 충전층을 통해 반응기 밖으로 삼출하는 것을 가능하게 하기에 충분한 배지 유동 및 채널 폭을 가능하게 할 수 있다. 이 설계는 세포에 의해 경험되는 전단력을 감소시킬 수 있고, 그의 관류 기반 설계로 인해 효율적인 배지 사용을 허용할 수 있고, 방출되는 preMK의 연속적인 수집을 가능하게 할 수 있었다.
실시예 7. 교반 탱크 생물반응기에서 자기-응집 iPSC-유래 스페로이드
규모가변성 3D 솔루션의 또 다른 예는 교반된 또는 진탕된 초저점착성 용기에서 현탁된 자기-응집 스페로이드를 사용하여 분화를 수행하는 것을 수반한다 (도 32). 이 실시예에서, 만능성 PBG-1 iPSC를 TrypLE를 사용하여 단일 세포로 해리시키고, 만능성 유지 배지 (예컨대, 에센셜 8, 뉴트리스템, 스템플렉스, 다른 유사한 배지, 또는 이들의 조합) + H1152 또는 다른 ROCK 억제제에서 0.5-1 백만 세포/ml로 재현탁시키고, 90 rpm에서 궤도형 진탕기 또는 일정하게 진탕되는 스피너 플라스크 (125 ml 스피너 플라스크에서 50 ml 부피에 대해 90 rpm) 상에서 6-웰 초저점착성 플레이트에서 37℃, 5% CO2, 20% O2에서 인큐베이션하였다. 어느 하나의 시스템에서 24시간 이내에, PBG-1 세포는 자기-응집하여 대략 50-150 um 직경의 스페로이드를 형성하였다 (도 33A, 또한 상이한 용기에서 유사한 실시예에 대한 도 11A 참조). 그 후, 진탕을 일시정지시키고, 스페로이드는 용기의 하단으로 침강하도록 허용되었다 (대략 5분). 그 후, 조혈성 내피를 향한 분화를 촉진하기 위해 배지의 50%-100%를 단계 I 분화 배지로 교환하였고, 저산소 조건 (37℃, 5% CO2, 5% O2)에서 인큐베이션하면서 진탕을 재개하였다. 배지 교환을 총 6일 (37℃, 5% CO2, 5% O2에서 4일, 이어서 37℃, 5% CO2, 20% O2에서 2일)에 대한 매일 기준으로 유사하게 수행하였으며, 이 기간 동안 스페로이드는 제6일까지 더 크게 성장하고 특징적인 구조 및 형상을 발달시켰다 (도 33A). 제6일에 이들 스페로이드의 샘플을 유동 세포계측법에 의해 해리하고 평가할 때, 세포의 ~44%는 조혈성 내피 마커 CD31 및 CD34를 발현하고 (도 33B), 유리하게는 2D 매트릭스-의존적 배양과 비교되는 순도를 갖는 것으로 밝혀졌다 (도 16B). 단계 II로 전이하기 위해, 진탕을 일시정지시키고, 스페로이드는 용기의 하단으로 침강하도록 허용되었다 (대략 5분). 그 후, 현탁 세포의 분화 및 방출을 촉진하기 위해 배지의 50%-100%를 단계 II 분화 배지로 교환하였다 (도 34A). 그 후 매일 기준으로, 현탁 세포를 수집하고, 부분적 배지 교환을 수행하였다. 이를 위해, 진탕을 일시정지시키고, 조혈성 내피 스페로이드는 용기의 하단으로 침강하도록 허용되었다 (대략 5분). 배지 (현탁 세포와 함께)의 대략 80%를 수집하고 원심분리하였다. 원래 작업 부피를 회복시키기에 충분한 부피의 컨디셔닝된 배지 (즉, 원심분리 후 상등액)와 함께, 신선한 단계 II 분화 배지의 작업 부피의 절반을 스페로이드에 첨가하였다. 그 후, 남은 상등액을 버리고, 세포 펠렛의 일부를 FACS 분석에 사용하고 (도 34B), 나머지를 동결보존하거나, 성숙 MK로의 성숙을 위해 단계 III으로 이동시켰다. 현탁 세포의 유동 세포계측법 분석은 제6+2일 및 제6+6일 사이에 방출된 대부분의 세포가 preMK 마커 CD43 및 CD41을 공동-발현한 것으로 나타났다 (도 34B, 도 34C). 3D 자기-응집 스페로이드 배양물로부터의 전체 preMK 순도 및 수율 (도 34C, 도 34D)은 유리하게는 2D 배양물로부터의 순도 및 수율과 비교하였다 (도 18A, 도 19A). 정적 단계 III 배양으로의 전이 시, 3D 자기-응집 스페로이드 배양물로부터의 preMK는 2D 배양 시스템으로부터의 preMK로서 유사한 MK 순도를 생성하였다 (도 35A-35C). 또한, 3D 자기-응집 스페로이드 배양물로부터 생성된 단계 III 분화 배양물은 크기가 급격하게 증가하고 진정한 거핵구와의 이들의 동일성과 일치하는 프로혈소판을 생성할 수 있는 세포를 함유하였다 (도 36).
실시예 8. PBG1 iPSC-유래 거핵구의 상세한 특징화
본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 거핵구는 MK-특이적 단백질 베타-1-튜불린 (도 37), 뿐만 아니라 알파-과립 (PF4 및 VWF, 도 38A-38F) 및 치밀 과립 (LAMP1 및 세로토닌, 도 39A-39F)과 연관된 단백질에 대해 면역형광 현미경법에 의해 영상화할 때를 포함한, 기능적 성숙 MK와 연관된 많은 특색을 나타낸다. PBG1-유래 MK의 전자 현미경법 이미지는 다소포체, 글리코겐 과립 및 함입된 막 시스템을 포함한 특징적인 초미세구조적 특색을 나타낸다 (도 40A-40D). 유전자 발현 분석은 만능성 유전자, 예컨대 OCT4의 하향조절 (도 41A) 및 거핵구 계통 유전자, 예컨대 NFE2의 상향조절 (도 41B)을 나타내었다. 관련 유전자의 패널에 대해 유사한 분석을 수행하였으며, 이 분석 결과는 만능성 줄기 세포 시그너쳐의 상실 및 거핵구 시그너쳐의 획득과 일치한다 (도 41C).
골수 CD34+, 말초 혈액 CD34+, 또는 제대혈 CD34+ 세포, PBG1-유래 MK로부터 유래된 일차 거핵구 (천연 산물)와 비교할 때, PBG1 iPSC-유래 MK는 CD34+ 골수, 말초 혈액 또는 제대혈 줄기 세포로부터 유래된 일차 거핵구 (천연 산물)(도 42C, 도 43B)와 비교하여, 유사한 평균 크기를 갖지만 (도 42A-42C), 특징적인 더 낮은 배수성 분포 (도 43A-43B)를 갖는 것으로 밝혀졌다. PBG1 hiPSC 유래된 거핵구는 또한 거핵구에서 이전에 보고되지 않은 다중 인자의 존재를 포함한, 인간 혈소판에 존재하는 것과 유사한 인자의 특징적인 성장 인자, 시토카인, 및 케모카인 발현 프로파일을 가졌다 (도 44). 데이터를 준비하기 위해, 1X PBS에서 25 백만/mL의 hiPSC-MK를, 세포를 -80℃에서 밤새 동결시킨 후 37℃에서 해동함으로써 용해시켰다. 이 동결/해동 주기를 4회 반복하였다. 생성된 현탁액을 0.22 μm 시린지 필터를 사용하여 여과하였다. 다중화 레이저 비드 기술 (이브 테크놀로지스(Eve Technologies))을 사용하여 성장 인자, 시토카인 및 케모카인의 선택 패널에 대해 용해물을 시험하였다. 데이터를 백그라운드 (PBS, hiPSC-MK와 유사하게 프로세싱됨)에 대해 수정한 후, 시판되는 인간 혈소판 용해물 (HPL), 신선한 MK 분화 배지 (분화의 최종 단계에서 사용됨), 및 컨디셔닝된 배지, 즉 용해 전 hiPSC-MK로부터 제거된 MK 분화 배지와 비교하였다. hiPSC-MK 및 HPL 사이에 강한 중첩이 관찰되었지만, 또한 거핵구 또는 혈소판에 이전에 기재되지 않은 hiPSC-MK에서 측정된 여러 단백질이 있었다 (""으로 표시됨).
본원에 기재된 결과는 임상 등급 인간 iPSC-유래 거핵구를 생성하기 위한 강건한 프로세스를 입증한다. 인간 iPSC-유래 거핵구는 추가의 특징화 또는 하류 적용, 예컨대 인간 혈소판의 생성에 사용하기 위해 단리되고 농축될 수 있다 (도 45A-45C).
다른 실시양태
본원에 기재된 바와 같이, 본 개시내용은 거핵구 선조세포 및 거핵구를 생성하기 위한 조성물 및 방법을 특색으로 한다. 한 측면에서, 본 개시내용은 임상 등급 hiPSC 세포 또는 세포주로부터 분화된 거핵구 또는 거핵구 선조세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 임의의 측면에 따른 거핵구 또는 거핵구 선조세포를 포함하는 단리된 세포 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 임의의 측면에 따른 거핵구 또는 거핵구 선조세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 임의의 측면에 따른 거핵구의 용해물을 포함하는 조성물 또는 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 임의의 측면에 따른 거핵구로부터 생성된 혈소판의 용해물을 포함하는 조성물 또는 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 임상 등급 hiPSC 세포 또는 세포주를 분화시키는 것을 포함하는, 거핵구의 생성 방법을 제공한다. 본원에 기술된 임의의 측면의 다양한 실시양태에서, 거핵구는 CD42b+, CD61+ 및 DNA+ 중 하나 이상이다. 본원에 기술된 임의의 측면의 다양한 실시양태에서, 거핵구는 약 10-30 μm의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 거핵구는 약 10-20 μm의 직경을 갖는다. 본원에 기술된 임의의 측면의 다양한 실시양태에서, 거핵구는 적어도 4N, 8N, 또는 16N의 배수성을 갖는다. 본원에 기술된 임의의 측면의 다양한 실시양태에서, 거핵구 선조세포는 CD14-, CD41+, 및 CD43+이다. 본원에 기술된 임의의 측면의 다양한 실시양태에서, 거핵구 선조세포는 혈액-내피 선조세포로부터 분화 개시 후 적어도 제10일까지 연속적으로 생성될 수 있다 (즉, 단계 II, 제6+10일). 본원에 기술된 임의의 측면의 다양한 실시양태에서, 거핵구 선조세포는 혈액-내피 선조세포로부터 분화 개시 후 적어도 제17일까지 연속적으로 생성될 수 있다 (즉, 단계 II, 제6+17일). 본원에 기술된 임의의 측면의 다양한 실시양태에서, 임상 등급 hiPSC 세포 또는 세포주는 PBG1, PBG2 및 PBG3으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 기술된 임의의 측면의 다양한 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 본 개시내용의 거핵구로부터 생성된 혈소판을 함유한다. 본원에 기술된 임의의 측면의 다양한 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 CD41+ CD61+ 세포의 적어도 50% CD42b+를 함유한다. 본원에 기술된 임의의 측면의 다양한 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 4N 이상의 배수성을 갖는 적어도 50% 거핵구를 함유한다. 특정 실시양태에서, 적어도 50% 거핵구는 배수성 4N-16N을 갖는다. 본원에 기술된 임의의 측면의 다양한 실시양태에서, 단리된 세포 집단 또는 조성물은 4N 이상의 평균 배수성을 갖는 거핵구를 함유한다.
상기 기재로부터, 다양한 용도 및 조건에 적용하기 위해 본원에 기재된 개시내용에 대해 변이 및 변형이 이루어질 수 있음이 명백할 것이다. 이러한 실시양태는 또한 다음 청구항의 범위 내에 있다.
본원에서 변수의 임의의 정의에서 요소의 목록의 언급은 임의의 단일 요소 또는 열거된 요소들의 조합 (또는 하위조합)으로서의 변수의 정의를 포함한다. 본원에서 실시양태의 언급은 해당 실시양태를 임의의 단일 실시양태로서, 또는 임의의 다른 실시양태 또는 그의 부분과 조합하여 포함한다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 공보는 각각의 독립적인 특허 및 공보가 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.

Claims (48)

  1. 거핵구 생성을 위한 방법으로서,
    만능성 줄기 세포를 저점착성 또는 비점착성 조건 하에 및 진탕 하에 확장시키며, 여기서 확장된 만능성 줄기 세포는 자기-응집 스페로이드를 형성하는 것인 단계;
    만능성 세포를 제1 배양 배지에서 조혈성 내피 세포로 분화시키는 단계;
    조혈성 내피 세포를 제2 배양 배지에서 거핵구 선조세포로 분화시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 만능성 세포를 조혈성 내피 세포로 분화시키는 단계가 점착성 조건 하에 매트릭스 상에서 수행되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 매트릭스가 라미닌을 포함하는 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 매트릭스가 2차원 표면에 부착된 것인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 매트릭스가 3차원 구조에 부착된 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 만능성 세포를 조혈성 내피 세포로 분화시키는 단계가 조혈성 내피 세포의 자기-응집을 가능하게 하는 저점착성 또는 비점착성 조건 하에 수행되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 제1 배양 배지가 골 형태형성 단백질 4 (BMP4), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF) 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 제1 배양 배지가 WNT 조정인자를 추가로 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 제2 배양 배지가 줄기 세포 인자 (SCF), 트롬보포이에틴 (TPO), Fms-관련 티로신 키나제 3 리간드 (Flt3-L), 인터류킨-3 (IL-3), 인터류킨-6 (IL-6) 및 헤파린 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 만능성 줄기 세포가 인간 유도된 만능성 줄기 세포인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 확장된 만능성 줄기 세포를 수확하고 해리시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 거핵구 선조세포를 거핵구로 분화시키기 전에 거핵구 선조세포를 배양 배지에서 비점착성 표면 상으로 시딩하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 거핵구 선조세포를 제3 배양 배지에서 거핵구로 분화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 제3 배양 배지가 줄기 세포 인자 (SCF), 트롬보포이에틴 (TPO), 인터류킨-6 (IL-6), 인터류킨-9 (IL-9) 및 헤파린 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  15. 거핵구 생성을 위한 방법으로서,
    만능성 세포를 제1 배양 배지에서 조혈성 내피 세포로 분화시키는 단계; 및
    조혈성 내피 세포를 제2 배양 배지에서 거핵구 선조세포로 분화시키는 단계
    를 포함하며,
    여기서 만능성 세포를 분화시키는 단계 및 조혈성 내피 세포를 분화시키는 단계 중 적어도 하나는 매트릭스 코팅된 3차원 구조 상에서 수행되는 것인
    방법.
  16. 제15항에 있어서, 3차원 구조가 마이크로캐리어인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 3차원 구조가 마이크로캐리어인 방법.
  18. 제15항에 있어서, 매트릭스가 라미닌을 포함하는 것인 방법.
  19. 제15항에 있어서, 제1 배양 배지가 골 형태형성 단백질 4 (BMP4), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF) 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  20. 제15항에 있어서, 제1 배양 배지가 WNT 조정인자를 추가로 포함하는 것인 방법.
  21. 제15항에 있어서, 제2 배양 배지가 줄기 세포 인자 (SCF), 트롬보포이에틴 (TPO), Fms-관련 티로신 키나제 3 리간드 (Flt3-L), 인터류킨-3 (IL-3), 인터류킨-6 (IL-6) 및 헤파린 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  22. 제15항에 있어서, 만능성 줄기 세포가 인간 유도된 만능성 줄기 세포인 방법.
  23. 제15항에 있어서, 만능성 줄기 세포를 매트릭스 코팅된 3차원 구조 상에서 확장시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  24. 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 거핵구 선조세포를 제3 배양 배지에서 거핵구로 분화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 제3 배양 배지가 줄기 세포 인자 (SCF), 트롬보포이에틴 (TPO), 인터류킨-6 (IL-6), 인터류킨-9 (IL-9) 및 헤파린 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  26. 거핵구 생성을 위한 방법으로서,
    만능성 세포를 제1 배양 배지에서 조혈성 내피 세포로 분화시키는 단계; 및
    조혈성 내피 세포를 제2 배양 배지에서 거핵구 선조세포로 분화시키는 단계
    를 포함하며,
    여기서 만능성 세포를 분화시키는 단계 및 조혈성 내피 세포를 분화시키는 단계 중 적어도 하나는 세포의 자기-응집을 가능하게 하는 저점착성 또는 비점착성 조건 하에 수행되는 것인
    방법.
  27. 제26항에 있어서, 제1 배양 배지가 골 형태형성 단백질 4 (BMP4), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF) 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 제1 배양 배지가 WNT 조정인자를 추가로 포함하는 것인 방법.
  29. 제26항에 있어서, 제2 배양 배지가 줄기 세포 인자 (SCF), 트롬보포이에틴 (TPO), Fms-관련 티로신 키나제 3 리간드 (Flt3-L), 인터류킨-3 (IL-3), 인터류킨-6 (IL-6) 및 헤파린 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  30. 제26항에 있어서, 만능성 줄기 세포가 인간 유도된 만능성 줄기 세포인 방법.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 거핵구 선조세포를 제3 배양 배지에서 거핵구로 분화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 제3 배양 배지가 줄기 세포 인자 (SCF), 트롬보포이에틴 (TPO), 인터류킨-6 (IL-6), 인터류킨-9 (IL-9) 및 헤파린 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  33. 제1항 내지 제12항, 제15항 내지 제23항 및 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 거핵구 선조세포를 포함하는 조성물.
  34. 제1항 내지 제12항, 제15항 내지 제23항 및 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 거핵구 선조세포의 용해물을 포함하는 조성물.
  35. 제13항, 제14항, 제24항, 제25항, 제31항 및 제32항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 거핵구 또는 거핵구의 용해물을 포함하는 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 거핵구가 CD42b+, CD61+ 및 DNA+인 조성물.
  37. 제13항의 방법에 의해 생성된 거핵구 또는 거핵구의 용해물을 포함하는 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 거핵구가 CD42b+, CD61+ 및 DNA+인 조성물.
  39. 제14항의 방법에 의해 생성된 거핵구 또는 거핵구의 용해물을 포함하는 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 거핵구가 CD42b+, CD61+ 및 DNA+인 조성물.
  41. 제24항의 방법에 의해 생성된 거핵구 또는 거핵구의 용해물을 포함하는 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 거핵구가 CD42b+, CD61+ 및 DNA+인 조성물.
  43. 제25항의 방법에 의해 생성된 거핵구 또는 거핵구의 용해물을 포함하는 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 거핵구가 CD42b+, CD61+ 및 DNA+인 조성물.
  45. 제31항의 방법에 의해 생성된 거핵구 또는 거핵구의 용해물을 포함하는 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 거핵구가 CD42b+, CD61+ 및 DNA+인 조성물.
  47. 제32항의 방법에 의해 생성된 거핵구 또는 거핵구의 용해물을 포함하는 조성물.
  48. 제47항에 있어서, 거핵구가 CD42b+, CD61+ 및 DNA+인 조성물.
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