KR20200116106A - 과민성 대장 증후군의 예방 및 치료를 위한 조합 생성물 - Google Patents
과민성 대장 증후군의 예방 및 치료를 위한 조합 생성물 Download PDFInfo
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Abstract
비피도박테리움 NCIMB 41003의 단리된 균주 및 비피도박테리움 NCIMB 41003과 불리하게 상호작용하지 않는 다른 균주를 포함하는 조합 생성물은 IBS와 관련된 위장 증상을 개선 시키며 IBS와 관련된 기분, 스트레스, 불안증, 수면 질 및 우울증 중 하나 이상을 개선 시킨다.
Description
서론(Introduction)
과민성 대장 증후군(IBS)은 만성 복부 통증, 불편함, 팽창 및 배변 습관의 변화를 특징으로 하며, 일반적인 개체군의 10-15%에 영향을 미친다(Hungin et al., 2003). 많은 경우, 이러한 병태는 심신을 약화시킬 수 있다. IBS에 기여하는 기본 인자는 이질적이고 완전하게 이해되지 않지만, 변형된 장 점막 면역 활성화(O'Malley, 2015), 인지 기능(Kennedy et al., 2014), 심리적 스트레스, 뇌-장 상호작용 및 장 미생물군(gut microbiota)에서의 변화는 병태에 대한 중요한 기여자(Drossman and Hasler, 2016)이다.
위장관(gastrointestinal tract)은 방대한 무리의 미생물(인체 내의 모든 세포의 약 95%는 장 박테리아임)를 함유하고, 이는 장내 감염에 대한 보호를 제공하고, 발효에 의해 식품으로부터 추가적인 영양가를 공급하고, 면역 시스템의 발생에 기여함으로써 인간 건강에 매우 중요하다. 축적한 증거에 따르면, IBS 환자가 건강한 대조군과 비교해 상이한 장 미생물군을 갖으며(Jeffery et al., 2012, Tap et al., 2017), 이러한 변형된 미생물군은 또한, 심리적 스트레스에 의해 변화될 수 있다는(Blanchard et al., 2008, Chitkara et al., 2008) 것을 시사했다. 실제로, 장 미생물군은 장-뇌 축과 상호작용함에 따라 IBS의 발생 및 지속성에서 가능한 핵심자로서 주목을 받고 있다.
프로바이오틱 박테리아는 소비될 때 건강상의 이점을 제공하는 것으로 여겨지는 미생물로서, "살아있는 미생물들(micro-organisms)"로서 정의되는데, 이는 적절한 양으로 투여되면 숙주에 건강상의 이점을 부여한다(FAO/WHO, 2001). 최근의 연구는 전임상 및 임상 연구 모두에서 장-뇌 축에 대한 프로바이오틱의 유망한 효과를 나타내었다(Dina and Cryan, 2017).
IBS에 대해, 특정 프로바이오틱 균주는 과민성 대장 증후군의 위장관 증상의 일부 또는 전부를 감소시키는 것으로 밝혀졌다(Ford et al., 2014, O'Mahony et al., 2005, Whorwell et al., 2006). 35624 균주는 IBS와 관련된 가장 중요한 장 증상에 영향을 미치는 것으로 밝혀진 유일한 프로바이오틱이다(Whorwell et al., 2006). 그러나 스트레스, 불안증 및 우울증의 동반-이환(co-morbid) 증상을 다루기 위해 거의 행해지지 않았으며, IBS에서 장-뇌 축에 대한 프로바이오틱의 효과에 대해서는 거의 알려져 있지 않으며, 위장관 증상 및 관련 스트레스, IBS의 불안증 및 우울증 증상 둘 다의 관리를 입증하는 가용의 프로바이오틱 균주 또는 균주의 조합이 존재하지 않는다.
본 발명의 기술(Statement of Invention)
본 발명에 따르면, 제2 균주가 균주 NCIMB 41003의 위장 효과에 악영향을 미치지 않는 비피도박테리움 ( Bifidobacterium ) 균주 NCIMB 41003 및 제2 박테리아 균주의 단리된 균주를 포함하는 조성물이 제공된다.
상기 제2 균주는 균주 NCIMB 41003의 위장 효과에 악영향을 미치지 않는 비피도박테리움 균주일 수 있다.
상기 제2 균주는 균주 NCIMB 41003의 위장 효과에 악영향을 미치지 않는 락토바실러스 (Lactobacillus) 균주일 수 있다.
상기 제2 균주는 균주 NCIMB 41003의 위장 효과에 악영향을 미치지 않는 락토코커스 (Lactococcus) 균주일 수 있다.
일부 경우에 상기 제2 균주는 비피도박테리움 롱검 ( Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 비피덤 ( Bifidobacterium bifidum ), 비피도박테리움 락티 스(Bifidobacterium lactis ), 비피도박테리움 브레브 ( Bifidobacterium breve ), 락 토바실러스 아시도필루스 (Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis ), 락토바실러스 카세인(Lactobacillus casei ), 락토바실러스 살리바리우스 락토코커스 락티스 (Lactobacillus salivarius Lactococcus lactis), 락토바실러스 아시도필루스 (Lactobacillus acidophilus), 또는 균주 NCIMB 41003의 위장 효과에 악영향을 미치지 않는 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus )일 수 있다.
다음의 균주들은 Danisco B. lactis HN019, L. acidophilus NCFM (ATCC PTA-4797), L. rhamnosus HN001, B. lactis Bi-07, B. lactis B420, B. lactis Bl-04로부터 가용하다.
추가적인 균주는 B. Bifidum W23, B. lactis W51, B. lactis W52, Lactobacillus acidophilus W37, Lactobacillus, brevis W63, Lactobacillus casei W56, Lactobacillus casei W56, Lactobaillis salivarius W24, Lactococcus lactis W19, Lactococcus lactis W58로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 살아있는 락토바실러스 균주를 포함하는 Winclove로부터 가용한 다종 프로바이오틱 조성물에 포함된 하나 이상의 균주일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 상기 제2 균주는:
IBS와 관련된 기분을 개선 시키고;
IBS와 관련된 스트레스를 감소시키고;
IBS와 관련된 불안증을 감소시키고;
IBS와 관련된 수면 질을 개선 시키고;
IBS와 관련된 우울증을 치료하는; 및/또는
IBS와 관련된 조절되지 않은 코르티솔(cortisol) 각성 반응을 정상화한다.
상기 조성물은 하나 이상의 추가 균주를 함유할 수 있다.
본 발명에 따르면, IBS와 관련된 위장 증상을 개선함 및 다음:
IBS와 관련된 기분을 개선 시킴;
IBS와 관련된 스트레스를 감소시킴;
IBS와 관련된 불안증을 감소시킴;
IBS와 관련된 수면 질을 개선 시킴;
IBS와 관련된 우울증을 치료함; 및
IBS와 관련된 조절되지 않은 코르티솔 각성 반응을 정상화함 중 하나 이상에 의해, 과민성 대장 증후군(IBS)의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 비피도박테리움 균주 NCIMB 41003 및 제2 비피도박테리움 균주의 분리된 균주를 포함하는 조합 생성물이 제공된다.
상기 조합 생성물은 IBS와 관련된 위장 증상을 개선 및 IBS와 관련된 조절되지 않은 코르티솔 각성 반응을 정상화함으로써, 과민성 대장 증후군(IBS)의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 비피도박테리움 균주 NCIMB 41003 및 제2 비피도박테리움 균주의 단리된 균주를 포함할 수 있다.
일부 경우에 제2 균주는 B. longum 1714 ®(NCIMB 41676)가 아니다. B. longum 1714®에 대한 대안으로서, B. longum 35624®와 양립할 수 있고 35624/1714의 하나 이상의 특성을 제공할 수는 다른 B. longum 균주도 활용될 수 있다. 잠재적인 예는 다음을 포함한다:
비피도박테리움 롱검 R175("Rosell® 175")는 기준 프로바이오캡(reference probiocap) Rosell ME-175으로 Lallemand(프랑스)에 의해 판매된다.
B. longum NCC3001(ATCC BAA-999)은 Morinaga Milk Industry Co., Ltd.로부터 입수 가능한 B. longum BB536의 동의어이다.
제2 비피도박테리움 균주는 균주 NCIMB 41003의 위장 효과에 악영향을 미치지 않아야 한다. 이는 본 명세서의 실시예 6 및 7에 약술된 바와 같은 적합한 시험관 내 및/또는 생체 내 시험에 의해 결정될 수 있다.
놀랍게도, 본 발명자들은 박테리아 균주 B. longum 35624(NCIMB 41003) 및 B longum 1714®(NCIMB 41676)를 혼입한 조합 생성물이 공급 중단 후에도 놀라운, 지속적이고 긍정적인 효과를 가져온다는 것을 발견하였다.
IBS는 병리 생리학에 관여하는 많은 요소를 갖는다. 위장 및 우울증/불안증 증상 둘 모두는 증상 둘 다에 영향을 미치는 것으로 알려진 기본적인 저등급 염증과 함께 동반-이환(co-morbid)이다(Enck et al. 2016). 이러한 모든 요소를 다루는 것은, 종래 기술이 이들 다른 동반-이환을 완전히 적절하게 다루지 않기 때문에 IBS의 모든 측면을 유리하게 다루게 될 것이다.
35624 균주를 함유하는 조합 생성물을 생성하는 것은 수월하지 않다. 35624는 민감한 균주이고, 다른 균주의 존재를 용인하지 않거나 함께 쉽게 성장하지 않는다. 15개의 상이한 B. longum의 사이토킨 프로파일을 1714TM 균주 및 DPC6315(실시예 6)를 포함하는 PBMC 분석에서 평가하였다. 1714 및 DPC6315 균주는 다음과 같은 이유 때문에 추가 작업을 위해 선택되었다:
35624는 성장 실험에서 1714 및 DPC6315 둘 다를 용인하는 것으로 나타났다(실시예 5).
35624 및 1714의 조합이 인간 IBS 코호트(cohort)에 의해 소비되었을 때, IBS 위장 증상의 조합뿐만 아니라 IBS의 장-뇌 관점을 다루는 놀라운 효과가 있었고, 예상치 못한 새로운 시너지 효과가 관찰되었다(실시예 1-4). IBS 증상은 개선되고, 조절되지 않은 코르티솔 각성 반응(Cortisol Awakening Response)(CAR)은 공급 기간 동안 정상화되지만, 이들 효과는 공급 후 상실되었다. 놀랍게도, 항-불안 효과의 지속성 및 우울증의 개선, 수면 질뿐만 아니라 전-염증성 사이토카인 TNF-α의 감소는 공급이 중단된 후에도 관찰되었다. 35624 균주 단독으로 공급할 때 TNF-α의 감소 후 지속성(개선된 항-염증성 톤)이 관찰되지 않았다(도 11).
또한, 시험관 내 B. longum DPC6315 및 35624의 조합을 추가로 평가하였다(실시예 6). 이 조합은 그의 높은 IL-10 신호를 35624 및 1714와 유사하게 유지한다. 항-염증성 물질을 스크린 하기 위해 정상적으로 사용되는 잘 확립된 동물 모델에서 DPC6315 및 35624의 조합을 조사하였다(실시예 7). 조합에서 시너지 효과가 관찰되지 않았고, 매우 예기치 않게 6315의 존재가 35624의 효과를 상쇄하고, 조합이 단일 균주 35624단독보다 더 악화했다. 따라서, B. longum 균주의 모든 조합이 시험관 내 면역 프로파일 시험에서도 함께 작용할 것이라는 것은 명백하지 않으며, 따라서 미리 35624/1714 조합 시험의 결과를 예측하는 것이 가능하지 않을 것이다.
또한, 비피도박테리움 NCIMB 41003의 단리된 균주 및 균주 NCIMB 41003의 위장 효과에 악영향을 미치지 않는 제2 비피도박테리움 균주의 분리된 균주를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명은 또한 비피도박테리움 NCIMB 41676의 단리된 균주 및 비피도박테리 움 NCIMB 41003의 단리된 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 비피도박테리움 균주 중 적어도 하나는 생존 세포의 형태일 수 있다.
상기 비피도박테리움 균주 중 적어도 하나는 비-생존 세포의 형태일 수 있다.
일부 경우에, 상기 비피도박테리움 균주 NCIMB 41676은 106 cfu 이상의 양으로 조성물에 존재한다. 상기 비피도박테리움 균주 NCIMB 41676은 약 5x108 cfu의 양으로 조성물에 존재할 수 있다.
일부 경우에, 상기 비피도박테리움 균주 NCIMB 41003은 106 cfu 이상의 양으로 조성물에 존재한다. 상기 비피도박테리움 균주 NCIMB 41003은 약 5x108 cfu의 양으로 조성물에 존재할 수 있다.
박테리아 생존 능력은 샘플 내의 배양 가능한 박테리아의 수, 즉 최적 조건하에서 성장할 때 재생할 수 있는 능력을 보유하는 박테리아의 수를 반영한다(생존 세포). 환언하면 생존 능력은 더 큰 박테리아 콜로니(콜로니 형성 단위(CFUs))로 복제할 수 있는 능력을 보유하는 개별 박테리아 세포의 수를 반영한다.
생존 능력은 일반적으로 플레이트-카운팅(plate-counting) 방법을 사용하여 결정되며, 이에 의해 박테리아 샘플이 희석되어 성장을 위해 필요한 영양분을 함유하는 한천 플레이트상에서 배양된다. 이어서, 플레이트상에서 확인된 박테리아 콜로니의 수로부터 생존 능력을 계산한다. 이러한 방법은 문헌[Modern Food Biology 2005 7th edition, James Monroe Jay, Martin J. Loessner, David A. Golden, Springer Science, New York]에 요약되어 있다.
플레이트-카운팅은 생존 능력의 양호한 표시를 제공하지만, 이는 샘플 내의 모든 살아있는 박테리아 세포를 포함하지 않는다.(Kell, Douglas B., et al. 1998).
샘플은 또한 대사적으로 활성으로 남아있지만 플레이트 카운트에 의해 분석시 복제할 수 있는 능력을 상실시켰고, 따라서 살아있음에도 불구하고 CFUs를 형성하지 않는 "생존 가능하지만 비-배양 가능한"(VBNC) 세포를 함유할 것이다. 마지막으로, 샘플은 또한 죽은 세포를 함유할 것이다. 이들 2개 그룹은 "비-생존 세포"로서 함께 그룹화될 수 있다. 따라서, 비-생존 세포는 살아있는 세포, 즉 시험 될 때 복제할 수 있는 능력을 상실한 모든 세포의 반대의 것이다.
생존 세포를 함유하는 모든 샘플은 또한 비-생존 세포를 함유할 것이고, 따라서 생존 세포 배양물의 정의는 CFU 측정을 사용하여 정화된다.
모든 비-생존 샘플은 적어도 VNBCs 및 아마 소량의 생존 세포를 함유할 것이다. 103 CFU/g 생존 세포의 산업 표준 하위 수준 검출 한계는 비-생존 샘플에서 특정 수의 VBNCs/생존 세포의 존재에 의해 야기되는 고유의 공정 가변성을 허용한다.
일부 실시 양태에서, 특정 멸균 식료품 또는 의약과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는, 프로바이오틱 균주의 비-복제 형태가 바람직할 수 있다. 예를 들어, 비피도박테리아 균주의 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 97%, 더욱 바람직하게는 적어도 99%가 조성물에 비-복제될 수 있다.
상기 조성물은 박테리아 브로스(broth)의 형태, 또는 동결 건조된 분말의 형태일 수 있다.
일부 경우에, 상기 조성물은 프리바이오틱 물질을 추가로 포함한다.
일부 경우에, 상기 조성물은 섭취 가능한 담체를 추가로 포함한다.
상기 섭취 가능한 담체는 캡슐, 정제 또는 분말과 같은 약학적 허용 가능한 담체일 수 있다.
상기 섭취 가능한 담체는 산성화된 우유, 요구르트, 동결된 요구르트, 우유 분말,우유 농축물, 치즈 스프레딩, 아이스크림, 드레싱 또는 음료와 같은 식료품일 수 있다.
일부 경우에 상기 조성물은 발효 식료품 또는 발효 유제품의 형태이다.
일부 경우에, 상기 담체는 자연에서 나타나지 않는다.
상기 조성물은 단백질 및/또는 펩타이드, 특히 글루타민/글루탐산염, 지질, 탄수화물, 비타민, 미네랄 및/또는 미량 원소가 풍부한 단백질 및/또는 펩타이드를 포함할 수 있다.
상기 조성물은 보조제를 포함할 수 있다.
상기 조성물은 박테리아 성분을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 약물 개체(drug entity)를 포함할 수 있다.
상기 조성물은 생물학적 화합물을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물을 포함하는 식품을 제공한다.
또한, 본 발명의 조성물을 포함하는 약제가 제공된다.
본 발명은 또한 과민성 대장 증후군(IBS)의 예방 또는 치료에 있어서 비피도 박테리움 NCIMB 41003의 단리된 균주와 함께 비피도박테리움 NCIMB 41676의 단리된 균주의 용도를 제공한다.
상기 조합은:
IBS와 관련된 대장 증상을 변경시키고;
IBS와 관련된 기분을 개선 시키고;
IBS와 관련된 스트레스를 감소시키고;
IBS와 관련된 불안증을 감소시키고;
IBS와 관련된 수면 질을 개선 시키고;
IBS와 관련된 우울증을 치료하는; 및/또는
IBS와 관련된 조절되지 않은 코르티솔 각성 반응을 정상화할 수 있다.
상기 용도는 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
또한, 과민성 대장 증후군(IBS)의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 비피도박 테리움 NCIMB 41676의 단리된 균주 및 비피도박테리움 NCIMB 41003의 단리된 균주를 포함하는 조합 생성물이 제공된다. 이 조합 생성물이 본원에 기재되어 있다.
수면에 대한 효과는 특히 중요하다. 수면 장애는 삶의 임의의 단계에서 관찰된다. 이러한 장애는 전형적으로 수면을 개시 및 유지하는 능력의 감소, 그리고 더 깊고, 더 복원성 수면의 감소된 비율에 의해 특징지어진다. 삶의 질은 이들 교대(alternation)로 고통받는 개인에서 상당하게 손상된다.
유아 수면은 정상적으로 야간에 오랫동안 지속 되는 수면을 갖는 일일주기 리듬을 따르도록 첫 1개월의 삶에 걸쳐 변하고, 유사하게, 수면 상태는 출생시 REM(활동적)과 NREM(편안한) 수면 사이에서, 8월령까지 3분의 1 REM 및 3분의 2 NREM로 동일하게 분포되는 것으로 변화한다. 또한, 유아의 이들 변화를 성공적으로 극복에 대한 어떤 실패는 어린이의 수면 패턴에 대한 지속적인 효과를 가질 수 있다.
유아 및 어린이들의 가장 일반적인 수면 장애는 각성(즉, 취침시 세팅하는 어려움 또는 중단 없이 밤 내내 수면에 실패)과 관련된 것이다. 이들 장애는 24개월 미만 연령 유아의 15 내지 35%에 영향을 미친다는 것이 추정되었다. 유아 및 아동 수면 장애는 필연적으로 부모의 수면 장애 및 스트레스를 초래할 수 있으며, 이는 부적절한 자식-부모 상호작용을 초래할 수 있어, 결국 악순환을 이끄는 유아 및 아동 증상을 악화시킨다.
또한, 삶의 정상 연령의 다른 말기에는 수면 질, 양 및 구조의 변화가 수반된다. 특히, 더 깊고, 더 복원성 NREM 수면의 비율의 감소를 수반하는, 수면을 개시하고 유지하기 위한 건강한 노인의 능력에 측정 가능한 감소가 나타난다.
수면은 특히 노인에서 중요하다. 우리가 노화될 때 발생하는 신체 변화와 함께, 우리의 수면 패턴에 대한 변화는 정상적인 노화 과정의 일부이다. 사람들은 나이가 들 때 그들이 젊었을 때보다 수면에 드는데 더 힘든 시간 및 수면 유지에 더 많은 문제를 갖는 경향이 있다. 수면이 연령에 따라 감소할 필요가 있다는 것은 일반적인 잘못된 개념이다. 사실상, 연구에 따르면 우리의 수면이 성인 전체에 걸쳐 일정하게 유지될 필요가 있다는 것을 입증한다. 수면, "수면 구조(sleep architecture)"의 패턴의 변화는 나이가 들 때 발생하며, 이는 수면 문제의 원인이 될 수 있다. 수면은 꿈도 꾸지 않고 자는 가볍고 깊은 수면 기간 및 간헐적인 능동적 꿈꾸기(dreaming) 기간(REM 수면)을 포함하는 다수의 단계에서 발생한다. 수면 주기는 밤 동안 수회 반복되고, 총수면 시간은 일정하게 유지되는 경향이 있지만, 노인들은 깊은 수면에서보다 더 낮은 수면 단계에서 더 많은 시간을 소비한다.
또한, 많은 더 나이들은 성인은 물론 전부는 아니지만, 하루 동안 수면에 덜 만족하여 더 피곤하다고 전하고 있다. 더 나이들은 미국인의 수면 습관에 대해 연구는 잠드는데 걸리는 시간(수면 잠복기), REM 수면의 전체적인 감소, 및 늙어 감에 따라 수면 분절(fragmentation)(밤 동안 깨워짐)의 증가를 보여준다. 또한, 수면 질환의 이환수는 늙어감에 따라 증가하는 경향이 있다. 노인들 사이의 수면 장애는 부분적으로 신체적 및 정신 질환 및 이들을 치료하는데 사용되는 약물에 기인할 수 있다는 것을 시사한다.
우리가 나이가 들어감에 따라 발생하는 수면 구조의 변화에 부가하여, 수면에 영향을 미치는 다른 요인은 수면을 포함하는 우리의 신체 기능의 타이밍을 조정하는 일주기 리듬(circadian rhythm)이다. 예를 들어, 노인들은 젊은 성인과 비교해 초저녁에 더 졸리고 아침에 더 빨리 깨지는 경향이 있다. 이 패턴을 전진 수면 위상 증후군(advanced sleep phase syndrome)이라 한다. 수면 리듬은 7 또는 8시간의 수면이 여전히 얻어지도록 순방향으로 이동되지만, 개인은 매우 조기에 수면 되기 때문에 매우 조기에 깨워질 것이다. 우리가 나이가 들어감에 따라 수면 및 일주기 리듬의 이러한 변화에 대한 이유는 명확하게 이해되지 않는다.
환경 스트레스 요인은 또한 문제가 될 수 있다. 스트레스에 대한 노출은 수면 및 수면/기상 주기에 부정적인 영향을 미친다. 예를 들어, 낮은 소셜 지원을 갖는 작업-관련 스트레스 요인을 경험하는 것, 또는 외상/전쟁에 대한 노출은 모두 수면 및 수면/기상 주기를 분열할 수 있다.
수면 의약에서의 임상적 시험은 넓은 범위의 수면-기상 문제를 커버 하며, 따라서 수면 의학 임상 시험에서 결과 측정의 선택은 시험 중인 특정 질환에 맞추어질 필요가 있다. 조사자는 생리학적 시험에 비해 자기-보고(self-report) 설문지를 선택하는 상대적인 장점을 고려할 필요가 있다. 놀랍게도, 자기-보고 측정은 종종 더 고가의 생리학적 시험과 비교하여 치료 효과에 더욱 민감하다.
일부 경우에, 조합 생성물은 개 또는 고양이와 같은 반려동물에 의한 섭취에 적합한 조성물로 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 탄수화물 공급원, 단백질 공급원 및 지질 공급원 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있는 건조 애완동물 먹이이다.
본 발명은 단지 실시예로 주어지고, 도면이 아래와 같은, 다음의 상세한 설명으로부터 더 명확하게 이해될 것이다.
도 1은 오픈 라벨 콤보(open label combo) IBS 연구 개략도이다.
도 2는 콤보 처리 전 및 후의 IBS 환자에 대한 IBS 증상 중증도 스케일(IBS-SSS)의 그래프이다.
도 3(a) 내지 (e)는 콤보 처리 전 및 후의 IBS 환자에 대한 IBS-SSS 개별 증상(복부 통증(a) 불편 및 (b) 빈도, (c)복부 팽창, (d)장 만족 및 (e)IBS 삶의 질)의 그래프이다.
도 4(a) 내지 (c)는 콤보 처리 전 및 후의 IBS 환자(변비(a), 혼합(b) 및 설사(c))에 대한 IBS 증상 중증도 스케일(IBS-SSS)의 그래프이다.
도 5(a) 내지 (c)는 콤보 처리 전 및 후의 IBS 환자((a) 중간에서 중증, (b) 중간 및 (c) 중증)에 대한 IBS 증상 중증도 스케일(IBS-SSS)의 그래프 세트이다.
도 6(a) 및 (b)는 콤보 처리 전 및 후의 IBS 환자에 대한 (a) HADS 우울증 및 (b) HADS 불안증 점수의 그래프이다.
도 7(a) 및 (b)는 (a) IBS 증상 중증도 스케일 대 HADS 우울증 및 (b) IBS 증상 중증도 스케일 대 HADS 불안증 사이의 상관관계의 도표이다.
도 8(a) 및 도 8(b)는 콤보 처리 전 및 후와 비교하여 Bif35624 단독 전 및 후의 IBS 환자에 대한 HADS 우울증의 % 감소의 막대 차트이다.
도 9(a) 및 (b)는 콤보 처리 전 및 후와 비교하여 Bif35624 단독 전 및 후의 IBS 환자에 대한 HADS 불안증 및 우울증 점수의 퍼센트 감소의 막대 차트이다.
도 10(a) 및 (b)는 콤보 처리 전 및 후의 건강한 대 IBS 환자 및 IBS 환자에 대한 혈장 TNF 수준의 도표이다.
도 11은 Bif35624 처리 전 및 후의 IBS 환자에 대한 혈장 TNF 수준의 도표이다.
도 12는 콤보 처리 전 및 후의 IBS 환자(a) 및 IBS 환자(5 초월 PSQI)(b)에 대한 전체 PSQI 점수의 도표이다.
도 13은 콤보 처리 전 및 후의 IBS 환자(a) 및 IBS 환자(5 초월 PSQI)(b)에 대한 주관적인 수면(subjective sleep) 잠복기의 도표이다.
도 14는 콤보 처리 전 및 후의 IBS 환자에 대한 주관적인 수면 질의 도표(a) 및 표(b)이다.
도 15는 콤보 처리 전 및 후의 IBS 환자(5 초월 PSQI)에 대한 주관적인 수면 질의 도표(a) 및 표(b)이다.
도 16은 건강한 대조군 대 IBS 환자에 대한 타액 코르티솔(AUCi)의 막대그래프이다.
도 17은 콤보 처리 전 및 후의 IBS 환자에 대한 타액 코르티솔(AUCi)의 도표이다.
도 18(a) 및 (b)는 단독으로 또는 1714 또는 DPC6315와 조합하여 35624의 하룻밤 동안의 배양물의 챠트이다.
도 19는 시험관 내에서 Bif35624, AH1714 및 DPC6315로 자극된 PBMC로부터의 IL-10/IL-12 비의 도표이다.
도 20은 시험관 내에서 Bif35624, 또는 DPC6315 또는 이들의 조합으로 자극된 PBMC로부터의 IL-10 수준의 도표이다.
도 21(a) 및 (b)는 Bif35624, DPC6315 또는 이들의 조합으로 공급한 후 임상적 관절염 점수(Clinical Arthritis Score)-모든 발(paw)(점수 0-5)의 그래프이다.
도 22는 Bif35624, DPC6315 또는 이들의 조합으로 공급한 후 시간에 따른 발생 빈도 퍼센트의 도표이다.
도 1은 오픈 라벨 콤보(open label combo) IBS 연구 개략도이다.
도 2는 콤보 처리 전 및 후의 IBS 환자에 대한 IBS 증상 중증도 스케일(IBS-SSS)의 그래프이다.
도 3(a) 내지 (e)는 콤보 처리 전 및 후의 IBS 환자에 대한 IBS-SSS 개별 증상(복부 통증(a) 불편 및 (b) 빈도, (c)복부 팽창, (d)장 만족 및 (e)IBS 삶의 질)의 그래프이다.
도 4(a) 내지 (c)는 콤보 처리 전 및 후의 IBS 환자(변비(a), 혼합(b) 및 설사(c))에 대한 IBS 증상 중증도 스케일(IBS-SSS)의 그래프이다.
도 5(a) 내지 (c)는 콤보 처리 전 및 후의 IBS 환자((a) 중간에서 중증, (b) 중간 및 (c) 중증)에 대한 IBS 증상 중증도 스케일(IBS-SSS)의 그래프 세트이다.
도 6(a) 및 (b)는 콤보 처리 전 및 후의 IBS 환자에 대한 (a) HADS 우울증 및 (b) HADS 불안증 점수의 그래프이다.
도 7(a) 및 (b)는 (a) IBS 증상 중증도 스케일 대 HADS 우울증 및 (b) IBS 증상 중증도 스케일 대 HADS 불안증 사이의 상관관계의 도표이다.
도 8(a) 및 도 8(b)는 콤보 처리 전 및 후와 비교하여 Bif35624 단독 전 및 후의 IBS 환자에 대한 HADS 우울증의 % 감소의 막대 차트이다.
도 9(a) 및 (b)는 콤보 처리 전 및 후와 비교하여 Bif35624 단독 전 및 후의 IBS 환자에 대한 HADS 불안증 및 우울증 점수의 퍼센트 감소의 막대 차트이다.
도 10(a) 및 (b)는 콤보 처리 전 및 후의 건강한 대 IBS 환자 및 IBS 환자에 대한 혈장 TNF 수준의 도표이다.
도 11은 Bif35624 처리 전 및 후의 IBS 환자에 대한 혈장 TNF 수준의 도표이다.
도 12는 콤보 처리 전 및 후의 IBS 환자(a) 및 IBS 환자(5 초월 PSQI)(b)에 대한 전체 PSQI 점수의 도표이다.
도 13은 콤보 처리 전 및 후의 IBS 환자(a) 및 IBS 환자(5 초월 PSQI)(b)에 대한 주관적인 수면(subjective sleep) 잠복기의 도표이다.
도 14는 콤보 처리 전 및 후의 IBS 환자에 대한 주관적인 수면 질의 도표(a) 및 표(b)이다.
도 15는 콤보 처리 전 및 후의 IBS 환자(5 초월 PSQI)에 대한 주관적인 수면 질의 도표(a) 및 표(b)이다.
도 16은 건강한 대조군 대 IBS 환자에 대한 타액 코르티솔(AUCi)의 막대그래프이다.
도 17은 콤보 처리 전 및 후의 IBS 환자에 대한 타액 코르티솔(AUCi)의 도표이다.
도 18(a) 및 (b)는 단독으로 또는 1714 또는 DPC6315와 조합하여 35624의 하룻밤 동안의 배양물의 챠트이다.
도 19는 시험관 내에서 Bif35624, AH1714 및 DPC6315로 자극된 PBMC로부터의 IL-10/IL-12 비의 도표이다.
도 20은 시험관 내에서 Bif35624, 또는 DPC6315 또는 이들의 조합으로 자극된 PBMC로부터의 IL-10 수준의 도표이다.
도 21(a) 및 (b)는 Bif35624, DPC6315 또는 이들의 조합으로 공급한 후 임상적 관절염 점수(Clinical Arthritis Score)-모든 발(paw)(점수 0-5)의 그래프이다.
도 22는 Bif35624, DPC6315 또는 이들의 조합으로 공급한 후 시간에 따른 발생 빈도 퍼센트의 도표이다.
비피도박테리움 롱검 균주 UCC35624의 기탁이 영국, 스코틀랜드, AB21 9YA, 벅스번, 에버든, 크래입스톤 에스테이트, 퍼거슨 빌딩(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland, UK)의 National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB)에 1999년 1월 13일에 이루어졌고 기탁 번호 NCIMB 41003를 부여받았다.
비피도박테리움 롱검 균주 UCC35624는 절제되어 세척된 사람 위장관으로부터 분리되었다. 이 균주는 WO00/42168A에 기재되어 있으며, 그 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
B. longum 35624는 광범위하게 연구되어 염증 반응을 조절하는 것으로 나타났으며(Groeger et al., 2013, Konieczna et al., 2012), 2개의 잘-제어된 임상 연구에서 IBS 피험자에서 복부 통증, 팽창, 가스 및 예측할 수 없는 배변 습관을 감소시킨다(O'Mahony et al., 2005, Whorwell et al., 2006).
비피도박테리움 롱검 균주 AH1714의 기탁이 영국, 스코틀랜드, AB21 9YA, 벅스번, 에버든, 크래입스톤 에스테이트, 퍼거슨 빌딩(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland, UK)의 National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB)에 2009년 11월 5일에 이루어졌고 기탁 번호 NCIMB 41676를 부여받았다.
비피도박테리움 롱검 균주 AH1714는 건강한 인간 피험자로부터의 결장 생검 조직으로부터 분리되었다. 이 균주는 WO2011/058535A에 기재되어 있으며, 그 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
B. longum 1714 균주는 불안증 및 스트레스를 감쇠하고 전임상 및 임상 연구에서 인지를 개선 시키는 것으로 나타났다(Allen et al., 2016, Savignac et al., 2014, Savignac et al., 2015).
실시예
하기 실시예는 본 발명의 범위 내의 실시 양태를 추가로 기술하고 설명한다. 실시예는 단지 예시를 위한 것이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되며, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 많은 변형이 가능하다.
조성물
(Formulation)
균주는 환자 순응성을 보장하기 위해 바람직한 단일 조성물로 투여될 수 있다. 그러나 일부 경우에, 균주는 동일하거나 상이한 시간에 투여될 수 있고, 투여를 위해 동일하거나 상이한 경로를 사용할 수 있다.
상기 균주는 원하는 결과를 달성하기 위해 임의의 적합한 양으로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 동일한 양의 균주가 투여된다.
바람직하게는, 균주는 균주 당 하루에 적어도 l06 cfu의 투여량으로, 바람직하게는 균주 당 하루에 5x108 cfu 내지 1x109 cfu의 표적 용량으로 투여된다.
균주는 식용 부형제와 혼합되고, 사쉐(sachet) 또는 캡슐과 같은 형태에 채워지는 동결 건조된 분말의 형태이다.
5x108 CFU B. longum 35624 및 1x109 CFU B. longum 1714를 포함하는 동결 건조된 분말을 제조하였다. 균주는 데만(de Man), 로고사(Rogosa) 및 샤프 배지(Sharpe medium)(제1원리(first principles))에서 배양되었다. 각 균주의 원심분리 후 수집된 미립자를 세척하고, 이어서 동결 건조시켰다.
실시예
1-오픈 라벨 과민성 대장 증후군(IBS) 연구: 조합
B.
lonsum
생성물은 성인에서의 IBS 증상의 감소를 나타낸다(콤보)
과민성 대장 증후군(IBS)을 갖는 성인에서의 장 증상에 대한 B. longum 35624 및 B. longum 1714의 조합의 효과를 조사하기 위해 다음과 같이 인간 시험을 수행하였다. 이 작업은 오픈 라벨 연구로 구성된다. 장 증상은 통증, 팽만, 장 기능장애 및 삶의 질(글로벌 웰빙)을 포함하는 IBS 증상 중증도 스케일(IBS-SSS)과 같은 자기-보고 측정치를 사용하여 측정하였다. IBS-SSS는 온화, 중간 또는 중증으로 이전에 분류된 환자를 신뢰성 있게 점수를 매기는 능력에 대해 인정된다. 달성 가능한 최대 점수는 500이었다. 환자들의 더 균질한 그룹(온화, 중간 및 중증 경우)의 모집은 각각 75 내지 175, 175 내지 300 및 300 이상의 점수에 의해 표시되었다. 75 미만의 점수가 매겨진 대조군 및 이 범위에서 점수가 매겨지는 환자는 또한 차도가 있을 수 있다. ≥ 50의 IBS-SSS는 증상 중증도에서 임상적으로 중요한 변화로서 정의되었다(Francis et al., 1997). 이러한 스케일은 IBS에 의해 제공되는 많은 도전을 충족시키는데 도움을 주는 가치있는 도구를 제공한다.
이 시험을 위한 임상 프로토콜은 다음과 같았다:
18-55세 40명의 여성 피험자를 IBS로 모집하고, Rome III 기준에 의해 진단하고, 병원 불안 및 우울증 척도(Hospital Anxiety and Depression scale)(HADs)에 의해 밝혀진 바와 같이 온화에서 중간 불안증 및/또는 우울증 이였다. 불안증 또는 우울증 이외의 정신의학적 진단, 중대한 염증성 장애로 진단받거나 또는 항우울제, 항불안제 또는 항정신병제가 지난 6개월 내에 복용 중인 피험자는 배제되었다.
IBS-
SSS
스케일에 의해 측정된 IBS 증상에 대한
콤보
시험 결과
IBS 증상은 IBS-증상 중증도 스케일(IBS-SSS)에 의해 평가되었다. 이것은 8주 동안 5x108 CFU B. longum 35624 및 5x108 CFU B. longum 1714(콤보)를 포함하는 동결 건조된 분말을 사용한 오픈 라벨 연구이고, 이어서 8주 세척하였다(도 1) IBS-SSS는 0, 4, 8, 12 및 16주에서 측정되었다.
IBS-SSS 점수는 콤보 그룹에서 100±112.5의 평균±SD에 의해 기준선으로부터 개입(8주)의 끝까지 상당히 개선되었다. 그러나 일단 공급이 중단되면, IBS-SSS 는 다시 그리고 단지 기준선으로부터 35±97 개선을 가지는 16주(공급 후 8주)까지 개선되지 않는다. 임상적으로 중요한 차이는 ≥ 50의 IBS-SSS의 변화로 설명되었다(도 2). 본 발명자들이 IBS-SSS 점수를 구성하는 모든 개별적인 증상을 분석하였을 때, 콤보 처리는 복부 통증 불편, 복부 통증 빈도, 복부 팽창, 장 만족 및 IBS 삶의 질, 모든 프로바이오틱에 대해 동일하지 않은 결과를 포함하는 모든 증상을 개선 시켰다(도 3(a)-(e)). 콤보 생성물은 변비, 설사 및 혼합 환자를 포함하는 IBS 환자의 모든 서브타입에 이익이 된다(도 4(a)-(c)). 콤보 생성물은 공급시 가장 중증 환자들에도 영향을 미치지만, 그 조합이 더 이상 소비되지 않으면 증상은 복귀하기 시작한다(도 5(a)-(c)).
정상적으로 무작위 이중-맹검 위약-대조 연구는 임상 의학에서 최첨단이지만, 오픈 라벨 연구를 사용하여, 이월 효과를 추정하는 유용한 정보를 제공, 세척 기간을 결정, 피험자 특성 및 측정된 파라미터의 변화뿐만 아니라 이 조합 생성물의 치료 가능성을 나타내는 신뢰성 있는 데이터를 제공할 수 있었다.
IBS-
HADs
스케일에 의해 측정된 IBS 증상에 대한
콤보
시험 결과
콤보 시험에 있어서, 0, 4, 8, 12 및 16주에서 병원 불안 및 우울증 스케일(HADs)이라 불리는 검증된 설문지를 사용하여 불안증 및 우울증을 측정하였다. 본 발명자들은 B. longum 1714와 조합하여 B. longum 35624가 IBS에서 우울증 및 불안증 증상을 감소시키는 데 있어 IBS에서 매우 효과적이라는 것을 발견하였다. 콤보 그룹에서 평균±SD의 -l.6±3.l22에 의해 기준선에서부터 개입(8주)의 끝까지 유의하게 HADs 우울증 점수를 개선 시켰다. 놀랍게도, 일단 공급이 중단되면 12주(-2.0±2.63; 평균±SD)에서 추가로 HADs 우울증 점수를 개선 시켰고, 16주(-l.75±3.386; 평균±SD)(공급 후 8주)까지 이러한 개선을 유지하였다(도 6(a)). HADs 우울증 점수는 콤보 그룹에서 -1.375±3.012의 평균±SD에 의해 기준선에서부터 개입(8주)의 끝까지 상당히 개선되었다. 놀랍게도, 일단 공급이 중단되면, HADs 불안 점수는 또한 12주(-2.275±3.637; 평균±SD)에서 추가로 개선되고, 참가자가 콤보 생성물의 섭취를 중단한 후 8주인, 16주(-2.3±2.98; 평균±SD)에서 이러한 개선을 유지하였다(도 6(b)). 임상적으로 중요한 차이는 ≥ 2의 HADs 개선으로 기재되어 있다.
콤보
연구에서 IBS 환자에서
HADS
점수와 증상 중증도 점수 사이의 베이스라인에서 상관관계가
없다
IBS는 장-뇌 질환이다. 불안증 및 우울증은 IBS를 갖는 환자 중에서 동반-이환과 통상 접하게 된다는 것으로 인식되었다. 그러나 이들 동반-이환의 정확한 성질 및 IBS에서 이들의 연관성이 거의 알려져 있지 않다. 목적은 IBS와 이러한 정신의학적 동반-이환 간의 관계를, 이들이 의존적인지 또는 독립적인 보조 인자였는지를 알기 위해 상승된 불안증 및 우울증을 갖는 IBS 그룹에서 특성화하는 것이었다. 이는 실시예 1에 기재된 바와 같이 조합 연구의 베이스라인 결과를 이용하여 평가되었다.
중간 IBS-SSS 점수는 250(IQR:190-315) 이었지만, HADs 불안증 점수 및 HADs 우울증 점수는 각각 l0.43±2.3 및 5.48±3.69이었다. 40명의 피험자 중 95% 및 45%는 각각 HADs 불안증 또는 > 8의 우울증 점수를 가졌으며, 38%는 HADs 불안증 및 > 8의 HADs 우울증 점수를 모두 가졌다. IBS-SSS와 HADs 우울증 및 HADs 불안증 점수의 상관 분석은 HADs 우울증 점수(R2=0.3246; P=0.001)에 대한 약한 상관관계를 나타냈지만, HADs 불안증 점수(R2=0.3647; P=0.2378)에 대한 상관관계는 없었다(도 7(a)-(b)). 불안증 및 우울증의 온화에서 중간 수준을 갖는 IBS 피험자의 그룹에 대해, IBS의 중증도 및 불안증 및 우울증 수준 사이에서 약하거나 상관관계가 없다는 것이 관찰되었다. 이들 결과는 IBS 및 동반-이환 불안증/우울증이 독립적인 요인이며, 조합 35624/1714 생성물에 사용된 바와 같은 별도의 관리 접근법을 요구할 수 있다 것을 시사한다. 이 가설을 심문하기 위해, 조합 시험의 결과는 35624 균주 단독을 사용하여 수집된 데이터를 참조하여 평가하였다.
콤보
또는
35624 단독의
효과의 비교는 IBS 환자의
HADS
점수에
의존한다
콤보 생성물은 기분(불안증 및 우울증 감소)을 개선하는데 임상적으로 중요한 효과를 가졌고, 놀랍게도, 참가자들이 콤보 생성물을 취하지 않는 8주 기간 동안 불안증 및 우울증에 대한 효과가 지속되었다. 따라서, 우리의 결과를 B. longum 35624 단독으로 처리된 IBS 환자에서 수행된 이전 연구와 비교하는 것이 흥미로웠다(Whorwell et al 2006). 이 연구는 모든 유형의 IBS 환자가 동반-이환 불안증/우울증을 가졌는지 여부와는 상관없이 시험으로 받아들여진 무작위 이중-맹검 위약 대조 멀티센터 시험(randomized double-blind placebo controlled multientre trial)이었다. 단일 균주 B. longum 35624에 의한 위약 효과에 대한 HADs 점수에 대한 효과는 없었다. 피험자는 일단 공급이 중단되면 사라지는 HADs 점수의 중증도의 일시적인 감소를 가졌다(도 8(a) 및 도 9(a)). 이것은 공급 후 나타나는 HADs 점수에 대한 현저한 효과가 증가 되는 콤보 생성물과 차이가 있으며, 그 효과는 공급 중단 후 8주간 유지된다(도 8(b) 및 도 9(b)).
실시예
2-IBS 환자에서 혈장
TNF
-a 수준의
1714
TM
균주와 조합 또는 35624®균주 단독의 공급의 효과
콤보 생성물을 IBS 환자에게 공급한 후, IBS와 함께 불안증 및 우울증의 감소가 있었으며, 이들 효과는 공급의 중지 후 유지하였다. 또한, 연구 참가자의 염증성 톤의 변화가 있었는지를 결정하기 위해, 혈장 바이오마커 종양 괴사 인자(TNF)-α를 측정하였다. 최근 연구에서, TNF-α 혈청 수준은 IBS 환자에서 불편함 및 증상의 중증도와 상관되었다(Choghakhori et al 2017). 몇몇 다른 연구들은 IBS 환자들이 건강한 대조군과 비교하여 혈청에서 더 높은 수준의 TNF-α를 갖는다는 것을 입증하였다(Rana et al 2012; seyedmizaee et al 2016; Schmulson et al 2012). 또한, 케이스-대조 시험에서, 저자들은 종양 괴사 인자-α를 포함하는 사이토카인의 비정상적인 수준이 IBS의 증상과 유의하게 상관되었고, 우울성 및 불안증 기분 증상의 중증도에 유의하게 상관되었다는 것을 실증하였다(Zhen et al 2018).
본 발명자들은 0, 4, 8, 12 및 16주에서 IBS를 갖는 성인에서의 염증성 마커 TNF-α에 대한 B. longum 35624 및 B. longum 1714의 조합의 효과를 조사하였다.
그 결과는 불안증 및 우울증으로 동반-이환되고, 8주 동안 생성물을 유사하게 소비한 IBS를 갖는 환자에서 B. longum 35624 단독의 효과를 연구하기 위해 착수된 다른 임상 시험과 비교되었다. 이 연구를 위해, 4주 세척 기간이 있었다. 시험군은 다음과 같았다: 위약(n=3l) 및 비피도박테리움 롱검 35624(1Х1010 cfu)(n=39).
혈장 샘플을 말초 혈액으로부터 수집하고 분석할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 혈장 내 TNF-α는 메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery) (Gaithersburg, MD; catalog K15008B-1)로부터의 96-웰 분석 키트를 사용하여 분석되었고, 정량되어 밀리리터당 피코그램에서 베이스라인으로부터의 변화로서 보고되었다. 각 샘플을 이중으로 분석하였다.
이전 보고와 일치하여, 본 발명자들은 또한 건강한 대조군과 비교하여 IBS 환자에서 혈장 TNF-α의 상당한 증가를 발견하였다(도 10(a)). 콤보 생성물은 IBS 코호트에서 시간에 따라 상당히 감소된 혈장 TNF-α를 감소시켰다. 다시, 본 발명자들이 HADs 점수로 보았던 것과 유사하게, 공급 후 연장된(8주) 개선, 즉 공급이 중단된 후에도 TNF-α의 감소가 있었다(도 10(b)). IBS 환자들이 B. longum 35624 단독으로 공급받았던 이전의 연구에서는, 8주 동안의 공급 기간 동안 위약과 비교하여 혈장 TNF-α의 현저한 감소가 있었으나, 혈장 TNF-α 수준을 공급한 후 4주 후는 증가하고 베이스라인 수준으로 돌아왔다(도 11). 이것은 B. longum 35624와 B. longum 1714의 조합 사이의 시너지를 다시 강조하며, 여기서 공급이 중단된 후에 연장된 개선을 얻는다. 비교에서, B. longum 35624는 일단 공급이 중단되면 항염증 효과를 상실한다.
실시예
3-피츠버그 수면 질 지수에 의해 측정된 수면 질에 대한 시험
결과
IBS 환자의 수면 질은 피츠버그 수면 질 지수(PSQI)에 의해 평가되었다. 이는 'COMBO'(5xl08 CFU/day B. longum 35624 + 1xl09 CFU/day B. longum 1714), 말토덱스트린을 갖는 사쉐(sachet) 형태 및 이산화규소와 같은 유동화제로 8주 동안 취하고, 이어서 8주 세척을 하는 오픈 라벨 연구였다(도 1).
PSQI는 0, 4, 8, 12 및 16주에서 측정하였다. 수면 질은 수용 가능한 신뢰성 및 유효성을 갖기 때문에 임상 개체군에서 지난달에 걸쳐 수면 질 및 장애를 측정하도록 설계된 변형된 PSQI를 통해 평가되었다(Buysse et al., 1989). PSQI는 7개의 도메인: (1) 수면 지속, (2) 수면 장애, (3) 수면 잠복기, (4) 졸음에 기인하는 주간 기능장애, (5) 수면 효율, (6) 전체 수면 질, 및 (7) 수면 약물 사용들에 걸친 수면 질을 평가하는 19-항목 자기-보고 측정치이다. 각각의 수면 구성성분은 0 내지 3 범위의 점수를 산출하며, 3은 가장 큰 기능장애를 나타낸다. 수면 구성성분 점수는 더 나쁜 수면 질을 나타내는 더 높은 총 점수(전체 점수로 지칭됨)와 함께 0 내지 21 범위의 총 점수를 산출하도록 합산된다. 양호한 수면 자 및 불량한 수면 자를 구별하는 데 있어서, 전체 PSQI 점수 > 5는 89.6%의 민감성(sensitivity) 및 86.5%의 특이성(specificity)을 산출한다(Buysse et al., 1991; Herman et al., 2002; Fillingim et al., 2011, Porto et al., 2011). 본 발명자들은 수면 질이 불량한 IBS 환자들의 부분 개체군(subpopulation)을 찾기 위해 이 > 5 전체 PSQI 컷오프(cut off)를 사용하였다. 주관적인 수면 질은 다음과 같이 채점되었다: '매우 양호(very good)'(0,) '상당히 양호(fairly good)'(1),'상당히 불량(fairly bad)'(2) '매우 불량(very bad)'(3).
콤보 생성물의 매일 섭취는 4주 및 8주에서 PSQI 전체 점수를 상당히 감소시켰다(도 12(a)). PSQI 전체 점수의 감소는 수면 질의 개선을 나타낸다. 불량한 수면 질(> 5 전체 PSQI)을 갖는 우리의 IBS 환자의 서브 그룹을 볼 때, 콤보는 심지어 공급 후조차도 모든 시점에서 PSQI 전체 점수를 상당히 감소시켰다(도 12(b)). 7개의 구성요소 점수(수면 장애, 전체 수면 질, 수면 잠복기(잠드는 시간), 수면 지속, 졸음에 기인하는 주간 기능장애, 수면 효율, 및 수면에 대한 의약의 필요성)의 합이다. 그 중, 콤보는 4주 및 8주째 및 공급 후 8주째에서 PSQT-수면 잠복기 점수를 상당히 감소시켰다(도 13(a)). 다시, 우리가 "불량한 수면 자들"의 부분 개체군을 검토해 볼 때, 공급 후 8주째에서 PSQT-수면 잠복기의 감소를 보았다(도 13(b)). 또 다른 주목할 만한 결과는 피험자가 '지난달 동안, 당신의 전체의 수면 질을 어떻게 평가하는가?) 질문받았을 때, 그 결과는 콤보 생성물의 투여가 PSQI 전체 점수와 일치하여 수면 질이 상당히 개선되었다는 것을 보여주었다. 주관적인 수면 질 점수는 콤보 그룹에서 베이스라인으로부터 개입(8주)의 말까지 개선되고, 공급이 중단된 후(16주) 그 효과를 유지하였다(도 14(a)). 상이한 카테고리의 수면 자들의 백분율을 검토해 볼 때, 콤보 치료는 그들의 수면을 '양호'로 설명하는 환자들의 수를 증가시켰고, '상당히 불량' 수면을 갖는 피험자들의 수를 감소시키고, 이는 공급이 중단된 후에도 유지된다(도 14(b)). 또한, 본 발명자들은 베이스라인에서 '불량' 수면을 가지는 것으로 보고한 IBS 환자의 서브 그룹을 분석하였고, 이는 5보다 큰 PSQI 전체 점수에 반영되었다. 이 그룹(5 넘는 전체 PSQI 점수)에서 베이스라인으로부터 개입(8주) 말까지 주관적 수면 질 점수는 개선되었고, 공급이 중단된 후(16주) 그 효과를 유지하였다(도 15(a)). 상이한 카테고리의 수면 자들의 백분율을 검토해 볼 때, 콤보 치료는 그들의 수면을 '상당히 양호'로 설명하는 환자들의 수를 증가시켰고, '상당히 불량' 수면을 갖는 피험자들의 수를 감소시키고, 이는 공급이 중단된 후에도 유지된다(도 15(b)). 수면 질에 대한 콤보 생성물의 유익한 효과는 건강 증진에 대한 이러한 균주 조합의 잠재적인 이점을 나타낸다.
이 IBS 연구에서, 40명 환자 중 33명은 5 넘는 전체 PSQI 점수를 가졌으며, 그래서 IBS 환자가 불량한 수면 질을 갖는 것을 나타내는 문헌과 일치하는 불량한 수면 자들로 특징지어졌다. 콤보 투여 후, 이들 IBS 환자에서 PSQI에 의해 측정된 바와 같이 수면 질에 상당한 개선이 있었고, 이러한 효과는 콤보 투여 후 8주 동안 유지된다. 이들 결과는 IBS 증상과 불량한 수면 질 사이의 상호작용이 있기 때문에 공급 중지 후 8주 유지되는 효과가 있는 HADs 점수에 의해 알 수 있는 것과 일치한다.
실시예
4-IBS 환자에서 타액 코르티솔에 대한 1714 균주와 조합하여 35624 균주의 공급의 효과
오픈 라벨 시험의 일부로서(실시예 1에 기재된 바와 같이), 0, 4, 8, 12 및 16주에서 IBS를 갖는 성인에서의 스트레스 호르몬 코르티솔에 대한 B. longum 35624 및 1714 균주의 조합의 효과를 조사하였다. 타액 코르티솔 및 코르티솔 각성 반응은 비-침습적(non-invasive)이고, 수행하기에 용이하고, HPA 축 기능을 평가하기 위한 잘 입증된 방법이다. 타액 코르티솔이 일주기이기 때문에, 우리는 4개의 상이한 시점(15분, 30분, 45분, 60분)에서 코르티솔을 각성하는 것을 측정한다. 아침 코르티솔의 동적 상승은 보통 하루 중 나머지에 걸쳐 점진적으로 떨어지기 전에 각성 후 30-45분 이내에 일어난다. 이는 코르티솔 각성 반응(CAR)으로 알려져 있다. 정상 CAR 반응은 30분에서 짧은 수명의 피크를 특징으로 한다. IBS 환자에서, 이러한 동적 반응은 각성에 대한 코르티솔 수준의 변화가 거의 없거나 전혀 없이 둔화된다. 이것은 CAR 반응에서 "소진(exhaustion)" 또는 네거티브 피드백 루프를 비롯한, IBS 질환과 관련된 만성적인 스트레스 요인으로 인한 것으로 가설된다. CAR 반응의 정규화는 피험자의 뇌-장 축의 정상적인 작업에서 IBS의 영향에서의 유익한 감소를 나타낼 수 있다.
타액 샘플의 위생적 수거를 위해 Salivette 스웝(swab)을 사용 후 샘플을 분석할 때까지 -80℃에서 냉동보관했다. Salivette 샘플링 장치는 환자들이 2분 동안 씹고 난 후, 장치의 플라스틱 튜브로 이전되는 면 스웝으로 구성된다. 환자가 섭식, 흡연, 차 또는 커피 음용, 또는 샘플링에 앞서 15분 동안 칫솔질하는 것을 억제하도록 지시되고, 24시간 선행 샘플 수집에서는 치과 작업이 허용되지 않는다. 타액 샘플은 연구실에 전달될 때까지 실온에서 또는 참석자의 가정용 냉장고 또는 냉동고에 보관될 수 있다. 코르티솔 농도는 제조자의 지시에 따라 코르티솔 효소 면역분석 키트를 사용하여 측정하였다(Enzo Life Sciences, UK). 분석 검출 한계는 0.16 nmol/l이었다. 측정법 내 및 측정법 간 변동 계수(Inter- and intra-assay coefficients of variation)(CVs)는 각각 11.24% 및 8.2%였다.
문헌으로부터 IBS를 갖는 피험자는 각성시 높은 코르티솔 수준 및 둔화된 CAR을 나타내고, 즉 각성 후 30분에서 코르티솔의 최소 또는 전혀 증가하지 않았고, 따라서 60분에서 후속적인 감소를 나타내지 않았다. CAR에 대한 개입의 효과를 가장 잘 시각화하기 위해, "곡선 아래 영역(area under the curve)"(AUCi)의 증가가 그래프화 및 계산된다. AUCi는 시간 0 내지 시간 60분의 반응 곡선 아래에서 측정될 수 있는 영역이다. 이는 제1 값을 참조하여 계산되어 시간에 따른 변화를 강조한다.
IBS 환자들은 건강한 대조군과 비교하여 IBS 피험자에서 기본 아침 타액 코르티솔 수준에 대한 더 낮은 AUCi를 초래하는 아침에 기상할 때 코르티솔 생산에서 둔화된 증가를 갖는다(도 16). 이 그래프는 간행물 Suarez-Hitz et al. 2012.에 제공된 데이터로부터 재생성되었다.
B. longum 35624 및 B. longum 1714(콤보)의 조합의 사용은 각성 코티솔의 생성에 대한 정상 효과를 가졌고, IBS의 중간 및 중증 증상을 갖는 성인에서의 기상 후 30분에서 일시적인 증가를 유도하였다. AUCi(n=33)를 0주, 4주, 8주, 12주 및 16주째에 측정하였을 때, AUCi는 증가하였으며, 이는 공급 동안 IBS 피험자에서 CAR 반응의 둔화의 역전을 나타낸다. 이 효과는 다음 8주간 후-공급(9-16주)에 걸쳐 손실되었다(도 17). 따라서, 콤보의 공급은 조절되지 않은 코르티솔 각성 반응을 정상화하였다. 이러한 효과는 수면 질, 불안증 및 우울증에 대한 효과와는 달리, 공급 후에 유지되지 않았다. 본 발명자가 아는 바로는 이러한 유익한 방식으로 IBS 피험자에서 CAR를 변화시키는 프로바이오틱 또는 프로바이오틱 조합이 발견되지 않았다.
실시예
5-시험관 내에서의 균주 호환성(compatibility)의 예시:
35624 단독
으로 또는
1714
TM
균주 또는
DPC6315
균주, 또는
DPC6315
균주와 조합의 하룻밤 배양
인간 시험을 수행하기 전에, 2회의 공동-배양 실험을 수행하여 성장 실험에서 다른 B. longum DPC6315 또는 1714 균주와 B. longum 35624의 조합의 효과를 조사하였다. 35624 균주를 성장시키는 모든 과거 경험은 신중한 관리를 필요로 하는 민감한 균주라는 것을 나타내었다. B. longum DPC6315는 시험관 내 실험에서 항염증을 위해 선택되었다(실시예 6).
AH174/35624 및 DPC6315/35624는 모든 100ml 배양물에 접종하기 위해 정확한 동일한 세포 수를 사용하여, 100ml 스케일로 공동 배양되었다. OD-표준화된 접종을 100ml 알레르겐 유리 배지(Allergan Free Medium), 4.5% 수크로스, 0.05% 시스테인(모든 균주에 대해 사용됨)에 첨가하였다. 단독 균주 대 조합에서의 균주의 배양은 37℃에서 24시간 동안 수행하였다. 이 실험의 결과는 이들 균주의 공동-배양 능력의 더 나은 표시를 제공하였다. 35624의 리팜피신 내성 변이체를 사용하여 수확시 균주의 검출을 가능하게 하였다. 이러한 변이는 리팜피신 항생제 내성 유전자의 점 돌연변이로 이루어진다. 35624를 배양하고 리팜피신 함유 한천 배지상에서 생존가능한 카운팅을 수행하여 배양 실험에서 35624의 정확한 세포 수를 얻었다.
AH174/35624 공동-배양 실험: 어느 쪽 균주의 주요 억제는 없었고, CFU/ml 또는 각각에 대한 성장은 양 균주 함께에 대한 공동-배양의 성장과 유사하였다(7.9e8 CFU/ml 35624 rif 및 7.2e8 CFU/ml AH1714)(도 18(a)).
DPC6315/35624 공동-배양 실험: 어느 쪽 균주의 주요 억제는 없었고, 각각에 대한 CFU/ml는 양 균주 함께의 공동-배양에서와 유사하였다(9.4e8 CFU/ml 35624 rif 및 8.5e8 CFU/ml AH1714)(도 18(b)).
이 결과는 35624와 1714 사이에 유해한 상호작용이 없다는 것을 보여주었다.
실시예
6-
35624, AH1714 및 AH1714
DPC6315의
항-염증성(IL-10/IL-12 비율) PBMC 프로파일
본 발명자들은 B. longum 35624가 시험관 내에서 항염증성 프로파일을 갖고, 이러한 유형의 프로파일이 IBS에서 관련성을 가질 수 있음을 이미 입증하였다. 따라서, 본 연구의 목적은 우리가 B. longum 35624와 파트너가 될 수 있는 유사한 항-염증성 비피도박테리아 롱검 균주를 발견할 수 있었는지를 결정하여 향상된 항염증성 조합을 만들 수 있는지를 결정하는 것이었다. B. longum DPC6315 및 B. longum 1714 둘 다를 포함하는 15개의 상이한 B. longum을 이들의 항-염증성 균주 프로파일에 대해 스크린 하였다. 이를 결정하기 위해, 시험관 내에서 자극된 PBMCs 로부터 IL-10 및 IL-12를 이들 박테리아 균주들로 측정한다.
인터루킨-10(IL-10)은 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 비만 세포 및 림프구(T 조절 세포)를 포함하는 많은 세포 유형에 의해 생성되는 항염증성 사이토카인이다. IL-10은 항원 제시 세포상의 전-염증성 Thl 사이토카인, MHC 클래스 II 항원, 및 공동-자극 분자의 발현을 하향 조절한다. 또한, B 세포 생존, 증식 및 항체 생성을 향상시킨다. 이러한 사이토킨은 NF-kB 활성을 차단할 수 있고, JAK-STAT 신호 경로의 조절에 관여한다. 뮤린(Murine) 녹아웃 연구는 IL-10KO 생쥐가 중증 대장염을 발생함에 따라 면역조절에서 IL-10에 대한 필수적인 역할을 입증하였다. 또한, IL-10의 강력한 유도체인 박테리아는 생체 내에서 T 조절 세포 분화를 촉진시켜 면역학적 항상성에 기여하는 것으로 나타났다(O'Mahony et al., AJP 2006; O'Mahony et al., PLoS Pathogens 2008).
인터루킨-12(IL-12)는 Thl 이펙터 T 세포 반응의 분극과 관련된 전-염증성 사이토카인이고, T 및 자연살해(NK) 세포로부터 인터페론-감마(IFN-γ) 및 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)와 같은 다른 전-염증성 Thl 사이토카인의 생성을 자극한다. 높은 수준의 IL-12 발현은 자가면역과 관련된다. 자가면역 질환으로 고통받는 사람에게 IL-12를 투여하는 것은 질병 증상을 악화시키는 것으로 나타났다. 대조적으로, IL-12 녹-아웃 생쥐 또는 IL-12 중성화 항체에 의한 생쥐의 치료는 질환을 개선시켰다.
사이토카인 캐스케이드 및 네트워크는 세포 유형에서 사이토카인의 작용보다는 염증 반응을 조절한다. 두 사이토카인(IL-10 및 IL-12 와 같은)의 발현 또는 균형의 상대적인 수준은 단일 사이토카인의 발현보다 더 유익하다. 이들 연구에서, 우리는 상이한 박테리아 균주의 범위로 인간 PBMCs를 자극하였다. 모든 균주는 IL-10을 유도하였고 모든 균주는 IL-12를 유도하였다. 그러나 IL-10과 IL-12 유도 사이의 비율의 조사는 일부 박테리아 균주가 다른 균주와 비교하여 더 높은 비율(즉, 더 많은 IL-10 더 적은 IL-12)을 유도한다는 것을 보여주었다. 이는 궁극적으로 면역학적 결과를 결정하는 각각의 이들 대향 신호 사이의 균형이 있기 때문에 의미 있는 관찰이다. 높은 IL-l0:IL-l2 비는 적절한 면역조절 활성과 관련된 항염증 반응을 촉진 시킬 수 있는 반면, 낮은 IL-l0:IL-l2 비는 면역 반응의 Th1 분극에 기여할 것으로 예상된다. 따라서, PBMC IL-l0:IL-l2 비는 면역조절 특성을 갖는 박테리아 균주의 식별을 위한 중요한 선택 기준이다.
분석은 하기 기재된 바와 같이 수행하였다:
말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)를 제조업자의 지시에 따라 BD Vacutainer CPT tubes(BD catalog 362761)를 사용하여 신선한 건강한 인간 말초 혈액으로부터 분리하였다. PBMCs를 세척하고 둘베코 변형 이글 배지-글루타맥스 TM(Dulbecco's Modified Eagle Medium-Glutamax TM)(글루타맥스(글루타민 대체) + 피루베이트(pyruvate) + 4.5g/l 글루코스(Gibco catalog 10569-010) 10% 태아 소 혈청(Sigma catalog F4135) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Sigma catalog P0781)에 재현탁시켰다. 1x106 세포/mL(즉, 2x105 세포)의 농도로 200μL의 PBMC를 평평한 바닥 96-웰 플레이트에 첨가하고, 20μL의 박테리아(1x107 CFU/mL의 농도로)를 필요한 웰, 즉 20μL 자극제/200mL 세포에 첨가한다. 인큐베이터에서 37℃/5% C02로 요구되는 바와 같이 플레이트를 배양한다.
박테리아를 다음과 같이 생성하였다: 신선한 브로스 박테리아를 Difco MRS 배지에서 배양시키고, 정지 상(stationary phase)에 진입한 직후에 수확하였다. 모든 세포를 37℃에서 혐기성 조건하에 배양시켰다. 냉동 건조된 생성물을 위해 박테리아를 Difco MRS 배지에서 배양시키고, 정지 상에 진입한 직후에 수확하였다. 세포를 혐기성 조건하에 37℃에서 배양시켰다. 그 후, 동결 건조된 분말을 이들 각각의 세균에 대해 배양시키고, 사용 직전까지 미리 분취된(pre-aliquoted) 100mg 바이알(vial)에서 -80℃로 저장하였다. 일단 냉동기로부터 제거되면, 단일 바이알을 실온으로 해동시키고, 10ml 링거에서 3회 세척하고, 이어서 원심분리하였다. 각 경우에 신선한 바이알을 사용하였다. 총 박테리아 수는 하기 기재된 바와 같이 형성하였다. 멸균 튜브에 분취된 동결 건조된 세균은 10ml의 배양 배지(RPMI 또는 DMEM)로 희석되어야 한다. 이 튜브로부터 lml를 취하고, 4.5ml의 배양 배지(RPMI 또는 DMEM)에 첨가하면, 이는 1.0E+09의 농도로 최고 용량이 될 것이고, 이는 1:1(중간 용량) 또는 1:9(더 낮은 용량)로 희석될 것이다. 박테리아 용액 20ml를 PBMC 현탁액(2x105 세포) 200m1에 첨가하거나, 또는 박테리아 용액 50μ1를 PBMC 현탁액(5x105 세포) 500μ1 또는 1OOμl에 첨가한다. 선택된 통상적인 희석은 100:1(박테리아:PBMC)에 상응하는 1.0E+08이었다. 음성 대조군은 자극되지 않은 세포에 첨가되어야 하는 동결 보호제이지만, 박테리아 분취와 동일한 방식으로 희석되어야 한다. 모든 분석을 3회 수행하였다. 37℃에서 l-일 배양 후, 플레이트를 300 x g로 회전하고, 상청액을 제거하고, 분석까지 -80℃에서 냉동보관하였다. 배양 상청액에서 사이토카인은 Meso Scale Discovery(Gaithersburg, MD; catalog K15008B-1), 인터루킨 10(Il-10), 및 인터루킨 12p70(Ill2p70)으로부터 96-웰 분석 키트를 사용하여 분석되었고, 정량되어 밀리리터당 피코그램으로 보고되었다. 각 샘플을 이중으로 분석하였다. 도면들은 대표적인 실험의 결과를 나타낸다.
시험된 15개의 균주 중 3개의 비피도박테리아 롱검 균주, B. longum 35624 및 B. longum 1714는 매우 유사하며 원하는 IL-10/IL-12 비를 유도한다. B. longum DPC6315는 유사하게 바람직한 특성인 35624 또는 1714보다 더 높은 비율을 제공하였다(도 19).
또한, 균주들을 조합하는 것의 부정적인 효과가 있는지 여부를 결정하기 위해, 35624 및 DPC6315 그리고 2개의 균주의 조합으로 자극된 PBMCs의 IL-10 생산을 평가했다. 시험관 내에서 조합하여 양 균주를 사용하는 부정적인 효과는 관찰되지 않았고, 유사한 IL-10 생산은 단독으로 사용된 균주로서 달성되었다(도 20). 35624 가 1714와 조합하여 사용될 때 유사한 결과가 얻어진다. 따라서, 문헌의 모든 이용가능한 정보로부터 그리고 이들 결과로부터 B. longum 35624와 조합된 B. longum DPC6315가 또한, 큰 결합성 항염증성 생성물이어야 한다는 것이 우리의 가설이었다.
실시예
7-항-염증성 콜라겐-유도 관절염(CIA) 모델에서 균주 비교
35624/DPC6315 조합을 추가로 시험하기 위해, 균주는 염증의 생쥐 모델에서 조합되었다. 본 발명자들은 특정 프로바이오틱 박테리아 균주의 소비가 점막 염증성 질환을 조절할 수 있음을 이미 입증하였다. 본 연구의 목적은 잘 확립된 항염증성 균주 스크리닝 모델에서 단독으로 또는 조합하여 사용되는 뮤린 관절염 모델에서 프로바이오틱 비피도박테리아 롱검 균주의 경구 투여의 효과를 결정하는 것이었다. IBS는 더 높은 수준의 염증과 관련된다. 항염증 효과를 평가하는 IBS에 대한 생쥐 모델은 잘 확립되지 않았고, 따라서 잘 검증된 항염증 모델이 사용되었다. 이들 신규한 비피도박테리아 균주는 시험관 내에서 항염증성 프로파일을 갖는 것으로 확인되었다.
우리의 PBMC 스크린으로부터(실시예 5), B. longum DPC6315를 선택하여, 공지된 프로바이오틱 B. longum 35624 치료 효과가 항염증성 B. longum DPC6315와 함께 사용될 때 향상될 수 있는지를 결정한다. 이들 균주는 공동-배양 실험에서 서로의 성장을 억제하지 않았다.
생쥐는 B. longum 35624, B. longum DPC6315 또는 이들의 조합을 경구적으로 공급하였다. 관절염의 CIA 모델에서 관절염 발병 및 질병 중증도는 질병 및 발 부종의 임상적 징후와 같은 종점(endpoint)을 사용하여 측정된 주요 파라미터이다.
류마티스성 관절염(RA)은 백인 개체군의 1 내지 2%에 영향을 주는 만성 자가면역 질환이다. RA는 관절 활액막, 연골 퇴화 및 골 침식의 염증을 특징으로 한다. 관절 손상은 RA 동안 초기에 발생하고, 일단 존재하면 대부분 비가역적이다. 전-염증성 사이토카인 TNF, IL-6 및 IFN-γ 및 항-염증성 IL-10의 이상 발현은 IL-15(McInnes IB et al., Nat Med 1996, 2:175-182) 및 IL-17(McInnes IB et al., Arthritis Res 2000, 2:374-378)의 높은 수준을 갖는 것으로 보고되었다(Fieldman et al., 1996, Annu Rev Immunol l4;397-440). 질병 발병에 대한 TNF-α 및 IL-1β의 관련성은 TNF-α 또는 IL-1β를 중화시키는 치료 전략의 임상적 성공에 의해 강조되었다[Elliott MJ et al., Lancet 1994,344:1105-1110. Moreland LW et al., N Engl J Med 1997,337:141-147, Feldmann M: Nat Rev Immunol 2002,2:364-371]. 콜라겐-유도 관절염은 인간 RA의 잘 알려진 뮤린 모델이고, RA에서 발견되는 것과 같은 체액성 및 세포 면역 메커니즘 모두의 특성을 가질 수 있다(Durie FH et al., Clin Immunol Immunopathol 1994;73:11-18). 타입 II 콜라겐 관절염을 갖는 생쥐 및 쥐에서 염증성 침윤물은 병변이 급성기 내지 아급성기에 있을 때 더 적은 수의 림프구를 갖는 호중구 및 대식세포로 구성된다. 관절 공간 내의 조직 부종 및 호중구 삼출물은 아급성기에 비해 급성기에서 일반적이다. 염증이 만성으로 진행할 때, 단핵 염증 세포(단핵구, 림프구)가 우세하고, 종종 변색성 매트릭스의 침착을 갖는, 섬유아세포 증식은 활액 및 관절주위 조직에서 일어난다. 삼출물은 관절 공간에서 덜 일반적이다.
코멘트 영역에 표시되지 않는 한, 염증 유형은 아급성에 비해 급성이다.
분석은 하기 기술된 바와 같이 수행하였다.
실험 설계
동물(15 DBA/l 생쥐/관절염 그룹)을 이소플루란으로 마취시키고, 꼬리의 기부에서 면도를 하고, 0일째에 및 다시 21일째에 꼬리의 기부에 소 타입 II 콜라겐(Bolder BioPATH, Batch #5)(1mg/ml)을 함유하는 Freund's Complete Adjuvant(Difco) 150ml로 피부 내 주사하였다. 연구 -14일째에, 생쥐를 체중에 의해 처리 그룹으로 무작위화 하였다. 등록 후, 처리를 개시하였고 연구 34일 동안에 표시된 바와 같이 매일(24시간 간격으로 QD) 계속하였다(양성 대조군 덱사메타손과의 처리는 dl8상에서 개시하였다). 연구 24-35일에, 관절염의 발병이 일어났다. 생쥐는 연구 35일째에 종료되었다. 임상 점수는 18-35일째에 각각의 발(우측 전방, 좌측 전방, 우측 후방, 좌측 후방)에 대해 제공되었다.
관찰, 측정 및 견본
일단 질병이 유도되면, 생쥐는 질병의 임상적 징후를 위해 관찰된다. 일일 임상 점수는 하기 기준을 사용하여 연구 18-35일에서 각각의 발(우측 전방, 좌측 전방, 우측 후방, 좌측 후방)에 대해 제공되었다:
0 = 정상.
1 = 1개의 후방 또는 전방 발 관절 영향 또는 최소 확산 홍반 및 부종.
2 = 2개의 후방 또는 전방 발 관절 영향 또는 온화한 확산 홍반 및 부종.
3 = 3개의 후방 또는 전방 발 관절 영향 또는 중간 확산 홍반 및 부종.
4 = 4개의 후방 또는 전방 발 관절 영향 또는 현저한 확산 홍반 및 부종.
5 = 전체 발 영향, 중증 확산 홍반 및 굽힐 수 없는 중증 부종.
염증 평점(scoring)
0 = 정상.
0.5 = 매우 최소한으로, 염증 세포의 단지 하나의 관절 또는 최소 다발성 관절주위 침윤에 영향을 미친다.
1 = 손상된 관절의 활액 및 관절주위 조직에서의 염증 세포의 최소 침윤.
2 = 염증 세포의 온화한 침윤. 발을 참조하면, 일반적으로 영향받은 관절(1-3개 영향)로 제한된다.
3 = 중간 부종의 중간 침윤. 발을 참조하면, 영향받은 관절, 일반적으로 3-4개의 관절 및 손목 또는 발목으로 제한된다.
4 = 현저한 부종을 갖는 대부분의 영역에 영향을 미치는 현저한 침윤, 1 또는 2개의 영향을 받지 않은 관절이 존재할 수 있다.
5 = 모든 관절(어느 정도) 및 관절주위 조직에 영향을 미치는 심각한 부종을 갖는 중증 확산 침윤.
발 점수에 대한 임상 데이터(동물에 대한 평균)를 18-35일 동안 투여 곡선 아래 영역(AUC)을 결정함으로써 분석하였다. AUC의 계산을 위해, 각 생쥐에 대한 일일 평균 점수를 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel)에 기입하고, 치료 날과 최종 날 사이의 영역을 계산하였다. 각 그룹에 대한 평균을 결정하고, 치료된 동물 및 정상적인 동물에 대한 값을 비교함으로써 관절염 대조군으로부터의 % 억제를 계산하였다. 원-웨이 분석(l-way ANOVA) 또는 Kruskal-Wallis 테스트(비-파라메트릭)를 사용하여 적절한 다중 비교 사후-테스트(post-test)와 함께 데이터를 분석하였다. 스투던트 양측 t-테스트(Student's two-tailed t-test)를 사용하여 정상 대조군과 질병 대조군을 비교하여 모델을 확인하였다. 통계적 테스트는 데이터의 정규성 및 분산의 균질성에 관한 특정 가정을 만들고, 검증이 이러한 가정들의 위반들을 초래한다면 추가적인 분석이 요구될 수 있다. 모든 테스트에 대한 유의성 p < 0.05로 설정하였다.
B. longum 35624 공급은 질병 대조군 그룹(*p < 0.05)(도 21(a)) 또는 DPC6315 및 35624 공급 그룹의 조합(도 21(b))과 비교하여 염증 및 질병의 임상적 징후를 감소시켰다. 이것과 일치하여, b. longum 35624 소비는 질병의 퍼센트 발생률에 의해 측정된 바와 같이 질병 개시 및 중증도를 지연시키는 반면, 2개의 비피 도박테리아 롱검 또는 DPC6315 단독의 조합은, 비록 DPC 6315가 35624와 유사한 경향을 나타내었지만, 지연시키지 않았다(도 22). 결과적으로, 프로바이오틱 B. longum 35624의 경구 투여는 관절 점수를 통한 감소된 염증을 위한 조합된 생성물보다 논증에 의해 더 우수하였으며, 발병률은 콜라겐-유도 관절염 모델에서 관절염의 시각적 평가에서 상당한 개선을 가져왔다. 이는 시험관 내 PBMC 시험으로부터 최상의 2개의 후보 균주로서 그리고 공동-배양 실험에서 생장의 억제가 없는 것으로 예상치 못한 결과이다. B. longum DPC6315는 조합되었을 때 관절염(CIA)의 생쥐 모델에서 35624의 항염증 효과를 억제하였고, 이 조합은 각 균주 단독보다 악화 되었다. 본 연구는 비피도박테리움 롱검 균주의 조합의 효과가 생체 내에서 예측할 수 없다는 것을 입증한다.
본 발명의 균주는 캡슐, 미세캡슐, 정제, 과립, 분말, 트로키(troch), 환제, 좌약, 현탁액 및 시럽과 같은 통상적인 제조에서 경구 섭취 가능한 형태로 동물(인간을 포함함)에 투여될 수 있다. 적합한 조성물은 통상적인 유기 및 무기 첨가제를 사용하여 통상적으로 사용되는 방법에 의해 제조될 수 있다. 의료 조성물 중의 활성 성분의 양은 원하는 치료 효과를 발휘할 수준에 있을 수 있다.
조성물은 또한 박테리아 성분, 약물 개체 또는 생물학적 화합물을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 균주를 포함하는 백신은 임의의 적합한 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있고, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 보조제를 포함할 수 있다.
프로바이오틱 유기체의 도입은 적합한 담체의 마이크로-유기체의 섭취에 의해 달성된다. 대장에서 이들 프로바이오틱 균주의 성장을 촉진하는 매질(medium)을 제공하는 것이 유리할 것이다. 하나 이상의 올리고당, 다당류, 또는 다른 프리바이오틱의 첨가는 위장관에서 유산균의 생장을 증진시킨다. 프리바이오틱스는 양성 등급(positive value), 예를 들어, 비피도박테리아, 락토바실러스(lactobacilli)인 것으로 생각되는 토착 세균에 의해 결장에서 특별히 배양되는 임의의 비-생존 식품 성분을 지칭한다. 프리바이오틱의 유형은 과당, 자일로오스, 콩, 갈락토오스, 포도당 및 만노스를 함유하는 것들을 포함할 수 있다. 하나 이상의 프리바이오틱 화합물과 프로바이오틱 균주의 결합된 투여는 생체 내(in vivo )에 투여된 프로바이오틱의 생장을 증진시켜, 더 현저한 건강상의 이익을 초래하며, 신바이오틱(synbiotic)으로 명명된다.
프로바이오틱 균주는 예방적으로 또는 상기 기재된 바와 같은 다른 프로바이오틱 및/또는 프리바이오틱 물질과 함께 또는 그들 자신의 치료 방법으로서 투여될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 박테리아는 염증 또는 다른 질병, 특히 면역학적 관여를 가지는 관련 질환을 치료하는데 사용되는 것과 같은 다른 활성 물질을 사용하는 예방 또는 치료 요법의 일부로서 사용될 수 있다. 이러한 조합물은 단일 조성물로 투여될 수 있거나 동일하거나 상이한 시간에 그리고 동일하거나 상이한 투여 경로를 사용하여 투여되는 별도의 조성물로서 투여될 수 있다.
본 발명의 균주는 균주의 지연된 방출과 같은 조절된 방출을 용이하게 하도록 조성물화될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 소장 또는 결장과 같은 위장관의 특정 위치에서 균주를 방출하기에 적합할 수 있다. 이러한 조절된 방출을 달성하기 위해, 균주는 특정 위치에서 균주를 방출하기에 적합한 코팅을 갖는 캡슐로 조성물화될 수 있다. 이러한 조절된 방출을 용이하게 하기 위해 코팅 범위를 이용할 수 있다. 이러한 코팅의 한가지의 패밀리는 상품명 Eudragit로 입수 가능한 것이다.
본 발명은 전술한 실시예에 한정되지 않으며, 상세하게 변경될 수 있다.
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Claims (40)
- 제2 박테리아 균주 및 비피도박테리움 ( Bifidobacterium ) 균주 NCIMB 41003의 단리된 균주를 포함하는 조성물에 있어서,
상기 제2 박테리아 균주는 NCIMB 41003의 위장 효과에 악영향을 미치지 않는, 조성물. - 제1 항에 있어서,
상기 제2 균주는 균주 NCIMB 41003의 위장 효과에 악영향을 미치지 않는 비피도박테리움 균주인, 조성물. - 제1 항에 있어서,
상기 제2 균주는 균주 NCIMB 41003의 위장 효과에 악영향을 미치지 않는 락토바실러스 (lactobcillus) 균주인, 조성물. - 제1 항에 있어서,
상기 제2 균주는 균주 NCIMB 41003의 위장 효과에 악영향을 미치지 않는 락토코수스 ( Lactocossus ) 균주인, 조성물. - 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 균주는:
IBS와 관련된 기분을 개선 시키고;
IBS와 관련된 스트레스를 감소시키고;
IBS와 관련된 불안증을 감소시키고;
IBS와 관련된 수면 질을 개선 시키고;
IBS와 관련된 우울증을 치료하고; 및/또는
IBS와 관련된 조절되지 않은 코르티솔(cortisol) 각성 반응을 정상화하는, 조성물. - IBS와 관련된 위장 증상 및 다음:
IBS와 관련된 기분을 개선 시키는 것;
IBS와 관련된 스트레스를 감소시키는 것;
IBS와 관련된 불안증을 감소시키는 것;
IBS와 관련된 수면 질을 개선 시키는 것;
IBS와 관련된 우울증을 치료하는 것; 및
IBS와 관련된 조절되지 않은 코르티솔 각성 반응을 정상화하는 것 중 하나 이상을 개선함으로써 과민성 대장 증후군(IBS)의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 제2 박테리아 균주 및 비피도박테리움 균주 NCIMB 41003의 단리된 균주를 포함하는, 조성물. - 제6 항에 있어서,
IBS와 관련된 염증을 개선하는데 사용하기 위한, 조성물. - 제6 항 또는 제7 항에 있어서,
제2 비피도박테리움 균주는 균주 NCIMB 41003의 위장 효과에 악영향을 미치지 않는, 조성물. - IBS와 관련된 위장 증상 및 다음:
IBS와 관련된 기분을 개선 시키는 것;
IBS와 관련된 스트레스를 감소시키는 것;
IBS와 관련된 불안증을 감소시키는 것;
IBS와 관련된 수면 질을 개선 시키는 것;
IBS와 관련된 우울증을 치료하는 것; 및
IBS와 관련된 조절되지 않은 코르티솔 각성 반응을 정상화하는 것 중 하나 이상을 개선함으로써 과민성 대장 증후군(IBS)의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 비피도박테리움 균주 NCIMB 41003 및 제2 비피도박테리움 균주의 분리된 균주를 포함하는, 조성물. - 제9 항에 있어서,
IBS와 관련된 염증을 개선하는데 사용하기 위한, 조성물. - 제9 항 또는 제10 항에 있어서,
상기 제2 비피도박테리움 균주가 균주 NCIMB 41003의 위장 효과에 악영향을 미치지 않는, 조성물. - 제1 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비피도박테리움 균주 중 적어도 하나는 생존 세포의 형태인, 조성물. - 제1 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비피도박테리움 균주 중 적어도 하나는 비-생존 세포의 형태인, 조성물. - 제9 항 내지 제13 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 비피도박테리움 균주는 비피도박테리움 롱검 균주인, 조성물. - 제9 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 비피도박테리움 균주는 비피도박테리움 균주 NCIMB 41676의 단리된 균주인, 조성물. - 제9 항 내지 제15 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비피도박테리움 균주 NCIMB 41676은 106 cfu 이상의 양으로 상기 조성물에 존재하는, 조성물. - 제9 항 내지 제16 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비피도박테리움 균주 NCIMB 41676은 107 내지 1010 cfu의 양으로 상기 조성물에 존재하는, 조성물. - 제9 항 내지 제17 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비피도박테리움 균주 NCIMB 41676은 108 내지 109 cfu의 양으로 상기 조성물에 존재하는, 조성물. - 제9 항 내지 제18 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비피도박테리움 균주 NCIMB 41676은 약 5x108 cfu의 양으로 상기 조성물에 존재하는, 조성물. - 제9 항 내지 제19 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비피도박테리움 균주 NCIMB 41003은 106 cfu 이상의 양으로 상기 조성물에 존재하는, 조성물. - 제9 항 내지 제20 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비피도박테리움 균주 NCIMB 41003은 107 내지 1010 cfu의 양으로 상기 조성물에 존재하는, 조성물. - 제9 항 내지 제21 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비피도박테리움 균주 NCIMB 41003은 108 내지 109 cfu의 양으로 상기 조성물에 존재하는, 조성물. - 제9 항 내지 제22 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비피도박테리움 균주 NCIMB 41003은 약 5x108 cfu의 양으로 상기 조성물에 존재하는, 조성물. - 제1 항 내지 제23 항 중 어느 한 항에 있어서,
박테리아 브로스(broth)의 형태인, 조성물. - 제1 항 내지 제24 항 중 어느 한 항에 있어서,
동결 건조된 분말 형태인, 조성물. - 제1 항 내지 제25 항 중 어느 한 항에 있어서,
프리바이오틱 물질을 추가로 포함하는, 조성물. - 제1 항 내지 제26 항 중 어느 한 항에 있어서,
섭취 가능한 담체를 추가로 포함하는, 조성물. - 제27 항에 있어서,
상기 섭취 가능한 담체는 캡슐, 정제 또는 분말과 같은 약학적으로 허용 가능한 담체인, 조성물. - 제27 항에 있어서,
상기 섭취 가능한 담체는 산성화된 우유, 요구르트, 냉동 요구르트 또는 아이스크림과 같은 냉동식품, 검, 캔디, 우유 분말, 우유 농축물, 치즈 스프레드, 영양 조성물, 영양 보충제, 시리얼 바, 드레싱 또는 음료와 같은 식료품인, 조성물. - 제27 항에 있어서,
상기 조성물은 유아 식품인, 조성물. - 제1 항 내지 제30 항 중 어느 한 항에 있어서,
발효 식료품의 형태인, 조성물. - 제1 항 내지 제31 항 중 어느 한 항에 있어서,
발효 유제품의 형태인, 조성물. - 제27 항 내지 제32 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 담체는 자연에서 발생하지 않는, 조성물. - 제1 항 내지 제33 항 중 어느 한 항에 있어서,
단백질 및/또는 펩타이드, 특히 글루타민/글루탐산염, 지질, 탄수화물, 비타민, 미네랄 및/또는 미량 원소가 풍부한 단백질 및/또는 펩타이드를 추가로 포함하는, 조성물. - 제1 항 내지 제34 항 중 어느 한 항에 있어서,
보조제를 추가로 포함하는, 조성물. - 제1 항 내지 제35 항 중 어느 한 항에 있어서,
박테리아 성분을 추가로 포함하는, 조성물. - 제1 항 내지 제36 항 중 어느 한 항에 있어서,
약물 개체(drug entity)를 추가로 포함하는, 조성물. - 제1 항 내지 제37 항 중 어느 한 항에 있어서,
생물학적 화합물을 추가로 포함하는, 조성물. - 제1 항 내지 제38 항 중 어느 한 항에 청구된 조성물을 포함하는 식품.
- 제1 항 내지 제38 항 중 어느 한 항에 청구된 조성물을 포함하는 약제.
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