KR20200103215A - 아스퍼질러스 오리재 균주 및 이의 발효물을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 - Google Patents

아스퍼질러스 오리재 균주 및 이의 발효물을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 Download PDF

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Abstract

프로테아제 활성을 가지는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) Enz-5 균주 (수탁번호: KCCM12426P), 상기 균주에 의해 발효된, 발효물 및 상기 발효물를 포함하는 피부상태 개선용 조성물에 관한 것으로, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) Enz-5 균주 (수탁번호: KCCM12426P)에 의해 발효된 발효물은 피부에 자극을 주지 않으면서 피부의 각질 및 블랙헤드, 화이트헤드를 효과적으로 제거할 수 있는바, 피지 및 모공 관리에 이용될 수 있다.

Description

아스퍼질러스 오리재 균주 및 이의 발효물을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물{Strain of Aspergillus oryzae and composition for improving skin condition comprising a fermenttion production thereof}
아스퍼질러스 오리재 균주 및 이의 발효물을 포함하는 피부 개선용 조성물에 관한 것이다.
각질은 피부 속 수분의 증발을 막아주며, 외부로부터 이물질의 침입을 막아주는 역할을 한다. 건강한 각질층의 수분함유량은 약 20% 정도이며 이때, 피부가 촉촉하고 탱탱하여 윤기가 흐르는 건강한 피부로 보이게 된다. 시간이 지남에 따라 각질층이 오래되어 떨어져 나가지 않고 수분함유량이 15% 이하로 줄어들면 건조해지고 갈라지는 거친 피부로 된다. 나이가 들면서 각질 세포가 빨리 탈락되지 않게 되고 순환이 이루어지지 않아 피부는 칙칙해지고 노화가 빨라져 거친 피부의 원인이 된다. 한편, 강하게 타월로 문질러 피부 각질을 제거하는 방법은 정상적인 각질층을 손상시켜 각질층의 기능을 약화시켜 피부 자극을 유발하여 염증을 일으키는 문제점이 있다. 따라서 오래된 각질을 제대로 적당히 제거해줘야 피부 기저층의 세포로부터 새로운 각질세포가 분화되어 건강한 피부가 될 수 있다.
피지는 피지선에서 만들어져 모공을 통하여 방출된다. 또한 피지는 피부 표면에 지방막을 형성하여 항균작용을 하며, 자외선과 외부자극으로부터 피부를 보호하는 등 여러 기능을 하고 있다. 그러나 피지가 과량 분비되거나 모공 안에서 축적되면, 각질, 메이크업 노폐물, 먼지 등과 엉겨 붙게 되는데, 엉겨 붙은 피지축적물은 산화되면서 갈색 혹은 검은색으로 변색되어 '블랙헤드 (black head)'가 된다. 이렇게 형성된 블랙헤드는 모공을 넓고 깊어지게 하여 깨끗하지 못한 피부로 보이게 된다. 블랙헤드나 피지를 제거하기 위해 기계나 도구를 이용한 물리적인 방법과 AHA(alpha hydroxy acid)나 BHA(beta　hydroxy acid)와 같은 화학적인 방법으로 즉각적인 효과를 가지는 방법들이 화장품 산업에 많이 이용된다. 그러나 이러한 방법들은 심한 자극을 주기 때문에 피부 따가움, 간지러움, 피부 홍반 등의 부작용이 발생하여 피부 상태가 악화될 수 있는 문제점이 있다.
화장품 산업에서 사용되는 브로멜라인과 파파인은 식물유래의 단백질 분해효소로 각질을 제거하는 목적으로 사용되어온 고농도의 정제 효소들이다. 그러나 실효성이 있는 고농도로 사용시 피부자극 및 알러지 반응을 유발할 수 있으며(Caroline Stremnitzer et al., 2015, Gunjan M. Modi et al., 2009), 리파아제(Lipase) 역시 고농도의 단백질 분해효소와 같이 사용시 피부 자극 및 경피수분손실율(TEWL, Transepidermal water loss)을 증가시키는 문제점이 있다(P.H. Andersen et al., 1993). 이러한 문제점 때문에 스킨 제형에 사용되지 않고 사용한 후 바로 씻어내는 세안 조성물로 상기 효소제들을 사용하지만, 이로 인해 효소에 의한 각질이나 피지가 제거 효과가 미미한 문제점이 있다.
일 양상은 프로테아제 활성을 가지는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) Enz-5 균주 (수탁번호: KCCM12426P)를 제공하는 것이다.
다른 양상은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 균주에 의해 발효된, 발효물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 균주 또는 이에 의해 발효된, 발효물을 포함하는 피부상태 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 균주를 배양하는 단계; 및 배양 후 얻어진 균체 배양액을 곡류에 접종하여 발효하는 단계를 포함하는 발효 효소제의 제조방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 프로테아제 활성을 가지는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) Enz-5 균주 (수탁번호: KCCM12426P)를 제공한다.
상기 "아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)"는 곰팡이의 일종으로서, 곡물로부터 분리한 것일 수 있다. 상기 곡물은 그 종류를 한정하지 않으나, 예를 들어 누룩일 수 있다. 상기 균주는 누룩 샘플을 감자 포도당 한천 배지에 접종하여 배양된 콜로니를 순수 분리 배양하는 방법에 의해 분리된 균주일 수 있다. 상기 균주는 식품, 토양, 바다 등에서 분리한 것일 수 있다. 또한, 상기 균주는 리파아제 활성 및/또는 프로테아제 활성을 가질 뿐만 아니라, 같은 종의 아스퍼질러스 오리재 KCCM11372 및 아스퍼질러스 오리재 니거(KCCM11239)와 비교하여 프로테아제 활성이 높은 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 균주는 서열번호 1에 기재된 염기서열을 갖는 16S rDNA 유전자를 포함하는 것일 수 있다.
다른 양상은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 균주에 의해 발효된, 발효물을 제공한다. 또 다른 양상은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 균주에 의해 발효된, 발효 효소제를 제공한다.
본 명세서 내 용어, "발효물"이란 쌀을 포함한 곡류에 미생물을 첨가하여 발효시킴으로써 제조된 것을 의미한다. 일 구체예에 있어서, 상기 미생물은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) Enz-5 균주 (수탁번호: KCCM12426P)인 것일 수 있다.
본 명세서 내 용어, "발효 효소제"란 발효를 빠르게 하거나 더디게 하는 효소로서, 효소의 존재 하에서 복잡한 유기물이 분해되어 간단한 다른 유기물로 분해될 수 있도록 반응속도를 촉매하는 단백질을 의미한다. 즉, 본 발명에 있어서 발효 효소제란, 아스퍼질러스 오리재 균주가 생산한 효소를 분말화한 후 제제화한 것일 수 있다. 상기 효소는 리파아제 및/또는 프로테아제인 것일 수 있다. 상기 아스퍼질러스 오리재 균주의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 일 구체예에 따른 발효물 또는 발효 효소제에서, 상기 균주는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) Enz-5 균주(수탁번호: KCCM12426P)인 것일 수 있으며, 서열번호 1에 기재된 염기서열을 갖는 16S rDNA 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 발효는 고체 발효인 것일 수 있다.
본 명세서 내 용어, "고체 발효(Solid-state fermentation, SSF)"란 수분이 적은 고체상태의 곡류에 미생물을 접종하여 발효하는 것으로 낮은 수분 활력에 의해 오염균의 생장이 제한되므로 액상발효처럼 심각한 오염을 유발하지 않는다. 상기 고체 발효에서 온도, 수분함량 및 통기량은 효소의 발현에 영향을 미치는 요소로 작용할 수 있다. 상기 아스퍼질러스 오리재 균주를 고체 발효 시키는 경우, 세포외 효소가 발현될 수 있는데 예를 들어, 상기 균주의 생육 조건이 나빠지면 생존을 위해 곰팡이가 포자를 형성하면서 발현된 효소도 포자 내에 함께 포함시키기 때문에 균사일 때보다 세포외 효소(extracellular enzyme)의 활성이 상대적으로 낮아진다는 문제점이 있다. 따라서, 포자 형성을 최대한 지연시켜 효소의 활성을 최대화 하기 위해서는 아스퍼질러스 오리재 균주의 생육 조건을 최적화할 필요가 있다.
다른 양상은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 균주에 의해 발효된, 발효물을 포함하는 피부상태 개선용 조성물을 제공한다. 또 다른 양상은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 균주에 의해 발효된, 발효 효소제를 포함하는 피부상태 개선용 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 조성물은 상기 균주의 배양액을 추가로 포함할 수 있다. 상기 배양액은 예를 들어, 상기 균주를 배양하여 수득된 배양액 자체 또는 그의 농축물 또는 동결건조물, 또는 배양액으로부터 균주를 제거하여 수득된 배양 상층액, 그의 농축물 또는 동결건조물인 것일 수 있다. 또한 상기 배양은 아스퍼질러스 오리재 Enz-5 균주를 감자한천배지에서 5℃ 초과 40℃ 미만 중 어느 온도에서 일정 시간, 예를 들면, 10 내지 80시간 동안 배양하여 수득된 것일 수 있다. 일 구체예에서, 균주의 배양 상층액을 균주 배양액을 원심분리나 여과시켜 균주를 제거하는 단계에 의해 수득될 수 있다. 다른 구체예에서, 농축물은 상기 균주 배양액 자체, 또는 상기 배양액을 원심분리나 필터를 이용하여 여과한 후 수득된 상층액을 농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다. 상기 아스퍼질러스 오리재 Enz-5 균주를 배양하기 위한 배양용 배지 및 배양 조건은 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다.
상기 아스퍼질러스 오리재 균주의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 일 구체예에 따른 조성물에서, 상기 균주는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) Enz-5 균주(수탁번호: KCCM12426P)인 것일 수 있다. 상기한 바와 같이, 상기 아스퍼질러스 오리재 Ezn-5 균주는 리아파제 활성 및/또는 프로테아제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는바, 상기 균주에 의해 발효된 발효물 또는 발효 효소제; 및 상기 발효물 또는 발효 효소제를 포함하는 화장료 조성물은 피부 각질 제거, 피지 제거, 피부 표면의 유분 감소 등의 효과를 나타낼 수 있다.
상기 피부상태 개선은 피부 각질 제거, 피지 예를 들어, 블랙헤드 및/또는 화이트헤드 제거, 모공 막힘 증상 호전, 모공 축소 또는 여드름 예방, 감소일 수 있다. 상기 아스퍼질러스 오리재 균주에 의해 발효된, 발효물 또는 발효 효소제는 각질 제거 및/또는 피지 제거 효과가 우수하므로, 상기 발효물 또는 발효 효소제를 포함하는 조성물은 피부 각질 제거, 피지 제거, 모공 막힘 증상 호전, 모공 축소 또는 여드름 예방, 감소용 조성물로 사용될 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물에서, 상기 발효물 또는 발효 효소제는 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 5 중량%, 예를 들어, 0.1 내지 5 중량%, 0.1 내지 4.8 중량%, 0.1 내지 4.5 중량%, 0.1 내지 4.3 중량%, 0.1 내지 4 중량%, 0.5 내지 5 중량%, 0.5 내지 4.5 중량%, 0.5 내지 4 중량%, 0.5 내지 3.5 중량%, 0.5 내지 3 중량%, 1 내지 5 중량%, 1 내지 4 중량%, 1 내지 3 중량%, 1.5 내지 5 중량%, 1.5 내지 4.5 중량% 또는 2 내지 3 중량%로 포함될 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물은 상기 발효물 또는 발효 효소제를 유효한 양, 또는 유효 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 유효한 양은 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환 내지 상태의 중증도, 개체의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 효소제에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 투여 기간, 상기 조성물과 배합 또는 동시에 사용 되는 다른 조성물을 포함한 요소 및 기타 생리 내지 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
일 구체예에 따른 피부상태 개선용 조성물은 화장료, 식품 또는 약학적 조성물일 수 있다. 따라서 상기 조성물은 화장품학적으로, 식품학적으로, 또는 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 조성물은 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제, 또는 피부외용제일 수 있다. 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제등을 필요에 따라서 적절하게 배합할 수 있다.
상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류등도 적절하게 배합할 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물은 화장료 조성물일 수 있다. 이 경우, 배양액은 화장수(스킨로션), 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양 로션, 마사지크림, 영양 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 현탁액, 겔, 분말, 페이스트, 마스크팩 또는 시트 또는 에어로졸 조성물을 포함하는 제형으로 제조될 수 있다. 이러한 제형의 조성물은 당해 분야에서 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 보존제, 안정화제, 계면활성제, 용해제, 보습제, 에몰리언트제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및 무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한제 등을 더 포함할 수 있다. 상기 보습제 등의 추가 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하며, 그 배합량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 5 중량%, 구체적으로 0.01 내지 3 중량%일 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물은 식품 조성물일 수 있다. 이 경우, 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 식품 조성물은 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 환제, 캅셀제, 현탁액, 유제, 시럽제, 침제, 액제, 엑스제 등의 일반적인 제형으로 제조될 수도 있고, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 젤리, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등의 임의의 건강식품 형태로 제조될 수도 있다. 상기 건강식품의 제제화를 위해 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 사용할 수 있으며, 제조하고자 하는 제형의 제조에 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다. 상기 첨가제로서 각종 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 이외에도 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 첨가제 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 첨가제의 비율은 조성물 총 중량을 기준으로 0.001 내지 5 중량%, 구체적으로 0.01 내지 3 중량%일 수 있다.
상기 식품 조성물 중의 상기 배양액의 함량은 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 포함할 수 있으며, 음료로서 제조될 경우 100 mL를 기준으로 0.02 내지 10 g, 구체적으로 0.3 내지 1 g의 비율로 함유할 수 있다.
상기 음료는 상기 추출물 이외의 다른 성분을 더 포함할 수 있으며, 통상적으로 음료에 사용되는 다양한 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 더 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물로는 단당류(예: 포도당, 과당 등), 이당류(예: 말토즈, 수크로즈 등), 다당류(예: 덱스트린, 시클로덱스트린 등)와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 함유될 수 있다. 또한, 향미제로서 천연 향미제(예: 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예: 사카린, 아스파탐 등)를 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 음료 100 mL 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 구체적으로 약 5 내지 12g으로 함유될 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물은 약학 조성물일 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은 피부 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물일 수 있다. 상기 피부 질환은 피지낭종, 지루성 피부염, 모공 각화증 등인 것일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 조성물은 모공 각화증, 각질 제거, 블랙헤드 및/또는 화이트헤드 제거, 모공 막힘 등의 피부 상태를 개선할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 상기 약학적 조성물은 피부 각질, 블랙헤드 및/또는 화이트헤드를 효과적으로 제거시킴으로써 피지낭종, 지루성 피부염, 모공 각화증, 모공 막힘 등을 예방 또는 치료할 수 있다.
다른 양상은 상기 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 피부상태를 개선 또는 피부 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 조성물에 대해서는 상술한 바와 동일하다.
용어, "투여하는", "도입하는" 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체 내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다. 일 구체예에 따른 조성물의 배양액 또는 배양액 성분의 적어도 일부를 생존하는 개체 내에서 원하는 위치로 전달하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다.
투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 피부미용 개선, 예를 들어 피부 장벽 강화, 피부 보습, 피부 세포 재생, 피부 활력 증가, 항산화, 항염증, 또는 항아토피 효과를 필요로 하는 개체일 수 있다.
상기 투여는 아스퍼질러스 오리재 균주에 의해 발효된, 발효물 또는 발효 효소제를 개체당 일당 0.1 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg을 투여하는 것일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 임상적으로 용인 가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있으며, 매일 또는 2 내지 5일 간격으로 총 투여 일수는 한번 치료 시 1일에서 30일까지 투여될 수 있다. 필요한 경우, 적정 시기 이후에 동일한 치료를 반복할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다.
다른 양상은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 균주를 배양하는 단계; 및 배양 후 얻어진 균체 배양액을 곡류에 접종하여 발효하여 발효물을 제조하는 단계를 포함하는 발효 효소제의 제조방법을 제공한다.
상기 아스퍼질러스 오리재 균주의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 일 구체예에 따른 방법에서, 상기 균주는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) Enz-5 균주(수탁번호: KCCM12426P)인 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 방법은 아스퍼질러스 오리재 균주를 배양하는 단계를 포함한다. 상기 배양은 초기 수분함량이 20 내지 70%인 배지에서 배양되는 것일 수 있다. 상기 초기 수분함량은 예를 들어, 20 내지 70%, 20 내지 60%, 20 내지 50%, 30 내지 70%, 40 내지 70% 또는 40 내지 50%일 수 있다. 이때, 초기 수분함량이 상기 범위 미만인 경우, 균주의 포자 형성이 촉진되어 프로테아제의 활성이 감소하는 문제점이 있으며 상기 범위를 초과하는 경우, 균주 사이에 공기 순환이 감소하여 균주의 생장이 느려지고 다른 미생물에 의한 오염이 발생할 수 있다는 문제점이 있다.
일 구체예에 따른 방법은 상기 균주를 배양하여 얻어진 균체 배양액을 곡류에 접종하여 발효하여 발효물을 제조하는 단계를 포함한다. 상기 발효는 고체 발효인 것일 수 있다. 상기 고체 발효는 20 내지 40℃에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 발효 온도는 예를 들어, 20 내지 40℃, 20 내지 35℃, 20 내지 30℃, 25 내지 40℃, 25 내지 35℃ 또는 30 내지 35℃일 수 있다. 이때, 발효 온도가 상기 범위 미만인 경우, 균주의 성장 속도가 느려져 오염이 발생하거나 및/또는 생산성이 저해된다는 문제점이 있으며 상기 범위를 초과하는 경우, 균주의 성장이 저해되므로 효소의 발현이 낮아지는 문제점이 있다. 상기 고체 발효는 50 내지 70시간 동안 수행되는 것일 수 있다. 상기 발효 시간은 예를 들어, 50 내지 70시간, 50 내지 65시간, 50 내지 60시간, 55 내지 70시간 또는 55 내지 65시간일 수 있다. 이때, 발효 시간이 상기 범위 미만인 경우, 효소가 충분히 발현되지 않아 생산성이 감소하는 문제점이 있으며 상기 범위를 초과하는 경우, 균주에서 포자가 형성되면서 생성된 효소가 포자 내부로 포집되는바, 효소 활성이 감소하는 문제점이 있다. 또한, 상기 고체 발효는 0.05 내지 0.5 vvm의 통기량을 갖도록 배양하는 것일 수 있다. 상기 통기량은 예를 들어, 0.05 내지 0.5 vvm, 0.05 내지 0.4 vvm, 0.05 내지 0.3 vvm, 0.1 내지 0.5 vvm, 0.2 내지 0.5 vvm 또는 0.3 내지 0.45 vvm인 것일 수 있따. 이때, 통기량이 상기 범위 미만인 경우, 절대 호기성 균주인 아스퍼질러스 오리재 Enz-5 균주가 생장하면서 이산화탄소가 증가하고 필요한 산소량이 부족하여 생육이 저해되는 바, 생산성이 낮아지거나 오염 확률이 높아지는 문제점이 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우, 발효물 내의 수분 함량이 급격하게 감소되어 균주의 생육이 저해되거나 및/또는 효소의 발현이 저하되는 문제점이 있다. 또한, 상기 방법은 상기 발효물을 멸균수와 혼합한 후 추출하여 제조한 효소액을 건조시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 양상에 따른 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) Enz-5 균주를 이용한 고체 발효물은 피부에 자극을 주지 않으면서 피부 따가움, 간지러움, 피부 홍반 등의 부작용 없이 피부의 각질 및 블랙헤드, 화이트헤드를 효과적으로 제거할 수 있는바, 피지 및 모공 관리에 이용될 수 있다.
도 1은 전통 누룩 유래의 형태학적으로 곰팡이로 분류되는 후보 균주들을 스킴밀크(skim milk)를 포함하는 배지에서 배양한 후, 단백질 분해효소 활성을 가진 균주들을 나타낸 사진이다.
도 2는 초기 수분함량 및 발효시간에 따른 아스퍼질러스 오리재 Enz-5의 프로테아제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 초기 수분 50% 및 발효 시간 66시간 조건에서 통기량에 따른 아스퍼질러스 오리재(A. oryzae) Enz-5의 프로테아제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 아스퍼질러스 오리재 Enz-5 및 다른 곰팡이들간의 프로테아제 활성을 비교한 그래프이다.
도 5는 아스퍼질러스 오리재 Enz-5 고체발효물의 발효 전 후의 리파아제 활성을 확인한 결과이다.
도 6은 복합 효소제 분말이 첨가된 마스크를 얼굴에 적용한 후, 각질 제거 정도를 나타낸 그림(a) 및 그래프(b)이다.
도 7은 복합 효소제 분말이 첨가된 마스크를 얼굴에 적용한 후, 블랙헤드, 화이트헤드 및 모공의 크기 변화를 나타낸 사진이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 아스퍼질러스 오리재 균주의 분리, 동정 및 배양
1-1. 아스퍼질러스 오리재 균주의 분리 및 동정
제주도에서 구매한 전통 누룩 10g을 0.85% NaCl 용액으로 적절하게 연속 희석한 다음 클로람페니콜(chloramphenicol)이 첨가된 감자 포도당 한천 배지(Himedia, India, M1942)에 도말 한 후, 30℃에서 60시간 동안 배양하였다. 이후, 외형적으로 곰팡이 형태를 가지는 균주들을 선별하였다. 선별한 균주들을 대상으로 스팀밀크 1 %, NaCl2 2 %, 펩톤 2 %, Agar 2%로 구성된 Skim Milk agar plate(pH 7.0)에서 접종 한 후, 30℃에서 48시간 동안 배양하여 가장 큰 분해능을 나타내는 균주를 최종 선별하였다.
최종 선별한 균주는 (사)한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 동정 의뢰하여 Internal Transcribed Spacer(ITS)- 5.8S 16S rDNA 염기서열을 분석하였다. 분석 결과, 최종 선별된 균주들이 아스퍼질러스 오리재(A. oryzae)와 99.9%의 상동성을 나타내는 것을 확인하였다. 상기에서 분리된 균주 즉, 아스퍼질러스 오리재(A. oryzae) Enz-5를 한국 미생물 보존센터(Korean culture center of microorganisms, KCCM)에 2019년 1월 11일자로 기탁하고, 기탁번호 KCCM12426P를 부여 받았다.
1-2. 아스퍼질러스 오리재 ( A. oryzae ) Enz-5 균주의 배양
상기 실시예 1-1에서 분리한 아스퍼질러스 오리재(A. oryzae) Enz-5 균주의 배양 조건을 확인하기 위하여 최적 생장온도는 5℃에서부터 40℃까지 (5℃ 간격) 설정하여 최적배양온도를 확인하였다. 또한, 성장 배지를 확인하기 위하여 감자포도당 한천 배지(Difco, USA)를 사용하여 30℃에서 5일 동안 배양하여 확인하였다. 그 결과, 상기 균주는 감자포도당 한천 배지에서 30℃, 72시간의 배양 시간에서 가장 활성이 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2. 아스퍼질러스 오리재( A. oryzae ) Enz -5 균주를 이용한 고체 발효물 및 효소분말의 제조
2-1. 고체 발효물의 제조 및 초기 수분, 통기량에 따른 효소발현의 최적 조건 확인
상기 실시예 1-1에서 분리한 아스퍼질러스 오리재(A. oryzae) Enz-5를 이용하여 고체 발효물을 제조하였다. 구체적으로, 쌀의 평균 수분 함량을 40~50%로 보정하고 121℃에서 30분 동안 멸균하였다. 이후, 감자 포도당 한천배지에서 배양한 아스퍼질러스 오리재(A. oryzae) Enz-5를 포자 현탁액으로 제조하여 냉각한 쌀에 접종한 후, 33℃, 75~85%의 습도에서 60~65 시간 동안 고체발효 하였다. 이때, 상기 균주에 대한 최적의 효소 발현 조건을 확인하기 위하여 초기 수분 함량을 30, 40, 50 및 60%로 하였다.
도 1은 전통 누룩 유래의 형태학적으로 곰팡이로 분류되는 후보 균주들을 스킴밀크(skim milk)를 포함하는 배지에서 배양한 후, 단백질 분해효소 활성을 가진 균주들을 나타낸 사진이다. 일반적으로 단백질 분해효소 활성을 가지는 균주는 배양되면서 스킴밀크를 분해하여 분해환(clear zone)을 형성한다. 도 1에 나타난 바와 같이 일 양상에 따른 아스퍼질러스 오리재 Enz-5는 스킴밀크를 포함하는 배지에서 가장 큰 분해환을 형성하는바, 다른 균주들과 비교하여 단백질 분해효소 활성이 우수하다.
도 2는 초기 수분함량 및 발효시간에 따른 아스퍼질러스 오리재 Enz-5의 프로테아제 활성을 나타낸 그래프이다. 도 2에 나타난 바와 같이, 초기 수분 함량이 50%일 경우에 상기 균주들의 프로테아제 활성이 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 초기 수분 함량을 50%, 발효 시간을 66 시간으로 고정하고, 통기량을 각각 0, 0.05, 0.1 및 1 vvm으로 하여 프로테아제 활성을 비교하였다. 이때, 1 vvm은 1L 또는 1㎏의 배지에서 1분간 1L의 공기를 공급하는 것이다.
도 3은 초기 수분 50% 및 발효 시간 66시간 조건에서 통기량에 따른 아스퍼질러스 오리재(A. oryzae) Enz-5의 프로테아제 활성을 나타낸 그래프이다. 도 3에 나타난 바와 같이, 통기량이 0.05 내지 0.5에서 프로테아제 활성을 우수한 것을 확인할 수 있었다.
2-2. 복합 효소 분말의 제조
상기 실시예 2-1에서 확인한 최적의 효소 생성 조건(초기 수분 50%, 통기량 0.05 내지 0.5 vvm 및 발효 시간 66시간)에서 고체 발효한 쌀과 멸균수를 1:10의 질량비로 혼합하여 4℃, 250 rpm 조건에서 60분 동안 교반 추출하였다. 이후, 0.45 ㎛에서 막여과(emebrane filterarion)하여 효소액을 제조하였다. 제조된 효소액을 동결 건조한 후, 부형제를 혼합하여 분말화된 복합 효소 분말을 제조하였다.
실시예 3. 복합 효소 분말이 첨가된 마스크 제형의 제조
상기 실시예 2-2에서 제조한 복합 효소 분말이 첨가된 마스크 제형을 제조하였다. 하기 표 1의 조성 및 함량에 따라 통상적인 방법으로 마스크 제형을 제조하였다.
전성분명 (함량: 중량% ) 제형예 1
세테아릴 알코올 0.5
글리세릴 스테아레이트/PEG-100 스테아레이트 0.5
PEG-40 스테아레이트 0.8
C14-22 알콜/C12-20 알킬 글루코시드 0.2
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 3
하이드로제네이티드 폴리데센 1
사이클로펜타실록산 3
정제수 54.1
글리세린 1
디프로필렌 글리콜 4
카보머 8.5
잔탄검 10
아크릴레이트/C10-30 알킬 아크릴레이트 크로스폴리머 8.5
디소듐 EDTA 0.4
트로메타민 4.5
복합 효소 분말 2
1,2-헥산디올 1
합계 100
[실험예]
프로테아제 정량 분석
프로테아제 활성은 카제인에 프로테아제가 작용할 때 펩타이드 결합의 절단에 의해 증가되는 산가용성 저분자 분해산물의 양을 폴린 반응으로 비색 측정하여 구한다. 그 단위는 조작법의 조건에 따라 시험할 때 1분간에 티로신 1 ㎍에 상당하는 폴린 시액 정색물질의 증가를 나타내는 효소량을 1 unit으로 정의한다. 이때, 아스퍼질러스 오리재 Enz-5 및 비교예 1~2의 프로테아제 활성은 상기 실시예 2-1에서 확인한 초기 수분 50%, 통기량 0.05 내지 0.5 vvm 및 발효시간 66시간의 조건에서 측정하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 통상적인 고체 발효 조건으로 배양한 아스퍼질러스 오리재(A. oryzae) Enz-5의 조효소액, 아스퍼질러스 오리재(A. oryzae) KCCM 11372(비교예 1) 및 아스퍼질러스 니거(A. niger) KCCM 11239(비교예 2)의 프로테아제 정량 분석을 하기 방법에 따라 실시하였다.
먼저, 상기 실시예 2-1의 고체 발효물 3 g에, 염화 나트륨이 첨가된 구연산염 버퍼(citric acid buffer) 30 ㎖를 가해 상온에서 1시간 동안 추출하였다. 이후, 상기 추출된 추출액을 4000 rpm, 20분간 원심 분리하여 상등액을 0.45 ㎛ 시린지 필터(syringe filter)로 여과하여 아스퍼질러스 오리재 Enz-5 조효소 추출액을 얻었다. . 상기 얻어진 아스퍼질러스 오리재 Enz-5 조효소액을 희석하였다. 이때, 효소의 활성이 알려지지 않았을 경우에는 희석액 별로 적절히 반응시켜 티로신(tyrosin) 기준 범위에 포함되는 희석 배수를 선택하였다. 이후, 상기 조효소액 0.5 ㎖ 및 맥클베인 버퍼(McIlvaine buffer) (pH 6.0) 1 ㎖를 글래스 테스트 튜브에 넣고 40 ℃에서 5분간 예열하였다. 이때, 기질용액을 또 다른 테스트 튜브에 넣고 40℃에서 5분간 예열하였다. 이후, 상기 예열된 조효소액에 기질용액 1.5 ㎖을 일정시간 간격으로(10초 혹은 20초 간격) 넣고 즉시 혼합하였다. 상기 조효소액 및 기질용액 혼합물을 40 ℃ ± 0.5에서 60분 동안 반응 시킨 후 정확히 반응 60분이 되는 시점에서 반응정지액(0.4M TCA용액, 트리클로로아세트산(Trichloroacetic acid)) 3 ㎖를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 상기 혼합물의 최종 부피는 5 ㎖가 되었으며 반응정지액을 첨가한 직후 하얀색의 침전이 발생하는 것을 확인할 수 있었다. 반응이 종료된 용액은 와트만지(Watman paper) #2를 이용하여 여과하고 여과액 1 ㎖를 테스트 튜브에 옮겼다. 이후, 상기 여과액 1 ㎖, 0.4M 탄산나트륨 용액 5 ㎖ 및 페놀시약 1 ㎖를 순서로 첨가하여 혼합하고 40℃에서 30분간 반응시킨 후 흡광도계 660 ㎚에서 발색 반응을 확인하였다.
한편, 비교예 1~2의 경우, 상기와 동일한 방법으로 조효소액 및 기질 혼합물을 반응시켰다. 이때, 조효소액 0.5 ㎖, 맥클베인 버퍼 (pH 6.0) 1 ㎖, 0.4M TCA 3 ㎖ 및 기질용액 1.5 ㎖의 용량으로 하였다. 이후, 상기와 동일한 방법으로 여과액을 얻어 발색 반응을 확인하였다.
도 4는 아스퍼질러스 오리재 Enz-5 및 비교예 1~2의 프로테아제 활성을 비교한 그래프이다. 도 4에 나타난 바와 같이, 아스퍼질러스 오리재(A. oryzae) KCCM 11372(비교예 1) 및 아스퍼질러스 니거(A. niger) KCCM 11239(비교예 2)과 비교하여 아스퍼질러스 오리재(A. oryzae) Enz-5의 프로테아제 활성이 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다. 즉, 일 양상에 따른 아스퍼질러스 오리재 Enz-5는 상기 실시예 2-1에서 확인한 수분, 발효시간 및 통기량 조건에서 프로테아제 발현이 우수한 바, 상기 균주로 발효된 발효물을 포함하는 화장료 조성물은 피부 각질 또는 피지 제거에 탁월한 효과가 있다.
리파아제 정성 분석
최적의 효소 생성 조건에서 배양한 상기 실시예 2-1의 아스퍼질러스 오리재(A. oryzae) Enz-5 고체 발효물의 리파아제 정성 분석을 위하여, 상기 실시예 2-1의 고체 발효물 10g에 멸균수 100㎖를 넣고 250 rpm에서 30분간 추출한 후, 0.45㎛ 막 여과하여 여과액을 얻었다. 이후, API® ZYM kit의 분석 매뉴얼에 따라 효소의 정성 분석을 진행하였다.
도 5는 아스퍼질러스 오리재 Enz-5 고체 발효물의 발효 전 후의 리파아제 활성을 확인한 결과이다. 도 5에 나타난 바와 같이, 발효 후 생성된 효소들에 의해 기질이 분해되면서 기질에 붙어있던 염료가 색을 띄는 바, 아스퍼질러스 오리재 Enz-5의 리파아제 활성을 확인할 수 있었다. 즉, 일 양상에 따른 아스퍼질러스 오리재 Enz-5는 리아파제 활성을 가지는바, 상기 균주로 발효된 발효물을 포함하는 화장료 조성물은 피부 표면의 유분기를 제거하는데 탁월한 효과가 있다.
피부 자극 확인
상기 실시예 2-2에서 제조한 복합 효소 분말의 피부 자극 여부를 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2-2의 복합 효소 분말을 증류수에 각각 0, 1, 5, 10% 농도로 녹인 후, 각 35 ㎕씩 피부 시험부위에 도포하였다. 48시간 동안 피부에 첩포 하였으며, 첩포를 제거한 후에는 마킹펜으로 시험부위를 표시하여 각각 30분, 24시간 및 120시간 경과 후에 시험부위를 관찰하였다. 피부반응은 국제 접촉피부염연구외(ICDRG: International Contact Dermatitis Research Group)의 평가기준에 따라 자극 정도를 하기 표 2와 같이 분류하고 그 결과를 하기 표 3에 나타냈다.
평균점수 판정(등급) 설명
0.00~0.75 무자극(1)
0.76~1.50 미자극(2) 희미한 또는 가까스로 감지할 수 있는 가벼운 홍반
1.15~2.50 경자극(3) 경계가 뚜렷하나 약한 홍반, 부종 및 구진
2.51~4.00 중자극(4) 뚜렷한 홍반, 구진 및 소수포
4.01~ 강자극(5) 심한 홍반 및 대수포, 가피 형성
농도(%) 반응지수 반응도 평균피부반응도
30분 24시간 120시간
0 0 0.0 0.0 0.0 0.00
1 0 0.0 0.0 0.0 0.00
5 0 0.0 0.0 0.0 0.00
10 1 0.0 0.5 0.0 0.19
그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이 0 내지 5%의 농도에서 반응지수는 모두 0이고, 평균피부 반응도 역시 0으로 나타났으며, 10%의 농도에서 반응지수 1, 평균피부반응도가 0.19인 것으로 나타났다. 상기 표 2에 의할 때, 복합 효소제 분말은 0 내지 10%의 농도에서 피부에 자극이 없는 것을 확인할 수 있다.
각질 제거 효과 확인
상기 실시예 3에서 제조한 마스크 제형의 각질 제거 효과를 확인하였다. 구체적으로, 20세 이상의 건강한 성인 남녀 5명(평균 연령 30.5세)을 대상으로 마스크 제형을 얼굴에 사용하도록 하였다. 마스크 제형을 얼굴에 사용하기 전, 사용 30분 후의 각질량을 Skin visiometer(SV-600, Germany)를 이용하여 측정하였다. 2x2 크기의 테이프를 피부에 접촉시키고 5초간 눌러준 후 각질이 묻은 테이프를 측정 카메라의 편광에 조사하여 이미지 분석을 통해 면적당 각질량을 측정하였다.
도 6은 복합 효소 분말이 첨가된 마스크를 얼굴에 적용한 후, 각질 제거 정도를 나타낸 그림(a) 및 그래프(b)이다. 도 6(a)에 나타난 바와 같이, 마스크를 사용한 후에 각질의 양이 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 각질 제거 정도를 수치화한 도 6(b)에 나타난 바와 같이, 마스크를 사용한 후에 각질의 양이 75.5% 감소한 것을 확인할 수 있었다. 즉, 일 양상에 따른 아스퍼질러스 오리재 Enz-5 균주의 발효물은 피부의 각질을 효과적으로 제거할 수 있다.
블랙헤드 및 화이트헤드 제거 효과 확인
상기 실시예 3에서 제조한 마스크 제형의 블랙헤드 및 화이트헤드 제거 효과를 확인하였다. 구체적으로, 20세 이상의 건강한 성인 남녀 5명(평균 연령 30.5세)을 대상으로 마스크 제형을 4주 동안 2일 간격으로 1회씩 얼굴에 사용하도록 하였다. 마스크 제형을 얼굴에 사용하기 전, 사용한 후 2주차, 4주차에 Digital dermascope(DE300, USA)로 측정하여 얻은 이미지를 육안 평가하였다.
도 7은 복합 효소제 분말이 첨가된 마스크를 얼굴에 적용한 후, 블랙헤드, 화이트헤드 및 모공의 크기 변화를 나타낸 사진이다. 도 7에 나타난 바와 같이, 시험자 5명 모두 마스크를 사용한 후에 모공의 크기가 유의적으로 감소하였으며 블랙헤드 및 화이트헤드가 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 즉, 일 양상에 따른 아스퍼질러스 오리재 Enz-5 균주의 발효물은 모공의 크기를 감소시킬 뿐만 아니라, 블랙헤드 및 화이트헤드를 효과적으로 제거할 수 있다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM12426P 20190111
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Claims (17)

  1. 프로테아제 활성을 가지는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) Enz-5 균주 (수탁번호: KCCM12426P).
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 아스퍼질러스 오리재는 서열번호 1에 기재된 염기서열을 갖는 16S rDNA 유전자를 포함하는 것인 균주.
  3. 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 균주에 의해 발효된, 발효 효소제.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 균주는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) Enz-5 균주 (수탁번호: KCCM12426P)인 것인 발효 효소제.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 발효는 고체 발효인 것인 발효 효소제.
  6. 청구항 3에 있어서, 상기 균주를 곡류에 접종하여 고체 배양한 것인 발효 효소제.
  7. 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 균주 또는 그에 의해 발효된, 발효 효소제를 포함하는 피부상태 개선용 화장료 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 발효 효소제는 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 5 중량%로 포함되는 것인 조성물.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 피부상태는 피부 각질 제거 또는 피지 제거인 것인 조성물.
  10. 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 균주 또는 그에 의해 발효된, 발효 효소제를 포함하는 피부 상태 개선용 식품 조성물.
  11. 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 균주 또는 그에 의해 발효된, 발효 효소제를 포함하는 피부 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 피부 질환은 피지낭종, 지루성 피부염 및 모공 각화증으로 구성된 군에서 선택되는 것인 조성물.
  13. 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 균주를 배양하는 단계; 및
    배양 후 얻어진 균체 배양액을 곡류에 접종한 후 발효하여 발효물을 제조하는 단계를 포함하는 발효 효소제의 제조방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 배양은 초기 수분함량이 20 내지 70%인 배지에서 배양되는 것인 방법.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 발효는 고체 발효인 것인 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 고체 발효는 50 내지 70시간 동안 수행되는 것인 방법.
  17. 청구항 13에 있어서, 상기 발효물을 멸균수와 혼합한 후 추출하여 제조한 효소액을 건조시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
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