KR101803265B1 - 대기오염물질에 의한 피부손상의 방지효과가 있는 수수발효물 및 이를 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대기오염물질에 의한 피부손상의 예방효과가 있는 수수발효물 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 수수를 추출한 후 당분해효소로 당화처리한 다음, 발효미생물로 발효시켜 수수발효물을 수득함으로써, 본 발명에 따른 수수발효물과 이를 함유하는 화장료 조성물이 유해산소(수퍼옥사이드 라디칼 및 하이드록시 라디칼)를 제거하고, 오존과 이산화질소에 의한 세포손상을 억제하며, 콜라겐분해효소인 MMP-1의 발현을 억제하고 콜라겐생성효소인 TIMP-1의 발현을 촉진하여 콜라겐의 합성을 촉진하고, 세포독성이 없으며, 대기오염물질에 의한 피부손상을 방지하는 효과가 있다.

Description

대기오염물질에 의한 피부손상의 방지효과가 있는 수수발효물 및 이를 함유하는 화장료 조성물{The cosmetic composition for prevention effect of skin damage by air pollutants}

본 발명은 대기오염물질에 의한 피부손상의 예방효과가 있는 수수발효물 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 수수를 추출한 후 당분해효소로 당화처리한 다음, 발효미생물로 발효시켜 수수발효물을 수득함으로써, 본 발명에 따른 수수발효물과 이를 함유하는 화장료 조성물이 유해산소(수퍼옥사이드 라디칼 및 하이드록시 라디칼)를 제거하고, 오존과 이산화질소에 의한 세포손상을 억제하며, 콜라겐분해효소인 MMP-1의 발현을 억제하고 콜라겐생성효소인 TIMP-1의 발현을 촉진하여 콜라겐의 합성을 촉진하고, 세포독성이 없으며, 대기오염물질에 의한 피부손상을 방지하는 효과가 있다.

현대사회는 국민의 생활수준이 향상되고 도시화가 되어 감에 따라 화학연료의 사용 및 자동차의 수요가 증가되고 있으며, 이로 인해 오존, 이산화질소, 이산화황, 일산화탄소, 미세먼지 등의 대기오염물질이 증가하여 심각한 대기오염 문제를 발생하고 있다. 종래에는 대기오염물질을 대기오염의 원인으로서만 인식하였으나, 최근 대기오염물질이 천식, 알레르기성 비염 등의 호흡기 질환, 아토피피부염, 알레르기성 피부질환 등에 영향을 미치는 것으로 알려지면서, 인체건강을 위협하는 직접적인 원인으로 인식되고 있으며, 오늘날 뉴스에는 미세먼지 및 오존 주의보가 기상정보와 함께 예보되고 있다.

대기오염물질과 피부손상 및 노화의 연관성은 대도시에서의 대기오염 관련 피부질환 환자수가 농어촌지역보다 많다는 것을 미루어 보아 알 수 있다. 최근 미세먼지 농도가 우리나라의 평균보다 높은 지역인 인천의 공장지대 인근 초등학교 아토피피부염 학생 41명을 대상으로 한 연구에서도 전일 미세먼지 농도는 유의하게 다음날 피부 가려움증 증상을 3.1% 증가시킨다고 하여, 높은 대기오염물질의 농도는 피부에 직접 영향을 미쳐 아토피피부염을 악화시킬 수 있음을 시사한다.(Song S et al., En-viron Res, volume 111:394-399, 2011). 또한, 다른 역학적 연구에서는 미세먼지 노출이 주름과 색소반점이 증가되는 피부노화와 직접적인 연관성이 있다고 보고하고 있는데, 미세먼지가 피부의 모낭을 통해 피부 내로 침투하여 피부세포기능에 영향을 주는 것으로 알려져 있다(Vierkotter A et al., J Invest Dermatol 130:2719-2726, 2010). 또한, 오존이 다양한 피부질환과 상관관계가 있음이 최근 다른 연구에 의해 밝혀지고 있다.

이러한 대기오염물질 중 오존, 이산화질소 및 미세먼지는 피부에서 라디칼 반응을 유발하여 피부노화를 촉진하게 된다. 일반적인 피부노화는 유전적으로 결정되고 시간경과에 의해 일어나는데, 이를 내인적 피부노화라고 한다. 반면, 환경요소에 의해 발생하는 피부노화는 외인적 피부노화라고 한다. 각각의 피부노화는 특징적인 증상을 나타내며, 내인적 피부노화는 피부가 건조하고 잔주름이 생기고 탄력성이 감소하는 증상을 주로 나타내는 반면, 외인적 피부노화는 거친 주름과 불균일한 색소침착을 주로 나타낸다.

대기오염물질 중 미세먼지는 피부에 부착되어 피부의 염증반응을 일으키고 피부장벽기능을 손상시켜 아토피피부염 등의 피부질환을 유발한다. 또한, 미토콘드리아에서 활성산소(reactive oxygen species)를 생산하여 콜라겐 합성을 감소시키고 콜라겐 분해를 증가시켜 피부노화를 일으키며, 미세먼지에 흡착된 PAH(다환방향족탄화수소)가 멜라닌 세포를 증식시켜 피부에 색소반점을 증가시키기도 한다.

한편, 피부는 자동차 배기가스 중 한가지인 이산화질소와 자외선의 반응에 의해 생긴 오존에 직접적인 노출 및 접촉에 의해 손상되기도 한다. 이중 오존은 그 화학적인 성질로 인해 강력한 산화제로 작용한다.

오존은 피부의 피지, 세포막 지질의 불포화지방산 등과 반응을 일으키고, 이 반응과정에서 생긴 산화물질은 여러 가지 산화작용을 일으킨다. 또한, 피부에서의 비타민 C 및 E의 파괴를 유도하고 지질의 과산화를 일으켜 산화적 스트레스를 초래하며, 결국 피부노화를 유발한다. 오존에 의해 발생되는 산화물질에는 Superoxide radical(O₂ ^-·), Hydrogen peroxide(H₂O₂), Singlet oxygen(¹O₂) 등이 알려져 있다.

이산화질소는 피부에서 질소아민과 질산을 발생시켜 피부를 자극하고 결과적으로 아토피성 피부염을 유발하며, 자유라디칼을 생성하여 지질의 과산화 및 세포막 손상을 일으켜 피부노화를 촉진한다.

활성산소(reactive oxygen species)란 산소의 산화물로서, 라디칼 및 이것으로부터 파생된 여러 가지 비라디칼 산소화합물을 총칭하며, 유해산소로 부르기도 한다. 활성산소에는 Superoxide radical, Hydroxyl radical과 같은 자유라디칼 이외에 Hydrogen peroxide, Singlet oxygen 등이 있다. 활성산소는 매우 큰 반응성으로 인하여 세포 내 단백질, 지질뿐만 아니라 핵산과 결합하여 구조의 변화를 유발한다. 세포대사에 사용되는 산소는 전체 산소의 90-95%가 미토콘드리아에서 ATP를 만들어내는 과정에서 소모되고, 1-2%는 활성산소로 전환된다.

자유라디칼 이론(Free radical theory)은 1950년대 중반 디 하만(D. Harman)에 의해서 제시되었는데, 이 이론에 따르면 세포손상은 자신의 세포에서 생성된 라디칼에 의해 일어난다. 일반적으로 안정한 상태의 분자는 전자들이 쌍을 이루고 있는데, 전자가 여러 가지 이유에 의해 쌍을 이루지 못하면 자유라디칼이 된다. 인체에 라디칼이 존재하는 원인에는 여러 가지가 있으며, 이러한 라디칼은 세포를 파괴하거나, 피부진피층의 결합조직을 절단하거나 교차결합을 일으켜, 주름형성, 피부암, 세포살상, 류마티스성 관절염, 아토피성 피부염, 여드름 등 여러 가지 문제를 유발한다. 라디칼이 생성되는 원인에는 백혈구의 식작용, 미토콘드리아에서의 ATP 생산과정 중 전자 전달계, 미엘로퍼 옥사이드(Myeloper Oxide; MPO)의 작용, 자외선, 담배, 정상적인 대사 과정, 스트레스, 공해 물질, 세균 등이 있다.

물론 인체에는 라디칼 소거제로서 항산화물질인 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 (SuperOxide Dismatase; SOD), 카탈라아제, 비타민 E, 비타민 C, 유비퀴놀 (Ubiquinol) 등이 있으나, 인체의 항산화 체계가 나이, 스트레스, 대기오염물질, 자외선 등에 의해 점차적으로 깨지기 시작하면서 무력화되고, 라디칼은 지속적으로 증가하게 된다. 인체 내 증가된 라디칼은 진피의 결합조직인 콜라겐(Collagen), 엘라스틴(Elastin), 히아루론산(Hyaluronic acid) 등을 파괴하여 피부의 일정부위의 침하현상(주름)을 일으키고, 세포막의 지질을 산화시켜 세포파괴를 유발하며, 최종적으로 피부염, 여드름, 피부암 등의 피부질환을 일으킨다. 또한, 라디칼은 멜라닌 형성과정 중 자발적인 산화반응(도파퀴논이 멜라닌으로 생성)에 관여하여 기미, 주근깨, 주름생성의 원인이 되기도 한다(대한 화장품학회지 23권 1호 75~132).

한편, 생체 내에서의 콜라겐 합성과 분해는 콜라겐 분해에 관련된 기질 단백질 분해효소 (matrix metalloproteinase, MMP) 및 MMPs 작용을 저해하는 tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMPs)에 의해 조절된다. 기질 단백질분해효소는 여러 효소의 집합으로 구조와 기능적 특성에 따라 여러 개의 집단으로 나누어지는데, 이 중 피부의 대표적인 콜라겐인 콜라겐 Type 1은 MMP-1에 의해 분해되고, MMP-1의 작용은 세포의 항상성을 유지하기 위해 분비되는 2-marcroglobulin 이나 TIMP-1과 같은 저해제에 의해 활성이 조절된다. 이러한 MMPs 및 TIMPs 등의 효소들은 섬유아세포를 포함한 대다수의 세포들에서 분비된다.

종래에는 피부보습력을 증가시켜 피부노화를 억제하기 위한 방법으로, 콜라겐을 화장료에 혼합한 제품들을 사용하였으나, 이러한 화장품은 피부 표면에 고분자의 콜라겐을 도포하는 것이서, 콜라겐이 경피흡수되는 것이 어려워 피부보습작용을 기대할 수 없었으며, 본질적인 피부노화 방지라고 말할 수 없었다. 이에, 근본적으로 피부노화를 억제하기 위하여 피부 내 콜라겐의 합성을 촉진하는 물질에 대한 관심이 높아졌으며, 그와 관련된 다양한 연구를 통해 콜라겐 합성의 촉진물질로 레티노익애씨드 및 그 유도체, TGF(transforming growth factor), 동물 태반 유래의 단백질(JP 8-231370), 베툴린산(betulinic acid, JP 8-208424), 클로렐라 추출물(JP 9-40523,JP 10-36283) 등이 알려졌다. 상기 콜라겐 합성 촉진물질 중에 레티노익애씨드 및 그 유도체가 일반적으로 사용되고 있다.

레티노익애씨드 및 그 유도체는 콜라겐 합성을 돕는데 효과가 있으나, 피부자극 및 피부발적 등의 안정성 문제가 있어 사용이 제한된다. 또한, 피부에 레티노익애씨드 및 그 유도체를 바른 후 자외선에 노출시키면, 레티노익애씨드 및 그 유도체는 자외선과 반응하여 피부 부작용을 유발할 수 있고, 대기오염물질인 오존, 이산화질소, 미세먼지로 인한 피부노화를 개선하는데 효과가 미미하여 실질적인 피부노화 예방효과를 기대할 수 없다.

국내에서는, 대기오염물질 즉, 오존, 이산화질소, 미세먼지에 의한 피부손상 관련 연구는 미미한 실정이며, 이러한 사정으로 관련 기술이나 제품의 연구개발이 이루어지지 않고 있다. 따라서, 피부손상 및 피부노화에 영향을 미칠 수 있는 오존, 이산화질소, 미세먼지 등의 대기오염물질로부터 피부손상 및 피부노화를 예방 또는 억제하는 효과가 우수하고, 피부에 안전하며, 화장품에 용이하게 적용할 수 있고, 제형에 있어서 안정성이 있는 소재의 개발이 요구된다.

본 발명자들은 대기환경오염물질로 인한 피부손상 및 피부노화를 예방 및 억제하는 효과가 있는 근본적인 물질을 찾고자 다양한 천연물을 이용한 연구를 거듭한 결과, 수수발효물에 유해산소(수퍼옥사이드 라디칼 및 하이드록시 라디칼)를 제거하고, 오존과 이산화질소에 의한 세포손상을 억제하며, 콜라겐분해효소인 MMP-1의 발현을 억제하고 콜라겐생성효소인 TIMP-1의 발현을 촉진하여 콜라겐의 합성을 촉진하고, 세포독성이 없으며, 대기오염물질에 의한 피부손상을 방지하는 효과가 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 대기오염물질 중 오존과 이산화질소에 의한 피부손상의 방지효과가 있는 수수발효물 및 이를 함유하는 화장료 조성물을 제공하는데 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 대기오염물질 중 오존과 이산화질소에 의한 피부손상의 방지효과가 있는 수수발효물 및 이를 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 수수발효물과 이를 함유하는 화장료 조성물은 유해산소(수퍼옥사이드 라디칼 및 하이드록시 라디칼)를 제거하고, 오존과 이산화질소에 의한 세포손상을 억제하며, 콜라겐분해효소인 MMP-1의 발현을 억제하고 콜라겐생성효소인 TIMP-1의 발현을 촉진하여 콜라겐의 합성을 촉진하고, 세포독성이 없으며, 대기오염물질에 의한 피부손상을 방지하는 효과가 있다.

본 발명자들은 대기환경오염물질로 인한 피부손상 및 피부노화를 예방 및 억제하는 효과가 있는 근본적인 물질을 찾고자 다양한 천연물을 이용한 연구를 거듭한 결과, 수수발효물에 매우 우수한 유해산소(수퍼옥사이드 라디칼 및 하이드록시 라디칼)의 제거, 콜라겐 합성촉진, 대기오염물질에 의한 피부손상을 방지하는 효능을 나타냄을 발견하고, 이 수수발효물을 화장료 조성물에 적용하여 피부안정성 문제를 동시에 해결하였다.

또한, 상기 수수발효물을 화장료 조성물에 일정 농도이상으로 배합하여 피부에 직접 도포한 실험결과에서도 피부상태가 개선되는 효과를 발휘하게 됨을 발견하게 되었다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.

본 발명은 수수를 분쇄, 추출, 농축 후, 당분해효소로 당화처리시킨 다음, Aspergillus 또는 Lactobacillus 또는 Bacillus 또는 Saccharomyce 또는 이들의 혼합물로 발효되는 것을 특징으로 하는 대기오염물질에 의한 피부손상을 방지하는 효과를 갖는 수수발효물을 제공하고, 상기 수수발효물을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

수수(Sorglum Bicolor)는 외떡잎식물 벼목 화본과의 한해살이풀로, 내건성이 강해 척박한 땅이나 건조한 땅에서도 자생하여 아시아 및 아프리카 전역에서 중요한 식량원으로 재배되고 있으며, 우리나라에서도 쌀, 보리, 밀, 옥수수와 함께 식량자원으로 재배되고 있다. 수수에는 다양한 품종이 존재하고, 용도에 따라 곡용수수(grain sorghum), 단수수(sorgo), 장목수수(broom-corn)로 분류된다(Chang et al., 2005). 장목수수는 이삭에 마디가 없고 꼬투리에 달린 줄기의 길이는 20~30cm이며, 열매는 두꺼운 껍질이 탈곡을 해도 벗겨지지 않기 때문에 종자로만 이용된다. 민간요법에서는 수수를 식욕개선, 소화촉진, 체온유지, 위장보호, 해독 등의 다양한 증상에 활용해왔다. 수수에는 식이섬유, phenolic compounds, tannins 등의 다양한 유효 성분이 함유되어있다고 알려져 있으나, 붉은수수는 tannin이 함유되어 있지 않는 특징이 있다. 수수에 함유된 phenolic compounds는 flavonoids, phenolic acids, antocyanins 등으로 구성되어 있으며, 대부분이 flavonoids로 알려져 있다(Ryu HS, Kim J, Kim HS. 2006. Enhancing effect of sorghum bicolor L. Moench (sorghum, su su) extracts on mouse spleen and macrophage cell activation. J. Korean Diet. Assoc. 19: 176-182.) (Chae KY, Hong JS. 2006. Quality characteristics of Sulgidduk with different amounts of waxy sorghum flour. Korean J Food Cookery Sci 22: 363-369., Chang HG, Park YS. 2005. Effects of waxy and normal sorghum flours on sponge cake properties. Food Eng Prog 9: 199-207.) (Kim KO, Kim HS, Ryu HS. 2006. Effect of Sorghum bicolor L. Moench(sorghum, su-su) Water extracts on mouse immune cell activation. J Korean Diet Assoc 12: 82-88.).

상기 수수는 수수의 전 부위를 사용할 수 있지만, 줄기 또는 잎을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명은 상기 수수로부터 유해산소(수퍼옥사이드 라디칼 및 하이드록시 라디칼)를 제거하고, 오존과 이산화질소에 의한 세포손상을 억제하며, 콜라겐분해효소인 MMP-1의 발현을 억제하고 콜라겐생성효소인 TIMP-1의 발현을 촉진하여 콜라겐의 합성을 촉진하고, 세포독성이 없으며, 대기오염물질에 의한 피부손상을 방지하는 효과를 나타내는 수수발효물을 수득하기 위하여, 수수를 분쇄, 추출, 농축의 단계를 순차적으로 수행한 후, 당분해효소에 의한 당화과정을 수행하여 발효를 위한 당원 및 탄소원을 확보한 다음, Aspergillus, Lactobacillus, Bacillus, Saccharomyce 또는 이들의 혼합물로 발효시켜 수수발효물을 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 수수발효물의 제조방법을 각 단계별로 나누어서 설명하면 다음과 같다.

공기가 잘 통하는 음지에서 건조시킨 수수를 분쇄기에 넣어 분쇄하여 수수분말을 얻는 단계(1)를 수행한다.

상기 수수분말을 추출용매와 혼합하여 60 내지 70℃에서 2 내지 10시간동안 추출하는 단계(2)를 수행한다. 상기 추출용매는 당업계에 공지된 다양한 추출용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 물, 유기용매 또는 물과 유기용매의 혼합물을 사용하여 추출할 수 있다. 더욱 바람직하게는 물과 에탄올의 혼합물을 사용하여 수득할 수 있다. 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 글리세린 중 어느 하나이거나, 이들 중 둘 이상의 혼합물을 포함한다.

상기 단계(2)에서 추출용매로 물과 에탄올을 혼합하여 에탄올의 농도가 5 내지 50%(v/v)인 에탄올 혼합액을 제조하였으며, 상기 단계(1)에서 얻은 수수분말을 에탄올 혼합액의 총 부피대비 2 내지 20%(w/v)로 혼합하여 60 내지 70℃의 온도에서 2 내지 10시간 동안 추출을 진행하였다. 바람직하게는 에탄올의 농도가 30%(v/v)인 에탄올 혼합액에 수수분말을 5 내지 10%(w/v)로 혼합하여, 65℃에서 4 내지 6시간 동안 추출하였으며, 확보된 결과물은 상온으로 유지한 후 원심분리 또는 막 필터를 이용하여 고상과 액상으로 분리하였다.

상기 단계(2)에서 추출하여 얻은 액상은 농축기를 이용하여 에탄올 혼합액을 제거하는 단계(3)를 수행한다. 상기 단계(3)는 단계(2)에서 얻은 액상을 회전증발감압농축기(BUCHI 사 제품)에 투입하여 100 mbar 이하의 압력, 농축온도 50℃, 회전속도 30rpm의 조건으로 농축한다. 상기 단계(3)을 수행하여 에탄올 혼합액을 제거하며, 이때 농축물의 브릭스는 5 내지 10 브릭스(Brix)가 되도록 한다.

상기 단계(3)에서 얻은 농축물에 당분해효소를 혼합하여 효소처리 한 후 전처리하는 단계(4)를 수행한다. 상기 단계(3)에서 얻은 농축물과 당분해효소를 혼합하여 최적의 온도에서 12 내지 48시간동안 효소처리한 다음, 100℃에서 10 내지 60분간 가열하여 당분해효소를 불활성시킨 후, 정제 및 농축과정을 거쳐 전처리된 수수부유물을 제조하였다. 상기 당분해효소로는 아밀라아제(Amylase), 글루코시데이즈(Glucosidase), 인베르타아제(Invertase), 셀룰라아제(Cellulase) 또는 글루코아밀라아제(Glucoamylase) 중 어느 하나이상을 선택하여 사용할 수 있다.

상기 단계(4)에서 전처리된 수수부유물을 배양배지에 일정량을 첨가하여 발효하는 단계(5)를 수행한다. 상기 단계(4)에서 전처리된 수수부유물은 배양배지에 넣어, 전배양을 통해 활성을 높인 Aspergillus 또는 Lactobacillus 또는 Bacillus 또는 Saccharomyce 또는 이들의 혼합물과 혼합하여 발효를 진행하였으며, 바람직하게는 Aspergillus에 속하는 Aspergillus oryzae(A. oryzae) 균주를 이용하여 발효하였다.

상기 단계(5)의 발효는, PDA 고체배지에서 배양시킨 A. oryzae 균을 액상배지의 전체 부피대비 0.5%(w/v)가 되도록 접종하여 48시간동안 배양시킨 후, 상기 배양된 A. oryzae 균을 수수부유물 전체중량의 0.5%(v/v)가 되도록 접종한 다음, 발효기를 이용하여 30 ~ 37℃, pH 6.0 ~ 8.0, 교반속도 200 ~ 250 rpm, 24 ~ 48시간의 배양조건에서 발효한 후, 121℃, 60분, 1.5기압의 조건에서 멸균하였다. 발효미생물이 더 이상 증식할 수 없도록 멸균시킨 발효물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GF/C 150 mm 여과지로 2번 여과하여 최종적으로 0.1 ㎛이하의 수수발효물을 정밀 여과하였다. 그리고 감압농축기를 이용하여 50℃에서 농축한 후, 동결 건조하여 수수발효분말을 수득하였다.

본 발명의 수수발효물은 세포독성이 없고, 유해산소(수퍼옥사이드 라디칼 및 하이드록시 라디칼)를 제거하고, 오존과 이산화질소에 의한 세포손상을 억제하며, 콜라겐분해효소인 MMP-1의 발현을 억제하고 콜라겐생성효소인 TIMP-1의 발현을 촉진하여 콜라겐의 합성을 촉진하는 효과가 탁월하다.

또한, 본 발명에 따른 수수발효물을 함유하는 화장료 조성물은 피부독성이 없고, 세포 내 유해산소(수퍼옥사이드 라디칼 및 하이드록시 라디칼)를 제거하고, 오존과 이산화질소에 의한 세포손상을 억제하며, 콜라겐분해효소인 MMP-1의 발현을 억제하고 콜라겐생성효소인 TIMP-1의 발현을 촉진하여 콜라겐의 합성을 촉진하는 효과가 탁월하고, 대기오염물질인 오존과 이산화질소에 의한 피부손상을 방지하는 효과가 탁월하다.

본 발명에 따른 대기오염물질에 의한 피부손상의 방지효과가 있는 수수발효물을 함유하는 화장료 조성물은 액상의 중량으로서 0.1 내지 30%으로 수수발효물을 포함할 수 있고, 건조중량으로서 0.001 내지 5 중량%으로 수수발효물을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.01 내지 5 중량%으로 수수발효물을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 수수발효물을 함유하는 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 화장수, 영양로션, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩 등의 제형을 가질 수 있다.

또한, 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기의 수수발효물 외에 다른 성분들은 기타 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 임의로 선정하여 배합할 수 있다.

이하, 실시예 및 시험예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예 및 시험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 수수발효물의 제조

강원도 원주 인근에서 구입한 수수를 흐르는 물에 수세하여 이물질을 제거 한 후에 공기가 잘 통하는 음지에서 건조시켜 분쇄기로 분쇄하여 수수분말로 제조하고, 분쇄된 수수분말 1Kg은 물과 에탄올이 혼합되어 에탄올의 농도가 30%(v/v)인 에탄올 혼합액 10L에 첨가하여 65℃에서 5시간 동안 추출하였다. 그리고 상온으로 냉각시킨 후, GF/C 사이즈의 여과 필터(Adventec)로 여과하여 여과액을 분리한 다음, 상기 여과액은 회전증발감압농축기(BUCHI 사 제품)로 감압농축하여 brix 10의 농축액을 확보하였다. 확보된 농축액은 당분해효소로 온도 20~40℃, 12 내지 48 시간 동안 반응시켜 발효력을 증진시키기 위한 당화과정을 진행한 다음, 100℃에서 10 내지 60분간 가열하여 당분해효소를 불활성시켰다. 당분해효소의 반응으로 낮아진 브릭스(Brix)를 10으로 보정하기 위해, 재차 회전증발 감압농축기로 감압농축을 진행하여 전처리된 수수농축액을 제조하였다. 전처리된 수수농축액은 발효를 위한 배지 10L에 5~20%의 함량이 되도록 투입한 후 121℃의 온도에서 15분간 멸균처리 하였으며, 전배양시킨 A. oryzae 발효균주를 멸균된 배지에 0.5%로 접종하여 발효하였다. 발효는 온도 37℃, pH 6.0~8.0, 교반속도 200~250 rpm, 배양시간 48시간의 조건으로 진행하였으며, 발효가 완료된 후 더 이상 발효가 진행되지 않도록 발효액을 멸균(121℃, 60분, 1.5기압)하였다. 발효미생물이 더 이상 증식할 수 없도록 멸균시킨 발효물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GF/C 150 mm 여과지로 2번 여과하여 최종적으로 0.1 ㎛이하의 발효물을 정밀 여과하였다. 그리고 감압농축기를 이용하여 50℃에서 농축한 농축물을 동결 건조하여 수수발효분말 132.5 g을 얻었다.

비교예 1. 수수추출물의 제조(용매- 30%(v/v) 에탄올)

강원도 원주 인근에서 구입한 수수를 흐르는 물에 수세하여 이물질을 제거 한 후에 공기가 잘 통하는 음지에서 건조시켜 분쇄기에 넣어 분쇄한 분말 1Kg에 30%(v/v) 에탄올 10를 넣고, 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 80℃의 중탕조건하에서 5시간동안 추출한 후, 뜨거울때 300메쉬로 여과하여 고상과 액상을 분리한 다음, 액상을 오염되지 않도록 밀봉하여 3일간 실온에서 방치하여 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GF/C 293mm 여과지로 2번 여과시켰다. 그리고 감압농축기를 이용하여 50℃에서 농축한 후 동결건조기(일신랩 제품)를 이용하여 건조시켜 건조중량으로 수수추출분말 95.6g을 얻었다.

비교예 2. 수수추출물의 제조(용매- 70%(v/v) 에탄올)

추출용매로 70%(v/v) 에탄올을 이용하여 비교예 1과 같은 방법으로 추출, 농축, 동결건조 하여 건조중량으로 수수추출분말 90.8g을 얻었다.

비교예 3. 수수추출물의 제조(용매- 물)

추출용매로 물을 이용하여 비교예 1과 같은 방법으로 추출, 농축, 동결건조 하여 건조중량으로 수수추출분말 102.3g을 얻었다.

실험예 1. 유해산소( 수퍼 옥사이드 라디칼)의 제거 효과

상기 실시예 1에서 제조된 수수발효분말 및 비교예 1~3에 제조된 수수추출분말의 수퍼옥사이드 라디칼 제거에 대한 효과를 확인하기 위해, 유해산소 제거에 우수한 효능이 있는 녹차를 추출 및 동결건조하여 얻은 녹차추출분말을 비교군으로 하여, 수퍼옥사이드 라디칼의 소거 효과를 측정하였다.

수퍼옥사이드 라디칼(Superoxide radical)의 소거활성은 크산틴/크산틴 옥시다아제 시스템(Xanthine/xanthine oxidase system)으로 수퍼옥사이드(superoxide)를 발생시키고 수퍼옥사이드뮤타아제(Superoxide dismutase ; SOD)에 의한 수퍼옥사이드(Superoxide)의 제거 속도를 DMPO 스핀 트랩(Spin trap)을 이용한 전자상자성공명법(Electron paramagnetic resonance; EPR)으로 측정하였다.

수퍼옥사이드 라디칼은 DMPO와 반응하여 DMPO-OOH·라는 새로운 라디칼을 만들어내며, 이는 EPR(ethanol extract of steamed roots of P. thunbergiana radix) 신호를 가지고 있다. 이를 이용하여 수퍼옥사이드 라디칼 소거에 따른 DMPO-OOH·의 EPR 신호 세기의 감소를 통해 특정 물질의 수퍼옥사이드 라디칼의 소거활성을 정량적으로 측정할 수 있다.

즉, 크산틴/크산틴 옥시다아제 시스템으로 수퍼옥사이드를 발생시키고, 시료의 수퍼옥사이드의 제거속도를 DMPO 스핀 트랩(spin trap)을 이용하여 EPR로 측정하여, 각 시료별 수퍼옥사이드 라디칼에 대한 항산화 활성은 수퍼옥사이드에 의한 DMPO-OOH·의 EPR 신호세기의 감소로 나타낼 수 있다.

하기 수학식 1에 의해, 시료를 넣지 않은 대조군의 EPR 신호 세기의 값을 기준으로 하여, 각 시료별 수퍼옥사이드 제거능을 대조군의 EPR 신호 세기의 값에 대한 상대적인 EPR 신호 세기 감소로 나타내었으며, 그 결과를 하기 표1에 나타내었다.

상기 수학식 1에서 E_EPR은 시료의 EPR 신호 세기를 나타내고, C_EPR은 대조군의 EPR 신호 세기를 나타낸다.

시료 농도 (100 ㎍/㎖)	수퍼옥사이드 라디칼에 대한 항산화능
실시예 1	97.3
비교예 1	90.7
비교예 2	90.3
비교예 3	91.5
비교군-녹차 추출 분말	91.2

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 수수발효분말이 수퍼옥사이드 라디칼 제거에 대해 가장 탁월한 활성을 나타냄을 알 수 있었다.

실험예 2. 유해산소( 하이드록시라디칼 )의 제거 효과

상기 실시예 1에서 제조된 수수발효분말 및 비교예 1~3에 제조된 수수추출분말의 하이드록시라디칼 제거에 대한 효과를 확인하기 위해, 녹차추출분말을 비교군으로 하여, 유해산소(하이드록시 라디칼)의 제거 효과를 측정하였다.

히드록실 라디칼(Hydroxyl radical)에 대한 항산화 효과(제거효과)는 펜톤(Fenton)반응으로 히드록실 라디칼(Hydroxyl radical)을 발생시킨 후, DMPO 스핀 트랩(Spin trap)을 이용한 EPR 방법으로 정량하였다. 시료를 가하고 EPR 신호의 감소를 측정하였으며, 이때, 시료를 가하지 않은 대조군의 EPR 신호 세기의 값을 기준으로 하여 시료가 첨가되었을 때의 EPR 신호를 특정하여 상대적인 신호값으로 나타내었다.

과산화수소에 2가의 철염을 첨가하면 OH·가 발생되고, 이는 다시 DMPO와 반응하여 DMPO-OH·라디칼을 생성한다. 생성된 DMPO-OH·의 EPR 신호를 측정함으로써 히드록실 라디칼에 대한 시료의 항산화 활성을 확인할 수 있다. 시료가 첨가된 실험에서 항산화 활성이 있을 경우 히드록실 라디칼을 소거하여 EPR의 신호가 약해진다. 이를 이용하여 특정물질의 히드록실 라디칼 소거 효과를 정량적으로 측정할 수 있다.

하기 수학식 2에 의해, 시료를 넣지 않은 대조군의 EPR 신호 세기의 값을 기준으로 하여, 각 시료별 하이드록시라디칼의 제거능을 대조군의 EPR 신호 세기의 값 대비 대한 상대적인 EPR 신호 세기 감소로 나타내었으며, 그 결과를 하기 표2에 나타내었다.

상기 수학식 2에서 E_EPR은 시료의 EPR 신호 세기를 나타내고, C_EPR은 대조군의 EPR 신호 세기를 나타낸다.

시료 농도 (100 ㎍/㎖)	하이드록시 라디칼에 대한 항산화능
실시예 1	90.2
비교예 1	81.3
비교예 2	78.6
비교예 3	82.7
비교군-녹차 추출 분말	80.5

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 수수발효분말이 하이드록시 라디칼에 대해 가장 높은 항산화 활성을 나타냄을 알 수 있었다.

실험예 3. 대기 오염물질인 오존 및 이산화질소에 의한 세포 손상 억제능 평가

상기 실시예 1에서 제조된 수수발효분말 및 비교예 1~3에 제조된 수수추출분말과 비교군으로 녹차추출분말에 대하여 대기오염물질인 오존과 이산화질소로 인한 세포 손상 억제 효과를 측정하였다.

오존과 이산화질소의 세포독성 영향을 평가하기 위해 MTT 방법을 이용하였다. 각각의 세포를 10% 우태아 혈청, 페니실린(100 units/㎖), 스트렙토마이신(100 units/㎖)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)배지를 이용해 37℃의 온도, 5% 탄산가스가 있는 세포배양기에서 배양하였다. 그 후 정상적으로 24시간 배양한 뒤 배지를 제거한 후 PBS(phosphate-buffered saline)을 이용해 세포를 세척한 후 일정 농도의 오존수와 이산화질소에 노출시킨 후 6시간 후 오존과 이산화질소에 노출되지 않은 대조군과 세포사 여부를 MTT 방법(MTT : (2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide, disodium salt)는 살아있는 세포의 미토콘드리아에 있는 탈수소화효소에 의해 formazan으로 환원되어 파란색의 색을 띄게 된다. 살아있는 세포가 많을수록 푸른색을 많이 띄게 된다.)으로 비교하여 평가하였다. 또한 항산화제 표준품을 처리한 대조군과 시료를 처리한 실험군을 비교하여 수수발효물에 의한 오존과 이산화질소에 대한 세포 독성 방어효과를 비교 분석하였다.

오존과 이산화질소에 의한 직접적인 피부손상의 확인과 평가를 위해 피부세포를 이용하여 오존과 이산화질소의 세포 독성을 평가한 결과, 오존 및 이산화질소 모두 피부세포에 현저한 손상을 입힘을 확인할 수 있었으며, 또한 표준 항산화제를 이용한 실험을 통해 이들에 대한 세포 보호 효과가 입증되었다. 이에 시료의 오존 및 이산화질소에 대한 피부세포 손상 억제 활성을 측정하여 유효한 수수발효물을 탐색하였다. 유효한 수수발효물의 오존 및 이산화질소에 대한 세포 보호 효과를 하기 수학식 3에 의해 산출하여, 그 결과를 하기 표 3 및 4에 나타내었다.

상기 수학식 3에서, E_MTT는 시료 첨가시 MTT 흡광치를 나타내고, C_MTT는 대조군 MTT 흡광치를 나타내며, O_MTT는 오존 및 이산화질소 단독 처리시의 MTT 흡광치를 나타낸다.

(1) 오존에 대한 세포 손상 억제능

오존에 대한 세포 손상 억제능을 평가하기 위하여 가지 일정농도의 오존을 처리한 세포(각질화세포, HaCaT)을 이용하여, 세포 손상의 정도를 MTT 시험법으로 세포의 생존율로 확인하였다. 오존을 처리한 경우 세포의 손상을 확인할 수 있었으며, 하기 표 3에 보는 바와 같이, 실시예 1은 오존을 처리하지 않은 대조군의 세포생존율에 가까운 것을 확인할 수 있었다.

시료 농도 (100 ㎍/㎖)	오존에 대한 세포 보호능(%)
실시예 1	97.7
비교예 1	87.2
비교예 2	88.3
비교예 3	89.7
비교군-녹차 추출 분말	88.7

(2) 이산화질소에 대한 세포 손상 억제능

이산화질소에 대한 세포 손상 억제능을 평가하기 위하여 일정농도의 이산화질소를 처리한 세포(각질화세포, HaCaT)을 이용하여 세포 손상의 정도를 MTT 시험법으로 세포의 생존율로 확인하였다. 이산화질소를 처리한 경우 세포의 손상을 확인할 수 있으며, 하기 표 4에 보는 바와 같이, 실시예 1은 이산화질소를 처리하지 않은 대조군의 세포생존율에 가까운 것을 확인할 수 있었다.

시료 농도 (100 ㎍/㎖)	이산화질소에 대한 세포 보호능(%)
실시예 1	92.9
비교예 1	78.6
비교예 2	77.5
비교예 3	79.3
비교군-녹차 추출 분말	83.7

실험예 4. 수수발효물의 세포 증식 및 독성 확인

(1) 세포 배양

상기 실시예 1에서 제조된 수수발효분말과 비교예 1~3에서 제조된 수수추출 분말의 항노화에 작용하는 유전자 발현을 확인하기 위하여, 콜라게나제(Collagenase)와 Timp-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1)는 HaCaT(Human keratinocyte cell line)에서, MMP-1와 트로포엘라스틴(Tropoelastin)은 CCD-986Sk(Human fibroblast cell line)을 사용하였다. HaCaT 및 CCD-986Sk 세포는 10%(v/v) FBS(fetal bovine serum, Gibco, USA)와 1000 U/㎖의 streptomycin과 1000 U/㎖의 penicillin 항생제(Gibco, USA)가 포함된 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium, Gibco, USA)배지를 사용하여 5% CO₂ 및 37℃ 조건의 인큐베이터에서 배양하였다.

(2) 세포 생존율 측정 실험(MTT assay)

상기 실시예 1에서 제조된 수수발효분말과 비교예 1~3에서 제조된 수수추출 분말에 대하여 세포 증식에 미치는 영향을 확인하였다. 세포 증식 및 독성 확인을 위하여 하기와 같은 방법으로 진행하였다.

배양하고 있는 세포 3T3(Fibroblast cell line)을 96 웰 마이크로플레이트에 5,000 세포/웰로 나누어 30분간 항온조에서 배양하고, 시료를 농도별 각각 0, 0.001, 0.005, 0.01, 0.1 %(w/v)로 투여하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후, 티아졸린 블루(Thiazoline blue)를 투여하고 4시간 동안 추가 배양을 하였다. 배양액을 모두 버리고 마이크로플레이트의 각 웰에 반응 정지액을 가하고 5분간 교반한 후, 570㎚에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군은 시료 주입량만큼 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS) 배지를 투여하여 세포 성장의 최적 조건으로 동시배양을 하였으며, 대조군의 세포증식을 100%로 하여 시료를 투입한 실험군의 세포증식율을 계산하였다. 세포증식 효과는 수학식 4에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.

구분		시료 농도 (㎍/㎖)
증식율(%)		대조군	0	10	50	100	1000
	실시예 1	100	0	109.22	115.77	128.78	135.28
	비교예 1	100	0	102.45	105.27	108.77	112.18
	비교예 2	100	0	100.35	103.11	106.27	113.27
	비교예 3	100	0	103.51	106.45	110.25	115.34

상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 대조군의 세포증식율 100%로 하였을 때, 실시예 1과 비교예 1~3 모두에서 세포독성이 없으며, 세포 증식효과가 있음을 확인하였다. 특히, 실시예 1은 비교예 1 내지 3보다 현저한 세포증식효과를 나타내었으며, 실시예 1의 농도가 높아짐에 따라 세포증식효과가 증가됨을 알 수 있었다.

실험예 5. 수수발효물의 세포 내 collagenase , Timp -1 및 Tropoelastin의 유전자 발현과 MMP -1의 유전자 발현 억제 효과.

HaCaT 및 CCD-986Sk 세포를 세포수 5×10⁵ cells/㎖로 조제한 후에 페트리디쉬에 처리하여 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 세포가 페트리디쉬에서 80% 이상 자란 후, 실시예 1 및 비교예 1 내지 3을 세포생존률이 100% 이상으로 나타난 농도로 첨가하였다. 또한, 대조군으로서 무처리군(control)을 준비하고, 아데노신(Adenosine) 표준품을 5%로 처리하여 실시예 1과 비교예 1 내지 3의 시료와 비교 실험을 통하여 효능을 확인하고, 그 결과를 하기 표 7내 10에 나타내었다..

실시예 1에서 제조된 수수발효분말과 비교예 1 내지 3에서 제조된 수수추출분말을 첨가한 후, DMED/10 FBS에서 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 24시간 후 세포에서 RNA 분리, cDNA 합성 및 RT-PCR은 Komoroski 등(Drug Metab. Dispos. 32: 512-518, 2004)이 기술한 방법에 따라 수행하였다. RT-PCR에서 측정한 유전자는 콜라게나아제(COL1A1), TIMP-1 및 Tropoelastin의 발현과 MMP-1의 발현 억제를 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 GAPDH을 사용하였다.

각각의 유전자의 프라이머 서열은 하기 표 6에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(Oligo dT-adaptor primer)와 DEPC water를 이용하여 총량 15㎕로 하고 70℃에서 5분동안 변성한 후, M-MLV(Moloney murine leukemia virus) RNA의 역전사를 수행하여 42℃ 60분, 94℃ 5분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭하였으며, 총 반응액은 25㎕로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100p㏖, 1.0μM, dNTP 혼합액 0.2 mM, 5x green or colorless GoTaq Reaction buffer 1×1.5 mM, MgCl₂(PCR 완충액) 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25 units 이었다.

변성(Denaturation), 어닐링(Annealing) 및 익스텐션(Extension)에 대한 PCR 반응조건은 다음과 같으며, 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 5분, 30~40사이클로 수행하였다. PCR 반응 후 생성물의 10㎕를 2% 아가로즈겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. Gel Documentation system(코리아랩텍, Cat. No DGS-200D)을 이용하여 발현량을 확인하였다.

프라이머 이름	염기서열
GAPDH	Forward : GGCATTGCTCTCAATGACAA
	Reverse : TGTGAGGGAGATGCTCAGTG
MITF	Forward : AACCGACAGAAGAAGCTGGA
	Reverse : ACAAGTTCCTGGCTGCAGTT
Tyrosinase	Forward : TTATGCGATGGAACACCTGA
	Reverse : ACTGGCAAATCCTTCCAGTG

구분		시료 농도 (㎍/㎖)
		0	10	50	100	1000
Collagenase expression (%)	실시예 1	100	108.59	119.20	131.08	141.90
	비교예 1	100	102.12	104.34	108.56	116.27
	비교예 2	100	100.39	102.37	106.66	113.34
	비교예 3	100	101.27	104.11	110.21	119.58
	아데노신 5%					138.29

구분		시료 농도 (㎍/㎖)
		0	10	50	100	1000
TIMP-1 expression (%)	실시예 1	100	107.18	111.39	121.35	129.15
	비교예 1	100	102.45	103.17	105.28	109.21
	비교예 2	100	101.58	102.66	103.25	106.34
	비교예 3	100	102.22	106.82	108.27	110.15
	아데노신 5%					123.53

구분		시료 농도 (㎍/㎖)
		0	10	50	100	1000
Tropoelastin expression (%)	실시예 1	100	118.37	125.58	133.27	137.55
	비교예 1	100	105.27	106.19	109.21	113.05
	비교예 2	100	101.91	102.28	104.37	109.19
	비교예 3	100	106.66	110.35	110.27	114.11
	아데노신 5%					135.48

구분		시료 농도 (㎍/㎖)
		0	10	50	100	1000
MMP-1 expression (%)	실시예 1	100	93.17	88.09	81.55	75.32
	비교예 1	100	98.02	96.62	94.28	89.56
	비교예 2	100	99.70	97.81	94.09	91.07
	비교예 3	100	96.20	95.81	94.27	90.27
	아데노신 5%					78.88

PT-PCR 수행 후 관찰결과, 상기 표 7 및 8에 나타낸 바와 같이 실시예 1은 비교예 1 내지 3의 수수추출분말보다 Collagenase 및 TIMP-1의 발현이 증가함을 알수 있었다.

상기 표 10에 나타낸 바와 같이 MMP-1의 발현은 농도 의존적으로 감소하는 경향을 나타냄을 확인할 수 있었고, 비교군인 아데노신(Adenosine)과 실시예 1을 비교했을 때, 그 효과가 우수하거나 비슷한 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

트로포엘라스틴(Tropoelastin)은 피부 탄력을 나타내는 탄력 섬유 중심의 엘라스틴을 형성하고 있는 인자로, 상기 표 9에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 수수발효분말은 0.1%의 농도에서 아데노신 5%와 비슷한 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

제조예 1. 스킨로션의 제조

하기 표 11의 조성에 따라, 실시예 1의 수수발효분말을 함유한 화장수(스킨로션)를 제조하였다. 제조방법은 11번 원료에 2, 3, 4, 8번의 원료를 순서대로 투입하고 교반하여 용해시킨 후, 5번 원료를 60℃ 정도로 가열하여 용해시켜 투입하고, 10번 원료를 투입하여 용해한 후 11번 원료를 투입하였다. 마지막으로 1, 6, 7, 9번 원료를 투입하여 충분히 교반한 뒤 숙성시킨다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	실시예 1의 수수발효분말	1.0
2	글리세린	3.0
3	부틸렌 글리콜	2.0
4	프로필렌 글리콜	2.0
5	폴리옥시에칠렌 경화피마자유	1.0
6	에탄올	10.0
7	트리에탄올아민	0.1
8	방부제	미량
9	색소	미량
10	향료	미량
11	정제수	잔량

제조예 2. 영양로션의 제조

하기 표 12의 조성에 따라, 실시예 1의 수수발효분말을 함유한 영양로션을 제조하였다. 제조방법은 10, 11, 13, 16번 원료를 혼합하여 교반하면서 80 ~ 85℃ 온도로 가열하여 용기에 투입한 후 유화기를 작용시킨 다음, 2 내지 9번 및 12번의 원료를 80 ~ 85℃ 온도로 가열하여 용해한 후 투입하여 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 냉각한 뒤 15번 원료를 투입하고 45℃까지 냉각한 다음, 14번 원료를 투입하여 혼합하고, 35℃일 때 1번 원료를 투입하여 혼합한 후 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	실시예 1의 수수발효분말	1.0
2	밀납	1.0
3	폴리솔베이트 60	1.5
4	솔비탄 세스퀴올레이트	0.5
5	유동 파라핀	10.0
6	소르비탄 스테아레이트	1.0
7	친유형 모노스테아린산 글리세린	0.5
8	스테아린산	1.5
9	글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
10	프로필렌글리콜	3.0
11	카르복시폴리머	0.1
12	트리에탄올아민	0.2
13	방부제	미량
14	색소	미량
15	향료	미량
16	정제수	잔량

제조예 3. 영양크림의 제조

하기 표 13의 조성에 따라, 실시예 1의 수수발효분말을 함유한 영양크림을 제조하였다. 제조방법은 12, 13, 14, 16번 원료를 혼합하여 교반하면서 80 ~ 85℃ 온도로 가열하여 용기에 투입한 후 유화기를 작용시킨 다음, 2, 내지 11번 원료를 80 ~ 85℃로 가열하여 용해한 후 투입하여 유화한 후, 15번 원료를 투입하여 교반한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 35℃까지 냉각하고 1번 원료를 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	실시예 1의 수수발효분말	1.0
2	스테아린산	2.0
3	세틸알콜	2.0
4	글리세릴모노스테아레이트	2.0
5	폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트	0.5
6	솔비탄세스퀴올레이트	0.5
7	글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트/폴리옥시에틸렌스테아레이트	1.0
8	왁스	1.0
9	유동파라핀	4.0
10	스쿠알란	4.0
11	카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0
12	카르복시비닐폴리머	0.3
13	부틸렌글리콜	5.0
14	글리세린	3.0
15	트리에탄올아민	0.5
16	정제수	잔량

제조예 4. 에센스의 제조

하기 표 14의 조성에 따라, 실시예 1의 수수발효분말을 함유한 에센스를 제조하였다. 제조방법은 2 내지 5 및 6번 원료를 일정한 온도에서 균질화한 것을 비이온계 양친매성 지질이라 칭한다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 1, 7, 8 및 14번 원룔를 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루이다이져를 통과시키고, 9번 원료를 일정한 온도에서 서서히 첨가하여 균질화한 후, 다시 마이크로플루이다이져에 재차 통과시킨다. 마지막으로 10 내지 13번 원료를 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시킨다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	수수 발효 분말(실시예1)	1.0
2	시토 스테롤	1.7
3	폴리글리세릴 2-올레이트	1.5
4	세라마이드	0.7
5	스테아레스-4	1.2
6	콜레스테롤	1.5
7	디세틸포스페이트	0.4
8	농글리세린	5.0
9	마카다미아 오일	15.0
10	카르복시비닐폴리머	0.2
11	산탄검	0.2
12	방부제	미량
13	향료	미량
14	정제수	잔량

지금까지 본 발명에 대해서 상세히 설명하였으나, 그 과정에서 언급한 실시예는 예시적인 것일 뿐이며, 한정적인 것이 아님을 분명히 하고, 본 발명은 이하의특허청구범위에 의해 제공되는 본 발명의 기술적 사상이나 분야를 벗어나지 않는 범위 내에서, 균등하게 대처될 수 있는 정도의 구성 요소 변경은 본 발명의 범위에 속한다 할 것이다.

실험예 6. 수수발효물을 함유한 화장료 조성물의 피부 영향 평가

수수발효물을 함유한 화장료 조성물이 오존 또는 이산화질소에 의한 피부손상을 방지하는 효과를 확인하기 위해, 상기 제조예 4의 에센스를 이용하여, 아래의 실험방법으로 피부내 아스코르브산 및 α-토코페롤의 손실정도를 측정하였다.

(1) 오존 및 이산화탄소의 노출

오존 및 이산화질소 발생기에 연결되어 있는 노즐과 주사기가 말단에 연결되어 있는 5㎝×10㎝×3cm 크기의 플라스틱 챔버를 사람의 앞 팔의 뒤쪽에 고정시킨 후 전항에서 언급한 대로 일정 농도의 오존 및 이산화질소를 각각 발생시킨 후, 챔버에 연결되어 있는 빈 주사기로 챔버내의 공기를 빼주어 오존 및 이산화질소를 각각 플라스틱 챔버내로 유입시켜, 사람의 피부에 오존 및 이산화질소를 각각 1시간 노출시켰다. 수수발효물을 함유하는 화장료 조성물의 효과 측정시에는 화장료 조성물을 피부에 도포하여 건조시킨 후 오존 및 이산화질소를 처리하였다.

(2) 피부 각질층의 획득

피부 각질층의 시료는 테이프 스트리핑(tape-stripping) 방법을 이용하였다. 오존 및 이산화질소를 각각 처리하기 전의 피부에 5㎝×5㎝ 크기의 셀룰로판 테이프을 부착시킨 후 떼어내어 각질층을 획득하고, 대조군으로 화장료 조성물을 도포하지 않고 오존 및 이산화질소를 각각 처리한 피부에 5㎝×5㎝ 크기의 셀룰로판 테이프을 부착시킨 후 떼어내어 각질층을 획득하였다. 부착되어 나온 각질층은 광학현미경을 이용하여 균질성을 확보한 후 그 질량은 스트리핑(stripping) 전과 후의 셀룰로판 테이프의 질량차이로 측정하였다. 테이프 스트립 당 얻어진 각질층의 양은 3.01 ± 0.17 mg이었다.

(3) 각질층의 아스코르브산 농도 측정

셀룰로판 테이프의 질량을 측정한 후, 1 mM EDTA가 함유된 2㎖의 PBS와 50㎕의 부틸화된 히드록시톨루엔(1mg/㎖), 1㎖의 2.9%(v/v) SDS을 첨가하여 보텍싱(vortexing)을 실시하였다. 전처리가 끝난 시료를 막여과(0.45μm)한 후, HPLC 분석을 실시하여 아스코르브산을 정량하였다.

HPLC 분석은 워터(Water)사의 모듈 2690엘시시스템(Module2690 LC system)과 동일회사의 전기화학검출기(electrochemical detector)를 사용하여 수행하였고, 컬럼은 알테크(Alltech)사의 에코노실(Econosil) C18(10 um, 250 X 4.6 mm)을 이용하였다. 40 mM 아세트산나트륨 및 0.537 mM EDTA, 5%의 메탄올을 함유하는 용액을 이동상으로 하였으며 유속은 1.0 ㎖/min으로 하였다.

(4) 각질층의 α-토코페롤의 농도 측정

셀룰로판 테이프의 질량을 측정한 후, 1 mM EDTA가 함유된 2 ㎖ 의 PBS와 50 ㎕의 부틸화된 히드록시톨루엔(1 mg/㎖), 1 ㎖의 2.9 % (v/v) SDS를 첨가하여 보텍싱하였다. 전처리 과정이 끝난 시료에 4㎖의 헥산을 첨가하여 분획한 후, 2㎖의 에탄올을 헥산층에 첨가하여 셀룰로판 테이프의 접착성분을 침전시켜 제거하였다. 그런 다음, 헥산/에탄올층을 질소가스로 말려 그 건조물을 500㎕의 에탄올:메탄올(1:1)에 녹인 후, HPLC 분석을 실시하여 α-토코페롤을 정량하였다.

HPLC 분석은 워터(Water) 사의 모듈 2690 엘시 시스템(Module2690 LC system)과 동일 회사의 전기화학 검출기(electrochemical detector)를 사용하였고, 컬럼은 알테크(Alltech)사의 에코노실(Econosil) C18(10 um, 250 X 4.6 mm)을 이용하였다. 20 mM 리튬 퍼클로레이트(lithium perchlorate)를 함유하는 1:9의 메탄올:에탄올 용액을 이동상으로 하였으며 유속은 1.2 ㎖/min으로 하였다.

(5) 수수발효물을 함유한 화장료 조성물의 오존 및 이산화질소에 대한 피부손상 방지효과

먼저, 오존 및 이산화질소에 의한 피부손상에 대한 수수발효물을 함유한 화장료 조성물의 방지효과를 알아보기 위하여, 피부에 제조예 4의 에센스를 도포한 후 건조한 다음, 오존 및 이산화질소를 각각 1시간씩 처리하고, 각질층을 획득하여 각질층에 함유되어 있는 대표적인 항산화제인 아스코르브산과 α-토코페롤의 함량을 조사하고, 그 결과를 하기 표 15에 나타내었다. 이때, 오존과 이산화질소의 농도는 각각 10ppm으로 피부에 1시간 처리하였다.

		각질층에서의 농도(pmol/mg)
		아스코르브산	α-토코페롤
0ppm		347 ± 22	8.2 ± 0.7
오존 10ppm	대조군	165 ± 18	0.8 ± 0.4
	제조에 4	294 ± 17	6.7 ± 0.2
이산화질소 10ppm	대조군	325 ± 15	7.9 ± 0.4
	제조예 4	334 ± 21	8.0 ± 0.1

상기 표 15에서 대조군의 결과를 살펴보면, 오존으로 처리한 경우가 이산화질소 각질층에 함유된 아스코르브산과 α-토코페롤의 함량이 급격하게 감소함을 알 수 있다. 즉, 오존과 이산화질소 모두 피부에 손상을 유발하나, 오존의 화학적인 성질로 인해 피부에 심각한 산화적 스트레스를 유발하여 피부손상을 유발하는 정도가 큼을 알 수 있다.

한편, 제조예 4와 대조군의 결과를 살펴보면, 제조예 4를 도포한 경우에 아스코르브산과 α-토코페롤의 함량의 높게 나타남을 알 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 수수발효물을 함유한 화장료 조성물은 오존과 이산화질소에 의한 피부손상을 방지하는 효과가 있음을 알 수 있다.

Claims (5)

1. 수수를 분쇄, 추출, 농축 후, 당분해효소로 당화처리시킨 다음, Aspergillus oryzae로 발효되는 것을 특징으로 하는 오존 및 이산화질소에 의한 세포손상, 아스코르브산 및 α-토코페롤의 손실을 억제하여 피부손상을 방지하는 효과를 갖는 수수발효물을 함유하는 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 당분해효소는 아밀라아제(Amylase), 글루코시데이즈(Glucosidase), 인베르타아제(Invertase), 셀룰라아제(Cellulase) 또는 글루코아밀라아제(Glucoamylase) 어느 하나 이상을 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 오존 및 이산화질소에 의한 세포손상, 아스코르브산 및 α-토코페롤의 손실을 억제하여 피부손상을 방지하는 효과를 갖는 수수발효물을 함유하는 화장료 조성물.
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 수수발효물은 화장료 조성물 총 중량대비 0.1 내지 30 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.