KR20200099118A - 뉴로필린 1 (Neuropilin 1, NRP1)에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 조절 T 세포의 활성을 억제하기 위한 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 뉴로필린 1(Neuropilin 1, NRP1)에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 이용한 조절 T 세포(Regulatory T cell, Treg)의 면역반응 억제 저해용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 뉴로필린 1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 융합 단백질은 종양 조직 내에서 CD4+ T 세포 중 조절 T 세포의 비율을 감소시키고, 종양 조직 내 침투해 있는 조절 T 세포의 활성을 억제함으로써, 전신에 대한 독성 없이 종양조직 내에서 면역억제 반응을 하향 조절할 수 있는 바, 종양의 치료에 높은 효과를 기대할 수 있다.

Description

뉴로필린 1 (Neuropilin 1, NRP1)에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 조절 T 세포의 활성을 억제하기 위한 조성물 {Composition for Inhibiting Activity of Regulatory T Cell comprising peptides which specificallly binds to Neuropilin 1}

본 발명은 뉴로필린 1 (Neuropilin 1, NRP1)에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 조절 T 세포 (Regulatory T cell, Treg)의 활성 억제용 조성물에 대한 것으로, 구체적으로는 종양조직 내에서의 조절 T 세포의 활성 억제를 통한 면역반응 억제 저해용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 종양 조직 내에 있는 조절 T 세포의 활성을 억제함으로써, 종양 조직 내 세포 독성 T 세포의 성장을 증가시켜 암세포의 성장을 억제하는 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 종양 조직 내에 있는 조절 T 세포에 과발현되어 있는 뉴포필린 1을 표적하여 조절 T 세포의 활성을 억제함으로써 암세포의 성장을 억제하지만, 조절 T 세포의 활성을 저해함에 따른 전신에 독성을 보이지 않는 조성물에 관한 것이다.

면역계는 감염의 인지 및 체액성, 세포매개성 반응을 통하여 우리 몸을 보호하는 매우 중요한 체계로서, 제 기능을 못하면 감염성 질환이 발생할 뿐만 아니라 암 억제 기능도 떨어지게 된다. T 세포는 면역반응을 총괄하는 중요한 역할을 하며, T 세포 중에서도 조절 T 세포 (Regulatory T cell, Treg)는 자가면역질환의 억제 및 면역기능의 항상성 유지에 필수적이다. 그러나, 종양미세환경 (Tumor microenvironment)에서 조절 T 세포는 세포독성 T 세포 (Cytotoxic T Lymphocytes, CTL) 및 자연살해 세포 (Natural Killer Cell, NK cell)와 같은 면역세포의 수를 감소시키고 그 기능을 억제함으로써 암 등의 질환 진행을 촉진시킨다.

종양미세환경에서 조절 T 세포는 다음의 네 가지 기전을 통하여 면역억제 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 첫째, 조절 T 세포는 억제성 사이토카인인 인터루킨-10, TGF-β, 인터루킨-35 등을 분비하여 근거리에 있는 다양한 선천 면역세포 및 효과 T 세포 (effector T cell)에 작용하여 그들의 항암면역반응을 억제한다 (Nakamura et al., 2001; Collison et al., 2007). 둘째, 조절 T 세포 표면에 높은 수준으로 발현되는 CD25(인터루킨-2 수용체 알파 체인, IL-2Rαchain)로 인해 세포 주변에 국소적으로 분포하는 인터루킨-2를 제거하는 결과를 초래하며, 이는 사이토카인 결핍으로 인한 효과 T 세포의 활성화 억제 및 세포자살을 유도한다고 알려져 있다 (Thornton and Shevach, 1998). 셋째, 세포내부 혹은 세포외부에 아데노신 뉴클레오시드 방출을 유도하는 기전으로, 전자는 조절 T 세포가 효과 T 세포와의 간극연접을 통해 직접적으로 억제신호물질인 cAMP (cyclic AMP)를 전달하여 억제가 이루어지며 (Kobie et al., 2006), 후자의 경우 조절 T 세포의 세포막에 존재하는 외부효소인 CD39, CD73에 의해 세포주변 아데노신이 생성되어 효과 T 세포에 존재하는 아데노신 수용체 2A(A2AR)을 통해 인식됨으로써 효과 T 세포의 기능을 억제한다 (Zarek et al., 2008). 마지막으로 수지상세포를 비롯한 항원공여세포를 대상으로 한 억제 기전이 있다. 공동자극분자인 CTLA-4 (Cytotoxic T-lymphocyte associated molecule-4)는 조절 T 세포 표면에 발현되어 있으며, 이는 수지상세포 표면에 존재하는 CD80/CD86와 상호작용함으로써 관용유도 수지상세포로 전환시키는 역할을 한다. 또한 이러한 수지상세포들에서 트립토판대사에 관련된 효소인 IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase)를 분비함으로써, 효과 T 세포의 면역기능을 억제한다 (Read et al., 2000; Fallarino et al., 2003). 추가로 조절 T 세포에 존재하는 LAG-3 (Lymphocyte-activation gene-3)를 통해서도 억제 기전이 이루어진다. LAG-3는 미성숙 수지상세포 표면의 MHC class II (Major histocompatibility complex class II)분자와 강하게 결합하여 수지상세포의 성숙 및 면역자극능을 저해한다 (Huang et al., 2004).

이와 같은 기전들에 의해 조절 T 세포는 항암면역반응을 억제하고, 암의 진행을 촉진하기 때문에 종양조직 내 조절 T 세포의 수를 감소시켜 항암 효과를 증가시키기 위한 치료전략들이 개발되고 있다. 현재까지, 면역억제 반응을 조절하는 화학요법인 Cyclophosphamide (CP)를 낮은 농도로 투여하는 방법, 조절 T 세포가 특이적으로 발현하는 CD25, CTLA-4, PD-1 등의 분자 및 케모카인 (Chemokine) 수용체를 표적하는 항체를 이용하는 방법 등이 개발되었다. 특히, 미국 식품의약국에서 임상시험용 의약품 사용승인을 받은 항체로는, 조절 T 세포에 발현된 CD25를 표적하는 다클리주맙 (daclizumab)과 CTLA-4와 PD-1 (Programmed cell death protein-1)을 각각 표적하는 이필리무맙 (ipilimumab) 및 니볼루맙 (nivolumab)이 있다. 또한 면역점검포인트(Immune checkpoint) 분자인 LAG-3, TIM-3, GITR, OX40 및 케모카인 수용체인 CCR4를 표적하여 항체의존성 세포매개성 세포독성 (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)을 통한 조절 T 세포의 수를 감소시키는 항체들도 임상시험 중에 있다. 하지만 이러한 조절 T 세포 표적 항체들은 조절 T 세포의 수를 감소시키는 치료전략으로써, 환자에 따라 생명을 위협하는 자가면역반응이나 면역관련부작용 (Immune-related adverse events, irAEs)을 초래하기도 한다. 따라서, 최소한의 부작용으로 종양미세환경에서 조절 T 세포의 면역억제 기능을 차단할 수 있는 효과적인 치료법의 개발이 필요하다.

한편, 뉴로필린 1 (Neuropilin 1, NRP1)은 막투과성 당단백질 (transmembrane glycoprotein)로서, VEGF 패밀리 리간드들과 세마포린 패밀리 리간드들과 결합한다 (Guo and Vander Kooi, 2015; Prud'homme and Glinka, 2012). 뉴로필린 1은 정상세포에 매우 미약하게 발현되는 반면, 대부분의 종양 혈관내피세포, 고형암 세포, 혈액종양 세포 등에 과발현되어 있다고 알려져 있다. 이외에도, 마우스 모델에서 뉴로필린 1은 조절 T 세포 표면에 높게 발현되어 마우스 조절 T 세포의 마커로도 알려져 있다 (Bruder et al., 2004; Loser et al., 2005). 특히, 조절 T 세포에 발현된 뉴로필린 1은 CD4⁺ T 세포나 CD8⁺ T 세포에 발현된 세마포린-4A (Semaphorin 4A, Sema4A)과 상호작용하여 면역시냅스 (immunological synapse)에서 다음과 같은 기작으로 조절 T 세포의 활성을 증가시킨다고 알려졌다 (Delgoffe et al., 2013). 1) 인산 가수분해효소와 텐신 동족체 (phosphatase and tensin homolog, PTEN)를 유입시키고, 2) Akt 신호의 활성화를 억제하며, 3) Foxp3의 발현에 중요한 전사인자인 foxo3a의 핵 내 이동 증가에 의한 Foxp3의 발현을 유지시킴으로써 조절 T 세포의 안정성과 면역반응 억제기능을 유지시키는 역할을 한다. 이와 같은 조절 T 세포의 뉴로필린 1의 역할을 바탕으로, 조절 T 세포에서 뉴로필린 1의 발현을 감소시키면 조절 T 세포의 인터페론-감마 (Interferon-γ, IFN-γ)의 분비와 인터페론-감마 수용체의 발현이 증가되어 조절 T 세포의 유약성 (fragility)이 유도되고 효과 T 세포에 대한 조절 T 세포의 억제활성이 감소된다 (Overacre-Delgoffe et al., 2017). 뿐만 아니라, 뉴로필린 1이 없는 조절 T 세포를 가진 마우스는 뉴로필린 1이 발현된 조절 T 세포를 가진 마우스와 비교하여, 악성 흑색종의 종양 형성이 억제되는 것이 확인되었다 (Hansen et al., 2012).

반면, 인간에서는 마우스 모델과 달리 정상인의 말초혈에 존재하는 조절 T 세포의 경우 뉴로필린 1의 발현이 낮고 이에 대해 보고된 바가 거의 없다. 하지만, 흑색종 환자와 두경부 편평세포상피암 환자의 말초혈에 존재하는 조절 T 세포에서는 정상인의 조절 T 세포와 달리, 약 20~30%가 뉴로필린 1을 발현하고 있었으며, 특히 이들 환자의 종양에 침윤된 조절 T 세포는 약 50% 이상이 뉴로필린 1을 발현하고 있다고 보고되었다 (Overacre-Delgoffe et al., 2017). 또한, 뉴로필린 1을 많이 발현하는 조절 T 세포를 가진 흑색종 환자와 두경부 편평세포상피암 환자는 뉴로필린 1을 적게 발현하는 조절 T 세포를 가진 환자보다 무병생존 (disease-free survival) 기간이 짧았다. 즉, 종양에 침윤된 조절 T 세포의 뉴로필린 1의 발현양은 환자의 예후와 밀접한 관련이 있음을 보여 준다.

따라서, 인간 모델에서 조절 T 세포에 발현된 뉴로필린 1을 표적하는 전략은 기존의 조절 T 세포 표적인 CTLA-4 등과 달리, 종양 조직 내 조절 T 세포만 특이적으로 표적할 수 있기 때문에, 면역관련 부작용을 최소화시킬 수 있는 효과적인 항암 치료 전략이 될 수 있다. 현재까지 마우스 모델에서 조절 T 세포에 발현된 뉴로필린 1에 대한 중요성은 연구되어 왔지만, 이를 기반으로 한 조절 T 세포의 뉴로필린 1을 표적하는 항체 또는 항암제가 개발된 사례는 없다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 뉴로필린 1에 특이적인 펩타이드가 면역반응을 억제하는 조절 T 세포의 활성을 감소시킬 수 있으며, 이를 통해 면역억제 반응을 저해할 수 있음을 확인하였다.

특히, 뉴로필린 1 특이적 펩타이드에 의한 조절 T 세포의 활성 억제 및 세포 독성 T 세포의 성장 증가를 통해 조절 T 세포를 가진 마우스 생체 내에서 종양 성장이 억제되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 뉴로필린 1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 함유하며, 면역반응을 억제하는 조절 T 세포의 활성을 억제하여 그 활성을 하향 조절할 수 있는 조성물 및 방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 뉴로필린 1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 함유하며, 조절 T 세포의 활성 억제를 통한 면역반응 억제 저해용 조성물 및 뉴로필린 1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 이용한 면역반응 억제 저해 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 뉴로필린 1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 함유하며, 면역반응을 억제하는 조절 T 세포의 활성을 억제하여 그 활성을 하향 조절할 수 있는 조성물을 포함하는 면역조절제, 항암제 및 감염성 질환의 치료제 및 이를 이용한 상기 질환들의 치료방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 종양 조직 내에 있는 조절 T 세포에 과발현되어 있는 뉴로필린 1을 표적하여 조절 T 세포의 활성을 억제함으로써 세포 독성 T 세포의 성장을 증가시켜 암세포의 성장을 억제하지만, 조절 T 세포의 활성을 저해함에 따른 전신에 독성을 보이지 않는 조성물 및 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 뉴로필린 1 (Neuropilin 1)에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 조절 T 세포 (Regulatory T cell, Treg)의 활성 억제용 조성물 및 활성 억제 방법을 제공하며, 조절 T 세포의 활성 억제를 통한 면역반응 억제 저해용 조성물 및 이를 이용하여 면역반응 억제를 저해하는 방법을 제공한다. 이러한 면역반응 억제를 저해하여 궁극적으로 종양조직 내에서의 세포 독성 T 세포 및 다른 면역세포의 면역력을 제고함으로써, 면역반응이 억제되어 발생할 수 있는 감염성 질환 및 면역성 질환을 치료할 수 있다.

본 발명은 또한, 종양조직 내에 침윤되어 있는 조절 T 세포에 과발현되어 있는 뉴로필린 1을 표적하여, 종양조직 내에서 조절 T 세포의 활성을 저해하고, 전신의 조절 T 세포에는 최소한의 영향만 끼쳐 조절 T 세포의 활성을 저해함에 따른 전신에 독성을 보이지 않는 조성물 및 활성 억제 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 조절 T 세포의 활성을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 면역조절제, 감염성 질환 치료제 및 항암제를 제공한다.

본 발명에 따른 뉴로필린 1 (Neuropilin 1)에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 조절 T 세포의 활성을 억제하므로, 종양 조직 내 면역억제 반응을 제해하여 이를 하향 조절할 수 있으므로, 효과적으로 면역력을 제고시켜 암이나, 결핵, 패혈증 또는 바이러스성 간염 등의 감염성 질환의 치료제 개발에 사용될 수 있다.

도 1은 구축된 Fc-TPP11 및 9D9-TPP11의 모식도를 나타낸 것으로,
도 1a는 TPP11 펩타이드가 15개 잔기 (G₄S)₃ 링커를 통하여 항체 중쇄불변부위의 C-말단에 융합된 형태의 Fc-TPP11의 모식도이며,
도 1b는 TPP11 펩타이드가 15개 잔기 (G₄S)₃ 링커를 통하여 항-마우스 CTLA-4 (Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4) 항체인 9D9의 중쇄불변부위의 C-말단에 융합된 형태의 9D9-TPP11의 모식도이고,
도 1c는 야생형 항체 9D9 및 9D9-TPP11을 동물세포 (HEK293F)에서 발현 및 정제한 후, 4 ㎍의 단백질을 비환원성 조건의 SDS-PAGE상에서 분리하고, Coomasie Blue 염색을 통해 크기 및 조합형태로 분석한 결과이다.
도 2는 항체 9D9의 중쇄불변부위에 TPP11이 융합된 9D9-TPP11 단백질을 동물세포 HEK293F 세포에서 발현하기 위한 벡터의 모식도로,
도 2a는 9D9의 중쇄불변부위에 TPP11이 융합된 9D9-TPP11 중쇄 발현 벡터의 모식도이며,
도 2b는 9D9의 경쇄 발현 벡터의 모식도이다.
도 3은 구축된 Fc-TPP11 및 9D9-TPP11의 뉴로필린 1(Neuropilin 1, NRP1) 및 CTLA-4에 대한 결합능을 확인한 결과로,
도 3a는 9D9과 비교하여, 구축된 9D9-TPP11이 인간 뉴로필린 1-b1b2 도메인 (Human NRP1-b1b2, hNRP1-b1b2)에 대해 Fc-TPP11과 같이 결합능을 보이는지 확인한 ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) 결과이며,
도 3b는 구축된 9D9-TPP11이 야생형 항체인 9D9의 CTLA-4에 대한 결합능과 동일하게 유지되는지 마우스 CTLA-4 및 인간 CTLA-4 항원에 대해 확인한 ELISA 결과이다.
도 4는 Fc-TPP11 및 9D9-TPP11의 시험관 내 조절 T 세포 (Regulatory T cell) 활성 억제능을 평가한 결과로,
도 4a는 CD4⁺ T 세포의 성장을 억제하는 조절 T 세포의 활성에 대한 Fc-TPP11 및 9D9-TPP11의 효과를 측정한 분석 결과이며,
도 4b는 Fc-TPP11 및 9D9-TPP11의 조절 T 세포 활성 억제능 효과를 비교하기 위해, CD4⁺ T 세포의 성장 시 분비하는 사이토카인인 인터루킨-2 (Interleukin-2, IL-2)의 분비 정도를 측정한 ELISA 결과이고,
도 4c는 Fc-TPP11 및 9D9-TPP11의 조절 T 세포 활성 억제능 효과를 비교하기 위해, CD4⁺ T 세포의 성장 시 분비하는 또 다른 사이토카인인 인터페론-감마 (Interferon-γ, IFN-γ)의 분비 정도를 측정한 ELISA 결과이다.
도 5는 Fc-TPP11 및 9D9-TPP11의 BALB/c 마우스 생체 내에서 종양 성장 억제 활성을 측정한 결과로,
도 5a는 마우스 생체 내 종양 성장 억제 활성 실험에 대하여 종양 이식 날짜와 약물의 투여 간격, 투여량, 투여 방법을 나타낸 계획표이며,
도 5b 및 도 5c는 CT26 마우스 대장암 세포를 동종이식한 마우스에서 Fc, Fc-TPP11, 9D9, 9D9-TPP11 투여에 의한 종양 부피의 변화 (b) 및 실험 과정에서 주기적으로 측정된 마우스의 체중 변화 (c)를 나타낸 그래프이고,
도 5d는 상기 도 5b의 결과에서 날짜에 따라 각 투여군의 종양 부피 변화를 마우스 한 개체마다 나타낸 그래프이다.
도 6은 상기 도 5의 약물 마지막 투여 24시간 뒤에 마우스를 치사하여 비장에서 분리한 림프구와 종양 침윤 림프구 (Tumor-Infiltrating Lymphocyte)를 분리하고 이를 이용하여 시험관 내에서 세포 활성을 평가한 것으로,
도 6a는 각 투여군의 마우스를 치사하여 얻은 종양 침윤 림프구 중 세포 독성 T 세포 (CD8⁺)의 비율을 유세포 분석기 (FACS)로 분석하여 나타낸 그래프이고,
도 6b는 상기 도 6a의 종양 침윤 림프구에서 분리한 조절 T 세포(CD4⁺CD25⁺)와 종양 이식하지 않은 마우스의 비장에서 분리한 CD4⁺ T 세포를 공동배양하여 조절 T 세포의 억제효과를 평가하고 CD4⁺ T 세포가 분비하는 인터페론-감마 농도를 측정한 그래프이다.
도 7은 Fc-TPP11, Fc(AAG)-TPP11 및 9D9의 BALB/c 마우스 생체 내에서 종양 성장 억제 활성을 측정한 결과로,
도 7a는 마우스 생체 내 종양 성장 억제 활성 실험에 대하여 종양 이식 날짜와 약물의 투여 간격, 투여량, 투여 방법을 나타낸 계획표이며,
도 7b 및 도 7c는 CT26 마우스 대장암 세포를 동종이식한 마우스에서 Fc, Fc-TPP11, Fc(AAG), Fc(AAG)-TPP11, 9D9 투여에 의한 종양 부피의 변화 (b) 및 실험 과정에서 주기적으로 측정된 마우스의 체중 변화 (c)를 나타낸 그래프이고,
도 7d는 상기 도 7b의 결과에서 날짜에 따라 각 투여군의 종양 부피 변화를 마우스 한 개체마다 나타낸 그래프이다.
도 8은 상기 도 7의 Fc(AAG)와 Fc(AAG)-TPP11 투여군의 다섯 번째 투여 24시간 뒤에 투여군 각각의 마우스를 치사하여 얻은 종양 침윤 림프구의 비율을 측정하고 시험관 내에서 세포 활성을 평가한 것으로,
도 8a는 투여군 각각의 마우스를 치사하여 종양 침윤 림프구를 분리하고 종양 침윤 림프구 (CD45⁺) 중 세포 독성 T 세포 (CD45⁺CD3⁺CD8⁺)의 비율 및 조절 T 세포의 비율(CD45⁺CD4⁺Foxp3⁺)을 유세포 분석기 (FACS)로 분석하여 나타낸 그래프이며,
도 8b는 각 투여군의 종양 침윤 림프구에서 분리한 조절 T 세포(CD4⁺CD25⁺)와 종양 이식하지 않은 마우스의 비장에서 분리한 CD4 T 세포(CD4⁺CD25^-)를 배양하여 조절 T 세포의 억제활성을 평가한 그래프이다.
도 9는 Fc-TPP11, Fc(AAG)-TPP11 및 9D9의 C57BL/6 마우스 생체 내에서 종양 성장 억제 활성을 측정한 결과로,
도 9a는 마우스 생체 내 종양 성장 억제 활성 실험에 대하여 종양 이식 날짜와 약물의 투여 간격, 투여량, 투여 방법을 나타낸 계획표이며,.
도 9b 및 도 9c는 B16F10 마우스 악성 흑색종 세포를 동종이식한 마우스에서 Fc, Fc-TPP11, Fc(AAG), Fc(AAG)-TPP11, 9D9 투여에 의한 종양 부피의 변화 (b) 및 실험 과정에서 주기적으로 측정된 마우스의 체중 변화 (c)를 나타낸 그래프이고,
도 9d는 상기 도 9b의 결과에서 날짜에 따라 각 투여군의 종양 부피 변화를 마우스 한 개체마다 나타낸 그래프이다.
도 10은 상기 도 9의 마지막 투여 24시간 뒤에 마우스를 치사하여 얻은 종양 침윤 림프구를 분리하여 세포수, 세포 활성, 독성을 평가한 것으로,
도 10a는 각 투여군의 마우스를 치사하여 종양을 적출하고 무게를 측정한 그래프이며,
도 10b는 각 투여군의 마우스를 치사하여 종양 침윤 림프구를 분리하고 종양 침윤 림프구 (CD45⁺) 중 세포 독성 T 세포 (CD45⁺CD3⁺CD8⁺)의 비율 및 조절 T 세포 (CD45⁺CD4⁺Foxp3⁺)의 뉴로필린 1의 발현양과 인터페론-감마의 분비양을 나타낸 그래프이고,
도 10c는 각 투여군의 종양 침윤 림프구에서 분리한 조절 T 세포(CD4⁺CD25⁺)와 종양 이식하지 않은 마우스의 비장에서 분리한 CD4 T 세포 (CD4⁺CD25^-)를 배양하여 조절 T 세포의 억제활성을 평가한 그래프이다.
도 11은 세포 독성 T 세포 (CD8⁺)와 조절 T 세포(CD4⁺CD25⁺)를 입양전이한 Balb/c nude 마우스에서 Fc(AAG)와 Fc(AAG)-TPP11의 종양 성장 억제 활성을 측정한 결과로,
도 11a는 마우스 생체 내 종양 성장 억제 활성 실험에 대하여 입양전이 날짜, 종양 이식 날짜 및 약물의 투여 간격, 투여량, 투여 방법을 나타낸 계획표이고,
도 11b는 상기 마우스에서 Fc(AAG)와 Fc(AAG)-TPP11 투여에 의한 종양 부피의 변화를 나타낸 그래프이며,
도 11c는 각 투여군의 마우스를 치사하여 종양 침윤 림프구를 분리하고 종양 침윤 림프구 (CD45⁺) 중 조절 T 세포 (CD45⁺CD4⁺Foxp3⁺)의 비율, Foxp3의 발현양 및 뉴로필린 1을 발현하는 조절 T 세포의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 12는 상기 도 9의 Fc(AAG)-TPP11 및 9D9의 마지막 투여 24시간 뒤에 마우스를 치사하여 B16F10 종양에 침윤된 조절 T 세포(CD4⁺CD25⁺)와 세포 독성 T 세포 (CD45⁺CD3⁺CD8⁺)의 수와 기능을 측정한 결과로,
도 12a는 종양 침윤 조절 T 세포 (CD45⁺CD4⁺Foxp3⁺)의 뉴로필린 1의 발현양과 CD4⁺ T 세포 중 (CD45⁺CD4⁺) 중 조절 T 세포의 비율, 조절 T 세포 억제효과의 마커인 Foxp3의 발현양 및 대표적인 억제성 사이토카인인 인터루킨-10을 분비하는 조절 T 세포의 비율을 나타낸 그래프이고,
도 12b는 종양 침윤 림프구 (CD45⁺) 중 세포 독성 T 세포 (CD45⁺CD3⁺CD8⁺)의 비율, 증식능 및 인터페론-감마를 분비하는 세포 독성 T 세포의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 13은 뉴로필린 1에 대한 결합능이 향상된 Fc-TPP10 단백질의 발현 및 뉴로필린 1에 대한 결합능을 분석한 것으로,
도 13a는 Fc-TPP10을 동물세포 (HEK293F)에서 발현 및 정제한 후, 4 ㎍의 단백질을 비환원성 조건의 SDS-PAGE상에서 분리하고, Coomasie Blue 염색을 통해 크기 및 조합형태를 분석한 결과이며,
도 13b는 Fc-TPP10이 Fc-TPP11와 비교하여, 인간 뉴로필린 1 세포밖 도메인 (Human NRP1 Extracellular domain, hNRP1-ECD)에 대해 Fc-TPP11보다 뛰어난 결합능을 보이는지 확인한 ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 일 관점에서, 뉴로필린 1 (Neuropilin 1)에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 조절 T 세포의 활성 억제용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 다른 관점에서, 조절 T 세포의 활성 억제를 통한 면역반응 억제 저해용 조성물 및 면역반응 억제를 저해하는 방법을 제공한다. 이러한 면역반응 억제를 저해함으로써 궁극적으로 면역력을 제고하여, 면역반응이 억제되어 발생할 수 있는 암이나 결핵, 패혈증 또는 바이러스성 간염 등의 감염성 질환을 치료할 수 있다.

본 발명의 또 다른 관점에서 뉴로필린 1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 함유하는, 면역반응을 억제하는 조절 T 세포의 활성을 억제하여 그 활성을 하향 조절할 수 있는 조성물을 포함하는 면역조절제, 감염성 질환 치료제 및 항암제에 대한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 뉴로필린 1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 조절 T 세포의 활성을 억제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 뉴로필린 1에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 바람직하게는 TPP11 (서열번호 1), TPP1 (서열번호 2), TPP8 (서열번호 3) 및 TPP10 (서열번호 4)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

HTPGNSKPTRTPRR (TPP11, 서열번호 1),

HTPGNSNQFVLTSTRPPR (TPP1, 서열번호 2),

HTPGIATRTPR (TPP8, 서열번호 3), 및

HTPGNSKPTRTPR (TPP10, 서열번호 4).

본 발명에 있어서, 상기 뉴로필린 1에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 단독으로 사용될 수도 있으며, 바람직하게는 항체(immunoglobulin) 중쇄불변부위(Fc), 항체 또는 항체 단편과 융합된 융합 단백질인 것을 특징으로 할 수 있다. 뉴로필린 1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 항체 중쇄불변부위(Fc), 항체 또는 항체 단편과 융합된 융합단백질의 경우, 상승작용(synergistic effect)을 나타내어, 우수한 면역조절 작용을 가지며, 이에 따라 암이나 감염성 질환의 치료효과가 극대화될 수 있는 장점이 있다.

뉴로필린 1에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 Fc, 항체 또는 항체 단편과 링커 매개(linker-mediated) 결합, 화학적 결합, 유전적 융합(genetic fustion) 등을 통해 연결될 수 있다.

본 발명에서 있어서, “Fc” 또는 “중쇄불변부위”는 항체 유래의 CH2 도메인, CH3 도메인 및 힌지 영역(hinge domain)을 포함하는 영역을 의미한다. 다만, IgE의 경우에는 CH2 도메인, CH3 도메인, CH4 도메인 및 힌지 영역(hinge domain)을 포함하는 영역을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 링커는 바람직하게는 펩타이드 링커이지만 이에 한정되는 것은 아니며, 펩타이드 링커는 예를 들어, (GGGGS)n의 서열을 포함하고, n은 1-20의 정수일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 펩타이드는 항체의 중쇄불변영역(Fc)의 C-말단에 결합된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 항체 단편은 항체의 Fab, F(ab)₂, scFv, V_H 또는 V_L 인 것을 특징으로 할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 항체 단편은 항체의 중쇄 또는 경쇄 각 도메인 또는 이의 단편을 의미하며, 예를 들면, Fc, Fab, 항체의 중쇄 불변영역 절편 (CH₁, CH₂, 또는 CH₃), 중쇄 가변영역 절편 (V_H), 경쇄 불변영역 절편 (C_L), 경쇄 가변영역 절편 (V_L), 단일 사슬 항체 절편 (single chain variable fragment(scFv)) 또는 이들의 단편일 수 있다.

"Fab"는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역 (CH₁)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역 (hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다.

"Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이, 예를 들어 scFv로 단단하게 사실상 공유적으로 연합된 이량체로 이루어진다.

"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함할 수 있다.

단쇄 Fv (single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고 (예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab을 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.

중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.

"중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.

또한, 상기 항체의 단편은 단량체 (monomer), 이량체 (dimer) 또는 다량체일 수 있다. 상기 뉴로필린 1에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 항체의 중쇄 불변부위(Fc) 단편에 결합될 수 있으며, 바람직하게는 Fc의 N- 또는 C-말단에 결합할 수 있다.

상기 "결합"은 기능 또는 구조가 다르거나 같은 두 분자를 일체화하는 것으로, "융합"과 혼용하여 사용할 수 있다. 상기 펩타이드가 결합할 수 있는 모든 물리, 화학적 또는 생물학적 방법에 의한 결합 또는 융합일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 면역관문(immune checkpoint) 관련 항원, 암세포 표면 특이적 항원, 암조직 혈관 특이적 항원, 암조직 미세환경 특이적 항원, 조절 T 세포 특이적 항원 또는 종양조직에 침윤된 면역세포 특이적 항원과 특이적으로 결합하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특히 바람직한 항원은 면역관문 관련 항원이지만 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 항원은 EGFR (Epidermal growth factor receptor), ERBB2 (HER2), VEGF (Vascular endothelial growth factor), EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule), VEGFR-2 (VEGF receptor-2), c-Met (hepatocyte growth factor receptor), CD20 (cluster of differentiation-20), CD19 (cluster of differentiation-19), CD22 (cluster of differentiation-22), CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4), PD-1 (Programmed cell death protein 1), PD-L1 (Programmed death-ligand 1), TIM3 (T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3), MSLN (Mesothelin), TNFRSF4 (Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4, OX40), PSMA (prostate specific membrane antigen), GPC3 (Glypican-3), GD2 ganglioside, CEA (carcinoembryonic antigen), FAP (fibroblast-activation protein), integrin 및 fibronectin으로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 세툭시맙 (Cetuximab), 파니투무맙 (Panitumumab), 잘루투무맙 (Zalutumumab), 니모투주맙 (Nimotuzumab), 네시투무맙 (Necitumumab), 마투주맙 (Matuzumab), 트라스투주맙 (Trastuzumab), 베바시주맙 (Bevacizumab), 라무시루맙 (Ramucirumab), 오나투주맙 (Onartuzumab), 리툭시맙 (Rituximab), 이필리무맙 (Ipilimumab), 니볼루맙 (Nivolumab), 람브로리주맙 (Lambrolizumab), 세구투주맙 (Cergutuzumab) 및 펨브로리주맙 (Pembrolizumab)으로 구성된 군에서 선택되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 조성물은 당해 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 또한 본 발명에 따른 약제학적 조성물에는 추가적으로 제약상 허용되는 담체가 포함될 수 있다. "제약상(약학적으로) 허용되는 담체"는 제제를 제제화하거나 또는 안정화시키는 것을 돕기 위해서 활성 성분에 추가될 수 있는 물질이고, 환자에게 유의한 해로운 독성 효과를 야기하지 않는다.

상기 담체는 환자를 자극하지 않고 본 발명에 따른 조성물 내에 포함된 뉴로필린 1(Neuropilin 1)에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이를 포함하는 융합단백질의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 다른 담체는 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin)]에 기재되어 있다.

제약상 허용되는 담체는 멸균 주사가능한 용액제 또는 분산액제를 즉각 투여용(extemporaneous)으로 제조하기 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 해당 기술분야에 공지되어 있다. 조성물은 바람직하게는 비경구 주사용으로 제제화된다. 조성물은 용액제, 마이크로에멀젼제, 리포좀제, 또는 높은 약물 농도에 적합한 기타 주문된 구조물로서 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이것들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 일부 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함시킬 수 있다. 멸균 주사가능한 용액제는 필요한 양의 뉴로필린 1(Neuropilin 1)에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 이를 포함하는 융합단백질을 필요에 따라 상기 기재된 성분들 중 1 종 또는 이것들의 조합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후에 멸균 마이크로여과를 수행하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액제는 활성 화합물을 기본적인 분산 매질 및 상기 기재된 것들로부터의 기타 필요한 성분을 함유하는 멸균 비히클로 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사가능한 용액제를 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 일부 제조 방법은 활성 성분 및 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 이것의 미리 멸균-여과시킨 용액으로부터 생성하는 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조)이다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 고통받는 환자의 중증도에 따라 달라질 수 있는 투여량 및 빈도로 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 조성물은 필요에 따라 볼루스로서 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 또 다른 형태로, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 직장으로, 정맥으로(intravenously), 피하로(subcutaneously), 종양내로 (intratumorly), 자궁내로(intrauterinely) 또는 뇌혈관내로(intracerebrovascularly) 투여될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 조절 T 세포의 활성 억제는 조절 T 세포에 의한 면역반응 억제를 저해하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 i) 종양 조직 내 CD4+ T 세포 중 조절 T 세포의 비율 감소; ii) 종양 조직 내 침투해 있는 조절 T 세포의 활성을 억제함으로써 인터루킨-2 및 인터페론-감마 발현 증가; 또는 iii) 종양 조직 내 침투해 있는 조절 T 세포의 활성을 억제함으로써 세포 독성 T 세포 성장 증가를 통하여 암세포의 성장을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 상기 뉴로필린 1 (Neuropilin 1)에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 구축한 다음, 상기 융합 단백질이 조절 T 세포의 활성을 억제시키는 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 실시예에서는 조절 T 세포의 활성이 억제됨에 따라, 생체 내 대장암 및 악성 흑색종 종양에서 CD4⁺ T 세포의 성장이 증가하고, 인터루킨-2 및 인터페론-감마의 발현이 증가하며, 세포 독성 T 세포의 성장이 증가하는 것을 확인하였다. 이에 따라, 본 발명의 융합 단백질은 조절 T 세포의 활성 억제에 의해 암세포의 성장을 억제하는 것을 확인하였다.

따라서, 상기 조성물은 암이나 결핵, 패혈증 또는 바이러스성 간염 등의 감염성 질환의 치료용도로 사용될 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명은 뉴로필린 1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 함유하는 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에 투여하여, 조절 T 세포의 활성을 억제하는 것을 포함하는 면역반응이 억제되어 발생할 수 있는 암이나 각종 감염성 질환 등의 질환의 치료방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 뉴로필린 1에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 함유하는 조성물을 통해 다양한 암 및 감염성 질환 등을 치료할 수 있는 면역조절제를 제공한다.

상기 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001-100㎎/kg 범위 내이다. 용어 "약학적 유효량"은 암 또는 감염성 질환을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.

한 측면에서, 본 발명에 따른 조성물 또는 치료방법은 암에 적용될 수 있으며, 치료가능한 암은 조절 T 세포의 활성 억제에 의하여 치료될 수 있는 암으로서, 그 종류를 제한하지 않지만, 예를 들어, 대장암, 악성 흑색종, 유방암, 난소암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 뇌종양, 간암, 전립선암, 방광암, 혈액암(만성 또는 급성의 림프구성 또는 비림프구성 백혈병, 만성/급성 골수성 백혈병 등), ACTH 생성 종양, 경관암, 만성 골수성 백혈병, T-존 림프종, 자궁내막증, 식도암, 담즙 방광암, 에윙스 육종(Ewing's sarcoma), 두경부암, 목암, 설암, 홉킨스 림프종, 카포시스 육종, 신장암, 중피종, 다발성 골수종, 신경아세포종, 비홉킨 림프종, 골육종, 신경아세포종, 유선암, 경관암, 페니스암, 레티노블라스토마, 피부암, 위암, 갑상선암, 자궁암, 고환암, 윌름스 종양, 또는 트로포블라스토마 등의 암일 수 있다. 가장 바람직하게는 상기 암은 대장암 또는 악성 흑색종일 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서 상기 조성물을 포함하는 항암제에 관한 것이다. 상기 조성물은 본 발명에 따른 뉴로필린 1에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물을 통해 항암 효과를 직접 나타내거나, 기타 항암제와 병용하여 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 뉴로필린 1에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 항암제에 관한 것이다.

상기 뉴로필린 1에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 함유하는 조성물과 다른 항암제를 병용 투여함으로써, 조절 T 세포의 활성을 억제시킴으로써 암 치료 효과를 개선시킬 수 있다. 또한, 상기 뉴로필린 1에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 함유하는 조성물은 추가로 다른 항암제를 더 포함할 수도 있다

상기 병용 투여는 뉴로필린 1에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 함유하며, 이와 관련된 구성은 앞서 설명한 조성물 및 치료방법에 포함된 구성과 동일하므로 각 구성에 대한 설명은 병용 투여를 통한 암 치료방법에서도 동일하게 적용된다.

"병용"은 뉴로필린 1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 융합 단백질과 항암제 각각이 동시, 순차적, 또는 역순으로 투여될 수 있음을 의미하는 것으로, 당업자의 범위 내 적절한 유효량의 조합으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 뉴로필린 1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 융합 단백질과 항암제가 각각 별도의 용기에 보관된 후 동시, 순차적 또는 역순으로 병용 투여될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명에 따른 조성물 또는 치료방법은 감염성 질환에 적용될 수 있으며, 감염성 질환은 세균성 및 바이러스성 감염 질환을 모두 포함하며, 바람직하게는 결핵, 패혈증 또는 바이러스성 간염 등이 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 특히 상기 바이러스성 간염 질환은 A형 간염, B형 간염 및 C형 간염 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: Fc-TPP11 및 9D9-TPP11의 발현 및 정제

Fc-TPP11 및 9D9-TPP11이 조절 T 세포의 활성을 억제할 수 있는지 확인하기 위해, Fc-TPP11 및 9D9-TPP11을 발현, 정제하였다.

본 발명에서의 “Fc-TPP11”은 뉴로필린 1에 특이적으로 결합하는 펩타이드인 TPP11이 Fc와 융합된 융한단백질을 의미하며, “9D9-TPP11”은 TPP11이 CTLA4에 특이적인 항체인 9D9와 융합된 융합 단백질을 의미한다.

구체적으로는, TPP11 펩타이드와 항체의 중쇄불변부위 (Fc)가 융합된 단백질(Fc-TPP11)을 생산하기 위한 벡터 (KR 10-1551306)에서 NotI와 HindIII 제한효소를 처리하여 얻은 항체의 중쇄불변부위 CH3에서 TPP11이 융합된 부분의 DNA를 야생형 9D9 중쇄를 인코딩하는 벡터에 클로닝하였다. 항체의 중쇄불변부위 CH3에서 TPP11이 융합된 부분의 아미노산 서열은 서열번호 5, DNA 서열은 서열번호 6 및 야생형 9D9 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 7로 표시하였다. 또한, 경쇄를 코딩하는 아미노산 서열은 서열번호 8, DNA 서열은 서열번호 9로 나타내었으며, 야생형 9D9 경쇄 발현 벡터를 동일하게 사용하였다.

구성	서열	번호
9D9-TPP11 중쇄 아미노산 서열	METDTLLLWVLLLWVPGSTGDEAKLQESGPVLVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGVINPYNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELNSLTSEDSAVYYCARYYGSWFAYWGQGTLITVSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKGGGGSGGGGSGGGGSHTPGNSKPTRTPRR	서열번호 5
9D9-TPP11 중쇄 DNA 서열	ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGAGGCAAAGCTGCAGGAGTCCGGACCCGTGCTGGTGAAGCCTGGAGCCAGCGTGAAGATGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACAGACTACTATATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCACGGCAAGTCCCTGGAGTGGATCGGCGTGATCAACCCCTACAATGGCGACACCTCTTATAACCAGAAGTTTAAGGGCAAGGCCACCCTGACAGTGGATAAGAGCTCCTCTACCGCCTACATGGAGCTGAATAGCCTGACATCCGAGGATTCTGCCGTGTACTATTGTGCCCGGTACTATGGCTCTTGGTTCGCCTATTGGGGCCAGGGCACCCTGATCACAGTGAGCGCCAAAACAACAGCCCCATCGGTCTATCCACTGGCCCCTGTGTGTGGAGATACAACTGGCTCCTCGGTGACTCTAGGATGCCTGGTCAAGGGTTATTTCCCTGAGCCAGTGACCTTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGTGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACCCTCAGCAGCTCAGTGACTGTAACCTCGAGCACCTGGCCCAGCCAGTCCATCACCTGCAATGTGGCCCACCCGGCAAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAAGGTGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGAAGTGGAGGTGGAGGATCACATACTCCTGGAAATAGCAAACCAACACGCACACCAAGGCGT	서열번호 6
9D9 중쇄 아미노산 서열	METDTLLLWVLLLWVPGSTGDEAKLQESGPVLVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGVINPYNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELNSLTSEDSAVYYCARYYGSWFAYWGQGTLITVSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK	서열번호 7
9D9 경쇄 아미노산 서열	METDTLLLWVLLLWVPGSTGDDIVMTQTTLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSRTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC	서열번호 8
9D9 경쇄 DNA 서열	ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGACATCGTGATGACCCAGACCACACTGTCCCTGCCCGTGTCTCTGGGCGATCAGGCCTCTATCAGCTGCCGGAGCTCCCAGAGCATCGTGCACTCCAACGGCAATACATACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCTAAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTAACCGGTTCAGCGGCGTGCCAGACAGATTTTCCGGCTCTGGCAGCGGCACCGATTTCACACTGAAGATCTCCAGGGTGGAGGCAGAGGACCTGGGCGTGTACTATTGTTTCCAGGGCTCTCACGTGCCCTATACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGCGCGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGAACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT	서열번호 9

도 2b와 2c는 상기 9D9-TPP11 발현 시스템에서 사용한 동물세포 발현 벡터의 모식도를 나타낸 것이다.

경쇄, 중쇄 발현 벡터를 일시적 트랜스펙션 (transient transfection)을 이용하여 단백질을 발현 및 정제하였다. 진탕 플라스크에서, 무혈청 FreeStyle 293 발현 배지 (Invitrogen)에서 부유 성장하는 HEK293-F 세포(Invitrogen)를 플라스미드 및 폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine, PEI) (Polyscience)의 혼합물로 트랜스펙션하였다. 진탕 플라스크 (Corning)에 200mL 트랜스펙션 시, HEK293-F 세포를 2 X 10⁶ 세포/ml의 밀도로 배지 100ml에 파종하여, 130 rpm, 8 % CO₂에서 배양하였다. 각각의 단일클론항체 생산하기 위해 알맞은 중쇄와 경쇄 플라스미드를 10ml FreeStyle 293 발현 배지 (Invitrogen)에 중쇄 125㎍, 경쇄 125㎍ 총 250㎍ (2.5 ㎍/ml)으로 희석하여, PEI 750 ㎍ (7.5 ㎍/ml)을 희석한 10ml의 배지와 혼합하여 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후, 반응시킨 혼합배지를 앞서 100ml로 파종한 세포에 넣어 4시간 동안 150 rpm, 8% CO₂에서 배양 후, 나머지 100 ml의 FreeStyle 293 발현 배지를 추가하여 7일 동안 배양했다. 표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 배양 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 단백질 A 세파로오스 컬럼 (Protein A Sepharose column) (GE healthcare)에 항체를 적용하고 PBS (pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 M 글라이신 완충액을 이용하여 pH 3.0에서 항체를 용리한 후 1M Tris 완충액 (pH 9.0)을 이용하여 샘플을 즉시 중화하였다. 용리한 항체 분획은 투석방법을 통해 PBS (pH 7.4)로 완충액을 교환하며 농축을 진행하였다. 정제된 단백질은 BCA protein assay kit (Thermo)내 용액을 이용하여 562 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그려진 표준 곡선에 따라 그 양을 정량하였다. 얻어진 9D9-TPP11 항체의 수율은 야생형 9D9 항체와 비교하여, 큰 차이 없이 잘 정제되었다.

실시예 2: 9D9-TPP11의 뉴로필린 1과 CTLA-4에 대한 결합능 평가

실시예 1에서 발현, 정제한 9D9-TPP11의 뉴로필린 1과 CTLA-4에 대한 결합능을 Fc-TPP11 및 야생형 항체 9D9과 비교 분석하였다.

도 3a는 9D9과 비교하여, 구축된 9D9-TPP11이 인간 뉴로필린 1-b1b2 도메인(Human NRP1-b1b2, hNRP1-b1b2)에 대해 Fc-TPP11과 같이 결합능을 보이는지 확인한 ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) 결과이다.

구체적으로는, 96-웰 플레이트 (SPL, Korea)에 인간 뉴로필린 1-b1b2 도메인 (0.1 ㎍/well)을 1시간동안 25℃에서 코팅한 후, TBS (pH 7.4)으로 세척한 후, 4% BSA가 포함된 TBS (pH 7.4)로 1시간 동안 25℃에서 blocking 하였다. 그 후, Fc-TPP11, 9D9, 9D9-TPP11을 농도별 (10, 1, 0.1 nM)로 25℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, TBS로 3회 세척하였다. HRP가 결합된 항-인간 항체 중쇄부위 항체 (Horse radish peroxidase anti-human Fc mAb, Thermo, USA)를 25℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, TBS로 3회 세척하였다. 그 후, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB, Sigma) 기질을 넣어 마이크로플레이트 리더(Biotek Cytation 3, Korea)를 이용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

그 결과, TPP11이 융합되지 않은 야생형 항체 9D9과 비교하여, 9D9-TPP11의 인간 뉴로필린 1-b1b2 도메인에 대한 결합능이 Fc-TPP11의 인간 뉴로필린 1-b1b2 도메인에 대한 결합능과 유사함을 확인하였다.

도 3b는 구축된 9D9-TPP11의 CTLA-4에 대한 결합능을 야생형 항체인 9D9와 비교하기 위하여, 마우스 CTLA-4 및 인간 CTLA-4 항원에 대해 확인한 ELISA 결과이다.

구체적으로는, 96-웰 플레이트 (SPL, Korea)에 인간 CTLA-4 (hCTLA-4) 및 마우스 CTLA-4 (mCTLA-4) (0.5 ㎍/well)을 1시간 동안 25℃에서 코팅한 후, TBS (pH 7.4)으로 세척한 후, 4% BSA가 포함된 TBS (pH 7.4)로 1시간 동안 25℃에서 blocking 하였다. 그 후, 9D9, 9D9-TPP11을 농도별 (10, 1, 0.1 nM)로 25℃에서 1시간동안 반응시킨 후, TBS로 3회 세척하였다. 9D9의 항체 isotype이 mouse IgG2a이기 때문에, HRP가 결합된 항-마우스 항체 중쇄부위 항체 (Horse radish peroxidase anti-mouse Fc mAb, Santa Cruz)로 25℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, TBS로 3회 세척하였다. 그 후, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB, Sigma) 기질을 넣어 마이크로플레이트 리더(Biotek Cytation 3, Korea)를 이용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

그 결과, TPP11이 융합되지 않은 야생형 항체 9D9과 비교하여, 9D9-TPP11의 마우스 CTLA-4 항원에 대한 결합능이 9D9과 유사함을 확인하였고, 인간 CTLA-4 항원에 대해 교차 반응성이 없는 9D9과 같이 인간 CTLA-4 항원에 대해서는 9D9과 9D9-TPP11 모두 결합능이 나타나지 않음을 확인하였다.

실시예 3: Fc-TPP11 및 9D9-TPP11의 조절 T 세포 활성 저해능 평가

실시예 1 및 2에서 발현된 Fc-TPP11 및 9D9-TPP11의 뉴로필린 1 및 CTLA-4 항원에 대한 결합능을 확인하였으므로, 이들이 조절 T 세포에 발현된 뉴로필린 1 및 CTLA-4에 결합하여 조절 T 세포의 활성을 저해할 수 있는지 평가하였다.

도 4는 CD4 T 세포 (CD4⁺) 성장을 억제하는 조절 T 세포의 활성에 대한 Fc-TPP11 및 9D9-TPP11의 효과를 측정한 CD4 T 세포 성장 어세이 및 사이토카인 ELISA 결과이다.

구체적으로는, 정상 BALB/c 마우스로부터 비장을 적출한 다음, 70 마이크론 메쉬를 넣은 60 mm 디시에 비장과 배지를 넣고 분쇄하였다. 1500 rpm, 4℃, 5분 동안 원심분리하여 얻은 세포에 적혈구 용혈 완충액을 넣어 적혈구를 용혈시킨 후 PBS로 세척하여 FITC가 결합된 항-CD4 항체 (e-Bioscience)와 PE가 융합된 항-CD25 항체 (e-Bioscience)를 넣어 4℃에서 30 분간 반응시켰다. PBS로 세척 후, CD4 T 세포 (CD4⁺CD25^-)와 조절 T 세포 (CD4⁺CD25⁺)를 FACS Aria III (BD biosciences, Korea)로 분리하였다. 그 후, 항-CD3 항체 (1㎍/ml) 과 항-CD28 항체 (0.5 ㎍/ml)을 4℃에서 20시간 코팅한 96-웰 플레이트에 분리한 CD4 T 세포 (2x10⁵ cells/well), 조절 T 세포 (4x10⁴ cells/well)과 함께, Fc, Fc-TPP11, 9D9, 9D9-TPP11 (0.5 μM)을 각각 처리하였다. 37℃에서 2일 동안 배양한 후, 각 웰마다 상등액을 50 μL 회수하여 사이토카인 (IL-2, IFNγ) ELISA를 수행하였다. 각 웰마다 배지를 50 μL씩 추가하여 2일 더 배양한 후, CellTiter-Glo Luminescent assay (CTG assay, Promega)를 수행하였다. 이는 기질을 넣으면 세포의 ATP 양과 비례하여 발광하는 것을 이용하여 CD4 T 세포의 성장율을 측정하는 것으로, CTG 반응액을 각 웰당 80 μL씩 넣어 25℃, 10분간 쉐이커 위에서 반응시킨 후, 화이트 96-웰 플레이트에 세포 용해물을 옮겨 마이크로플레이트 리더기 (Biotek Cytation 3, Korea)를 통해 발광 신호를 측정하였다. 이때, 발광 신호 값이 높을수록, CD4 T 세포의 성장이 많이 일어났음을 뜻한다.

그 결과, 조절 T 세포를 함께 배양하지 않아 성장이 많이 일어난 CD4 T 세포 단독의 발광 신호값과 비교하여, 조절 T 세포와 CD4 T 세포를 함께 배양한 경우에는 조절 T 세포에 의해 CD4 T 세포의 성장이 저해되어 발광 신호값이 감소함을 확인하였다. 또한, 동일하게 CD4 T 세포와 조절 T 세포를 함께 배양하면서 Fc-TPP11, 9D9, 9D9-TPP11을 처리한 경우, 조절 T 세포의 활성이 감소하여 CD4 T 세포의 성장 신호가 증가함을 확인하였다 (도 4a).

그 다음, 상기와 동일한 조건으로 37℃에서 2일 동안 배양한 세포 배양액 내 인터루킨-2 및 인터페론-감마 농도를 측정하였다. 96-웰 플레이트에 인간 인터루킨-2 또는 인간 인터페론-감마 포획 항체 (e-bioscience)를 12시간 동안 코팅한 후, PBST (PBS with 0.1% Tween-20)으로 세척 후, 1% BSA (PBS with 1% bovine serum albumin)를 넣고 1시간 동안 실온에서 blocking 하였다. PBST (PBS with 0.1% Tween-20)으로 세척 후, 회수한 상등액을 1% BSA로 5배 희석하여 100 μl씩 첨가한 다음 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. PBST (PBS with 0.1% Tween-20)으로 세척 후, biotin이 결합된 항-인터루킨-2 및 항-인터페론-감마 검출 항체(e-bioscience)를 실온에서 1시간 동안 결합시켰다. PBST (PBS with 0.1% Tween-20)으로 세척 후, avidin이 결합된 horse radish peroxidase (HRP) (e-bioscience)를 실온에서 30분간 결합시킨 다음 PBST (PBS with 0.1% Tween-20)으로 세척 후, 3,3',5,5′'-Tetramethylbenzidine (TMB, sigma-aldrich) 기질을 넣어 마이크로플레이트 리더(Biotek Cytation 3, Korea)를 이용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 4b, 4c에 나타난 바와 같이, CD4 T 세포가 성장하면서 분비하는 사이토카인인 인터루킨-2와 인터페론-감마의 분비도 Fc-TPP11, 9D9, 9D9-TPP11을 처리한 경우 증가함을 확인하였다. 이때, 조절 T 세포의 CTLA-4를 표적하는 9D9에 비해서 CTLA-4와 뉴로필린 1을 동시에 표적할 수 있는 9D9-TPP11의 조절 T 세포 활성 억제능이 월등히 증가되어 CD4 T 세포의 인터페론-감마 분비능이 현저히 증가됨을 확인할 수 있다. 이는 조절 T 세포에 발현된 각각 다른 항원인 뉴로필린 1과 CTLA-4을 모두 표적함으로써, 조절 T 세포의 성장 및 활성을 모두 저해한 것임을 알 수 있다.

실시예 4: Fc-TPP11 및 9D9-TPP11의 생체 내 대장암 성장 억제능 평가

실시예 3에서 뉴로필린 1 특이적 펩타이드인 TPP11을 융합한 Fc-TPP11 및 9D9-TPP11의 시험관 내 조절 T 세포의 활성 저해능을 확인하였으므로, Fc-TPP11 및 9D9-TPP11의 동일한 효과가 마우스 생체 내에서도 나타나는지 알아보았다.

도 5는 Fc-TPP11 및 9D9-TPP11의 마우스 생체 내에서 종양 성장 억제 활성을 측정한 결과이다.

구체적으로, 5주령의 암컷 BALB/c 마우스 (Charles River Japan)에 CT26 세포 (1 x 10⁶ 세포/마우스)를 150 μL PBS에 희석하여 마우스 피하에 이식하였다. 유사한 크기의 종양 (평균 부피 120~150 mm³)을 가진 마우스를 처리집단으로 무작위로 배정하고, 도 5a에 나타낸 바와 같이, Fc, Fc-TPP11는 각각 10 mg/kg씩 2일마다 총 7회, 9D9, 9D9-TPP11는 각각 5 mg/kg씩 3일마다 총 4회 복강으로 주사하였다. 종양은 일주일에 2회씩 측정하고, 종양의 부피 (V)를 V=길이x폭²/2로 계산하였다.

그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 대조군인 Vehicle 및 Fc에 비해, Fc-TPP11, 9D9, 9D9-TPP11은 종양성장 억제능을 나타냄을 확인하였다. 또한, 도 5c에서 대조군과 비교하여 Fc-TPP11, 9D9, 9D9-TPP11 투여시 마우스의 체중 변화가 거의 없는 것을 확인하였으며, 이에 따라 독성은 없는 것으로 판단되었다.

도 5d는 상기 도 5b의 실험에 나타낸 결과에서 날짜에 따라 각 투여군의 종양 부피 변화를 마우스 한 개체마다 나타낸 그래프이다.

실시예 5: Fc-TPP11 및 9D9-TPP11의 생체 내 조절 T 세포의 활성 저해능 평가

실시예 4에서 확인한 Fc-TPP11 및 9D9-TPP11의 종양 성장 억제능이 조절 T 세포의 활성 저해를 통해 일어난 것인지 평가하고자 투여가 끝난 마우스에서 종양을 적출하여 분석하였다.

도 6은 실시예 4에서 약물 마지막 투여 24시간 뒤에 마우스를 치사하여 종양 침윤 림프구 (Tumor-Infiltrating Lymphocyte)를 분리하고 이를 이용하여 시험관 내에서 세포 활성을 평가한 것이다.

5-1: 림프구와 종양 침윤 림프구의 FACS 분석

도 6a에서는 각 투여군의 마우스를 치사하여 얻은 종양 침윤 림프구 중 세포 독성 T 세포(CD8⁺)의 비율을 유세포 분석기 (FACS)로 분석하였다.

구체적으로는, 실시예 4 마지막 투여 24 시간 뒤에 각 투여군의 마우스를 치사하고 종양을 적출한 다음 70 마이크론 메쉬를 넣은 60 mm 플레이트에 종양과 PBS를 넣고 분쇄하였다. 원심분리 하여 얻은 세포에 적혈구 용혈 완충액을 넣어 적혈구를 용혈 시킨 후 PBS로 세척하고 종양을 분쇄하여 얻은 세포 중 세포 독성 T 세포를 염색하기 위해서 림프구 마커인 CD45를 인지하는 FITC가 결합된 항체 (e-Bioscience)와 CD8a를 인지하는 eFlour660이 결합된 항체를 넣어 4℃에서 30분간 반응시켰다. PBS로 세척 후, 세포 독성 T 세포 (CD45⁺CD8⁺)를 유세포 분석기 FACS Calibur (BD biosciences, Korea)로 분석하였다.

그 결과, 대조군인 vehicle 및 Fc 투여군에 비하여 Fc-TPP11 투여군의 종양 침윤 세포 독성 T 세포의 비율이 높아졌고, 조절 T 세포의 CTLA-4를 표적하는 9D9 투여군보다 CTLA-4와 뉴로필린 1을 함께 표적할 수 있는 9D9-TPP11 투여군의 종양 침윤 세포 독성 T 세포의 비율이 더 높아졌음을 알 수 있었다 (도 6a).

5-2: 조절 T 세포의 CD4 ⁺ T 세포에 대한 영향

도 6b에서는 각 투여군의 종양 침윤 림프구 중에서 분리한 조절 T 세포(CD4⁺CD25⁺)와 종양 이식하지 않은 정상 마우스의 비장에서 분리한 CD4⁺ T 세포 (CD4⁺CD25^-)를 공동배양하여 조절 T 세포의 CD4⁺ T 세포 성장에 대한 억제활성을 평가하고 CD4⁺ T 세포가 분비하는 인터페론-감마 농도를 측정하였다.

구체적으로, 상기 실시예 5-1의 방법과 동일하게 마우스를 치사한 뒤 비장과 종양을 적출하고 분쇄하여 세포를 얻고 마우스 조절 T 세포 (CD4⁺CD25⁺) 분리 키트 (Miltenyi Biotec)를 이용하여 조절 T 세포를 분리하였다. 먼저 바이오틴이 결합된 항-마우스 CD8a, CD11b, CD45R, CD49b, Ter119 항체 칵테일과 바이오틴을 인지하는 항체-마그네틱 비드를 넣고 동시에 CD25를 인지하는 PE가 결합된 항체를 넣어 4℃에서 15분간 반응시켰다. 앞서 처리된 세포를 LD 컬럼에 로딩하여 컬럼 아래로 빠져 나온 세포만을 회수하였다. 이때 회수한 세포는 항-마우스 CD8a, CD11b, CD45R, CD49b, Ter119 항체 칵테일에 표적되지 않은 CD4 T 세포(CD4⁺CD25^-) 및 조절 T 세포 (CD4⁺CD25⁺)이다. 회수한 CD4 T 세포와 조절 T 세포를 원심 분리 후 PE를 인지하는 항체-마그네틱 비드를 넣어 4℃에서 15분간 반응시켰다. 앞서 처리된 세포를 MS 컬럼에 로딩하면 결합하지 않고 컬럼 아래로 빠져나온 세포는 CD4 T 세포 (CD4⁺CD25^-)이고, 컬럼에 결합한 세포는 조절 T 세포(CD4⁺CD25⁺)라고 할 수 있다. 이러한 방법에 따라, 종양을 이식하지 않은 정상 마우스의 비장 세포에서 CD4 T 세포 (CD4⁺CD25^-)를 얻고 각 투여군의 종양으로부터 얻은 세포에서 조절 T 세포 (CD4⁺CD25⁺)를 얻었다. 그 후, 항-CD3 항체 (1 ㎍/ml)과 항-CD28 항체 (0.5 ㎍/ml)을 4℃에서 20시간 코팅한 96-웰 라운드 바텀 플레이트 (SPL, Korea)에 앞서 분리하여 얻은 CD4 T 세포 (1x10⁵ cells/well), 조절 T 세포 (2x10⁴ cells/well)를 배양하였다. 37℃에서 2일 동안 배양한 후, 각 웰마다 상등액을 50 μL 회수하여 인터페론-감마 분비정도를 비교하기 위해 ELISA를 수행하였다. 각 웰마다 배지를 50 μL씩 추가하여 1일 더 배양한 후, CellTiter-Glo Luminescent assay (CTG assay, Promega)를 수행하였다. CTG 반응액을 각 웰당 100 μL씩 넣어 25℃, 15분간 쉐이커 위에서 반응시킨 후, 화이트 96-웰 플레이트에 세포 용해물을 옮겨 마이크로플레이트 리더기(Biotek Cytation 3, Korea)를 통해 발광 신호를 측정하였다. 이때, 발광 신호 값이 높을 수록, CD4⁺ T 세포의 성장이 많이 일어났음을 뜻한다.

그 결과, 대조군인 Fc와 비교하여, Fc-TPP11 투여군의 조절 T 세포의 CD4⁺ T 세포의 성장 억제 활성이 감소되어 있음을 확인하였고, 조절 T 세포의 CTLA-4를 표적하는 9D9 투여군보다 CTLA-4와 뉴로필린 1을 함께 표적할 수 있는 9D9-TPP11 투여군의 조절 T 세포의 CD4⁺ T 세포 성장 억제능이 현저하게 감소해 있음을 확인하였다.

다음으로, 공동배양 2일 후 회수한 상등액을 대상으로 CD4⁺ T 세포가 분비한 인터페론-감마의 양을 ELISA을 통해 측정하였다.

구체적으로는, ELISA용 96-웰 플레이트에 마우스 인터페론-감마 포획 항체 (e-Bioscience)를 12시간 동안 코팅한 후, PBST (PBS with 0.1% Tween-20)으로 세척 후, 1% BSA (PBS with 1% bovine serum albumin)를 넣고 1시간 동안 25℃에서 blocking하였다. PBST으로 세척 후, 수집한 배양액을 1% BSA로 5배 희석하여 100 μl씩 첨가한 다음 25℃에서 2시간 동안 반응시켰다. PBST으로 세척 후, 바이오틴이 결합된 인터페론-감마 검출 항체 (e-Bioscience)를 25℃에서 1시간 동안 결합시켰다. PBST으로 세척 후, avidin이 결합된 Horse Radish Peroxidase (HRP) (e-Bioscience)를 25℃에서 30분간 결합시킨 다음 PBST으로 세척 후, 3,3',5,5′'-Tetramethylbenzidine (TMB, sigma-aldrich) 기질을 넣어 마이크로플레이트 리더 (Biotek Cytation 3, Korea)를 이용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 6c에 나타난 바와 같이, CD4 T 세포가 성장하면서 분비하는 사이토카인인 인터페론-감마의 분비가 Fc-TPP11, 9D9, 9D9-TPP11을 처리한 경우 증가함을 확인하였다. 이때, 조절 T 세포의 CTLA-4를 표적하는 9D9에 비해서 CTLA-4와 뉴로필린 1을 동시에 표적할 수 있는 9D9-TPP11의 조절 T 세포 활성 억제능이 월등히 증가되어 CD4⁺ T 세포의 인터페론-감마 분비가 현저히 증가됨 확인할 수 있다. 이는 조절 T 세포에 발현된 각각 다른 항원인 뉴로필린 1과 CTLA-4을 모두 표적함으로써, 조절 T 세포의 성장 및 활성을 모두 저해한 것임을 알 수 있다.

실시예 6: Fc(AAG) 및 Fc(AAG)-TPP11의 구축 및 발현, 정제.

실시예 5에서 뉴로필린 1 특이적 펩타이드인 TPP11을 융합한 Fc-TPP11 및 9D9-TPP11의 마우스 종양 성장 억제 활성을 확인하였다. 이때, 종양 성장 억제 활성 중에서 항체 의존적 세포 독성(Antibody-Dependent Cell Cytotoxicity, ADCC)에 의한 종양 억제 활성을 배제하고, 조절 T 세포에 의한 효과만을 확인하기 위해 Fc 영역에 Fc gamma 수용체가 결합하지 못하도록 234, 235번째 잔기 라이신(Lysine)을 알라닌(Alanine)으로 치환하고, 329번째 프롤린(Proline)을 글라이신(Glycine)으로 치환하여 구축한 Fc 돌연변이체를 Fc(AAG)로 명명하고, 여기에 TPP11을 융합한 Fc(AAG)-TPP11을 구축하여 항체 의존적 세포 독성이 유도될 수 있는 Fc-TPP11과 비교하여 조절 T 세포 표적을 통한 종양 성장 억제 활성능을 확인하였다.

따라서, 먼저 Fc(AAG) 및 Fc(AAG)-TPP11을 구축하였다.

구체적으로는, Fc 및 Fc-TPP11가 코딩되어 있는 DNA에 합성 올리고뉴클레오티드 (Macrogen, Korea)를 이용해 통상의 기술자에 의해 행해지는 부위 지정 돌연변이 (Site-directed mutagenesis) 방법으로 동물세포 발현 벡터에 signal sequence-hinge-CH2-CH3의 순서를 가지도록 인 프레임 (in-frame)으로 NotI/HindIII 제한효소를 이용하여 클로닝 하였다. 하기 표 2에 Fc(AAG)에 TPP11이 융합된 Fc(AAG)-TPP11의 아미노산 및 DNA 서열을 나타내었다.

구성	서열	번호
Fc(AAG)-TPP11 아미노산 서열	TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSHTPGNSKPTRTPRR	서열번호 10
Fc(AAG)-TPP11 DNA 서열	ACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCCGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCGCCGGGTAAAGGTGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGAAGTGGAGGTGGAGGATCACATACTCCTGGAAATAGCAAACCAACACGCACACCAAGGCGT	서열번호 11
Fc(AAG) 아미노산 서열	TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	서열번호 12
Fc-TPP11 아미노산 서열	TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSHTPGNSKPTRTPRR	서열번호 13
Fc 아미노산 서열	TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	서열번호 14

Fc(AAG) 및 Fc(AAG)-TPP11 발현 벡터를 일시적 트랜스펙션 (transient transfection)을 이용하여 단백질을 발현 및 정제하였다. 진탕 플라스크에서, 무혈청 FreeStyle 293 발현 배지 (Invitrogen)에서 부유 성장하는 HEK293-F 세포(Invitrogen)를 플라스미드 및 폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine, PEI) (Polyscience)의 혼합물로 트랜스펙션하였다. 진탕 플라스크 (Corning)에 30mL 트랜스펙션시, HEK293-F 세포를 2 X 10⁶ 세포/ml의 밀도로 배지 25ml에 파종하여, 130 rpm, 8 % CO₂에서 배양하였다. 각각의 단백질을 생산하기 위해 Fc(AAG) 및 Fc(AAG)-TPP11 발현 플라스미드를 3ml FreeStyle 293 발현 배지 (Invitrogen)에 각각 37.5㎍으로 희석하여, PEI 112.5 ㎍을 희석한 5ml의 배지와 혼합하여 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후, 반응시킨 혼합배지를 앞서 25ml로 파종한 세포에 넣어 7일 동안 150 rpm, 8% CO₂에서 배양했다. 표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 배양 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 단백질 A 세파로오스 컬럼 (Protein A Sepharose column) (GE healthcare)에 항체를 적용하고 PBS (pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 M 글라이신 완충액을 이용하여 pH 3.0에서 항체를 용리한 후 1M Tris 완충액 (pH 9.0)을 이용하여 샘플을 즉시 중화하였다. 용리한 항체 분획은 투석방법을 통해 PBS (pH 7.4)로 완충액을 교환하며 농축을 진행하였다. 정제된 단백질은 BCA protein assay kit (Thermo)내 용액을 이용하여 562 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그려진 표준 곡선에 따라 그 양을 정량하였다. 얻어진 Fc(AAG) 및 Fc(AAG)-TPP11 단백질의 수율은 돌연변이가 도입되기 전의 Fc 및 Fc-TPP11 단백질과 비교하여, 큰 차이 없이 잘 정제된 것을 확인하였다.

실시예 7: Fc-TPP11 및 Fc(AAG)-TPP11의 생체 내 대장암 성장 억제능

실시예 6에서 구축 및 발현, 정제한 Fc(AAG) 및 Fc(AAG)-TPP11의 조절 T 세포 표적을 통한 종양 성장 억제능을 항체 의존적 세포 독성이 유도될 수 있는 Fc-TPP11과 비교하기 위해, Fc, Fc-TPP11, Fc(AAG), Fc(AAG)-TPP11 및 9D9의 BALB/c 마우스 생체 내에서 종양 성장 억제 활성을 측정하였다.

도 7은 Fc, Fc-TPP11, Fc(AAG), Fc(AAG)-TPP11 및 9D9의 BALB/c 마우스 생체 내에서 종양 성장 억제 활성을 측정한 결과이다.

구체적으로, 5주령의 암컷 BALB/c 마우스 (Charles River Japan)에 CT26 세포 (1 x 10⁶ 세포/마우스)를 150 μL PBS에 희석하여 마우스 피하에 이식하였다. 유사한 크기의 종양 (평균 부피 120~150 mm³)을 가진 마우스를 처리집단으로 무작위로 배정하고, 도 7a에 나타낸 바와 같이, Fc, Fc-TPP11, Fc(AAG), Fc(AAG)-TPP11은 각각 10 mg/kg씩 2일마다 총 7회, 9D9은 2.5 mg/kg씩 3일마다 총 3회 안구 뒤로 주사 (Retro-orbital injection, R.O injection)하였다. 종양은 일주일에 2회씩 측정하고, 종양의 부피 (V)를 V=길이x폭²/2로 계산하였다.

그 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이, 대조군인 Vehicle, Fc 및 Fc(AAG) 투여군에 비해, Fc-TPP11, Fc(AAG)-TPP11 및 9D9 투여군이 종양 성장 억제능을 나타냄을 확인하였다. 또한, Fc-TPP11과 Fc(AAG)-TPP11간의 종양 성장 억제능은 유의미한 차이를 보이지 않았다. 즉, Fc gamma 수용체 결합을 통한 항체 의존적 세포독성 기작에 의한 종양 성장 억제능이 아닌 뉴로필린 1 특이적 결합 펩타이드인 TPP11을 통해 종양 성장 억제능이 나타남을 알 수 있었다.

또한, 도 7c에서는 대조군인 Vehicle, Fc 및 Fc(AAG) 투여군과 비교하여 Fc-TPP11, Fc(AAG)-TPP11, 9D9 투여시 마우스의 체중 변화가 거의 없는 것을 확인하였으며, 이에 따라 독성은 없는 것을 알 수 있었다.

도 7d는 상기 도 7b의 결과에서 날짜에 따라 각 투여군의 종양 부피 변화를 마우스 한 개체마다 나타낸 그래프로서, 각각의 투여군에서 마우스 개체마다 큰 오차 없이 유사한 종양 성장 경향을 보임을 확인하였다.

실시예 8: Fc-TPP11 및 Fc(AAG)-TPP11 투여군의 생체 내 종양 침윤 림프구 분석을 통한 기작 평가

실시예 7의 Fc-TPP11 및 Fc(AAG)-TPP11 투여에 의한 생체내 종양 억제가 TPP11을 통한 조절 T 세포의 뉴로필린 1 표적에 의한 효능인지 확인하기 위해, 상기 실시예 7의 Fc(AAG)와 Fc(AAG)-TPP11 투여군의 다섯 번째 투여 24시간 뒤에 투여군 각각의 마우스를 치사하여 종양 침윤 림프구를 분리하고 종양 침윤 림프구 중 세포 독성 T 세포의 비율 및 조절 T 세포의 비율을 유세포 분석기 (FACS)로 분석하였다.

구체적으로는, 적출한 종양을 0.5~1.0g 사이가 되도록 절단하여 실시예 5에서와 동일하게 종양을 분쇄하여 세포를 얻고 세포 독성 T 세포를 염색하기 위해서 림프구 마커인 CD45를 인지하는 APC가 결합된 항체 (e-Bioscience), CD3를 인지하는 PE-cy5가 결합된 항체 (e-Bioscience)와 CD8를 인지하는 PE가 결합된 항체 (e-Bioscience)를 넣어 4℃에서 30분간 반응시켰다. 또한, 조절 T 세포를 염색하기 위해 CD45를 인지하는 FITC가 결합된 항체 (e-Bioscience), CD4를 인지하는 PE가 결합된 항체 (e-Bioscience)를 넣어 4℃에서 30분간 반응시켰다. PBS로 세척하고 Foxp3 염색 키트를 이용하여 실시예 5에서와 동일하게 Foxp3 염색도 수행하였다. PBS로 세척 후, 세포 독성 T 세포 (CD45⁺CD3⁺CD8⁺)와 조절 T 세포 (CD45⁺CD4⁺Foxp3⁺)를 유세포 분석기 FACS Aria III (BD bioscience, Korea)로 분석하였다.

그 결과, 종양 침윤 림프구 중 세포 독성 T 세포의 비율이 대조군인 Vehicle 및 Fc(AAG)에 비하여 Fc(AAG)-TPP11 투여군에서 증가되어 있음을 관찰하였고, 반면, 종양 내 CD4⁺ T 세포 (CD45⁺CD4⁺) 중 조절 T 세포 (CD45⁺CD4⁺Foxp3⁺)의 비율은 대조군인 Vehicle 및 Fc(AAG)에 비하여 Fc(AAG)-TPP11 투여군에서 감소함을 확인하였다 (도 8a).

또한, Fc(AAG)-TPP11 투여군에서 세포 독성 T 세포 비율의 증가가 Fc(AAG)-TPP11의 조절 T 세포의 활성을 억제한 효과에 의한 것인지 알아보고자, 각 투여군의 종양 침윤 림프구에서 분리한 조절 T 세포(CD4⁺CD25⁺)와 종양을 이식하지 않은 마우스의 비장에서 분리한 CD4 T 세포(CD4⁺CD25^-)를 공동배양하여 조절 T 세포의 억제활성을 평가하였다.

구체적으로는, 실시예 5-2의 방법과 동일하게 Vehicle, Fc(AAG) 및 Fc(AAG)-TPP11 투여군의 종양 침윤 림프구에서 분리한 조절 T 세포(2 x 10⁴ cells/well)와 종양을 이식하지 않은 정상 마우스의 비장을 분쇄하여 얻은 CD4 T 세포(1 x 10⁵cells/well)를 항-CD3, CD28 항체를 미리 코팅한 96-웰 라운드 바텀 플레이트에 5% CO₂, 37℃ 조건에서 3일 동안 공동배양하였다. 3일 뒤 각 웰에 CTG 기질을 100 μl씩 넣고 15분 동안 25℃에서 반응시켜 세포를 용해시켰다. 세포 용해물을 화이트 96-웰 플레이트로 옮기고 마이크로플레이트 리더를 이용하여 발광 정도를 측정하였다.

그 결과, Fc 및 Fc-TPP11 결과과 동일하게 Fc(AAG)-TPP11 투여군에서 얻은 조절 T 세포는 대조군인 Fc(AAG) 투여군에 비하여 조절 T 세포의 CD4⁺ T 세포 성장 억제능이 감소해 있음을 확인하였다 (도 8b). 따라서, Balb/c 마우스 모델에서 Fc(AAG)-TPP11이 CT26 종양성장 억제능을 보이는 기작은 NRP1 표적 Fc(AAG)-TPP11에 의해 종양 조직 내 CD4+ T 세포 중 조절 T 세포의 비율을 감소시키고, 종양 조직 내 침투해 있는 조절 T 세포의 활성을 억제함으로써, 종양 조직 내 세포 독성 T 세포의 성장을 증가시키는 기작임을 확인하였다.

실시예 9: Fc - TPP11 및 Fc ( AAG )- TPP11의 생체 내 악성 흑색종 성장 억제능 평가

실시예 8에서 Fc-TPP11 및 Fc(AAG)-TPP11의 BALB/c 마우스의 대장암 성장 억제 활성을 확인하였으며, 이러한 종양 성장 억제능이 다른 종양 모델에서도 나타나는지 알아보기 위해, 악성 흑생종 모델을 통해 추가로 확인하였다.

도 9는 Fc-TPP11, Fc(AAG)-TPP11 및 9D9의 C57BL/6 마우스 생체 내에서 악성 흑생종인 B16F10 종양 성장억제 활성을 측정한 것이다.

구체적으로, 5주령의 암컷 C57BL/6 마우스 (NaraBio, Korea)에 B16F10 세포 (1 x 10⁶ 세포/마우스)를 150 μL PBS에 희석하여 마우스 피하에 이식하였다. 유사한 크기의 종양 (평균 부피 120~150 mm³)을 가진 마우스를 처리집단으로 무작위로 배정하고, 도 9a에 나타낸 바와 같이, Fc, Fc-TPP11, Fc(AAG), Fc(AAG)-TPP11은 각각 10 mg/kg씩 2일마다 총 7회, 9D9은 2.5 mg/kg씩 3일마다 총 5회 복강 주사하였다. 종양은 일주일에 2회씩 측정하고, 종양의 부피 (V)를 V=길이x폭²/2로 계산하였다.

그 결과, 도 9b에 나타낸 바와 같이, 대조군인 Vehicle, Fc, Fc(AAG) 투여군에 비하여 Fc-TPP11, Fc(AAG)-TPP11 투여군에서 종양 성장 억제를 확인하였고, CTLA-4를 표적하는 9D9 역시 종양 성장 억제능을 보임을 확인하였다. 또한, 도 9c에서 대조군과 비교하여 Fc-TPP11, Fc(AAG)-TPP11, 9D9 투여시 마우스의 체중 변화가 거의 없는 것을 확인하였으며, 이에 따라 독성은 없는 것으로 판단하였다.

도 9d는 상기 도 9b의 결과에서 날짜에 따라 각 투여군의 종양 부피 변화를 마우스 한 개체마다 나타낸 그래프로서, 각각의 투여군에서 마우스 개체마다 큰 오차없이 유사한 종양 성장 경향을 보임을 확인하였다.

실시예 10: Fc-TPP11 및 Fc(AAG)-TPP11 투여군의 생체 내 악성 흑색종 침윤 림프구 분석을 통한 기작 평가 및 약물 독성 평가

실시예 8에서 Fc-TPP11 및 Fc(AAG)-TPP11 투여를 통한 생체 내 종양 억제 기작을 평가한 것과 같이, 악성 흑색종 모델에서 Fc-TPP11 및 Fc(AAG)-TPP11 투여군의 생체 내 종양 억제 기작을 확인하였다.

먼저, 도 10a는 실시예 9의 마지막 투여 24시간 뒤에 각 투여군의 마우스를 치사하여 종양을 적출하고 각 종양의 무게를 측정한 것이다.

그 결과, 대조군인 Vehicle, Fc, Fc(AAG) 투여군에 비하여 Fc-TPP11 및 Fc(AAG)-TPP11 및 9D9 투여군에서 종양 무게가 감소하였음을 확인하였다. 이는 도 9b에서 나타난 종양의 부피를 시간별로 측정한 종양 성장 곡선에서 나타난 Fc-TPP11, Fc(AAG)-TPP11 및 9D9의 종양 성장 억제능과 유사한 결과를 나타낸다.

10-1: 생체 내 악성 흑색종 침윤 림프구 분석

다음으로, 실시예 9의 Fc(AAG)와 Fc(AAG)-TPP11 투여군의 마지막 투여 24시간 뒤에 마우스를 치사하여 얻은 종양 침윤 림프구를 분리하여 종양 내 세포 독성 T 세포의 비율, 조절 T 세포 표면 뉴로필린 1의 발현량 및 조절 T 세포의 인터페론-감마의 분비양을 확인함으로써, Fc-TPP11 및 Fc(AAG)-TPP11의 기작을 규명하고자 하였다.

구체적으로는, 적출한 종양을 0.5~1.0 g 사이가 되도록 절단하여 실시예 5에서와 동일하게 종양을 분쇄하여 세포를 얻고 세포 독성 T 세포를 염색하기 위해서 림프구 마커인 CD45를 인지하는 APC가 결합된 항체 (e-Bioscience), CD3를 인지하는 PE-cy5가 결합된 항체 (e-Bioscience)와 CD8를 인지하는 PE가 결합된 항체 (e-Bioscience)를 넣어 4℃에서 30분간 반응시켰다. 또한 조절 T 세포를 염색하기 위해 CD45를 인지하는 FITC가 결합된 항체(e-Bioscience), CD4를 인지하는 PE가 결합된 항체 (e-Bioscience)와 뉴로필린 1을 인지하는 APC가 결합된 항체 (e-Bioscience)를 넣어 4℃에서 30분간 반응시켰다. PBS로 세척하고 Foxp3 염색 키트를 이용하여 실시예 5에서과 동일하게 Foxp3 염색을 수행하였다. PBS로 세척 후, 세포 독성 T 세포 (CD45⁺CD3⁺CD8⁺) 비율을 유세포 분석기 FACS Calibur(BD bioscience, Korea)로 분석하였다.

그 결과, 대조군인 Vehicle, Fc 및 Fc(AAG)에 비하여 Fc-TPP11, Fc(AAG)-TPP11 투여군에서 종양 침윤 림프구 중 세포 독성 T 세포의 비율이 증가되어 있음을 확인하였다. 또한, 각 투여군의 조절 T 세포 표면의 뉴로필린 1 발현양을 비교하였을 때 대조군에 비해 TPP11이 융합된 Fc-TPP11 및 Fc(AAG)-TPP11 투여군에서 감소되는 경향이 관찰되었다 (도 10b).

아울러, 최근 문헌에 따르면 뉴로필린 1이 결핍된 조절 T 세포의 경우 조절 T 세포의 인터페론-감마 및 인터페론-감마 수용체의 발현이 증가함으로써, 조절 T 세포의 세포 독성 T 세포의 성장 억제활성이 감소된다고 보고되었다. 따라서, 뉴로필린 1을 표적할 수 있는 Fc-TPP11 및 Fc(AAG)-TPP11을 투여하였을 때, 조절 T 세포의 인터페론-감마의 분비가 증가되는 기작이 나타나는지 확인하기 위해, 실시예 9의 마지막 투여 후 각 종양 침윤 림프구를 분리하여, 조절 T 세포의 각 투여군 간의 인터페론-감마의 세포내 염색을 통하여 유세포 분석기로 분석하였다.

구체적으로는, 실시예 8에의 방법과 동일하게 종양을 적출한 뒤 종양을 분쇄하여 종양 세포와 종양 침윤 림프구가 혼재되어 있는 세포 부유물을 얻었다. 이 세포 부유물을 각 투여군 마다 2x10⁶ 개씩 준비하여 항-CD3 항체 (1 ㎍/ml) 및 항-CD28 항체(0.5 ㎍/ml)를 자극 하에서 37℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 그 후 단백질 수송 저해제인 Golgi plug (BD bioscience)를 제조사의 프로토콜에 따라 6시간 동안 처리하였다. 6시간 뒤에 세포를 회수하여 CD4를 인지하는 FITC가 결합된 항체와 CD25를 인지하는 PE가 결합된 항체를 넣고 4℃에서 30분간 반응시켰다. 세포 내 사이토카인을 염색하기 위해 BD Cytofix/Cytoperm 용액(BD bioscience)을 조건 당 100 μl를 넣고 4℃에서 20분간 반응시켜 세포를 고정 및 투과화시켰다. 고정 및 투과화 용액 내에서 인터페론-감마를 인지하는 PE-cy5가 결합된 항체를 넣고 4℃에서 30분간 반응시켰다. 고정 및 투과화 용액으로 세척한 뒤 유세포 분석기 FACS Calibur로 분석하여, 각 투여군의 종양에서 얻은 종양 침윤 림프구 중 조절 T 세포 (CD4⁺CD25⁺)에서 염색된 인터페론-감마의 발현량을 측정하였다.

그 결과, 대조군인 Vehicle, Fc 및 Fc(AAG) 투여군에 비해 Fc-TPP11 과 Fc(AAG)-TPP11 투여군의 조절 T 세포에서 인터페론-감마의 발현량이 현저히 증가했음을 확인하였다 (도 10b). 이는 기존 문헌의 뉴로필린 1이 결핍된 조절 T 세포에서 일어나는 현상과 동일한 결과로, 뉴로필린 1 표적 펩타이드 TPP11이 조절 T 세포의 인터페론-감마 발현을 증가시킴으로써, 조절 T 세포의 세포 독성 T 세포의 성장을 억제하는 활성을 감소시킴을 확인할 수 있었다.

10-2: 조절 T 세포의 활성 평가

추가적으로, 도 10c는 실시예 9의 각 투여군의 종양 침윤 림프구에서 분리한 조절 T 세포 (CD4⁺CD25⁺)와 종양을 이식하지 않은 마우스의 비장에서 분리한 CD4 T 세포를 배양하여 조절 T 세포의 억제효과를 평가한 것이다.

구체적으로, 실시예 5-2의 방법과 동일하게 Fc, Fc-TPP11, Fc(AAG) 및 Fc(AAG)-TPP11 투여군의 종양 침윤 림프구에서 분리한 조절 T 세포와 종양을 이식하지 않은 정상 마우스의 비장을 분쇄하여 얻은 CD4 T 세포를 96-웰 라운드 바텀 플레이트를 이용하여 항-CD3, CD28 자극 하에서 5% CO₂, 37℃ 조건에서 3일 동안 배양하였다. 3일 뒤 각 웰에 CTG 기질을 100 μl씩 넣고 15 분동안 25℃에서 반응시켜 세포를 용해시켰다. 세포 용해물을 96-웰 white 플레이트로 옮기고 마이크로플레이트 리더를 이용하여 발광 정도를 측정하였다.

그 결과, 악성 흑색종 모델에서도 대조군인 Fc 및 Fc(AAG) 투여군보다 Fc-TPP11 및 Fc(AAG)-TPP11 투여군에서 분리한 조절 T 세포의 활성이 감소해 있음을 확인하였다 (도 10c).

다음으로, Fc-TPP11 및 Fc(AAG)-TPP11이 마우스 내에서 면역 세포인 조절 T 세포의 활성을 저해시킴으로써, 독성을 나타내지 않는지 확인하기 위하여, 마우스의 체중 변화 외에 간독성 수치를 비교하였다.

구체적으로는, 실시예 9의 마지막 투여 24시간 뒤에 마우스를 치사하고 투여군 당 4마리의 마우스에서 혈액을 약 300-500μl씩 채취하여 30분간 12,000rpm, 25℃ 조건에서 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 간독성을 측정하기 위하여 ALT (Alanine Transaminase Activity) 어세이를 수행하였고, 이는 간에 존재하는 ALT라는 효소가 간이 손상됨에 따라 혈액 내로 빠져나오기 때문에, 혈액을 채취하여 혈청을 분리한 뒤 혈청 내 ALT 효소 농도를 측정함으로써 약물 투여에 의한 간독성 여부를 판단할 수 있는 어세이이다. 분리한 혈청을 5배 희석하여 ALT 어세이 키트(AsanPharm, Korea)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 어세이를 수행하였다.

그 결과, 9D9 투여군에서 다른 투여군에 비하여 ALT 수준이 증가되는 경향을 보였으나 유의미한 차이를 보이지 않았으며, 정상 수준의 ALT 농도는 35 U/ml 미만이라는 것을 고려했을 때 정상 마우스 및 대조군이 Fc, Fc(AAG)와 비교하여 간독성을 보이는 투여군은 관찰되지 았았다 (도 10d). 즉, Fc-TPP11 및 Fc(AAG)-TPP11이 마우스 내에서 면역세포인 조절 T 세포의 활성을 저해함에 따른 독성은 나타나지 않음을 확인하였다.

실시예 11: Fc (AAG)-TPP11의 생체 내 조절 T 세포 특이적 대장암 성장 억제능 평가

실시예 7 내지 10에서의 Fc(AAG)-TPP11 투여에 의한 생체내 종양 성장 억제효과가 조절 T(CD4⁺CD25⁺) 세포 의존적인 효능인지 확인하기 위해, 세포 독성 T 세포 (CD8⁺)와 조절 T 세포(CD4⁺CD25⁺)를 입양전이한 Balb/c nude 마우스에서 Fc(AAG)-TPP11의 종양 성장 억제 활성을 측정하였다.

도 11은 Fc(AAG)-TPP11의 세포 독성 T 세포 (CD8⁺)와 조절 T 세포(CD4⁺CD25⁺)를 입양전이한 Balb/c nude 마우스에서 Fc(AAG)-TPP11의 종양 성장 억제 활성을 측정한 결과이다.

구체적으로, 입양전이 할 세포 독성 T 세포 (CD8⁺)와 조절 T 세포(CD4⁺CD25⁺)는 5주령의 암컷 BALB/c 마우스 (Charles River Japan)에 CT26 세포 (1 x 10⁶ 세포/마우스)를 150 μL PBS에 희석하여 마우스 피하에 이식한 다음 15일 째 평균 부피 400~500 mm³를 가진 마우스의 비장과 사타구니 림프절에서 분리하였다. 비장과 사타구니 림프절은 페트리디쉬에서 철망을 이용해 분쇄한 다음 2%의 FBS가 포함된 배지 10 ml를 넣어 세척하였다. 그 후, 적혈구 용혈버퍼 (red blood cell lysis buffer)를 1 ml 넣어 적혈구를 용혈 시킨 다음 PBS로 세척하여 세포 혼탁액을 준비하였다. 림프구세포를 PE 가 결합된 CD8를 인지하는 항체를 넣어 4℃에서 30분간 염색하고 차가운 PBS(pH 7.4)로 세척한 다음 anti-PE microbeads(Miltenyi Biotec)를 15분간 결합시켜 MACS separator와 LS column(Miltenyi Biotec)을 이용하여 세포 독성 T 세포 (CD8⁺)를 분리하였다. 조절 T세포(CD4⁺CD25⁺)를 분리하기 위해 조절 T 세포 isolation kit(Miltenyi Biotec)를 이용하였다. 먼저 biotinylated 항체를 이용해 CD4⁺ T cells을 enrich 시키고, 이 림프구세포 중에서 PE 가 결합된 CD25를 인지하는 항체를 넣어 4℃에서 30분간 염색하고 차가운 PBS(pH 7.4)로 세척한 다음 anti-PE microbeads(Miltenyi Biotec)를 15분간 결합시켜 MACS separator와 LS column(Miltenyi Biotec)을 이용하여 CD4⁺CD25⁺T세포를 분리하였다. 세포 독성 T 세포 (CD8⁺)와 조절 T 세포(CD4⁺CD25⁺)는 95% 이상의 purity를 나타내었다.

Fc(AAG)-TPP11 투여에 의한 생체내 종양 성장 억제효과가 조절 T(CD4⁺CD25⁺) 세포 의존적인 효능인지 확인하기 위해, 5주령의 암컷 BALB/c nude 마우스 (Charles River Japan)에 CT26 세포 (1 x 10⁶ 세포/마우스)를 150 μL PBS에 희석하여 마우스 피하에 이식한 다음, 유사한 크기의 종양 (평균 부피 120~150 mm³)을 가진 마우스를 처리집단으로 무작위로 배정하였다. 도 11a에 나타낸 바와 같이 5일째에 세포 독성 T 세포 (CD8⁺, 5 x 10⁶ 세포/마우스)와 조절 T 세포(CD4⁺CD25⁺, 5 x 10⁶ 세포/마우스)를 정맥주사로 입양전이하고, Fc(AAG), Fc(AAG)-TPP11은 각각 15 mg/kg씩 3일마다 총 6회 복강주사(i.p.)하였다. 종양은 3일마다 측정하고, 종양의 부피 (V)를 V=길이x폭²/2로 계산하였다.

그 결과, 도 11b에 나타낸 바와 같이, Fc(AAG)-TPP11은 세포 독성 T 세포 (CD8⁺)만 입양전이한 마우스에서는 종양성장억제효과를 보이지 않았지만, 세포 독성 T 세포 (CD8⁺)와 조절 T 세포(CD4⁺CD25⁺)를 함께 입양전이한 마우스에서만 종양성장억제능을 보임을 확인하였다.

또한 Fc(AAG)-TPP11 투여군에서 종양성장억제능이 실시예 8과 9에서 관찰한 바와 같이 TPP11을 통한 조절 T 세포(CD4⁺CD25⁺)의 뉴로필린 1 표적에 의한 효능인지 확인하기 위해 상기 실시예 11의 Fc(AAG)와 Fc(AAG)-TPP11 투여군의 여섯 번째 투여 48시간 뒤에 투여군의 마우스를 각각 치사하여 종양침윤 림프구를 분리하고 종양 침윤 림프구 중 조절 T세포의 비율과 뉴로필린 1 의 발현양을 유세포 분석기 (FACS)로 분석하였다.

구체적으로는, 적출한 종양을 0.5~1.0g 사이가 되도록 절단하여 실시예 5에서와 동일하게 종양을 분쇄하여 세포를 얻고 조절 T 세포를 염색하기 위해서 CD45를 인지하는 FITC가 결합된 항체 (e-Bioscience), CD4를 인지하는 PE가 결합된 항체 (e-Bioscience) 및 뉴로필린 1을 인지하는 APC가 결합된 항체(e-Bioscience)를 넣어 4℃에서 30분간 반응시켰다. PBS로 세척하고 Foxp3 염색 키트를 이용하여 실시예 5에서와 동일하게 Foxp3 염색도 수행하였다. PBS로 세척 후, 조절 T 세포 (CD45⁺CD4⁺Foxp3⁺)를 유세포 분석기 FACS Aria III (BD bioscience, Korea)로 분석하였다.

그 결과, 조절 T 세포 (CD45⁺CD4⁺Foxp3⁺)의 비율과 조절 T 세포의 억제효과 마커인 Foxp3의 발현양이 대조군인 Vehicle 및 Fc(AAG)에 비하여 Fc(AAG)-TPP11 투여군에서 감소함을 확인하였다 (도 11c). 또한 대조군에 비해 TPP11이 융합된 Fc(AAG)-TPP11 투여군에서 조절 T 세포 표면의 뉴로필린 1 발현양이 감소되었다 (도 11c). 따라서 Fc(AAG)-TPP11은 NRP1을 표적하는 Fc(AAG)-TPP11에 의해 종양 조직 내 CD4⁺ T 세포 중 조절 T 세포의 비율을 감소시키고, 종양 조직 내 침투해 있는 조절 T 세포의 활성에 중요한 Foxp3의 발현을 억제함으로써 조절 T 세포의 존재하에서만 CT26 종양성장 억제능을 보임을 확인하였다.

실시예 12: Fc (AAG)-TPP11에 의한 종양침윤 조절 T 세포의 활성 감소 및 세포독성 T 세포 기능증가 평가

실시예 11에서의 Fc(AAG)-TPP11 투여에 의한 생체내 종양 성장 억제효과가 조절 T(CD4⁺CD25⁺) 세포 의존적인 효능임을 확인하였으므로, Fc(AAG)-TPP11에 의한 종양형성 억제효과 기전이 종양침윤 조절 T 세포(CD4⁺CD25⁺)에 발현된 뉴로필린 1의 감소에 의한 조절 T 세포의 수와 기능의 감소에 의한 것인지를 규명하고자 하였다. 또한 조절 T 세포의 수와 기능 감소로 종양침윤 세포 독성 T 세포 (CD8⁺)의 수와 기능이 증가되었는지도 분석하였다.

구체적으로는, 적출한 종양을 0.5~1.0g 사이가 되도록 절단하여 실시예 5에서와 동일하게 종양을 분쇄하여 세포를 얻고 조절 T 세포를 염색하기 위해 CD45를 인지하는 FITC가 결합된 항체 (e-Bioscience), CD4를 인지하는 PE가 결합된 항체 (e-Bioscience) 및 뉴로필린 1을 인지하는 APC가 결합된 항체 (e-Bioscience)를 넣어 4℃에서 30분간 반응시켰다. PBS로 세척하고 Foxp3 염색 키트를 이용하여 실시예 5에서와 동일하게 Foxp3 염색도 수행하였다. 세포 독성 T 세포를 염색하기 위해서 림프구 마커인 CD45를 인지하는 APC가 결합된 항체 (e-Bioscience), CD3를 인지하는 PE-cy5가 결합된 항체 (e-Bioscience)와 CD8를 인지하는 PE가 결합된 항체 (e-Bioscience)를 넣어 4℃에서 30분간 반응시켰다. 또한, 세포 독성 T 세포의 증식능을 평가할 수 있는 ki-67을 염색하기 위해, 핵내 단백질을 염색하기 위해 사용되는 시약인 Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 세포를 고정(fixation)하고 투과(permeabilization)시켰다. 그 후 ki-67를 인지하는 FITC가 결합된 항체 (e-Bioscience)를 넣어 4℃에서 30분간 염색한 다음 투과버퍼를 넣어 유세포 분석기 FACS Aria III (BD bioscience, Korea)로 분석하였다.

조절 T세포는 억제성 사이토카인인 인터루킨-10에 의해 세포독성 T세포의 기능을 억제한다. 반면 세포독성 T 세포는 인터페론-감마와 같은 사이토카인을 분비하여 암세포의 성장을 억제하는 것으로 알려져 있다. Fc(AAG)-TPP11에 의해 조절 T세포의 인터루킨-10 분비기능이 감소되고 세포독성 T 세포의 인터페론-감마 분비기능이 증가되었는지를 측정하기 위해 Ficoll을 이용하여 종양침윤 림프구를 분리하였다.

구체적으로는, 15 ml 시험관에 Ficoll (GE Healthcare) 5 ml을 채워 넣었다. 종양분쇄액을 RPMI 1640 배지 5 ml에 섞어 Ficoll이 담긴 시험관에 Ficoll과 섞이지 않게 넣고 750 g에서 20분간 no break 상태로 원심 분리하였다. 그 후 Ficoll 위에 형성된 buffy coat를 회수하여 PBS (pH 7.4)로 2번 세척한 후 종양침윤 림프구를 얻었다. 분리된 종양침윤 림프구에서 조절 T세포와 세포독성 T 세포의 사이토카인 분비능을 평가하기 위해 이 세포 부유물을 각 투여군 마다 1x10⁶ 개씩 준비하여 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA; 100 ng/mL)와 ionomycin (500 ng/mL) 자극 하에서 37℃에서 8시간 동안 반응시켰다. 세포를 회수하기 전 6시간 동안 단백질 수송 저해제인 Golgi plug (BD bioscience)를 제조사의 프로토콜에 따라 처리하였다. 조절 T세포의 인터루킨-10 분비능을 분석하기 위해 세포를 회수하여 CD4를 인지하는 FITC가 결합된 항체와 CD25를 인지하는 PE가 결합된 항체를 넣고 4℃에서 30분간 반응시켰다. 세포 내 사이토카인을 염색하기 위해 BD Cytofix/Cytoperm 용액(BD bioscience)을 조건 당 100 μl를 넣고 4℃에서 20분간 반응시켜 세포를 고정 및 투과화시켰다. 고정 및 투과화 용액 내에서 인터루킨-10을 인지하는 PE-cy5가 결합된 항체를 넣고 4℃에서 30분간 반응시켰다. 고정 및 투과화 용액으로 세척한 뒤 유세포 분석기 FACS Calibur로 분석하여, 각 투여군의 종양에서 얻은 조절 T 세포(CD4⁺CD25⁺) 중 인터루킨-10을 분비하는 조절 T 세포의 비율을 측정하였다. 세포독성 T세포의 인터페론-감마 분비능을 분석하기 위해 세포를 회수하여 CD8을 인지하는 FITC가 결합된 항체와 CD3를 인지하는 PE가 결합된 항체를 넣고 4℃에서 30분간 반응시켰다. 세포 내 사이토카인을 염색하기 위해 BD Cytofix/Cytoperm 용액(BD bioscience)을 조건 당 100 μl를 넣고 4℃에서 20분간 반응시켜 세포를 고정 및 투과화시켰다. 고정 및 투과화 용액 내에서 인터페론-감마을 인지하는 PE-cy5가 결합된 항체를 넣고 4℃에서 30분간 반응시켰다. 고정 및 투과화 용액으로 세척한 뒤 유세포 분석기 FACS Calibur로 분석하여, 각 투여군의 종양에서 얻은 세포독성 T 세포(CD3⁺CD8⁺) 중 인터페론-감마을 분비하는 세포독성 T 세포의 비율을 측정하였다.

그 결과, Fc(AAG)-TPP11 투여군에서 대조군인 Vehicle 및 Fc(AAG)에 비하여 조절 T 세포 (CD45⁺CD4⁺Foxp3⁺)의 뉴로필린 1 발현이 감소되었고, CD4+ T 세포(CD45⁺CD4⁺) 중 조절 T 세포 (CD45⁺CD4⁺Foxp3⁺)의 비율이 감소되었다 (도 12a). 특히 Fc(AAG)-TPP11 투여군에서 조절 T 세포의 억제효과 마커인 Foxp3의 발현양이 감소되었고, 억제성 사이토카인인 인터루킨-10을 분비하는 조절 T세포의 비율도 크게 감소되었다 (도 12a). 따라서 Fc(AAG)-TPP11은 조절 T 세포에 발현된 뉴로필린 1의 양을 감소시켜 조절 T 세포의 수와 기능을 감소시킴을 확인하였다.

또한 Fc(AAG)-TPP11 투여군에서 대조군인 Vehicle 및 Fc(AAG)에 비하여 종양에 침윤된 림프구 중 세포독성 T세포 (CD3⁺CD8⁺)의 비율이 높았으며, 이 세포독성 T세포는 증식능 뿐만 아니라 인터페론-감마 분비능도 대조군에 비해 높음을 확인하였다 (도 12b). 따라서 Fc(AAG)-TPP11은 종양에 침윤된 조절 T 세포의 수와 기능을 감소시키고, 그 결과 세포독성 T세포의 수와 기능이 증가되어 종양의 형성을 억제함을 확인하였다.

실시예 13: 뉴로필린 1에 대한 결합능이 향상된 Fc - TPP10의 구축 및 뉴로필린 1 결합능 평가

13-1: Fc-TPP10의 구축 및 발현, 정제.

실시예１ 내지 10에서 사용한 Fc-TPP11를 기반으로, 뉴로필린 1에 대한 결합능을 향상시켜 조절 T 세포의 활성 억제 등의 효능을 높일 수 있는 Fc-TPP10를 구축하였다. 기존의 뉴로필린 1에 특이적으로 결합하는 펩타이드인 TPP11의 서열(서열번호 1) 분석을 통해, 뉴로필린 1에 대한 결합능이 향상될 것이라 예상되는 펩타이드 TPP10 서열(서열번호 4)을 설계하여 합성 후, Fc-TPP10을 구축하여 발현 및 정제하였다.

HTPGNSKPTRTPR (TPP10, 서열번호 4)

본 발명에서의 “Fc-TPP10”은 뉴로필린 1에 특이적으로 결합하는 펩타이드인 TPP10이 항체의 중쇄불변부위(Fc)와 융합된 융합단백질을 의미한다.

구체적으로는, 상기 실시예 1에서 Fc-TPP11을 생산하기 위한 벡터 구축과 동일한 방법으로, TPP10 펩타이드가 융합된 Fc-TPP10 단백질을 생산하기 위한 DNA를 클로닝하였다.

도 13a는 Fc-TPP10 융합단백질을 동물세포 (HEK293F)에서 발현 및 정제한 후, 4 ㎍의 단백질을 비환원성 조건의 SDS-PAGE상에서 분리하고, Coomasie Blue 염색을 통해 크기 및 조합형태를 분석한 결과이다.

Fc, Fc-TPP11 및 Fc-TPP10 발현 벡터를 일시적 트랜스펙션 (transient transfection)을 이용하여 단백질을 발현 및 정제하였다. 진탕 플라스크에서, 무혈청 FreeStyle 293 발현 배지 (Invitrogen)에서 부유 성장하는 HEK293-F 세포(Invitrogen)를 플라스미드 및 폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine, PEI) (Polyscience)의 혼합물로 트랜스펙션하였다. 진탕 플라스크 (Corning)에 30mL 트랜스펙션시, HEK293-F 세포를 2 X 10⁶ 세포/ml의 밀도로 배지 25ml에 파종하여, 130 rpm, 8 % CO₂에서 배양하였다. 각각의 단백질을 생산하기 위해 Fc, Fc-TPP11 및 Fc-TPP10 발현 플라스미드를 3ml FreeStyle 293 발현 배지 (Invitrogen)에 각각 37.5㎍으로 희석하여, PEI 112.5 ㎍을 희석한 5ml의 배지와 혼합하여 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후, 반응시킨 혼합배지를 앞서 25ml로 파종한 세포에 넣어 7일 동안 150 rpm, 8% CO₂에서 배양했다. 표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 배양 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 단백질 A 세파로오스 컬럼 (Protein A Sepharose column) (GE healthcare)에 항체를 적용하고 PBS (pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 M 글라이신 완충액을 이용하여 pH 3.0에서 항체를 용리한 후 1M Tris 완충액 (pH 9.0)을 이용하여 샘플을 즉시 중화하였다. 용리한 항체 분획은 투석방법을 통해 PBS (pH 7.4)로 완충액을 교환하며 농축을 진행하였다. 정제된 단백질은 BCA protein assay kit (Thermo)내 용액을 이용하여 562 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그려진 표준 곡선에 따라 그 양을 정량하였다. 얻어진 Fc-TPP10 단백질의 수율은 Fc 및 Fc-TPP11 단백질과 비교하여, 큰 차이 없이 잘 정제된 것을 확인하였다.

13-2: Fc-TPP10 융합단백질의 뉴로필린 1에 대한 결합능 향상 평가.

상기 TPP11 펩타이드 서열분석을 통해 설계된 TPP10 펩타이드가 융합된 Fc-TPP10 융합단백질이 Fc-TPP11와 비교하여, 인간 뉴로필린 1 세포밖 도메인 (Human NRP1 Extracellular domain, hNRP1-ECD)에 대해 Fc-TPP11보다 뛰어난 결합능을 보이는지 ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)를 통해 확인하고자 하였다.

구체적으로는, 96-웰 플레이트 (SPL, Korea)에 인간 뉴로필린 1 세포밖 도메인 단백질 (0.2 ㎍/well)을 20시간동안 4℃에서 코팅한 후, PBS (pH 7.4)으로 세척한 후, 3% BSA가 포함된 PBS (pH 7.4)로 3시간 동안 25℃에서 blocking 하였다. 그 후, Fc, Fc-TPP11, Fc-TPP10을 농도별 (100, 10 nM)로 25℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, PBS로 3회 세척하였다. HRP가 결합된 항-인간 항체 중쇄부위 항체 (Horse radish peroxidase anti-human Fc mAb, Thermo, USA)를 25℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, PBS로 3회 세척하였다. 그 후, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB, Sigma) 기질을 넣어 마이크로플레이트 리더(Biotek Cytation 3, Korea)를 이용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

그 결과, Fc 및 Fc-TPP11과 비교하여, 낮은 농도 (10 nM)에서 Fc-TPP10의 인간 뉴로필린 1 세포밖 도메인에 대한 결합능이 Fc-TPP11보다 약 1.7 배 유의미하게 증가되었음을 확인하였다 (도 13b).

이는 상기 Fc-TPP11의 조절 T 세포의 뉴로필린 1을 표적함으로써 유도되는 조절 T 세포의 활성 억제능이 Fc-TPP10을 통해서 보다 효과적으로 일어날 수 있음을 시사한다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for Inhibiting Activity of Regulatory T Cell comprising peptides which specificallly binds to Neuropilin 1 <130> P20-B198 <150> KR 10-2017-0115262 <151> 2017-09-08 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TPP11 <400> 1 His Thr Pro Gly Asn Ser Lys Pro Thr Arg Thr Pro Arg Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TPP1 <400> 2 His Thr Pro Gly Asn Ser Asn Gln Phe Val Leu Thr Ser Thr Arg Pro 1 5 10 15 Pro Arg <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TPP8 <400> 3 His Thr Pro Gly Ile Ala Thr Arg Thr Pro Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TPP10 <400> 4 His Thr Pro Gly Asn Ser Lys Pro Thr Arg Thr Pro Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 496 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9D9-TPP11-HA <400> 5 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Glu Ala Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Val Leu 20 25 30 Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys 50 55 60 Ser Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser 85 90 95 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Leu Ile Thr Val Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser 130 135 140 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val 145 150 155 160 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu 165 170 175 Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr 195 200 205 Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro 210 215 220 Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr 225 230 235 240 Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met 260 265 270 Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu 275 280 285 Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val 290 295 300 His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu 305 310 315 320 Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly 325 330 335 Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr 370 375 380 Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu 385 390 395 400 Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro 405 410 415 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val 420 425 430 Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val 435 440 445 His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr 450 455 460 Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 465 470 475 480 Gly Ser His Thr Pro Gly Asn Ser Lys Pro Thr Arg Thr Pro Arg Arg 485 490 495 <210> 6 <211> 1488 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9D9-TPP11-HD <400> 6 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gacgaggcaa agctgcagga gtccggaccc gtgctggtga agcctggagc cagcgtgaag 120 atgtcctgca aggcctctgg ctacaccttc acagactact atatgaactg ggtgaagcag 180 agccacggca agtccctgga gtggatcggc gtgatcaacc cctacaatgg cgacacctct 240 tataaccaga agtttaaggg caaggccacc ctgacagtgg ataagagctc ctctaccgcc 300 tacatggagc tgaatagcct gacatccgag gattctgccg tgtactattg tgcccggtac 360 tatggctctt ggttcgccta ttggggccag ggcaccctga tcacagtgag cgccaaaaca 420 acagccccat cggtctatcc actggcccct gtgtgtggag atacaactgg ctcctcggtg 480 actctaggat gcctggtcaa gggttatttc cctgagccag tgaccttgac ctggaactct 540 ggatccctgt ccagtggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacacc 600 ctcagcagct cagtgactgt aacctcgagc acctggccca gccagtccat cacctgcaat 660 gtggcccacc cggcaagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgagcccag agggcccaca 720 atcaagccct gtcctccatg caaatgccca gcacctaacc tcttgggtgg accatccgtc 780 ttcatcttcc ctccaaagat caaggatgta ctcatgatct ccctgagccc catagtcaca 840 tgtgtggtgg tggatgtgag cgaggatgac ccagatgtcc agatcagctg gtttgtgaac 900 aacgtggaag tacacacagc tcagacacaa acccatagag aggattacaa cagtactctc 960 cgggtggtca gtgccctccc catccagcac caggactgga tgagtggcaa ggagttcaaa 1020 tgcaaggtca acaacaaaga cctcccagcg cccatcgaga gaaccatctc aaaacccaaa 1080 gggtcagtaa gagctccaca ggtatatgtc ttgcctccac cagaagaaga gatgactaag 1140 aaacaggtca ctctgacctg catggtcaca gacttcatgc ctgaagacat ttacgtggag 1200 tggaccaaca acgggaaaac agagctaaac tacaagaaca ctgaaccagt cctggactct 1260 gatggttctt acttcatgta cagcaagctg agagtggaaa agaagaactg ggtggaaaga 1320 aatagctact cctgttcagt ggtccacgag ggtctgcaca atcaccacac gactaagagc 1380 ttctcccgga ctccgggtaa aggtggagga ggatctggag gaggaggaag tggaggtgga 1440 ggatcacata ctcctggaaa tagcaaacca acacgcacac caaggcgt 1488 <210> 7 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9D9-HA <400> 7 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Glu Ala Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Val Leu 20 25 30 Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys 50 55 60 Ser Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser 85 90 95 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Leu Ile Thr Val Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser 130 135 140 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val 145 150 155 160 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu 165 170 175 Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr 195 200 205 Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro 210 215 220 Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr 225 230 235 240 Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met 260 265 270 Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu 275 280 285 Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val 290 295 300 His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu 305 310 315 320 Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly 325 330 335 Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr 370 375 380 Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu 385 390 395 400 Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro 405 410 415 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val 420 425 430 Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val 435 440 445 His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr 450 455 460 Pro Gly Lys 465 <210> 8 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9D9-LA <400> 8 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu Ser Leu 20 25 30 Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln 35 40 45 Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe 130 135 140 Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys 145 150 155 160 Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile 165 170 175 Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln 180 185 190 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Arg Thr Leu Thr Leu Thr 195 200 205 Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His 210 215 220 Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 235 240 <210> 9 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9D9-LD <400> 9 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gacgacatcg tgatgaccca gaccacactg tccctgcccg tgtctctggg cgatcaggcc 120 tctatcagct gccggagctc ccagagcatc gtgcactcca acggcaatac atacctggag 180 tggtatctgc agaagcccgg ccagtcccct aagctgctga tctacaaggt gtctaaccgg 240 ttcagcggcg tgccagacag attttccggc tctggcagcg gcaccgattt cacactgaag 300 atctccaggg tggaggcaga ggacctgggc gtgtactatt gtttccaggg ctctcacgtg 360 ccctatacct ttggcggcgg cacaaagctg gagatcaagc gcgctgatgc tgcaccaact 420 gtatccatct tcccaccatc cagtgagcag ttaacatctg gaggtgcctc agtcgtgtgc 480 ttcttgaaca acttctaccc caaagacatc aatgtcaagt ggaagattga tggcagtgaa 540 cgacaaaatg gcgtcctgaa cagttggact gatcaggaca gcaaagacag cacctacagc 600 atgagcagaa ccctcacgtt gaccaaggac gagtatgaac gacataacag ctatacctgt 660 gaggccactc acaagacatc aacttcaccc attgtcaaga gcttcaacag gaatgagtgt 720 720 <210> 10 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc(AAG)-TPP11-A <400> 10 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 1 5 10 15 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 35 40 45 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 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cgtcagtctt cctcttcccc 60 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 120 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 180 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 240 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 300 aacaaagccc tcggcgcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagcctcga 360 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 420 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 480 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 540 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 600 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtcg 660 ccgggtaaag gtggaggagg atctggagga ggaggaagtg gaggtggagg atcacatact 720 cctggaaata gcaaaccaac acgcacacca aggcgt 756 <210> 12 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc(AAG)-A <400> 12 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 1 5 10 15 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140 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 180 185 190 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220

Claims (15)

1. 뉴로필린 1(Neuropilin 1)에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 뉴로필린 1(Neuropilin 1)에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 Fc, 항체 또는 항체 단편과 융합된 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 뉴로필린 1에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 TPP11(서열번호 1), TPP1(서열번호 2), TPP8(서열번호 3) 및 TPP10(서열번호 4)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제2항에 있어서, 뉴로필린 1에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 링커 매개(linker-mediated) 결합, 화학적 결합, 또는 유전적 융합(genetic fustion)을 통해 Fc, 항체 또는 항체 단편과 결합된 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제2항에 있어서, 상기 펩타이드는 항체의 중쇄불변영역(Fc)의 C-말단에 결합된 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 제2항에 있어서, 상기 항체 단편은 Fab, F(ab)₂, scFv, V_H 또는 V_L인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
8. 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 면역관문(immune checkpoint) 관련 항원, 암세포 표면 특이적 항원, 암조직 혈관 특이적 항원, 암조직 미세환경 특이적 항원, 조절 T 세포 특이적 항원, 또는 종양조직에 침윤된 면역세포 특이적 항원과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 항원은 EGFR, HER2, VEGF, EpCAM, VEGFR-2, c-Met, CD20, CD19, CD22, CTLA-4, PD-1, PD-L1, TIM3, Mesothelin, TNFRSF4, PSMA, GPC3, GD2 ganglioside, CEA, FAP, integrin, 및 fibronectin으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
10. 제1항에 있어서, i) 종양 조직 내 CD4+ T 세포 중 조절 T 세포의 비율 감소; ii) 종양 조직 내 침투해 있는 조절 T 세포의 활성을 억제함으로써 인터루킨-2 및 인터페론-감마 발현 증가; 또는 iii) 종양 조직 내 침투해 있는 조절 T 세포의 활성을 억제함으로써 세포 독성 T 세포 성장 증가를 통하여 암세포의 성장을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
11. 제1항에 있어서, 조절 T 세포의 활성 억제를 통해 면역반응 억제를 저해하는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
12. 제1항에 있어서, 상기 암은 대장암, 악성 흑색종, 유방암, 난소암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 뇌종양, 간암, 전립선암, 방광암, 혈액암, ACTH 생성 종양, 경관암, 만성 골수성 백혈병, T-존 림프종, 자궁내막증, 식도암, 담즙 방광암, 에윙스 육종(Ewing's sarcoma), 두경부암, 목암, 설암, 홉킨스 림프종, 카포시스 육종, 신장암, 중피종, 다발성 골수종, 신경아세포종, 비홉킨 림프종, 골육종, 신경아세포종, 유선암, 경관암, 페니스암, 레티노블라스토마, 피부암, 위암, 갑상선암, 자궁암, 고환암, 윌름스 종양 및 트로포블라스토마로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
13. 제1항에 있어서, 상기 감염성 질환은 결핵, 패혈증 또는 바이러스성 간염인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
14. 뉴로필린 1(Neuropilin 1)에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 조절 T 세포(Treg)의 활성 억제용 조성물을 포함하는 면역조절제.
    
15. 제14항에 있어서, 항암제를 추가로 포함하거나, 항암제와의 병용투여 용도로 사용되는 것을 특징으로 하는 면역조절제.

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