KR20200095633A - 한약재 추출물을 포함하는 면역활성 증진용 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents
한약재 추출물을 포함하는 면역활성 증진용 조성물 및 그 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 한약재 혼합물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역활성 증진용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 맥문동, 창출, 감초, 건강, 진피 및 용안육을 포함하는 것을 특징으로 하고, 이들 한약재들을 적절한 중량비로 혼합함으로써 면역과 관련된 사이토카인의 분비 및 면역세포의 유전자 발현에 영향을 주어 면역활성을 증진시키고자 하는데 그 목적이 있다.
Description
본 발명은 한약재 혼합물의 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 맥문동, 창출, 감초, 건강, 진피, 용안육을 포함하는 한약재 혼합물을 사용한 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.
면역 시스템은 내부 및 외부의 병원성 물질로부터 인체를 보호하기 위하여 다양한 세포로 구성된 방어 체계를 구축하고 있다. 인체 면역계는 크게 면역을 억제, 조절하는 메커니즘인 면역 관용(tolerance)과 면역 반응(immunity)으로 구성되며, 면역계는 이러한 두 가지 면역작용이 적절한 균형을 이룸으로써 면역학적 항상성을 유지하고 있다.
하지만 이러한 면역학적 균형은 다양한 원인에 의해 면역 관용의 기능이 면역 반응에 비해 상대적으로 강하거나 이와 반대로 면역 반응 기능이 면역 관용 기능에 비해 강해질 경우 면역학적 불균형이 초래될 수 있다. 예를 들어 면역 반응에 비해 면역 관용 기작이 강해질 경우 인체면역계는 암의 발생이나 외부 바이러스 병원성 균 등의 침입이 용이하게 되어 암 또는 바이러스 및 세균성 질환을 발생시키게 된다. 이와 반대로 면역 반응성이 면역 관용 기능보다 강해질 경우는 자가 면역질환, 강력한 이식 거부 반응 및 알레르기성 질환과 같은 염증성 질환을 초래하게 된다. 특히 산업화 및 서구화에 따른 생활환경의 변화와 함께 과민성 또는 염증성 면역질환의 발병률이 크게 증가하고 있는데, 이는 사회적, 경제적, 문화적 활동의 위축으로 연결되어 심각한 사회 문제를 발생시킬 수 있다.
염증성/과민성 면역 질환은 다른 여러 면역성 질병의 주요 원인과 같이, 상술한 면역 관용과 면역 반응의 균형이 파괴되어 나타나는 진행성 면역 반응으로서 자가 면역질환 및 아토피 피부염, 천식과 같은 서구형 염증성 질환에 대한 사회적 관심과 인식의 증가와 함께 현재까지 활발한 연구가 진행되고 있다. 그러나 대부분의 질병에서 아직까지 정확한 발병 원인, 치료 방법 및 치료제의 개발에 어려움을 겪고 있다.
본 발명자는 면역의 항상성 유지에 관련된 연구를 하던 중, 염증 저해와 면역력 강화를 위하여 기존의 합성 화합물보다 부작용이 적은 식물과 같은 천연 성분 및 유기농 성분에 관심을 가지게 되었고, 특정 한약재들의 성분의 조합에서 면역활성 증진 효과가 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 면역력 증진 효과를 가지는 한약재 혼합물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역활성 증진용 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 면역력 증진 효과를 가지는 건강기능식품 조성물, 화장료 조성물 및 약학적 조성물을 각각 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 맥문동, 창출, 감초, 건강, 진피 및 용안육을 포함하는 한약재 혼합물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역활성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 한약재는 맥문동 100 중량부를 기준으로 창출 80 내지 150 중량부, 감초 40 내지 80 중량부, 건강 20 내지 40 중량부, 진피 20 내지 40 중량부, 용안육 20 내지 40 중량부로 혼합되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 한약재는 맥문동 : 창출의 건조중량비가 1 : 0.8 내지 1.2이고, 건강 : 진피 : 용안육의 건조중량비는 1 : 0.8 내지 1.2 : 0.8 내지 1.2로 혼합되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 맥문동, 창출, 감초, 건강, 진피 및 용안육을 포함하는 한약재를 혼합하는 단계; 상기 혼합된 한약재에 물, 주정 또는 이의 혼합물을 가하여 추출하는 단계; 상기 추출물을 여과하는 단계; 및 상기 여과액을 감압 농축하는 단계;를 포함하는 면역활성 증진용 조성물 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 추출하는 단계는 한약재 혼합물 100 중량부에 대하여 물, 주정 또는 이의 혼합물 1500 내지 2000 중량부를 넣어 70 내지 110℃의 온도 조건에서 1 내지 12시간 추출하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 감압 농축단계를 거친 한약재 추출물은 동결건조하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 면역활성 증진용 조성물은 건강기능식품 조성물일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 면역활성 증진용 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.
또한 상기 화장료 조성물은 피부 주름 개선 또는 항염증의 용도일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 면역활성 증진용 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 1일 1회 투여되고, 단일 투여량 단위가 100 내지 500 mg/kg 용량인 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 알레르기성 염증질환 예방 또는 치료용일 수 있다.
본 발명에 따른 면역활성 증진용 조성물은 폴리페놀, 플라보노이드와 같은 항산화물질이 다량 함유되어 항산화능이 우수하며, 건강기능식품 조성물, 화장료 조성물 및 약학적 조성물로 제공됨으로써 면역활성 증진 효과를 나타낼 수 있다. 본 발명에 따른 면역활성 증진용 조성물이 화장품에 응용됨으로써 피부주름의 개선 또는 항염 효과를 나타낼 수 있으며, 약학적 조성물로 응용시 1일 1회 투여를 통해 사용자의 편의성이 개선될 수 있으며 동시에 면역활성 역시 증진될 수 있다.
도 1은 본 발명의 시험예 1에 따른 면역활성 증진용 조성물의 농도별 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 시험예 1에 따른 면역활성 증진용 조성물의 농도별 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3 (A)는 본 발명의 시험예 2에 따른 면역활성 증진용 조성물을 농도별 투여한 경우 RAW264.7세포의 생존율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3 (B)는 본 발명의 시험예 2에 따른 면역활성 증진용 조성물을 농도별 투여한 경우 HUVEC 세포의 생존율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 시험예 3에 따른 면역활성 증진용 조성물의 농도별 NO 생성량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 시험예 3에 따른 면역활성 증진용 조성물의 농도별 사이토카인 생성량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 위의 그래프는 IL-1β의 생성량, 아래의 그래프는 IL-6의 생성량을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 시험예 3에 따른 면역활성 증진용 조성물의 농도별 TNF-α의 생성량 및 PGE2의 생성량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 시험예 4에 따른 면역활성 증진용 조성물을 농도별 투여한 경우 비장세포 증식능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 시험예 4에 따른 면역활성 증진용 조성물을 농도별 투여한 경우 IgA, IgG, IgM의 생성량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9(a)는 본 발명의 시험예 5에 따른 면역활성 증진용 조성물을 농도별 투여한 경우 HUVEC 세포에서의 MCP-1(단핵구화학유인물질; monocyte chemoattractant protein-1)의 유전자 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9(b)는 본 발명의 시험예 5에 따른 면역활성 증진용 조성물을 농도별 투여한 경우 HUVEC 세포에서의 KLF2(크룹펠 형상인자; kruppel like factor 2)의 유전자 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10(a)는 본 발명의 시험예 5에 따른 면역활성 증진용 조성물을 농도별 투여한 경우 HUVEC 세포에서의 eNOS(내피산화질소합성효소; endothelial nitric oxide synthase)의 유전자 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10(b)는 본 발명의 시험예 5에 따른 면역활성 증진용 조성물을 농도별 투여한 경우 HUVEC 세포에서의 ICAM-1(세포간 부착분자; Intercellular adhesion molecule-1)의 유전자 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 시험예 1에 따른 면역활성 증진용 조성물의 농도별 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3 (A)는 본 발명의 시험예 2에 따른 면역활성 증진용 조성물을 농도별 투여한 경우 RAW264.7세포의 생존율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3 (B)는 본 발명의 시험예 2에 따른 면역활성 증진용 조성물을 농도별 투여한 경우 HUVEC 세포의 생존율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 시험예 3에 따른 면역활성 증진용 조성물의 농도별 NO 생성량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 시험예 3에 따른 면역활성 증진용 조성물의 농도별 사이토카인 생성량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 위의 그래프는 IL-1β의 생성량, 아래의 그래프는 IL-6의 생성량을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 시험예 3에 따른 면역활성 증진용 조성물의 농도별 TNF-α의 생성량 및 PGE2의 생성량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 시험예 4에 따른 면역활성 증진용 조성물을 농도별 투여한 경우 비장세포 증식능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 시험예 4에 따른 면역활성 증진용 조성물을 농도별 투여한 경우 IgA, IgG, IgM의 생성량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9(a)는 본 발명의 시험예 5에 따른 면역활성 증진용 조성물을 농도별 투여한 경우 HUVEC 세포에서의 MCP-1(단핵구화학유인물질; monocyte chemoattractant protein-1)의 유전자 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9(b)는 본 발명의 시험예 5에 따른 면역활성 증진용 조성물을 농도별 투여한 경우 HUVEC 세포에서의 KLF2(크룹펠 형상인자; kruppel like factor 2)의 유전자 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10(a)는 본 발명의 시험예 5에 따른 면역활성 증진용 조성물을 농도별 투여한 경우 HUVEC 세포에서의 eNOS(내피산화질소합성효소; endothelial nitric oxide synthase)의 유전자 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10(b)는 본 발명의 시험예 5에 따른 면역활성 증진용 조성물을 농도별 투여한 경우 HUVEC 세포에서의 ICAM-1(세포간 부착분자; Intercellular adhesion molecule-1)의 유전자 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하에서 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 따로 정의하지 않는 경우 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 내용으로 해석되어야 할 것이다. 본 명세서의 도면 및 실시예는 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 쉽게 이해하고 실시하기 위한 것으로 도면 및 실시예에서 발명의 요지를 흐릴 수 있는 내용은 생략될 수 있으며, 본 발명이 도면 및 실시예로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 면역활성 증진용 조성물은 맥문동, 창출, 감초, 건강, 진피 및 용안육을 포함하는 한약재 혼합물의 추출물을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 한약재 혼합물에 사용되는 맥문동(Liriope spicata Lour)은 한방에서 보허약으로서 거담(去痰), 진해 (鎭咳), 자양(滋養), 강장(强壯), 이뇨(利尿), 지갈(止渴) 등에 이용되는 약재이다.
본 발명의 한약재 혼합물에 사용되는 창출(Atractylodes japonica Koidz)은 당삽주 (Atractylis chinensis)의 뿌리를 이르는 말로써, 발한, 이뇨, 진통 및 건위 등에 효능이 있어 위장염 및 감기 등에 효과가 있으며, 특히 중추신경 흥분을 억제와 진정작용의 역할을 하고 비만에 탁월한 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 한약재 혼합물에 사용되는 감초(Glycyrrhiza uralensis Fisch)는 콩과의 다년생 초본으로, 감초는 한방에서 모든 약재와 조화를 이루면서 효능을 증가시킬 뿐만 아니라 완화, 진통약으로 사용될 수 있고 그 자체가 독의 중화작용을 하기도 한다.
또한 본 발명의 한약재 혼합물에 사용되는 건강(Zingiber officinale Rosc)은 생강의 뿌리줄기를 말린 것으로서 위액 분비를 촉진하여 소화를 돕고 구토를 가라앉히는 약성이 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 한약재 혼합물에 사용되는 진피(Fraxinus rhynchophylla Hance)는 감귤의 껍질로 다양한 생리활성을 가진다.
본 발명의 한약재 혼합물에 사용되는 용안육(Dimocarpus longan Lour)은 무환자나무의 용안의 가종피를 말하는 것으로 육혈을 보하고 정신안정효과가 있어 숙면을 유도하는 것으로 알려져 있다.
본 발명은 상기 여섯 가지의 한약재를 포함할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아닌 바 오미자, 구기자, 대추 등을 더 포함할 수 있다.
특히, 상기 한약재 혼합물은 맥문동 100 중량부를 기준으로 할 때, 창출 80 내지 150 중량부, 감초 40 내지 80 중량부, 건강 20 내지 40 중량부, 진피 20 내지 40 중량부, 용안육 20 내지 40 중량부로 혼합되는 것일 수 있다. 바람직하게는 맥문동 100 중량부를 기준으로 하여 창출 90 내지 120 중량부, 감초 50 내지 70 중량부, 건강 25 내지 35 중량부, 진피 25 내지 35 중량부, 용안육 25 내지 35 중량부로 혼합되는 것일 수 있다.
상기 한약재들은 각각 진정작용, 정신안정작용, 세포 독성의 중화작용 등의 약성을 가지고 있으나, 본 발명에 따라 상술한 범위로 한약재가 혼합되어야 면역활성의 증가에 있어서 유의적인 효과가 발휘될 수 있다.
상기 한약재는 맥문동 : 창출의 건조중량비가 1 : 0.8 내지 1.2이고, 건강 : 진피 : 용안육의 건조중량비는 1 : 0.8 내지 1.2 : 0.8 내지 1.2로 혼합되는 것일 수 있다. 또한 바람직하게는 맥문동, 창출, 건강, 진피, 용안육의 건조중량비가 하기의 식을 만족하는 것일 수 있다.
[식 1]
한약재는 서로 다른 약성을 가지고 있어, 그 배합비가 특정 효능의 발휘에 중요한 요소가 될 수 있다. 본 발명에 따라 상기 건조중량비를 가질 경우 추출물의 유효성분은 월등히 높은 면역활성의 증진을 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 면역활성 증진용 조성물은 맥문동, 창출, 감초, 건강, 진피 및 용안육을 포함하는 한약재를 혼합하는 단계; 상기 혼합된 한약재에 물, 주정 또는 이의 혼합물을 가하여 추출하는 단계; 상기 추출물을 여과하는 단계; 및 상기 여과액을 감압 농축하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
구체적으로 상기 추출하는 단계는 상기 혼합된 한약재에 한약재 혼합물 100 중량부에 대하여 물, 주정 또는 이의 혼합물을 1500 내지 2000 중량부를 넣어 70 내지 110℃의 온도 조건에서 1 내지 12시간 추출하는 것일 수 있다.
상기 추출 용매는 바람직하게는 물일 수 있다. 추출 방법은 여과법, 열수추출, 침지추출, 환류냉각추출 및 초음파추출 등 당업계의 통상적인 방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 환류추출일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 환류추출 방식을 이용하는 경우 추출 전 70% 에탄올로 전처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 전처리 단계를 거치는 경우 세포막이 파괴되어 세포내용물이 더 잘 추출될 수 있으나, 70% 보다 더 높은 함량의 에탄올의 경우 세포막을 위축시킴으로써 오히려 추출함량이 더 낮아질 수 있다. 또한 환류추출 방식을 이용시 추출용매로 물을 사용하는 경우 훨씬 높은 함량의 유효성분을 수득할 수 있는 이점이 있다.
상기 범위의 온도에서 추출시, 한약재에 함유된 유효성분의 용출율이 높고, 고온에서 유효성분이 파괴될 가능성이 적다. 바람직하게는 상기 추출온도는 90 내지 100℃일 수 있으나, 이에 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한 추출 시간은 바람직하게는 3시간 내지 9시간일 수 있는데, 한약재에 함유된 유효성분이 충분히 추출되기 위해 필요한 시간이나, 이에 특별히 한정되는 것은 아니다.
상기 한약재 혼합물의 추출단계 이후, 여과 단계를 거칠 수 있다. 상기 한약재 혼합물의 추출액을 여과하여 불순물 및 침전물을 제거할 수 있다. 여과방법은 감압 여과, 마이크로여과지나 여과막을 통한 정밀 여과일 수 있다. 이러한 여과 단계를 거치는 경우 침전물이 발생하지 않고 안정하여 저장성이 향상될 수 있다.
상기 여과액은 감압 농축단계를 거치는데, 감압 농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것일 수 있고, 바람직하게는 진공회전증발기를 이용하여 60 내지 65℃에서 농축시킬 수 있다. 다만 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 감압 농축단계를 거치기 전에 필요에 따라 팔미라팜(palmyra palm) 수액과 혼합하는 단계를 추가로 더 포함할 수 있다. 팔미라팜이 추가되는 경우 가공이 용이한 이점이 있다. 이 때, 혼합비는 중량기준 1:1 내지는 1:3으로 하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 범위로 혼합될 때 팔미라팜 수액은 당도가 적절하여, 한약재의 쓴맛, 떫은맛을 감쇄하기 위한 천연 감미료 작용을 할 수 있다. 팔미라팜은 천연 비타민 B1이 풍부하게 함유되어 있어 탄수화물의 에너지 대사에 효과적이며 또한 칼슘, 칼륨, 인, 마그네슘과 같은 미네랄이 풍부하다.
상기 감압 농축단계를 거친 한약재 추출물은 동결건조하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 동결건조를 통해 상기 한약재 추출물을 완전히 건조시켜 분말 상태를 얻을 수 있다. 다만, 분말 상태를 얻기 위해 동결건조에 제한되는 것은 아니며, 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 면역활성 증진용 조성물은 건강기능식품 조성물일 수 있다.
상기 건강기능식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군을 의미할 수 있으며, 또한 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.
상기 건강기능석품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되고 식품학적으로 허용되는 식품 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
식품첨가물의 비한정적인 일 예로 단당류, 이당류, 다당류, 당알콜 등의 당류; 타우마틴, 스테비아 추출물, 사카린, 아스파르탐 등의 향미제; 영양제, 비타민, 식용 전해질, 풍미제, 착색제, 증진제, 펙트산, 알긴산, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산화제, 정제수 등이 예시될 수 있다.
본 발명에 따른 건강식품 조성물은 다양한 형태로 제형이 가능하므로 그 형태는 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게 건강식품조성물은 음료, 과립, 정제, 파우더, 환, 캡슐 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 형성될 수 있다. 이러한 음료, 과립, 정제, 파우더, 환, 캡슐 제형을 갖는 건강식품 조성물은 휴대가 간편하고 언제 어디서나 수시로 섭취하기가 용이하다.
본 발명에 따른 면역활성 증진용 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 피부 주름 개선 또는 항염증 용도일 수 있다. 본 발명에 따른 면역활성 증진용 조성물은 항산화 및 항염증에 있어 탁월한 효과를 발휘한다는 것이 후술할 시험예를 통하여 확인할 수 있다.
항산화 효과를 입증할 유효지표 성분으로 폴리페놀(Polyphenol)과 플라보노이드(Flavonoid)를 들 수 있다. 폴리페놀은 식물체에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물로 한 분자 내에 2개 이상의 페놀성 하이드록실기(phenolic hydroxyl group)를 가지고 있어 단백질 및 거대분자들과 쉽게 결합하여 항염증과 항산화 등의 다양한 생리활성 기능을 가질 수 있다. 페놀성 화합물의 경우 자유라디칼을 환원시키거나 상쇄시키는 능력이 강하고 항산화 작용에 농도 의존적이기 때문에 인체 내에서 천연 항산화제와 노화를 억제하는 척도로도 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 면역활성 증진용 조성물은 상기 항산화 및 항염증 효과가 우수한 폴리페놀 및 플라보노이드 성분을 다량 함유하고 있어 이를 화장료 조성물로 사용하는 경우 활성산소로 인해 발생하는 노화를 억제하는 데 탁월한 효과를 가질 수 있다. 구체적으로 항산화 활성이 증가되면 피부 세포 내 활성산소(reactive oxygen species, ROS)종을 제거시킴으로써 피부 세포의 노화 방지 및 주름 개선에 현저한 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 면역활성 증진용 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.
본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 인체에 사용시 안전성 및 효율성을 함께 고려하게 된다. 동물 실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우 비강 투여, 점안 투여, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게 경구 투여일 수 있다.
경구 투여의 경우 본 발명의 상기 약학적 조성물은 1일 1회 투여되고, 단일 투여량 단위가 100 내지 500 mg/kg 용량으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 200 내지 400 mg/kg일 수 있다. 그러나 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 연령 등에 따라 증감될 수 있으므로 상기 투여량에 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약제학적 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있으며, 통상의 제조방법으로 제형화할 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 약학적 조성물은 피부 외용제, 에어로졸, 스프레이, 점안제, 경구제 등의 형태의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 알레르기성 염증질환 예방 또는 치료용일 수 있다. 본 발명에 따른 면역활성 증진용 약학적 조성물은 NO(Nitric Oxide)와 PGE2(prostaglandin E2) 같은 염증매개체의 활성을 감소시킴으로써 염증질환을 억제할 수 있다.
이하, 하기의 실시 예를 통하여 본 발명에 대해 설명하고자 한다. 다만, 하기의 실시 예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 하기의 실시예로 한정하는 것은 아니다.
면역활성 증진용 조성물 제조
맥문동 30 g, 창출 30 g, 감초 20 g, 건강 10 g, 진피 10 g, 용안육 10 g을 혼합하여 증류수 1000 ㎖ 를 넣어 3시간 동안 환류추출을 하였다. 이 후 추출물을 여과하였고, 여과된 한약재 추출물과 팔미라팜 수액을 3:7 비율로 섞은 후, rotary vacuum evaporator로 감압 농축하였으며, 농축된 용액을 freeze dryer(EYELAFDU-540, Japan)로 동결 건조하여 얻어낸 한약재 조성물 분말 35.1 g(수율 31.9%)을 -80℃의 초저온 냉동고에서 보관하며, 실험에 필요한 농도로 증류수에 희석하여 사용하였다.
면역활성 증진용 조성물 제조
맥문동 30 g, 창출 30 g, 감초 20 g, 건강 10 g, 진피 20 g, 용안육 20 g을 혼합한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 면역활성 증진용 조성물을 제조하였다.
면역활성 증진용 조성물 제조
맥문동 30 g, 창출 60 g, 감초 20 g, 건강 10 g, 진피 10 g, 용안육 10 g을 혼합한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 면역활성 증진용 조성물을 제조하였다.
<
시험예
1>
실시예
1에 따른 면역활성 증진용 조성물의 항산화 효능평가
(1) 총 폴리페놀(
Polyphenol
) 함량 측정
면역활성 증진용 조성물 1 ㎖에 50% Foiln-Ciocalteu's phenol reagent 0.5 ㎖를 가하여 실온에서 3분간 반응시켰다. 반응용액에 Na2CO3 포화용액 1 ㎖와 7.5 ㎖ 증류수를 차례로 혼합하여 30분간 정치시킨 뒤, 14,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 취해 760 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. 총 페놀의 함량은 gallic acid를 표준물질로 이용하여 작성한 검량선에 따라 함량을 구하였으며 측정단위로는 GAE(Gallic acid equivalent)/g 을 사용하였다.
| Sample | 총 폴리페놀 함량(mg GAE /g) |
| 면역활성 증진용 조성물 | 33.8±2.9 |
(2) 총 플라보노이드(
flavonoid
) 함량 측정
면역활성 증진용 조성물 0.1 ㎖과 80% 에탄올 0.9 ㎖을 혼합한 혼합물 0.5 ㎖에 10% 질산알루미늄(aluminium nitrate)와 1M 아세트산칼륨(potassium acetate) 0.1 ㎖, 80% 에탄올 4.3 ㎖을 가하여 실온에 40분 방치한 뒤, 415 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 퀘르세틴(quercetin)을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다.
| Sample | 총 플라보노이드 함량(mg QE /g) |
| 면역활성 증진용 조성물 | 5.1±1.1 |
(3) DPPH 라디칼 소거능 측정
면역활성 증진용 조성물의 최종 농도가 1, 10, 100, 1,000 ㎍/㎖의 농도로 될 수 있게 희석하여, 에탄올에 용해시킨 0.2 mM의 DPPH 용액 150 ㎕와 면역활성 증진용 조성물을 각각 100 ㎕씩 혼합하였고, 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 517 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. 시료액의 대조군은 증류수를 넣었으며, DPPH 용액의 대조군으로는 에탄올을 넣어 보정값을 얻었다. DPPH 자유라디칼 소거율은 아래의 식에 따라 계산하였다.
[식 2]
소거율(%) = 
× 100
면역활성 증진용 조성물의 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과, 도 1을 보면, 1, 10, 100, 1,000 ㎍/㎖ 농도에서 각각 1.0±0.3%, 13.7±0.1%, 31.2±0.7%, 94.3±1.0%로 나타나, DPPH 라디칼 소거능의 농도 의존적인 증가가 나타났음을 확인할 수 있다.
(4)
ABTS
라디칼소거능
측정
면역활성 증진용 조성물의 최종 농도가 1, 10, 100, 1,000 ㎍/㎖의 농도로 될 수 있게 희석하여, ABTS 용액은 7.4 mM ABTS (2,2-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))와 2.6 mM 과황산칼륨(potassium persulfate)을 혼합하여 제조한 후, 암소에서 하룻동안 방치하여 양이온 (ABTS+)을 형성시킨 다음 732 ㎚에서 흡광도를 측정하여 흡광도 값이 1.5 이하가 나오도록 희석하고, 희석된 ABTS+ 용액 150 ㎕와 면역활성 증진용 조성물을 각각 5 ㎕ 혼합하고, 실온에서 10분간 반응시킨 후, 732 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. 항산화능은 증류수를 대조군으로 하여 대조군에 대한 ABTS 라디칼 소거능을 백분율로 나타내었다.
[식 3]
면역활성 증진용 조성물의 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과, 도 2를 보면, 1, 10, 100, 1,000 ㎍/㎖ 농도에서 각각 2.2±0.2%, 14.2±0.3%, 51.9±0.6%, 95.1±0.1%로 나타나, ABTS 라디칼 소거능의 농도 의존적인 증가가 나타났음을 확인할 수 있다.
<
시험예
2>
실시예
1에 따른 면역활성 증진용 조성물의 세포독성 검사
(1) 세포 배양
RAW264.7 세포는 10% 소태혈청(fetal bovine serum; FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)이 첨가된 DMEM 배지를 사용하였으며, HUVEC 세포는 EGM™-2 SingleQuots™ Kit가 첨가된 EGM™-2 Medium 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건이 유지되는 세포배양기에서 배양하였으며, 2-3일 주기로 계대 배양하여 실험을 진행하였다.
(2) 세포 생존율 측정
면역활성 증진용 조성물의 안전성 평가를 위하여 세포독성을 측정하는 시험을 진행하였다. 96 well plate에 RAW264.7 세포, HUVEC 세포를 1.5Х105 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다 실험을 하기 전에 새로운 배양액으로 교체하였고, 면역활성 증진용 조성물을 각각 1, 10, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 10 ㎕의 EZ-Cytox 용액을 첨가하여 세포배양기에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 450 ㎚에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.
도 3(A)는 RAW264.7 세포에서 세포생존율을 측정한 결과, 대조군이 100.0±3.0%로 나타났을 때, 면역활성 증진용 조성물 1, 10, 100 ㎍/㎖에서 각각 105.5±3.4%, 108.3±2.1%, 101.1±6.5%로 나타났음을, 도 3(B)는 HUVEC 세포에서 세포생존율을 측정한 결과, 대조군이 100.0±5.7%로 나타났을 때, 면역활성 증진용 조성물 1, 10, 100 ㎍/㎖에서 각각 102.9±3.6%, 100.7±2.7%, 101.6±1.8%로 나타났음을 보여준다.
<
시험예
3>
실시예
1에 따른 면역활성 증진용 조성물의 항염증 효능평가
(1) 염증 유발 물질인 NO (nitric oxide) 생성량 측정
96 well plate에 RAW264.7 세포를 1.5Х105 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였고 면역활성 증진용 조성물 1, 10, 100 ㎍/㎖의 농도와 1 ㎍/㎖ LPS(lipopolysaccharide: Sigma, U.S.A.)를 함께 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 이 후, N2 buffer를 50 ㎕씩 각 well에 처리하여 10분간 상온에서 반응 한 후, N2 buffer를 50 ㎕씩 각 well에 처리하고 10분간 반응시켰다. 반응 후 540 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정한 뒤 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.
도 4는 NO 생성량을 측정한 결과를 나타낸 것으로, 정상군(Normal)은 21.9±2.8%, 대조군(Control)은 100.0±2.1%로 나타났을 때, 면역활성 증진용 조성물 1, 10, 100 ㎍/㎖에서 각각 90.5±0.7%, 76.5±2.1%, 59.5±2.2%로 나타나, 모든 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 (* : p<0.05, ** : p<0.01, *** : p<0.001) 감소가 나타났음을 확인할 수 있다. NO는 대표적인 염증반응 매개물질이므로 NO의 유의적인 감소를 통해 본 발명의 면역활성 증진용 조성물은 염증억제 효과가 있음을 알 수 있다.
(2) 사이토카인 생성량 측정
12 well plate에 RAW264.7 세포를 2Х105 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였고 면역활성 증진용 조성물 1, 10, 100 ㎍/㎖의 농도와 1 ㎍/㎖ LPS를 함께 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 이후, 배양액을 1,200 rpm에서 5분간 원심분리하여 얻은 상등액과 standard를 96 well plate에 25 ㎕씩 분주하고 assay buffer 및 matrix buffer, antibody-immobilized beads를 각 25 ㎕씩 가하여 혼합한 후 2시간 동안 실온에서 반응시키고 washing 완충 용액을 이용하여 2회 세척하였다. 세척 후 25 ㎕의 검출항체(detection antibody)를 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시키고 추가로 25 ㎕의 Streptavidin-Phycoerythrin을 가하여 30분 동안 실온에서 반응시킨 뒤 washing 완충 용액을 이용하여 2회 세척하였다. 세척 후 PBS를 150 ㎕ 넣고 5분 간 교반한 후 Luminex를 이용하여 측정하여 절대값으로 표시하였다.
도 5는 IL-1β와 IL-6의 생성량을 나타낸 그래프로서, IL-1β 생성량을 측정한 결과, 정상군은 43.1±0.8 pg/㎖, 대조군은 224.9±12.6 pg/㎖로 나타났을 때, 면역활성 증진용 조성물 1, 10, 100 ㎍/㎖에서 각각 220.8±7.5 pg/㎖, 176.2±9.9 pg/㎖, 146.4±11.5 pg/㎖로 나타나, 10, 100 ㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 (* : p<0.05, *** : p<0.001) 감소가 나타난 것을 확인할 수 있다.
또한 IL-6 생성량을 측정한 결과, 정상군은 246.9±53.7 pg/㎖, 대조군은 5183.6±204.3 pg/㎖로 나타났을 때, 면역활성 증진용 조성물 1, 10, 100 ㎍/㎖에서 각각 4623.9±176.7 pg/㎖, 4176.9±182.3 pg/㎖, 3173.8±195.7 pg/㎖로 나타나, 모든 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 (* : p<0.05, ** : p<0.01, *** : p<0.001) 감소가 나타났음을 확인할 수 있다.
도 6을 통해 TNF-α 생성량을 측정한 결과, 정상군은 518.0±40.4 pg/㎖, 대조군은 3478.3±80.4 pg/㎖로 나타났을 때, 면역활성 증진용 조성물 1, 10, 100 ㎍/㎖에서 각각 3253.1±183.8 pg/㎖, 2834.9±73.3 pg/㎖, 1905.3±80.3 pg/㎖로 나타나, 10, 100 ㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 (* : p<0.05, *** : p<0.001) 감소가 나타났음을 확인할 수 있다.
(3) 염증 유발 물질인
PGE
2
생성량
측정
12 well plate에 RAW264.7 세포를 2Х105 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양 하였다. 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였고 면역활성 증진용 조성물 1, 10, 100 ㎍/㎖의 농도와 1 ㎍/㎖ LPS를 함께 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 이후, 배양액을 1,200 rpm에서 5분간 원심분리하여 얻은 상등액과 standard를 96 well plate에 100 ㎕씩 넣고 37℃에서 90분간 반응시켰다. 반응 후 washing buffer를 이용하여 3회 세척 작업을 진행한 후 100 ㎕의 검출항체 (detection antibody)를 넣어 다시 37℃에서 60분간 반응시키고 세척하였다. 세척 후 HRP conjugate를 100 ㎕씩 넣어 37℃에서 30분간 반응시키고 세척한 뒤 substrate reagent를 90 ㎕씩 넣어 37℃에서 15분간 반응시키고 50 ㎕의 stop solution을 추가하여 ELISA reader기를 통해 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 표준곡선을 기준으로 절대값으로 표시하였다.
도 6을 통해 PGE2 생성량을 측정한 결과, 정상군은 17.5±11.5 pg/㎖, 대조군은 134.9±15.7 pg/㎖로 나타났을 때, 면역활성 증진용 조성물 1, 10, 100 ㎍/㎖에서 각각 134.6±12.9 pg/㎖, 112.7±7.5 pg/㎖, 94.6±4.9 pg/㎖로 나타나, 10, 100 ㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 (** : p<0.01, ** : p<0.01) 감소가 나타났음을 확인할 수 있다.
<
시험예
4>
실시예
1에 따른 면역활성 증진용 조성물의 면역증진 효능평가
(1) 동물 및 사료
본 실험을 위하여 사용된 ICR mouse (5주령, 수컷, 23∼28 ｇ)는 ㈜샘타코 (Korea)에서 구입하여 사용하였다. 실험동물은 2주간의 안정기를 가지면서 순화를 시켰으며, 안정기 및 실험기간에 모든 실험군에는 일반 사료 (Altromin, Germany)를 자유식이 하며 물을 충분히 공급하였다. 2주간의 안정기 이후 7주령부터 동물 실험을 진행하였다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 22±2℃, 1일 중 12시간은 200-300 Lux로 조명하고, 12시간은 모든 빛을 차단하였다. 본 실험은 대전대 동물실험윤리 위원회의 승인 (승인번호 DJUARB2017-007)을 받아 동물윤리준칙에 의거하여 실험하였다.
(2) 면역억제 유도 및 시료 투여
7주령이 된 ICR mouse 복강에 면역억제제 (Cyclophosphamide)를 1일차와 3일차에 150 ㎎/㎏ 농도로 100 ㎕ 주사하여 면역 억제를 유도하였다. 면역 억제제 투여량은 마우스 체중 30 g으로 계산하여 산출하였다. 아무것도 처치하지 않는 정상군(Normal)과 면역 억제제 처리 후 증류수를 투여하는 대조군(Control), 면역억제제 주입시작 1주일 후, 면역활성 증진용 조성물을 200, 400 ㎎/㎏/day로 투여하는 실험군 등 총 8개의 그룹으로 나누어 매일 1회, 오후 2시에 200 ㎕씩 oral zonde를 이용하여 7일간 경구 투여하였다. 면역 억제제 투여량 및 시료 투여량은 성인 체중 1 kg당 200, 400 ㎎을 기준으로 하고 마우스 체중 30 g으로 계산하여 산출하였다.
(3) 혈청 및
비장세포
분리
투여 종료 후, terrell (isoflurane)를 이용하여 실험동물을 마취하고 혈액과 비장을 적출하였다. 혈액은 30분간 상온에서 굳힌 뒤 3000 rpm에서 15분간 원심분리 후 혈청을 분리하였으며, 비장은 cell strainer에서 마쇄하고 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 첨가된 DMEM 배지로 세척한 후, red blood cell lysing buffer를 이용하여 적혈구를 제거하여 분리하였다.
(4)
비장세포
증식능
측정
분리한 비장세포를 96 well plate에 1Х105 cells/well로 되도록 분주하고 면역활성 증진용 조성물을 1, 10, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 37°C, 5% CO2 조건에서 48시간 배양하고, 배양 후 10 ㎕의 EZ-Cytox 용액을 첨가하여 세포배양기에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 450 ㎚에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.
도 7을 통해 비장세포 증식능을 측정한 결과, 대조군은 100.0±6.4%로 나타났을 때, 면역활성 증진용 조성물 1, 10, 100 ㎍/㎖에서 각각 109.6±5.9%, 116.7±5.5%, 135.4±7.9%로 나타나, 100 ㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 (* : p<0.05) 증가가 나타났음을 확인할 수 있다.
(5) 면역글로불린(
Immunoglobulin
) 생성량 측정
각 well에 분리하여 25000배 희석한 혈청, standard, control을 50 ㎕씩 분주하고 anti-mouse multi-immunoglobulin beads를 각 25 ㎕씩 가하여 혼합하여 15분 동안 실온에서 빛을 차단한 채 반응시키고, washing 완충 용액을 이용하여 2회 세척하였다. 이 후 25 ㎕의 anti-mouse κLight Chain, PE를 가하여 15분 동안 실온에서 빛을 차단한 채 반응시키고 PBS를 150 ㎕ 넣고 5분 간 교반한 후 Luminex를 이용하여 측정하였다.
도 8을 통해, IgA 생성량을 측정한 결과, 정상군은 2156.7±132.9 pg/㎖, 대조군은 1391.3±167.0 pg/㎖로 나타났을 때, 면역활성 증진용 조성물 투여군 200, 400에서 각각 1520.9±117.9 pg/㎖, 1760.0±135.0 pg/㎖로 나타나, 400 투여군에서 대조군에 비해 유의성 있는 (* : p<0.05) 증가가 나타났음을 확인할 수 있다.
또한, IgG 생성량을 측정한 결과, 정상군은 3298.2±228.5 pg/㎖, 대조군은 2449.6±228.9 pg/㎖로 나타났을 때, 면역활성 증진용 조성물 투여군 200, 400에서 각각 3329.7±171.2 pg/㎖, 3685.6±253.8 pg/㎖로 나타나, 모든 투여군에서 대조군에 비해 유의성 있는 (* : p<0.05, ** : p<0.01) 증가가 나타났음을 확인할 수 있다.
IgM의 경우 정상군은 589.4±22.9 pg/㎖, 대조군은 462.8±28.8 pg/㎖로 나타났을 때, 면역활성 증진용 조성물 투여군 200, 400에서 각각 592.5±30.7 pg/㎖, 627.6±11.9 pg/㎖로 나타나, 모든 투여군에서 대조군에 비해 유의성 있는 (* : p<0.05, ** : p<0.01) 증가가 나타났다.
<
시험예
5>
실시예
1에 따른 면역활성 증진용 조성물이 유전자 발현량에 미치는 영향 측정
(1) RNA 추출
6 well plate에 HUVEC 세포를 106 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였고 CPP 1, 10, 100 ㎍/㎖의 농도와 1 ㎍/㎖ TNF-α를 함께 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. HUVEC 세포를 PBS로 2회 씻어준 뒤 easy blue 1㎖와 chloroform 200㎕를 넣고 vortexing 해준 후 13,000 rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리 해준다. 상층액 400 ㎕와 binding buffer 400 ㎕를 실온에서 1분 동안 반응시킨 뒤 반응액 700 ㎕를 column에 주입하여 13,000 rpm에서 30초 동안 원심분리한다. Column에 washing buffer A를 700 ㎕ 넣고 13,000 rpm에서 30초 동안 원심분리 후 washing buffer B를 700 ㎕ 넣고 동일하게 원심분리 한다. Column 하단을 Ep tube로 교체한 후 column에 elution buffer를 50 ㎕ 넣고 1분 동안 반응시킨 뒤 13,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 추출된 total RNA를 모아준다.
(2) cDNA 합성
역전사 (reverse transcription) 반응은 RT premix kit의 mixture (reaction buffer, dNTPs mixture, RNase inhibitor, stabilizer, oligo dT15 primer)를 사용하여 total RNA 1 ㎍이 되도록 diethyl pyrocarbonate (DEPC) 처리된 증류수에 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 하여 첨가하였다. 이 20 ㎕의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 45℃에서 60분 반응시켜 first-strand cDNA를 합성한 후 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT를 불활성화 시킨 다음 합성이 완료된 cDNA를 polymerase chain reaction (PCR)에 사용하였다.
(3) 유전자 발현량 측정
합성이 완료된 cDNA를 증폭시키기 위하여 real-time PCR을 진행하였으며, real-time 전용 tube에 cDNA 1 ㎕, 각 primer 2 ㎕, SYBR Green 10 ㎕, DEPC-DW 5 ㎕씩 넣어 다음과 같이 진행하였다. 94℃에서 5분 동안 반응한 다음 94℃에서 15초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초를 40회 반복하여 진행하였고, 이 후 유전자 발현량은 대조군에 비하여 계산하였으며, 사용된 프라이머의 서열은 표 3과 같다(F : forward, R : reverse)
1)
MCP
-1
도 9(a)를 통해, MCP-1 유전자 발현량을 측정한 결과, 정상군은 0.10±0.01%, 대조군은 1.00±0.15%로 나타났을 때, CPP 1, 10, 100 ㎍/㎖에서 각각 1.00±0.09%, 0.81±0.05%, 0.66±0.04%로 나타나, 10, 100 ㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 (* : p<0.05, ** : p<0.01) 감소가 나타났음을 확인할 수 있다.
2) KLF2
도 9(b)를 통해, KLF2 유전자 발현량을 측정한 결과, 정상군은 2.12±0.22%, 대조군은 1.00±0.11%로 나타났을 때, CPP 1, 10, 100 ㎍/㎖에서 각각 0.94±0.05%, 1.24±0.04%, 1.54±0.01%로 나타나, 10, 100 ㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 (* : p<0.05, ** : p<0.01) 증가가 나타났음을 확인할 수 있다.
3)
eNOS
도 10(a)를 통해, eNOS 유전자 발현량을 측정한 결과, 정상군은 3.65±0.23%, 대조군은 1.00±0.11%로 나타났을 때, CPP 1, 10, 100 ㎍/㎖에서 각각 0.90±0.06%, 1.46±0.07%, 2.17±0.01%로 나타나, 10, 100 ㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 (* : p<0.05, ** : p<0.01) 증가가 나타났음을 확인할 수 있다.4 ) ICAM-1
도 10(b)를 통해, ICAM-1 유전자 발현량을 측정한 결과, 정상군은 0.24±0.12%, 대조군은 1.00±0.12%로 나타났을 때, CPP 1, 10, 100 ㎍/㎖에서 각각 1.03±0.07%, 0.76±0.01%, 0.57±0.02%로 나타나, 10, 100 ㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 (** : p<0.01, *** : p<0.001) 감소가 나타났음을 확인할 수 있다.
상술한 실험 결과들은 SPSS 24.0의 unpaired student's T-test와 ANOVA를 사용하여 통계처리 하였고, p<0.05, p<0.01 및 p<0.001 수준에서 그 유의성을 검정하였다.
실시예 1에 따른 면역활성 증진용 조성물의 경우 상기 시험예를 통해 항산화 효능 및 면역활성 증진 효과를 확인하였고, 염증발생 억제 효과가 현저하게 우수함을 확인할 수 있었다. 실시예 2 및 실시예 3에 따른 면역활성 증진용 조성물의 경우에도 항산화 효능평가에서 폴리페놀 함량, 플라보노이드 함량이 높게 나타났고, DPPH 및 ABTS 라디칼소거능 측정에 있어서도 농도 의존적 증가를 나타냈다. 면역활성 평가 측면에서도 마찬가지로 사이토카인의 분비 감소, 면역글로불린의 분비 증가를 통해 면역활성 증진 효과를 확인할 수 있었다.
표 4는 한약재 혼합물의 건조중량 기준의 배합비에 따른 [식 1]의 값과 항산화 효능 평가 및 면역활성 평가의 결과를 나타낸 것으로, 상기 배합비가 [식 1]의 요건을 만족하는 실시예 1의 경우 2의 값을 가지면서, 항산화 효능 평가 및 면역활성 평가에서 보다 우수한 효과를 나타내었다.
Claims (12)
- 맥문동, 창출, 감초, 건강, 진피 및 용안육을 포함하는 한약재 혼합물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역활성 증진용 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 한약재는 맥문동 100 중량부를 기준으로 창출 80 내지 150 중량부, 감초 40 내지 80 중량부, 건강 20 내지 40 중량부, 진피 20 내지 40 중량부, 용안육 20 내지 40 중량부로 혼합되는 것인 면역활성 증진용 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 한약재는 맥문동 : 창출의 건조중량비가 1 : 0.8 내지 1.2이고, 건강 : 진피 : 용안육의 건조중량비는 1 : 0.8 내지 1.2 : 0.8 내지 1.2로 혼합되는 것인 면역활성 증진용 조성물. - 맥문동, 창출, 감초, 건강, 진피 및 용안육을 포함하는 한약재를 혼합하는 단계;
상기 혼합된 한약재에 물, 주정 또는 이의 혼합물을 가하여 추출하는 단계;
상기 추출물을 여과하는 단계; 및
상기 여과액을 감압 농축하는 단계;를 포함하는 면역활성 증진용 조성물 제조방법. - 제 4항에 있어서,
상기 추출하는 단계는 한약재 혼합물 100 중량부에 대하여 물, 주정 또는 이의 혼합물 1500 내지 2000 중량부를 넣어 70 내지 110℃의 온도 조건에서 1 내지 12시간 추출하는 것인 면역활성 증진용 조성물 제조방법. - 제 4항에 있어서,
상기 감압 농축단계를 거친 한약재 추출물은 동결건조하는 단계를 더 포함하는 것인 면역활성 증진용 조성물 제조방법. - 제 1항에 있어서,
상기 조성물은 건강기능식품 조성물인 것을 특징으로 하는 면역활성 증진용 건강기능식품 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 면역활성 증진용 화장료 조성물. - 제 8항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 피부 주름 개선 또는 항염증 효과를 가지는 면역활성 증진용 화장료 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 조성물은 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 면역활성 증진용 약학적조성물. - 제 10항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 1일 1회 투여되고, 단일 투여량 단위가 100 내지 500 mg/kg 용량인 면역활성 증진용 약학적 조성물. - 제 10항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 알레르기성 염증질환 예방 또는 치료용인 면역활성 증진용 약학적 조성물.
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2019
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