KR20200092616A - 생강 추출물을 유효성분으로 하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

생강 추출물을 유효성분으로 하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생강 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

Description

생강 추출물을 유효성분으로 하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION COMPRISING Zingiber officinale Roscoe EXTRACT AS AN EFFECTIVE INGREDIENT FOR PREVENTING OR TREATING NEURODEGENERATIVE DISEASE}
본 발명은 생강 추출물을 유효성분으로 하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
신경면역시스템의 제어 불균형은 다양한 신경변성 질환의 병인으로 알려져 있다. 미세아교세포는 중추 신경계에서 존재하며 면역조절 역할을 하며, 신경독소나 외부 감염 등에 의해 활성이 일어나며, 활성된 미세아교세포는 다양한 종류의 신경염증 인자 및 신경독소들을 생산한다. 마이크로글리오시스(microgliosis)는, 과활성화된 미세아교세포가 병리학적으로 독소방출 및 자극 등으로 신경세포의 손상을 돕거나 증가시키고, 이는 주변의 다른 뉴런들까지 손상을 입히는 것을 의미한. 신경독소인 lipopolysaccharide(LPS)는 일반적인 염증 유발로 인한 신경세포의 손상에서 흔히 쓰이는 연구 모델이다. BV-2 미세아교세포(Microgla)는 LPS의 내독성에 의해 각종 염증관련 인자들, 아질산염, iNOS, COX-2, TNF-α, IL1β, IL-6등과 같은 인자들을 합성한다. 이러한 물질들은 다발성경화증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병과 같은 퇴행성 신경변성질환의 병리기전에 관여한다는 것이 보고되어 있다. 그러므로, 이러한 신경염증의 조절이 퇴행성신경변성질환의 예방에 중요한 역할을 할 것이라고 사료된다.
한편, 생강(Zingiber officinale Roscoe)은 외떡잎식물 생강목 생강에 속하며 주로 동남아에서 재배된다. 생강은 향긋한 냄새와 매운 맛을 내는 특징을 가지고 있어 향신료나 식용으로 다양하게 이용되고 있다. 또한, 생강의 매운맛을 내는 주성분인 6-gingerol은 항염증, 항산화 효과의 특성을 가지고 있어 많은 연구가 현재까지 진행되고 있다.
본 발명은 생강 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 등을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 생강 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 생강 추출물은 생강을 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물로 추출한 것일 수 있다.
상기 생강 추출물은 지질다당류(lipopolysaccharide: LPS)에 의하여 활성화된 미세아교세포에서 유발된 염증을 억제하는 것일 수 있다.
상기 염증의 억제는 일산화질소(NO)의 생성 억제; iNOS 및 COX-2 유전자 또는 단백질의 발현 저해; 염증성 사이토카인 유전자의 발현 저해; 또는 MAPKs 및 IκB-α단백질의 인산화 저해를 통해 확인될 수 있다.
상기 생강 추출물의 농도는 1㎍/㎖ 내지 200㎍/㎖ 일 수 있다.
상기 퇴행성 신경질환은 뇌졸중, 중풍, 기억력 상실, 기억력 손상, 치매, 건망증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 피크(Pick)병, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Kacob)병, 헌팅턴병 및 루게릭병으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 생강 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명은 생강 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것으로, 상기 생강 추출물은 지질다당류(lipopolysaccharide: LPS)에 의하여 활성화된 미세아교세포에서 유발된 염증을 억제함으로써, 퇴행성 신경질환의 예방, 치료 또는 개선 효과가 우수하여 의약품 또는 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 생강 에탄올 추출물의 처리시, LPS로 자극된 BV-2 미세아교세포에서 세포 생존율 및 일산화질소(NO) 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 생강 에탄올 추출물의 처리시, LPS로 자극된 BV-2 미세아교세포에서 iNOS 및 COX-2 유전자 및 단백질의 발현 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 생강 에탄올 추출물의 처리시, LPS로 자극된 BV-2 미세아교세포에서 염증성 사이토카인 유전자의 발현 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 생강 에탄올 추출물의 처리시, LPS로 자극된 BV-2 미세아교세포에서 MAPKs 및 IκB-α단백질의 인산화 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
본 발명자들은 생강 에탄올 추출물을 지질다당류(lipopolysaccharide: LPS)에 의하여 활성화된 BV-2 미세아교세포에 처리하는 경우, 높은 세포 생존율을 가지면서, 농도 의존적으로 신경염증을 억제할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물
본 발명은 생강 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 생강 추출물을 유효성분으로 포함한다.
상기 생강(Zingiber officinale Roscoe)은 외떡잎식물 생강목 생강에 속하며 주로 동남아에서 재배된다. 생강은 향긋한 냄새와 매운 맛으로 향신료와 식용, 약용에 널리 사용되고 있다. 또한, 생강의 6-gingerol의 성분이 항산화, 항염증 효과가 있다고 알려져 있다. 한편, 상기 생강의 신경염증 관련 효능에 대해서는 보고된바 없다.
상기 생강 추출물은 생강을 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물(특히, 에탄올)로 추출한 것일 수 있으며, 상기 생강 추출물의 추출 대상은 줄기, 잎, 가지, 꽃, 열매 및 뿌리로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
구체적으로, 상기 추출은 건조된 생강을 세절한 후 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 생강 부피의 2배 내지 20배를 첨가하여 추출하는 것이 바람직하고, 3배 내지 15배를 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 추출온도는 30℃ 내지 100℃인 것이 바람직하며, 30℃ 내지 70℃인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 추출시간은 1시간 내지 48시간인 것이 바람직하며, 12 시간 내지 36시간인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 추출방법은 냉침, 초음파 추출 또는 환류 냉각 추출방법이 모두 이용가능하나, 이에 한정되지 않는다. 추출 회수는 1회 내지 5회인 것이 바람직하며, 2회 내지 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 추가적으로, 상기 생강 추출물을 희석시키거나, 농축시키거나, 희석 또는 농축시킨 후 정제하여 사용할 수 있다.
상기 생강 추출물은 지질다당류(lipopolysaccharide: LPS)에 의하여 활성화된 미세아교세포에서 유발된 염증을 억제하는 것으로, 구체적으로, 상기 염증의 억제는 일산화질소(NO)의 생성 억제; iNOS 및 COX-2 유전자 또는 단백질의 발현 저해; 염증성 사이토카인 유전자의 발현 저해; 또는 MAPKs 및 IκB-α단백질의 인산화 저해를 통해 확인될 수 있다.
또한, 상기 생강 추출물의 농도는 1㎍/㎖ 내지 200㎍/㎖ 인 것이 바람직하고, 1㎍/㎖ 내지 10㎍/㎖ 인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 상기 생강 추출물의 농도가 너무 낮은 경우에는, 지질다당류(lipopolysaccharide: LPS)에 의하여 활성화된 미세아교세포에서 유발된 염증을 효과적으로 억제하지 못하므로, 퇴행성 신경질환 예방, 치료 또는 개선 효과가 미미한 문제점이 있고, 상기 생강 추출물의 농도가 너무 높은 경우에는, 세포독성을 포함한 독성의 우려사항이 있을 수 있다.
상기 퇴행성 신경질환은 지질다당류(lipopolysaccharide: LPS)에 의하여 활성화된 미세아교세포에서 유발된 염증 매개인 것으로, 뇌졸중, 중풍, 기억력 상실, 기억력 손상, 치매, 건망증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 피크(Pick)병, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Kacob)병, 헌팅턴병 및 루게릭병으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화되어 사용할 수 있고, 제형화를 위하여 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기 담체 또는, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리게이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제는 상기 생강 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용하는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.
퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 건강기능식품
또한, 본 발명은 생강 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 건강기능식품은 상기 생강 추출물을 유효성분으로 포함하는 것으로, 상기 생강 추출물에 대해서는 전술한바 있으므로, 중복 설명을 생략하기로 한다.
상기 퇴행성 신경질환은 지질다당류(lipopolysaccharide: LPS)에 의하여 활성화된 미세아교세포에서 유발된 염증 매개인 것으로, 뇌졸중, 중풍, 기억력 상실, 기억력 손상, 치매, 건망증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 피크(Pick)병, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Kacob)병, 헌팅턴병 및 루게릭병으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 건강기능식품에 있어서, 상기 생강 추출물을 건강기능식품의 첨가물로 사용하는 경우 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 예방, 건강 또는 치료 등의 각 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.
상기 건강기능식품의 제형은 산제, 과립제, 환, 정제, 캡슐제의 형태뿐만 아니라 일반 식품 또는 음료의 형태 어느 것이나 가능하다.
상기 식품의 종류에는 특별히 제한은 없고, 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다.
일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 상기 생강 추출물은 원료 100 중량부에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 또한 본 발명은 천연물을 이용하는 점에서 안전성 면에서 문제가 없으므로 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품 중 음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 음료 100 mL당 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g일 수 있다.
상기 외에 본 발명에 따른 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제를 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 건강기능식품은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나 본 발명의 건강기능식품 100 중량부 대비 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
따라서, 본 발명은 생강 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것으로, 상기 생강 추출물은 지질다당류(lipopolysaccharide: LPS)에 의하여 활성화된 미세아교세포에서 유발된 염증을 억제함으로써, 퇴행성 신경질환의 예방, 치료 또는 개선 효과가 우수하여 의약품 또는 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
재료 준비
먼저, 생강 에탄올 추출물(Zingiber officinale Roscoe ethanol extract)의 제조를 위해, 생강을 경동시장에서 구매하였고, 건조 생강 중량을 기준으로, 약 10배 부피의 100% 에탄올로 24시간 동안 추출 및 여과하였다. 이후, 여과된 추출물을 30~70℃에서 진공 및 농축하여 동결 및 건조한 다음, DMSO에 녹였다(최종 수율: 약 12%). 또한, LPS(Lipopolysaccharide), Tween-20, 5% skim milk 및 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide)는 Sigma Chemical Co(USA)에서 구입하였고, 6-well, 24-well tissue culture plate 100mm culture plate는 NUNC Inc, IL(USA)에서 구입하였다. 또한, 불활성화시킨 5% FBS와 100 units/㎖ 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco, BRL)을 첨가한 DMEM 배지는 Gibco(BRL)에서 구입하였고, β-actin 및 COX-2 항체는 Santa Cruz(CA)에서, iNOS 항체는 Cell signaling, Co(USA)에서 구입하였다.
세포 배양
BV-2 미세아교세포(microglial cells)는 경북대학교 약리학 교실에서 제공 받았으며, 불활성화시킨 5% FBS와 100 units/㎖ 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco, BRL)을 첨가한 DMEM 배지 및 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 모든 실험에서 세포의 수는 2.5 X 105cell/㎖을 사용하였다. 생강 에탄올 추출물의 처리는 배지에 희석하여 농도별(1, 5 및 10㎍/㎖)로 1시간 동안 전처리하였고, LPS는 200ng/㎖를 사용하였다.
생강 에탄올 추출물의 세포 독성 검사를 MTT 어세이로 확인할 수 있으며, MTT 어세이는 NO 어세이를 한 후 마이크로플레이트에 있는 세포에 5㎎/㎖ MTT를 20㎕ 넣고 인큐베이터에서 1시간 반응시켜 DMSO 400㎕로 포르마잔 결정을 녹여 주어 96well 플레이트에 상층액 200㎕씩 옮긴 다음 540nm 파장에서 마이크로플레이트 리더기로 흡광도를 측정하였다.
NO 어세이
NO(nitric oxide)의 생산량을 정량적으로 측정하는 방법으로 마이크로플레이트(24well) 어세이 방법이다. 마이크로플레이트에 세포를 시딩한 후, LPS 및 생강 에탄올 추출물을 농도차를 두어 첨가하고 5% CO2 인큐베이터에서 반응시켰다. 24시간 후 상층액을 96well 플레이트에 각각 100㎕씩 Griess 시약[1% sulfanilamide, 0.1% N-(1-naphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride, 2.5% H3PO4]와 반응시킨 다음 550nm 파장에서 마이크로플레이트 리더기로 흡광도를 측정하였다.
총 RNA의 동정 및 RT- PCR
BV-2 미세아교세포주의 모든 RNA 동정은 RNAiso Plus(TaKaRa, Japan)를 이용하여 제조회사가 제시한 사용법에 따라 분리하였다. BV-2 미세아교세포주에 RNAiso Plus 1㎖과 클로로포름 200㎕를 넣고 잘 섞어준 다음 실온에서 5분 동안 반응시킨 후 원심분리(4℃, 16,000rpm, 15분)하였다. 새 튜브에 상층액 500㎕와 동량의 이소프로판올을 넣어주고 실온에서 10분간 반응시킨 다음 원심분리(4℃, 16000rpm, 15분)하였다. 상층액을 제거하고 75% EtOH을 이용하여 2회의 세척을 하고 pellet을 잘 건조시켜 DEPC-treated water로 잘 녹여주었다. RT(reverse transcription) PCR은 시료를 1㎍/㎕의 농도가 되도록 하고 ReverTra Ace(TOYOBO, JAPAN)의 cDNA 합성법에 따라 cDNA를 합성하였다. 각 PCR 반응은 cDNA 2㎕ (0.5㎍/㎕)를 사용하여 수행하였고 반응 조성은 AccuPower® RocketPlex RT-PCR PreMix (BIONEER)를 사용하였으며, template 2㎕, PreMix 2㎕, primer-F 1㎕, primer-R 1㎕, 증류수 16㎕를 반응조건 94℃ 5분, 94℃ 30초 - 54℃ 1분 - 72℃ 1분 25회 반복, 72℃ 5분, 4℃ 보관으로 하여 총 22㎕를 반응시켰다. 사용한 프라이머들은 하기 표 1에 명시하였다.
타겟 유전자 서열 (5’→3’) 크기 (bp)
iNOS 정방향 프라이머
역방향 프라이머		 5′-GAGGTACTCAGCGTGCTCCA-3′
5′-AGGGAGGAAAGGGAGAGAGG-3′		 444
COX-2 정방향 프라이머
역방향 프라이머		 5′-TGAGTGGTAGCCAGCAAAGC-3′
5′-CTGCAGTCCAGGTTCAATGG-3′		 319
IL-1β 정방향 프라이머
역방향 프라이머		 5′-CAAGGAGAACCAAGCAACGA-3′
5′-TTGGCCGAGGACTAAGGAGT-3′		 428
IL-6 정방향 프라이머역방향 프라이머 5′-GGAGGCTTAATTACACATGTT-3′5′-TGATTTCAAGATGAATTGGAT-3′ 435
TNF-α 정방향 프라이머
역방향 프라이머		 5′-AGGGAGAGTGGTCAGGTTGC-3′
5′-CAGCCTGGTCACCAAATCAG-3′		 392
GAPDH 정방향 프라이머역방향 프라이머 5′-CCAGTAGACTCCACTCACG-3′
5′-CCTTCCACAATGCCAAAGTT-3′		 160
웨스턴 블랏 분석
BV-2 미세아교세포에서 단백질의 동정은 2X sample buffer [Glycerol, 10% SDS, b-Mercaptoethanol, Bromophenol blue, 0.5M Tris-Hcl]를 이용하여 동정하였다. 동일량의 단백질을 10% SDS-PAGE에 전기영동한 후, 0.2㎛ 니트로셀룰로오스(NC: GE Healthcare Life Sciences) 멤브레인으로 옮겼다. 항체의 사용은 1차 항체로 anti-β-actin, anti-COX-2 (1:2000; Santa Cruz), anti-iNOS (1:2000; Cell Signaling)를 사용하였고 희석하여 4℃에서 O/N (overnight)하였다. 2차 항체로 Horseradish peroxidase (HRP)를 가지고 있는 항체를 실온에서 1시간 반응시킨 후, ECL kit (pierce, CA)와 West Femto(Thermo, USA), Developer(동진사, Republic of Korea) 와 Fixer(동진사, Republic of Korea)를 사용하여 결과를 확인하였다.
통계학적 분석
실험 결과의 재현성 확인을 위하여 평균값 ± 표준편차로 표기하였으며, 각 실험은 2회 실시하였다. 실험 결과의 통계분석은 Graphpad Prism V5.01. software 를 사용하여 Dunnett’s method를 이용한 일원분산분석(One-way ANOVA)을 하였다.
실험예 1: 생강 에탄올 추출물의 처리시, LPS로 자극된 BV -2 미세아교세포에서 일산화질소(NO) 생성 억제 효과 측정
생강 에탄올 추출물의 처리시, LPS로 자극된 BV-2 미세아교세포에서 일산화질소(NO) 생성 억제 측정하기 위해, NO 어세이를 수행하였고, 그 결과는 도 1에 나타내었다.
구체적으로, BV-2 미세아교세포를 24well plate에 2.5 X 105cell/well이 되도록 한 후, 생강 에탄올 추출물을 농도별로 1시간 동안 전처리하였다. 그 다음, LPS(100 ng/㎖)로 세포에 자극을 하였다. 24시간 후, 세포 상층액을 96well에 100㎕씩 덜어 Griess 어세이를 통하여 산화질소의 방출량을 측정하였다. 남은 상층액에 MTT시약을 넣은 후, 생존한 세포들을 측정 하여 나온 값을 백분율로 표시하였고, 실험결과의 값은 2번 실험하여 통계를 하였다.
도 1은 생강 에탄올 추출물의 처리시, LPS로 자극된 BV-2 미세아교세포에서 세포 생존율 및 일산화질소(NO) 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 1에 나타난 바와 같이, 생강 에탄올 추출물의 처리시(1, 5 및 10㎍/㎖), LPS로 자극된 BV-2 미세아교세포에서 세포 생존율은 모두 높으면서, 농도 의존적으로 일산화질소(NO) 생성 억제 효과를 가지는 것으로 확인된다.
실험예 2: 생강 에탄올 추출물의 처리시, LPS로 자극된 BV -2 미세아교세포에서 iNOS 및 COX-2 유전자 또는 단백질의 발현 저해 효과 측정
생강 에탄올 추출물의 처리시, LPS로 자극된 BV-2 미세아교세포에서 iNOS 및 COX-2 단백질의 발현 저해 효과 측정하였고, 그 결과는 도 2(A)에 나타내었다. 구체적으로, BV-2 미세아교세포를 6well plate에 3.5 X 105 cell/well로 배양하여 20시간 후, 세포에서 단백질을 동정하여 단일클론 항체인 iNOS 및 COX-2를 사용하여 western blot을 사용하여 분석하였다.
도 2(A)는 생강 에탄올 추출물의 처리시, LPS로 자극된 BV-2 미세아교세포에서 iNOS 및 COX-2 단백질의 발현 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2(A)에 나타난 바와 같이, LPS로 자극된 BV-2 미세아교세포에서 iNOS 및 COX-2 단백질의 발현양은 대조군에 비해 증가하였으나, 생강 에탄올 추출물로 처리시(1, 5 및 10㎍/㎖), iNOS 및 COX-2 단백질의 발현양은 농도 의존적으로 감소하는 것으로 확인된다. 이때, β-actin은 단백질의 발현양을 분석하기 위한 대조군으로 사용하였다.
또한, 생강 에탄올 추출물의 처리시, LPS로 자극된 BV-2 미세아교세포에서 iNOS 및 COX-2 유전자의 발현 저해 효과 측정하였고, 그 결과는 도 2(B)에 나타내었다. 구체적으로, BV-2 미세아교세포를 6well plate에 3.5 X 105 cell/well로 배양하여 6시간 후, 세포 상층액을 제거한 후, 세포에서 RNA를 동정하여, iNOS 및 COX-2 유전자를 RT-PCR을 사용하여 분석하였다.
도 2(B)는 생강 에탄올 추출물의 처리시, LPS로 자극된 BV-2 미세아교세포에서 iNOS 및 COX-2 유전자의 발현 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2(B)에 나타난 바와 같이, LPS로 자극된 BV-2 미세아교세포에서 iNOS 및 COX-2 유전자의 발현양은 대조군에 비해 증가하였으나, 생강 에탄올 추출물로 처리시(1, 5 및 10㎍/㎖), iNOS 및 COX-2 유전자의 발현양은 농도 의존적으로 감소하는 것으로 확인된다. 이때, gapdh는 유전자의 발현양을 분석하기 위한 대조군으로 사용하였다.
실험예 3: 생강 에탄올 추출물의 처리시, LPS로 자극된 BV -2 미세아교세포에서 염증성 사이토카인 유전자의 발현 저해 효과 측정
생강 에탄올 추출물의 처리시, LPS로 자극된 BV-2 미세아교세포에서 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β 및 IL-6) 유전자의 발현 저해 효과 측정하였고, 그 결과는 도 3에 나타내었다.
구체적으로, BV-2 미세아교세포를 6well plate에 3.5 X 105 cell/well이 되도록 한 후, 생강 에탄올 추출물을 농도별로 1시간 동안 전처리하였다. 그 다음, LPS(200 ng/㎖)로 세포에 자극을 하였다. 6시간 후, 세포에서 RNA를 동정하여, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 유전자를 RT-PCR을 사용하여 분석하였다.
도 3은 생강 에탄올 추출물의 처리시, LPS로 자극된 BV-2 미세아교세포에서 염증성 사이토카인 유전자의 발현 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3에 나타난 바와 같이, LPS로 자극된 BV-2 미세아교세포에서 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 유전자의 발현양은 대조군에 비해 증가하였으나, 생강 에탄올 추출물로 처리시(1, 5 및 10㎍/㎖), TNF-α, IL-1β 및 IL-6 유전자의 발현양은 농도 의존적으로 감소하는 것으로 확인된다. 이때, gapdh는 유전자의 발현양을 분석하기 위한 대조군으로 사용하였다.
실험예 4: 생강 에탄올 추출물의 처리시, LPS로 자극된 BV -2 미세아교세포에서 MAPKs 및 IκB-α단백질의 인산화 저해 효과 측정
생강 에탄올 추출물의 처리시, LPS로 자극된 BV-2 미세아교세포에서 MAPKs(ERK, JNK 및 p38) 및 IκB-α단백질의 인산화 저해 효과 측정하였고, 그 결과는 도 4에 나타내었다.
구체적으로, BV-2 미세아교세포를 6well plate에 3.5 X 105 cell/well이 되도록 한 후, 생강 에탄올 추출물을 농도별로 1시간 동안 전처리하였다. 그 다음, LPS(200 ng/㎖)로 세포에 자극을 하였다. 1시간 후, 세포에서 단백질을 동정하여 단일클론 항체인 p-ERK, p-JNK, p-p38 및 p-IκBα를 사용하여 western blot을 사용하여 분석하였다.
도 4는 생강 에탄올 추출물의 처리시, LPS로 자극된 BV-2 미세아교세포에서 MAPKs(ERK, JNK 및 p38) 및 IκB-α단백질의 인산화 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4에 나타난 바와 같이, LPS로 자극된 BV-2 미세아교세포에서 MAPKs(ERK, JNK 및 p38) 및 IκB-α단백질의 인산화 정도는 대조군에 비해 증가하였으나, 생강 에탄올 추출물로 처리시(1, 5 및 10㎍/㎖), MAPKs(ERK, JNK 및 p38) 및 IκB-α단백질의 인산화 정도는 농도 의존적으로 감소하는 것으로 확인된다.
하기에 본 발명의 생강 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1: 산제의 제조
생강 추출물 20 mg
유당수화물 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
제제예 2: 정제의 제조
생강 추출물 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당수화물 100mg
스테아르산마그네슘 2mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
제제예 3: 캅셀제의 제조
생강 추출물 10 mg
미결정셀룰로오스 3 mg
유당수화물 14.8 mg
스테아르산마그네슘 0.2 mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캅셀제의 제조방법에 따라서 젤라틴캡슐에 충전하여 캅셀제를 제조하였다.
제제예 4: 주사제의 제조
생강 추출물 10 mg
만니톨 180mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
인산일수소나트륨 26 mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1앰플당(2mL) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.
제제예 5: 액제의 제조
생강 추출물 10 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
레몬향 적량
상기의 성분을 통상의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 정제수를 가하여 전체 100mL로 조절한 후 멸균시켜 갈색병에 충진하여 액제를 제조한다.
제제예 6: 건강기능식품의 제조
생강 추출물 10 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7: 건강음료의 제조
생강 추출물 10 mg
비타민 C 15 g
비타민 E(분말) 100 g
젖산철 19.75 g
산화아연 3.5 g
니코틴산아미드 3.5 g
비타민 A 0.2 g
비타민 B1 0.25 g
비타민 B2 0.3g
정제수 정량
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (7)

  1. 생강 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 생강 추출물은 생강을 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물로 추출한 것인, 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 생강 추출물은 지질다당류(lipopolysaccharide: LPS)에 의하여 활성화된 미세아교세포에서 유발된 염증을 억제하는 것을 특징으로 하는 것인, 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 염증의 억제는
    일산화질소(NO)의 생성 억제;
    iNOS 및 COX-2 유전자 또는 단백질의 발현 저해;
    염증성 사이토카인 유전자의 발현 저해; 또는
    MAPKs 및 IκB-α단백질의 인산화 저해를 통해 확인되는 것인, 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 생강 추출물의 농도는 1㎍/㎖ 내지 200㎍/㎖ 인, 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 퇴행성 신경질환은 뇌졸중, 중풍, 기억력 상실, 기억력 손상, 치매, 건망증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 피크(Pick)병, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Kacob)병, 헌팅턴병 및 루게릭병으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 생강 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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