KR20200086305A

KR20200086305A - 진단 방법

Info

Publication number: KR20200086305A
Application number: KR1020207015928A
Authority: KR
Inventors: 스테파니 플룩키겔-만구알; 윌헤름 크렉
Original assignee: 톨레모 테라퓨틱스 아게
Priority date: 2017-11-20
Filing date: 2018-11-20
Publication date: 2020-07-16
Also published as: WO2019097078A1; CA3080633A1; AU2018368639A1; US20200325543A1; AU2018368639A8; JP7379355B2; EP3714069A1; JP2021503308A; CN111417730A

Abstract

본 발명은 암 진단의 분야이다. 구체적으로, 본 발명은 암 환자에서 암 요법에 사용된 화학 물질에 대한 저항성을 발생시킬 위험성을 결정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암을 치료하는데 사용되는 화학 물질에 대한 약물 저항성을 발생시킬 것으로 진단되었던 환자를 위한 새로운 조합 요법을 제공한다.

Description

진단 방법

암 세포의 유전적 변경은 종종 세포 주기, 조절, 증식, 분화 및/또는 신호 전달에 주요한 유전자에 영향을 준다 (Hanahan, D., Weinberg, R.A., Cell 100, 57-70 (2000); Hanahan, D., Weinberg, R.A., Cell 144, 646-674 (2011)). MAPK 경로의 종양원 유전자 활성화는 흑색종, 비-소세포 폐암 (NSCLC) 및 췌장암을 포함한 많은 인간 암의 서명 특징이다 (Dhillon, A.S. et al., Oncogene 26, 3279-3290 (2007)). 예를 들면, 50 내지 70%의 흑색종은 전신 발현 MAPK 신호전달을 활성화하는 BRAF-V600E 종양원 유전자에 의해 유발된다 (Davies, H. et al., Nature 417, 949-954 (2002)). BRAF 저해제는 단독으로 또는 MEK 저해제와 조합하여 환자 생존을 유의하게 증가시키지만 임상 반응이 보통 제한된 지속 기간을 갖는다 (Flaherty, K.T. et al., N. Engl. J. Med. 363, 809-819 (2010); Chapman, P.B. et al., N. Engl. J. Med. 364, 2507-2516 (2011); Hauschild, A. et al., Lancet 380, 358-65 (2012); Flaherty, K.T. et al., N. Engl. J. Med. 367, 1694-1703 (2012); Larkin, J. et al., N. Engl. J. Med. 371, 1867-1876 (2014); Long, G.V. et al., N. Engl. J. Med. 371, 1877-1888 (2014); Robert, C. et al., N. Engl. J. Med. 372, 30-39 (2015); Long, G.V. et al., Lancet 386, 444-451 (2015)).

표현형 및 신호전달 유연성, 뿐만 아니라 새로운 유전적 변경의 획득은 암 치료에서 표적화 저해제에 대한 저항성의 발생을 구동하는 요인으로 확인되어 왔다 (Engelman, J. A. et al., Science 316, 1039-1043 (2007); Kugel, C.H.. et al., Cancer Res. 74, 4122-4132 (2014); Goetz, E.M. et al., Cancer Res. 74, 7079-7089 (2014); Hartsough, E., Shao, Y., Aplin, A.E., J. Invest. Dermatol. 134, 319-325 (2014); Roesch, A. et al., Eur. J. Cancer 59, 109-112 (2016)). 약물 저항성 종양의 유전적 배경의 예측될 수 없는 종양간 및 종양내 불균일성은 표적화 요법에 대한 저항성을 예방하는 임상 시험의 설계를 복잡하게 만든다 (Romano, E., Clin. Cancer Res. 19, 5749-5757 (2013); Shi, H. et al, Cancer Discov. 4, 80-93 (2014); Van Allen, E.M et al., Cancer Discov. 4, 94-109 (2014); Roesch, A., Oncogene 34, 2951-2957 (2015); Shaffer S.M. et al., Nature 564, 431-435 (2017)).

부가적인 약물과 표적화 저해제의 조합을 사용하는 새로운 요법으로 환자의 생존을 증가시키는 최신의 접근법은 종종 선별되지 않은 환자 집단에게 사용되거나, 정상 세포와 비교하여 암 세포에서 또는 약물 저항성 암 세포 대 약물 민감성 암 세포에서 기본 유전자 발현 양상에 의해 안내를 받는다 (Evans, W.E., Relling, M.V., Nature 429, 464-468 (2014); Glinsky, G.V., Stem Cell Rev. 3, 79-93 (2007); Johannessen, C.M. et al., Nature 504, 38-42 (2013)). 약물 치료에 반응한 암 세포의 적응적 전사 변화 및 종양내 및 종양간 불균일성은 이들 접근법의 임상적 효능을 제한한다. 이전에 관찰된 단점을 극복하는 하나의 접근법은 국제특허출원 WO 2009/151503에 기술되어 있다. 본 문헌에서는 통상적인 요법으로의 치료에 저항하는 신생물을 식별하는 방법이 제공된다. 이 방법은 최근에 신생물의 진료를 경험한 환자로부터 유래한 시료에서 다양한 마커의 수준 증가를 식별 과정이 관여한다. 따라서, 환자는 이미 통상적인 치료를 받고 있다. 그러나, 암 치료가 암 세포의 변화를 유도하고, 이로써 약물 저항성을 야기할 수 있다 (Smith, M.P., Cancer Cell 29, 270-284 (2016)). 이것은 기술된 방법이 환자가 통상적인 요법에 노출되기 이전에 저항성을 발생시킬 위험성을 잠재적으로 갖는 것으로서 환자를 식별해낼 수 없음을 의미한다.

따라서, 암 환자에서 주어진 화학 물질에 대한 저항성을 발생시킬 위험성을 신뢰할만하게 결정하는 수단 및 방법을 제공하는 것이 필요하고, 이 방법은 장기간 치료 전략에 순응하는 환자를 식별하는 개인화된 암 요법에 사용될 수 있다.

본 발명은 현재 이러한 수단 및 방법을 제공하는 점에서 이러한 필요성을 충족시키고, 이는 보다 구체적으로 본 발명의 청구항 및 다음의 구현예에서 정의되어 있다.

일 구현예에서, 본 발명은 세포, 구체적으로 암 또는 종양 세포가 화학 물질에 대한 저항성을 발생시킬 것인지 여부를 결정하는 방법으로서, 다음의

a) 암으로 진단된 피험자로부터 획득된 암 또는 종양 세포를 포함하거나 이로 구성된 하나 이상의 시료(들)의 화학 물질에 대한 노출 단계로서, 암으로 진단된 피험자는 상기 화학 물질로 이전에 투여된 적이 없는, 단계;

b) a)에 사용된 하나 이상의 시료(들)에서 암 약물 저항성의 발생과 관련된 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계;

c) a)에 사용된 화학 물질에 노출되지 않은, 암으로 진단된 피험자로부터의 하나 이상의 시료(들)에서 b)에서와 동일한 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계:를 포함하고,

c)에서 결정된 발현 수준과 비교하여 b)에서 결정된 발현 수준의 상승은 상기 시료에 포함된 암 또는 종양 세포에 의한 화학 물질에 대한 저항성의 발생을 나타내는, 방법을 제공한다.

이에 따라, 본 발명자는 예기치 못하게 및 놀랍게도, 암으로 진단된 피험자로부터 획득된 시료에 포함된 세포, 구체적으로 암 또는 종양 세포가 시료에 포함된 세포 구체적으로 암 또는 종양 세포가 화학 물질, 구체적으로 암의 치료에 사용된 물질에 대한 저항성을 발생시킬 것인지 여부를 시험관내에서 결정하도록 분석될 수 있음을 발견하였다. 구체적으로, 암의 발생과 관련된 유전자의 발현이 시험관내 방법으로 화학 물질에 의해 유도될 수 있는 것으로 알려졌거나 제시되었던 적은 없었다. 해당 기술분야에 공지된 선행 방법은 환자가 이미 화학 물질에 대한 저항성을 발생시킨 이후에 환자로부터 채취한 시료에서 변경되는 유전자 서명을, 이들이 화학 물질에 대한 저항성을 발생시키기 이전에 또는 여전히 상기 물질에 대해 임상적으로 민감한 동안 환자로부터 채취한 시료의 유전자 서명과 비교하여 사용한다. 본 발명자가 관찰하였던 바와 같이, 약물 노출은 치료에 사용된 화학 물질에 대한 저항성의 잠재적 발생 여부에 관한 임의의 후속적 분석에 극적으로 영향을 미칠 수 있다. 본 발명의 방법은 하나 이상의 시료(들)을 획득하기 이전에 치료를 받지 않은 피험자로부터 유래한 시료를 사용함으로써 이러한 단점을 극복하고 있다.

상기에 따라, 본 발명은 또한 암으로 이전에 진단된 피험자가 상기 암을 치료하는데 사용된 화학 물질에 대한 저항성을 발생시킬 것인지 여부를 결정하는 방법으로서, 다음의

a) 암으로 진단된 피험자로부터 획득된 암 또는 종양 세포를 포함하거나 이로 구성된 하나 이상의 시료(들)의 화학 물질에 대한 노출 단계로서, 암으로 진단된 피험자가 화학 물질로 이전에 투여된 적이 없는, 단계;

c) a)에 사용된 화학 물질에 노출되지 않은 암으로 진단된 피험자로부터의 하나 이상의 시료(들)에서 b)에서와 동일한 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계:를 포함하고,

c)에서 결정된 발현 수준과 비교하여 b)에서 결정된 발현 수준의 상승은 환자에 의한 화학 물질에 대한 저항성의 발생을 나타내는, 방법을 제공한다.

세포, 구체적으로 암 또는 종양 세포가 화학 물질에 대한 저항성을 발생시킬 것인지 여부를 결정하는 상기 방법과 유사하게, 본 방법은 암으로 진단되었던 피험자가 상기 암을 치료하는데 사용된 화학 물질에 대한 약물 저항성을 발생시킬지 여부를 결정하는데 채용될 수 있다. 본 발명의 방법은 화학 물질을 투여하기 이전에 채용되고, 이로써 약물 저항성이 유도되는 것을 회피할 수 있는 놀랍고도 예기지 못한 장점을 갖는다. 이러한 유도를 회피하기 위하여, 시료(들)이 화학 물질에 대한 노출 이전에 사전 획득되었고 이로써 시료가 시험관내에서 분석될 수 있다. 따라서, 시험관내 분석이 약물 저항성을 발생시킬 위험성을 상승시키는 경우라면, 이러한 화학 물질로의 치료에 의한 저항성의 유도는 본 발명에 따른 시험관내 분석에서 약물 저항성을 발생시킬 위험성의 증가를 나타내지 않았던 화학 물질로의 대안의 치료를 적용함으로써 또는 본 발명에 따른 조합 치료 또는 요법을 시도함으로써 예방될 수 있다.

다양한 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 선행 구현예 중 임의의 하나에 따른 방법으로서, 시료가 종양 생검으로부터 및 혈액에서 순환하는 종양 세포로부터 획득되는 시료로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법에 관한 것이다.

다양한 추가의 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 선행 구현예 중 임의의 하나에 따른 방법으로서, 저항성의 발생과 관련된 유전자는 SOX2, Nanog, OCT4, FGF4, FBX15, FOXP4, KLF9, CD24, CD271, CD36, ITLN2, TNFSF12, NOX3, CLEC7A, ACYAP1, UNC5C, UNC5D, MUC16, VAV3, FOXD3, VGLL3, ALPP, C3, F2R, ENPP2, ETV4, NTNG1, NTRK2, ROBO1 및 ROBO2로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자인, 방법에 관한 것이다.

본 발명의 상세한 구현예에서, 저항성의 발생과 관련된 유전자는 SOX2이다.

SOX2로도 알려진 SRY (성별 결정 부위 Y)-박스 2는 미분화된 배아 줄기 세포의 자가-재생 또는 다능성을 유지하는데 필수적인 전사인자이다. 이 단백질은 Sox 패밀리 전사인자의 구성원이고, 이는 포유동물 발생에서의 다수 단계에서 핵심 역할을 담당하는 것으로 관찰되어 왔다. 예를 들면, SOX2가 폐 발생에서 기관지 나무의 분지화 형태발생 및 기도 상피의 분화를 조절한다. 정상적인 조건 하에서, SOX2는 성인 기관 상피에서 기저 세포의 자가-재생 및 적절한 비율을 유지하는데 중요하다. 그러나, 이의 과다발현이 성장 중 및 성장 완료된 마우스 폐 둘 다에서 광범위한 상피 과다형성증, 궁극적으로 암종을 유발한다. 게다가, 편평세포 암종에서, 유전자 증폭은 빈번하게 3q26.3 영역을 표적한다. SOX2의 유전자는 이 영역 내에 위치하고, 이는 효과적으로 SOX2를 종양원 유전자로서 특성화한다. SOX2는 폐 편평세포 암종에서 상향조절되는 핵심 인자이고, 종양 진행에 관여하는 많은 유전자를 유도한다. SOX2 과다발현은 LKB1 발현의 소실과 협력하여 마우스에서 편평세포 폐암을 촉진시킨다. 이의 과다발현이 또한 세포 이동 및 고정화에 의존하지 않은 성장을 활성화시킨다. SOX2 발현은 높은 글리슨 등급 전립샘암에서도 역시 관찰되고, 거세-저항성 전립샘암 성장을 촉진시킨다. SOX2는 유방암에서 타목시펜 저항성의 발생과도 역시 관련되는 것으로 확인되었다. SOX2와 같은 암의 발생과 관련된 유전자에 대한 지식에도 불구하고, 이러한 유전자의 선천적 발현 수준을 능가하는 발현이 화학 물질의 첨가에 의해 시험관내 유도될 수 있고, 유도된 과다발현이 적용된 화학 물질에 대한 저항성의 발생을 나타내는 점은 이전에 전혀 알려지지 않았다.

다양한 추가의 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 선행 구현예 중 임의의 하나에 따른 방법으로서, 암은 흑색종, 비-소세포 폐암, 전립샘암, 담관암, 방광암, 췌장암, 갑상샘암, 난소암, 결장직장 종양, 털세포 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 간암, 유방암, 식도암, 두경부암 및 교아종이고, 상기 암 중 임의의 하나로 고생하는 환자로부터 얻은 시료는 각각의 암 또는 종양 세포를 포함하거나 이로 구성되는, 방법에 관한 것이다.

상세한 구현예에서, 암은 흑색종 및/또는 비-소세포 폐암이다.

용어 "흑색종"은 본원에 사용된 바, 멜라닌 세포로부터 발생하는 암의 유형에 관한 것이다. 흑색종은 전형적으로 피부에서 일어나지만 드물게 입, 창자 또는 눈에서 일어날 수 있으며, 이 모두가 본 발명에 의해 포괄된다. 흑색종의 일차 원인은 낮은 수준의 피부 색소를 갖는 장소에 자외선 광 (UV) 노출이다. UV 광은 태양으로부터 또는 태닝 장치와 같은 다른 광원으로부터 나올 수 있다. 이것은 모반으로부터도 역시 발생할 수 있다. 침범된 가족 구성원의 병력인 많은 모반과 함께, 빈약한 면역 기능을 갖는 사람은 더 높은 위험성을 갖는다. 색소성 건피증을 유발하는 결함과 같은 다수의 유전적 결함이 흑색종을 발생시킬 위험성도 역시 증가시킨다. 진단은 임의의 의심된 피부 병변의 생검에 의할 수 있다. 흑색종의 예방은 일반적으로 광차단제의 사용 및 UV 광 차단을 포함한다. 가장 공통적인 치료는 수술에 의한 제거이다. 그러나, 구체적으로 약간 더 큰 암을 갖는 피험자는 확산을 테스트해볼 수 있다. 구체적으로 흑색종이 확산되었던 피험자는 면역요법, 생물제제 요법, 방사선 요법 및/또는 화학요법이 필요할 수 있다. 해당 기술분야에 입수가능한 다양한 치료 옵션에도 불구하고, 흑색종은 여전히 가장 위험한 유형의 피부암이다. 전세계적으로 2012년에, 232,000명의 사람이 새로이 발병하였다. 2015년에는 활성 질환을 갖는 3.1백만 명 중 59,800명이 사망하였다. 테모졸로미드, 다카르바진 (DTIC으로도 명명됨), 인터류킨-2 (IL-2) 또는 인터페론 (IFN))으로의 면역요법, 뿐만 아니라 국소 관류를 포함하는 다양한 화학요법이 사용가능하다. 그러나, 전이성 흑색종의 전반적인 성공은 매우 한정적이다. IL-2 (프로류킨)도 역시 흑색종 요법을 위한 소중한 표적인 것으로 확인되었다. IL-2가 이러한 질환에서 완벽하고 오래 지속되는 진정의 가능성을 제시하는 점을 연구로 밝혀졌다. 전이성 흑색종의 요법은 생물제제 면역요법을 포함하고, 예를 들면 이필리무맙, 펨브롤리주맙 및/또는 니볼루맙을 포함하는 생물제제 면역요법 제제; 베무라페닙 및 다브라페닙과 같은 BRAF 저해제; 및 트라메티닙 및/또는 코비메티닙과 같은 MEK 저해제를 포함하는 제제가 흑색종의 치료에 역시 사용가능하다. 그러나, 암 세포, 구체적으로 흑색종 세포는 치료에 사용되는, 입수가능한 화학 물질에 대해 저항성을 발생시킬 수 있다. 따라서, 저항성의 발생을 유발하지 않는 요법 옵션을 제공하거나, 피험자가 흑색종의 치료에 사용된 화학 물질에 대한 저항성을 발생시킬지 여부를 신뢰할만하게 예측하는 방법을 제공하는 것이 바람직하다. 상기에 상술된 바와 같이, 본 발명은 구체적으로 흑색종인 암으로 진단된 피험자가 구체적으로 흑색종인 암의 치료에 사용된, 상기에 인용된 화학 물질과 같은 화학물질에 대해 저항성을 발생시킬지 여부를 결정하도록 사용되는 신뢰할만한 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 일부 구현예에서 피험자의 흑색종을 상기 피험자에게 저항성의 발생을 이전에 유발하지 않았던 화학 물질을 사용함으로써 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 피험자가 이러한 치료를 이전에 받았던 적이 없고, 따라서 저항성을 이전에 발생시키지 않았기 때문에 유리하다.

본 발명의 다른 구현예에서, 피험자는 비-소세포 폐 암종 (NSCLC)로 진단되었던 적이 있다. NSCLC는 모든 폐암 중 약 85%를 차지하고, 따라서 주요한 위협이 되고 있다. 현재까지, NSCLC는 소세포 암종 및 기타 유형의 암과 비교하여 화학요법에 상대적으로 민감하지 않다. 가능한 경우, 화학요법의 사용이 수술-전 (네오아쥬반트 화학요법) 및 수술-후 (아쥬반트 화학요법) 둘 다로 증가하고 있더라도, 이들은 주로 치유의 목적을 갖는 외과적 절제에 의해 치료된다. 가장 공통적인 유형의 NSCLC은 편평세포 암종, 큰 세포 암종 및 샘암종이지만, 덜 빈번하게 발생하는 여러 다른 유형이 존재하고, 모든 유형이 특수한 조직 변이체에서 및 혼합된 세포-유형 조합으로서 발생할 수 있다. 일반적으로 하나 이상의 치료가 암의 단계, 개인의 건강 전반, 연령, 화학요법에 대한 반응 및 치료의 가능한 부작용과 같은 기타 요인에 따라 사용된다. 의사라면 사용가능한 치료를 잘 인식하고 있다. 그러나, 완전한 단계 결정 이후에, NSCLC 환자는 전형적으로 세 가지 상이한 카테고리 중 하나로 분류된다: 초기 비-전이성 질환을 갖는 환자 (제 Ⅰ기, 제 Ⅱ기 및 선별 제 Ⅲ기 종양), 국소적으로 진행된 흉강에 한정된 질환을 갖는 환자 (예로, 큰 종양, 위험한 가슴 구조가 관여된 종양 또는 양성 종격동 림프절을 갖는 환자) 또는 흉강으로부터 거리가 먼 전이를 갖는 환자. NSCLC가 보통 화학요법 및/또는 방사선 조사에 매우 민감하지는 않다. 그러나, 당업자에 의해 선택될 수 있는 많은 가능한 화학요법 제제이 존재한다. 대부분은 백금-기반의 화학요법 약물 시스플라틴이 관여할 것이다. 그러나, 진행성 (전이성) NSCLC에 사용되는 매우 다양한 화학요법 옵션이 존재한다. 이들 제제는 신속하게 분열하는 세포라면 모두 구별하지 않고 표적하는 시스플라틴과 같은 전통적인 화학요법, 뿐만 아니라 환자의 종양 내에서 발견되는 특이한 유전적 변형에 더 맞추는 최신의 표적화 제제 둘 다를 포함한다. 현재 NSCLC 종양에서 추가의 치료 결정을 안내하도록 일상적으로 프로파일화된 두 가지 유전적 마커가 존재한다: EGFR 및 역형성 림프종 키나제 내의 돌연변이. 또한 BRAF (유전자), HER2/neu 및 KRAS를 포함하여, NSCLC 내에서 돌연변이된 것으로 공지되고, 미래에 치료에 영향을 줄 수 있는 많은 추가적인 유전적 마커가 존재한다.

중요하게, 대략 NSCLC 환자 중 대략 10 내지 35%는 EGFR의 약물 민감화 돌연변이를 갖을 것이다. 많은 상이한 EGFR 돌연변이가 발견되었지만, 특정 변형은 단백질의 과다활성을 갖는 형태를 유도할 것이다. 이들 돌연변이를 갖는 환자는 샘암종 조직학을 갖거나, 비-흡연자 또는 가벼운 흡연자일 수 있다. 이들 환자는 타이로신 키나제 저해제, 구체적으로 에를로티닙, 제피티닙 또는 아파티닙으로 알려진 EGFR 단백질을 차단하는 특정 투약에 대해 민감화되는 것으로 확인되어 왔다. SOX2가 EGFR 저해제에 노출될 때 배양된 NSCLC 세포주에서 전사적으로 유도되는 것으로 관찰되었다. 폐암에서 신뢰할만한 돌연변이 식별은 진단 기법의 가변적인 민감도로 인해 조심스러운 고려가 필요하다. 대안적으로, NSCLC 환자 중 최대 7%가 ROS1 유전자에서 EML4-ALK 전위 또는 돌연변이를 갖는다. 이들 환자는 당업자라면 숙지하고 있는 ALK 저해제로부터 유익을 얻을 수 있다. 크리조티닙은 다수의 키나제, 구체적으로 ALK, ROS1 및 MET의 기지의 저해제이다.

EGFR 또는 ARK 돌연변이 중 어느 하나를 갖는 것으로 확인되지 않은 진행성 질환을 갖는 NSCLC 환자는 혈관 내피세포 성장인자 (VEGF)에 대해 표적화된 단일클론 항체인 베박시주맙을 수여받을 수 있다. 이것은 재발성 또는 진행성 비-소세포 폐암 (제 ⅢB기 및 제 Ⅳ기)을 갖는 특정 환자에게 카보플라틴 및 파크리탁셀 화학요법에 추가하여 베박시주맙의 투여가 생존 전반 및 무-진행성 생존 둘 다를 증가시킬 수 있음을 관찰하였던 동부 협동 종양학 그룹 (Eastern Cooperative Oncology Group) 연구를 기초로 한다. 또 다른 연구 옵션은 종양이 PD-L1 발현하고 다른 화학요법 제제로의 치료에 실패하였던 환자에서 진행성 또는 전이성 편평세포 암종을 위한 항-PD-1 제제 니볼루맙 또는 전이성 비-소세포 폐암 (NSCLC)의 치료를 위한 펨브로리주맙이다.

펨브로리주맙은 암이 PD-L1을 과다발현하고 암이 EGFR 또는 ALK의 돌연변이가 없으면 NSCLC의 치료에서 가장 먼저 사용되는 제 1 면역요법이 되었다. 화학요법이 이미 투여되었으면, 다음으로 펩브로리주맘은 제 2 치료로서 사용될 수 있지만, 암이 EGFR 또는 ALK 돌연변이를 갖으면 이들 돌연변이를 표적하는 제제가 먼저 사용되어야 한다. PD-L1의 평가는 검증되고 승인된 동반 진단제로 시행되어야 한다. 그러나, 이들 치료 옵션 모두에서 치료 이전에 저항성을 발생시킬 가능성을 결정하는 것이 바람직하다. 흑색종에서, MAPK-표적화 요법은 선천적으로 항-PD-1 요법에 저항성이 있는 종양에서 검출되는 변화와 유사한 유전자 발현 변화를 유도한다 (Hugo, W., Cell 165, 35-44 (2016)). 본 발명의 방법은 치료 이전에 환자로부터 유래한 하나 이상의 시료(들)을 사용하여 이러한 유리한 결정을 제공한다.

상기에 따라, 다양한 추가의 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 선행 구현예 중 임의의 하나에 따른 방법으로서, 상기 화학 물질은 수용체 타이로신 키나제 (RTK)의 저해제, EGFR 경로의 저해제 (EGFRi), 체크포인트 키나제 또는 MAPK 경로의 저해제 (MAPKi) 또는 면역요법에 사용된 제제이고, 바람직하게 상기 MAPKi는 B-Raf의 저해제 (BRAFi), MEK의 저해제 (MEKi) 또는 ERK의 저해제 (ERKi)인, 방법에 관한 것이다. 화학 물질은 또한 암의 면역요법에 사용된 제제, 구체적으로 면역-종양학 제제일 수 있다.

다양한 구체적인 구현예에서,

i) 상기 BRAFi는 베무라페닙, 다브라페닙, 엔코라페닙, LGX818, PLX4720, TAK-632, MLN2480, SB590885, XL281, BMS-908662, PLX3603, RO5185426, GSK2118436 또는 RAF265이고/거나,

ii) 상기 MEKi는 AZD6244, 트라메티닙, 셀루메티닙, 코비메티닙, 비니메티닙, MEK162, RO5126766, GDC-0623, PD 0325901, CI-1040, PD-035901, 하이포테마이신 또는 TAK-733이고/거나,

iii) 상기 ERKi는 울릭세르티닙, 코리녹세인, SCH772984, XMD8-92, FR 180204, GDC-0994, ERK5-IN-1, DEL-22379, BIX 02189, ERK 저해제 (CAS 번호 1049738-54-6), ERK 저해제 Ⅲ (CAS 번호 331656-92-9), GDC-0994, 호노키올, LY3214996, CC-90003, 델토닌, VRT752271, TIC10, 아스트라갈로시드 Ⅳ, XMD8-92, VX-11e, 모그롤 또는 VTX11e이고/거나,

iv) 상기 EGFRi는 세툭시맙, 파니투무맙, 잘루투무맙, 니모투주맙, 마투주맙, 제피티닙, 에를로티닙, 라파티닙, 네라티닙, 반데타닙, 네시투무맙, 오시메르티닙, 아파티닙, AP26113, EGFR 저해제 (CAS 번호 879127-07-8), EGFR/ErbB-2/ErbB-4 저해제 (CAS 번호 881001-19-0), EGFR/ErbB-2 저해제 (CAS 번호 179248-61-4), EGFR 저해제 Ⅱ (BIBX 1382, CAS 번호 196612-93-8), EGFR 저해제 Ⅲ (CAS 번호 733009-42-2), EGFR/ErbB-2/ErbB-4 저해제 Ⅱ (CAS 번호 944341-54-2) 또는 PKCβⅡ/EGFR 저해제 (CAS 번호 145915-60-2)이다.

본 발명의 구체적인 구현예에서, 화학 물질은 면역요법 제제, 보다 구체적으로 예로 CD52, PD-L1, CTLA4, CD20 또는 PD-1을 표적하는 제제와 같은 면역-종양학 제제이다. 본 발명의 화합물과 조합하여 사용될 수 있는 제제는, 예를 들면 알렘투주맙, 아테졸리주맙, 이필리무맙, 니볼루맙, 오파투무맙, 펨브롤리주맙, 리투지맙을 포함한다. 또한 화학 물질은, 예를 들면 아파티닙, 아칼라브루티닙, 알렉티닙, 아파티닙, 악시티닙, 보수피닙, 카보잔티닙, 카네르티닙, 크레노라닙, 세디라닙, 크리조티닙, 담나칸탈, 다사티닙, 엔토스플레티닙, 엔트렉티닙, 어를로티닙, 포레티닙, 포스타마티닙, 길테리티닙, 글레사티닙, 제피티닙, 이브루티닙, 이코티닙, 이마티닙, 리나파닙, 라파티닙, 레스타우르티닙, 모테사닙, 무브리티닙, 닌테다닙, 닐로티닙, ONT-380, 파조파닙, 퀴자르티닙, 레고라페닙, 로실레티닙, 라도티닙, 사볼리티닙, 시트라바티닙, 세막사닙, 소라페닙, 수니티닙, 사볼리티닙, 시트라바티닙 γ, 테세바티닙, 바타라닙, 베무라페닙 또는 반데타닙을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 선행 구현예 중 임의의 하나의 방법으로서, 하나 이상의 시료(들)이 생검에 의해 획득되었던, 방법에 관한 것이다.

본원에 사용된 바, 생검은 보통 질환의 존재 또는 정도를 결정하는 검사를 위해 수행되는 시료 세포 또는 조직(들)의 추출이 관여하는 의학적 테스트이다. 조직은 일반적으로 병리학자에 의해 현미경 하에서 조사되고/거나 화학적으로 분석된다. 전체 덩어리 또는 의심되는 영역이 제거될 때, 절차는 적출 생검으로 불린다. 단지 조직의 시료가 조직 세포의 조직학적 구조를 보존하면서 제거될 때, 절차는 절개 생검 또는 코아 생검으로 불린다. 조직 또는 체액의 시료가 세포가 조직 세포의 조직학적 구조를 보존하지 않는 이러한 방식으로 바늘로 제거될 때, 절차는 바늘 흡인 생검으로 불린다. 상이한 유형의 생검 모두는 달리 명시되지 않으면 본 발명에 포괄된다. 생검은 가장 공통적으로 가능한 암성 및/또는 염증성 병태, 구체적으로 암 내의 질병 통찰을 위해 수행된다. 암이 의심될 때, 당업자에게 알려져 있는 다양한 생검 기법이 적용될 수 있다. 적출 생검은 전체 병변을 제거하는 시도이다. 표본이 평가될 때 진단에 추가하여, 병변의 주변에 관여되지 않은 조직의 분량인 표본의 수술 경계면은 질환이 생검된 영역을 넘어 확산되었는지 여부를 관찰하도록 조사된다. "깨끗한 경계면" 또는 "음성 경계면"은 생검 표본의 가장자리에서 질환을 전혀 찾지 못했던 것을 의미한다. "양성 경계면"은 질환을 찾았고, 진단에 의존하여 더 광범위한 적출이 필요할 수 있는 것을 의미한다. 다양한 이유로 완전한 제거가 되지 않을 때, 조직의 가장자리가 절개 생검에서 채취될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 시료는 조직을 "채취하는" 장치에 의해 수집될 수 있다. 다양한 크기의 바늘이 내강에서 조직을 수집할 수 있다 (코아 생검). 더 작은 직경의 바늘이 세포 및 세포 군집을, 미세한 바늘은 흡인 생검을 수집한다. 생검의 병리학적 검사는 병변이 비악성 또는 악성인지 여부를 결정할 수 있고, 상이한 유형의 암을 서로 차별하도록 도울 수 있다.

단순히 병변을 시료화하는 생검과는 대조적으로, 절제라고 불리는 더 큰 적출 표본은 전형적으로 환자로부터 기지의 병변을 박멸하려고 시도한 외과의사가 병리학자에게 보낼 수 있다. 예를 들면, 병리학자는 이전의 비적출 유방 생검이 이미 유방암의 진단을 확립하였더라도, 유방절제술 표본을 검사할 것이다. 완전한 유방절제술 표본의 검사는 암의 정확한 특성 (종양의 하위분류 및 조직 "등급 결정")을 검증하고, 이의 확산 정도 (병리적 "단계 결정")를 보여줄 것이다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 생검은 액체 생검, 예로 순환하는 종양 세포의 제거이다. 이러한 방법은 암에서의 돌연변이를 평가하고 개인화된 치료를 계획하기 위하여 침습적 생검을 반복하는 비-침습적 대안을 제공한다. 또한, 암이 불균일한 유전적 질환이고, 적출 생검이 종양에 발생하는 신속한 역동적 유전적 변화 중 일부의 시점에 스냅 사진만을 제공하기 때문에, 액체 생검은 조직 생검-기반의 게놈 테스트를 능가하는 일부 장점을 제공한다. CTC에서 게놈 변형을 검출하고 정량화함으로써, 액체 생검은 종양 진행의 단계, 치료 효능 및 암 전이 위험성에 관한 실시간 정보를 제공할 수 있다. 따라서 본 발명의 일 구현예 내에서, 액체 생검을 사용하는 것이 고려된다. 이에 따라, 본 발명의 일 구현예에서, 생검은 암으로 진단된 피험자로부터 분석될 시료를 획득하는데 사용된다.

용어 "결정" 또는 "결정하는 것"은 본원에서 특정한 화학 물질, 구체적으로 치료제에 대한 저항성을 발생시킬 환자의 위험성의 평가를 말하는데 사용된다. 일 구현예에서, 결정 또는 결정하는 것은 이들 저항성의 정도에 관한 것이다. 일 구현예에서, 결정 또는 결정하는 것은 치료, 예를 들면 특정한 화학 물질/치료제로의 치료 이후에 저항성을 발생시킬 환자의 위험성이 증가/감소되는지 여부에 관한 것이다.

본 발명은 또한 다양한 구현예에서 본원에 기술된 본 발명의 방법을 사용하여 상기 화학 물질에 대한 저항성을 발생시킬 것으로 결정된 환자에서 암을 치료하는데, 추가적인 화학 물질과 조합하여 사용되는 화학 물질로서, 상기 제 2 화학 물질은 제 1 화학 물질 또는 물질들에 대한 암 약물 저항성의 발생과 관련된 유전자의 발현을 억제하는, 화학 물질에 관한 것이다.

일 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 화학 물질의 용도로서, 다양한 구현예에서 본원에 기술된 본 발명의 방법을 사용하여 상기 화학 물질에 대한 저항성을 발생시킬 것으로 결정된 환자에서 상기 제 1 화학 물질 또는 물질들에 대한 암 약물 저항성의 발생과 관련된 하나 이상의 유전자의 발현을 억제하는 추가적인 화학 물질과 조합하여 암을 치료하는, 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 다양한 구현예에서 본원에 기술된 본 발명의 방법을 사용하여 화학 물질에 대한 저항성을 유도할 것으로 결정된 환자에서 암을 치료하는 하나 이상의 화학 물질 및 상기 제 1 화학 물질에 대한 암 약물 저항성의 발생과 관련된 하나 이상의 유전자의 발현을 억제하는 추가적인 화학 물질의 조합을 포함하는 산물이다.

상기 치료될 암은 일 구현예에서, 비-흑색종 피부암, 식도위 샘암종, 교모세포종, 방광암, 방광 요로상피 암종, 식도위암, 흑색종, 비-소세포 폐암, 자궁내막암, 자궁 샘암종, 식도 편평세포 암종, 유방암, 두경부 편평세포 암종, 배아세포 종양, 소세포 폐암, 난소암, 연조직 육종, 간세포 암종, 결장직장 샘암종, 자궁 편평세포 암종, 담낭 암종, 전립샘암, 상부관 요로상피 암종, 확산성 교아종, 결장직장암, 팽대 암종, 부신피질 암종, 두경부암, 신장 투명세포 암종, 간담낭암, 교아종, 비-호지킨 림프종, 중피종, 침샘암, 신장 비-투명세포 암종, 분류되지 않은 신경상피 종양, 크롬친화 세포종, 흉선 종양, 다발성 골수종, 신장 세포 암종, 골암, 췌장암, 백혈병, 말단 신경계 종양, 갑상샘암, B-림프모세포 백혈병, 단일클론 B-세포 림프구증가증, 림프종, 털세포 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 윌름 종양 구체적으로 흑색종 및 비-소세포 폐암일 수 있다. 상기 질환은 전형적으로 RTK (EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4, PDGFA, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, KIT, FGF1, FGFR1, IGF1, IGFR, VEGFA, VEGFB, KDR) 및/또는 MAPK 경로 구성원 (KRAS, HRAS, BRAF, RAF1, MAP3K1/2/3/4/5, MAP2K1/2/3/4/5, MAPK1/3/4/6/7/8/9/12/14, DAB, RASSF1, RAB25) 중 3% 이상에서 돌연변이 발생 빈도를 나타낸다.

본 발명의 용도를 위한 화학 물질은 수용체 타이로신 키나제 (RTK)의 저해제, EGFR 경로의 저해제 (EGFRi), MAPK 경로의 저해제 (MAPKi)일 수 있고, 바람직하게 상기 MAPKi는 B-Raf의 저해제 (BRAFi), MEK의 저해제 (MEKi) 또는 ERK의 저해제 (ERKi)이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 화학 물질은 BRAFi 구체적으로 베무라페닙, 다브라페닙, 엔코라페닙, LGX818, PLX4720, TAK-632, MLN2480, SB590885, XL281, BMS-908662, PLX3603, RO5185426, GSK2118436 또는 RAF265, 및/또는 MEKi 구체적으로 AZD6244, 트라메티닙, 셀루메티닙, 코비메티닙, 비니메티닙, MEK162, RO5126766, GDC-0623, PD 0325901, CI-1040, PD-035901, 하이포테마이신 또는 TAK-733, 및/또는 ERKi 구체적으로 울릭세르티닙, 코리녹세인, SCH772984, XMD8-92, FR 180204, GDC-0994, ERK5-IN-1, DEL-22379, BIX 02189, ERK 저해제 (CAS 번호 1049738-54-6), ERK 저해제 Ⅲ (CAS 번호 331656-92-9), GDC-0994, 호노키올, LY3214996, CC-90003, 델토닌, VRT752271, TIC10, 아스트라갈로시드 Ⅳ, XMD8-92, VX-11e, 모그롤 또는 VTX11e, 및/또는 EGFRi 구체적으로 세툭시맙, 파니투무맙, 잘루투무맙, 니모투주맙, 마투주맙, 제피티닙, 에를로티닙, 라파티닙, 네라티닙, 반데타닙, 네시투무맙, 오시메르티닙, 아파티닙, AP26113, EGFR 저해제 (CAS 번호 879127-07-8), EGFR/ErbB-2/ErbB-4 저해제 (CAS 번호 881001-19-0), EGFR/ErbB-2 저해제 (CAS 번호 179248-61-4), EGFR 저해제 Ⅱ (BIBX 1382, CAS 번호 196612-93-8), EGFR 저해제 Ⅲ (CAS 번호 733009-42-2), EGFR/ErbB-2/ErbB-4 저해제 Ⅱ (CAS 번호 944341-54-2) 또는 PKCβⅡ/EGFR 저해제 (CAS 번호 145915-60-2)일 수 있다.

제 1 화학 물질과 동시적으로 또는 연속적으로 투여될 수 있는 제 2 화학 물질은 암 약물 저항성의 발생과 관련된 유전자의 발현을 억제한다. 바람직한 구현예에서, 제 2 화학 물질은 SOX2, Nanog, OCT4, FGF4, FBX15, FOXP4, KLF9, CD24, CD271, CD36, ITLN2, TNFSF12, NOX3, CLEC7A, ACYAP1, UNC5C, UNC5D, MUC16, VAV3, FOXD3, VGLL3, ALPP, C3, F2R, ENPP2, ETV4, NTNG1, NTRK2, ROBO1 및 ROBO2로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자를 억제한다. 제 2 화학 물질은 SOX2의 발현을 억제하는 것이 바람직하다.

본 양태에서, 본 발명자는 놀랍게도 및 예기치 못하게도, 기존의 승인된 약물이 약물 저항성과 관련된 유전자를 억제하는데 사용될 수 있는 점을 발견하였다. 이에 따라, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 암의 치료에 사용되는 화학 물질, 바람직하게 상기 저해제 중 하나는 환자가 암을 치료하는데 사용된 화학 물질에 대한 약물 저항성을 발생시키는 것을 예방하기 위하여 기존의 승인된 약물과 조합될 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 일 구현예에서, 본 발명의 암을 치료하는데 사용되는 화학 물질로서, 제 2 화학 물질이 세트리모늄 브롬화물, 이다루비신 염산, 네라티닙 (hki-272), 벤질 이소티오시아네이트, 보리노스타트, 에메틴 이염산, 다우노루비신 염산, 닥티노마이신, 퀴시노스타트 (jnj26481585), 니클로스아미드, 독소루비신, pci-24781 (아벡시노스타트), 라나토시드 C, 파노비스타트 (lbh589), 살리노마이신 소듐, 브록살딘, 테니포시드, 프라시노스타트 (sb939), 아자시티딘, 호모하링토닌, 아크리소르신, 톨로늄 염산, 라도티닙, 아모디아퀸 이염산, 벤제토늄 염화물, 쉬다미드, cudc-101, 셀라멕틴, 테트란드린, 벨리노스타트 (pxd101), 에트라비린 (tmc125), 암시노니드, 옥시벤다졸, 아세틸-1-류신, 클로로옥신, 나파부카신, 레스미노스타트, 이독수리딘, 티오구아닌, 사이클로헥시미드, 트리플루리딘, 베타메타손 17 및 21, 디프로피오네이트, 도비티닙 (tki-258) 이젖산, 콜히친, 모세티노스타트 (mgcd0103), 수니티닙, 펠리티닙 (ekb-569), 피마반세린, 에플록세이트, tg101348 (sar302503), 클로베타솔 프로피오네이트, 메틸프레드니솔론 소듐 숙시네이트, 디클로리손 아세테이트, 알벤다졸, 엔티노스타트 (ms-275), 플루니솔리드, 아르테니몰, 아미나크린, 플루메타손, 로실리노스타트 (acy-1215), 브로노폴, 그라미시딘 (그라미시딘 a 도시), 아바멕틴 (아버멕틴 b1a 도시), 디설피람, 디플루프레드네이트, 아세트리아조산, 이소플루프레돈 아세테이트, ly2835219, 퍼헥실린 말레이트, 메테르골린, 포르메스탄, 모넨신 소듐, 플록수리딘, 프레드니카르베이트, 덱사메타손 소듐 포스페이트, 레플루노미드, 할로베타솔 프로피오네이트, 시롤리무스, 이프리플라본, 닌테다닙 (bibf 1120), 피르비늄 파모에이트, 루플록사신 염산, 포스브레타불린 (콤브레타스타틴 a4 포스페이트 (ca4p)), 디소듐 트리암시놀론 디아세테이트, 오테나반트 (cp-945598) 염산, 아프로티닌, 플루티카손 프로피오네이트, 아무바티닙 (mp-470), 메틸벤제토늄 염화물, 펜벤다졸, 부피발케인 염산, 베타메타손, 플루메타존 피발레이트, 티오구아닌, 테가세로드 말레이트, 프레드니솔론 아세테이트, 클로린디온, 하이드로코르티손 헤미숙시네이트, 덱사메타손 아세테이트, 플루드로코르티손 아세테이트, 이버멕틴, 프로플라빈 헤미설페이트, 란소프라졸, 세르둘라티닙 (prt062070, prt2070), 살리펀진, 할시노니드, 푸도스테인, 터페나딘, 플루오시노니드, 헥세티딘, 아르테수네이트, 플루오시놀론 아세토니드, 리팜핀, 트리암시놀론, 졸피뎀, 에토프로파진 염산, 레고라페닙 (bay 73-4506), 테라조신 염산, 탄쉬논 iia-설폰 소듐, 노코다졸, 트리클로산, 클로피돌, 소라페닙 토실레이트, 설피소미딘, 메틸렌블루, 크리조티닙 (pf-02341066), 프로실라리딘 a, 덱시부프로펜, 트리플루프로마진 염산, 피리베딜 염산, 카르모퍼, 스워티아마린, 설타미실린 토실레이트, 진세노시드 rc, 에토피브레이트, 세틸피리디늄 염화물, 라베프라졸 소듐, 알리자프리드 염산, 메틸 아미노레불리네이트 염산, 토피록소스타트, 디소듐 클로드로네이트 테트라하이드레이트, 아목사핀, 베타퀼린 (tmc207; r207910), 옥테니딘, 에카베트 소듐, 아피제닌, 글리코피롤레이트 요오드, 소듐 몬트모릴로나이트, 하이드로코르티손으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화학 물질에 관한 것이다. 또한, 약물 저항성과 관련된 유전자의 저해제로서 고려되는 추가의 화학 물질은, 예를 들면 바르바딘, CCS1477, SGC-CBP30, CPI-637, PF-CBP1, ICG, 001, PRI-724, A-485, C646, 4-메틸티오-2-옥소부티르산 (MTOB), HIPP 유도체, 고리 펩티드 CP61, NSC95397, 2-(하이드록시이미노)-3-페닐프로판산 및 이의 4-클로로 및 3-클로로 유사체, MLN4924, AS1842856, JIB-04, EP-5676, N-옥살릴글리신 (NOG), 피리딘-2,4-디카르복실레이트 (2,4-PDCA), 플라디네오리드 B, IDC16, CBL0137, 디포페인 또는 R18와 같은 ARRB1, ATXN7L3, CBX1, CREBBP, CTBP2, CUL3, DDB2, FMR1, FOXO1, KDM4B, KMT2E/MLL5, NIPBL, OGFOD1, RBX1, SF3B1, SFPQ, SRSF1, SSRP1, YWHAZ 또는 ZMYND11를 표적하는 물질을 포함한다.

본 발명은 또한 도면에 도시된 추가의 특징 모두를, 이들이 전술한 또는 다음의 상세한 설명에 기술되지 않았을지라도 개별적으로 포괄한다. 또한, 도면 및 상세한 설명에 기술된 단일한 대안의 구현예 및 이의 단일한 대안의 특징은 본 발명의 다른 양태의 주제로부터 부인될 수 있다.

또한, 청구항에서 용어 "포함하는"은 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않고, 부정 관사 "하나 (a)" 또는 "하나 (an)"는 복수를 배제하지 않는다. 단일한 단위는 청구항에서 재인용된 여러 특징의 기능을 충족시킬 수 있다. 용어 "필수적으로", "약" 및 "대략" 등은 구체적으로 속성 또는 수치와 연결하여 각각 정확한 속성 또는 정확한 수치도 역시 정의한다. 청구항에서 임의의 참조 표시는 발명의 범주를 제한하는 것으로서 참작되지 않아야 한다.

본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용된 바, 단수 형태 "하나 (a)", "하나 (an)" 및 "상기 (the)"는 달리 문맥상 명백하게 진술되지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면 "화합물"에 대한 언급은 하나 이상의 화합물을 포함한다.

용어 "치료" 및 "치료하는" 등은 본원에서 일반적으로 원하는 약학적 및/또는 생리학적 효과를 획득하는 것을 의미하는데 사용된다. 효과는 질환 또는 이의 증상을 완벽하게 또는 부분적으로 예방하는 견지에서 예방적일 수 있고/거나 질환 및/또는 질환으로 인한 부작용을 부분적으로 또는 완벽하게 치유하는 견지에서 치료적일 수 있다. 용어 "치료"는 본원에 사용된 바 피험자에서 질환의 임의의 치료를 포괄하고, (a) 질환을 예방하거나; (b) 질환을 억제하고, 예로 이의 진행을 정지시키거나; (c) 질환을 완화하고, 예로 질환의 퇴행을 유발하는 것:을 포함한다.

"환자" 또는 "피험자"는 본 발명의 목적으로 상호교환적으로 사용되고, 인간 및 기타 동물, 구체적으로 포유동물 및 기타 유기체를 둘 다 포함하도록 의미한다. 따라서, 본 방법은 인간 요법 및 수의적 응용 둘 다에 적용가능하다. 바람직한 구현예에서, 환자 또는 피험자는 포유동물이고, 가장 바람직한 구현예에서, 환자 또는 피험자는 인간이다.

세포-기반의 선별검사 방법은 과다-활성화된 신호전달 경로를 특징으로 하는 세포에 의해 특성화되는 암의, 상기 신호전달 경로의 저해제와의 조합 약제로의 치료에 효과적인 화합물을 식별하는데 사용될 수 있고, a) 상기 신호전달 경로에 포함된 단백질을 인코딩하는 유전자에서 활성화 돌연변이 또는 증폭을 보유하는 세포를 제공하는 단계; b) 상기 세포를 상기 신호전달 경로의 저해제 및 테스트 화합물과 접촉하여 배치시키는 단계; c) SOX2, Nanog, OCT4, FGF4, FBX15, FOXP4, KLF9, CD24, CD271, CD36, ITLN2, TNFSF12, NOX3, CLEC7A, ACYAP1, UNC5C, UNC5D, MUC16, VAV3, FOXD3, VGLL3, ALPP, C3, F2R, ENPP2, ETV4, NTNG1, NTRK2, ROBO1 및 ROBO2로 이루어진 군으로부터 선택된, 저항성의 발생과 관련된 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 제 2 화학 물질은 SOX2의 발현을 억제하고, d) 상기 테스트 화합물에 점수를 배정하는 단계로서, 상기 점수는 상기 SOX2 및/또는 저항성의 발생과 관련된 또 다른 유전자의 발현 수준이 미리 결정된 역치값 미만이면 높고, 상기 역치값은 상기 신호전달 경로의 상기 저해제 단독으로 처리된 대조군 세포에서 SOX2 및/또는 저항성의 발생과 관련된 또 다른 유전자의 발현 수준에 해당하며, 상기 점수는 상기 SOX2 및/또는 저항성의 발생과 관련된 또 다른 유전자의 발현 수준이 상기 미리 결정된 역치값과 동일하거나 이를 초과하면 낮은, 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

다수의 세포는 단계 a)에 동시적으로 채용될 수 있다. 상기 다수의 세포는 단계 b)로 다함께 진행되고, SOX2 및/또는 저항성의 발생과 관련된 또 다른 유전자의 평균 발현 수준이 상기 다수의 세포에 대해 결정되고, 상기 SOX2 및/또는 저항성의 발생과 관련된 또 다른 유전자의 평균 발현 수준이 상기 신호전달 경로의 상기 저해제 단독으로 처리된 대조군 세포에서 SOX2 및/또는 저항성의 발생과 관련된 또 다른 유전자의 평균 발현 수준 미만이면 높은 점수가 상기 테스트 화합물에 배정된다.

구체적으로, 다수의 세포는 단계 a)에 동시적으로 채용될 수 있다. 상기 다수의 세포는 단계 b)로 다함께 진행되고, 상기 SOX2 및/또는 저항성의 발생과 관련된 또 다른 유전자의 발현 수준이 미처리된 세포에 대해 결정된 발현 수준을 초과하면 "SOX2 양성"으로서 평가되고, 총 세포 대 "SOX2 양성" 세포의 비율이 상기 다수의 세포에 대해 결정되며, d) 상기 테스트 화합물로 처리된 세포에 대해 결정된 상기 비율이 상기 신호전달 경로의 상기 저해제 단독으로 처리된 대조군 세포에 대해 결정된 상기 비율 미만이면 높은 점수가 상기 테스트 화합물에 배정된다.

당업자라면 SOX2 및/또는 저항성의 발생과 관련된 또 다른 유전자의 발현 수준을 결정하는데 적합한 방법을 잘 인식하고 있다. 일 상세한 구현예에서, 발현 수준은 단백질 발현 및/또는 mRNA 발현을 분석함으로써 결정된다. 그러나, 게놈, 전사 및/또는 프로테옴으로부터 유래한 정보를 사용하는 임의의 방법은 본 발명에 채용될 수 있다. 예를 들면, 발현 수준은 (SOX2 및/또는 저항성의 발생과 관련된 또 다른 유전자의) 단백질 수준 상에서 결정될 수 있고, 표지의 사용, 구체적으로 항체-매개된 염색에 의해 직접적으로 영상화되고 정량화될 수 있다. 발현 수준은 또한 (SOX2 및/또는 저항성의 발생과 관련된 또 다른 유전자의) mRNA 수준 상에서 제자리 혼성화를 사용한 직접적인 영상화에 의해 결정될 수 있다. 이러한 기법을 사용하여, 개별적인 분자가 정량화될 수 있다.

특정 구현예에서, 저항성의 발생과 관련된 유전자는 Nanog, OCT4, FGF4, FBX15, FOXP4, KLF9, CD24, CD271, CD36, ITLN2, TNFSF12, NOX3, CLEC7A, ACYAP1, UNC5C, UNC5D, MUC16, VAV3, FOXD3, VGLL3, ALPP, C3, F2R, ENPP2, ETV4, NTNG1, NTRK2, ROBO1 및 ROBO2를 포함하는 군으로부터 선택된다.

이에 따라, 본 발명 내에서, 유전자 발현 수준은 당해 기술분야에 공지된 임의의 기법, 예를 들면 폴리뉴클레오티드 (mRNA 전사체)의 혼성화를 기반으로 하는 방법, 폴리뉴클레오티드의 서열 결정 또는 폴리뉴클레오티드의 증폭을 기반으로 하는 방법을 사용하여 결정될 수 있다.

시료에서 mRNA 유전자 전사체의 정량화는, 이에 제한되는 것은 아니지만 노던 블럿팅, 제자리 혼성화, RNAse 프로테아제 검정법, 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR) 및 실시간 정량적 PCR qRT-PCR과 같은 PCR 기반의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 대안적으로, 핵산 이중체 (duplex)에 대한 결합 특이성을 갖는 항체가 mRNA 수준을 결정하는데 사용될 수 있다. 관심있는 RNA에 특이적인 결합 구성원, 예를 들면 관심있는 RNA에 특이적인 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 관심있는 RNA에 특이적인 항체를 사용하는 마이크로어레이 기법으로서, 특이적인 결합 구성원이 기질, 예를 들면 유리 슬라이드 또는 마이크로칩 기질 상에 도말되거나 배열되는 기법이 사용될 수 있다. 특이적인 결합 구성원은 겨냥가능한 위치에 있는 기질 상에 제공될 수 있고, 겨냥가능한 위치의 수는 예를 들면 적어도 3개, 적어도 10개, 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 1,000개 또는 적어도 10,000개 이상으로 다양할 수 있다. 구현예에서, 겨냥가능한 위치의 수는 1,000개 미만, 100개 미만, 50개 미만, 10개 미만 또는 5개 미만으로 다양할 수 있다. 이러한 구현예에서, 시료는 어레이와 접촉되고, 배열된 특이적인 결합 구성원은 시료에서 표적과 검출가능한 상호작용을 형성할 수 있다. 상호작용은 적합한 표지를 사용하여 검출될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브이 사용되는 곳에서, 적절한 조건 하에 올리고뉴클레오티드 프로브은 표적 핵산 서열에 "혼성화"하여 상보적인 염기 서열을 갖는 핵산 분자와 염기쌍을 이루는 이중체를 형성할 수 있다. 특정한 엄격도를 유도하는 혼성화 조건은 혼성화 방법의 특성 및 혼성화하는 핵산 서열의 조성 및 길이에 의존하여 다양할 것이다.

엄격한 혼성화는 핵산이 최소의 배경을 갖는 표적 핵산에 결합할 때 일어난다. 전형적으로, 엄격한 혼성화를 달성하기 위하여, Tm (절반의 분자가 이들의 상대방으로부터 해리되는 녹는 온도) 미만으로 대략 1℃ 내지 약 20℃, 더욱 바람직하게 5℃ 내지 약 20℃의 온도가 사용된다. 그러나, 이것은 용액의 이온 강도 및 pH에 의해 추가로 정의된다. 적합한 혼성화 조건은 당업자에게 공지되어 있을 것이고, 예시적인 혼성화 조건은 매우 높은 엄격도 (적어도 90% 동일성을 공유하는 서열을 검출함) - 5× SSC로 65℃에서 약 16시간 동안 혼성화, 높은 엄격도 (적어도 80% 동일성을 공유하는 서열을 검출함) - 5× 내지 6× SSC로 65℃에서 약 16시간 동안 혼성화, 및 낮은 엄격도 (적어도 50% 동일성을 공유하는 서열을 검출함) - 6× SSC로 실온 내지 55℃에서 약 20 내지 30분 동안 혼성화이다.

매우 엄격한 세척 조건의 예는 72℃에서 약 15분 동안 0.15 M 염화나트륨이다. 엄격한 세척 조건의 예는 65℃에서 15분 동안 0.2× 염화나트륨 및 소듐 시트레이트 (SSC) 세척이다 (상기 Sambrook and Russell 참조, SSC 완충액의 설명을 위해, 예를 들면 800 mL 증류수에 175.3 g의 염화나트륨 및 88.9 g의 소듐 시트레이트를 용해하여 제조된 20× SSC. pH를 pH 7.0으로 조정하고 증류수로 부피를 1 L로 조정함). 종종 높은 엄격도 세척은 배경 프로브 신호를 제거하도록 낮은 엄격도 세척이 선행된다. 중간 엄격도 세척의 예는, 예를 들면 100개 미만의 뉴클레오티드의 이중체의 경우 45℃에서 15분 동안 1× SSC이다. 낮은 엄격도 세척의 예는, 예를 들면 100개 미만의 뉴클레오티드의 이중체의 경우 40℃에서 15분 동안 4 내지 6× SSC이다. 짧은 프로브 (예를 들면, 약 10개 내지 50개의 뉴클레오티드)의 경우, 엄격한 조건은 전형적으로 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.5 M 미만의 염 농도, 더욱 바람직하게 약 0.01 내지 1.0 M의 Na 이온 농도 (또는 다른 염)이 관여하고, 온도는 전형적으로 적어도 약 30℃ 및 긴 프로브 (예를 들면, > 50개의 뉴클레오티드)의 경우 적어도 약 60℃이다.

PCR 방법, 예를 들면 RT-PCR 그리고 PCR 및 RT-PCR에 사용된 방법론은 당업자에게 잘 공지되어 있을 것이다.

일부 방법은 시료로부터 RNA의 분리를 요구할 수 있다. 이러한 분리 기법은 당해 기술분야에 공지되어 있고, Qiagen과 같은 제조사로부터의 시판되는 RNA 분리 키트를 사용할 수 있다.

단백질 발현의 결정, 면역조직화학 (IHC) 및 ELISA는 단백질 발현을 검출하는데 유용한 기법이다. 항체 (단일클론 또는 다중클론) 또는 항체의 결합 단편가 개시된 방법 및 키트에 사용될 수 있다. 항체는 항체의 직접적인 표지화에 의해 또는 표적에 대한 결합 특이성을 갖는 일차 항체에 특이적인 이차 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 이차 항체는 검출가능한 모이어티로 표지될 수 있거나, 햅텐 (예컨대 바이오틴 등)에 컨쥬게이션될 수 있고, 여기서 햅텐은 검출가능하게 표지된 동족체 햅텐 결합 분자, 예를 들면 스트렙트아비딘 호스래디쉬 퍼옥시다제에 의해 검출가능하다.

항체 (특정한 항원 예로 SOX2 및/또는 저항성의 발생과 관련된 또 다른 유전자에 대한 결합 특이성을 갑는 항체)의 결합 특이성은 일차 종양의 취급을 모방하는 포르말린-고정되고, 파라핀-포매된 세포주의 면역조직화학적 분석과 동시적인 웨스턴 블럿팅을 사용하여 확립될 수 있다.

대안적으로, 단백질은 앱타머 (예를 들면, 특이적인 서열 의존적 형태를 가정하고, 높은 친화성 및 특이성으로 FKBPL 단백질에 결합하는 단일가닥 핵산 분자 (예컨대 DNA 또는 RNA)) 및 거울상 앱타머 (스피겔머^TM (SPIEGELMER^TM)) 또는 조작된 비-면역글로불린 결합 단백질, 예를 들면 피브로넥틴 (애드넥틴^TM (ADNECTINS^TM)), CTLA-1 (에비바디^TM (EVIBODIES^TM)), 리포칼린 (안티칼린^TM), 단백질 A 도메인 (애피바디^TM (AFFIBODIES^TM))을 포함하는 스캐폴드를 기반으로 하는 비-면역글로불린 결합 단백질 등을 사용하여 검출될 수 있다. 구현예에서, 앱타머는 100개 미만의 뉴클레오티드, 75개 미만의 뉴클레오티드, 50개 미만의 뉴클레오티드, 예를 들면 25개 내지 100개의 뉴클레오티드, 10개 내지 50개의 뉴클레오티드, 10개 내지 100개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

상세한 구현예에서, SOX2 단백질 또는 SOX2 단백질의 단편 또는 SOX2 단백질 또는 이의 단편에 대한 결합 특이성을 갖는 항체를 포함하는 어레이가 제공될 수 있다. 이들 단백질 서열 또는 항체는 기질에 공동결합될 수 있다. 단백질 발현의 변화는 예를 들면 테스트될 시료가 어레이와 접촉하여 배치될 때 시료에서 SOX2 단백질 및/또는 저항성의 발생과 관련된 또 다른 유전자에 대한 결합 특이성을 갖는 항체에 결합하는 SOX2 단백질 및/또는 저항성의 발생과 관련된 또 다른 유전자의 수준을 측정함으로써 검출될 수 있다.

특정 구현예에서, 저항성의 발생과 관련된 또 다른 유전자는 Nanog, OCT4, FGF4, FBX15, FOXP4, KLF9, CD24, CD271, CD36, ITLN2, TNFSF12, NOX3, CLEC7A, ACYAP1, UNC5C, UNC5D, MUC16, VAV3, FOXD3, VGLL3, ALPP, C3, F2R, ENPP2, ETV4, NTNG1, NTRK2, ROBO1 및 ROBO2를 포함하는 군으로부터 선택된다.

어레이 및 어레이 포맷에서 사용에 적합한 기질은 당업자에게 공지되어 있을 것이다.

상세한 구현예에서, IHC 시료는 자동화된 영상 분석을 사용하여 분석되어 블라인드 분석을 제공할 수 있다. 이를 위해, 전체 슬라이드 디지탈 영상이 먼저 스캔스코프 XT 슬라이드 스캐너 (Aperio Technologies)를 사용하여 20×로 포획될 수 있다. 다음으로, 양성 픽셀 계수 알고리즘 (Aperio Technologies)이 SOX2 발현을 위한 정량적인 점수 결정 모델을 개발하는데 사용될 수 있다. 조직 마이크로어레이-유도된 데이타의 통계학적 분석이 경향성의 경우 v2 테스트, 피셔 정확성 및 SOX2 발현의 비교의 경우 만-휘트니 테스트를 사용하여 수행될 수 있고, 카플란-마이어 플롯이 생존 분석에 사용될 수 있고, 곡선은 로그-순위 테스트를 사용하여 비교된다. 콕스 비례적인 위험 회귀 분석은 이전에 기술된 바와 같이 비례적인 위험 비율을 추정하고, 다중변수 분석을 시행하는데 사용될 수 있다. 모든 계산은 SPSS v11.0 (SPSS, IL)으로 수행될 수 있다. 또한, 구분된 다중-마커 테스트의 생성을 용이하게 하도록, (중첩되지 않은 형광단을 보유하는) 형광-태그화 항체, 다음으로 추가적인 적절한 바이오마커가 동시에 사용될 수 있다. 유리하게, 아페리오사로부터 최근 개발된 형광 스캐닝 시스템, 예를 들면 스캔스코프 FL 시스템이 사용될 수 있다. 이러한 검정 방법은 통상적인 밝은 부분 영상화에 의하기 보다는 더욱 정량적인 분석을 제공함으로써 추가의 정교한 층을 제공할 것이다. 이해될 바와 같이, SOX2의 발현, 세포에서 SOX2의 위치 또는 SOX2의 활성을 검출하는 방법은 본원에 기술되거나 청구된 임의의 본 발명의 방법과 관련하여 적용가능할 수 있다.

본 발명의 각각의 양태의 바람직한 특징 및 구현예는 달리 문맥상 요구하지 않는 한, 각각의 나머지 양태의 경우에도 필요한 변경을 가하여 동일하다.

핵산 분자는 두 개의 분자가 상당히 많은 상보적인 뉴클레오티드를 공유하여 가닥이 서로 결합 (혼성화)할 때 안정한 이중체 또는 삼중체를, 예를 들면 왓슨-크릭 염기쌍을 형성함으로써 만들면 또 다른 핵산 분자와 상보적인 것이라고 언급된다. 상보성은 두 개 분자의 특이적 영역 내의 두 개 핵산 분자 사이의 염기쌍 비율의 백분율로서 설명될 수 있다.

접촉은 제제를 또 다른 제제와 매우 근접하여 배치하여 제제 둘 다가 서로 상호작용할 수 있는 것을 의미한다. 예를 들면, 항체 또는 다른 결합 구성원은 시료에서 단백질과 매우 근접하여 배치될 수 있고, 항체가 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 곳에서 항체는 단백질과 결합할 것이다. 대안적으로, 제 1 핵산은 제 2 상보적인 핵산 (표적 서열을 갖는 프라이머)과 매우 근접하여 배치될 수 있고, 결합이 검출될 수 있거나 표적 서열의 증폭이 일어날 수 있도록 배양될 수 있다.

검출은 두 개의 제제 예를 들면 두 개의 단백질 또는 두 개의 핵산 간의 상호작용이 존재 또는 부재하는지 여부를 결정하는 것을 의미한다. 이것은 증폭을 포함할 수 있다. 검출은, 예를 들면 분광광도측정법, 유세포 측정법 또는 마이크로어레이를 사용하여 검출할 수 있는 제제 (표지)의 사용을 포함할 수 있다. 예시적인 표지는 방사성 동위원소 (예컨대 ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰V, ⁹⁹Tc, ¹¹¹Ln, ¹²⁵I₁Or ¹³¹I), 형광단 (예컨대 플루오세인, 플루오세인 이소티오시아네이트 또는 로다민 등), 발색단, 리간드, 화학발광제, 생체발광제 (예컨대 루시페라제, 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 황색 형광 단백질), 검색가능한 반응 산물을 생산할 수 있는 효소 (예컨대 호스래디쉬 퍼옥시다제, 루시페라제, 알칼라인 포스파타제, 베타-갈락토시다제) 및 이들의 조합을 포함한다.

특이적 결합은 하나의 결합 상대방 및 또는 또 다른 결합 상대방, 예를 들면 프라이머 및 표적 서열 또는 단백질 특이적 항체 및 단백질 간의 특정한 상호작용을 의미한다. 하나의 결합 상대방 및 또는 또 다른 결합 상대방 간의 상호작용은 하나 이상의, 전형적으로 1개를 초과하는 비공유 결합에 의해 매개될 수 있다. 특이적 결합을 특성화하는 예시적인 방식은 특이적 결합 곡선에 의한다.

본 발명의 방법의 추가의 구현예에서, 방법은 세포 주기 단계가 결정되고, 구체적으로 상기 신호전달 경로의 상기 저해제 및 상기 테스트 화합물로 처리된 상기 세포에서 세포 주기 정지가 검출되고, 상기 세포가 세포 주기 정지를 겪으면 높은 점수가 상기 테스트 화합물에 배정되는 단계를 포함한다.

본 발명의 방법의 상세한 구현예에서, 신호전달 경로는 MAPK 또는 EGFR 경로이다. 본 발명의 이러한 구현예에서, 암은 MAPK 또는 EGFR 경로에 포함되는 단백질을 인코딩하는 유전자에서 활성화 돌연변이 또는 증폭, 구체적으로 NRAS, KRAS, HRAS, BRAF, MEK, ERK, ROS, ALK, MET, KIT 또는 EGFR에서 활성화 돌연변이 또는 증폭을 보유하는 암 세포를 특징으로 할 수 있다. 다음으로 암은 비-흑색종 피부암, 식도위 샘암종, 교모세포종, 방광암, 방광 요로상피 암종, 식도위암, 흑색종, 비-소세포 폐암, 자궁내막암, 자궁 샘암종, 식도 편평세포 암종, 유방암, 두경부 편평세포 암종, 배아세포 종양, 소세포 폐암, 난소암, 연조직 육종, 간세포 암종, 결장직장 샘암종, 자궁 편평세포 암종, 담낭 암종, 전립샘암, 상부관 요로상피 암종, 확산성 교아종, 결장직장암, 팽대 암종, 부신피질 암종, 두경부암, 신장 투명세포 암종, 간담낭암, 교아종, 비-호지킨 림프종, 중피종, 침샘암, 신장 비-투명세포 암종, 분류되지 않은 신경상피 종양, 크롬친화 세포종, 흉선 종양, 다발성 골수종, 신장 세포 암종, 골암, 췌장암, 백혈병, 말단 신경계 종양, 갑상샘암, B-림프모세포 백혈병, 단일클론 B-세포 림프구증가증, 림프종, 털세포 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 윌름 종양 구체적으로 흑색종 및 비-소세포 폐암으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 방법의 상세한 구현예에서, 단계 a)에서 제공된 세포는 BRAF 돌연변이, 구체적으로 BRAF-V600E 또는 BRAF-V600K 돌연변이를 보유하는 흑색종 또는 비-소세포 폐암 세포 및 EGFR 돌연변이, 증폭 또는 과다발현을 보유하는 비-소세포 폐암 세포로부터 선택된다.

본 발명의 방법에서, 신호전달 경로의 저해제는 예를 들면, EGFR 경로의 저해제 (EGFRi) 및 MAPK 경로의 저해제 (MAPKi)로부터 선택될 수 있고, 구체적으로 상기 MAPKi는 B-Raf의 저해제 (BRAFi), MEK의 저해제 (MEKi) 또는 ERK의 저해제 (ERKi)로부터 선택된다. 본 발명 내에서, 이러한 저해제는 베무라페닙, 다브라페닙, 엔코라페닙, LGX818, PLX4720, TAK-632, MLN2480, SB590885, XL281, BMS-908662, PLX3603, RO5185426, GSK2118436 또는 RAF265일 수 있거나, 상기 MEKi는 AZD6244, 트라메티닙, 셀루메티닙, 코비메티닙, 비니메티닙, MEK162, RO5126766, GDC-0623, PD 0325901, CI-1040 또는 TAK-733일 수 있거나, 상기 ERKi는 울릭세르티닙, SCH772984, XMD8-92, FR 180204, GDC-0994, ERK5-IN-1, DEL-22379, BIX 02189, ERK 저해제 (CAS 번호 1049738-54-6), ERK 저해제 Ⅲ (CAS 번호 331656-92-9), GDC-0994 또는 VTX11e일 수 있거나, 상기 EGFRi는 세툭시맙, 파니투무맙, 잘루투무맙, 니모투주맙, 마투주맙, 제피티닙, 에를로티닙, 라파티닙, AP26113, EGFR 저해제 (CAS 번호 879127-07-8), EGFR/ErbB-2/ErbB-4 저해제 (CAS 번호 881001-19-0), EGFR/ErbB-2 저해제 (CAS 번호 179248-61-4), EGFR 저해제 Ⅱ (BIBX 1382, CAS 번호 196612-93-8), EGFR 저해제 Ⅲ (CAS 번호 733009-42-2), EGFR/ErbB-2/ErbB-4 저해제 Ⅱ (CAS 번호 944341-54-2) 또는 PKCβⅡ/EGFR 저해제 (CAS 번호 145915-60-2)일 수 있다.

본 발명의 맥락, 구체적으로 본 발명의 방법의 맥락에서, 용어 "신호전달 경로에 포함된 단백질"은 세포에서 증식, 분화 또는 세포사멸과 같은 특이적 세포 기능을 조절하도록 상호작용하는 분자에 관한 것이다. 하나의 신호전달 경로에 포함된 분자는 조화된 활성화 연속반응의 일부이다. 자극 시, 경로의 제 1 분자는 하나 또는 여러 하류 분자를 활성화시킨다. 활성화는 활성화 연쇄반응의 최종 분자가 활성화되고 세포 기능이 수행될 때까지 계속 진행된다. MAPK 경로의 관점에서, 이것은 NGF, NRG, BDNF, NT3/4, EGF, FGF, PDGF, CACN, TrkA/B, EGFR, FGFR, PDGFR, ROS, ALK, MET, KIT, GFB2, SOS, HRAS, KRAS, NRAS, RasGRF, RasGRP, CNasGEF, PKC, PKA, Rap1, G12, Gap1m, NF1, p120GAF, RafB, ARAF, BRAF, CRAF, Mos, MEK1, MEK2, MP1, ERK1, ERK2, PTP, MKP, Tau, STMN1, cPLA2, MNK1/2, RSK2, CREB, Elk-1, Sap1a, c-Myc, SRF5 및 c-fos을 포함하는 군으로부터 선택되는 특이적 리간드, 수용체 및 하류 전사인자에 관한 것이다.

용어 "활성화 돌연변이"는 본 발명의 맥락에서 유전자 산물의 활성 증가를 유도하는 유전자의 뉴클레오티드 서열의 변경에 관한 것이다. 활성 증가는 유전자 산물의 증진된 효소적 활성, 연장된 반감기 또는 과다발현으로 인한 것일 수 있다.

용어 "SOX2의 전사적 조절 하에서의 유전자"는 본 발명의 맥락에서 SOX2가 동일한 세포에서 발현되지 않으면 제 1 발현 수준 그리고 SOX2가 동일한 세포에서 발현되면 제 2 발현 수준을 특징으로 하는 유전자에 관한 것이다. 제 1 발현 수준은 제 2 발현 수준보다 낮다. 특정 구현예에서, 저항성의 발생과 관련된 유전자는 Nanog, OCT4, FGF4, FBX15, FOXP4, KLF9, CD24, CD271, CD36, ITLN2, TNFSF12, NOX3, CLEC7A, ACYAP1, UNC5C, UNC5D, MUC16, VAV3, FOXD3, VGLL3, ALPP, C3, F2R, ENPP2, ETV4, NTNG1, NTRK2, ROBO1 및 ROBO2를 포함하는 군으로부터 선택된다.

특정 구현예에서, 본 발명은 암 환자에서 환자가 암의 치료에 효과적인 화학 물질 또는 화합물에 대한 저항성을 발생시킬 위험성을 갖는지 여부를 결정하는 세포-기반의 방법을 제공한다. 암은 과다-활성화된 신호전달 경로를 특징으로 하는 세포에 의해 특성화된다. 과다-활성화는 신호전달 경로에 작용하는 단백질을 인코딩하는 유전자의 활성화 돌연변이 또는 증폭에 의해 유발될 수 있다. 당업자라면 신호전달 경로의 과다-활성화가 NF1과 같은 신호전달 경로의 저해제를 인코딩하는 유전자의 억제하는 돌연변이 또는 결실에 의해 역시 유발될 수 있는 점을 인식한다. 화합물은 각각의 과다-활성화된 신호전달 경로의 저해제를 포함하는 조합 약제에서 암의 치료에 효과적이다.

이러한 관점에서, 본 발명자는 놀랍게도 돌연변이체 BRAF 및 MEK의 저해제 (본원에서 이하 종합적으로 MAPK 저해제, MAPKi으로 약칭됨)가 흑색종 세포에서 약물 적용 수시간 이내에 급성 전사 반응 (즉, 적응적 저항성 프로그램; ARP)을 유도하는 점을 관찰하였다. 이들 ARP는 SOX2-의존성 줄기 (stemness), 액손 안내 및 EMT (상피 대 중간엽 전이) 유전자의 전사 유도에 관여하고, 약물 내성 세포 풀의 생성을 유도한다 (도 1). 이들 약물 내성 세포가 장기간 획득된 저항성의 발생을 접종시킬 수 있다. 약물 내성 세포의 수는 SOX2의 siRNA 매개된 녹다운, 줄기의 대장 조절인자 및 MAPKi-유도된 ARP의 주요 구동인자에 의해 유의하게 감소될 수 있다 (도 2). 결론적으로, 임상적 맥락에서 MAPKi-유도된 SOX2를 약화시킴으로써 APR 유도를 막는 것은 치료적 가치가 매우 높아서 획득된 약물 저항성을 막고 이로써 임상적으로 사용된 MAPK 저해제의 내구성을 확장할 것이다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술적 및 과학적 용어 모두는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 공통적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 테스트에 사용될 수 있더라도, 적합한 방법 및 물질은 하기에 설명된다. 모순이 되는 경우, 정의를 포함하여 본 명세서가 통제할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 단지 설명적이며 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

본 발명의 양태는 추가적으로 본 발명의 구현예 및 이의 많은 장점의 더 나은 이해를 제공하는 다음의 도시적인 제한되지 않는 실시예에 의해 설명된다. 다음의 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 입증하도록 포함된다. 당업자라면 다음의 실시예에 개시된 기법이 본 발명에서 본 발명의 실행이 잘 기능하는데 사용된 기법을 나타내고, 따라서 이의 실행을 위해 바람직한 방식을 구성하도록 고려될 수 있는 것으로 이해해야 한다. 그러나, 당업자라면 본 발명에 비추어, 많은 변형이 개시되어 있는 특정한 구현예에 만들어지고, 본 발명의 정신 및 범주를 벗어나지 않고도 동일한 또는 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있는 점을 이해해야 한다.

달리 명시되지 않는 한, 재조합 유전자 기술학의 확립된 방법이, 예를 들면 Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001)에 기술된 바와 같이 사용되었고, 이는 본원에 이의 전문이 참고문헌으로 통합된다.

특허 출원, 제조사의 매뉴얼 및 과학 출판물을 포함하는 많은 문헌이 본원에 인용된다. 이들 문헌의 개시 내용은 본 발명의 특허가능성과 관련되어 고려되지 않는 한편, 본원에서 함께 이의 전문이 참고문헌으로 통합된다. 보다 구체적으로, 모든 언급된 문헌은 각각의 개별 문헌이 구체적으로 및 개별적으로 참고문헌으로 통합되도록 언급되는 것과 동일한 정도로 참고문헌으로 통합된다.

도 1은 RNA 시퀀싱에 의해 분석된 MAPKi로의 급성 처리 시 줄기 및 EMT 서명의 유도를 나타낸다. (A) A375-P 세포가 PLX4720 (BRAFi) 또는 DMSO로 6시간 동안 처리되었다. RNA가 분리되고, RNA 시퀸싱이 수행되었다. 분산 플롯이 ≥ 0.5 RPKM의 최소 정상화 농도로 모든 유전자를 나타낸다. 경로 분석을 위해 선택된 차별적으로 발현된 유전자 (DEG)를 전사 변화의 방향에 의존하여 적색 및 청색 점으로 나타낸다 (적색 유전자가 PLX4720 상에서 유도되고, 청색 유전자가 PLX4720 상에서 억압됨). (B) 막대 그래프가 분석된 DEG의 유의한 강화를 갖는 5개의 상위 경로를 나타낸다. 더 긴 막대가 더 강한 유의성을 나타낸다. (C) PLX4720으로의 처리 시 조절되지 않는 상위 유전자 (좌측 컬럼). PLX4720에 의해 유도된 및 억압된 상위 유전자를 개별 리스트에 나타낸다. (D) 표시된 세포주가 1 μM PLX4720 또는 0.01% DMSO (0시간째)로 표시된 시간 동안 처리되었고, 줄기/EMT와 관련된 선택된 유전자의 발현 변화가 qPCR에 의해 검증되었다. 모든 세포주가 BRAF 억제 시 유사한 적응적 유전자 프로그램을 발현하였다. 관찰된 데이타가 세 벌의 독립적인 생물학적 사본 ± SEM의 평균을 나타낸다. (E)(D)에 나타낸 것과 동일한 실험이 웨스턴 블럿 분석. 줄기 서열의 핵심 작동인자로서, SOX2 수준이 평가되었다. P-ERK1/2 수준이 양성 처리 대조군으로서 사용되었다. 전체 ERK1/2 수준이 로딩 대조군으로서 사용되었다. (F) A375-P 세포가 1 μM PLX4720, 0.5 μM AZD6244 (MEK1/2 저해제) 또는 0.01% DMSO로 표시된 시간 동안 처리되었고, SOX2 수준이 웨스턴 블럿 분석에 의해 평가되었다. BRAF의 억제 및 MEK1/2의 억제가 유사한 SOX2 수준을 유도하여, 이것이 종양원 유전자 MAPK 억제의 일반적인 특징임을 제시하고 있음에 주목한다. (G) A375-P 세포가 1 μM PLX4720 (BRAFi), 0.5 μM AZD6244 (MEKi), 약물 둘 다의 조합 또는 0.01% DMSO로 표시된 시간 동안 처리되었고, SOX2 수준이 웨스턴 블럿 분석에 의해 평가되었다. BRAFi 및 MEKi가 SOX2 수준에 미치는 비슷한 효과를 가졌고, 약물 둘 다의 조합은 약간 더 높은 SOX2 수준을 유도함을 주목한다. (H) A375-P 세포가 1 μM PLX4720 (BRAFi), 0.5 μM AZD6244 (MEKi), 약물 둘 다의 조합 또는 0.01% DMSO로 24시간 동안 처리되었고, 줄기/EMT와 관련된 선택된 유전자의 발현 변화가 qPCR에 의해 검증되었다. BRAFi 및 MEKi가 전사체 수준에 미치는 비슷한 효과를 가졌고, 약물 둘 다의 조합은 전사체 유도에 약간 더 효율적임을 주목한다. 모든 웨스턴 블럿의 경우, 개별 시간대가 적어도 두 번의 독립적인 실험으로 평가되었다. 예시적인 데이타를 나타낸다.
도 2는 MAPKi-유도된 항-증식성 효과로부터 SOX2의 보호 효과를 나타낸다. (A) A375-P 세포가 SOX2 표적하는 100 nM siRNA 또는 음성 대조군 siRNA 세포로 형질감염되었다. 다음으로 세포가 PLX4720 (BRAFi) 또는 DMSO로 48시간 동안 처리되었다. 수확 이전 2시간째, 세포가 순환하는 세포를 표지하도록 3 μM EdU로 펄스 처리되었다. EdU-양성 세포가 유세포 측정법을 사용하여 검출되었다. SOX2 녹다운이 BRAF가 활성을 가질 때 세포 증식에 미치는 효과가 전혀 없지만 (DMSO), BRAFi 조건에서는 약물 내성, 순환하는 세포 풀을 감소시킨다. 예시적인 데이타를 나타낸다. (B) 실험 (A)의 정량화. 각각의 조건의 경우, SOX2의 siRNA 녹다운 시 순환하는 세포의 백분율이 음성 대조군 siRNA으로 정상화되었다. 데이타가 세 벌의 독립적인 생물학적 사본 ± SEM의 평균을 나타낸다. (C) pTRIPZ-SOX2 벡터로 안정적으로 형질도입된 A375-P 세포가 표시된 농도의 독시사이클린으로 3일 동안 또는 1 μM PLX4720 (PLX)으로 24시간 동안 처리되었다. SOX2 과다발현이 웨스턴 블럿 분석에 의해 검증되었다. 라민 A가 로딩 대조군으로서 사용되었다. 개별 농도가 적어도 두 번의 독립적인 실험으로 평가되었다. 예시적인 결과를 나타낸다. (D) A375-P/pTRIPZ-대조군 또는 -SOX2 세포가 0 ng/mL (음성 대조군) 또는 50 ng/mL 독소사이클린으로 24시간 동안, 후속적으로 DMSO 또는 PLX4720으로 추가 48시간 동안 미리 처리되었다. 수확 이전 2시간째, 세포가 순환하는 세포를 표지하도록 3 μM EdU로 펄스 처리되었다. 관찰된 데이타는 독소사이클린이 없는 조건에서 순환하는 세포의 백분율로 정상화된다. 세 벌의 독립적인 생물학적 사본 ± SEM의 평균을 나타낸다. (E) A375-P/pTRIPZ-대조군 또는 -SOX2 세포가 0 ng/mL (음성 대조군) 또는 50 ng/mL 독소사이클린으로 24시간 동안, 후속적으로 PLX4720의 일련의 희석물로 추가 4일 동안 미리 처리되었다. 세포 생존도가 프레스토블루 검정법에 의해 평가되었고, IC₅₀ 값이 계산되었다. 독소사이클린이 pTRIPZ-대조군 세포 상에 미치는 효과가 전혀 없었지만 pTRIPZ-SOX2 세포에서는 생존 곡선을 우측으로 이동시키고, SOX2가 과다발현될 때 약물 민감도의 감소를 나타냄을 주목한다. IC₅₀ 값이 생존 곡선을 초과하여 진술된다. 관찰된 데이타가 DMSO-처리된 세포로 정상화된다. 오차 막대가 세 번의 독립적인 실험의 SEM을 나타낸다. (F) A375-P/pTRIPZ-대조군 또는 -SOX2 세포가 0 ng/mL (음성 대조군) 또는 50 ng/mL 독소사이클린으로 24시간 동안, 후속적으로 DMSO 또는 PLX4720로 추가 48시간 동안 미리 처리되었다. 생존 신호전달이 웨스턴 블럿에 의해 평가되었다. S6K 및 BAD을 통한 생존 신호전달은 PLX4720에 의해 억압되지만, SOX2이 독소사이클린 처리에 의해 과다발현될 때 구출된다.
도 3은 화합물 웰 할당의 열 지도를 나타낸다. neg: DMSO; pos: 5 μM 엔티노스타트; c: 5 μM 테스트 화합물; r1: 1 μM 엔티노스타트; r3: 3 μM 엔티노스타트; r10: 10 μM 엔티노스타트.
도 4는 고유의 형광 fl2 및 fl3, 뿐만 아니라 비율 y를 보여주는 대조군 웰의 로그-형질전환된 신호를 나타낸다. y-축 스케일링은 1% 내지 99% 분위수이다.
도 5는 정상화 이전 및 이후 (norm) 대조군 웰의 로그-형질전환된 신호 (y)를 나타낸다. y-축 스케일링은 1% 내지 99% 분위수이다.
도 6은 처음 4개의 플레이트에 대한 미가공 신호 대비 행 또는 열의 번호를 나타낸다. 시스템의 행 또는 열 효과가 존재하는 경우 식별될 수 있다.
도 7은 처음 4개으 플레이트에 대한 정상화 신호 (A, B) 및 기학학-교정된 신호 (C, D) 대비 행 (A, C) 또는 열 번호 (B, D)를 나타낸다. 시스템의 행 또는 열 효과가 더 가시적이어서는 안된다.
도 8은 대조군 및 화합물의 분포를 나타낸다. (A) 경험적인 확률 밀도, (B) 분위수-분위수 플롯, (C) 플레이트-방향 MAD 대 플레이트-방향 중앙값, (D) P-값 분포 (PVD). 규칙적인 PVD가 2개의 구분된 모양을 갖을 수 있다: (i) DEG가 없으면 일정하고 (밀도 = 1에서 편평기), (ii) 작은 p 값에서 피크 및 p -> 1의 경우 편평기 < 1; 편평기 값은 DEG의 비율에 해당한다. 임의의 다른 모양은 불규칙하고, 민감도가 모델 가정의 위반을 나타낸다.
도 9는 모든 웰의 볼케이노 플롯이 거짓 발견율 (FDR)의 음성 로그로서 표현되는 테스트의 유의성 및 변화 배수의 로그로서 표현되는 효과 크기 사이의 관련성을 보여주는 점을 나타낸다. 수평선이 FDR = 0.01에 해당하고, 이 선 아래의 cpd가 '유의하지 않음'으로 표시된다. 두 개의 수직선이 활성에서 0.5의 변화에 해당하고, 이러한 범위 외부의 cpd가 '강함'으로 표시된다.

실시예 1: 저항성의 발생을 결정하는 방법

1. 종양 절편의 준비 및 생체외 처리

잉여 종양 조직은 프로세싱 이전에 차가운 무-혈청 RPMI 1620 글루타맥스에서 4℃로 최대 24시간 동안 저장되었다. 큰 생검이 약 1 cm 최대 직경으로 재단되었다.

50 mL 팔콘 튜브가 40 mL 표시에서 절단되었고, 바닥 부분이 제거되었다. 생검이 단절된 팔콘 튜브의 입구 부분 내에 놓여졌다. 튜브가 45 mL 표시까지 액체 4% 저온 아가로스 (SeaPlaque Agarose, Lonza)로 충전되었다. 아가로스는 얼음 위에서 고체화되도록 방치되었다.

일단 고체화되면, 아가로스 블록이 팔콘 튜브로부터 제거되었고, 직사각형으로 재단되었다. 약 2 mm의 아가로스가 조직 생검의 좌측 및 우측으로부터 남았다. 약 5 mm의 아가로스가 조직 생검의 정상 및 바닥으로부터 남게 하여 조직이 절단 과정 동안 아가로스로부터 빠져나가는 것을 막았다.

재단된 아가로스 블록이 바이브라톰 (Leica VT1000 S 진통 칼 마이크로톰)의 표본 집게 위에 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 부착되었고, 실온에서 건조되었다. 일단 건조되면, 표본 집게가 완충액 트레이 내로 유입되었고, 완충액 트레이는 얼음 수조 트레이에 장착되었다. 완충액 트레이가 얼음 냉각된 PBS로 충전되었다. 생검이 400 μm 두게의 절편으로 대략 0.30 mm/s의 속도 및 약 0.70 mm의 진동 진폭에서 절단되었다.

1× 항생제-안티마이코틱 (집코사) 및 10% FCS 포함하는 1 mL PRMP 1620 글루타맥스가 6웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가되었다. 하나의 밀리셀 인서트 (밀리셀 세포 배양 인서트, 30 mm, 친수성 PTFE, 0.4 μm)가 각각의 웰 내에 전달되었다. 여러 개의 절편이 하나의 밀리셀 인서트 상에 전달되었다. 절편이 습윤화된 세포 배양 배양기 (21% O₂, 5% CO₂)에서 유지되었고, 회복되도록 24시간 동안 방치되었다.

회복 이후에, 밀리셀 인서트가 1 mL PRMP 1620 글루타맥스 (1× 항생제-안티마이코틱 (집코사), 10% FCS) 및 0.01% DMSO (대조군 생검의 경우) 또는 0.5 μM 셀루메티닙 (처리 생검의 경우) 둘 중 하나를 포함하는 6-웰 플레이트 상의 웰 내로 전달함으로써 헹구어졌다.

다음으로 인서트가 1 mL PRMP 1620 글루타맥스 (1× 항생제-안티마이코틱 (집코사), 10% FCS) 및 0.01% DMSO (대조군 생검의 경우) 또는 0.5 μM 셀루메티닙 (처리 생검의 경우) 둘 중 하나를 포함하는 신선한 웰 내로 전달되었다. 생검이 습윤화된 세포 배양 배양기에서 16시간 내지 48시간 동안 배양되었다.

2. 종양 절편의 유전자 발현 분석

유전자 발현을 분석하기 위하여, 종양 절편이 2.0 mL 에펜도르프 세이프-락 마이크로원심분리 튜브 (둥근 바닥) 내에 무균 쪽집게를 사용하여 전달되었고, 무게가 측정되었으며, 액체 질소에서 순간 동결되어 추가 사용까지 -80℃에 저장되었다. RNA가 조직 무게에 의존하여 RNeasy 미니 또는 마이크로 키트 (Qiagen)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 분리되었고, 10 내지 30 μL RNase가 없는 물에서 용출되었으며, -80℃에 저장되었다. RNA 농도 및 순도가 나노드롭 2000 (Thermo Scientific)을 사용하여 분광광도법으로 결정되었다. RNA가 고성능 cDNA 역전사 키트 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 cDNA로 역전사되었다. 20 μL 반응마다 다음의 믹스가 로슈 라이트사이클러 480 멀티웰 플레이이에 준비되었다: 3 μL 물, 1 μL의 5 μM 전방 프라이머, 1 μL의 5 μM 역방 ㅍ프라이머, 10 μL 라이트사이클로 480 SYBR 그린 I 마스터 (2×) 또는 KAPA SYBR® FAST qPCR 키트, 5 μL cDNA [5 ng/μL]. 시료가 두 벌씩 피펫팅되었다. 96-웰 플레이트가 2000 rpm에서 1분 동안 원심분리되었고, 표준 qRT-PCR 프로토콜을 사용하여 라이트사이클러 480 기기 (Roche) 상에 45 주기로 전개되었다. 상대적 유전자 발현 수준이 △△Ct 방법 {Livak:2001is}을 사용하여 계산되었고, GAPDH, TBP 또는 HPRT로 정상화되었다.

단기간 생체외 셀루메티닙 처리 이후에 종양 절편이 동일한 종양 생검으로부터의 대조군-처리된 절편과 비교하여, SOX, Nanog, OCT4, FGF4, FBX15, FOXP4, KLF9, CD24, CD271, CD36, ITLN2, TNFSF12, NOX3, CLEC7A, ACYAP1, UNC5C, UNC5D, MUC16, VAV3, FOXD3, VGLL3, ALPP, C3, F2R, ENPP2, ETV4, NTNG1, NTRK2, ROBO1 및 ROBO2를 포함하는 군으로부터 선택되는 바 저항성의 발생과 관련된 유전자를 더 많이 발현하는 환자는 셀루메티닙-기반의 암 요법에 대한 저항성을 발생시킬 수 있다.

3. 종양 절편의 면역조직화학적 분석

조직 절편에 대한 손상을 막기 위하여, 절편을 니트로셀룰로스 막의 작은 스트립을 사용하여 밀리셀 인서트 외부로 올렸다. 조직 절편을 갖는 스트립이 다음으로 4% 파라포름알데히드로 전달되었다. 24시간 이후에, 니트로셀룰로스 막-부착된 종양 절편이 70% 에탄올로 이동되거나 직접적으로 파라핀에 포매되어 표준 프로토콜에 따라 분절되었다. 파라핀 분절이 압력 쿠커를 사용하여 EDTA 완충액 (pH 9) (Dako S2367)에서 98℃로 20분 동안 처리되었다. 분절은 퍼옥시다제 블록 (Dako S2023)으로 10분 동안 차단되었고, 희석 완충액 (Dako S2022)으로 2 μg/mL까지 희석된 항-SOX2 항체 (sc365823)와 1시간 동안 배양되었으며, 이차 항체 (Envision Mouse, Dako K4001)와 30분 동안 배양되었다. 모든 단계가 실온에서 수행되었다. 핵 계수 염색이 Gill Ⅱ (Merck 1051752500)에 따라 변형된 헤마톡실린 용액을 사용하여 2초 동안 수행되었다. 탈수 이후에 슬라이드가 Tissue-Tek 필름 커버슬리퍼 (Sakura, 4742)를 사용하여 커버슬립되었다.

단기간 생체외 셀루메티닙 처리 이후에 종양 절편이 동일한 종양 생검으로부터의 대조군-처리된 절편과 비교하여 SOX2를 더 많이 발현하는 환자는 셀루메티닙-기반의 암 요법에 대한 저항성을 발생시킬 수 있다.

실시예 2: 저항성 저해제와 조합하여 암을 치료하는데 사용되는 화학적 화합물

1. 선별검사 및 획득

1일째, A375 세포가 10% FCS 및 2 mM L-글루타민이 보충된 DMEM을 넣은 384-웰 플레이트 내에 웰 당 1,400개 세포로 접종되었다. 플레이트는 습윤화된 세포 배양 배양기 (21% O₂, 5% CO₂)에서 유지되었고, 회복되도록 16시간 동안 방치되었다. 2일째, 세포가 각각 최종 농도 1 μM 및 0.5 μM를 갖는 PLX4720 및 AZD6244로 처리되었다. 동시에, 세포가 최종 농도 5 μM을 갖는 FDA-승인된 약물의 라이브러리 (표 1)로 처리되었다. 플레이트는 습윤화된 세포 배양 배양기 (21% O₂, 5% CO₂)에서 유지되었고, 회복되도록 24시간 동안 방치되었다. 3일째, 플레이트가 PBS로 3번 세척되었고, 최종 농도 2% PFA로 실온에서 10분 동안 고정되었다. 플레이트가 PBS로 세 번 세척되었고, (PBS에서) 최종 농도 0.2% 트리톤-X으로 4℃에서 10분 동안 배양되었다. 플레이트가 PBS로 세 번 세척되었고, (PBS에서) 최종 농도 0.2% 트리톤-X으로 4℃에서 10분 동안 배양되었다. 플레이트가 PBS로 세 번 세척되었고, (PBS에서) 최종 농도 1% 글리신으로 4℃에서 10분 동안 배양되었다. 플레이트가 PBS로 세 번 세척되었고, (0.05 % 트윈 20/PBS에서) 최종 농도 0.8 μg/mL Sox-2 항체 (SantaCruz, E-4, sc-365823)와 밤새 배양되었다. 4일째, 플레이트가 PBS로 세 번 세척되었다. 플레이트가 (CMF-PBS + 0.05 % 트윈 20/PBS으로 희석된) 최종 농도 2 μg/mL 이차 항체 (A-11029, 염소 항-마우스 알렉사-488, 2 mg/mL)와 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 플레이트가 PBS로 세 번 세척되었고, 최종 농도 6.7 μg/mL 프로피듐 요오드 및 0.2 mg/mL Rnase A와 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 1시간 후에 플레이트가 아큐멘 셀레스티아 (TTP Labtech)로 판독되었다. 이를 위해 형광단이 488 nm에서 여기되었고, 신호가 FL3 (핵 염색) 및 FL2 (이차 항체)에서 측정되었다. 선별검사는 두 벌로 1개월 이내에 전개되었다.

2. 사전 프로세싱

플레이트 간의 세스템 상의 다양성은 표준 정상화 절차 (Malo, Nat Biotech, 2006)에 의해 제거된다. 공통적인 실행 이후에, 검정 품질이 Z' 팩터를 기초로 하여 평가된다. 플레이트 내의 행-방향 또는 열-방향 스트립 양상뿐만 아니라 가장자리 효과가 플레이트 준비 동안 일어날 수 있다. 이들 양상이 터키의 중앙값 연마 방법 (Tukey, Reading Massachusetts: Addison-Wesley, 1977)을 사용하여 또는 뢰스 함수를 사용한 평면 다항 (Boutros, Genome Biology, 2006)을 차감함으로써 제거된다.

3. 차별적인 활성 분석

차별적인 활성은 프러머 등 (Prummer, J Biomol Screen, 2012)에 도시된 워크플로우를 따라가며 분석되었다. 간략하게, 화합물의 각각의 단일-용량 측정을 위해, Z-테스트가 이의 활성이 음성 대조군과 구별되지 않는 무효 가설에 대항하여 수행된다. 이것이 유효하기 위해, 음성 대조군의 활성 분포가 정상인지 검토된다. 분포의 평균 및 분산이 각각의 플레이트에 대해 굳게 추정되고, 적절한 경우 연속적인 플레이트의 범위를 넘어 평면적으로 평균화된다.

절반-자동화된 워크플로우가 R environment for statistical computing (Huber, Nat Methods, 2015)에서 실행된다.

Claims

암 또는 종양 세포가 화학 물질에 대한 저항성을 발생시킬 것인지 여부의 결정 방법으로서, 다음의
a) 암으로 진단된 피험자로부터 획득된 암 또는 종양 세포를 포함하거나 이로 구성된 하나 이상의 시료(들)의 화학 물질에 대한 노출 단계로서, 상기 암으로 진단된 피험자가 상기 화학 물질로 이전에 투여된 적이 없는, 단계;
b) 상기 a)에 사용된 하나 이상의 시료(들)에서 암 약물 저항성의 발생과 관련된 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계;
c) 상기 a)에 사용된 화학 물질에 노출되지 않은 암으로 진단된 상기 피험자로부터의 상기 하나 이상의 시료(들)에서 상기 b)에서와 동일한 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계:를 포함하고,
상기 c)에서 결정된 발현 수준과 비교하여 상기 b)에서 결정된 발현 수준의 상승은 상기 시료에 포함된 암 또는 종양 세포에 의한 상기 화학 물질에 대한 저항성의 발생을 나타내는, 방법.
암으로 이전에 진단된 피험자가 상기 암을 치료하는데 사용된 화학 물질에 대한 저항성을 발생시킬 것인지 여부를 결정하는 방법으로서, 다음의
a) 상기 암으로 진단된 피험자로부터 획득된 암 또는 종양 세포를 포함하거나 이로 구성된 하나 이상의 시료(들)의 화학 물질에 대한 노출 단계로서, 상기 암으로 진단된 피험자가 상기 화학 물질로 이전에 투여된 적이 없는, 단계;
b) 상기 a)에 사용된 하나 이상의 시료(들)에서 암 약물 저항성의 발생과 관련된 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계;
c) 상기 a)에 사용된 화학 물질에 노출되지 않은 암으로 진단된 상기 피험자로부터의 상기 하나 이상의 시료(들)에서 상기 b)에서와 동일한 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계:를 포함하고,
상기 암으로 진단된 피험자는 상기 하나 이상의 시료(들)을 획득하기 이전에 상기 a)에 사용된 화학물질로 투여된 적이 없으며, 상기 c)에서 결정된 발현 수준과 비교하여 상기 b)에서 결정된 발현 수준의 상승은 상기 환자에 의한 상기 화학 물질에 대한 저항성의 발생을 나타내는, 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 하나 이상의 시료(들)은 생검에 의해 획득되는, 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 시료는 혈액에서 순환하는 종양 세포로부터 획득되는, 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 저항성의 발생과 관련된 유전자는 SOX2, Nanog, OCT4, FGF4, FBX15, FOXP4, KLF9, CD24, CD271, CD36, ITLN2, TNFSF12, NOX3, CLEC7A, ACYAP1, UNC5C, UNC5D, MUC16, VAV3, FOXD3, VGLL3, ALPP, C3, F2R, ENPP2, ETV4, NTNG1, NTRK2, ROBO1 및 ROBO2로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자인, 방법.
제 5항에 있어서,
상기 저항성의 발생과 관련된 유전자는 SOX2인, 방법.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 암은 비-흑색종 피부암, 식도위 샘암종, 교아세포종, 방광암, 방광 요로상피 암종, 식도위암, 흑색종, 비-소세포 폐암, 자궁내막암, 자궁 샘암종, 식도 편평세포 암종, 유방암, 두경부 편평세포 암종, 배아세포 암종, 소세포 폐암, 난소암, 연조직 육종, 간세포 암종, 결장직장 샘암종, 자궁 편평세포 암종, 담낭암종, 전립샘암, 상부관 요로상피 암종, 확산성 교아종, 결장직장암, 팽대 암종, 부신피질 암종, 두경부암, 신장 투명세포 암종, 간담낭암, 교아종, 비-호지킨 림프종, 중피종, 침샘암, 신장 비-투명세포 암종, 분류되지 않은 신경상피 종양, 크롬친화 세포종, 흉선 종양, 다발성 골수종, 신장 세포 암종, 골암, 췌장암, 백혈병, 말단 신경계 종양, 갑상샘암, B-림프모세포 백혈병, 단일클론 B-세포 림프구증가증, 림프종, 털세포 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 윌름 종양 구체적으로 흑색종 및 비-소세포 폐암인, 방법.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 화학 물질은 수용체 타이로신 키나제 (RTK)의 저해제, EGFR 경로의 저해제 (EGFRi) 또는 MAPK 경로의 저해제 (MAPKi)이고, 바람직하게 상기 MAPKi는 B-Raf의 저해제 (BRAFi), MEK의 저해제 (MEKi) 또는 ERK의 저해제 (ERKi)인, 방법.
제 8항에 있어서,
i) 상기 BRAFi는 베무라페닙, 다브라페닙, 엔코라페닙, LGX818, PLX4720, TAK-632, MLN2480, SB590885, XL281, BMS-908662, PLX3603, RO5185426, GSK2118436 또는 RAF265이고/거나,
ii) 상기 MEKi는 AZD6244, 트라메티닙, 셀루메티닙, 코비메티닙, 비니메티닙, MEK162, RO5126766, GDC-0623, PD 0325901, CI-1040, PD-035901, 하이포테마이신 또는 TAK-733이고/거나,
iii) 상기 ERKi는 울릭세르티닙, 코리녹세인, SCH772984, XMD8-92, FR 180204, GDC-0994, ERK5-IN-1, DEL-22379, BIX 02189, ERK 저해제 (CAS 번호 1049738-54-6), ERK 저해제 Ⅲ (CAS 번호 331656-92-9), GDC-0994, 호노키올, LY3214996, CC-90003, 델토닌, VRT752271, TIC10, 아스트라갈로시드 Ⅳ, XMD8-92, VX-11e, 모그롤 또는 VTX11e이고/거나,
iv) 상기 EGFRi는 세툭시맙, 파니투무맙, 잘루투무맙, 니모투주맙, 마투주맙, 제피티닙, 에를로티닙, 라파티닙, 네라티닙, 반데타닙, 네시투무맙, 오시메르티닙, 아파티닙, AP26113, EGFR 저해제 (CAS 번호 879127-07-8), EGFR/ErbB-2/ErbB-4 저해제 (CAS 번호 881001-19-0), EGFR/ErbB-2 저해제 (CAS 번호 179248-61-4), EGFR 저해제 Ⅱ (BIBX 1382, CAS 번호 196612-93-8), EGFR 저해제 Ⅲ (CAS 번호 733009-42-2), EGFR/ErbB-2/ErbB-4 저해제 Ⅱ (CAS 번호 944341-54-2) 또는 PKCβⅡ/EGFR 저해제 (CAS 번호 145915-60-2)인, 방법.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 화학 물질에 대한 저항성을 발생시킬 것으로 결정된 환자에서 암을 치료하는데, 제 2 화학 물질과 조합하여 사용되는 화학 물질로서, 상기 제 2 화학 물질은 암 약물 저항성의 발생과 관련된 유전자의 발현을 억제하는, 화학 물질.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 하나 이상의 화학 물질에 대한 저항성을 발생시킬 것으로 결정된 환자를 상기 화학 물질 또는 물질들에 대한 암 약물 저항성의 발생과 관련된 하나 이상의 유전자의 발현을 억제하는 추가의 화학 물질과 조합하여 치료하는데 사용되는 화학 물질.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 암 또는 종양 세포에서 암 약물 저항성을 유도할 것으로 결정된 하나 이상의 화학 물질 및 상기 제 1 화학 물질에 대한 암 약물 저항성의 발생과 관련된 하나 이상의 유전자의 발현을 억제하는 추가의 화학 물질의 조합을 포함하는 산물.
제 10항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 암은 비-흑색종 피부암, 식도위 샘암종, 교모세포종, 방광암, 방광 요로상피 암종, 식도위암, 흑색종, 비-소세포 폐암, 자궁내막암, 자궁 샘암종, 식도 편평세포 암종, 유방암, 두경부 편평세포 암종, 배아세포 종양, 소세포 폐암, 난소암, 연조직 육종, 간세포 암종, 결장직장 샘암종, 자궁 편평세포 암종, 담낭 암종, 전립샘암, 상부관 요로상피 암종, 확산성 교아종, 결장직장암, 팽대 암종, 부신피질 암종, 두경부암, 신장 투명세포 암종, 간담낭암, 교아종, 비-호지킨 림프종, 중피종, 침샘암, 신장 비-투명세포 암종, 분류되지 않은 신경상피 종양, 크롬친화 세포종, 흉선 종양, 다발성 골수종, 신장 세포 암종, 골암, 췌장암, 백혈병, 말단 신경계 종양, 갑상샘암, B-림프모세포 백혈병, 단일클론 B-세포 림프구증가증, 림프종, 털세포 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 윌름 종양 구체적으로 흑색종 및 비-소세포 폐암인, 화학 물질 및 산물.
제 10항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 화학 물질은 수용체 타이로신 키나제 (RTK)의 저해제, EGFR 경로의 저해제 (EGFRi), MAPK 경로의 저해제 (MAPKi) 또는 암의 면역요법에 사용된 제제이고, 바람직하게 상기 MAPKi는 B-Raf의 저해제 (BRAFi), MEK의 저해제 (MEKi) 또는 ERK의 저해제 (ERKi)인, 화학물질 및 산물.
제 14항에 있어서,
i) 상기 BRAFi는 베무라페닙, 다브라페닙, 엔코라페닙, LGX818, PLX4720, TAK-632, MLN2480, SB590885, XL281, BMS-908662, PLX3603, RO5185426, GSK2118436 또는 RAF265이고/거나,
ii) 상기 MEKi는 AZD6244, 트라메티닙, 셀루메티닙, 코비메티닙, 비니메티닙, MEK162, RO5126766, GDC-0623, PD 0325901, CI-1040, PD-035901, 하이포테마이신 또는 TAK-733이고/거나,
iii) 상기 ERKi는 울릭세르티닙, 코리녹세인, SCH772984, XMD8-92, FR 180204, GDC-0994, ERK5-IN-1, DEL-22379, BIX 02189, ERK 저해제 (CAS 번호 1049738-54-6), ERK 저해제 Ⅲ (CAS 번호 331656-92-9), GDC-0994, 호노키올, LY3214996, CC-90003, 델토닌, VRT752271, TIC10, 아스트라갈로시드 Ⅳ, XMD8-92, VX-11e, 모그롤 또는 VTX11e이고/거나,
iv) 상기 EGFRi는 세툭시맙, 파니투무맙, 잘루투무맙, 니모투주맙, 마투주맙, 제피티닙, 에를로티닙, 라파티닙, 네라티닙, 반데타닙, 네시투무맙, 오시메르티닙, 아파티닙, AP26113, EGFR 저해제 (CAS 번호 879127-07-8), EGFR/ErbB-2/ErbB-4 저해제 (CAS 번호 881001-19-0), EGFR/ErbB-2 저해제 (CAS 번호 179248-61-4), EGFR 저해제 Ⅱ (BIBX 1382, CAS 번호 196612-93-8), EGFR 저해제 Ⅲ (CAS 번호 733009-42-2), EGFR/ErbB-2/ErbB-4 저해제 Ⅱ (CAS 번호 944341-54-2) 또는 PKCβⅡ/EGFR 저해제 (CAS 번호 145915-60-2)이고/이거나,
v) 상기 면역요법에 사용된 제제는 CD52, PD-L1, CTLA4, CD20 또는 PD-1을 표적하는 제제로서, 상기 화합물과 조합하여 사용될 수 있고, 예를 들면 알렘투주맙, 아테졸리주맙, 이필리무맙, 니볼루맙, 오파투무맙, 펨브롤리주맙, 리투지맙을 포함하는 제제인, 화학물질 및 산물.
제 10항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 암 약물 저항성의 발생과 관련된 유전자의 발현을 억제하는 상기 제 2 화학 물질은 SOX2, Nanog, OCT4, FGF4, FBX15, FOXP4, KLF9, CD24, CD271, CD36, ITLN2, TNFSF12, NOX3, CLEC7A, ACYAP1, UNC5C, UNC5D, MUC16, VAV3, FOXD3, VGLL3, ALPP, C3, F2R, ENPP2, ETV4, NTNG1, NTRK2, ROBO1 및 ROBO2로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자인, 화학 물질 및 산물.
제 16항에 있어서,
상기 저항성의 발생과 관련된 유전자는 SOX2인, 화학 물질 및 산물.
제 10항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제 2 화학 물질은 세트리모늄 브롬화물, 이다루비신 염산, 네라티닙 (hki-272), 벤질 이소티오시아네이트, 보리노스타트, 에메틴 이염산, 다우노루비신 염산, 닥티노마이신, 퀴시노스타트 (jnj26481585), 니클로스아미드, 독소루비신, pci-24781 (아벡시노스타트), 라나토시드 C, 파노비스타트 (lbh589), 살리노마이신 소듐, 브록살딘, 테니포시드, 프라시노스타트 (sb939), 아자시티딘, 호모하링토닌, 아크리소르신, 톨로늄 염산, 라도티닙, 아모디아퀸 이염산, 벤제토늄 염화물, 쉬다미드, cudc-101, 셀라멕틴, 테트란드린, 벨리노스타트 (pxd101), 에트라비린 (tmc125), 암시노니드, 옥시벤다졸, 아세틸-1-류신, 클로로옥신, 나파부카신, 레스미노스타트, 이독수리딘, 티오구아닌, 사이클로헥시미드, 트리플루리딘, 베타메타손 17 및 21, 디프로피오네이트, 도비티닙 (tki-258) 이젖산, 콜히친, 모세티노스타트 (mgcd0103), 수니티닙, 펠리티닙 (ekb-569), 피마반세린, 에플록세이트, tg101348 (sar302503), 클로베타솔 프로피오네이트, 메틸프레드니솔론 소듐 숙시네이트, 디클로리손 아세테이트, 알벤다졸, 엔티노스타트 (ms-275), 플루니솔리드, 아르테니몰, 아미나크린, 플루메타손, 로실리노스타트 (acy-1215), 브로노폴, 그라미시딘 (그라미시딘 a 도시), 아바멕틴 (아버멕틴 b1a 도시), 디설피람, 디플루프레드네이트, 아세트리아조산, 이소플루프레돈 아세테이트, ly2835219, 퍼헥실린 말레이트, 메테르골린, 포르메스탄, 모넨신 소듐, 플록수리딘, 프레드니카르베이트, 덱사메타손 소듐 포스페이트, 레플루노미드, 할로베타솔 프로피오네이트, 시롤리무스, 이프리플라본, 닌테다닙 (bibf 1120), 피르비늄 파모에이트, 루플록사신 염산, 포스브레타불린 (콤브레타스타틴 a4 포스페이트 (ca4p)), 디소듐 트리암시놀론 디아세테이트, 오테나반트 (cp-945598) 염산, 아프로티닌, 플루티카손 프로피오네이트, 아무바티닙 (mp-470), 메틸벤제토늄 염화물, 펜벤다졸, 부피발케인 염산, 베타메타손, 플루메타존 피발레이트, 티오구아닌, 테가세로드 말레이트, 프레드니솔론 아세테이트, 클로린디온, 하이드로코르티손 헤미숙시네이트, 덱사메타손 아세테이트, 플루드로코르티손 아세테이트, 이버멕틴, 프로플라빈 헤미설페이트, 란소프라졸, 세르둘라티닙 (prt062070, prt2070), 살리펀진, 할시노니드, 푸도스테인, 터페나딘, 플루오시노니드, 헥세티딘, 아르테수네이트, 플루오시놀론 아세토니드, 리팜핀, 트리암시놀론, 졸피뎀, 에토프로파진 염산, 레고라페닙 (bay 73-4506), 테라조신 염산, 탄쉬논 iia-설폰 소듐, 노코다졸, 트리클로산, 클로피돌, 소라페닙 토실레이트, 설피소미딘, 메틸렌블루, 크리조티닙 (pf-02341066), 프로실라리딘 a, 덱시부프로펜, 트리플루프로마진 염산, 피리베딜 염산, 카르모퍼, 스워티아마린, 설타미실린 토실레이트, 진세노시드 rc, 에토피브레이트, 세틸피리디늄 염화물, 라베프라졸 소듐, 알리자프리드 염산, 메틸 아미노레불리네이트 염산, 토피록소스타트, 디소듐 클로드로네이트 테트라하이드레이트, 아목사핀, 베타퀼린 (tmc207; r207910), 옥테니딘, 에카베트 소듐, 아피제닌, 글리코피롤레이트 요오드, 소듐 몬트모릴로나이트, 하이드로코르티손, 바르바딘, CCS1477, SGC-CBP30, CPI-637, PF-CBP1, ICG, 001, PRI-724, A-485, C646, 4-메틸티오-2-옥소부티르산 (MTOB), HIPP 유도체, 고리 펩티드 CP61, NSC95397, 2-(하이드록시이미노)-3-페닐프로판산 및 이의 4-클로로 및 3-클로로 유사체, MLN4924, AS1842856, JIB-04, EP-5676, N-옥살릴글리신 (NOG), 피리딘-2,4-디카르복실레이트 (2,4-PDCA), 플라디네오리드 B, IDC16, CBL0137, 디포페인, R18로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화학 물질 및 산물.