KR20200083974A - 허혈 치료용 헤파린 조성물 - Google Patents

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KR20200083974A
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heparin
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린 엘.에이치. 황
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엑셀 메드, 엘엘씨
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Abstract

코어 구성요소 및 매트릭스 구성요소를 포함하는 허혈성 조직을 치료하기 위한 약제학적 조성물에 있어서, 상기 코어 구성요소는 헤파린 또는 이의 유도체를 포함하고, 상기 매트릭스 구성요소는 히알루로난 또는 이의 유도체를 포함하며, 상기 약제학적 조성물의 점도는 10 mPa·s를 초과하는, 약제학적 조성물.

Description

허혈 치료용 헤파린 조성물
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 2017 년 9 월 5 일자로 출원된 미국 가 특허 출원 제 62/554,101 호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 내용은 본원에 참고로 포함된다.
허혈 시에는 장기 또는 조직의 혈액 함량이 감소된다. 허혈은 전신성 빈혈의 국소적 발현 또는 국소적 혈액 순환 장애의 결과일 수 있다. 허혈의 유형은 하기를 포함한다: 1) 예를 들어, 혈관 내강의 협착 또는 폐색을 유발하는 종양, 타이트한 붕대, 및 삼출(effusion)로 인한 동맥 혈관 상의 압력에 의해 압박 허혈(compression ischemia)이 야기될 수 있다. 임상적으로, 장기적인 와상(lying) 시 형성되는 치질이나 궤양은 측혈관의 압박으로 인한 허혈에 의해 야기되는 조직 괴사의 경우이며, 이는 근육 손상을 유발할 수 있다. 2) 동맥 혈전증(arterial thrombosis) 또는 색전증(embolism)으로부터 야기되는 폐쇄성 허혈(obstructive ischemia)은 혈관 폐색(vascular occlusion)을 유발할 수 있으며, 이는 예를 들어 사지 또는 심장으로의 혈액 공급을 차단하게 된다. 3) 다량의 혈액이 복부 장기 내로 신속히 이동하여 다른 장기 및 조직의 허혈을 유발함으로써 측부 사지 허혈(lateral limb ischemia)을 야기할 수 있다.
하지 말초 동맥 질환을 가진 환자는 주로 60 세 이상의 사람들로서, 이들 환자의 약 절반 정도는 당뇨병을 지니고 있다. 현재, 허혈성 하지에 대한 혈관신생 치료법들(angiogenesis treatment)이 일반인들에 제공되고 있다. 예를 들어, AutoloGel 시스템은 환자의 자가 고농도 혈소판-풍부 플라스마(autologous high-concentration plate-rich plasma; PRP)를 추출 후, 상처 치유를 촉진하는 성장 인자 및 젤라틴성 물질을 형성하는 사이토카인을 첨가하여 제조한 창상 피복재(wound dressing)이다. 그러나, 이러한 치료법들은 단지 만성 상처의 치료에만 사용되지만, 이들 치료법으로 기저의 허혈을 치료할 수는 없으며, 혈관 폐색의 문제를 해소하기 위해서는 우회로 이식(bypass grafting), 혈관확장, 및 혈관 스텐트(vascular stents)의 설치와 같은 다른 치료법들이 필요하다.
허혈성 하지에 대한 많은 연구의 결과로, 혈관신생 치료제(예; 혈관신생 신호전달(angiogenic signaling)과 관련된 사이토카인) 또는 재조합 성장 인자(예; 혈관신생을 자극하는 VEGF 및 FGF)가 활발하게 개발되고 있다. 혈소판-유래 성장 인자(PDGF)는 발생 중 또는 성체의 조직에서 중간엽 세포 증식, 이동, 및 분화를 자극하는 것으로 확인되었으며, 환자의 골수로부터 내피-유래 세포(endothelial-derived cells)의 방출을 촉진하여 혈관 증식을 하는 데 사용된다. 인간 제대 정맥 내피 세포(Human umbilical vein endothelial cells; HUVEC)는 또한 혈관신생을 자극하는 혈관신생 신호전달(angiogenic signaling)에 직접 관련되는 물질에 의해 자극될 수 있다. 조직 플라스미노겐 활성화제(tissue plasminogen activator; tPA) 및 HUVEC을 사용하는 치료법은, 치료 효과를 얻기 위해 골수로부터 혈관으로 이동하여 혈관 내피의 회춘(rejuvenation)을 촉진하는 내피 전구 세포(endothelial progenitor cells)의 수를 증가시킬 목적으로 제공된다.
상기 언급된 혈관신생의 직접적인 촉진에 이어서, 헤파린을 폴리(락트-코-글리콜산)(poly(lactic-co-glycolic acid); PLGA) 나노입자로 처리하여 치료적 혈관신생(therapeutic angiogenesis)을 달성할 수 있음이 연구에 의해 확인되었다. 그의 역할은 약물의 지연 방출에 의해 혈관신생-관련 성장 인자의 발현을 자극하는 것이다. 헤파린(미분획 헤파린(unfractionated heparin)으로도 알려짐), 분획 헤파린(fractionated heparin)(저분자량 헤파린으로도 알려짐), 및 이의 저분자량 유도체(예를 들어, 에녹사파린(enoxaparin), 달테파린(dalteparin), 및 틴자파린(tinzaparin))은 심부 정맥 혈전증(deep vein thromboses) 및 폐 색전증(pulmonary emboli)의 예방에 효과적이다. 이들은 전형적으로 정맥 내 또는 피하 투여된다.
당뇨에 의해 야기되는 고혈당증의 생리학적 병태는 내피 성장 인자의 분비를 감소시키며, 이는 중증 혈관 질환의 경우 신체를 절단하는 결과를 가져올 수도 있다. 현재 사용되는 대부분의 치료 방법에는 혈관신생 인자들(angiogenic factors)이 관여되며, 이로 인해 임상적 사용 또는 의학적 효능과 관련하여 많은 어려움에 봉착할 수 있다. 아직까지도, 비록 사지 절단을 피할 수는 있을지라도, 허혈 조직을 재생시킬 수 있는 효과적인 치료법은 없는 상태다. 그러므로, 대부분의 환자에게 적합한 허혈 조직 치료용 조성물의 개발은 시급한 해결을 요하는 중요한 문제이다.
일 태양에서, 본 발명은 허혈성 조직 치료용 약제학적 조성물을 기재한다. 상기 약제학적 조성물은 코어 구성요소 및 매트릭스 구성요소를 포함하며, 여기서 상기 코어 구성요소는 헤파린 또는 이의 유도체를 포함하고, 상기 매트릭스 구성요소는 히알루로난 또는 이의 유도체를 포함하며, 상기 약제학적 조성물의 점도는 10 mPa·s를 초과한다. 일부 실시예에서, 상기 약제학적 조성물의 점도는 10 mPa·s 내지 10000 mPa·s이다. 일부 실시예에서, 상기 약제학적 조성물의 점도는, 700 kDa 내지 2,000 kDa의 평균 분자량을 가진 3 mg/ml 내지 10 mg/ml 의 히알루로난의 점도 범위 이내이다. 일부 실시예에서, 상기 약제학적 조성물의 점도는 1,560 kDa의 평균 분자량을 가진 5 mg/ml의 히알루로난의 점도와 동일하다.
일부 실시예에서, 히알루로난의 평균 분자량은 100 kDa 내지 5,000 kDa(예를 들어, 700 kDa 내지 2,000 kDa)이다. 일부 실시예에서, 상기 약제학적 조성물은 1 mg/ml 내지 100 mg/ml 의 히알루로난을 포함한다. 상기 히알루로난의 평균 분자량은 700 kDa 내지 2,000 kDa 일 수 있고, 상기 히알루로난의 농도는 3 mg/ml 내지 10 mg/ml 일 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 히알루로난의 평균 분자량은 1,560 kDa 이고 상기 히알루로난의 농도는 5 mg/ml 이다.
상기 약제학적 조성물에 포함되는 상기 헤파린 또는 이의 유도체는 미분획 헤파린(UFH), 분획 헤파린(저분자량 헤파린), 헤파리노이드, 에녹사파린, 달테파린, 또는 틴자파린으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 약제학적 조성물은 상기 약제학적 조성물 100 ㎕당 0.00001 U 내지 20 U 의 상기 헤파린 또는 이의 유도체를 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 매트릭스 구성요소는 콜라겐, 세포외 매트릭스 인자, 단백질, 또는 다당류를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 코어 구성요소는 혈전용해(thrombolytic) 약물 또는 혈관신생(angiogenic) 화합물을 추가로 포함한다. 상기 혈전용해 약물 또는 혈관신생 화합물은 티클로피딘(ticlopidine), 와파린(warfarin), 조직 플라스미노겐 활성화제, 에미나제(eminasee), 레타바제(retavase), 스트렙타제(streptase), 조직 플라스미노겐 활성화제, 테넥테플라제(tenecteplase), 아보키나제(abbokinase), 킨리틱(kinlytic), 유로키나제(urokinase), 프로유로키나제(prourokinase), 아니소일레이트화 정제 스트렙토키나제 활성화제 복합체(anisoylated purified streptokinase activator complex; APSAC), 피브린(fibrin), 플라스민(plasmin), 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
다른 태양에서, 본 발명은 대상체에서 허혈성 조직을 치료하는 방법을 제공된다. 상기 방법은 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물을 대상체의 허혈성 조직에 직접 투여하는 단계를 포함하며, 단, 상기 약제학적 조성물은 정맥 내 투여되지는 않는다. 일부 실시예에서, 상기 약제학적 조성물은 근육 내 투여된다. 상기 허혈성 조직은 대상체의 궤양이거나, 심장 또는 사지에 있을 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 허혈성 조직은 대상체의 궤양이거나, 심장 또는 사지에 있다. 상기 허혈성 조직은 근육일 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 대상체는 당뇨병을 가진다.
이하 하나 이상의 실시예의 상세 사항들을 하기 첨부 도면 및 상세한 설명에 기술하고자 한다. 실시예들의 기타 특징, 목적, 및 이점들은 상세한 설명, 도면 및 청구범위로부터 자명한 것으로 생각된다.
도 1은 당뇨병 및 비-당뇨병 마우스에서 허혈성 조직의 재생력(regenerative power)을 비교하는 막대 그래프의 세트이다. (A) 하지 신체 점수; 및 (B) 하지 혈류.
도 2는 히알루로난을 함유하는 약제학적 조성물로 치료한 하지 허혈을 가진 당뇨병 마우스의 외관 점수를 나타내는 막대 그래프이다.
도 3은 히알루로난 및 헤파린을 함유하는 약제학적 조성물로 치료한 하지 허혈을 가진 당뇨병 마우스의 외관 점수를 나타내는 막대 그래프이다.
도 4는 히알루로난 및 헤파린을 함유하는 약제학적 조성물의 다중 용량(multiple doses)으로 치료한 하지 허혈을 가진 당뇨병 마우스의 외관 점수를 나타내는 막대 그래프이다.
도 5는 히알루로난 및 헤파린을 함유하는 약제학적 조성물로 치료한 하지 허혈을 가진 당뇨병 마우스에서 (A) 신혈관형성(neovascularization) 및 (B) 보행 기능(walking function)을 나타내는 막대 그래프의 세트이다.
도 6은 (A) 완충 용액, (B) 헤파린 및 히알루로난을 함유하는 약제학적 조성물, 및 (C) (B)의 조성물의 점도의 1/3을 가진, 헤파린 및 히알루로난을 함유하는 약제학적 조성물로 치료한 허혈성 돼지의 심장의 단면을 나타내는 영상의 세트이다.
헤파린 및 특정 점도를 가진 히알루로난을 함유하는 약제학적 조성물이 허혈성 조직의 치료에 효과적임을 예기치 않게 발견하였다.
약제학적 조성물
따라서, 본 명세서에는 허혈성 조직 치료용 약제학적 조성물이 기재된다. 약제학적 조성물은 코어 구성요소 및 매트릭스 구성요소를 포함하며, 상기 코어 구성요소는 헤파린을 포함하고 상기 매트릭스 구성요소는 히알루로난 또는 이의 유도체를 포함한다. 상기 약제학적 조성물의 점도는 10 mPa·s를 초과한다. 점도 측정을 위해 선택되는 파라미터(예를 들어, 스핀들 및 회전 속도)에 따라, 상기 조성물의 점도는 10 mPa·s 내지 10000 mPa·s(예를 들어, 10-100, 50-150, 100-200, 150-250, 250-500, 500-1000, 1000-1,500, 1,500-2,000, 2,000-2,500, 2,500-3000, 3000-3500, 3500-5,000, 5,000-6000, 6000-7000, 7000-8000, 8000-9000, 또는 9000-10000 mPa·s)의 범위일 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 점도는 700 kDa 내지 2,000 kDa(예를 들어, 700, 800, 900, 1000, 1,500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2,000 kDa)의 평균 분자량을 가진 3 10 mg/ml 내지 10 mg/ml(예를 들어, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 또는 10 mg/ml)의 히알루로난의 점도 범위 내에 포함될 수 있다 (하기 표 2 내지 5 참조). 일부 실시예에서, 상기 조성물의 점도는 1,560 kDa의 평균 분자량을 가진 히알루로난 5 mg/ml의 점도와 동일하다. 예를 들어, 하기 기재된 데이터는 4 mg/ml의 2,000 kDa 히알루로난, 5 mg/ml의 1,560 kDa 히알루로난, 및 6.5 mg/ml의 700 kDa 히알루로난의 점도가 대략 동일함을 나타낸다.
상기 약제학적 조성물 내의 히알루로난의 분자량은 4 kDa 내지 5,000 kDa의 범위일 수 있다(예를 들어, 4 내지 20, 20 내지 100, 100 내지 500, 500 내지 1000, 1000 내지 2,000, 2,000 내지 2,500, 2,500 내지 5,000, 5, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 1,500, 1800, 2,000, 2,500, 3000, 3500, 4000, 4500, 또는 5,000 kDa). 상기 약제학적 조성물 내의 히알루로난의 농도는 1 mg/ml 내지 100 mg/ml일 수 있다(예를 들어, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 mg/ml). 특히, 평균 분자량이 700 kDa 내지 2,000 kDa인 히알루로난을 사용하는 경우, 상기 약제학적 조성물 내의 히알루로난의 농도는 3 mg/ml 내지 10 mg/ml일 수 있다(예를 들어, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 또는 10 mg/ml). 당업자라면 목적하는 점도를 가진 조성물을 얻기 위해 분자량과 농도의 적절한 조합을 선택할 수 있을 것이다. 당업자는 또한 당업계에 공지된 방법 및 구매가능한 기기들을 사용하여 조성물의 점도를 결정할 수 있을 것이다.
상기 약제학적 조성물 내의 헤파린은 헤파린 또는 이의 유도체일 수 있다. 헤파린은 미분획 헤파린(unfractionated heparin; UFH), 분획 헤파린(fractionated heparin; 저분자량 헤파린), 헤파리노이드(heparinoid), 에녹사파린(enoxaparin), 달테파린(daltepartin), 및 틴자파린(tinzaparin)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 약제학적 조성물은 헤파린을 100 ㎕당 0.00001 U 내지 20 U(예를 들어, 0.0001 U 내지 10, 0.0001, 0.0005, 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 U)의 농도로 함유한다. 1 단위(U)의 헤파린("호웰 단위(Howell unit)")은 0.002 mg의 순수한 헤파린과 대략 동일한 양이며, 이는 1 ml의 고양이 혈액을 0℃에서 24 시간 동안 유지하기 위해 필요한 양이다.
상기 코어 구성요소는 VEGF, 티클로피딘(ticlopidine), 와파린(warfarin), 조직 플라스미노겐 활성화제(tissue plasminogen activator; t-PA), 에미나제(eminasee; 아니스트레플라제(anistreplase)), 레타바제(retavase; 레테플라제(reteplase)), 스트렙타제(streptase; 스트렙토키나제(streptokinase), 카비키나제(kabikinase)), 액티바제(activase), 테넥테플라제(tenecteplase; TNKase), 아보키나제(abbokinase), 킨리틱(kinlytic; 로키나제(rokinase)), 유로키나제(urokinase), 프로유로키나제(prourokinase), 아니소일레이트화 플라스미노겐 스트렙토키나제 활성화제 복합체(anisoylated plasminogen streptokinase activator complex; APSAC), 피브린(fibrin), 및 플라스민(plasmin)으로 구성된 군으로부터 선택된 혈전용해 약물(thrombolytic drug) 또는 혈관신생 화합물(angiogenic compound)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 하나 이상의 혈전용해 약물 또는 혈관신생 화합물을 포함할 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 혈전용해 약물 및 혈관신생 화합물을 권장되는 임상적 투여량과 유사하거나 그보다 더 낮은 투여량으로 함유할 수 있다.
상기 용어 "히알루로난"은 N-아세틸글루코사민 및 D-글루쿠론산이 반복되는 이당류 단위를 포함하는 자연-발생 음이온성 비-설페이트화 글리코사미노글리칸, 및 이의 유도체를 지칭한다. 자연-발생 히알루로난(히알루론산 또는 히알루로네이트로도 알려짐)은 이의 천연 공급원, 예를 들어, 스트렙토코키(Streptococci)의 캡슐, 닭 벼슬, 연골, 관절 활액(synovial joints fluid), 제대(umbilical cord), 피부 조직, 및 눈의 유리체(vitreous of eyes)로부터 통상적인 방법을 통해 분리할 수 있다 (참조, 예; Guillermo Lago et al. Carbohydrate Polymers 62(4): 321-326, 2005; 및 Ichika　Amagai et al. Fisheries Science 75(3): 805-810, 2009). 또는, 상업적 공급처, 예를 들어, Genzyme Corporation, Lifecore Biomedical, LLC, 및 Hyaluron Contract Manufacturing으로부터 구매할 수 있다. 자연-발생 히알루로난의 유도체는 히알루로난 에스테르, 아디픽 디하이드라지드-변형 히알루로난(adipic dihydrazide -modified hyaluronan), 히알루로난 아미드 산물, 가교결합된 히알루론산, 석신산의 헤미에스테르 또는 그의 중금속 염 히알루론산(heavy metal salts thereof hyaluronic acid), 히알루론산의 부분 또는 전체 에스테르, 설페이트화 히알루론산, N-설페이트화 히알루론산, 및 아민 또는 디아민 변형 히알루론산을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 이의 작용기(예를 들어, 카르복실산 기, 하이드록실 기, 환원성 말단 기, N-아세틸 기) 중 하나 이상을 화학적으로 변형시킴으로써 이들을 얻을 수 있다. 카르복실 기는 에스테르화 또는 카르보디이미드 및 비스하이드라지드에 의해 매개되는 반응을 통해 변형될 수 있다. 하이드록실 기의 변형은 설페이트화, 에스테르화, 이소우레아 커플링, 시아노겐 브로마이드 활성화, 및 과요오드 산화(periodate oxidation)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 환원성 말단 기는 환원성 아민화에 의해 변형될 수 있다. 이는 또한 인지질, 염료(예를 들어, 형광단 또는 발색단), 또는 친화도 매트릭스(affinity matrices)의 제조에 적합한 제제에 연결될 수 있다. 자연-발생 히알루로난의 유도체는 또한 가교결합제(예를 들어, 비스에폭사이드, 디비닐설폰, 비스카르보디이미드, 작은 동종이기능성 링커(homobifunctional linker), 포름알데히드, 사이클로헥실 이소시아나이드, 및 라이신 에틸 에스테르, 금속 양이온, 하이드라자이드, 또는 이의 혼합물)를 사용하거나 내부 에스테르화, 광-가교결합, 또는 표면 플라스마 처리를 통한 가교결합에 의해 얻을 수 있다. 히알루로난 용액을 제조하기 위해, 히알루로난을 인산염 완충 용액(예를 들어, ≤ 0.05 M, pH 7±1) 및/또는 NaCl(예를 들어, ≤ 0.9%)에 용해시킬 수 있다.
상기 조성물의 점도가 목적하는 범위 내에서 유지되는 한, 상기 매트릭스 구성요소는 하나 이상의 다른 매트릭스 분자를 포함할 수 있다. 상기 매트릭스 분자는 젤라틴, 콜라겐, 히알루로난, 피브로넥틴, 엘라스틴, 테나신(tenacin), 라미닌(laminin), 비트로넥틴(vitronectin), 폴리펩티드, 헤파란 설페이트, 콘드로이틴(chondroitin), 콘드로이틴 설페이트, 케라탄(keratan), 케라탄 설페이트, 데르마탄(dermatan) 설페이트, 카라기난, 헤파린, 키틴, 키토산, 알기네이트, 아가로스, 아가, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 카르복실 메틸 셀룰로스, 글리코겐, 및 이의 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 매트릭스 구성요소는 피브린, 피브리노겐, 트롬빈, 폴리글루탐산, 합성 중합체(예를 들어, 아크릴레이트, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 또는 폴리(락트-코-글리콜산)(poly(lactic-co-glycolic acid)), 또는 가교결합제(예를 들어, 제니핀(genipin), 글루타르알데히드, 포름알데히드, 또는 에폭사이드)를 포함할 수 있다.
치료 방법
상기 약제학적 조성물을 유효량으로 환자에게 투여하여 허혈성 조직을 치료할 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 허혈성 조직(예를 들어, 근육)에 직접, 또는 그 부근에 투여될 수 있다(예를 들어, 주사 주입 또는 투여). 농도(in consistency)가 젤라틴성이거나 점성인 조성물은 정맥 내 투여되지 않는다.
상기 조성물은 적합한 치료 기간, 예를 들어, 1 내지 4 주, 1 내지 12 개월, 또는 1 내지 3 년 동안, 예를 들어, 매일 1 내지 5 회, 매주 1 내지 5 회, 매월 1 내지 5 회, 필요에 따라 대상체에 투여할 수 있다. 상기 조성물은 허혈 또는 허혈성 손상이 발생한 후 가급적 빨리(예를 들어, 0 내지 48 시간 또는 1 내지 7 일 이내) 여하는 것이 바람직하다.
상기 약제학적 조성물의 투여량은 상기 치료 화합물(therapeutic compound), 예를 들어, 헤파린, 혈전용해 약물, 또는 혈관신생 화합물의 유효 용량을 제공하기에 충분해야 한다. 헤파린에 대한 유효 용량은 체중 1 그램당 100 ㎕당 0.00001 U 내지 20 U(예를 들어, 0.0001 U 내지 10, 0.0001, 0.0005, 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 U)일 수 있다. 상기 혈전용해 약물 또는 혈관신생 화합물의 유효 용량은, 혈전용해 약물의 효능에 따라, 예를 들어 대상체의 체중 1 그램당 0.00001 ㎍ 내지 10 ㎍(예를 들어, 0.00001 ㎍ 내지 0.001, 0.001 내지 0.005, 0.005 내지 0.01, 0.05 내지 0.1, 0.1 내지 0.5, 0.5 내지 1, 0.00001, 0.0001, 0.0005, 0.001, 0.005, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 ㎍)일 수 있다.
용어 "치료"는 장애를 앓고 있거나 장애가 발생할 위험이 있는 대상체에게, 장애, 장애의 증상, 장애에 대한 2차적 질환 상태, 또는 장애에 대한 질병의 소질(predisposition)을 치료(cure), 경감(alleviate), 완화(relieve), 처리(remedy)하거나, 이의 발병을 지연, 예방, 또는 개선할 목적으로 약제학적 조성물을 투여하는 것을 지칭한다. "유효량"은 치료되는 대상체로부터 의학적으로 바람직한 결과를 낳을 수 있는 상기 조성물의 양을 지칭한다. 상기 치료 방법은 단독으로, 또는 다른 약물 또는 요법과 함께 수행될 수 있다. 치료할 대상체는 인간 또는 실험 동물 또는 가축일 수 있다.
하기 구체적 예는 단지 예시적인 것으로서, 어떠한 임의의 방식으로도 본 발명 개시의 나머지 부분을 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 추가 상세한 기재가 없더라도, 당업자는 본 명세서의 상세한 설명에 기초하여 본 발명의 개시를 충분히 이용할 수 있다고 생각된다. 본 명세서에 인용된 모든 간행물은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
실시예 1: 당뇨병성 하지 허혈 마우스 모델
하기 수행된 모든 실험은 대만 국립 성공 대학교(NCKU: National Cheng Kung University)에서 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC: Institutional　Animal　Care and Use Committees)에 의해 사전-승인되었다. C57BL/6 수컷 마우스는 상기 NCKU 실험 동물 센터 또는 BioLASCO Taiwan Co., Ltd. 로부터 공급되었다. 실험 수행 전 이들 마우스를 환경에 적응시키기 위해 적어도 1 주 동안 상기 NCKU 생명과학 연구소의 동물 시설에서 이들을 사육하였다.
하지 허혈에 대한 요법 치료(therapeutics treatments)를 연구하기 위해 본 실험 동물 모델을 확립하였다. 고령 및 치유가 느린 창상 당뇨병 조직(slow-to-heal wounded diabetic tissues)의 특징을 나타낼 수 있도록, 월령 6-8 개월 이상의 마우스를 스트렙토조토신(STZ) 용액으로 50 mg/kg 체중의 용량으로 처리하여 제 I형 당뇨병을 유도하였다. 마우스의 저혈당은 결과를 방해할 수 있으므로, 혈당이 400 mg/dl 내지 550 mg/dl의 범위 이내인 마우스를 본 실험에 사용하였으며, 생명을 위협하는 고혈당을 피하기 위해 소량의 인슐린을 마우스에 적용하였다. 자가-재생 신혈관 형성(self-regenerative neovascularization)의 가능성을 피하고자, 마우스의 하지에서 대퇴 동맥 및 이의 말초 혈관들을 절단하였다. 상기 모델은 치료없이 혈관이 재생되는 가능성이 제거되었으며, 이로 인해 시험 약물의 혈관신생 능력을 더욱 정확하게 평가할 수 있었다.
하지 허혈을 유도하기 위해, 제모한 당뇨병 마우스를 1 분당 가스 1 리터 당 1-3%의 이소플루란을 포함한 통풍 가스가 구비된 가스 마취 박스에 넣었다. 마우스가 의식을 잃은 후, 상기 마우스를 수술대로 옮기고 가스 마취 상태로 유지하였다. 통기성 테이프를 사용하여 상기 마우스의 사지를 고정한 후에, 37℃ 가열 패드로 마우스의 체온을 일정하게 유지하였다. 상기 마우스의 하복부 및 사지를 소독한 후, 좌측 발목에서의 작은 개구로부터 대퇴부까지 사지의 피부를 절개하였다. 상기 마우스 종아리 근육의 배면(dorsal side) 상의 2 개의 측혈관의 양측 말단을 수술용 봉합사로 결찰하고, 혈관을 제거하여 배혈관(dorsal vessels)의 혈류를 차단하였다. 이어서, 복측 대퇴 동맥의 분지 및 주혈관을 차단하였다. 발목 부근의 동맥의 말단 및 그 주변 혈관을 수술용 봉합사로 결찰하여 대퇴 동맥 및 말초 혈류가 완전히 차단되도록 하였다.
혈관을 잘라낸(truncated) 후, 허혈에 대한 치료 효과를 시험하고자 하는 약제학적 조성물을 조직 상에 직접 투여하거나 8 개의 부위에서 비복근(gastrocnemius muscle) 내로 주사한 후, 수술 개구를 봉합하였다. 상기 마우스에 1 mg/kg 체중의 케토롤락(ketorolac) 진통제 및 리도카인-HCl 국소 마취제를 피하 주사하고, 또한 1 ml의 식염수를 투여하여 통증을 완화하고 수분을 보충하였다. 필요 시마다, 글루코스 용액을 투여하여 체력을 유지시켰다.
당뇨병 마우스의 하지 허혈 외관 점수.
점수 병태/외관 점수 병태/외관
0 대퇴부 절단 8 발가락 1개 절단
1 대퇴부 괴사 9 발가락 다중 괴사
2 종아리 절단 10 발가락 1개 괴사
3 종아리 괴사 11 발가락 다중 흑화(blackened toe)
4 발목 관절 괴사 12 발가락 1개 흑화
5 발톱 절단 13 발톱 다중 흑화/파손
6 발톱 괴사 14 발톱 1개 흑화/파손
7 다중 발가락 절단 15 정상
수술 후 제 0일, 제 1일, 제 2일, 제 3일, 제 4일, 제 5일, 제 6일, 제 7일, 제 14일, 제 21일, 및 제 28일에, 표 1에 나타낸 점수 시스템 및 레이저 도플러 혈류측정법(laser Doppler flowmetry)을 각각 사용하여 마우스에서 하지의 뚜렷한 외관 및 혈류를 평가하였다. 대퇴부로부터 말단 발톱까지의 영역에 대하여 레이저 도플러 혈류측정법으로부터 관심 지역(ROI: region of interest)을 얻었다. 이어서, 수술 후 치료하지 않은 우측 하지의 혈류 신호 대비 좌측 하지의 혈류 신호의 비율로서 ROI를 계산하였으며, 백분율 단위의 비율을 수술 전에 얻은 혈류 신호를 기초로 정규화하였다(normalized).
실시예 2: 비-당뇨병성 조직의 재생력
비-당뇨병 및 당뇨병 마우스의 재생력을 비교하기 위해, 상기와 같이 기재된 하지 허혈의 수술을 상기 두 그룹의 마우스에 대해 모두 수행하였다. 상기 두 그룹에 대한 사지 외관 점수 및 이들의 혈류 정보를 시간에 따라 기록하였다 (도 1(A) 및 (B) 참조). 상기 두 그룹 모두, 중증 허혈 수술을 받은 경우, 마우스에서 당뇨병의 유도는 비-당뇨병 마우스보다 사지 회복을 악화시켰다. 상기 결과는 또한 당뇨병 그룹보다 비-당뇨병 그룹에서 하지의 혈류가 더 양호하게 회복될 수 있었음을 입증했다. 상기 약제학적 조성물의 효능을 스크리닝하고 보장하기 위하여, 당뇨병 마우스를 하기 실험에 사용했지만, 이들 결과가 청구범위의 적용 분야를 한정해서는 안된다.
실시예 3: 히알루로난 점도 시험
다양한 분자량을 가진 상이한 농도의 히알루로난을 함유하는 조성물을 제조하였다.
DV2TRV 점도계(Brookfield, USA)를 사용하여 매뉴얼에 따라 약제학적 조성물의 점도를 시험하였다. 점도에 따라 적절한 스핀들(CPE40 또는 CPE52)을 선택하였다. 시험 전에, 기계를 보정하고 25℃에서 20 rpm으로 1 분 동안 실행되도록 설정하였다. 점도 피펫으로 각각의 샘플 500 ㎕를 샘플 플레이트에 옮긴 후 실행 버튼을 눌러 샘플의 점도 결정을 시작하였다.
평균 분자량이 1,560 kDa, 700 kDa, 및 2,000 kDa인 히알루로난의 5 mg/ml에서의 점도를 결정하였으며, 그 결과는 표 2에 나타내었다. 평균 분자량이 1,560 kDa인 히알루로난의 5 mg/ml의 점도를 기준치로 사용하였고, 평균 분자량이 700 kDa 및 2,000 kDa인 다양한 농도의 히알루로난의 점도를 표 3 및 표 4에 나타낸 바와 같이 측정하였다. 이어서, 기준치 점도에 근접한 점도에서의 평균 분자량이 700 kDa 및 2,000 kDa인 히알루로난의 농도를 계산하고 각각 6.5 mg/ml 및 4 mg/ml로 조정하였다.
하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 측정 파라미터가 변화한 경우에 농도 및 분자량 범위가 동일한 히알루로난의 점도가 변화했음이 분명했다.
상이한 분자량을 가진 히알루로난의 5 mg/ml의 점도
5 mg/ml의 히알루로난
(20 rpm)		 히알루로난의 평균 분자량
2,000 kDa 1,560 kDa 700 kDa
점도 (mPa·s) 137.30 86.33 41.20
토크 (%) 84 52.8 25.2
전단 응력 (dyne/cm2) 206.0 129.5 61.8
전단율 (1/s) 150.0
평균 분자량이 700 kDa인 히알루로난의 상이한 농도에서의 점도
~700 kDa의 히알루로난
(20 rpm)		 히알루로난의 농도
5 mg/ml 6 mg/ml 7 mg/ml 8 mg/ml
점도 (mPa·s) 41.20 66.87 106.3 138.8
토크 (%) 25.2 40.9 65.0 84.9
전단 응력 (dyne/cm2) 61.8 100.3 159.4 208.2
전단율 (1/s) 150.0
평균 분자량이 2,000 kDa인 히알루로난의 상이한 농도에서의 점도
~2,000 kDa의 히알루로난 (20 rpm) 히알루로난의 농도
1 mg/ml 2 mg/ml 3 mg/ml 4 mg/ml 5 mg/ml
점도 (mPa·s) 7.36 20.27 52.16 87.15 137.3
토크 (%) 4.5 12.4 31.9 53.3 84
전단 응력 (dyne/cm2) 11.04 30.41 78.23 130.7 206.0
전단율 (1/s) 150.0
평균 분자량이 1~1.8 MDa인 히알루로난의 상이한 농도에서의 점도
히알루로난의 점도
(mPa·s)		 히알루로난의 농도(mg/ml)
1 2 3 4 5 6 7
50 rpm 16.6 42.0 61.7 89.6 121.1 - -
Y=25.66X-10.77, R2=0.9935
10 rpm 47.1 82.4 151.7 302.8 427.7 564.4 -
Y=130.8X-222.37, R2=0.9993
2 rpm 127.5 189.7 349.9 977.7 1,436 1,995 2,596
Y = 541.39X-1,226.5, R2 = 0.9964
실시예 4: 허혈성 조직의 치료에 대한 히알루로난 또는 헤파린 단독 효능
당뇨병 마우스에서 허혈성 하지에 근육 내 주사를 통해 히알루로난을 투여하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 히알루로난 단독 투여 시, 2 주 시점에 단지 작은 효과를 가졌으나, 당뇨병 마우스가 하지에 중증 허혈을 가진 경우에는 그 효과가 유의적이지 않았다. 제 3일 또는 제 5일에 제 2 주사 투여가 이어진 경우, 다중-용량은 허혈 부위에 인산염 완충 식염만 투여한 대조군과 대비하여 어떠한 보다 양호한 치료 효과도 보이지 않았다 (도 2 참조).
헤파린은 혈전증 예방을 위한 정맥 내 주사용으로 사용된다. 마우스 하지의 허혈 부위 내로 헤파린을 주사함으로써 헤파린 단독 투여의 효능을 시험하였다. 마우스 하지 주변에 조직 출혈이 항상 관찰되었거나 또는
마우스의 허혈성 하지에서 어떠한 회복 효과도 관찰되지 않았다(자료 미도시).
실시예 5: 히알루로난 및 헤파린을 함유하는 약제학적 조성물
헤파린의 코어 구성요소 및 히알루로난 매트릭스 구성요소를 각각 함유하는 약제학적 조성물을 제조하고 허혈에 대한 이들 조성물의 치료 효과를 시험하였다. 상기 헤파린 구성요소는 하기 군에서 택일하였다: 미분획 헤파린(UFH), 분획 헤파린(저분자량 헤파린), 헤파리노이드, 에녹사파린, 달테파린, 및 틴자파린. 상기 히알루로난 매트릭스 구성요소의 평균 분자량은 4 kDa 내지 5,000 kDa이었다. 실시예 3에 기재된 바와 같이, 다양한 분자량의 히알루로난이 다양한 농도에서 상이한 점도를 나타내었다. 더욱이, 헤파린, 특히 미분획 헤파린(UFH) 및 헤파리노이드는 젤라틴성 재료로서, 또한 특정 점도를 나타내었다.
인간에게 사용될 수 있는 헤파린 약물의 최대 및 최소 유효 용량을, 마우스의 체중에 따라 마우스에 대한 투여량으로 전환하였다. 상기 실시예 1 에 기재된 바와 같이, 하지 허혈성 수술 후 당뇨병 마우스의 다중 부위에 상기 약제학적 조성물을 주사하였다. 수술 후 완충 용액만을 투여한 당뇨병 마우스를 대조군으로 사용하였다. 상기 실시예 1 에 기재된 바와 같이, 수술 후 제 0일, 제 1일, 제 2일, 제 3일, 제 4일, 제 5일, 제 6일, 제 7일, 제 14일, 제 21일, 및 제 28일에 외관 점수를 기록하였고, 수술 후 제 7일, 제 14일, 제 21일, 및 제 28일에 혈류 신호를 결정하였다.
일 실시예에서, 평균 2,500 kDa의 히알루로난 3.5 mg/ml 및 0.1 U의 저분자량 헤파린 투여 시, 허혈성 사지의 절단을 예방할 수 있었다. 다른 경우에는, 6.5 mg/ml의 평균 700 kDa의 히알루로난 6.5 mg/ml 및 0.05 U의 헤파리노이드가 허혈성 사지의 절단을 예방할 수 있었다.
실시예 6: 히알루로난 및 헤파린을 함유하는 약제학적 조성물의 효능
완충 인산염 식염수 중에 저분자량 헤파린의 코어 구성요소 및 평균 분자량이 1,560 kDa인 히알루로난 5 mg/ml을 각각 함유하는 약제학적 조성물을 제조하고 하지 허혈에 대한 이들의 치료 효과를 연구하였다. 실시예 1 에 기재된 바와 같이, 하지 허혈성 수술 후 당뇨병 마우스의 허혈성 근육 내의 8 개 부위에 상기 약제학적 조성물을 투여하였다. 수술 후 인산염 완충 식염수만을 투여한 당뇨병 마우스를 대조군으로 사용하였다. 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 수술 후 제 0일, 제 1일, 제 2일, 제 3일, 제 4일, 제 5일, 제 6일, 제 7일, 제 14일, 제 21일, 및 제 28일에 외관 점수를 기록하였고, 수술 후 제 7일, 제 14일, 제 21일, 및 제 28일에 혈류 신호를 결정하였다. 외관 점수는 도 3에 나타내었다.
치료할 마우스는 6 U, 8 U, 10 U, 14 U, 또는 16 U의 저분자량 헤파린 및 평균 분자량이 1,560 kDa인 히알루로난 500 ㎍을 함유한 100 ㎕의 약제학적 조성물(즉, 각각 DIB6, DIB8, DIB10, DIB14, 및 DIB16)을 각각 주사하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 DIB6 그룹(6 U의 저분자량 헤파린 및 히알루로난)은 당뇨병 마우스에서 허혈성 하지의 괴저(gangrene)로부터의 회복 또는 보호에 대한 유의적인 치료 효과를 나타냈다. 체중(BW)당 사용되는 투여량으로 전환 시, 0.20 ± 0.01 U/g BW, 0.26 ± 0.01 U/g BW, 및 0.51 ± 0.01 U/g BW의 헤파린을 DIB6, DIB8, 및 DIB16 그룹에 각각 투여하였다.
실시예 7: 히알루로난 및 헤파린을 함유하는 약제학적 조성물의 다중 용량의 효능
당뇨병 마우스에 2 U, 4 U, 6 U, 8 U, 10 U, 12 U, 14 U, 또는 16 U의 저분자량 헤파린 및 평균 분자량이 1,560 kDa인 히알루로난 500 ㎍(즉, 각각 DIB2, DIB4, DIB6, DIB8, DIB10, DIB12, DIB14, 및 DIB16)을 함유한 100 ㎕의 약제학적 조성물을 각각 수술 후 주사하였다. 다시 말해서, 상기 약제학적 조성물 내의 0.05~0.08 U/g BW, 0.12~0.15 U/g BW, 0.20 ± 0.01 U/g BW, 0.26 ± 0.01 U/g BW, 및 0.51 ± 0.01 U/g BW의 헤파린을 DIB2, DIB4, DIB6, DIB8, 및 DIB16 그룹에 각각 투여하였다.
손상된 근육 내의 다중 부위에서의 제 2 주사 투여가 수술 후 제 3일에 제공된 점을 제외하고는, 실시예 6에 기재된 바와 같이 본 연구를 수행하였다. 하지의 외관 점수는 도 4에 나타내었다. 상기 결과는 히알루로난과 6 U 이하의 헤파린의 조합이 허혈에 대한 치료 효과를 제공했으며, 다중 용량이 치료의 효능을 유의적으로 증가시킬 수 있음을 입증했다.
실시예 8: 치료 효과를 가진 약제학적 조성물 내의 헤파린의 최적 용량
저분자량 헤파린 및 히알루로난을 각각 함유하는 다양한 약제학적 조성물을 표 6에 나타낸 바와 같이 제조하였으며, 여기서 헤파린 투여량은 U/g 체중(BW)으로 표시하였다. 허혈성 수술 후, 허혈성 근육 내의 다중 부위에서 상기 조성물을 당뇨병 마우스에 투여하고 실시예 6에 기재된 바와 같이 관찰하였다.
당뇨병 마우스에서 허혈성 하지의 외관 점수
마우스 번호 투여량
(U/g BW)		 수술 후 일수
0 3 7 14 21 28
152804 대조군 15 11 5 3 3 3
151303 8 U 14 5 4 3 2 1
152705 8 U 14 11 6 4 3 2
152801 6 U 13 8 4 3 2
152001 6 U 15 14 14 13 12 12
151801 3 U 15 14 14 14 14 14
153304 0.12 U 15 14 13 13 13 -
153202 0.5 U 15 13 13 12 12 12
161403 0.05 U 14 10 8 7 6 6
160402 0.01 U 14 14 13 13 13 13
161207 0.005 U 14 13 13 11 10 9
161205 0.001 U 14 13 11 - - -
160102 0.0005 U 15 13 12 11 10 10
161210 0.0001 U 15 13 11 9 8 7
외관 점수는 상기 표 6에 나타내었다. 상기 결과는, 마우스마다 다소 일부 차이가 있을 수 있지만, 히알루로난과 6 U/g BW 이하의 헤파린의 조합이 치료 효과를 나타내었고 유효 투여량은 0.1 mU/g BW 내지 6 U/g BW의 범위일 수 있음을 입증했다.
실시예 9: 상이한 유형의 헤파린, 하나 이상의 혈전용해/혈관신생 제제, 및 히알루로난을 함유하는 약제학적 조성물
상이한 유형의 헤파린, 혈전용해/혈관신생 제제, 및 히알루로난의 조합을 함유하는 다양한 약제학적 조성물을 표 7에 나타낸 바와 같이 제조하였다. 허혈성 수술 후, 허혈성 근육 내의 다중 부위에서 상기 조성물을 당뇨병 마우스에 투여하고 실시예 6에 기재된 바와 같이 관찰하였다.
외관 점수는 표 7에 나타내었다. 상기 결과는 상기 약제학적 조성물 내의 코어 구성요소가 다양한 유형의 헤파린 및 다양한 혈전용해/혈관신생 제제를 포함할 수 있으며, 헤파린의 유효 용량은 0.00001 U/g BW 내지 20 U/g BW의 범위일 수 있음을 입증하였다. 그러나, 상기 약제학적 조성물은 평균 또는 중간(average) 분자량이 4 kDa 내지 5,000 kDa(예를 들어, 50 kDa 내지 2,500 kDa)의 범위인 히알루로난을 포함할 수 있었다.
수술 후 제 28일에 하지의 외관 점수
코어 구성요소 히알루로난(avg. mw) 점수
대조군 3~1

헤파린		 2,500 kDa 15~12
1,500 kDa 15~13
700 kDa 15~13
50 kDa 14~10
LMW 헤파린 50 kDa~2,500 kDa 15~12
헤파리노이드 50 kDa~2,500 kDa 15~10
헤파린 + 티클로피딘 50 kDa~2,500 kDa 15~13
헤파린 + 와파린 50 kDa~2,500 kDa 15~13
LMW 헤파린 + 티클로피딘 50 kDa~2,500 kDa 15~13
LMW 헤파린 + 와파린 50 kDa~2,500 kDa 15~13
LMW 헤파린 + VEGF 50 kDa~2,500 kDa 15~13
헤파리노이드 + 티클로피딘 50 kDa~2,500 kDa 15~13
헤파리노이드 + 와파린 50 kDa~2,500 kDa 15~13
헤파린 + 티클로피딘 + 와파린 50 kDa~2,500 kDa 15~13
헤파린 + LMW 헤파린 + 와파린 50 kDa~2,500 kDa 15~13
● 헤파린 코어 구성요소의 양은 0.00001 U/g BW 내지 20 U/g BW의 헤파린, LMW 헤파린, 또는 헤파리노이드임.
각 개체마다 일부 차이가 있을 수 있지만, 히알루로난과 코어 구성요소의 조합 효과는 조직의 출혈을 야기하지 않으면서 치료 효과를 지속시키기 위해 부분적으로 점성 히알루로난과 코어 구성요소의 상호작용을 통해 유효 성분의 방출을 제어하는 것이다.
실시예 10: 약제학적 조성물로 치료한 마우스의 기능적 평가
실시예 6 내지 9 에 기재된 실험에서 긍정적인 결과가 관찰되었으므로, 상기 약제학적 조성물들의 치료 효과를 이해하기 위해 허혈성 수술 후 제 28일에 하지의 생리학적 기능을 조사하였다. 영상 분석 결과, DIB 치료 그룹에서 명백한 신혈관형성이 확인되었다(자료 미도시). 상기 약제학적 조성물의 국소 적용은 신혈관형성의 효능을 증가시킬 뿐 아니라, 손상 조직을 괴저(gangrene)로부터 보호함이 차별적 조직 염색(different staining of histology)으로부터 관찰되었다.
수술 후 제 35일에, 신혈관형성과 관련한 DIB 치료 그룹과 정상 마우스 사이의 정량적 비교 결과를 도 5(A)에 나타내었다. 상기 결과는 허혈성 조직의 재생에는 시간이 소요되며, 밀도 및 혈관 직경의 관점에서 증식된 혈관들이 조직의 재생과 더불어 동시에 관찰됨을 입증하였다. 시간이 더 주어질 경우, 신혈관의 밀도 및 치수(dimension)가 정상치에 근접할 상당한 가능성이 있었다.
신경 기능의 재생을 더욱 이해하기 위해, 수술 후 제 35일에 각각의 마우스를 플랫폼 상에 놓고 걸음걸이 보행 분석(gait walking analysis)을 수행하였다. 상기 결과는 도 5(B)에 나타내었다. 상기 DIB 치료 그룹에서의 2 개의 사지 사이의 기저 너비(base width)는 정상 대조군의 것과 차이가 없음이 관찰되었다. 상기 DIB 그룹의 보폭 길이가 대조군의 것과 비교하여 유의적으로 증가하였지만, 정상 마우스의 것과 대조하여 볼 때 여전히 상이하였다 (도 5(B)를 참조). 손상된 사지의 보행 기능이 회복되는데 시간이 소요되었으므로, 상기 결과는 상기 DIB 그룹의 마우스의 하지가 수술 후 위축(atrophy)되기 시작했으므로 이들 마우스의 걸음이 비록 완전히 정상으로 회복되지는 않았지만 이들은 여전히 대조군보다 훨씬 더 양호했음을 나타내었다.
실시예 11: 경색(infarction) 후 허혈성 심장 조직의 재생에 대한 약제학적 조성물의 치료 효과
상기 실험적 경험으로부터, 심장 경색(heart infarction) 실험을 위해 10 U/ml의 헤파린 및 평균 분자량이 1,500 kDa인 5 mg/ml의 히알루로난을 포함하는 약제학적 조성물을 제조하였다. 알록산(alloxan) 주사에 의해 월령 12 내지 18 개월의 란위 돼지(Lanyu pigs)에서 당뇨병 증상을 유도하였다. 당뇨병 돼지의 재생 능력은 정상 대조군의 것보다 훨씬 더 낮았다. 돼지 심장의 관상 동맥 상에 심근 수술을 수행하고, 좌전 하행(left anterior descending; LAD)의 상부 대각 분지(upper diagonal branch) D2 내의 혈관을 결찰하였다. 허혈 수술 후, 허혈성 심근의 30 내지 40 개 부위에 상기 제조된 바와 같은 젤라틴성 약제학적 조성물을 근육 내 주사에 의해 투여하였다. 심장초음파검사 및 혈관조영술을 사용하여 심장 기능 및 혈관 반응을 각각 관찰하였다. 초음파검사는 매주 수행하였다.
도 6은 결찰의 하부 엣지(lower edge)에서의 첨부의 단면을 나타낸다. 섬유증 영역의 비교를 위해 결찰 관상 동맥 바로 옆에 있는 심근을 확대하였다(척도 막대 = 1 cm). 수술 후 제 28일에, 결찰 매듭이 여전히 심장 내에 존재했지만, 상기 약제학적 조성물을 이용한 치료는 심근 내에서 섬유증 조직이 관찰되지 않는 주목할 만한 결과를 제공하였음이 관찰되었다. 반면에, 샴 대조군(sham control group) 과 인산염 완충 식염수로 희석함으로써 약제학적 조성물의 점도를 바람직한 약제학적 조성물의 1/3로 고의로 감소시킨 다른 실험군 모두에서 섬유증 조직이 분명히 관찰되었다. 또한, 이후의 조직 염색을 위해 마우스를 희생시킨 후에 심장을 수집하였다. 이들 결과 또한 특정 범위의 점도가 최적임을 시사한다.
다른 실시 형태
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일하거나 등가이거나 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특징에 의해 대체될 수 있다. 따라서, 명시적으로 달리 언급되지 않는 한, 각각의 개시된 특징은 등가이거나 유사한 특징의 포괄적인 시리즈의 예일 뿐이다.
상기 상세한 설명으로부터, 당업자는 기재된 실시 형태의 필수적 특징을 용이하게 확인할 수 있으며, 그의 사상 및 범위로부터 이탈하지 않으면서, 그것을 다양한 용법 및 조건에 대해 조정하기 위해 실시 형태의 다양한 변화 및 변형을 실행할 수 있다. 따라서, 다른 실시 형태 또한 본 발명의 청구 범위 내에 있다.

Claims (34)

  1. 코어 구성요소 및 매트릭스 구성요소를 포함하는 허혈성 조직을 치료하기 위한 약제학적 조성물에 있어서,
    상기 코어 구성요소는 헤파린 또는 이의 유도체를 포함하고, 상기 매트릭스 구성요소는 히알루로난 또는 이의 유도체를 포함하며, 상기 약제학적 조성물의 점도는 10 mPa·s를 초과하는, 약제학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물의 점도가 10 mPa·s 내지 10000 mPa·s 인, 약제학적 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 히알루로난의 평균 분자량이 100 kDa 내지 5,000 kDa 인, 약제학적 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 히알루로난의 평균 분자량이 700 kDa 내지 2,000 kDa 인, 약제학적 조성물.
  5. 제 3항에 있어서,
    1 mg/ml 내지 100 mg/ml 의 히알루로난을 함유하는, 약제학적 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    점도가, 700 kDa 내지 2,000 kDa 의 평균 분자량을 가진 3 mg/ml 내지 10 mg/ml 의 히알루로난의 점도 범위 이내인, 약제학적 조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    점도가, 1,560 kDa의 평균 분자량을 가진 5 mg/ml 의 히알루로난의 점도와 동일한, 약제학적 조성물.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 히알루로난의 평균 분자량이 700 kDa 내지 2,000 kDa 이고, 상기 히알루로난의 농도가 3 mg/ml 내지 10 mg/ml 인, 약제학적 조성물.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 히알루로난의 평균 분자량이 1,560 kDa 이고, 상기 히알루로난의 농도가 5 mg/ml 인, 약제학적 조성물.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 매트릭스 구성요소가 콜라겐, 세포외 매트릭스 인자, 단백질, 또는 다당류를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 헤파린 또는 이의 유도체가 미분획 헤파린(UFH: unfractionated heparin), 분획 헤파린(fractionated heparin)(저분자량 헤파린), 헤파리노이드(heparinoid), 에녹사파린(enoxaparin), 달테파린(daltepartin), 및 틴자파린(tinzaparin)으로 구성된 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물 100 ㎕당 0.00001 U 내지 20 U 의 상기 헤파린 또는 이의 유도체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 코어 구성요소가 혈전용해(thrombolytic) 약물 또는 혈관신생(angiogenic) 화합물을 추가로 포함하는, 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 혈전용해(thrombolytic) 약물 또는 혈관신생(angiogenic) 화합물이 티클로피딘(ticlopidine), 와파린(warfarin), 조직 플라스미노겐 활성화제(tissue plasminogen activator; t-PA), 에미나제(eminasee), 레타바제(retavase), 스트렙타제(streptase), 조직 플라스미노겐 활성화제, 테넥테플라제(tenecteplase), 아보키나제(abbokinase), 킨리틱(kinlytic), 유로키나제(urokinase), 프로유로키나제(prourokinase), 아니소일레이트화 정제 스트렙토키나제 활성화제 복합체(anisoylated purified streptokinase activator complex; APSAC), 피브린(fibrin), 플라스민(plasmin), 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)로 구성된 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 허혈성 조직에는 직접 투여되지만 정맥 내에는 투여되지 않는, 약제학적 조성물.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 허혈성 조직이 대상체의 궤양이거나 또는 심장 또는 사지(limb)에 있는, 약제학적 조성물.
  17. 약제학적 조성물을 허혈성 조직에 직접 투여(단, 약제학적 조성물은 정맥 내 투여되지 않음)하는 단계를 포함하는 허혈성 조직을 치료하는 방법에 있어서;
    상기 약제학적 조성물은 코어 구성요소 및 매트릭스 구성요소를 포함하고, 상기 코어 구성요소는 헤파린 또는 이의 유도체를 함유하며, 상기 매트릭스 구성요소는 히알루로난 또는 이의 유도체를 포함하고, 및 10 mPa·s를 초과하는 점도를 가지는, 대상체에서 허혈성 조직을 치료하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 허혈성 조직이 궤양이거나, 대상체의 심장 또는 사지(limb)에 있는, 대상체에서 허혈성 조직을 치료하는 방법.
  19. 제 17항에 있어서,
    상기 허혈성 조직이 근육인, 대상체에서 허혈성 조직을 치료하는 방법.
  20. 제 17항에 있어서,
    상기 대상체가 당뇨병을 가지는, 대상체에서 허혈성 조직을 치료하는 방법.
  21. 제 17항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물의 점도가 10 mPa·s 내지 10000 mPa·s 인, 대상체에서 허혈성 조직을 치료하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서,
    상기 히알루로난의 평균 분자량이 100 kDa 내지 5,000 kDa 인, 대상체에서 허혈성 조직을 치료하는 방법.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 히알루로난의 평균 분자량이 700 kDa 내지 2,000 kDa 인, 대상체에서 허혈성 조직을 치료하는 방법.
  24. 제 21항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 1 mg/ml 내지 100 mg/ml 의 히알루로난을 함유하는, 대상체에서 허혈성 조직을 치료하는 방법.
  25. 제 24항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물의 점도가, 700 kDa 내지 2,000 kDa 의 평균 분자량을 가진 3 mg/ml 내지 10 mg/ml의 히알루로난의 점도 범위 이내인, 대상체에서 허혈성 조직을 치료하는 방법.
  26. 제 24항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물의 점도가 1,560 kDa 의 평균 분자량을 가진 5 mg/ml 의 히알루로난의 점도와 동일한, 대상체에서 허혈성 조직을 치료하는 방법.
  27. 제 25항에 있어서,
    상기 히알루로난의 평균 분자량이 700 kDa 내지 2,000 kDa 이고, 상기 히알루로난의 농도가 3 mg/ml 내지 10 mg/ml 인, 대상체에서 허혈성 조직을 치료하는 방법.
  28. 제 26항에 있어서,
    상기 히알루로난의 평균 분자량이 1,560 kDa 이고, 상기 히알루로난의 농도가 5 mg/ml인, 대상체에서 허혈성 조직을 치료하는 방법.
  29. 제 17항에 있어서,
    상기 매트릭스 구성요소가 콜라겐, 세포외 매트릭스 인자, 단백질, 또는 다당류를 추가로 포함하는, 대상체에서 허혈성 조직을 치료하는 방법.
  30. 제 17항에 있어서,
    상기 헤파린 또는 이의 유도체가 미분획 헤파린(UFH: unfractionated heparin), 분획 헤파린(fractionated heparin)(저분자량 헤파린), 헤파리노이드(heparinoid), 에녹사파린(enoxaparin), 달테파린(daltepartin), 또는 틴자파린(tinzaparin)으로 구성된 군으로부터 선택되는, 대상체에서 허혈성 조직을 치료하는 방법.
  31. 제 17항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 헤파린 또는 이의 유도체를 100 ㎕당 0.00001 U 내지 20 U 로 함유하는, 대상체에서 허혈성 조직을 치료하는 방법.
  32. 제 17항에 있어서,
    상기 헤파린이 체중 1 그램당 0.00001 U 내지 20 U 의 용량으로 투여되는, 대상체에서 허혈성 조직을 치료하는 방법.
  33. 제 17항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 코어 구성요소가 혈전용해(thrombolytic) 약물 또는 혈관신생(angiogenic) 화합물을 추가로 포함하는 방법.
  34. 제 33항에 있어서,
    상기 혈전용해(thrombolytic) 약물 또는 혈관신생(angiogenic) 화합물이 티클로피딘(ticlopidine), 와파린(warfarin), 조직 플라스미노겐 활성화제, 에미나제(eminasee), 레타바제(retavase), 스트렙타제(streptase), 조직 플라스미노겐 활성화제, 테넥테플라제(tenecteplase), 아보키나제(abbokinase), 킨리틱(kinlytic), 유로키나제(urokinase), 프로유로키나제(prourokinase), 아니소일레이트화 정제 스트렙토키나제 활성화제 복합체(APSAC: anisoylated purified streptokinase activator complex), 피브린(fibrin), 플라스민(plasmin), 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)로 구성된 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
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