KR20200078570A - 감염 치료 또는 예방을 위한 효소적으로 가수분해된 펙틴 다당류 - Google Patents

감염 치료 또는 예방을 위한 효소적으로 가수분해된 펙틴 다당류 Download PDF

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Abstract

본 발명은 감염의 치료적 또는 예방적 치료에 사용되는 제품에 관한 것으로, 상기 치료는 제품의 구강 투여를 포함하며, 여기서 상기 제품은 영양제, 식품, 식이 보충제, 음료 및 약학 제품으로부터 선택되며, 상기 제품은 하기의 조합 특징을 갖는 당근 RG-I 다당류를 함유한다: ㆍ 10-300kDa 범위의 분자량; ㆍ 갈락투론산 잔기와 람노오스 잔기로 구성된 백본, 상기 람노오스 잔기는 알파(1→4)-갈락투로닉-알파(1→2)-람노오스 잔기에 함유됨; ㆍ 하기의 단당류 조성: 20-60몰% 갈락투론산 잔기, 여기서 개별 갈락투론산은 메틸화 및/또는 아세틸화될 수 있음; 8-50몰% 람노오스 잔기; 0-40몰% 아라비노오스 잔기; 0-40몰% 갈락토오스 잔기; 5:1 내지 1:1 범위의 갈락투론산 잔기 대 람노오스 잔기의 몰비; 갈락투론산 잔기, 람노오스 잔기, 아라비노오스 잔기 및 갈락토오스 잔기는 함께 당근 RG-1 다당류에서 단당류 잔기의 적어도 85몰%를 구성함. 이들 당근 RG-I 다당류는 당근 펙틴 분리물에 존재하는 펙틴 다당류를 부분 가수분해함으로써 제조될 수 있다. 당근 RG-I 다당류의 감염에 대한 효과는 RG-I 다당류를 효소적으로 가수분해하여 호모갈락투로난 성분의 적어도 일부를 제거함으로써 실질적으로 개선된다.

Description

감염 치료 또는 예방을 위한 효소적으로 가수분해된 펙틴 다당류
본 발명은 상기도의 감염과 같은 감염의 예방적 또는 치료적 치료에서 효소적으로 가수분해된 펙틴 다당류(pectic polysaccharides)의 용도에 관한 것이다. 효소적으로 가수분해된 펙틴 다당류는 당근에서 유래하며, 매우 높은 람노갈락투로난 I(RG-I, rhamnogalacturonan I) 함량을 특징으로 한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 영양제, 식품, 식이 보충제, 음료 또는 약학 제품으로부터 선택된 제품을 제공하며, 상기 제품은 상기 효소적으로 가수분해된 당근 RG-1 다당류를 함유한다. 본 발명은 또한 감염의 치료에서 상기 언급된 생성물의 용도 및 효소적으로 가수분해된 당근 RG-1 다당류의 제조 방법에 관한 것이다.
감염은 질병을 유발하는 제제에 의한 유기체의 신체 조직의 침입, 이들의 증식 및 숙주 조직과 이들 유기체 및 이들이 생성하는 독소에 대한 숙주 조직의 반응이다. 유기체는 면역 시스템을 사용하여 감염과 싸울 수 있다. 면역 시스템은 질병으로부터 보호하는 유기체 내에서 많은 생물학적 구조 및 프로세스를 포함하는 숙주 방어 시스템이다. 영양은 면역 기능의 중요한 조절자이다. 예를 들어, 식이 섬유는 면역 시스템의 다양한 특성을 조절하여 감염에 대한 저항성을 변형시킬 수 있다. 면역 시스템을 자극하거나 지원하면 질병을 유발하는 유기체에 대해 더 효과적인 면역 반응이 일어난다. 이것은 증상적 감염을 예방하거나 감염의 보다 빠른 회복을 이끌 수 있다.
상기도 감염은 코, 부비동(sinuses), 인두 또는 후두를 포함하는 상기도를 포함하는 급성 감염에 의해 발생하는 질환이다. 이는 일반적으로 코막힘, 인후염, 편도선염, 인두염, 후두염, 부비동염, 중이염, 특정 타입의 인플루엔자 및 감기를 포함한다. 대부분의 감염은 본질적으로 바이러스성이며, 다른 경우에 그 원인은 박테리아이다. 상기도 감염은 또한 곰팡이 또는 기생충일 수 있지만, 이는 훨씬 덜 일반적이다. 하기도 감염은 일반적으로 상기도 감염보다 더 심각하며, 모든 감염성 질환 중에서 사망의 주요 원인이다.
급성 호흡기 감염을 일으킬 수 있는 바이러스에는 리노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스, 콕사키 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial viruses) 및 인간 메타뉴모바이러스(human metapneumovirus)가 포함된다. 상기도 감염을 유발할 수있는 박테리아로는 그룹 A 베타-용혈성 연쇄상구균, 코리네박테리움 디프테리아, 임질균(neisseria gonorrhoeae), 클라미디아 뉴모니아(chlamydia pneumoniae), 그룹 C 베타-용혈성 연쇄상구균이 포함된다.
어린이들은 매년 2-9회의 바이러스성 호흡기 질환에 걸린다. 상기도 감염은 사람들이 직장과 학교를 빠지는 주요 원인이다. 인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스, 홍역, 풍진, 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 디프테리아, 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 및 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)에 대한 예방 접종은 URT 감염을 예방하거나 감염의 심각성을 감소시킬 수 있다.
면역 시스템이 보호를 제공하는 다른 감염에는 장 감염이 포함된다. 장 감염성 질환에는 특히 콜레라, 장티푸스, 파라티푸스(paratyphoid fever), 다른 타입의 살모넬라 감염, 세균성 이질(shigellosis), 보툴리눔 독소증(botulism), 위장염(gastroenteritis) 및 아메바증이 포함된다. 감염성 설사로도 알려진 위장염은 위와 소장을 포함하는 위장관의 염증이다. 징후 및 증상으로는 설사, 구토 및 복통이 포함된다. 열, 에너지 부족 및 탈수 또한 발생할 수 있다. 위장염은 바이러스, 박테리아, 기생충 및 곰팡이에 의한 감염에 기인할 수 있다. 로타바이러스, 노로바이러스, 아데노바이러스 및 아스트로바이러스는 바이러스성 위장염을 유발하는 것으로 알려져 있다. 로타바이러스는 어린이들에서 위장염의 가장 흔한 원인이다.
선진국에서 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)는 박테리아성 위장염의 주요 원인이다. 위장염을 유발할 수 있는 다른 박테리아로는 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 스타필로코커스 오우러스(Staphylococcus aureus) 및 캄필로박터(Campylobacter) 종이 포함된다. 독성 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile)는 노인에서 더 자주 발생하는 설사의 중요한 원인이다. 많은 원생 동물은 또한 가장 일반적으로 지아디아 람빌라(Giadia lamblia)의 위장염을 유발할 수 있지만, 엔트아메바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 크립토스포르디움(Cryptosporidium) spp. 및 기타 종들도 관련이 있다.
US 2004/072791에는 유해 물질 또는 유기체의 포유동물 세포에의 부착, 특히 감염과의 싸움을 위해 차단하기 위한 펙틴 가수분해 생성물의 용도가 기술되어 있다. 펙틴은 감귤류(citrus), 사과 또는 사탕무에서 얻을 수 있다.
US 2002/0022601에는 키틴 올리고당, 키토산 올리고당 및 부분적으로 탈아세틸화된 키틴 올리고당으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함하는 제제를 투여하는 것을 포함하는, 감기 예방 또는 치료 방법이 기술되어 있다.
US 2011/0112048에는 스트레스를 받은 대상자에서 상기도 감염 증상을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 유효량의 베타-글루칸을 투여하는 단계를 포함하는 것이 기술되어 있다.
US 2013/0137757에는 인플루엔자 바이러스 감염을 억제하는 방법이 기재되어 있으며, 상기 방법은 펙틴 및 폴리뉴클레오티드를 주로 함유하는 조성물을 대상자의 점막에 처리하여 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌과 시알산 사이의 부착을 억제하는 것을 포함한다.
US 2014/0288021에는 상기도 감염의 예방적 치료시 낙엽송 나무(larch trees)의 아라비노갈락탄 및 폴리페놀의 용도가 기재되어 있다.
US 2016/0250625에는 상기도 감염의 치료 방법이 기재되어 있으며, 상기 방법은 비피도박테리아(Bifidobacteria), 락토바실리(Lactobacilli), 프로피오니박테리아(Propionibacteria) 및 이들의 조합으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 비-복제 프로바이오틱 미생물을 포함하는 조성물에 투여하는 것을 포함한다.
펙틴은 육상 식물의 1차 세포벽에 존재하는 구조적 헤테로 다당류이다.
펙틱 다당류는 다양한 양의 하기 다당류 성분을 포함하는 이종(heterogeneous) 다당류 그룹이다:
(i) 호모갈락투로난(HG),
(ii) 자일로갈락투로난(XG),
(iii) 아피오갈락투로난(apiogalacturonan, AG)
(iv) 람노갈락투로난-I(RG-I), 및
(v) 람노갈락투로난-II(RG-II).
도 1은 상기 언급된 5개의 다당류 성분을 포함하는 펙틴의 다당류의 구조의 개략도를 제공한다. 다당류 성분 AG, XG 및 RG-II는 전형적으로 소 부분의 펙틴의 다당류만을 나타낸다는 점에 유의한다.
다당류 성분 HG, AG, XG 및 RG-II는 각각 α(1-4)-연결된 D-갈락투론산 단당류 단위의 선형 쇄로 구성된 백본을 포함한다.
RG-1만이 반복 이당류 단위의 선형 쇄로 구성된 백본을 포함한다: 4)-α-D-갈락투론산-(1,2)-α-L-람노오스-(1. RG-I의 구조의 개략도가 도 2에 도시된다.
펙틴 다당류 조성 및 미세 구조는 식물 공급원 및 적용되는 추출 조건에 따라 크게 달라진다. 호모갈락투로난 도메인은 최대 약 100개의 연속적인 D-GalA 잔기의 길이를 가질 수 있다. 측쇄를 함유하는 RG-I 도메인은 일반적으로 '분기된 영역(ramified region)' 또는 '헤어리 영역(hairy region)'으로 불리며, 호모갈락투로난 도메인(RG-I 도메인에 연결됨)은 전형적으로 글리코시드 또는 글리코시딕 측쇄로 치환되지 않는다.
RG-I의 GalA 잔기는 1 및 4 위치를 통해 Rha 잔기에 연결되는 반면, Rha 잔기는 아노머의(anomeric) 그리고 2-OH 위치를 통해 GalA 잔기에 연결된다. 일반적으로 Rha 잔기의 약 20-80%가 중성 및 산성 측쇄와 함께 (식물 공급원 및 분리 방법에 따라) 4-OH 위치에서 분지된다. 이들 측쇄는 아라비난, 아라비노갈락탄 I(AG-I) 및/또는 AG-II로 알려진 폴리머를 구성하는 다양한 방식으로 연결된 Ara 및 Gal 잔기로 주로 구성된다. AG I은 알파-L-아라비노실기의 3-OH에서 치환을 갖는 베타-(1,4)-연결된 D-Gal 백본으로 구성되고; Gal 백본은 인터스페이싱(interspacing) 알파(1,5)-L-Ara 단위를 가질 수 있다. AG-II는 외부적으로 짧은 (1,6)-연결된 사슬의 치환을 갖는 주로 내부 베타(1,3)-연결된 D-Gal을 갖는 고도로 분기된 갈락탄으로 구성된다. 후자는 (1,3)- 및/또는 알파(1,5)-연결된 L-Ara의 추가 부착을 갖는다. 올리고당 측쇄는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이들 측쇄 중 일부는 알파-L-푸코사이드, 베타-D-글루쿠로니드 및 4-O-메틸 베타-D-글루쿠로닐 잔기로 종결될 수 있다.
WO 2011/069781에는 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) 종의 식물로부터 수득된 다당류를 포함하는 식용 제품이 기술되어 있으며, 여기서 다당류의 백본은 교호하는(alternating) 람노갈락투로난-I 코어 및 알파(1,4)-연결된 폴리갈락투론산 또는 알파(1,4)-연결된 올리고갈락투론산 코어를 포함하며, 여기서 다당류의 백본에서 갈락투로닐산 잔기 대 람노실 잔기의 몰비는 2.5:1 내지 1:1의 범위이고, 다당류는 적어도 70kDa의 분자량을 갖는다. 식용 제품은 미나리과(Apiaceae family)에 속하는 하나 이상의 식물, 바람직하게는 다우커스 카로타(Daucus carota)(당근) 종의 식물로부터 얻을 수 있는 다당류를 추가로 함유할 수 있다. 표 1은 110kDa 초과의 분자량을 갖는 당근으로부터 분리된 펙틴의 다당류 분획을 나타낸다. 표 2는 이 다당류 분획이 시험관내 면역 조절 활성을 가짐을 보여준다.
WO 2012/148277에는 적어도 20중량%의 건조 물질 함량을 갖는 제제가 기술되어 있으며, 상기 제제는 펙틴 다당류의 중량으로 계산시, 40kDa 초과의 분자량을 갖는 람노갈락투로난-I 펙틴 적어도 20%를 포함하는, 펙틴 다당류 혼합물의 건조 물질을 적어도 50중량% 함유하며, 상기 펙틴 다당류 혼합물은 다음을 특징으로 한다:
-20% 이하의 갈락투로닐산 잔기의 메틸화도;
-20% 이하의 갈락투로닐산 잔기의 아세틸화도;
상기 제제는 50mM 암모늄비카보네이트의 수용액으로 2.5중량%의 고형분 함량으로 희석될 때 겔을 형성하지 않는다. 실시예는 상이한 추출 절차를 사용하여 당근으로부터 분리된 펙틴 다당류 분획을 기술한다. 이들 분획 중 일부는 면역 조절 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
WO 2004/084652에는 다음의 순차적인 단계를 포함하는 식물성 퓨레(puree)의 제조 방법이 기술되어 있다:
a) 야채를 1 내지 30mm의 조각으로 분쇄, 자르거나 썰기;
b) 60 내지 90℃의 온도에서 야채 조각을 데치는 단계;
c) 데친 야채 조각을 마세레이팅 효소(macerating enzyme)와 접촉시키는 단계;
d) 마세레이팅된 야채 조각을 블렌딩하고 퓨레를 얻는 단계. 상기 국제특허출원의 실시예는 이 방법을 사용하여 당근 퓨레의 제조를 기술한다.
Broxterman 등(Acetylated pectins in raw and heat processed carrot, Carbohydrate Polymers 177 (2017) 58-66)은 펙틴에 대한 열처리의 효과가 연구된 연구를 기술하였다. 수용성 고형물(WSS)을 껍질을 벗긴 당근 또는 열처리된 당근 큐브로부터 분리된 알코올 불용성 고형물 분획으로부터 추출하였다. 펙틴의 정밀한 화학 구조를 연구하기 위해, 펙토리틱(pectolytic) 효소에 의한 제어된 분해가 수행되었다. WSS는 A. 아쿨레아투스(A. aculeatus)의 폴리갈락투로나아제(endo-PG)와 A. 나이거(A. niger)의 펙틴 리아제(pectin lyase, PL)에 의해 분해되었다.
발명의 개요
본 발명자들은 RG-1 다당류를 효소적으로 가수분해하여 호모갈락투로난 성분의 적어도 일부를 제거함으로써 감염에 대한 당근 RG-1 다당류의 효과가 실질적으로 개선될 수 있음을 발견하였다. 본 발명의 효소적으로 가수분해된 당근 RG-1 다당류는 다음과 같은 특징의 조합을 특징으로 한다:
ㆍ 10-300kDa 범위의 분자량;
ㆍ 갈락투론산 잔기와 람노오스 잔기로 구성된 백본, 상기 람노오스 잔기는 알파(1→4)-갈락투로닉-알파(1→2)-람노오스 잔기에 함유됨;
ㆍ 다음의 단당류 조성:
- 20-60몰% 갈락투론산 잔기, 여기서 개별 갈락투론산은 메틸화 및/또는 아세틸-에스테르화될 수 있음;
- 8-50몰% 람노오스 잔기;
- 0-40몰% 아라비노오스 잔기;
- 0-40몰% 갈락토오스 잔기;
- 5:1 내지 1:1 범위의 갈락투론산 잔기 대 람노오스 잔기의 몰비;
- 갈락투론산 잔기, 람노오스 잔기, 아라비노오스 잔기 및 갈락토오스 잔기는 함께 당근 RG-1 다당류에서 단당류 잔기의 적어도 85몰%를 구성한다.
본 발명의 일 견지는 감염의 치료적 또는 예방적 치료에서 상기 언급된 당근 RG-1 다당류를 함유하는 제품의 용도에 관한 것이다.
본 발명자들은 이론에 구속되기를 원하지 않지만, 호모갈락투로난 성분의 제거([GalA]:[Rha] 비율을 낮춤)는 RG-1 다당류의 물리화학적 특성을 변화시켜서 장 및 인간 말초 혈액 단핵 세포에서 소위 패턴 인식 수용체와 보다 효과적으로 상호작용하는 분자의 3차원 구성을 형성하는 것으로 여겨진다. 상피 세포 및 다른 면역학적 활성 세포에서 발현되는 패턴 인식 수용체와 RG-1 다당류의 상호작용은, 이들의 기능적 반응성을 조절할 수 있으며, 이는 매개체의 생산 및 면역학적 활성 세포의 재순환을 통해 장내에서뿐만 아니라 구강, 호흡기, 요로, 질 및 피부를 포함한 신체의 다른 부위에서도 감염에 대한 저항성을 향상시킬 수 있는 것으로 여겨진다.
호모갈락투로난 원소를 제거하기 위해 펙토리틱 효소를 사용하는 것은 면역조절 RG-1 다당류의 수율을 증가시키는 비용-효과적인 방법을 제공한다는 이점을 제공한다.
본 발명의 다른 견지는 영양 제제, 식품, 식이 보충제, 음료 및 약학 제품으로부터 선택되는 제품에 관한 것으로, 상기 제품은 상술한 바와 같은 당근 RG-1 다당류의 건조 물질을 적어도 0.1중량% 함유하며, 그리고 여기서 당근 RG-1 다당류는 제품에 존재하는 적어도 20중량%의 펙틴 다당류를 나타내며, 상기 펙틴 다당류는 10kDa 초과의 분자량을 갖는 임의로 분지된 다당류로서, 갈락투론산 잔기 및 람노오스 잔기로 구성되는 백본을 포함하며, 상기 람노오스 잔기는 알파(1→4)-갈락투로닉-알파(1→2)-람노오스 잔기에 함유되는 것으로 정의된다.
본 발명의 효소적으로 가수분해된 당근 RG-1 다당류는 다음을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다:
ㆍ 당근(예, 당근 퍼미스(pomace))으로부터 펙틴 분리물을 제공하는 단계, 상기 분리물은 적어도 15kDa의 분자량을 가지며 갈락투론산 잔기 및 람노오스 잔기로 구성되는 백본을 가지며, 상기 람노오스 잔기는 알파(1→4)-갈락투로닉-알파(1→2)-람노오스 잔기에 함유되어 있는, 펙틴 다당류의 건조 물질을 적어도 5중량% 포함함;
ㆍ 펙틴 리아제(EC 4.2.2.10), 펙테이트 리아제(EC 4.2.2.2), 엔도-폴리갈락투로나아제(EC 3.2.1.15), 엑소폴리갈락투로나아제(EC 3.2.1.67 및 EC 3.2.1.82)로부터 선택된 하나 이상의 갈락투로나아제를 사용하여 상기 펙틴 다당류를 부분적으로 가수분해하는 단계; 및
ㆍ 부분적으로 가수분해된 펙틴 다당류를 원심 분리, 디캔팅, 여과 및 이들의 조합으로부터 선택된 고체-액체 분리 기술에 적용하여 부분적으로 가수분해된 펙틴 다당류를 함유하는 액체 분획을 생성하는 단계;
ㆍ 10 내지 100kDa 범위의 분자량 컷-오프를 갖는 한외 여과막을 사용하여 액체 분획을 한외 여과하는 단계; 및
ㆍ 부분적으로 가수분해된 펙틴 다당류를 함유하는 농축물(retentate)을 회수하는 단계.
따라서, 본 발명의 일 견지는 감염의 치료적 또는 예방적 치료에 사용되는 제품에 관한 것으로, 상기 치료는 제품의 구강 투여를 포함하며, 여기서 상기 제품은 영양제, 식품, 식이 보충제, 음료 및 약학 제품으로부터 선택되며, 상기 제품은 다음과 같은 조합 특징을 갖는 당근 RG-I 다당류의 건조 물질을 적어도 0.1중량% 함유한다:
ㆍ 10-300kDa 범위의 분자량;
ㆍ 갈락투론산 잔기와 람노오스 잔기로 구성된 백본, 상기 람노오스 잔기는 알파(1→4)-갈락투로닉-알파(1→2)-람노오스 잔기에 함유됨;
ㆍ 다음의 단당류 조성:
- 20-60몰% 갈락투론산 잔기, 여기서 개별 갈락투론산은 C-6 위치에서 메틸화 및/또는 O-2 및/또는 O-3 위치에서 아세틸화될 수 있음;
- 8-50몰% 람노오스 잔기;
- 0-40몰% 아라비노오스 잔기;
- 0-40몰% 갈락토오스 잔기;
- 5:1 내지 1:1 범위의 갈락투론산 잔기 대 람노오스 잔기의 몰비;
- 갈락투론산 잔기, 람노오스 잔기, 아라비노오스 잔기 및 갈락토오스 잔기는 함께 당근 RG-1 다당류에서 단당류 잔기의 적어도 85몰%를 구성한다.
본 명세서에 사용된 용어 "분지된 다당류(branched polysaccharide)"는 글리코시딕 결합에 의해 함께 바인딩된 단당류 단위의 선형 백본 사슬을 포함하는 다당류로서, 여기서 백본 사슬 내의 단당류 단위 중 적어도 하나는 하나 이상의 글리코시드로 연결된(glycosidically linked) 단당류 단위의 측쇄를 보유하는 것을 지칭한다.
"백본 체인(backbone chain)" 및 "백본(backbone)"이라는 용어는 동의어이다.
본 명세서에 사용된 용어 "펙틴 다당류(pectic polysaccharide)"는 10kDa 초과의 분자량을 가지며 갈락투론산 잔기 및 람노오스 잔기로 구성된 백본을 포함하는 임의로 분지된 다당류를 지칭하며, 상기 람노오스 잔기는 알파(1→4)-갈락투로닉-알파(1→2)-람노오스 잔기에 함유된다.
본 명세서에 사용된 용어 "스트레치"는 이에 부착되는 임의의 측쇄를 제외하고, 다당류의 백본 내에서 2개의 글리코시드로 연결된 단당류 단위의 시퀀스를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "도메인"은 스트레치와 상기 스트레치에 부착되는 임의의 측쇄를 지칭한다.
용어 "람노갈락투로난-I 스트레치(rhamnogalacturonan-l stretch)" 또는 "RG-I 스트레치"는 갈락투론산(GalA) 및 람노오스(Rha) 쌍으로 구성된 스트레치를 지칭하며, 여기서 GalA 잔기는 1 및 4 위치를 통해 Rha 잔기에 연결되고, Rha 잔기는 아노머의 그리고 2-OH 위치를 통해, 즉 교호하는(alternating) 알파(1→4)-갈락투로닉-알파(1→2)-람노오스 잔기를 통해 GalA 잔기에 연결된다. RG-I 도메인은 예를 들어, 갈락탄, 아라비난 및 아라비노갈락탄 측쇄와 같은 측쇄를 포함할 수 있다.
용어 "람노갈락투로난-I-다당류(rhamnogalacturonan-l polysaccharide)" 또는 "RG-I 다당류"는 하나 이상의 람노갈락투로난-I 스트레치를 함유하는 백본을 포함하는 임의로 분지된 펙틴 다당류를 지칭한다.
RG-I 도메인 외에, 본 발명의 당근 RG-I 다당류는 하기 도메인들 중 하나 이상을 함유할 수 있다:
ㆍ 호모갈락투로난(homogalacturonan)(HG),
ㆍ 자일로갈락투로난(xylogalacturonan)(XG),
ㆍ 아피오갈락투로난(apiogalacturonan)(AG)
ㆍ 람노갈락투로난-II(rhamnogalacturonan-II)(RG-II).
도메인 XG, AG 및 RG-II는 전형적으로 RG-I 다당류의 소수 분획만을 나타낸다.
본 발명의 RG-I 다당류에 임의로 존재하는 HG 도메인, XG 도메인, AG 및 RG-II 도메인은 둘 이상의 α-(1-4)-연결된 D-갈락투론산의 선형 사슬로 구성되는 백본을 포함한다.
HG 도메인은 어느 측쇄를 함유하지 않는다. HG 도메인의 백본 내에 갈락투론산 잔기의 카르복실기는 에스테르화될 수 있다. 에스테르화된 갈락투론산은 메틸 에스테르 또는 아세틸 에스테르의 형태로 발생할 수 있다.
XG 도메인의 백본은 D-자일로오스의 형태로 하나 이상의 측쇄를 함유한다.
AG 도메인의 백본은 하나 이상의 D-아피오스(D-apiose) 잔기를 포함하여 구성되는 하나 이상의 측쇄를 함유한다.
RG-II의 백본은 D-자일로오스 또는 D-아피오스로 독점적으로 구성되지 않는 하나 이상의 측쇄를 함유한다. RG-II 도메인의 백본 내에 갈락투론산 잔기의 카르복실시는 에스테르화될 수 있다. 갈락투론산은 메틸 또는 아세틸기에 의해 에스테르화되어, 각각 메틸 또는 아세틸 에스테르를 형성할 수 있다.
용어 "아세틸화도(degree of acetylation)"는 퍼센트로 표현되는, 갈락투론산 잔기 당 아세틸 잔기의 수를 지칭한다.
용어 "메틸화도(degree of methylation)"는 퍼센트로 표현되는, 갈락투론산 잔기 당 메틸 잔기의 수를 지칭한다.
상이한 다당류 및 그의 단당류 조성의 농도는 당업자에게 공지된 분석 기술에 의해 결정될 수 있다. 산 가수분해(메타노라이시스(methanolysis)) 후, 중성 당의 단당류 조성은 펄스 전류 측정 검출(HPAEC-PAD)과 결합된 고성능 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 적절하게 측정될 수 있다.
우론산(갈락투론산은 우론산의 주된 형태임)은 비색 m-하이드록시디페닐 분석법을 사용하여 측정할 수 있다.
분자 크기 분포는 굴절률(R1) 검출(농도)을 이용한 고성능 크기-배제 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
상기 언급된 분석 방법은 Analytical Biochemistry Vol. 207, Issue 1, 1992, pg 176(중성 당 분석을 위해) 및 Mol. Nutr. Food Res., Vol 61, Issue 1, 2017, 1600243(우론산 분석 및 분자 크기 분포를 위해)에 기술되어 있다.
본 명세서에 언급된 모든 퍼센트는 달리 표기하지 않는 한 중량 퍼센트를 지칭한다.
본 발명의 치료의 문맥 내에서 경구 투여는 자가-투여를 포함한다.
본 발명에 따른 치료적 또는 예방적 치료시 사용은 바람직하게 적어도 100mg, 보다 바람직하게 적어도 350mg, 그리고 가장 바람직하게 350-5000mg의 당근 RG-I 다당류를 제공하는 투여량으로 제품의 경구 투여를 포함한다.
다른 바람직한 구현으로, 치료는 적어도 100mg, 보다 바람직하게 적어도 350mg, 그리고 가장 바람직하게 350-5000mg의 당근 RG-I 다당류를 제공하는 일일 투여량으로 제품의 경구 투여를 포함한다.
특히 바람직한 구현에 따르면, 제품은 감기 또는 독감과 같은 상기도의 감염의 치료적 또는 예방적 치료에 사용된다.
다른 바람직한 구현에 따르면, 제품은 위장염과 같은 장관의 감염의 치료적 또는 예방적 치료에 사용된다.
본 발명의 RG-I 다당류 함유 조성물을 경구 투여하는 대상자는 바람직하게는 포유 동물, 보다 바람직하게는 인간 대상자이다.
본 발명의 제품은 바람직하게 영양 제제, 식품, 식이 보충제 또는 음료이다.
제품은 바람직하게 적어도 0.2 건조물질 중량%, 보다 바람직하게 0.3-10 건조물질 중량% 및 가장 바람직하게 0.4-5 건조물질 중량%의 당근 RG-I 다당류를 함유한다.
당근 RG-I 다당류는 바람직하게 RG-I 다당류가 풍부한 펙틴 다당류 분리물의 형태로 본 발명의 제품에 편입된다. 따라서, 특히 바람직한 구현으로, 당근 RG-I 다당류는 제품에 존재하는 펙틴 다당류의 적어도 20wt.%, 보다 바람직하게 적어도 30wt.%, 보다 바람직하게 60wt.%, 그리고 가장 바람직하게 적어도 80wt.%를 나타내며, 상기 펙틴 다당류는 10kDa 초과의 분자량을 가지며 갈락투론산 잔기 및 람노오스 잔기로 구성된 백본을 포함하며, 상기 람노오스 잔기는 알파(1→4)-갈락투로닉-알파(1→2)-람노오스 잔기에 함유된, 임의로 분지된 다당류로서 정의된다.
본 발명에 따라 사용되는 당근 RG-I 다당류는 람노갈락투로난-I 스트레치 및 임의로 알피(1,4)-연결된 호모-갈락투론산 스트레칭를 포함하는 백본을 갖는다. 당근 RG-I 다당류에서 갈락투론산 잔기 대 람노오스 잔기의 몰비는 5:1 내지 1:1 범위 내이다. 바람직하게 당근 RG-I 다당류에서 갈락투론산 잔기 대 람노오스 잔기의 몰비는 4.8:1 내지 1:1, 보다 바람직하게 4.5:1 내지 1.1, 보다 바람직하게 4.2:1 내지 1:1, 가장 바람직하게 4:1 내지 1.1:1 범위이다.
람노오스 잔기는 전형적으로 당근 RG-I 다당류에 함유된, 즉 측쇄에 함유된 단당류 잔기를 포함하는, 모든 단당류 잔기의 9-45%, 보다 바람직하게 10-40%, 그리고 가장 바람직하게 11-35%를 나타낸다.
아라비노오스 잔기는 전형적으로 당근 RG-I 다당류에 함유된 모든 단당류 잔기의 4-38%, 보다 바람직하게 6-36%, 그리고 가장 바람직하게 8-34%를 나타낸다.
갈락토오스 잔기는 당근 RG-I 다당류에 함유된 모든 단당류 잔기의 4-42%, 보다 바람직하게 8-40%, 그리고 가장 바람직하게 10-38%를 나타낸다.
갈락투론산 잔기, 람노오스 잔기, 아라비노오스 잔기 및 갈락토오스 잔기의 조합은 함께 바람직하게 당근 RG-I 다당류에서 단단류 잔기의 적어도 88몰%, 보다 바람직하게 적어도 90몰%, 그리고 가장 바람직하게 적어도 92몰%를 구성한다.
당근 RG-I 다당류는 전형적으로 적어도 10kDa의 분자량을 갖는다. 보다 바람직하게, 하나 이상의 RG-I 다당류는 20kDa 내지 300kDa, 가장 바람직하게 40kDa 내지 300kDa의 분자량을 갖는다.
본 발명의 당근 RG-I 다당류는 당근에서 발견되는 펙틴 다당류의 효소적 가수분해에 의해 적절히 생성될 수 있다. 당근에서 발견되는 펙틴 다당류는 전형적으로 30-50%의 아세틸화도 및 60-80%의 메틸화도를 갖는다. 효소적 가수분해에 의한 이들 펙틴 다당류로부터의 호모갈락투로난(HG) 도메인의 제거는 전형적으로 감소된 메틸화도 및 증가된 아세틸화도를 갖는 RG-I 풍부 다당류를 수득한다.
본 발명에 따라 사용되는 효소적 가수분해는 적어도 20%, 보다 바람직하게 30-110%, 바람직하게 35-90% 그리고 가장 바람직하게 40-70%의 아세틸화도를 갖는 당근 RG-I 다당류를 수득한다.
본 발명의 바람직한 구현에 따라. 당근 RG-I 다당류의 효소적 제조는 예를 들어, 펙틴에스테라아제 활성에 기인하여 메틸화도의 실질적인 감소를 일으킨다. 바람직하게, 당근 RG-1 다당류는 50% 이하, 보다 바람직하게 40% 이하, 그리고 가장 바람직하게 10-30%의 메틸화도를 갖는다.
다른 바람직한 구현에 따르면, 당근 RG-1 다당류의 아세틸화도(DA) 대 당근 RG-I 다당류의 메틸화도(DM)의 비율은 바람직하게 1 이상, 보다 바람직하게 2 이상, 보다 바람직하게 3 이상, 그리고 가장 바람직하게 5 이상이다. 펙틴에스테라아제 활성은 효소적으로 제조된 당근 RG-I 다당류의 아세틸화도에 현저한 영향을 미치지 않기 때문에, 매우 높은 DA:DM 비율을 갖는 RG-I 다당류는 펙티나아제(폴리갈락투로나아제 및/또는 리아제) 및 펙틴에스테라아제의 조합을 이용하여 부분적으로 가수분해하는 당근 펙틴 다당류에 의해 얻어질 수 있다.
다른 바람직한 구현에 따라, 펙틴 다당류로부터 당근 RG-I 다당류의 효소적 제조는 말단에 불포화 갈락투론산 잔기를 함유하는 당근 RG-I 다당류를 생성한다. 당근에서 발견되는 펙틴 다당류는 보통 불포화 갈락투론산 잔기를 함유하지 않는다. 그러나, 펙틴 리아제 및/또는 펙테이트 리아제에 의한 이들 펙틴 다당류의 가수분해는, 불가피하게 말단 불포화 비환원 갈락투론산 잔기를 함유하는 다당류 프레그먼트를 생성한다. RG-I 다당류에서 말단 비-환원 갈락투론산 잔기의 바람직하게, 적어도 10%, 보다 바람직하게 적어도 25%, 그리고 가장 바람직하게 적어도 50%가 불포화 갈락투론산 잔기이다. 불포화 갈락투론산은 예를 들어, 235nm에서 UV 흡광을 측정함으로써 쉽게 확인될 수 있다.
당근 RG-I 다당류의 백본은 하나 이상의 측쇄를 포함할 수 있다. 이들 측쇄는 아라비노오스 및/또는 갈락토오스의 잔기, 및 소량의 단량체 푸코오스, 글루코오스, 글루쿠론산, 자일로오스, 및/또는 우론산의 잔기를 함유할 수 있다. 하나 이상의 측쇄는 바람직하게 갈락탄 측쇄, 아라비난 축쇄 및 아라비노갈락탄 측쇄로부터 선택된다.
아라비난 측쇄는 적어도 하나 이상의 알파(1,5)-연결된 아라비노오스 잔기를 포함하며, RG-I 도메인에서 람노오스 잔기의 4-OH 위치에 치환된다. 아라비만 측쇄는 선형이거나 또는 분지될 수 있다. 측쇄가 선형인 경우에, 측쇄는 알파(1,5)-연결된 아라비노오스 잔기로 구성된다. 아라비난 측쇄가 분지된 측쇄인 경우에, 하나 이상의 알파-아라비노오스 잔기가 알파(1,5)-연결된 아라비노오스들의 O-2 및/또는 O-3에 연결된다.
갈락탄 측쇄는 적어도 하나 이상의 베타(1,4)-연결된 갈락토오스 잔기를 포함하며, RG-I 도메인에서 람노오스 잔기의 O-4 위치에 치환된다.
아라비노갈락탄 측쇄는 RG-I 도메인에서 람노오스 잔기의 O-4 위치에 치환되며, 타입 I 아라비노갈락탄(AGI) 또는 타입 II 아라비노갈락탄(AGII)일 수 있다. AGI는 (1→4)-β-D-Galp 백본을 포함하여 구성되며, 이에 O-6 위치에서 또는 O-3 위치에서 모노머릭 Galp 단위에 의한 치환이 일어날 수 있다. AGI는 α-L-Araf-p 잔기로 및/또는 (1→5)-α-L-Araf 짧은 측쇄로 추가로 치환된다. AGII은 아라비노실화된 (1→6)-β-D-Galp 2차 사슬로 데코레이팅된 α(1→3)-β-D-Galp 백본을 포함하여 구성된다.
바람직하게, 아라비노오스 잔기 및 람노오스 잔기는 당근 RG-I 다당류에 4:1 미만, 보다 바람직하게 3:1 미만, 가장 바람직하게 2:1 미만의 몰비로 존재한다.
갈락토오스 잔기 및 람노오스 잔기는 바람직하게 당근 RG-I 다당류에 4:1 미만, 보다 바람직하게 3.2:1 미만, 가장 바람직하게 2.5:1 미만의 몰비로 존재한다.
당근 RG-I 다당류에서 아라비노오스 잔기와 갈락토오스 잔기의 조합 대 람노오스 잔기의 몰비는 바람직하게 7:1 미만, 보다 바람직하게 5:1 미만, 그리고 가장 바람직하게 4:1 미만이다.
갈락투론산 잔기와 람노오스 잔기의 조합은 바람직하게 당근 RG-I 다당류에 함유된 단당류 잔기의 적어도 30몰%, 보다 바람직하게 35-90몰%, 그리고 가장 바람직하게 40-75몰%를 구성한다.
특히 바람직한 구현에 따르면, 당근 RG-I 다당류는 하기의 단당류 조성을 갖는다:
- 21-55몰% 갈락투론산 잔기, 여기서 개별 갈락투론산은 메틸화 및/또는 아세틸-에스테르화될 수 있음;
- 9-35몰% 람노오스 잔기;
- 5-35몰% 아라비노오스 잔기;
- 5-40몰% 갈락토오스 잔기.
본 발명의 제품에서 당근 RG-I 다당류는 바람직하게 당근 펙틴의 부분적인 효소적 가수분해에 의해 얻어진다. 특히 바람직한 구현에 따르면, 당근 RG-I 다당류는 펙틴 리아제(EC 4.2.2.10), 펙테이트 리아제(EC 4.2.2.2), 엔도-폴리갈락투로나아제(EC 3.2.1.15), 엑소폴리갈락투로나아제(EC 3.2.1.67 및 EC 3.2.1.82)로부터 선택된 하나 이상의 펙티나아제를 사용하여 당근 펙틴의 효소적 가수분해에 의해 얻어진다. 가장 바람직하게, 당근 RG-I 다당류는 펙틴 리아제(EC 4.2.2.10) 및 엔도-폴리갈락투로나아제(EC 3.2.1.15)로부터 선택된 하나 이상의 펙티나아제를 사용하여 당근 펙틴의 효소적 가수분해에 의해 얻어진다.
본 발명의 제품은 바람직하게 미량의 하나 이상의 상기 언급된 펙티나아제를 함유한다. 이들 펙티나아제는 활성 형태 및/또는 불활성 형태로 존재할 수 있다.
바람직한 일 구현에 따르면, 당근 RG-I 다당류는 펙틴에스테라아제(EC 3.1.1.11)와 결합하여 엔도-폴리갈락투로나아제 및/또는 엑소폴리갈락투로나아제를 사용하여 당근 펙틴의 효소적 가수분해에 의해 얻어진다.
다른 바람직한 구현에 따르면, 당근 RG-I 다당류는 펙틴 리아제 및/또는 펙테이트 리아제를 사용하여 당근 펙틴의 효소적 가수분해에 의해 얻어진다.
당근 RG-I 다당류 외에, 본 발명의 제품은 바람직하게 락토오스, 이눌린, 프룩토올리고당, 갈락토올리고당, 우유(milk) 올리고당, 구아검 및 아라빅검으로부터 선택된 하나 이상의 프리바이오틱스를 적어도 1 건조물질 중량%, 보다 바람직하게 적어도 3 건조물질 중량% 함유한다. 보다 바람직하게, 제품은 락토오스, 이눌린, 프룩토올리고당, 갈락토올리고당 및 우유 올리고당으로부터 선택된 하나 이상의 프리바이오틱스를 적어도 1 건조물질 중량%, 보다 바람직하게 적어도 3 건조물질 중량% 함유한다.
본 발명의 다른 견지는 영양 제제, 식품, 식이 보충제, 음료 및 약학 제품으로부터 선택되는 제품에 관한 것으로, 상기 제품은 상술한 바와 같은 당근 RG-1 다당류의 건조 물질을 적어도 0.1중량% 함유하며; 여기서 당근 RG-1 다당류는 제품에 존재하는 적어도 20중량%의 펙틴 다당류를 나타내며, 상기 펙틴 다당류는 10kDa 초과의 분자량을 갖는 임의로 분지된 다당류로서, 갈락투론산 잔기 및 람노오스 잔기로 구성되는 백본을 포함하며, 상기 람노오스 잔기는 알파(1→4)-갈락투로닉-알파(1→2)-람노오스 잔기에 함유되는 것으로 정의된다.
본 발명의 다른 견지는 당근 RG-I 다당류를 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
ㆍ 당근으로부터 펙틴 분리물을 제공하는 단계, 상기 분리물은 적어도 15kDa의 분자량을 가지며 갈락투론산 잔기 및 람노오스 잔기로 구성되는 백본을 가지며, 상기 람노오스 잔기는 알파(1→4)-갈락투로닉-알파(1→2)-람노오스 잔기에 함유되어 있는, 펙틴 다당류의 건조 물질을 적어도 5중량%, 바람직하게 상기 펙틴 다당류의 건조 물질을 적어도 10중량%, 보다 바람직하게 상기 펙틴 다당류의 건조 물질을 적어도 25중량% 포함함;
ㆍ 펙틴 리아제(EC 4.2.2.10), 펙테이트 리아제(EC 4.2.2.2), 엔도-폴리갈락투로나아제(EC 3.2.1.15), 엑소폴리갈락투로나아제(EC 3.2.1.67 및 EC 3.2.1.82)로부터 선택된 하나 이상의 펙티나아제를 사용하여 상기 펙틴 다당류를 부분적으로 가수분해하는 단계; 및
ㆍ 부분적으로 가수분해된 펙틴 다당류를 원심 분리, 디캔팅, 여과 및 이들의 조합으로부터 선택된 고체-액체 분리 기술에 적용하여 부분적으로 가수분해된 펙틴 다당류를 함유하는 액체 분획을 생성하는 단계;
ㆍ 10 내지 100kDa 범위의 분자량 컷-오프를 갖는 한외 여과막을 사용하여 액체 분획을 한외 여과하는 단계; 및
ㆍ 부분적으로 가수분해된 펙틴 다당류를 함유하는 농축물(retentate)을 회수하는 단계
를 포함한다.
바람직한 일 구현에 따르면, 펙틴 다당류는 엔도-폴리갈락투로나아제(EC 3.2.1.15) 및 엑소폴리갈락투로나아제(EC 3.2.1.67 및 EC 3.2.1.82)로부터 선택된 하나 이상의 펙티나아제를 사용하여 부분적으로 가수분해된다.
다른 바람직한 구현에 따르면, 펙틴 다당류는 펙틴 리아제(EC 4.2.2.10) 및 펙테이트 리아제(EC 4.2.2.2)로부터 선택된 하나 이상의 펙티나아제를 사용하여 부분적으로 가수분해된다. 본 명세서에서 앞서 설명한 바와 같이, 이들 리아제에 의한 펙틴 다당류의 가수분해는 말단 불포화 비환원 갈락투론산 잔기를 함유하는 다당류 프레그먼트를 생성한다.
펙틴 다당류는 바람직하게 상기 언급된 하나 이상의 펙티나아제와 하나 이상의 펙틴에스테라아제(EC 3.1.1.11)의 조합을 사용하여 본 발명의 방법으로 가수분해된다. 하나 이상의 펙틴에스테라아제는 하나 이상의 펙티나아제를 사용하기 전에 또는 이와 동시에 사용될 수 있다. 펙티나아제와 펙틴에스테라아제의 조합 사용은 사용되는 펙티나아제가 엔도-폴리갈락투로나아제, 엑소폴리갈락투로나아제 및 이의 조합으로부터 선택되는 경우에 특히 유리하다. 펙티나아제와 펙틴에스테라아제의 조합 사용은 전형적으로 감소된 메틸화도 및 증가된 아세틸화/메틸화 비율을 갖는 부분적으로 가수분해된 당근 펙틴 다당류를 생성한다.
펙틴 다당류의 부분 가수분해는 바람직하게 펙틴 다당류 및 펙티나아제의 수용액을 15-70℃ 범위의 온도에서 적어도 10분 동안, 바람직하게 15-300분 동안 유지함으로써 수행된다.
본 발명의 방법에 사용되는 당근으로부터의 펙틴 분리물은 바람직하게 당근 주스의 제조로부터 얻어지는 당근 펄프 또는 이러한 당근 펄프의 분획이다.
본 명세서에 사용된, 용어 "한외여과(ultrafiltration)"는 또한 한외여과막을 사용하는 투석을 포함한다. 본 발명의 특히 바람직한 구현으로, 고체-액체 분리로부터 얻어지는 액체 분획은 12-80kDa 범위 내 분자량 컷-오프를 갖는 한외여과막을 사용하는 한외여과에 적용된다. 보다 바람직하게, 상기 한외여과막은 10-60kDa 범위 내, 가장 바람직하게 20-40kDa 범위 내 분자량 컷-오프를 갖는다.
특히 바람직한 구현에 따르면, 한외여과 단계에서 얻어지는 농축물은 50중량% 미만의 수 함량으로 농축된다. 보다 바람직하게, 농축물은 15중량% 미만, 가장 바람직하게 12중량% 미만의 수 함량으로 건조된다.
상기 언급된 농축물은 바람직하게 분무 건조, 드럼 건조 및 동결 건조로부터 선택된 건조 기술을 사용하여 건조된다. 보다 바람직하게, 사용되는 건조 기술은 분무 건조 또는 드럼 건조이다. 가장 바람직하게, 농축물은 분무 건조에 의해 건조된다.
본 발명의 방법은 바람직하게 유기 용매를 사용하지 않는다.
본 발명의 방법에 의해 얻어지는 당근 RG-I 다당류는 바람직하게 본 명세서에서 상술한 바와 같은 당근 RG-I 다당류이다.
본 발명은 또한 영양 제제, 식품, 음료, 식이 보충제 및 약학 제품으로부터 선택되는 제품을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 그 안에 본 명세서에서 상술한 바와 같은 당근 RG-I 다당류의 건조 물질을 0.1-50중량% 편입시키는 단계를 포함한다. 제품은 바람직하게 당근 RG-I 다당류를 하나 이상의 식용 성분과 혼합함으로써 제조된다.
본 발명의 방법의 일 구현은 영양 제제, 식품 및 음료로부터 선택된 제품의 제조에 관한 것으로, 상기 방법은 그 안에 당근 RG-I 다당류의 건조 물질을 0.5-40중량%, 보다 바람직하게 1-30중량% 편입시키는 단계를 포함한다.
다른 구현으로, 본 발명의 방법은 식이 보충제 및 약학 제품으로부터 선택된 제품을 제조하는데 사용되며, 상기 방법은 그 안에 당근 RG-I 다당류의 건조 물질을 10-90중량%, 바람직하게 20-80중량% 및 가장 바람직하게 30-60중량% 편입시키는 단계를 포함한다.
당근 RG-I 다당류는 건조 물질의 중량으로 적어도 5%, 보다 바람직하게 적어도 10%, 보다 바람직하게 적어도 20%, 그리고 가장 바람직하게 적어도 30%의 당근 RG-I 다당류를 함유하는 분리물의 형태로 제품에 편입된다.
다른 바람직한 구현에 따르면, 당근 RG-I 다당류는 분말의 형태로 제품에 편입되며, 바람직하게 15중량% 미만, 보다 바람직하게 12중량% 미만의 수 함량을 갖는 분말의 형태로 제품에 편입된다.
바람직하게, 상기 언급된 분말은 10kDa 미만의 분자량을 갖는 물질을 30중량% 미만, 보다 바람직하게 20중량% 미만, 그리고 가장 바람직하게 10중량% 미만 함유한다.
당근 RG-I 다당류는 바람직하게 분리물의 형태로 제품에 편입되며, 당근 RG-I 다당류는 분리물에 존재하는 펙틴 다당류의 적어도 20중량%, 보다 바람직하게 적어도 30중량%, 보다 바람직하게 적어도 60중량%, 그리고 가장 바람직하게 적어도 80중량%를 나타내며, 상기 펙틴 다당류는 10kDa 초과의 분자량을 갖는 임의로 분지된 다당류로서, 갈락투론산 잔기 및 람노오스 잔기로 구성되는 백본을 포함하며, 상기 람노오스 잔기는 알파(1→4)-갈락투로닉-알파(1→2)-람노오스 잔기에 함유되는 것으로 정의된다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예를 통해 더욱 상세히 설명된다.
실시예
실시예 1
건조된 당근 퍼미스(당근 섬유 분말, GreendFields, 폴란드), 당근 주스 제조의 잔여물을 탈염수(demineralised water)(100g/l)에 분산시키고, 3개의 상이한 상업적 효소를 사용하여 랩스케일 상에서 효소적 가수분해에 적용하였다(효소성 분해 조건: 45℃, 120분):
1. Pectinex® Yield Mash ex Novozymes(총 분산물의 0.02%)
2. Pectinex® Ultra Mash ex Novozymes(총 분산물의 0.02%)
3. Pectinex® Ultra Mash ex Novozymes(총 분산물의 0.05%)
효소성 분해는 90℃에서 10분간 가열함으로써 종결되었으며, 그 다음 원심분리 및 10kDa 컷 오프를 갖는 멤브레인(Microdyn Nadir; UP010)을 이용한 상청액의 투석이 수행되었다.
기준 분리물은 건조된 당근 퍼미스를 물(100g/l)에 도입하고, 그 용액을 90℃의 온도에서 120분간 유지하고, 원심분리하고, 그리고 효소성 분해된 분산물과 동일한 방식으로 투석에 의한 상청액의 투석에 의해 제조되었다.
실시예 2
실시예 1의 비-가수분해된 당근 RG-I 다당류(기준) 및 실시예 1의 효소적으로 가수분해된 당근 RG-I 다당류(샘플 1-3)의 단당류 조성을 다음과 같이 측정하였다:
상이한 다당류들의 농도 및 이들의 단당류 조성은 Analytical Biochemistry Vol. 207, Issue 1, 1992, pg 176(중성 당 분석) 및 Mol. Nutr. Food Res., Vol 61, Issue 1, 2017, 1600243(우론산 분석 및 분자 크기 분포)에 기술된 분석 방법을 사용하여 측정하였다.
단당류 분석의 결과는 표 1에 나타내었다(Rha=람노오스; GalA=갈락투론산; Ara=아라비노오스; Gal=갈락토오스).
Figure pct00001
실시예 3
실시예 1의 비-가수분해된 당근 RG-I 다당류(기준) 및 실시예 1의 효소적으로 가수분해된 당근 RG-I 다당류(샘플 1-3)의 면역조절 활성을 인간 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 어세이를 이용하여 측정하였다.
면역 조절 어세이.
다당류 물질의 면역 기능에 대한 영향을 평가하기 위해, 이들을 갓 분리된 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)와 함께 인큐베이션하였다. 간략히, PBMC는 Ficoll-plaque(Amersham)를 사용하여 혈액의 연막(buffy coats)으로부터 분리하고, PBMC(2*10E6 cells/mL)를 300μg RG-I 다당류를 함유하는 RPMI 배지(GibcoTM RPMI 1640 Medium)에서 20hr(5% CO2, 37℃) 동안 배양하였다. 후속적으로, 상청액을 수거하고, 사이토카인을 제조자의 지침에 따라 플로우사이토미터(BD FACSCANTO II)에서 측정되는 비드 어레이(CBA human inflammation kit, BD-Bioscience)를 사용하여 측정하였다. RPMI는 음성 대조구로서 사용되었으며, LPS(E. coli-Sigma L3012-5mG로부터)는 기준으로서 사용되었으며, 그 결과는 LPS로 100%로 정규화되었다. 데이터는 LPS에 의해 유도된 반응에 대해 정규화되고, 4개의 상이한 사이토카인에 대해 3개의 상이한 도너에 걸쳐 평균내어진 % 및 이들의 합으로 표현된다.
표 2는 면역조절 어세이의 결과를 나타낸다.
Figure pct00002
실시예 4
다른 스케일상에서, 즉, 20리터(샘플 1), 5,000리터(샘플 2) 및 10,000리터(샘플 3)에서 효소 Pectinex® Ultra Mash ex Novozymes(컨디션: 총 분산물의 0.1%w/w, 45℃, 2hr, 효소 불활성화: 90℃ 10분간)을 사용하여 실시예 1을 반복하였다. 샘플 2 및 3에서, 원심분리 대신에 디캔팅을 사용하여 액체로부터 고체를 분리하였다. 상청액을 10kDa 멤브레인을 사용하여 한외여과에 적용하여 소분자 성분들을 제거하였다.
가수분해된 다당류 물질의 단당류 조성은 실시예 2에 기재된 방법을 사용하여 분석되었다.
분석 결과를 표 3에 나타낸다.
Figure pct00003
아세틸화 및 메틸화의 정도는 다음과 같이 측정하였다: 다당류 샘플(2-5mg)을 소듐 하이드록시드로 처리하였다(0.1M, 밤새, 20℃). 방출된 메탄올은 DB-WAX ETR 컬럼, Cryo Focus-4 cold trap 및 FID 검출이 장착된 헤드-스페이스 GC(Huisman et al., Food Hydrocolloids, 18, 4, 2004, 665-668로부터 조정된)를 사용하여 측정하였다.
샘플들은 중성화되고(1M HCl), 그 다음 방출된 아세틸을 가드 컬럼을 갖는 Aminex HPX 87H 컬럼 및 RI 검출이 장착된 HPLC(Vorangen et al. Food Hydrocolloids, 1, 1, 1986, 65-70로부터 조정된)를 사용하여 정량화되었다. 에스테르화도는 우론산의 양의 퍼센트로서 방출된 메탄올 및 아세트산의 몰량으로서 표현된다.
에스테르화도 분석 결과를 표 4에 나타낸다.
Figure pct00004
실시예 5
실시예 4(샘플 1-3)의 효소적으로 가수분해된 당근 RG-I 다당류의 면역조절 활성을 실시예 3에 대해 기술된 바와 같이 인간 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 어세이를 이용하여 측정하였다. 그 결과를 표 5에 나타낸다.
Figure pct00005
실시예 6
실시예 4의 샘플 2의 가수분해된 다당류 물질을 추가로 가수분해한 다음, 고분자량 분획의 분리를 행하였다. 다당류 물질을 탈염수(demineralised water)(100g/l)에 분산시키고, 추가로 효소성 가수분해(Pectinex® Ultra Mash ex Novozymes, 45℃, 14시간)에 적용하였다. 효소성 분해는 90℃로 10분간 가열함으로써 종결되었다.
효소성 분해된 다당류 용액의 일부를 반제조 크기배제 크로마토그래피(semi-preparative size-exclusion chromatography)를 사용하여 분획화에 적용하여 70kDa 초과의 분자량을 갖는 다당류를 함유하는 분획을 생성하였다.
비분획화된 가수분해된 다당류 및 분리된 고분자량 분획의 단당류 조성을 실시예 2에 대해 기재된 방법을 사용하여 분석하였다.
분석 결과를 표 6에 나타낸다.
Figure pct00006
효소성 분해된 다당류 및 이의 고분자 분획의 면역조절 활성을 실시예 3에 기술된 방법을 사용하여 측정하였다. 그 결과를 표 7에 나타낸다.
Figure pct00007
실시예 7
가수분해된 펙틴 다당류 분리물을 물(100g/L)에 당근 퍼미스를 분산시킴으로써 제조하였다.
샘플 1은 추가 효소 없이 120분간 90℃에서 추출되었다(추출 수율: 4.8%)
샘플 2는 Rapidase C600(펙틴 리아제, 폴리갈락투로나아제, 펙틴 에스테라아제, 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제 활성을 함유하는 효소 믹스, Militz, H. Wood Sci.Technol. (1993) 28:9)을 45℃에서 120분간, 총 분산물의 1g/100mL의 효소 농도로 첨가함으로써 추출되었다. 효소성 분해는 100℃에서 10분간 가열함으로써 종결되었다(추출 수율: 5.6%).
두 샘플 모두 후속적으로 원심분리하고(18.000g, 10분), 상청액을 12-14kDa(Visking, London, UK) 컷오프를 갖는 멤브레인을 사용하여 광범위하게 투석하였다. 한외여과/투석 후, 분리물을 랩-스케일 동결 건조기를 사용하여 동결건조하였다.
굴절율 검출을 갖는 HPSEC에 의한 검출시, 샘플 1 및 샘플 2의 분자 크기 분포를 도 3에 나타낸다.
두 샘플의 단당류 조성을 실시예 2에 대해 기술된 방법을 사용하여 분석하였다. 분석 결과를 표 8에 나타낸다.
Figure pct00008

Claims (15)

  1. 감염의 치료적 또는 예방적 치료에 사용되는 제품으로서, 상기 치료는 제품의 구강 투여를 포함하며, 여기서 상기 제품은 영양제, 식품, 식이 보충제, 음료 및 약학 제품으로부터 선택되며, 상기 제품은 하기의 조합 특징을 갖는 당근 RG-I 다당류의 건조 물질을 적어도 0.1중량% 함유하는, 제품.
    ㆍ 10-300kDa 범위의 분자량;
    ㆍ 갈락투론산 잔기와 람노오스 잔기로 구성된 백본, 상기 람노오스 잔기는 알파(1→4)-갈락투로닉-알파(1→2)-람노오스 잔기에 함유됨;
    ㆍ 하기의 단당류 조성:
    - 20-60몰% 갈락투론산 잔기, 여기서 개별 갈락투론산은 C-6 위치에서 메틸화 및/또는 O-2 및/또는 O-3 위치에서 아세틸화될 수 있음;
    - 8-50몰% 람노오스 잔기;
    - 0-40몰% 아라비노오스 잔기;
    - 0-45몰% 갈락토오스 잔기;
    - 5:1 내지 1:1 범위의 갈락투론산 잔기 대 람노오스 잔기의 몰비;
    - 갈락투론산 잔기, 람노오스 잔기, 아라비노오스 잔기 및 갈락토오스 잔기는 함께 당근 RG-1 다당류에서 단당류 잔기의 적어도 85몰%를 구성함.
  2. 제1항에 있어서,
    당근 RG-I 다당류는 50% 이하의 메틸화도를 갖는, 제품.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 당근 RG-I 다당류의 아세틸화도 대 당근 RG-I 다당류의 메틸화도의 비율은 1 이상인, 제품.
  4. 제1항에 있어서,
    RG-I 다당류에서 말단 비-환원 갈락투론산 잔기의 적어도 10%가 불포화 갈락투론산 잔기인, 제품.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    당근 RG-I 다당류는 제품에 존재하는 펙틴 다당류의 적어도 20wt.%를 나타내며, 상기 펙틴 다당류는 10kDa 초과의 분자량을 가지며 갈락투론산 잔기 및 람노오스 잔기로 구성된 백본을 포함하며, 상기 람노오스 잔기는 알파(1→4)-갈락투로닉-알파(1→2)-람노오스 잔기에 함유된, 임의로 분지된 다당류로서 정의되는, 제품.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    당근 RG-I 다당류에서 아라비노오스 잔기와 갈락토오스 잔기의 조합 대 람노오스 잔기의 몰비는 5:1 미만, 바람직하게 4.5:1 미만인, 제품.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    당근 RG-I 다당류는 하기의 단당류 조성을 갖는, 제품.
    ㆍ 21-55몰% 갈락투론산 잔기, 여기서 개별 갈락투론산은 메틸화 및/또는 아세틸-에스테르화될 수 있음;
    ㆍ 9-35몰% 람노오스 잔기;
    ㆍ 5-40몰% 아라비노오스 잔기;
    ㆍ 5-40몰% 갈락토오스 잔기.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    당근 RG-I 다당류는 당근 펙틴의 부분적인 효소적 가수분해에 의해 얻어지는, 제품.
  9. 제8항에 따른 치료적 또는 예방적 치료에 사용되는 제품으로서, 상기 사용은 적어도 200mg의 당근 RG-I 다당류를 제공하는 투여량으로 제품의 경구 투여를 포함하는, 제품.
  10. 영양 제제, 식품, 식이 보충제, 음료 및 약학 제품으로부터 선택되는 제품으로서, 상기 제품은 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 당근 RG-1 다당류의 건조 물질을 적어도 0.1중량% 함유하며; 여기서 당근 RG-1 다당류는 제품에 존재하는 적어도 20중량%의 펙틴 다당류를 나타내며, 상기 펙틴 다당류는 10kDa 초과의 분자량을 가지며, 갈락투론산 잔기 및 람노오스 잔기로 구성되는 백본을 포함하는 임의로 분지된 다당류로서, 상기 람노오스 잔기는 알파(1→4)-갈락투로닉-알파(1→2)-람노오스 잔기에 함유되는 것으로 정의되는, 제품.
  11. ㆍ 당근으로부터 펙틴 분리물을 제공하는 단계, 상기 분리물은 적어도 15kDa의 분자량을 가지며 갈락투론산 잔기 및 람노오스 잔기로 구성되는 백본을 가지며, 상기 람노오스 잔기는 알파(1→4)-갈락투로닉-알파(1→2)-람노오스 잔기에 함유되어 있는, 펙틴 다당류의 건조 물질을 적어도 5중량% 포함함;
    ㆍ 펙틴 리아제(EC 4.2.2.10), 펙테이트 리아제(EC 4.2.2.2), 엔도-폴리갈락투로나아제(EC 3.2.1.15), 엑소폴리갈락투로나아제(EC 3.2.1.67 및 EC 3.2.1.82)로부터 선택된 하나 이상의 펙티나아제를 사용하여 상기 펙틴 다당류를 부분적으로 가수분해하는 단계; 및
    ㆍ 부분적으로 가수분해된 펙틴 다당류를 원심 분리, 디캔팅, 여과 및 이들의 조합으로부터 선택된 고체-액체 분리 기술에 적용하여 부분적으로 가수분해된 펙틴 다당류를 함유하는 액체 분획을 생성하는 단계;
    ㆍ 10 내지 100kDa 범위의 분자량 컷-오프를 갖는 한외 여과막을 사용하여 액체 분획을 한외 여과하는 단계; 및
    ㆍ 부분적으로 가수분해된 펙틴 다당류를 함유하는 농축물(retentate)을 회수하는 단계
    를 포함하는, 당근 RG-I 다당류를 제조하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    펙틴 다당류는 엔도폴리갈락투로나아제 및/또는 엑소폴리갈락투로나아제를 사용한 부분 가수분해 이전에 또는 이와 동시에 하나 이상의 펙틴에스테라아제(EC 3.1.1.11)를 사용하여 가수분해되는, 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    회수된 농축물은 15중량% 미만의 수 함량으로 건조되는, 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법에 의해 얻어지는 당근 RG-I 다당류는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 당근 RG-I 다당류인, 방법.
  15. 영양 제제, 식품, 식이 보충제, 음료 및 약학 제품으로부터 선택되는 제품을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 제품에 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 당근 RG-I 다당류의 건조 물질을 0.1-50중량% 편입시키는 단계를 포함하는, 방법.
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