BR112020008079A2 - produto para uso no tratamento terapêutico ou profilático de infecções, produto, processo para preparar polissacarídeos rg-i de cenoura e método para preparar um produto - Google Patents

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Abstract

A invenção refere-se a um produto para uso no tratamento terapêutico ou profilático de infecções, o dito tratamento compreendendo administração oral do produto, em que o produto é selecionado a partir de uma formulação nutricional, um produto alimentício, um suplemento dietético, uma bebida e um produto farmacêutico, o dito produto contendo polissacarídeos RG-I de cenoura que têm a seguinte combinação de características: um peso molecular na faixa de 10 a 300 kDa; uma cadeia principal que consiste em resíduos de ácido galacturônico e resíduos de ramnose, os ditos resíduos de ramnose estando contidos em resíduos de alfa(1->4)-galacturônico-alfa(1->2)-ramnose; a seguinte composição de monossacarídeos: 20 a 60%, em mol, de resíduos de ácido galacturônico, em que os ácidos galacturônicos individuais podem ser metilados e/ou acetilesterificados; 8 a 50%, em mol, de resíduos de ramnose; 0 a 40%, em mol, de resíduos de arabinose; 0 a 40%, em mol, de resíduos de galactose; razão molar de resíduos de ácido galacturônico para resíduos de ramnose na faixa de 5:1 a 1:1; resíduos de ácido galacturônico, resíduos de ramnose, resíduos de arabinose e resíduos de galactose, em conjunto, constituem pelo menos 85%, em mol, dos resíduos de monossacarídeos nos polissacarídeos RG-I de cenoura. Os polissacarídeos RG-I de cenoura podem ser produzidos por polissacarídeos pécticos parcialmente hidrolisados presentes em um isolado de pectina de cenoura.

Description

PRODUTO PARA USO NO TRATAMENTO TERAPÊUTICO OU PROFILÁTICO DE INFECÇÕES, PRODUTO, PROCESSO PARA PREPARAR POLISSACARÍDEOS RG-I DE CENOURA E MÉTODO PARA PREPARAR
UM PRODUTO Campo Técnico da Invenção
[001] A presente invenção refere-se ao uso de polissacarídeos pécticos hidrolisados enzimaticamente no tratamento profilático ou terapêutico de infecções, como infecções do trato respiratório superior. Os polissacarídeos pécticos hidrolisados enzimaticamente são originários de cenoura e são caracterizados por um teor muito alto de ramnogalacturonana I (RG-I).
[002] Mais particularmente, a invenção fornece um produto selecionado a partir de uma formulação nutricional, um produto alimentício, um suplemento dietético, uma bebida ou um produto farmacêutico, o dito produto contendo os polissacarídeos RG-I de cenoura hidrolisados enzimaticamente anteriormente mencionados. A invenção refere-se ainda ao uso do produto anteriormente mencionado no tratamento de infecções e a um processo para preparar os polissacarídeos RG-I de cenoura hidrolisados enzimaticamente. Antecedentes da Invenção
[003] A infecção é a invasão dos tecidos corporais de um organismo por agentes causadores de doenças, sua multiplicação e a reação dos tecidos hospedeiros a esses organismos e às toxinas que eles produzem. Os organismos podem combater infecções usando seu sistema imune. O sistema imune é um sistema de defesa do hospedeiro que compreende muitas estruturas e processos biológicos dentro de um organismo que protege contra a doença. A nutrição é um modulador importante da função imune. As fibras dietéticas, por exemplo, podem modular várias propriedades do sistema imune e, dessa forma, modificar a resistência a infecções. Estimular ou apoiar o sistema imune resulta em respostas imunes mais efetivas aos organismos causadores de doenças. Isto pode resultar na prevenção de infecções sintomáticas ou levar a uma recuperação mais rápida de infecções.
GED - 4817953v1
[004] Infecções do trato respiratório superior são doenças causadas por uma infecção aguda que envolve o trato respiratório superior, incluindo nariz, seios nasais, faringe ou laringe. Isso geralmente inclui obstrução nasal, dor de garganta, amigdalite, faringite, laringite, sinusite, otite média, certos tipos de influenza e o resfriado comum. A maioria das infecções é de natureza viral e, em outros casos, a causa é bacteriana. As infecções do trato respiratório superior também podem ser de origem fúngica ou helmíntica, mas são muito menos comuns. As infecções do trato respiratório inferior são geralmente mais graves do que as infecções respiratórias superiores e são a principal causa de morte entre todas as doenças infecciosas.
[005] Os vírus que podem causar infecções respiratórias agudas incluem rinovírus, vírus influenza, adenovírus, vírus Coxsackie, vírus parainfluenza, vírus sincicial respiratório e metapneumovírus humano. As bactérias que podem causar infecções respiratórias superiores incluem estreptococos beta- hemolíticos do grupo A, Corynebacterium diphtheriae, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia pneumoniae, estreptococos beta-hemolíticos do grupo C.
[006] As crianças têm 2 a 9 doenças respiratórias virais por ano. As infecções do trato respiratório superior são as principais razões para as pessoas faltarem no trabalho e na escola. A vacinação contra vírus influenza, adenovírus, sarampo, rubéola, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, difteria, Bacillus anthracis, e Bordetella pertussis pode prevenir a infecção do URT ou reduzir a severidade da infecção.
[007] Outras infecções para as quais o sistema imune fornece proteção incluem infecções intestinais. As doenças infecciosas intestinais incluem cólera, febre tifoide, febre paratifoide, outros tipos de infecções por salmonela, shigelose, botulismo, gastroenterite e amebíase, entre outros. A gastroenterite, também conhecida como diarreia infecciosa, é a inflamação do trato gastrointestinal que envolve o estômago e intestino delgado. Sinais e sintomas incluem alguma combinação de diarreia, vômito e dor abdominal. Febre, falta de energia e desidratação também podem ocorrer. A gastroenterite pode ser GED - 4817953v1 causada por infecções por vírus, bactérias, parasitas e fungos. Sabe-se que rotavírus, norovírus, adenovírus e astrovírus causam gastroenterite viral. O rotavírus é a causa mais comum de gastroenterite em crianças.
[008] No mundo desenvolvido Campylobacter jejuni é a principal causa de gastroenterite bacteriana. Outras bactérias que podem causar gastroenterite incluem as espécies Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Staphylococcus aureus and Campylobacter. Clostridium difficile toxigênico é uma causa importante de diarreia que ocorre mais frequentemente em idosos. Vários protozoários também podem causar gastroenterite mais comumente Giardia lamblia, mas Entamoeba histolytica, Cryptosporidium spp. e outras espécies também foram envolvidas.
[009] A patente US 2004/072791 descreve o uso de produtos de hidrólise de pectina para bloquear a fixação de substâncias ou organismos prejudiciais às células de mamíferos, particularmente para combater infecções. A pectina pode ser obtida a partir de cítricos, maçãs ou beterraba sacarina.
[010] A patente US 2002/0022601 descreve um método para prevenir ou tratar resfriado comum, que compreende administrar um agente que compreende pelo menos um componente selecionado a partir de oligossacarídeo de quitina, oligossacarídeo de quitosana e oligossacarídeo de quitina parcialmente desacetilado.
[011] A patente US 2011/0112048 descreve um método para reduzir os sintomas de infecção do trato respiratório superior em sujeitos estressados, o método compreendendo: administrar uma quantidade efetiva de beta-glucana.
[012] A patente US 2013/0137757 descreve um método para inibir infecção por vírus influenza, o método compreendendo: tratar uma composição contendo principalmente pectina e polinucleotídeo em uma membrana mucosa do sujeito para inibir a adesão entre hemaglutinina do vírus influenza e ácido siálico.
[013] A patente US 2014/0288021 descreve o uso de arabinogalactana e polifenóis de lariço no tratamento profilático de infecções do trato respiratório superior.
GED - 4817953v1
[014] A patente US 2016/0250625 descreve um método para tratamento de uma infecção do trato respiratório superior, o método compreendendo administrar uma composição que compreende microrganismos probióticos não replicantes selecionados a partir do grupo que consiste em Bifidobacteria, Lactobacilli, Propionibacteria e combinações dos mesmos.
[015] A pectina é um polissacarídeo heteroestrutural presente nas paredes celulares primárias de plantas terrestres.
[016] Polissacarídeos pécticos são um grupo heterogêneo de polissacarídeos que compreende quantidades variáveis dos seguintes componentes polissacarídeos: (i) homogalacturonana (HG), (ii) xilogalacturonana (XG), (iii) apiogalacturonana (GA), (iv) ramnogalacturonana-I (RG-I) e (v) ramnogalacturonana-II (RG-II).
[017] A Figura 1 fornece uma representação esquemática da estrutura de polissacarídeos pécticos, incluindo os 5 componentes polissacarídeos anteriormente mencionados. Nota-se que os componentes polissacarídeos AG, XG e RG-II tipicamente representam apenas uma pequena fração dos polissacarídeos pécticos.
[018] Os componentes polissacarídeos HG, AG, XG e RG-II compreendem, cada um, uma cadeia principal que consiste em uma cadeia linear de unidades de monossacarídeo de ácido D-galacturônico ligadas α-(1-4).
[019] Somente RG-I compreende uma cadeia principal que consiste em uma cadeia linear das unidades de dissacarídeo de repetição: 4)-ácido α-D- galacturônico-(1,2)-α-L-ramnose-(1. Uma representação esquemática da estrutura do RG-I é mostrada na Figura 2.
[020] A composição de polissacarídeo péctico e a estrutura fina variam amplamente dependendo da fonte vegetal e das condições de extração aplicadas. O domínio homogalacturonana pode ter um comprimento de até cerca GED - 4817953v1 de 100 resíduos de D-Gala consecutivos. O domínio RG-I que contém as cadeias laterais é geralmente chamado de “região ramificada” ou “região cabeluda”, enquanto o domínio homogalacturonana (conectado aos domínios RG-I) não é tipicamente substituído por glicosídeos ou cadeias laterais glicosídicas.
[021] Os resíduos de GalA no RG-I estão ligados aos resíduos de RhA através das posições 1 e 4, enquanto o resíduo de RhA está ligado ao resíduo de GalA através das posições anoméricas e 2-OH. Em geral, cerca de 20 a 80% dos resíduos de RHA são ramificados na posição 4-OH (dependendo da fonte vegetal e do método de isolamento), com cadeias laterais neutras e ácidas. Essas cadeias laterais consistem principalmente em resíduos de Ara e Gal ligados de várias maneiras, constituindo polímeros conhecidos como arabinanas, arabinogalactana I (AG-I) e/ou AG-II. AG I é composto de uma cadeia principal D-Gal ligada em beta-(1,4) com substituições em 3-OH de grupos alfa-L-arabinosil; a cadeia principal Gal pode ter unidades alfa(1,5)-L-Ara. AG-II consiste em galactana altamente ramificada com interior predominantemente D-Gal ligado beta(1,3) com substituições de cadeias curtas ligadas (1,6) exteriormente. Este último tem ainda anexos de L-Ara ligados alfa (1,3) e/ou (1,5). As cadeias laterais de oligossacarídeos podem ser lineares ou ramificadas, e algumas dessas cadeias laterais podem ser terminadas com resíduos alfa-L-fucosídeos, beta-D-glucuronídeos e 4-O-metil beta-D-glucuronil.
[022] O documento WO 2011/069781 descreve produtos comestíveis que compreendem um polissacarídeo obtido a partir de plantas da espécie Camellia sinensis, em que a cadeia principal do polissacarídeo compreende núcleos alternados de ramnogalacturonana-l e ácido poligalacturônico ligado alfa(1,4) ou núcleos de ácido oligogalacturônico ligado alfa(1,4), em que a razão molar de resíduos de ácido galacturonil para resíduos de ramnosil na cadeia principal do polissacarídeo varia de 2,5:1 a 1:1, e em que o polissacarídeo tem um peso molecular de pelo menos 70 kDa. Os produtos comestíveis podem conter adicionalmente polissacarídeos que podem ser obtidos a partir de uma ou mais plantas pertencentes à família Apiaceae, preferencialmente a partir de plantas GED - 4817953v1 da espécie Daucus carota (cenoura). A Tabela 1 descreve um isolado de fração de polissacarídeo péctico de cenoura que tem um peso molecular maior que 110 kDa. A Tabela 2 mostra que essa fração de polissacarídeo teve atividade imunomoduladora in vitro.
[023] O documento WO 2012/148277 descreve uma preparação que tem um teor de matéria seca de pelo menos 20%, em peso, a dita preparação contendo pelo menos 50%, em peso, de matéria seca, de uma mistura de polissacarídeos pécticos, incluindo pelo menos 20%, calculados, em peso, dos polissacarídeos pécticos, de pectinas ramnogalacturonana-I que tem um peso molecular maior que 40 kDa, a dita mistura de polissacarídeos pécticos sendo caracterizada por: - um grau de metilação dos resíduos de ácido galacturonil não maior que 20%; - um grau de acetilação dos resíduos de ácido galacturonil não maior que 20%;
[024] em que a preparação não forma um gel quando é diluída com uma solução aquosa de bicarbonato de amônio 50 mM para um teor de sólidos de 2,5%, em peso. Os exemplos descrevem frações de polissacarídeo péctico que foram isoladas a partir de cenoura, com o uso de diferentes procedimentos de extração. Descobriu-se que algumas destas frações têm atividade imunomoduladora.
[025] O WO 2004/084652 descreve um processo para produção um purê de hortaliças, que compreende as etapas sequenciais de: a) triturar, picar ou fatiar as hortaliças em pedaços de 1 a 30 mm; b) branquear os pedaços de hortaliças a uma temperatura de 60 a 90 ºC; c) colocar os pedaços de hortaliças em contato com uma atividade enzimática de maceração; d) misturar os pedaços de hortaliças macerados e obter um purê. Os exemplos do pedido de patente internacional descrevem a preparação de purê de cenoura com o uso dessa metodologia.
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[026] Broxterman et al. (Acetylated pectins in raw and heat processed carrot, Carbohydrate Polymers 177 (2017) 58-66) descrevem um estudo no qual foi estudado o efeito do processamento térmico na pectina.
[027] Os sólidos solúveis em água (WSS) foram extraídos a partir de uma fração de sólidos insolúveis em álcool que havia sido isolada a partir de cenouras descascadas ou cubos de cenoura tratados termicamente. A fim de estudar a estrutura química fina da pectina, foi realizada degradação controlada por enzimas pectolíticas. Os WSS foram degradados por poligalacturonase (endo- PG) de A. aculeatus e pectina liase (PL) de A. niger. Descrição Resumida da Invenção
[028] Os inventores descobriram que a efetividade de polissacarídeos RG- I de cenoura contra infecções pode ser substancialmente aprimorada por hidrólise enzimática dos polissacarídeos RG-I para remover pelo menos parte do componente homogalacturonana. Os polissacarídeos RG-I de cenoura hidrolisados enzimaticamente da presente invenção são caracterizados pela seguinte combinação de características: • um peso molecular na faixa de 10 a 300 kDa; • uma cadeia principal que consiste em resíduos de ácido galacturônico e resíduos de ramnose, os ditos resíduos de ramnose estando contidos em resíduos de alfa(1→4)-galacturônico-alfa(1→2)-ramnose; • a seguinte composição de monossacarídeos: - 20 a 60%, em mol, de resíduos de ácido galacturônico, em que os ácidos galacturônicos individuais podem ser metilados e/ou acetilesterificados; - 8 a 50%, em mol, de resíduos de ramnose; - 0 a 40%, em mol, de resíduos de arabinose; - 0 a 40%, em mol, de resíduos de galactose; - razão molar de resíduos de ácido galacturônico para resíduos de ramnose na faixa de 5:1 a 1:1; - resíduos de ácido galacturônico, resíduos de ramnose, resíduos de arabinose e resíduos de galactose, em conjunto, constituem pelo menos 85%, GED - 4817953v1 em mol, dos resíduos de monossacarídeos nos polissacarídeos RG-I de cenoura.
[029] Um aspecto da invenção refere-se ao uso de um produto que contém os polissacarídeos RG-I de cenoura anteriormente mencionados no tratamento terapêutico ou profilático de infecções.
[030] Embora os inventores não desejem se ater à teoria, acredita-se que a remoção do componente homogalacturonana (reduzindo a razão (GalA):(Rha)) altera as propriedades físico-químicas do polissacarídeo RG-I, resultando em configurações tridimensionais da molécula, que interage mais efetivamente com os chamados receptores de reconhecimento padrão no trato intestinal e nas Células Mononucleares do Sangue Periférico humano. Acredita-se que a interação de polissacarídeos RG-I com receptores de reconhecimento padrão expressos nas células epiteliais e outras células imunologicamente ativas possa modular sua responsividade funcional, que através da produção de mediadores e recirculação de células imunologicamente ativas, pode melhorar a resistência a infecções no trato intestinal, bem como em outros locais do corpo, incluindo a cavidade oral, o trato respiratório, o trato urinário, a vagina e a pele.
[031] O uso de enzimas pectolíticas para remover elementos homogalacturonanas oferece a vantagem de fornecer uma forma econômica de aumentar a produção de polissacarídeo RG-I imunomodulatório.
[032] Outro aspecto da invenção refere-se a um produto selecionado a partir de uma formulação nutricional, um produto alimentício, um suplemento dietético, uma bebida e um produto farmacêutico, o dito produto contendo pelo menos 0,1%, em peso, de matéria seca, dos polissacarídeos RG-I de cenoura, conforme descrito acima, e em que os polissacarídeos RG-I de cenoura representam pelo menos 20%, em peso, dos polissacarídeos pécticos presentes no produto, os ditos polissacarídeos pécticos sendo definidos como polissacarídeos opcionalmente ramificados que têm um peso molecular maior que 10 kDa e que compreendem uma cadeia principal que consiste em resíduos de ácido galacturônico e resíduos de ramnose, os ditos resíduos de ramnose GED - 4817953v1 estando contidos em resíduos de alfa(1→4)-galacturônico-alfa(1→2)-ramnose.
[033] Os polissacarídeos RG-I de cenoura hidrolisados enzimaticamente da presente invenção podem ser produzidos por um processo que compreende: • fornecer um isolado de pectina de cenoura (por exemplo, bagaço de cenoura), o dito isolado compreendendo pelo menos 5%, em peso, de matéria seca de polissacarídeos pécticos que têm um peso molecular de pelo menos 15 kDa e que têm uma cadeia principal que consiste em resíduos de ácido galacturônico e resíduos de ramnose, os ditos resíduos de ramnose estando contidos nos resíduos de alfa(1→4)-galacturônico-alfa(1→2)-ramnose; • hidrolisar parcialmente os ditos polissacarídeos pécticos com o uso de uma ou mais galacturonases selecionadas a partir de pectina liase (EC
4.2.2.10), pectato liase (EC 4.2.2.2), endopoligalacturonase (EC 3.2.1.15) e exopoligalacturonase (EC 3.2.1.67 e EC 3.2.1.82); e • submeter os polissacarídeos pécticos parcialmente hidrolisados a uma técnica de separação sólido-líquido selecionada a partir de centrifugação, decantação, filtração e combinações das mesmas para produzir uma fração líquida contendo polissacarídeos pécticos parcialmente hidrolisados; • submeter a fração líquida à ultrafiltração com o uso de uma membrana de ultrafiltração que tem um peso molecular de corte na faixa de 10 a 100 kDa; e • recuperar um retentato contendo os polissacarídeos pécticos parcialmente hidrolisados. Descrição Detalhada da Invenção
[034] Consequentemente, um primeiro aspecto da invenção refere-se a um produto para uso no tratamento terapêutico ou profilático de infecções, o dito tratamento compreendendo administração oral do produto, em que o produto é selecionado a partir de uma formulação nutricional, um produto alimentício, um suplemento dietético, uma bebida e um produto farmacêutico, o dito produto contendo pelo menos 0,1%, em peso, de matéria seca de polissacarídeos RG-I de cenoura que têm a seguinte combinação de características: GED - 4817953v1
• um peso molecular na faixa de 10 a 300 kDa; • uma cadeia principal que consiste em resíduos de ácido galacturônico e resíduos de ramnose, os ditos resíduos de ramnose estando contidos em resíduos de alfa(1→4)-galacturônico-alfa(1→2)-ramnose; • a seguinte composição de monossacarídeos: - 20 a 60%, em mol, de resíduos de ácido galacturônico, em que os ácidos galacturônicos individuais podem ser metilados na posição C-6 e/ou acetilados na posição O-2 e/ou O-3; - 8 a 50%, em mol, de resíduos de ramnose; - 0 a 40%, em mol, de resíduos de arabinose; - 0 a 40%, em mol, de resíduos de galactose; - razão molar de resíduos de ácido galacturônico para resíduos de ramnose na faixa de 5:1 a 1:1; - resíduos de ácido galacturônico, resíduos de ramnose, resíduos de arabinose e resíduos de galactose, em conjunto, constituem pelo menos 85%, em mol, dos resíduos de monossacarídeos nos polissacarídeos RG-I de cenoura.
[035] O termo “polissacarídeo ramificado”, como usado no presente pedido, refere-se a um polissacarídeo que compreende uma cadeia principal linear de unidades de monossacarídeos ligadas em conjunto por ligações glicosídicas, em que pelo menos uma das unidades de monossacarídeos dentro da cadeia principal carrega uma cadeia lateral de uma ou mais unidades de monossacarídeos glicosidicamente ligadas.
[036] Os termos “cadeia principal” e “esqueleto” são sinônimos.
[037] O termo “polissacarídeo péctico”, como usado no presente pedido, refere-se a polissacarídeos opcionalmente ramificados que têm um peso molecular maior que 10 kDa e que compreendem uma cadeia principal que consiste em resíduos de ácido galacturônico e resíduos de ramnose, os ditos resíduos de ramnose estando contidos em resíduos de alfa(1→4)- galacturônicos-alfa(1→2)-ramnose.
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[038] O termo trecho, como usado no presente pedido, refere-se a uma sequência de duas unidades de monossacarídeos glicosidicamente ligadas dentro da cadeia principal de um polissacarídeo, excluindo quaisquer cadeias laterais que estejam anexadas a esta.
[039] O termo “domínio”, como usado no presente pedido, refere-se a um trecho mais quaisquer cadeias laterais que estejam anexadas ao dito trecho.
[040] O termo “trecho de ramnogalacturonana-I” ou “trecho de RG-I” refere- se a um trecho que consiste em pares de ácido galacturônico (GalA) e ramnose (RhA), em que os resíduos de GalA estão ligados aos resíduos de Rha através das posições 1 e 4, enquanto que os resíduos de RhA estão ligados ao resíduo de GalA através das posições anoméricas e 2-OH, isto é, resíduos alternados de alfa(1→4)-galacturônico-alfa(1→2)-ramnose. O domínio RG-I pode compreender cadeias laterais como, por exemplo, cadeias laterais de galactana, arabinana e arabinogalactana.
[041] O termo “polissacarídeo ramnogalacturonana-I” ou “polissacarídeo RG-I” refere-se a polissacarídeos pécticos opcionalmente ramificados que compreendem uma cadeia principal que contém um ou mais trechos de ramnogalacturonana-I.
[042] O termo “trecho de ácido galacturônico ligado em alfa(l,4)” refere-se a um trecho que consiste em resíduos de alfa(1→4)-galacturônico.
[043] Além dos domínios RG-I, os polissacarídeos RG-I de cenoura da presente invenção podem conter um ou mais dos seguintes domínios: • homogalacturonana (HG), • xilogalacturonana (XG), • apiogalacturonana (AG), • ramnogalacturonana-II (RG-II).
[044] Os domínios XG, AG e RG-II tipicamente representam somente uma pequena fração dos polissacarídeos RG-I.
[045] Os domínios HG, domínios XG, domínios AG e RG-II que estão opcionalmente presentes nos polissacarídeos RG-I da presente invenção GED - 4817953v1 compreendem uma cadeia principal que consiste em uma cadeia linear de dois ou mais ácidos D-galacturônicos ligados α-(1-4).
[046] Os domínios HG não contêm nenhuma cadeia lateral. Os grupos carboxila de resíduos de ácido galacturônico dentro da cadeia principal de domínios HG podem ser esterificados. O ácido galacturônico esterificado pode ocorrer sob a forma de éster metílico ou éster acetílico.
[047] A cadeia principal dos domínios XG contém uma ou mais cadeias laterais na forma de D-xilose.
[048] A cadeia principal de domínios AG contém uma ou mais cadeias laterais que são compostas por um ou mais resíduos de D-apiose.
[049] A cadeia principal de RG-II contém uma ou mais cadeias laterais que não são exclusivamente compostas de D-xilose ou D-apiose. Os grupos carboxila de resíduos de ácido galacturônico dentro da cadeia principal de domínios RG- II podem ser esterificados. O ácido galacturônico pode ser esterificado tanto por grupos metila como acetila, formando ésteres metílicos ou acetílicos, respectivamente.
[050] A terminologia “grau de acetilação” refere-se ao número de resíduos de acetila por resíduo de ácido galacturônico, expresso como porcentagem.
[051] A terminologia “grau de metilação” refere-se ao número de resíduos de metila por resíduo de ácido galacturônico, expresso como percentagem.
[052] A concentração de diferentes polissacarídeos e sua composição de monossacarídeos pode ser determinada por técnicas analíticas conhecidas pelo técnico no assunto. Após hidrólise ácida (matanólise), a composição de açúcares neutros pode ser adequadamente determinada por Cromatografia de Troca Aniônica de Alta Eficiência combinada com Detecção Amperométrica Pulsada (HPAEC-PAD).
[053] Os ácidos urônicos (ácido galacturônico sendo a forma dominante de ácidos urônicos) podem ser determinados com o uso do ensaio colorimétrico de m-hidroxidifenila.
[054] A distribuição de tamanho molecular pode ser determinada por GED - 4817953v1
Cromatografia de Exclusão por Tamanho de Alto Desempenho com o uso de detecção (concentração) do índice refrativo (RI).
[055] Os métodos analíticos mencionados acima são descritos em: Analytical Biochemistry Vol. 207, Edição 1, 1992, pág. 176 (para análise de açúcar neutro) e em Mol. Nutr. Food Res., Vol 61, Edição 1, 2017, 1600243 (para a análise de ácido urônico e a distribuição de tamanho molecular).
[056] Todas as porcentagens mencionadas no presente pedido, a menos que estabelecido de outra forma, referem-se à porcentagem, em peso.
[057] A administração oral no contexto do presente tratamento engloba a autoadministração.
[058] O uso em tratamento terapêutico ou profilático de acordo com a invenção compreende preferencialmente a administração oral do produto em uma dose que fornece pelo menos 100 mg, mais preferencialmente pelo menos 350 mg, e com a máxima preferência 350 a 5.000 mg dos polissacarídeos RG-I de cenoura.
[059] Em outra realização preferencial, o tratamento compreende administração oral do produto em uma dose diária que fornece pelo menos 100 mg, mais preferencialmente pelo menos 350 mg, e com a máxima preferência 350 a 5.000 mg dos polissacarídeos RG-I de cenoura.
[060] De acordo com uma realização particularmente preferencial, o produto é usado para o tratamento terapêutico ou profilático de infecções do trato respiratório superior, como um resfriado ou gripe.
[061] De acordo com outra realização preferencial, o produto é usado para o tratamento terapêutico ou profilático de infecções do trato intestinal, como gastroenterites.
[062] O sujeito para o qual a composição contendo os polissacarídeos RG- I da presente invenção é administrada por via oral é preferencialmente um mamífero, mais preferencialmente um sujeito humano.
[063] O produto da presente invenção é preferencialmente uma formulação nutricional, um produto alimentício, um suplemento dietético ou uma bebida.
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[064] O produto preferencialmente contém pelo menos 0,2%, em peso, de matéria seca, mais preferencialmente 0,3 a 10%, em peso, de matéria seca, e com a máxima preferência 0,4 a 5%, em peso, de matéria seca dos polissacarídeos RG-I de cenoura.
[065] Polissacarídeos RG-I de cenoura são preferencialmente incorporados no produto da presente invenção sob a forma de um isolado de polissacarídeo péctico que é enriquecido em polissacarídeos RG-I. Consequentemente, em uma realização particularmente preferencial, os polissacarídeos RG-I de cenoura representam pelo menos 20%, em peso, mais preferencialmente pelo menos 30%, em peso, até mais preferencialmente 60%, em peso, e com a máxima preferência pelo menos 80%, em peso, dos polissacarídeos pécticos presentes no produto, os ditos polissacarídeos pécticos sendo definidos como polissacarídeos opcionalmente ramificados que têm um peso molecular em excesso de 10 kDa e que compreendem uma cadeia principal que consiste em resíduos de ácido galacturônico e resíduos de ramnose, os ditos resíduos de ramnose estando contidos em resíduos de alfa(1→4)-galacturônico-alfa(1→2)- ramnose.
[066] Polissacarídeos RG-I de cenoura que são empregados de acordo com a presente invenção têm uma cadeia principal que compreende trechos de ramnogalacturonana-I e opcionalmente trechos de ácido homo-galacturônico ligados alfa(1,4). A razão molar de resíduos de ácido galacturônico para resíduos de ramnose nos polissacarídeos RG-I de cenoura está dentro da faixa de 5:1 a 1:1. Preferencialmente, a razão molar de resíduos de ácido galacturônico para resíduos de ramnose nos polissacarídeos RG-I de cenoura varia de 4,8:1 a 1:1, mais preferencialmente de 4,5:1 a 1:1, ainda mais preferencialmente de 4,2:1 a 1:1, com a máxima preferência de 4:1 a 1,1:1.
[067] Resíduos de ramnose tipicamente representam 9 a 45%, mais preferencialmente 10 a 40% e com a máxima preferência 11 a 35% de todos os resíduos de monossacarídeos contidos nos polissacarídeos RG-I de cenoura, isto é, incluindo os resíduos de monossacarídeos que estão contidas nas cadeias GED - 4817953v1 laterais.
[068] Resíduos de ácido galacturônico tipicamente representam 21 a 55%, mais preferencialmente 22 a 50%, e com a máxima preferência 23 a 45% de todos os resíduos de monossacarídeos contidos nos polissacarídeos RG-I de cenoura, isto é, incluindo os resíduos de monossacarídeos que estão contidos nas cadeias laterais.
[069] Os resíduos de arabinose tipicamente representam 4 a 38%, mais preferencialmente 6 a 36%, e com a máxima preferência 8 a 34% de todos os resíduos de monossacarídeos contidos nos polissacarídeos RG-I de cenoura.
[070] Os resíduos de galactose tipicamente representam de 4 a 42%, mais preferencialmente 8 a 40%, e com a máxima preferência 10 a 38% de todos os resíduos de monossacarídeos contidos nos polissacarídeos nos polissacarídeos RG-I de cenoura.
[071] A combinação de resíduos de ácido galacturônico, resíduos de ramnose, resíduos de arabinose e resíduos de galactose, em conjunto, preferencialmente constitui pelo menos 88%, em mol, mais preferencialmente pelo menos 90%, em mol e até mais preferencialmente pelo menos 92%, em mol, dos resíduos de monossacarídeos nos polissacarídeos RG-I de cenoura.
[072] Os polissacarídeos RG-I de cenoura tipicamente têm um peso molecular de pelo menos 10 kDa. Mais preferencialmente, um ou mais polissacarídeos RG-I de cenoura têm um peso molecular entre 20 kDa e 300 kDa, com a máxima preferência entre 40 kDa e 300 kDa.
[073] Os polissacarídeos RG-I de cenoura da presente invenção podem ser adequadamente produzidos por hidrólise enzimática de polissacarídeos pécticos que são encontrados na cenoura. Polissacarídeos pécticos encontrados na cenoura tipicamente têm um grau de acetilação de 30 a 50% e um grau de metilação de 60 a 80%. A remoção de domínios homogalacturonanas (HG) destes polissacarídeos pécticos por hidrólise enzimática tipicamente produz um polissacarídeo enriquecido em RG-I que tem um grau reduzido de metilação e um grau aumentado de acetilação.
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[074] Os inventores descobriram que a hidrólise enzimática que é empregada de acordo com a presente invenção tipicamente produz polissacarídeos RG-I de cenoura que têm um grau de acetilação de pelo menos 20%, mais preferencialmente de 30 a 110%, até mais preferencialmente de 35 a 90%, e com a máxima preferência de 40 a 70%.
[075] De acordo com uma realização preferencial da presente invenção, a preparação enzimática dos polissacarídeos RG-I de cenoura resulta em uma redução substancial do grau de metilação, por exemplo, devido à atividade de pectinesterase. Preferencialmente, os polissacarídeos RG-I de cenoura têm um grau de metilação não maior que 50%, mais preferencialmente não maior que 40%, e com a máxima preferência de 10 a 30%.
[076] De acordo com outra realização preferencial, a razão do grau de acetilação (DA) dos polissacarídeos RG-I de cenoura para o grau de metilação (DM) dos polissacarídeos RG-I de cenoura é preferencialmente 1 ou mais, mais preferencialmente 2 ou mais, mais preferencialmente 3 ou mais, e com a máxima preferência 5 ou mais. Visto que a atividade de pectinesterase não tem um impacto significativo sobre o grau de acetilação dos polissacarídeos RG-I de cenoura preparados enzimaticamente, os polissacarídeos RG-I que têm uma razão DA:DM muito alta podem ser obtidos por hidrólise parcial de polissacarídeos pécticos de cenoura com o uso de uma combinação de pectinase (poligalacturonase e/ou liase) e pectinesterase.
[077] De acordo com outra realização preferencial, a preparação enzimática dos polissacarídeos RG-I de cenoura a partir de polissacarídeos pécticos cenoura produz polissacarídeos RG-I que contêm um resíduo de ácido galacturônico insaturadas na terminação. Polissacarídeos pécticos encontrados na cenoura normalmente não contêm resíduos de ácido galacturônico insaturados. No entanto, a hidrólise destes polissacarídeos pécticos por pectina liase e/ou pectato liase, inevitavelmente produz fragmentos de polissacarídeos que contêm um resíduo de ácido galacturônico sem redução insaturado terminal. Preferencialmente, pelo menos 10%, mais preferencialmente pelo menos 25% e GED - 4817953v1 com a máxima preferência pelo menos 50% dos resíduos de ácido galacturônico sem redução nos polissacarídeos RG-I são resíduos de ácido galacturônico insaturados. Os ácidos galacturônicos insaturados podem ser facilmente identificados, por exemplo, medindo a absorção de UV em 235 nm.
[078] A cadeia principal dos polissacarídeos RG-I de cenoura pode compreender uma ou mais cadeias laterais. Essas cadeias laterais podem conter resíduos de arabinose e/ou galactose, e pequenas quantidades de resíduos dos monômeros de fucose, glicose, ácido glucurônico, xilose e/ou ácido urônico. Uma ou mais cadeias laterais são preferencialmente selecionadas a partir de cadeias laterais de galactana, cadeias laterais de arabinana e cadeias laterais de arabinogalactana.
[079] A cadeia lateral de arabinana compreende pelo menos um ou mais resíduos de arabinose ligados alfa(1,5) e é substituída para a posição 4-OH de resíduos de ramnose no domínio RG-I. A cadeia lateral de arabinana pode ser linear ou ramificada. No caso da cadeia lateral ser linear, a cadeia lateral consiste em resíduos de arabinose ligados alfa(1,5). No caso da cadeia lateral de arabinana ser uma cadeia lateral ramificada, um ou mais resíduos de alfa- arabinose estão ligados em O-2 e/ou O-3 de arabinoses ligadas alfa(1,5).
[080] A cadeia lateral de galactana compreende pelo menos um ou mais resíduos de galactose ligados alfa(1,4) e é substituída na posição O-4 de resíduos de ramnose no domínio RG-I.
[081] A cadeia lateral de arabinogalactana é substituída na posição O-4 de um resíduo de ramnose no domínio RG-I e pode ser uma arabinogalactana tipo I (AGI) ou uma arabinogalactana tipo II (AGII). AGI é composta por uma cadeia principal (1→4)-β-D-Galp na qual podem ocorrer substituições por unidades monoméricas de Galp na posição O-6 ou O-3. AGI é ainda substituída por resíduos α-L-Araf-p e/ou por cadeias laterais curtas (1→5)-α-L-Araf. AGII é composta por cadeia principal α(1→3)-β-D-Galp decorada com cadeias secundárias (1→6)-β-D-Galp , as quais são arabinosiladas.
[082] Preferencialmente, os resíduos de arabinose e ramnose estão GED - 4817953v1 presentes nos polissacarídeos RG-I de cenoura em uma razão molar menor que 4:1, mais preferencialmente menor que 3:1, com a máxima preferência menor que 2:1.
[083] Os resíduos de galactose e ramnose estão preferencialmente presentes nos polissacarídeos RG-I de cenoura em uma razão molar menor que 4:1, mais preferencialmente menor que 3,2:1, com a máxima preferência menor que 2,5:1.
[084] A razão molar da combinação de resíduos de arabinose e resíduos de galactose para resíduos de ramnose nos polissacarídeos RG-I de cenoura é preferencialmente menor que 7:1, mais preferencialmente menor que 5:1, e com a máxima preferência menor que 4:1.
[085] A combinação de resíduos de ácido galacturônico e resíduos de ramnose preferencialmente constitui pelo menos 30%, em mol, mais preferencialmente pelo menos 350 a 90%, em mol, e com a máxima preferência 40 a 75%, em mol, dos resíduos de monossacarídeos contidos nos polissacarídeos RG-I de cenoura.
[086] De acordo com uma realização particularmente preferencial, os polissacarídeos RG-I de cenoura têm a seguinte composição de monossacarídeos: • 21 a 55%, em mol, de resíduos de ácido galacturônico, em que os ácidos galacturônicos individuais podem ser metilados e/ou acetilesterificados; • 9 a 35%, em mol, de resíduos de ramnose; • 5 a 35%, em mol, de resíduos de arabinose; • 5 a 40%, em mol, de resíduos de galactose.
[087] Os polissacarídeos RG-I de cenoura no produto da presente invenção são preferencialmente obtidos por hidrólise enzimática parcial de pectina de cenoura. De acordo com uma realização particularmente preferencial, os polissacarídeos RG-I de cenoura são obtidos por hidrólise enzimática de pectina de cenoura com o uso de uma ou mais pectinases selecionadas a partir de pectina liase (EC 4.2.2.10), pectato liase (EC 4.2.2.2), endopoligalacturonase GED - 4817953v1
(EC 3.2.1.15), exopoligalacturonase (EC 3.2.1.67 e EC 3.2.1.82). Com a máxima preferência, os polissacarídeos RG-I de cenoura são obtidos por hidrólise enzimática de pectina de cenoura com o uso de uma ou mais pectinases selecionadas a partir de pectina liase (EC 4.2.2.10) e endopoligalacturonase (EC
3.2.1.15).
[088] O produto da presente invenção preferencialmente contém traços de uma ou mais das pectinases anteriormente mencionadas. Essas pectinases podem estar presentes no produto na forma ativa e/ou inativa.
[089] De acordo com uma realização preferencial, os polissacarídeos RG-I de cenoura são obtidos por hidrólise enzimática de pectina de cenoura com o uso de endopoligalacturonase e/ou exopoligalacturonase em combinação com pectinesterase (EC 3.1.1.11).
[090] De acordo com outra realização preferencial, os polissacarídeos RG- I de cenoura são obtidos por hidrólise enzimática de pectina de cenoura com o uso de pectina liase e/ou pectato liase.
[091] Além dos polissacarídeos RG-I de cenoura, o produto da presente invenção preferencialmente contém pelo menos 1%, em peso, de matéria seca, mais preferencialmente pelo menos 3%, em peso, de matéria seca de um ou mais prebióticos selecionados a partir de lactulose, inulina, fruto-oligosacarídeos, galacto-oligossacarídeos, oligossacarídeos do leite, goma guar e goma arábica. Ainda mais preferencialmente, o produto contém pelo menos 1%, em peso, de matéria seca, mais preferencialmente pelo menos 3%, em peso, de matéria seca de um ou mais prebióticos selecionados a partir de lactulose, inulina, fruto- oligosacarídeos, galacto-oligossacarídeos e oligossacarídeos do leite.
[092] Outro aspecto da invenção refere-se a um produto selecionado a partir de uma formulação nutricional, um produto alimentício, um suplemento dietético, uma bebida e um produto farmacêutico, o dito produto contendo pelo menos 0,1%, em peso, de matéria seca dos polissacarídeos RG-I de cenoura, conforme descrito acima; em que os polissacarídeos RG-I de cenoura representam pelo menos 20%, em peso, dos polissacarídeos pécticos presentes GED - 4817953v1 no produto, os ditos polissacarídeos pécticos sendo definidos como polissacarídeos opcionalmente ramificados que têm um peso molecular maior que 10 kDa e que compreendem uma cadeia principal que consiste em resíduos de ácido galacturônico e resíduos de ramnose, os ditos resíduos de ramnose estando contidos em resíduos de alfa(1→4)-galacturônico-alfa(1→2)-ramnose.
[093] Ainda outro aspecto da presente invenção refere-se a um processo para preparar polissacarídeos RG-I de cenoura, o dito processo compreendendo: • fornecer um isolado de pectina de cenoura, o dito isolado compreendendo pelo menos 5%, em peso, de matéria seca, preferencialmente pelo menos 10%, em peso, de matéria seca. mais preferencialmente pelo menos 25%, em peso, de matéria seca de polissacarídeos pécticos que têm um peso molecular de pelo menos 15 kDa e que têm uma cadeia principal que consiste em resíduos de ácido galacturônico e resíduos de ramnose, os ditos resíduos de ramnose estando contidos nos resíduos de alfa(1→4)-galacturônico-alfa(1→2)- ramnose; • parcialmente hidrolisar os ditos polissacarídeos pécticos com o uso de uma ou mais pectinases selecionadas a partir de pectina liase (EC 4.2.2.10), pectato liase (EC 4.2.2.2), endopoligalacturonase (EC 3.2.1.15), exopoligalacturonase (EC 3.2.1.67 e EC 3.2.1.82), • submeter os polissacarídeos pécticos parcialmente hidrolisados a uma técnica de separação sólido-líquido selecionada a partir de centrifugação, decantação, filtração e combinações das mesmas para produzir uma fração líquida contendo polissacarídeos pécticos parcialmente hidrolisados; • submeter a fração líquida à ultrafiltração com o uso de uma membrana de ultrafiltração que tem um peso molecular de corte na faixa de 10 a 100 kDa; e recuperar um retentato contendo os polissacarídeos pécticos parcialmente hidrolisados.
[094] De acordo com uma realização preferencial, os polissacarídeos GED - 4817953v1 pécticos são parcialmente hidrolisados com o uso de uma ou mais pectinases selecionadas a partir de endopoligalacturonase (EC 3.2.1.15) e exopoligalacturonase (EC 3.2.1.67 e EC 3.2.1.82).
[095] De acordo com outra personificação preferida, os polissacarídeos pécticos são parcialmente hidrolisados usando uma ou mais pectinases selecionadas de pectina liase (EC 4.2.2.10) e pectato liase (EC 4.2.2.2). Conforme anteriormente explicado no presente pedido, a hidrólise de polissacarídeos pécticos por essas liases inevitavelmente produz fragmentos de polissacarídeos que contêm um resíduo de ácido galacturônico sem redução insaturado terminal.
[096] Os polissacarídeos pécticos são preferencialmente hidrolisados no presente processo com o uso de uma combinação de uma ou mais pectinases e uma ou mais pectinesterases anteriormente mencionadas (EC 3.1.1.11). Uma ou mais pectinesterases podem ser empregadas antes ou simultaneamente com uma ou mais pectinases. O uso combinado de pectinases e pectinesterases é particularmente vantajoso no caso da pectinase empregada ser selecionada a partir de endopoligalacturonase, exopoligalacturonase e combinações das mesmas. O uso combinado de pectinases e pectinesterases tipicamente produz polissacarídeos pécticos de cenoura parcialmente hidrolisados que têm um grau reduzido de metilação e uma razão aumentada de acetilação/metilação.
[097] A hidrólise parcial dos polissacarídeos pécticos é preferencialmente realizada mantendo uma solução aquosa dos polissacarídeos pécticos e a pectinase a uma temperatura na faixa de 15 a 70 ºC por pelo menos 10 minutos, preferencialmente por 15 a 300 minutos.
[098] O isolado de pectina a partir de cenoura que é empregado no presente processo é preferencialmente polpa de cenoura obtida a partir da produção de suco de cenoura ou uma fração dessa polpa de cenoura.
[099] Como usado no presente pedido, o termo “ultrafiltração” também engloba diálise com o uso de uma membrana de ultrafiltração. Em uma realização particularmente preferencial do presente processo, a fração líquida GED - 4817953v1 que é obtida a partir da separação sólido-líquido é submetida à ultrafiltração com o uso de uma membrana de ultrafiltração que tem um peso molecular de corte na faixa de 12 a 80 kDa. Mais preferencialmente, a dita membrana de ultrafiltração tem um peso molecular de corte na faixa de 10 a 60 kDa, com a máxima preferência na faixa de 20 a 45 kDa.
[0100] De acordo com uma realização particularmente preferencial, o retentato que é obtido na etapa de ultrafiltração é concentrado até um teor de água menor que 50%, em peso. Até mais preferencialmente, o retentato é seco até um teor de água menor que 15%, em peso, com a máxima preferência menor que 12%, em peso.
[0101] O retentato anteriormente mencionado é preferencialmente seco com o uso de uma técnica de secagem selecionada a partir de secagem por aspersão, secagem em tambor e liofilização. Mais preferencialmente, a técnica de secagem usada é a secagem por aspersão ou secagem em tambor. Com a máxima preferência, o retentato é seco por meio de secagem por aspersão.
[0102] O presente processo preferencialmente não emprega solventes orgânicos.
[0103] Os polissacarídeos RG-I de cenoura obtidos pelo processo da presente invenção são preferencialmente polissacarídeos RG-I de cenoura, conforme descrito no presente pedido.
[0104] A presente invenção também fornece um método para preparar um produto selecionado a partir de uma formulação nutricional, um produto alimentício, uma bebida, um suplemento dietético e um produto farmacêutico, o dito método compreendendo incorporar no mesmo 0,1 a 50%, em peso, de matéria seca dos polissacarídeos RG-I de cenoura, conforme anteriormente descrito no presente pedido. O produto é preferencialmente preparado combinando os polissacarídeos RG-I de cenoura com um ou mais ingredientes comestíveis.
[0105] Uma realização do presente método refere-se à preparação de um produto selecionado a partir de uma formulação nutricional, um produto GED - 4817953v1 alimentício e uma bebida, o dito método compreendendo incorporar no mesmo 0,5 a 40%, em peso, de matéria seca, mais preferencialmente 1 a 30%, em peso, de matéria seca dos polissacarídeos RG-I de cenoura.
[0106] Em outra realização, o presente método é usado para preparar um produto selecionado a partir de um suplemento dietético e um produto farmacêutico, o dito método compreendendo incorporar no mesmo 10 a 90%, em peso, de matéria seca, preferencialmente 20 a 80%, em peso, de matéria seca, e com a máxima preferência 30 a 60%, em peso, de matéria seca dos polissacarídeos RG-I de cenoura.
[0107] Os polissacarídeos RG-I de cenoura são preferencialmente incorporados no produto sob a forma de um isolado contendo pelo menos 5%, mais preferencialmente pelo menos 10%, até mais preferencialmente pelo menos 20% e com a máxima preferência pelo menos 30% dos polissacarídeos RG-I de cenoura, em peso, de matéria seca.
[0108] De acordo com outra realização preferencial, os polissacarídeos RG-I de cenoura são incorporados no produto sob a forma de pó, preferencialmente sob a forma de pó com um teor de água menor que 15%, em peso, mais preferência menor que 12%, em peso.
[0109] Preferencialmente, o pó anteriormente mencionado contém menos de 30%, em peso, mais preferencialmente menos de 20%, em peso, até mais preferencialmente menos de 10%, em peso, de material que tem um peso molecular menor que 20 kDa.
[0110] Os polissacarídeos RG-I de cenoura são incorporados no produto sob a forma de um isolado, os polissacarídeos RG-I de cenoura representando pelo menos 20%, em peso, mais preferencialmente pelo menos 30%, em peso, até mais preferencialmente pelo menos 60%, em peso, e com a máxima preferência pelo menos 80%, em peso, dos polissacarídeos pécticos presentes no isolado, os ditos polissacarídeos pécticos sendo definidos como polissacarídeos opcionalmente ramificados que têm um peso molecular maior que 10 kDa e que compreendem uma cadeia principal que consiste em resíduos GED - 4817953v1 de ácido galacturônico e resíduos de ramnose, os ditos resíduos de ramnose estando contidos em resíduos de alfa(1→4)-galacturônico-alfa(1→2)-ramnose.
[0111] A invenção é ainda ilustrada pelos Exemplos não limitantes a seguir. Exemplos Exemplo 1
[0112] Bagaço de cenoura seco (fibra de cenoura em pó, GreendFields, Polônia), o resíduo de produção de suco de cenoura foi disperso em água desmineralizada (100 g/L) e submetido à hidrólise enzimática em escala laboratorial com o uso de 3 diferentes enzimas comerciais (condições de enzimólise: 45 ºC, 120 minutos):
1. Pectinex® Yield Mash ex Novozymes (0,02% p/p de dispersão total)
2. Pectinex® Ultra Mash ex Novozymes (0,02% de dispersão total)
3. Pectinex® Ultra Mash ex Novozymes (0,05% de dispersão total).
[0113] A enzimólise foi concluída aquecendo a 90 ºC por 10 min, seguida por centrifugação e por diálise do sobrenadante com o uso de uma membrana com um corte de 10 kDa (Microdyn Nadir; UP010).
[0114] Um isolado de referência foi produzido por introdução do bagaço de cenoura seco em água (100 g/L), mantendo a solução por 120 minutos a uma temperatura de 90 ºC, centrifugação e diálise do sobrenadante por meio de diálise da mesma maneira que as dispersões de enzimólise. Exemplo 2
[0115] A composição de monossacarídeos do polissacarídeo RG-I de cenoura não hidrolisado do Exemplo 1 (Referência) e do polissacarídeo RG-I de cenoura hidrolisado enzimaticamente do Exemplo 1 (Amostras 1 a 3) foi determinada da seguinte forma:
[0116] A concentração de diferentes polissacarídeos e sua composição de monossacarídeos foram determinadas com o uso dos métodos analíticos descritos em: Analytical Biochemistry Vol. 207, Edição 1, 1992, pág. 176 (análise de açúcar neutro) e em Mol. Nutr. Food Res., Vol 61, Edição 1, 2017, 1600243 GED - 4817953v1
(para a análise de ácido urônico e distribuição de tamanho molecular).
[0117] Os resultados da análise de monossacarídeos são mostrados na Tabela 1 (Rha = ramnose; GalA = ácido galacturônico; Ara = arabinose; Gal = galactose. Tabela 1 Amostra Mol.% Mol.% Mol.% Mol.% (GalA):(Rha) (Gal):(Rha) (Ara):(Rha) Rha GalA Ara Gal Referência 6 62 14 16 10,3 2,7 2,3 1 10 45 19 23 4,6 2,3 2,0 2 17 35 28 16 2,1 1,0 1,6 3 13 47 23 15 3,7 1,2 1,8 Exemplo 3
[0118] A atividade imunomoduladora dos polissacarídeos RG-I de cenoura não hidrolisados do Exemplo 1 (Referência) e dos polissacarídeos RG- I de cenoura hidrolisados enzimaticamente do Exemplo 1 (Amostras 1 a 3) foi determinada com o uso de um ensaio de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC). Ensaio de Imunomodulação
[0119] Para avaliar o efeito dos materiais de polissacarídeos na função imune eles foram incubados com Células Mononucleares de Sangue Periférico recém-isoladas (PBMC). Em resumo, as PBMC foram isoladas a partir de camadas leucoplaquetárias de sangue com o uso da placa Ficoll (Amersham). As PBMC (2*10E6 células/mL) foram incubadas em meio RPMI (\Meio Gibco™ RPMI 1640) com 300 g de polissacarídeos RG-I por 20 h (CO2 5%, 37 ºC). Subsequentemente, os sobrenadantes foram coletados e as citocinas foram medidas com o uso de um arranjo de microesferas (kit de inflamação humana CBA, BD-Bioscience), medidas em um citômetro de fluxo (BD FACSCANTO II), de acordo com as instruções do fabricante. RMI foi usado como controle negativo e LPS (de E. coli - Sigma L3012-5mG) como referência à qual os resultados foram normalizados com LPS como 100%. Os dados são expressos como % normalizadas para a resposta induzida por LPS, com média de 3 doadores diferentes para 4 citocinas diferentes e sua soma.
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[0120] A Tabela 2 mostra os resultados desse ensaio de imunomodulação. Tabela 2 Amostra TNF IL10 IL6 IL1B Soma Referência 23 6 22 17 69 1 200 68 91 81 441 2 367 106 142 214 828 3 435 124 124 150 832 Exemplo 4
[0121] O Exemplo 3 foi repetido em diferentes escalas, isto é, em 20 litros (amostra 1), 5.000 litros (amostra 2) e 10.000 litros (amostra 3), com o uso da enzima Pectinex® Ultra Mash ex Novozymes (condições: 0,1% p/p de dispersão total, 45 ºC, 2 h, inativação enzimática: 90 ºC por 10 min). Nas amostras 2 e 3, ao invés de centrifugação, a decantação foi usada para separar os sólidos do líquido. O sobrenadante foi submetido à ultrafiltração, com o uso de uma membrana de 10 kDa, para remover pequenos componentes moleculares.
[0122] A composição de monossacarídeos dos materiais de polissacarídeos hidrolisados foi analisada seguindo os métodos descritos no Exemplo 2.
[0123] Os resultados das análises são mostrados na Tabela 3. Tabela 3 Amostra Mol.% Mol.% Mol.% Mol.% (GalA):(Rha) (Gal):(Rha) (Ara):(Rha) Rha GalA Ara Gal 1 17 28 30 22 1,6 1,3 1,7 2 17 23 33 20 1,4 1,2 2,0 3 15 28 29 19 1,8 1,2 1,9
[0124] O grau de acetilação e metilação foi determinado da seguinte forma: Amostras de polissacarídeos (2 a 5mg) foram tratadas com hidróxido de sódio (0,1 M, durante a noite, 20 ºC). O metanol liberado foi medido com o uso de GC de espaço vazio equipada com uma coluna DB-WAX ETR, Cryo Focus-4 cold trap e detecção FID (adaptado de Huisman et al., Food Hydrocolloids, 18, 4, 2004, 665-668).
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[0125] As amostras foram neutralizadas (HCL 1M) e, em seguida, o acetil liberado foi quantificado com o uso de HPLC equipada com uma coluna Aminex HPX 87H com coluna guarda e detecção RI
[0126] (adaptado de Voragen et al.Food Hydrocolloids,1, 1, 1986, 65- 70). O grau de esterificação é expresso como quantidade molar de metanol e ácido acético liberado como porcentagem da quantidade de ácido urônico.
[0127] Os resultados das análises do grau de esterificação são mostrados na Tabela 4. Tabela 4 DM% 1 DA% 2 DA:
DM 2 16 42 2,6 3 21 36 1,7 1 grau de metilação 2 grau de acetilação Exemplo 5
[0128] A atividade imunomoduladora dos polissacarídeos RG-I de cenoura hidrolisados enzimaticamente do Exemplo 4 (Amostras 1 a 3) foi determinada com o uso de um ensaio de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC), conforme descrito para o Exemplo 3. Os resultados são mostrados na Tabela 5. Tabela 5 TNF IL10 IL6 IL1B Soma 1 131 61 105 72 368 2 181 70 124 136 511 3 107 35 97 72 311 Exemplo 6
[0129] O material de polissacarídeo hidrolisado da Amostra 2 do Exemplo 4 foi ainda hidrolisado, seguido por isolamento de uma fração de alto peso molecular. O material polissacarídeo foi dissolvido em água desmineralizada (100 g/L) e submetido à hidrólise enzimática adicional (Pectinex® Ultra Mash ex Novozymes, 45 ºC, 14 horas). A enzimólise foi concluída aquecendo a 90 ºC por 10 min.
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[0130] Uma parte das soluções de polissacarídeos de enzimólise foi submetida ao fracionamento por cromatografia de exclusão por tamanho semipreparativa para produzir uma fração contendo polissacarídeos tendo um peso molecular maior que 70 kDa.
[0131] A composição de mossacarídeos do polissacarídeo hidrolisado não fracionado e da fração de alto peso molecular isolada foi analisada com o uso da metodologia descrita para o Exemplo 2.
[0132] Os resultados das análises são mostrados na Tabela 6. Tabela 6 Mol.% Mol.% Mol.% Mol.% (GalA): (Ara): (Gal): Rha GalA Ara Gal (Rha) (Rha) (Rha) Não fracionado 23 31 14 19 1,3 0,6 0,8 >70 kDa 15 23 17 38 1,5 1,1 2,5
[0133] A atividade imunomoduladora do polissacarídeo de enzimólise e da fração de alto peso molecular do mesmo foram determinadas com o uso da metodologia descrita no Exemplo 3. Os resultados são mostrados na Tabela 7. Tabela 7 14 horas de TNF IL10 IL6 IL1B Soma de enzimólise Todos Não fracionado 295 95 130 158 678 Fração >70 kDa 302 112 139 174 726 Exemplo 7
[0134] Isolados de polissacarídeos pécticos hidrolisados foram preparados dispersando o bagaço de cenoura em água (100 g/L).
[0135] Amostra 1 foi extraída a 90 ºC por 120 minutos sem enzima adicionada (rendimento do extrato: 4,8%)
[0136] Amostra 2 foi extraída adicionando Rapidase C600 (uma mistura enzimática contendo atividade de pectina liase, poligalacturonase, pectina esterase, celulase e hemicelulase, Militz, H. Wood Sci.Technol. (1993) 28: 9) com concentração enzimática de 1 g/100 mL de dispersão total, a 45 ºC, por 120 minutos. A enzimólise foi concluída aquecendo a 100 ºC por 10 min (rendimento do extrato: 5,6%).
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[0137] Ambas as amostras foram subsequentemente centrifugadas (18.000 g, 10 min) e o sobrenadante foi amplamente dialisado com uma membrana com corte de 12 a 14 kDa (Visking, Londres, Reino Unido). Após ultrafiltração/diafiltração, o isolado foi liofilizado com o uso de um liofilizador em escala laboratorial.
[0138] A distribuição de tamanho molecular da Amostra 1 e Amostra 2, conforme determinado por HPSEC com detecção do índice de refração, é mostrada na Figura 3.
[0139] A composição de monossacarídeos das duas amostras foi analisada com o uso da metodologia descrita para o Exemplo 2. Os resultados das análises são mostrados na Tabela 8. Tabela 8 Mol.% Mol.% Mol.% Mol.% [GalA]: [Ara]: [Gal]: Rha GalA Ara Gal [Rha] [Rha] [Rha] Amostra 1 3,7 47,5 8,0 11,5 12,8 3,1 2,2 Amostra 2 8,4 34,7 7,3 12,2 4,1 1,5 0,9 GED - 4817953v1

Claims (14)

Reivindicações
1. PRODUTO PARA USO NO TRATAMENTO TERAPÊUTICO OU PROFILÁTICO DE INFECÇÕES, o dito tratamento compreendendo administração oral do produto, caracterizado pelo produto ser selecionado a partir de uma formulação nutricional, um produto alimentício, um suplemento dietético, uma bebida e um produto farmacêutico, o dito produto contendo pelo menos 0,1%, em peso, de matéria seca de polissacarídeos RG-I de cenoura que têm a seguinte combinação de características: • um peso molecular na faixa de 10 a 300 kDa; • uma cadeia principal que consiste em resíduos de ácido galacturônico e resíduos de ramnose, os ditos resíduos de ramnose estando contidos em resíduos de alfa(1→4)-galacturônico-alfa(1→2)-ramnose; • a seguinte composição de monossacarídeos: ­ 20 a 60%, em mol, de resíduos de ácido galacturônico, em que os ácidos galacturônicos individuais podem ser metilados na posição C-6 e/ou acetilados na posição O-2 e/ou O-3; ­ 8 a 50%, em mol, de resíduos de ramnose; ­ 0 a 40%, em mol, de resíduos de arabinose; ­ 0 a 45%, em mol, de resíduos de galactose; ­ razão molar de resíduos de ácido galacturônico para resíduos de ramnose na faixa de 5:1 a 1:1; ­ resíduos de ácido galacturônico, resíduos de ramnose, resíduos de arabinose e resíduos de galactose, em conjunto, constituem pelo menos 85%, em mol, dos resíduos de monossacarídeos nos polissacarídeos RG-I de cenoura.
2. PRODUTO, para uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos polissacarídeos RG-I de cenoura terem um grau de metilação não maior que 50%.
3. PRODUTO, para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela razão do grau de acetilação dos polissacarídeos RG-I de cenoura para o grau de metilação dos polissacarídeos RG-I de cenoura ser 1 ou mais.
4. POLISSACARÍDEO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por pelo menos 10% dos resíduos de ácido galacturônico sem redução nos polissacarídeos RG-I serem resíduos de ácido galacturônico insaturados.
5. PRODUTO, para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelos polissacarídeos RG-I de cenoura representarem pelo menos 20%, em peso, dos polissacarídeos pécticos presentes no produto, os ditos polissacarídeos pécticos sendo definidos como polissacarídeos opcionalmente ramificados que têm um peso molecular maior que 10 kDa e que compreendem uma cadeia principal que consiste em resíduos de ácido galacturônico e resíduos de ramnose, os ditos resíduos de ramnose estando contidos em resíduos de alfa(1→4)-galacturônico-alfa(1→2)-ramnose.
6. PRODUTO, para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela razão molar da combinação de resíduos de arabinose e resíduos de galactose para resíduos de ramnose nos polissacarídeos RG-I de cenoura ser menor que 5:1, preferencialmente menor que 4,5:1.
7. PRODUTO, para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelos polissacarídeos RG-I de cenoura terem a seguinte composição de monossacarídeos: • 21 a 55%, em mol, de resíduos de ácido galacturônico, em que os ácidos galacturônicos individuais podem ser metilados e/ou acetilesterificados; • 9 a 35%, em mol, de resíduos de ramnose; • 5 a 40%, em mol, de resíduos de arabinose; • 5 a 40%, em mol, de resíduos de galactose.
8. PRODUTO, para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelos polissacarídeos RG-I de cenoura terem sido obtidos por hidrólise enzimática parcial de pectina de cenoura.
9. PRODUTO, para uso no tratamento terapêutico ou profilático, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo dito uso compreender administração oral do produto em uma dose que fornece pelo menos 200 mg dos polissacarídeos RG- I de cenoura.
10. PRODUTO, selecionado a partir de uma formulação nutricional, um produto alimentício, um suplemento dietético, uma bebida e um produto farmacêutico, caracterizado por dito produto conter pelo menos 0,1%, em peso, de matéria seca de polissacarídeos RG-I de cenoura, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 6 a 8; em que os polissacarídeos RG-I de cenoura representam pelo menos 20%, em peso, dos polissacarídeos pécticos presentes no produto, os ditos polissacarídeos pécticos sendo definidos como polissacarídeos opcionalmente ramificados que têm um peso molecular maior que 10 kDa e que compreendem uma cadeia principal que consiste em resíduos de ácido galacturônico e resíduos de ramnose, os ditos resíduos de ramnose estando contidos em resíduos de alfa(1→4)-galacturônico-alfa(1→2)-ramnose.
11. PROCESSO PARA PREPARAR POLISSACARÍDEOS RG-I DE CENOURA, caracterizado por dito processo compreender: • fornecer um isolado de pectina de cenoura, o dito isolado compreendendo pelo menos 5%, em peso, de matéria seca de polissacarídeos pécticos que têm um peso molecular de pelo menos 15 kDa e que têm uma cadeia principal que consiste em resíduos de ácido galacturônico e resíduos de ramnose, os ditos resíduos de ramnose estando contidos nos resíduos de alfa(1→4)- galacturônico-alfa(1→2)-ramnose; • hidrolisar parcialmente os ditos polissacarídeos pécticos com o uso de uma ou mais pectinases selecionadas a partir de pectina liase (EC 4.2.2.10), pectato liase (EC 4.2.2.2), endopoligalacturonase (EC 3.2.1.15), exopoligalacturonase (EC 3.2.1.67 e EC 3.2.1.82), e • submeter os polissacarídeos pécticos parcialmente hidrolisados a uma técnica de separação sólido-líquido selecionada a partir de centrifugação, decantação, filtração e combinações das mesmas para produzir uma fração líquida contendo polissacarídeos pécticos parcialmente hidrolisados; • submeter a fração líquida à ultrafiltração com o uso de uma membrana de ultrafiltração que tem um peso molecular de corte na faixa de 10 a 100 kDa; e • recuperar um retentato contendo os polissacarídeos pécticos parcialmente hidrolisados.
12. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelos polissacarídeos serem hidrolisados com o uso de uma ou mais pectinesterases (EC
3.1.1.11) antes ou simultaneamente à hidrólise parcial com o uso de endopoligalacturonase e/ou exopoligalacturonase.
13. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 12, caracterizado pelo retentato recuperado ser seco até um teor de água menor que 15%, em peso.
14. MÉTODO PARA PREPARAR UM PRODUTO selecionado a partir de uma formulação nutricional, um produto alimentício, um suplemento dietético, uma bebida ou um produto farmacêutico, caracterizado por dito método compreender incorporar no mesmo 0,1 a 50%, em peso, de matéria seca dos polissacarídeos RGI de cenoura, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
BR112020008079-9A 2017-10-23 2018-10-23 Uso de polissacarídeos rg-i de cenoura, produto, processo para preparar polissacarídeos rg-i de cenoura e método para preparar um produto BR112020008079B1 (pt)

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