CN107629135B - 一种提取富含rg-i果胶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提取富含RG‑I果胶多糖的方法。该方法，包括如下步骤：将柑橘皮粉与稀盐酸溶液在低温下混合搅拌破坏柑橘皮细胞壁，过滤后将截留物与氢氧化钠溶液混合低温提取，过滤所得溶液中加入乙醇沉淀，得到的多糖用乙醇洗涤后烘干则可得到上述果胶多糖。本发明所述方法与传统果胶多糖提取方法相比，通过控制提取温度，减少了果胶侧链的水解，提取得到的果胶多糖富含RG‑I型结构域，具有较高的预防癌症、心血管疾病等生物活性。同时，由于提取过程在常温下进行，可以极大的节省能量。提取得到的果胶多糖可以作为食品增稠剂、胶凝剂、稳定剂等应用，赋予食品更高的营养价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种提取富含RG-I果胶的方法。
背景技术
果胶是一种复杂的大分子多糖，广泛存在于植物的果实、根、茎、叶中，是植物细胞间质的重要成分。其结构复杂，目前普遍公认果胶有3种结构域，包括均聚半乳糖醛酸聚糖(HG)、鼠李半乳糖醛酸聚糖I(RG-I)和鼠李半乳糖醛酸聚糖II(RG-II)。果胶作为胶凝剂、稳定剂和增稠剂被广泛用于食品工业中，如果酱、果冻、糖果、果汁等产品，也可用于脂肪替代、成膜、药物输送和组织工程。尽管全球市场果胶的年交易额已经在2013年超过了8.5亿美元，果胶仍处于供不应求之中。为了得到质量统一、胶凝特性好的果胶，生产者通常采用强酸高温的条件处理原料，此过程会降解果胶的侧链，得到的商品果胶通常主要由HG结构组成，RG-I结构较少，并且半乳糖醛酸含量高于65％。
随着研究的深入,研究者发现果胶中的RG-I结构可以通过与半乳糖凝集素-3结合以更好的预防癌症、心血管疾病等。半乳糖凝集素-3含有特定的识别域，可以与其他蛋白和肽结合，诱导细胞粘附、迁移、转换和细胞凋亡。果胶的RG-I侧链可以占领这个识别域,进而抑制Gal-3的活动。且有研究表明果胶多糖中，RG-I结构上的阿拉伯糖和半乳糖能够显著抑制红细胞的凝集。
为了提高果胶的提取效率以及减少化学品的使用，研究者尝试用新型技术提取果胶。Jongbin Lim et.al比较了传统化学提取法和组合物理酶法从香橙果渣中提取得到的果胶的性质。结果表明通过组合物理酶获得的果胶中性糖含量(17.6％)高于传统化学法(11.1％)。
发明内容
本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种提取富含RG-I果胶的方法，该方法在常温下通过先酸再碱处理，极大的防止了柑橘粉中果胶侧链的水解，酒精沉淀、洗涤烘干后可得富含RG-I型结构域的低酯果胶。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种提取富含RG-I果胶的方法，包括如下步骤：
(1)将柑橘皮烘干粉碎后，与0.1-1.0wt％稀盐酸溶液按照料液比1：30g/ml混合，在10-40℃恒温下磁力搅拌10-120min，再用400目滤袋过滤，得到滤液和截留物。
(2)将步骤(1)中所得截留物分散于与步骤1中所用稀盐酸等体积的0.1-2.0wt％氢氧化钠溶液中，在10-40℃下磁力搅拌5-120min，用400目滤袋进行过滤；
(3)用2M盐酸将滤液pH调至6-7，再用与步骤(2)所得滤液等体积的95％体积分数的乙醇沉淀2-3小时，沉淀结束后，使用400目滤袋过滤,得到截留物碱提果胶多糖；
(4)将此截留物碱提果胶多糖用95wt％乙醇洗涤1-4次，即可得到精制后的碱提果胶多糖。
进一步地，所用稀盐酸的质量分数为0.3-0.7％，所用氢氧化钠的质量分数为0.3-0.7％。
进一步地，稀盐酸与柑橘皮粉混合搅拌时，温度控制在20-40℃，氢氧化钠提取时温度控制在20-40℃。
进一步地，稀盐酸与柑橘皮粉混合搅拌时，处理时间控制在30-60min，氢氧化钠提取时时间控制在10-50min。
进一步地，酒精沉淀得到碱提果胶多糖后，需将多糖用95％乙醇洗涤2-3次，使得烘干后得到性状良好的多糖。
本发明所述的柑橘果胶提取方法有益效果在于：本发明通过温和的提取条件保留了果胶的支链，因此得到了RG-I结构域占比高的果胶多糖。首先，通过盐酸低温处理破坏细胞壁，使得细胞壁中大部分果胶与纤维素的结合变松，然后通过氢氧化钠低温处理，即可溶出其中高度支化的果胶，最后通过控制pH再醇沉即可得到富含RG-I结构的果胶多糖。
附图说明
图1为果胶多糖的提取流程图；
图2为果胶多糖的FT-IR光谱图；
图3为不同浓度果胶多糖粘度随剪切速率的变化曲线；
图4为不同浓度果胶多糖形成的凝胶。
具体实施方式
实施例一：
将柑橘皮50g烘干粉碎后，与0.3％稀盐酸溶液1500ml混合，在20℃恒温下磁力搅拌30min，再用400目滤袋过滤，得到滤液和截留物。将截留物与1500ml0.3％氢氧化钠溶液混合，在20℃下磁力搅拌10min，用400目滤袋进行过滤，将滤液pH用2M盐酸调至6，再用1500ml 95％乙醇沉淀2小时，沉淀结束后，使用400目滤袋过滤得到截留物，将此截留物用95％乙醇200ml洗涤2次，洗涤后的截留物在55℃下干燥24h,称重得到果胶多糖干粉9.47g，得率为18.93％。
对得到的果胶多糖进行性质和结构测定：
单糖组成
单糖组成分析以Strydom(Strydom,1994)的苯基吡唑酮-高效液相色谱法为基础。将果胶多糖样品(2-3毫克)在2M三氟乙酸下110℃水解8h,然后用0.1M氢氧化钠中和并用氮气吹干。将干燥后的样品溶解在450微升0.3M的氢氧化钠中,加入0.5M的PMP甲醇溶液450ul在70℃下衍生30分钟。最后,混合物用0.3M盐酸中和,并用1ml氯仿萃取三次。上清液1ml过0.22μm的膜后进行测定。高效液相色谱分析条件为：装配有Zorbax EclipseXDB-C18柱(250mm×4.6mm,5μm,Agilent,USA)的Waters e2695(Waters,US)仪器，测试温度为25℃,检测器为2489UV/Vis Detector(Waters,US)，检测波长为250nm；流速：1mL/min；流动相：溶剂A为15％(v/v)乙腈+0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.9)，B溶剂为40％乙腈+0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.9)；梯度模式：时间梯度为0min→10min→30min→35min→45min，相应浓度梯度为0→15％→25％→25％→0溶剂B；进样体积：10ul。
表1果胶多糖的单糖组成
| 单糖种类 | 半乳糖醛酸 | 鼠李糖 | 葡萄糖 | 半乳糖 | 阿拉伯糖 |
| 含量(wt％) | 23.37 | 11.36 | 9.47 | 19.72 | 36.08 |
从表1中可以看出，果胶多糖中仅含有23.37％的酸性多糖，中性糖的比例较高。中性糖中主要包括鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖。鼠李糖/半乳糖醛酸的值为0.49,表明此果胶多糖主要由RG-I结构组成。(半乳糖+阿拉伯糖)/鼠李糖的值高达4.91，进一步表明此多糖毛发区和侧链所占比例较高。
分子量
将果胶多糖溶于纯净水中制成浓度为5mg/ml的溶液，过0.45um的水膜，然后将50ul进样到SEC-MALLS-RI((Wyatt Dawn Heleos-II,USA)系统中进行测定。所使用的柱子为Shodex SB-806 HQ(Showa Denko KK,Japan)，流动相为0.15M氯化钠溶液，流速为0.5ml/min，dn/dc＝0.1850mL/g。测得此果胶多糖的重均分子量为743.2kDa，数均分子量为191.7kDa，分散性为3.876。
FT-IR
果胶多糖的红外光谱测定采用Nicolet iN10(Thermo Fisher Scientific,USA)。将样品约1mg与200mg溴化钾粉末混合,研磨,然后压成小块进行红外光谱扫描，频率范围4000-400cm-1。获得的光谱图如图2所示，此果胶多糖在3421cm-1处的吸收峰是由于羟基的伸缩振动引起的。在2933cm-1处的峰是-CH2的伸缩振动。此外,1800cm-1和1500cm-1区间是计算果胶多糖酯化度的重要区间，从此图谱中可以看出，只有1610cm-1处的游离羧基产生的峰，无甲酯化羧基峰，表明该果胶多糖的酯化度很低。1000-1150cm-1间的三个峰是糖苷键的伸缩振动，一般来说,800-1200cm-1之间的解析是较困难的，被称为指纹区。
将按照上述方法得到的果胶多糖配制成浓度分别0.25％,0.5％,0.75％,1％,1.5％的溶液，静置12h后，将其加载到HAAKE RheoStress 6000流变仪上，采用P60TiL平行板，在25℃下测定其粘度随剪切速率的变化情况，结果如图3所示：图中可以看出，果胶多糖溶液具有剪切变稀现象，是典型的假塑性流体，当浓度从1％上升到1.5％时，粘度上升的较大，而浓度由0.25％上升到1％时，粘度都有相应的上升，具有增稠效果，可作为增稠剂应用于食品工业中。
将按照上述方法得到的果胶多糖配制成浓度分别为0.25％,0.5％,1％，1.5％的溶液15ml,加入12.5mg碳酸钙，再加入0.8％的葡萄糖酸内酯，放置一晚上，可得到如图4所示的完整的胶体。
取市售新鲜巴氏杀菌乳1L4组，分别加入70g蔗糖，再分别加入0、1、3、5果胶多糖，加热使之充分溶解，冷却后分别加入1g发酵菌粉，在42℃条件下发酵8小时，发酵结束后在4℃冰箱内老化12h，进行感官评定，感官评定由12个经过简单培训的人员完成，评定表根据GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》中对发酵乳的感官要求设计，评分表如下：
表2酸奶感官评定评分表
评分结果如下：
表3不同果胶多糖添加量下的酸奶得分表
| 果胶添加量 | 色泽 | 滋味 | 气味 | 组织状态 | 整体得分 |
| 0g | 8 | 7 | 8 | 6 | 29 |
| 1g | 8 | 8 | 8 | 7 | 31 |
| 3g | 8 | 8 | 8 | 8 | 32 |
| 5g | 6 | 7 | 7 | 8 | 28 |
由以上评分结果可知，当果胶添加量在0-0.3％之间时，随着添加量的增加，酸奶的色泽、滋味和气味等无太大变化，但是由于果胶的加入，使得酸奶的乳清析出率下降，组织更加细腻和均匀，口感更好。当果胶添加量达到0.5％时，果胶的加入会对酸奶的色泽有所影响，并且滋味评分有所下降，但是组织的乳清析出率较少，组织状态的分数依旧较高。
实施例2
将柑橘皮50g烘干粉碎后，与0.7％稀盐酸溶液1500ml混合，在40℃恒温下磁力搅拌30min，再用400目滤袋过滤，得到滤液和截留物。将截留物与1500ml0.7％氢氧化钠溶液混合，在40℃下磁力搅拌60min，用400目滤袋进行过滤，将滤液pH用2M盐酸调至6，再用1500ml 95％乙醇沉淀2小时，沉淀结束后，使用400目滤袋过滤得到截留物，将此截留物用95％乙醇200ml洗涤3次，洗涤后的截留物在55℃下干燥24h,称重得到果胶多糖干粉9.38g，得率为18.76％。
按照实施例1中单糖测定方法对其单糖组成进行测定，结果如下：
表4果胶多糖的单糖组成
| 单糖种类 | 半乳糖醛酸 | 鼠李糖 | 葡萄糖 | 半乳糖 | 阿拉伯糖 |
| 含量(wt％) | 24.56 | 12.36 | 5.33 | 17.72 | 40.63 |
从表4中可以看出，果胶多糖的单糖以中性糖为主。中性糖中主要包括鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖。计算鼠李糖/半乳糖醛酸的值为0.50,(半乳糖+阿拉伯糖)/鼠李糖的值为4.72，表明提取到的多糖仍为RG-I型结构域占主导的多糖，且侧链较长。测定其分子量为738.5kDa与实施例1中743.2kDa相差不大。对其进行FT-IR分析，表明其也为酯化度几乎为零的低酯多糖。应用于酸奶中具有较好的增稠稳定效果。
实施例3
将柑橘皮50g烘干粉碎后，与1％稀盐酸溶液1500ml混合，在40℃恒温下磁力搅拌120min，再用400目滤袋过滤，得到滤液和截留物。将截留物与1500ml2％氢氧化钠溶液混合，在40℃下磁力搅拌120min，用400目滤袋进行过滤，将滤液pH用2M盐酸调至6-7，再用1500ml 95％乙醇沉淀2小时，沉淀结束后，使用400目滤袋过滤得到截留物，将此截留物用95％乙醇200ml洗涤4次，洗涤后的截留物在55℃下干燥24h,称重得到果胶多糖干粉10.78g，得率为21.56％。
按照实施例1中单糖测定方法对其单糖组成进行测定，结果如下：
表5果胶多糖的单糖组成
| 单糖种类 | 半乳糖醛酸 | 鼠李糖 | 葡萄糖 | 半乳糖 | 阿拉伯糖 |
| 含量(wt％) | 30.07 | 11.36 | 10.77 | 16.72 | 31.08 |
从表4中可以看出，果胶多糖中酸性多糖含量增加到30.37％，中性糖比例仍然很高。中性糖中主要包括鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖。计算鼠李糖/半乳糖醛酸的值为0.38,(半乳糖+阿拉伯糖)/鼠李糖的值为4.21，表明提取到的多糖仍为RG-I型结构域占主导的多糖，且侧链较长。
按照实施例1中分子量测定方法对其分子量进行测定，其重均分子量为683.2kDa，数均分子量为161.7kDa，分散性为3.943。对其进行FT-IR分析，表明其也为酯化度几乎为零的低酯多糖。表明此条件下得到的RG-I型果胶多糖的分子量较小，测定其浓度为1.5％时的表观粘度为102mpa·s,小于优选条件下的粘度值。
实施例4
将柑橘皮50g烘干粉碎后，与0.1％稀盐酸溶液1500ml混合，在10℃恒温下磁力搅拌10min，再用400目滤袋过滤，得到滤液和截留物。将截留物与1500ml0.1％氢氧化钠溶液混合，在25℃下磁力搅拌5min，用400目滤袋进行过滤，将滤液pH用2M盐酸调至6-7，再用1500ml 95％乙醇沉淀2小时，沉淀结束后，使用400目滤袋过滤得到截留物，将此截留物用95％乙醇200ml洗涤1次，洗涤后的截留物在55℃下干燥24h,称重得到果胶多糖干粉6.38g，得率为12.76％，得率较优选条件下得率较低。
按照实施例1中单糖测定方法对其单糖组成进行测定，结果如下：
表6果胶多糖的单糖组成
| 单糖种类 | 半乳糖醛酸 | 鼠李糖 | 葡萄糖 | 半乳糖 | 阿拉伯糖 |
| 含量(wt％) | 21.72 | 4.78 | 16.49 | 14.36 | 42.65 |
从表5中可以看出，果胶多糖中酸性多糖含量为21.72％，中性糖比例仍然很高。中性糖中主要包括鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖。计算鼠李糖/半乳糖醛酸的值为0.22,(半乳糖+阿拉伯糖)/鼠李糖的值为11.92，表明提取到的多糖仍为RG-I型结构域占主导的多糖，且侧链较长。对其进行FT-IR分析，表明其为酯化度几乎为零的低酯多糖。
将此果胶多糖2g与牛血清蛋白BSA10g混合溶于100ml去离子水中，搅拌3h,使之完全溶解。然后将其用0.8mm直径的喷嘴滴加到0.3M氯化钙溶液中，缓慢搅拌，在氯化钙溶液中静置20min后用蒸馏水洗涤，在37℃下烘干即可形成包含有牛血清蛋白的钙果胶凝胶颗粒。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种提取富含鼠李半乳糖醛酸聚糖 I果胶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将柑橘皮烘干粉碎后，与0.1-1.0wt%稀盐酸溶液按照料液比1：30g/ml混合，在10-40℃恒温下磁力搅拌10-120min，再用400目滤袋过滤，得到滤液和截留物；
（2）将步骤（1）中所得截留物分散于与步骤1中所用稀盐酸等体积的0.1-2.0wt%氢氧化钠溶液中，在10-40℃下磁力搅拌5-120min，用400目滤袋进行过滤；
（3）用2M盐酸将滤液pH调至6-7，再用与步骤（2）所得滤液等体积的95%体积分数的乙醇沉淀2-3小时，沉淀结束后，使用400目滤袋过滤,得到截留物碱提果胶多糖；
（4）将此截留物碱提果胶多糖用95wt%乙醇洗涤1-4次，即可得到精制后的碱提果胶多糖。
2.根据权利要求1中所述方法，其特征在于所用稀盐酸的质量分数为0.3-0.7%，所用氢氧化钠的质量分数为0.3-0.7%。
3.根据权利要求1中所述方法，其特征在于稀盐酸与柑橘皮粉混合搅拌时，温度控制在20-40℃，氢氧化钠提取时温度控制在20-40℃。
4.根据权利要求1中所述方法，其特征在于稀盐酸与柑橘皮粉混合搅拌时，处理时间控制在30-60min，氢氧化钠提取时时间控制在10-50min。
5.根据权利要求1中所述方法，酒精沉淀得到碱提果胶多糖后，需将多糖用95%乙醇洗涤2-3次。
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