KR20200075309A - 도라지 추출물을 포함하는 호흡기염증 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 도라지 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기염증 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 도라지 추출물은 비강 점막 및 폐에 침투하여 호산구와 같은 면역세포의 침윤을 억제하고 알레르기 증상을 호전시키며, 기도세척액 및 폐 조직 주변 임파구 내 Th1, Th2 및 Th17 면역반응을 억제하는 등 면역 조절 효과가 우수한바, 천식을 비롯한 호흡기염증 질환의 예방 또는 치료를 위한 의약품 또는 식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

도라지 추출물을 포함하는 호흡기염증 질환의 예방 및 치료용 조성물 {Composition for preventing or treating respiratory inflammation disease comprising an extract of balloon flower roots}

본 발명은 도라지 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기염증 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 염증 반응은 생체의 세포나 조직에 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려고 하는 생체의 방어 반응과정이다. 따라서 이러한 일련의 반응에는 국소의 혈관, 체액의 각종 조직세포, 면역관여 세포 등이 포함된다. 최근 분자생물학의 발달과 더불어 염증성 질환이 사이토카인(cytokine)이라는 분자 수준에서의 이해가 시도되고 있으며, 이러한 질환에 영향을 주는 인자들도 하나씩 규명되고 있다.

알러지 반응은 그 반응 형태에 의해 I형, II형, III형 및 IV형의 4 가지 유형으로 분류될 수 있고, 또는 항원에 의한 재감작(感作) 후 발증까지의 시간에 의해서 I형, II형 및 III형 알러지는 즉시형 알러지라고 불리며, IV형 알러지는 지연형 알러지로 분류될 수 있다.

이 중, I형 알러지는 IgE 항체가 관여하는 반응으로서, 아나필락시형 알러지라고 불리우며, 여기에는 기관지 천식, 아토피성 질환(피부염, 장염 등), 화분증 등의 알러지성 비염, 알러지성 결막염, 음식물 알러지 등이 포함된다.

천식(asthma)이란 여러 가지 자극에 대한 기도의 과민성을 그 특징으로 하는 질환으로 기도의 광범위한 협착에 의해 발생하는 천명(喘鳴), 호흡곤란, 기침 등의 임상 증세들은 자연히 혹은 치료에 의해 가역적으로 호전될 수 있다. 대부분의 천식은 알러지성이며, 만성 기도염증(chronic airway inflammation)과 기도 과민반응성(bronchial hyperresponsiveness)이 특징이다(Minoguchi K and Adachi M. Pathophysiology of asthma. In: Cherniack NS, Altose MD, Homma I, editors. Rehabilitation of the patient with respiratory disease. New York: McGraw-Hill, 1999, pp97-104).

천식은 그 원인에 따라 외인성 천식과 내인성 천식으로 나누어질 수 있다. 외인성 천식의 경우 원인 항원에 노출되었을 때 증상이 나타나는 천식을 말한다. 원인 항원에 대한 피부시험이나 기관지 유발시험이 양성반응을 보이며 발병 연령이 어린 것이 일반적이다. 집 먼지, 진드기가 가장 많은 원인 항원이며, 그밖에 꽃가루, 동물의 상피, 곰팡이, 미세먼지 등이 원인 항원으로 작용한다. 내인성 천식의 경우에는 상기도 감염, 운동, 정서불안, 한랭 기후 및 습도의 변화 등이 천식을 유발하거나 악화시키는 경우인데, 성인형 천식에서 흔히 볼 수 있다. 그 외에도 약물에 의해 유발되는 천식, 운동 유발성 천식 및 직업성 천식 등이 있다.

천식은 TH2(T helper 2) 타입 면역세포가 생성하는 인터루킨-4, 5, 13에 의해 염증세포가 증식, 분화 및 활성화되어 기도 및 기도 주변 조직으로 이동, 침윤하기 때문에 만성 염증질환으로도 인식되고 있다(Elias JA, et al., J. Clin. Invest., 111, pp291-297, 2003). 천식을 앓고 있는 환자의 기관지에서 활성화된 호산구, 비만세포, 폐포 대식세포 등의 염증세포는 다양한 염증매개인자들(시스테인 류코트리엔, 프로스타글란딘 등)을 분비하면서 강력한 기관지 수축작용에 관여한다(Maggi E., Immunotechnology, 3, pp233-244, 1998; Pawankar R., Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol., 1, pp3-6, 2001; Barnes PJ, et al., Pharmacol Rev., 50, pp515-596, 1998).

따라서 염증세포 활성화에 관여하는 IL-4, IL-5, IL-13 등 사이토카인 및 면역글로불린 E의 생산과 이들의 작용으로 호산구 등 염증세포에서 분비되는 시스테인 류코트리엔 생합성 등은 염증 및 알러지 반응과 이로 인한 천식을 유발하는 주요 원인이므로 이들의 생산을 억제하기 위한 약물을 개발하고자 많은 연구가 진행되고 있다.

또한, 만성 폐쇄성 폐질환은, 가역적인 기류 폐쇄와 알러지성 기관지 염증 반응을 주된 특징으로 나타내는 천식과는 구분되어서 적합하게 치료되어야 하지만, 현재의 치료법은 단지 증상의 경감을 제공함에 불과하고, 최근 치료법 중 어느 것도 만성 폐쇄성 폐질환의 근본적인 치료 효과를 임상적인 결과로 나타내지 못하고 있다 (Hele DJ, Belvisi MG. 2003. Novel therapies for the treatment of inflammatory airway diseases. Expert Opin Investig Drugs 12: 5-18; Fox JC, Fitzgerald MF. 2009. The role of animal models in the pharmacological evaluation of emerging anti-inflammatory agents for the treatment of COPD. Curr Opin Pharmacol. 9: 231-242).

천식과 COPD는 원칙적으로 상이한 병리기전을 나타내는데, 예를 들어, (1) 염증세포 면에서, 천식은 비만세포(mast cell), 호산구(Eosinophils), CD4+ 세포 (Th2), 대식세포(Macrophages) 등이 주로 작용하는데 반하여, COPD는 호중구(Neutrophils), CD8+ 세포 (Tc) 등이 주로 작용한다는 점에서 상이하며; (2) 염증매개인자 면에서, 천식은 류코트리엔(Leukotriene B), 히스타민(Histamine), IL-4, IL-5, IL-13, 에오탁신(Eotaxin), RANTES, 산화적 스트레스(Oxidative stress) 등이 주로 관여되는데 반하여, COPD는 TNF-alpha, IL-8, GRO-alpha 등이 주로 관여된다는 점에서 상이하며; (3) 염증현상 면에서, 천식은 전체 기도에 작용하여, AHR(기도과민반응 과민), 상피성 쉐딩(Epithelial shedding), 섬유증(Fibrosis), 조직질실상 발전이 없으며(no parenchymal involvement), 점액분비(muscus secretion), 비교적 가역적 기류장애 현상, 기침, 재채기, 호흡곤란(dyspnea)를 주로 어린 시기에 발생하는 데 반하여, COPD는 말초 기도에 작용하여, 상피성 변성(Epithelial metaplasia), 조직질실상 손상 (parenchymal destruction), 비교적 비가역적 기류장애 현상, 만성 기관지염, 폐기종을 주로 성인기에 발생하는 점에서 상이한 점 등의 별개의 병리기전을 갖는 것으로 알려져 있다 (Barnes PJ. 2000. Mechanisms in COPD: differences from asthma. Chest 117: 10S-14S; Seatta M, Turato G, Maestrelli P, Mapp CE, Fabbri LM. 2001. Cellular and structural base of chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med. 163: 1304-1309).

따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 천연유래 물질을 포함하는 호흡기염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 천연유래 물질을 포함하는 호흡기염증 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 도라지 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 도라지 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기염증 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 "호흡기염증 질환"이란 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 천식 및 만성 폐쇄성 폐질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 도라지 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 비강 점막 및 폐에 침투하여 호산구와 같은 면역세포의 침윤을 억제하고 알레르기 증상을 호전시키며, 기도세척액 및 폐 조직 주변 임파구 내 Th1, Th2 및 Th17 면역반응을 억제하는 등 면역 조절 효과가 우수한바, 천식을 비롯한 호흡기염증 질환의 예방 또는 치료효과를 나타낸다.

본 발명에서 유효성분으로 사용하는 도라지는 특유의 향과 쌉싸름한 맛이 특징이며 생으로 또는 익혀서 나물로 먹는 것이 일반적이다. 강원도를 중심으로 연중 재배가 이루어지고 있으며, 특히 봄철의 도라지가 맛과 향이 좋은 편이다. 오래된 도라지는 산삼보다 낫다는 옛말이 있을 정도로 영양이 풍부하다. 대표적인 알칼리성 식품으로 칼슘과 철분, 칼륨, 미네랄, 비타민, 식이섬유 등을 비롯해 유익한 아미노산이 함유되어 있으며, 특히 풍부한 사포닌 성분은 기침, 가래에 효능이 있어 예로부터 호흡기를 보하는 약재로 많이 쓰여 왔다. 도라지와 궁합이 좋은 식재는 꿀과 배로 도라지에 부족한 열량을 보충해 주고 쓴맛을 줄여준다. 나물로 쓰는 도라지는 주로 1~3년 근을 사용하며, 3년 이상 자란 도라지는 쓴맛이 강하고 각종 유익한 성분의 함량이 높아 약도라지라고 부르며 주로 차와 약용으로 쓰인다. 도라지는 섬유질이 많고 비타민과 무기질이 풍부한 알칼리성 식품으로 산성 음식을 많이 섭취하는 현대인들에게 꼭 필요한 식재료 중 하나이다. 도라지의 사포닌은 기침, 가래, 염증을 삭혀주는 등 기관지 및 호흡기 건강에 좋고, 혈당 조절과 콜레스테롤 저하 기능이 있다. 또한 칼슘이 다량 함유되어 있어 골다공증 예방과 성장기 어린이들의 뼈 건강에 좋다.

본 발명의 용어 "추출물(extract)"은 생약을 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 증발시켜 농축한 제제를 의미하는 것으로, 이에 제한되지는 않으나, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다.

본 발명의 도라지 추출물은 당분야에 공지된 통상적인 추출용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 추출한 액은 액체 형태로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 이때, 상기 추출용매는 예를 들어, (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름 또는 (g) 1,3-부틸렌글리콜을 추출 용매로 하여 수득할 수 있다. 바람직하게는, 메탄올, 에탄올 또는 부탄을 이용하여 추출하는 것이 좋다. 추출용매에 따라 추출물의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 추출용매를 선택하여 사용하도록 한다. 상기 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다.

또한, 상기 도라지 추출물은 상기 추출용매에 의하여 추출하는 방법 외에 통상적인 정제과정을 거쳐서도 수득할 수 있다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제방법을 통해 얻어진 분획을 통하여서도 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명의 실시양태에 따르면, 도라지 추출물은 각각 도라지 시료 중량의 약 0.5 내지 20배, 바람직하게는 1 내지 15배 분량의 물, 에탄올, 메탄올 등과 같은 C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 물과 에탄올의 혼합용매를 이용하여 고온에서 약 20 내지 70시간, 바람직하게는 40 내지 50 시간 동안 교반추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여, 바람직하게는 열수추출한 후 수득한 추출액을 여과, 감압농축 또는 건조하여 추출물을 수득할 수 있다.

상기 용매로 추출한 추출물은 이후, 부탄올, 헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름, 물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 분획과정을 더욱 실시할 수 있다.

상기 도라지 추출물은 상기 수득된 추출액을 농축 및 동결건조를 통하여 수분을 완전히 제거시킨 것일 수 있으며, 상기 수분을 완전히 제거시킨 각 추출물은 분말형태로 사용하거나 상기 분말을 증류수 또는 통상의 용매에 녹여 사용할 수 있다.

본 발명은 상기 제조방법으로 얻어지는 도라지 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기염증 질환 예방 또는 치료효과를 가지는 조성물로서, 비강 점막 및 폐에 침투하여 호산구와 같은 면역세포의 침윤을 억제하고 알레르기 증상을 호전시키며, 기도세척액 및 폐 조직 주변 임파구 내 Th1, Th2 및 Th17 면역반응을 억제하는 등 면역 조절 효과가 우수하여 천식을 비롯한 호흡기염증 질환 예방 또는 치료 활성을 가지는 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 발명의 조성물에서, 도라지 추출물의 양은 전체 조성물에 대하여 0.001 내지 20 중량%, 보다 바람직하게는 도라지 추출물은 전체 조성물에 대하여 0.001 내지 10 중량%이 포함될 수 있다. 0.0001 중량% 미만인 경우에는 Th1, Th2 및 Th17의 발현 억제효과가 너무 미약하고, 20 중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 미비하여 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.

본 발명의 도라지 추출물을 함유하는 조성물은 호흡기염증 질환에 대한 항염증 효과를 나타내며, 천연 물질로서 세포독성이 거의 없다.

본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 도라지 추출물을 포함하는 호흡기염증 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 상기 추출물을 포함하는 조성물의 투여로 염증, 알러지 또는 호흡기염증 질환 및 천식을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"는 개체에서 (a) 질환 또는 질병의 발전의 억제 (b) 질환 또는 질병의 경감 및 (c) 질환 또는 질환의 제거를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "개체"는 본 발명의 상기 조성물을 투여하여 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 개, 고양이, 랫드, 마우스, 침팬지 등의 포유동물을 의미한다.

본 발명의 하나의 실시양태에 따른 호흡기염증 질환 예방 및 치료 활성을 가지는 조성물은 도라지 추출물 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구 또는 비경구 등의 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 예컨대 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 혈관내 주사에 의해 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구 투여 중 경피투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용된다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은, 경구형 제형인 경우 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있으며, 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1일당 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 사용할 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 도라지 추출물을 포함하는 호흡기염증 질환 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 하나의 실시양태에 따른 식품 조성물에는 유효성분으로서 도라지 추출물뿐만 아니라 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 도라지 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

한편, 본 발명의 도라지 추출물은 천연물질로서 인체에 무해하며, 독성 및 부작용이 거의 없으므로 장기간 사용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 약학적 및 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

이와 같이, 본 발명에 따른 도라지 추출물은 비강 점막 및 폐에 침투하여 호산구와 같은 면역세포의 침윤을 억제하고 알레르기 증상을 호전시키며, 기도세척액 및 폐 조직 주변 임파구 내 Th1, Th2 및 Th17 면역반응을 억제하는 등 면역 조절 효과가 우수한바, 천식을 비롯한 호흡기염증 질환의 예방 또는 치료를 위한 의약품 또는 식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 미세먼지와 과민성 호흡기 질환 유도 마우스 모델의 제조과정 및 동물실험 디자인을 모식도화한 것이다.
도 2는 천식 유도 마우스 모델에서 도라지 추출물에 의한 백혈구(white blood cell; WBC), 호중구(neutrophils), 호산구(eosinophils), 림프구(lymphocytes) 및 단핵백혈구(monocytes)의 분석결과이다.
도 3은 천식 유도 마우스 모델에서 도라지 추출물에 의한 IgE 분석결과를 나타낸 것이다.
도 4는 천식 유도 마우스 모델에서 도라지 추출물에 의한 조직병리학적 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 천식 유도 마우스 모델에서 도라지 추출물에 의한 Th1 cytokine의 DNA 발현량 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 천식 유도 마우스 모델에서 도라지 추출물에 의한 Th2 cytokine의 DNA 발현량 변화를 나타낸 것이다.
도 7은 천식 유도 마우스 모델에서 도라지 추출물에 의한 Th17 cytokine의 DNA 발현량 변화를 나타낸 것이다.
도 8은 천식 유도 마우스 모델에서 도라지 추출물에 의한 Th1 cytokine의 protein 발현량 변화를 나타낸 것이다.
도 9는 천식 유도 마우스 모델에서 도라지 추출물에 의한 Th2 cytokine의 protein 발현량 변화를 나타낸 것이다.
도 10은 천식 유도 마우스 모델에서 도라지 추출물에 의한 Th17 cytokine의 protein 발현량 변화를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 도라지 추출물 제조

도라지 1kg을 세척 건조 후 분쇄하여 분말화한 후 분말 20 g에 정제수 1 L를 넣고 멸균기에서 열수추출하거나, 30%(v/v) EtOH 및 70%(v/v) EtOH를 사용하여 추출하였다. 상층액은 농축기를 이용하여 농축하여 도라지 추출물을 제조하였다.

<시험예 1> 미세먼지 대응 과민성 호흡 개선 효능 규명

상기 실시예 1에서 제조된 도라지 추출물 시료의 총 기관지폐포세척액 (BAL; bronchoalveolarlavage) 세포수에 미치는 영향을 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 응용하여 실험하였다 (Schins et al., ToxicolAppl Pharmacol. 195(1), 1-11 (2004)과 Smith et al., Toxicol Sci, 93(2), 390-399 (2006)).

(1) 미세먼지와 과민성 호흡기 질환 유도 동물 모델 제작

동물입수 후 5일 이상의 순화기간을 거친 후 군분리를 실시하였다.

난알부민(ovalbumin, OVA)을 이용하여 알레르기성 호흡기 질환 마우스 모델을 제조하였다. 보다 구체적으로, OVA를 마우스에 투여하여 천식을 유도하였으며, 실험군의 경우, OVA 투여 전 실시예 1에서 수득한 도라지 추출물을 경구 투여하였다. 상기 미세먼지와 과민성 호흡기 질환 유도 마우스 모델의 제조과정 및 동물실험 디자인을 도 1에 모식도로 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 천식 유도 전, 실험군(TEST)에는 도라지 추출액을 1마리의 마우스당 50mg/kg, 150mg/kg 및 300mg/kg의 양으로 2일 간격으로 경구투여하였다. 양성대조군으로 덱사메타손(dexamethasone, DEX)을 사용하였다. 경구투여 1일 후, Ovalbumin (20 μg) + alum hydrate (1 mg)를 500 μL의 주사용 생리식염수로 희석한 후 1주일 간격으로 2회 복강투여한 다음 1주일 후 5일간 미세먼지와 5% ovalbumin이 함유된 생리식염수를 nebulizer를 사용하여 3 mL/min으로 분사하여 30분간 강제 흡입시켜 천식을 유도하였다.

(2) BALF(bronchoalveolar lavage fluid) 분석

마취된 마우스를 사지를 고정한 후 기관지를 노출하고 27G flexible feeding needle을 삽관한 다음 0.2 mL PBS를 폐에 천천히 넣고 천천히 회수하여 BALF를 얻되 혈액이 유입되지 않도록 하였다. 동일한 방법으로 3회 PBS를 회수하였다.

회수한 BALF는 혈구분석기를 통한 BALF의 WBC 및 상이한 세포수를 측정하였다. BALF 채취를 통해 얻은 1번 튜브는 3000 rpm/5 min으로 원심분리 후 상층액을 3번 튜브로 옮기고, 3번 튜브에 상층액을 옮긴 후 바로 냉동실 보관하였다. 1번의 남은 펠렛에 PBS 20 μL를 넣고 섞었다. 2번 튜브 또한 3000 rpm/5 min으로 원심분리 후 상층액을 버리고 남은 펠렛에 PBS 60 μL을 넣고 섞고, 1번의 20 μL와 2번의 60 μL를 섞어 총 80 μL를 만든 후 혈구분석을 실시하였다.

혈액은 혈구분석에 사용하기 위해 채취한 혈액을 capillary tube를 이용하여 혈구분석에 사용할 혈액을 따로 보관하고 나머지 혈액은 상층액으로 IgE 분석에 사용하였다.

도 2는 천식 유도 마우스 모델에서 도라지 추출물에 의한 백혈구(white blood cell; WBC), 호중구(neutrophils), 호산구(eosinophils), 림프구(lymphocytes) 및 단핵백혈구(monocytes)의 분석결과이다. 여기에서 보듯이, 혈구수 및 diff quik stain 분석결과 OVA 유도군과 비교하여 도라지 농도별 투여군에서 농도의존적으로 감소함을 확인하였다.

(3) IgE 분석

마우스 IgE ELISA set (BD Biosciences, 555248, CA, USA)을 사용하여 Coat micro well에 코팅 완충액에 희석한 Capture Ab를 100 μL씩 넣고 커버를 덮고 4℃에서 밤새 배양한 다음 세척액으로 3번 세척한 후 각 well에 Assay Diluent를 200 μL씩 넣고 실온에서 1시간 배양하였다. 세척액으로 3번 세척한 후 각 well에 Assay Diluent로 희석한 standard, sample를 100 μL씩 넣고 실온에서 2시간 배양하였다.

이어서, 세척액으로 5번 세척한 후 각 well에 Working Detector (Detection Antibody + SAv-HRP reagent)를 100 μL씩 넣고 실온에서 1시간 배양하고 세척액으로 7번 세척 후 각 well에 기질 용액을 100 μL씩 넣고 실온의 암조건에서 30분 배양 후 각 well에 중지 용액을 50 μL씩 넣고 30분 이내에 450 nm에서 측정하였다.

도 3은 천식 유도 마우스 모델에서 도라지 추출물에 의한 IgE 분석결과를 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, OVA 유도군과 비교하여 도라지 150 mg/kg에서 유의성 있게 감소하였음을 알 수 있다.

(4) 조직병리학적 분석

폐 및 비장은 부검 시 1/2은 액체질소에 넣어 급속동결한 후 초저온냉동고 혹은 액체질소통(약 -75℃)에 보관하여 PCR/western blot용으로 활용하고, 1/2은 10% 포르말린 용액에 보관하여 조직병리 및 면역조직화학 (IHC)용으로 활용하였다.

H&E 염색은 파리핀 제거 및 수화과정(xylene 5 min → xylene 5 min → xylene 5 min → 80% EtOH 1 min → 90% EtOH 1 min → 100% EtOH 1 min)을 실시하였다. 탈수과정 후 수돗물에 5분 동안 수세를 실시하고 물기를 잘 닦아준 후에 heamatoxylin solution에 1.5 min 동안 담가 염색하였다. 염색 후 조직이 파랗게 보일 때까지 흐르는 물에서 세척하였다. 청명과정 및 탈수과정(95% EtOH 5 min →Eosin 5 min → 95% EtOH 1 min → 95% EtOH 1 min → 100% EtOH 1 min → 80% EtOH 1 min → 90% EtOH 1 min → 100% EtOH 1 min → xylene 2 min → xylene 2 min → xylene 2 min)을 실시한 후에 mounting 과정으로 조직봉입을 실시하였다.

PAS 염색은 파리핀 제거 및 수화과정(xylene 5 min → xylene 5 min → xylene 5 min → 80% EtOH 1 min → 90% EtOH 1 min → 100% EtOH 1 min)을 실시함. 실시 후 10 min동안 0.5% periodic acid solution에 담가 조직을 산화시켰다. 산화 후 5 min 동안 흐르는 물에 수세하고 3 min정도 1차 증류수로 가볍게 세척하였다. 세척 후 10 min동안 schiff 시약에 담가 반응시킨 후 5 min동안 흐르는 물에 수세한 다음 1.5 min동안 hematoxylin solution으로 염색하고 10 min동안 흐르는 물에 수세하였다. 청명과정 및 탈수과정(95% EtOH 5 min → eosin 5 min → 95% EtOH 1 min → 95% EtOH 1 min → 100% EtOH 1 min → 80% EtOH 1 min → 90% EtOH 1 min → 100% EtOH 1 min → xylene 2 min → xylene 2 min → xylene 2 min)을 실시한 후에 mounting 과정으로 조직봉입을 실시하였다.

도 4는 천식 유도 마우스 모델에서 도라지 추출물에 의한 조직병리학적 분석 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, H&E 염색과 PAS 염색 결과 OVA 유도군에서 CON과 비교하여 eosinophil, mucus, epithelial hyperplasia, mucus가 증가하였고 양성대조군은 CON과 비슷하게 감소하였으며 도라지 농도별 투여군에서는 농도 의존적으로 감소하였음을 알 수 있다.

(5) 사이토카인 변화 분석

도라지 추출물이 Th1 cytokine, Th3 cytokine 및 Th17 cytokine 발현발현 억제에 미치는 영향을 시험하였다.

RT-PCR은 천식과 관련된 물질의 변화를 측정하기 위하여, 폐 조직으로부터 추출 키트를 이용하여 total RNA를 추출하고 PCR 방법을 통해서 mRNA의 변화를 관찰하였다. PCR cycle 조건은 95℃에서 2 min 후 95℃에서 5초 → 65℃에서 30 초를 40회 반복하였다. 상기 RT-PCR에 사용된 프라이머를 아래의 표 1에 정리하였다.

	forward primer	reverse primer
IFN-γ	5'-AATGAACGCTACACACTGCA-3'	5'-TGAAGAAGGTAGTAATCAGG-3'
IL-12α	5'-GCCAGGTGTCTTAGCCAGTC-3'	5'-ATGGCCTGGAACTCTGTCTG-3'
TNF-α	5'-CCACATCTCCCTCCAGAAAA-3'	5'-AGGGTCTGGGCCATAGAACT-3'
IL-4	5'-CCAGCTAGTTGTCATCCTGC-3'	5'-GTFATGTGGACTTGGACTCA-3'
IL-6	5'-TTGCCTTCTTGGGACTGATG-3'	5'-CAGAATTGCCATTGCACAACT-3'
IL-12α	5'-GCCAGGTGTCTTAGCCAGTC-3'	5'-ATGGCCTGGAACTCTGTCTG-3'
IL-13	5'-TCTGTGTAGCCCTGGATTCCC-3'	5'-CCGTGGCGAAACAGTTGCTT-3'
β-actin	5'-GAAATCGTGCGTGACATC-3'	5'-GCTTGCTGATCCACATCT-3'

도 5는 천식 유도 마우스 모델에서 도라지 추출물에 의한 Th1 cytokine의 DNA 발현량 변화를 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, IL-12의 발현량이 도라지 농도별 투여군에서 농도의존적으로 감소함을 알 수 있다.

도 6은 천식 유도 마우스 모델에서 도라지 추출물에 의한 Th2 cytokine의 DNA 발현량 변화를 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, IL-4의 발현량이 도라지 농도별 투여군에서 감소하였고 IL-5에서는 농도의존적으로 감소하였으며 IL-13에서는 중농도에서 가장 감소함을 확인하였다.

도 7은 천식 유도 마우스 모델에서 도라지 추출물에 의한 Th17 cytokine의 DNA 발현량 변화를 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, TNF-α의 발현량이 도라지 고농도 투여군에서 가장 감소함을 확인하였다.

ELISA 분석을 위해 모든 시약은 사용 직전 실온으로 옮겨 사용하였다. 세척액은 25x 세척액과 D.W를 1 : 24로 희석하여 사용하고 SAV-HRP은 streptavidin-HRP (100X) 10 μL 와 streptavidin-HRP 1 mL로 희석하여 사용하였다. 표준용액 (STD)의 농도는 8개 농도로 구성하여 고농도에서부터 저농도로 희석하여 제조하여 사용하였다. 각 well에 STD, 대조군, 시료를 100 μL 넣고 플레이트 커버를 덮고 실온에서 2 시간 동안 배양시킨 후, well에 있는 액체를 모두 제거하고 4번의 세척(200 μL)을 실시하였다. Chromogen blank를 제외하고 각 well에 biotinylated anti-Ms IFN-γ용액을 100 μL 씩 넣고 플레이트 커버로 플레이트를 덮고 실온에서 1시간 동안 배양함. Well에 있는 액체를 모두 제거하고 4번의 washing을 실시하였다. Chromogen blank를 제외하고 각 well에 streptavidin-HRP Working 용액을 100 μL 씩 넣은 후 플레이트 커버로 플레이트를 덮고, 실온에서 30 분간 배양함. Well에 있는 액체를 모두 제거하고 washing과정을 반복 후 각 well에 stabilized chromogen을 100 μL 추가하여 실온의 암조건에서 30분 동안 배양하였다. 변색 후 2시간 이내에 EZ Reader 450 nm에서 측정하였다.

도 8은 천식 유도 마우스 모델에서 도라지 추출물에 의한 Th1 cytokine의 protein 발현량 변화를 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, IL-12의 발현량이 도라지 농도별 투여군에서 농도의존적으로 감소함을 확인하였다.

도 9는 천식 유도 마우스 모델에서 도라지 추출물에 의한 Th2 cytokine의 protein 발현량 변화를 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, IL-4, IL-5, IL-13의 발현량이 도라지 농도별 투여군에서 농도의존적으로 감소함을 확인하였다.

도 10은 천식 유도 마우스 모델에서 도라지 추출물에 의한 Th17 cytokine의 protein 발현량 변화를 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, TNF-α의 발현량이 도라지 농도별 투여군에서 농도의존적으로 감소함을 확인하였다.

Claims (4)

1. 도라지 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 호흡기염증 질환이 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 천식 및 만성 폐쇄성 폐질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 호흡기염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
3. 도라지 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기염증 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
4. 제 3 항에 있어서,
   상기 호흡기염증 질환이 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 천식 및 만성 폐쇄성 폐질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 호흡기염증 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.

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