KR20200072499A - 바이러스 및 박테리아 감염의 치료를 위한 신규한 mek-억제제 - Google Patents
바이러스 및 박테리아 감염의 치료를 위한 신규한 mek-억제제 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 박테리아 감염 및 인플루엔자 바이러스 감염을 포함하는 동시 감염 또는 바이러스 또는 박테리아 감염 단독의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 PD-0184264에 관한 것이다. 박테리아 감염 및 인플루엔자 바이러스 감염을 포함하는 동시 감염 또는 박테리아 또는 바이러스 감염 단독의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 이러한 억제제를 포함하는 조성물이 또한 제공된다.
Description
인플루엔자 A 바이러스는 현저한 이환율 및 사망률을 초래하는 심각한 호흡기 질환의 원인성 제제이다. 인플루엔자 바이러스 감염 과정에서 대부분의 치명적인 사례는 실제로 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(에스. 아우레우스), 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 및 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza)와 같은 다른 박테리아에 의해 유발되는 2차 폐렴의 결과이다(참조: Morens et al., 2008, Chertow et al. al., 2013). 박테리아 동시 감염(co-infection)의 가장 두드러진 문제는 갑작스럽게 증가된 병원성(참조: Iwao et al., 2012, Paddock et al., 2012, Parker et al., 2012) 및 다른 병원체에 대한 강력한 항감염제의 제한된 비축이다. 인플루엔자 바이러스의 높은 가변성 및 새로운 균주의 지속적인 출현(참조: Neumann et al., 2009, Taubenberger et al., 2010, Parry, 2013), 박테리아 균주의 특이적 특성(참조: Grundmann et al. 2006, Moran et al., 2006, Gillet et al., 2007, Shilo et al., 2011)뿐만 아니라 이용가능한 약물/항생제에 대한 인플루엔자 바이러스(참조: Hayden et al, 1992, Bright et al., 2006, Pinto et al., 2006, De Clercq et al., 2007, Pinto et al., 2007) 및 박테리아(참조: Grundmann et al., 2006, Moran et al., 2006, Shilo et al. 2011) 둘 다의 신속한 내성 발달이 불량한 치료 옵션의 주요 원인이다.
WO 2001/076570은 (-)RNA 바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스에 의해 발생된 감염을 MEK 억제제에 의해 치료 또는 예방하는 개념을 제공한다. WO 2014/056894는 인플루엔자 바이러스 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 특정 MEK 억제제, 예를 들어, AZD-6244, AZD-8330, RDEA-119, GSK-1120212(트라메티닙), GDC-0973(코비메티닙), CI-1040, PD-0325901, RO-5126766, MSC1936369(AS-703026)를 제공한다. WO 2015/173788 A1에는 인플루엔자 바이러스 및 박테리아 동시 감염의 치료 방법에 사용하기 위한 MEK 억제제가 개시되어 있다.
그러나, 바이러스 감염, 특히 인플루엔자 바이러스 감염뿐만 아니라 바이러스 감염, 특히 인플루엔자 감염을 동반하는 박테리아 동시 감염을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 몇몇 유망한 MEK 억제제가 이미 공지되고 제공되어 있지만, 이러한 적용을 위해, 또한 추가로 특히 박테리아 감염의 치료를 위해 이상적으로 개선된 MEK 억제제를 추가로 제공할 필요가 여전히 존재한다. 따라서, 본 출원의 기술적 문제는 이러한 요구를 만족시키는 것이다.
기술적 문제의 해결책은 바이러스성 질환, 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 감염, 박테리아 감염 또는 박테리아 감염 및 바이러스성 질환을 포함하는 동시 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 CI-1040의 대사산물인 PD-0184264의 제공이다. 이 해결책은 또한 이후 및 청구범위에 기재된 구현예에 반영되며, 실시예 및 도면에 예시되어 있다. 본 출원의 발명자들은 놀랍게도 MEK 억제제 CI-1040의 대사산물인 PD-0184264가 CI-1040 자체보다 더 높은 항바이러스 및 항균 활성을 갖는다는 것을 발견했다. 따라서, PD-0184264를 사용하면 바이러스 감염, 특히 인플루엔자 바이러스 감염 뿐만 아니라 바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스, 박테리아 동시 감염 및 박테리아 감염에 대한 보다 효과적인 치료 옵션을 제공함으로써 본 출원의 기초가 되는 기술적 문제를 해결한다.
비록 MEK 억제제 CI-1040이 인플루엔자 바이러스 감염 및 인플루엔자 바이러스 또는 박테리아 동시 감염의 치료 또는 예방에 이미 효과적이지만, 본 발명자들은 CI-1040의 대사산물(PD-0184264, 화학식 1)이 CI-1040 그 자체보다 인플루엔자 바이러스 및/또는 박테리아 감염 또는 인플루엔자 바이러스 및 박테리아 감염을 포함하는 동시 감염을 표적화하는데 더 효과적이다는 것을 발견했다. PD-0184264는 CI-1040의 몇몇 대사산물 중 하나이지만(참조: Wabnitz et al., 2004, Lo usso et al., 2005), 대사산물이 CI-1040보다 더 강력한 것으로 공지되거나 추정될 수 없다. 본 발명자들의 놀라움에 많이, 그들은 실제로 하나의 대사산물(PD-0184264, 하기 구조식 1)이 실시예에 도시된 바와 같이 CI-1040보다 더 효과적이며 더 높은 치료 가능성을 갖는다는 것을 발견했다. PD-0184264의 이 특성은 예상할 수 없었는데, 이는 PD-0184264가 실제로 CI-1040보다 시험관내에서 MEK 키나제에 대해 더 약한 억제 효과를 나타내기 때문이다(참조: 실시예 9). 또한, 시험관내 검정은 CI-1040과 비교하여 PD-0184264의 약한 항바이러스 효과를 나타내는 반면(참조: 실시예 10), 생체내 검정은 놀랍게도 CI-1040과 비교하여 PD-0184264의 훨씬 더 강한 항바이러스 효과를 나타냈다(참조: 실시예 11).
[화학식 1]
따라서, 본 발명은 박테리아 감염 및/또는 바이러스성 질환의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것이다. 바람직하게는, 바이러스성 질환을 일으키는 바이러스는 음성 가닥 RNA 바이러스, 바람직하게는 인플루엔자 바이러스, 보다 바람직하게는 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B 바이러스이다.
본 발명은 또한 박테리아 감염의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것이다. 박테리아 감염은 바람직하게는 스타필로코카시에(Staphylococcaceae), 스트렙토코카시에(Streptococcaceae), 레지오넬라시에(Legionellaceae), 슈도모나다시에(Pseudomonadaceae), 바실라시에(Bacillaceae), 클라미디아시에(Chlamydiaceae), 마이코플라스마타시에(Mycoplasmataceae), 엔테로박테리아시에(Enterobacteriaceae), 슈도모나달레스(Pseudomonadales) 및/또는 파스테우렐라시에(Pasteurellaceae)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 박테리아에 의해 매개된다.
본 발명은 또한 박테리아 감염 및 바이러스성 질환을 포함하는 동시 감염의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것이다.
바람직하게는, PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 박테리아 감염 및 바이러스성 질환을 포함하는 동시 감염의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 것이며, 여기서 상기 박테리아 감염은 스타필로코카시에, 스트렙토코카시에, 레지오넬라시에, 슈도모나다시에, 바실라시에, 클라미디아시에, 마이코플라스마타시에, 엔테로박테리아시에, 슈도모나달레스 및/또는 파스테우렐라시에로 이루어진 그룹으로부터 선택된 박테리아에 의해 매개된다.
바람직하게는, PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 박테리아 감염 및 바이러스성 질환을 포함하는 동시 감염의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 것이고, 여기서 상기 바이러스는 음성 가닥 NA 바이러스, 바람직하게는 인플루엔자 바이러스, 보다 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스이다.
바람직하게는, PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 바이러스성 질환의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 것이며, 여기서 PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 뉴라미니다제 억제제 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 조합하여 투여된다.
바람직하게는, PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 박테리아 감염 및 바이러스성 질환을 포함하는 동시 감염의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 것이며, 여기서 PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 뉴라미니다제 억제제 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 조합하여 투여된다.
대안적인 구현예에서, PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 바이러스성 질환의 예방 및/또는 치료 방법, 또는 박테리아 감염 및 바이러스성 질환을 포함하는 동시 감염의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 것이고, 상기 뉴라미니다제 억제제는 오셀타미비르, 오셀타미비르 포스페이트, 자나미비르, 라니나미비르 또는 페라미비르 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로부터 선택된다.
PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 뉴라미니다제 억제제 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 약제학적 조성물이 또한 본 발명에 의해 제공된다.
바람직하게는, PD-0184264는 바이러스성 질환의 예방 및/또는 치료 방법 및/또는 박테리아 질환의 예방 및/또는 치료 방법 및/또는 박테리아 감염 및 바이러스성 질환을 포함하는 동시 감염의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 것이고, 여기서 PD-0184264는 하나 이상의 MEK 억제제와 조합된다.
바람직하게는, PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 대상체, 바람직하게는 척추 동물, 보다 바람직하게는 조류 또는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간에서 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 동시 감염의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 것이다.
본 발명은 추가로 PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 박테리아 감염의 치료 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 바이러스성 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 박테리아 감염 및 바이러스성 질환을 포함하는 동시 감염의 치료 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 바이러스는 음성 가닥 RNA 바이러스이고, 보다 바람직하게는 바이러스는 인플루엔자 바이러스이고, 가장 바람직하게는 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스이다.
바람직하게는, 박테리아 감염은 스타필로코카시에, 스트렙토코카시에, 레지오넬라시에, 슈도모나다시에, 바실라시에, 클라미디아시에, 마이코플라스마타시에, 엔테로박테리아시에, 슈도모나달레스 및 파스테우렐라시에로 이루어진 그룹으로부터 선택된 박테리아에 의해 매개된다.
도면은 다음을 도시한다:
도 1: 인플루엔자 A로 감염된 마우스의 PD-0184264 또는 CI-1040에 의한 치료.
실시예 1의 실험 결과는 바이러스 역가(log10) pfu/ml(왼쪽) 또는 % 바이러스 역가(오른쪽)로 제시된다.
도 2: MRSA 박테리아 성장에 대한 PD-0184264 및 CI-1040의 영향을 보여주는 그래프.
상이한 시점에서, 그래프의 수평 축에 지시된 바와 같이, 무세포 박테리아 배양물의 광학 밀도는 박테리아 성장에 대한 표시로서 측정되었으며, 그래프의 수직 축에 %로 나타냈다(OD600). 데이터는 실시예 2에 기재된 3개의 생물학적 복제물의 평균 값을 나타낸다.
도 3: 상이한 농도의 PD-0184264에 의한 박테리아 MRSA 성장의 억제.
PD-0184264는 에스. 아우레우스 USA300(MRSA)의 밤새 배양물에 상이한 농도(표시된 바와 같이)로 투여되었다. 6시간 후, 광학 밀도를 시험했다. 도면에 도시된 데이터는 실시예 2에 기재된 3개의 생물학적 복제물 중 하나의 실험을 나타낸다.
도 4: 박테리아 성장에 대한 CI-1040 및 PD-0184264의 영향.
(A) 상이한 농도에서 박테리아 성장에 대한 CI-1040의 영향 (B, C) 상이한 농도의 PD-184264에서 에스. 아우레우스 균주 6850(B) 또는 균주 USA300(C)에 대한 PD-0184264의 영향.
도 5: 단일 또는 동시 감염된 세포에 PD-0184264의 투여는 세포를 보호한다.
인간 폐 상피 세포(A549)를 PD-0184264(지시된 농도로) 또는 용매(DMSO)로 전처리하고, 인간 인플루엔자 바이러스 균주 A/푸에르토 리코/8/34(H1N1)로 감염시켰다. PD-0184264의 항바이러스 및 강력한 항균 효과(도 2 내지 4)를 감안할 때, 본 발명자들은 화합물의 이러한 특징이 또한 IAV(인플루엔자 A 바이러스) 및/또는 에스. 아우레우스 감염에 의해 유발된 세포 파괴성 세포 변성 효과(CPE)와 관련하여 거시적으로 관찰될 수 있는지를 분석했다. 세포 단층의 약간의 파괴가 IAV(H1N1)(중간 패널) 또는 에스. 아우레우스 균주 6850(상부 패널)에 의한 단일 감염 후 관찰되었다. 이 CPE는 두 병원체(하부 패널)에 의한 동시 감염시 강하게 증가되었지만, 증가하는 농도의 PD-0184264의 존재하에 억제되었다.
도 6: PD-0184264의 항균 작용과 일반적인 항생제의 비교.
일반적인 항생제의 작용으로 MEK-억제제 PD0184164의 항균 특성을 정렬시키기 위해, 본 발명자들은 박테리아를 밤새 용매, MEK-억제제 U0126 및 PD-0184264 또는 상이한 농도의 항생제 겐타마이신으로 처리했다. 용매 처리된 박테리아와 비교하여, 1세대 MEK-억제제 U0126에 의한 배양은 박테리아 역가의 최소한의 감소만을 초래한 반면, PD-0184264에 의한 치료는 박테리아 부하의 매우 강력한 감소를 초래했다. 이것은 두 박테리아 균주에 대해 마찬가지였다.
도 7: (a) PD-0184264의 항균 작용을 다른 MEK-억제 화합물 또는 항생제 겐타마이신과 비교하는 첨가 시간 검정 결과.
(b) 겐타마이신, 에리트로마이신에 의한 치료 또는 치료되지 않은 것과 비교된 에스. 아우레우스에서 MEK 억제제 PD0184264에 대한 내성에 대한 시험 결과.
도 8: 박테리아 키나제 PknB(상단)(Rakette et al. 2012)의 도메인 구조 및 포유류 MAP 키나제 p38, JNK 및 직접 MEK 표적 ERK의 활성화 부위를 갖는 PknB의 자동 인산화 부위의 서열 상동성(Miller et al. 2010).
도 9: 상이한 항생제의 최소 억제 농도(MIC)에 대한 억제제 치료의 영향의 결정.
도 10: PD-0184264로 처리될 때 에스. 아우레우스 균주 6850 및 MRSA 균주 USA300의 스트레스 내성.
도 11: PD-0184264에 의한 치료는 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 상이한 혈청 형의 성장을 손상시킨다.
(A) OD600에 의해 측정된 바와 같은 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주 TIGR4(혈청형 4) 및 D39 wt(혈청형 2)의 배양물에 대한 PD-0184264의 영향; (B) CFU/ml로 나타낸 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주 TIGR4(혈청형 4) 및 D39 wt(혈청형 2)의 배양물에 대한 PD-0184264의 영향; (C): CFU/ml로 나타낸 바실러스 서브틸리스의 배양물에 대한 PD-0184264의 영향.
도 12: 표 1: 항생제.
도 13:
PD-0184264에 의한 세포의 치료가 단일 박테리아(에스. 아우레우스) 또는 바이러스(인플루엔자 IV) 감염 및 동시 감염시 병원체-유도 CPE(세포 변성 효과)를 강하게 감소시킨다는 것을 보여주는 사진.
도 14: CI-1040(a) 또는 PD-0184264(b)로 치료시 세포내 박테리아 부하의 변화를 나타내는 그래프.
CI-1040 또는 PD-0184264가 진행 중인 감염 동안 나중에 투여될 때 필적할 만한 결과가 수득되었다(c).
도 15: 세포 생존력(A, B) 및 막 파열(C, D)을 나타내는 그래프.
(A, B)는 증가하는 농도의 PD-0184264의 존재하에 A549 세포 생존력을 보여준다. (C) 및 (D)에서, LDH-검정을 수행하여 억제제 치료로 인한 막 파열을 결정했다.
도 16: MEK 경로에 대한 CI-1040 및 PD-0184264의 억제 효과를 나타내는 무 세포 키나제 검정.
키나제의 활성은 ELISA 검정에 의해 인산화된 표적 단백질 ERK의 양을 결정함으로써 측정된다. 유사한 결과를 나타내는 3개의 독립적인 실험 시리즈가 수행되었다. 하나의 대표적인 실험이 여기에 제시된다.
도 17: 시험관내 검정에서 인플루엔자 바이러스 HlNlpdm09에 대한 PD-0184264의 항바이러스 활성.
(A) A549 세포를 바이러스(MOI= 0.001)로 감염시켜 바이러스 역가 감소를 결정했다. (B) A549 세포를 바이러스 RBI(MOI= 0.001)로 감염시키고 상이한 농도의 PD-0184264(100μM, 50μM, 10μM, 5μM, 1μM, 0.5μM 및 0.1μM)로 처리하여 EC50 값을 결정했다. (C) A549 세포를 상이한 농도의 PD-0184264(100μM, 50μM, 10μM, 5μM, 1μM, 0.5μM 및 0.1μM)로 24시간 동안 처리한 후 4시간 WST-염색하여 CC50 값을 측정했다.
도 18: PD-0184264에 의한 마우스 폐에서 바이러스 역가의 생체내 감소.
HlNlpdm09 바이러스 감염 후 암컷 C57BL/6 마우스를 2.8, 8.4 또는 25mg/kg PD-0184264(왼쪽 패널) 또는 25, 75 또는 150mg/Kg CI-1400(오른쪽 패널)으로 경구 경로로 처리했다. 감염 후 24시간에 동물을 사멸시키고, 표준 방법을 사용하여 바이러스 역가를 결정했다.
도 19: PD-0184264는 CI-1040보다 더 우수한 생체 이용률을 갖는다.
(A) 수컷 NMRI 마우스를 정맥내 경로로 75mg/kg CI-1040(암회색 영역) 또는 75mg/Kg PD-0184264로 처리했다. 투여 후 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간 및 24시간(시험 2일)에 혈액을 수집하고, 혈장을 약물의 존재에 대해 분석했다. (B) 수컷 NMRI 마우스를 경구 위관 영양법을 사용하여 경구로 150mg/kg CI-1040(암회색 영역) 또는 150mg/kg PD-0184264로 처리했다. 투여 후 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간 및 24시간(시험 2일)에 혈액을 수집하고, 혈장을 약물의 존재에 대해 분석했다.
도 1: 인플루엔자 A로 감염된 마우스의 PD-0184264 또는 CI-1040에 의한 치료.
실시예 1의 실험 결과는 바이러스 역가(log10) pfu/ml(왼쪽) 또는 % 바이러스 역가(오른쪽)로 제시된다.
도 2: MRSA 박테리아 성장에 대한 PD-0184264 및 CI-1040의 영향을 보여주는 그래프.
상이한 시점에서, 그래프의 수평 축에 지시된 바와 같이, 무세포 박테리아 배양물의 광학 밀도는 박테리아 성장에 대한 표시로서 측정되었으며, 그래프의 수직 축에 %로 나타냈다(OD600). 데이터는 실시예 2에 기재된 3개의 생물학적 복제물의 평균 값을 나타낸다.
도 3: 상이한 농도의 PD-0184264에 의한 박테리아 MRSA 성장의 억제.
PD-0184264는 에스. 아우레우스 USA300(MRSA)의 밤새 배양물에 상이한 농도(표시된 바와 같이)로 투여되었다. 6시간 후, 광학 밀도를 시험했다. 도면에 도시된 데이터는 실시예 2에 기재된 3개의 생물학적 복제물 중 하나의 실험을 나타낸다.
도 4: 박테리아 성장에 대한 CI-1040 및 PD-0184264의 영향.
(A) 상이한 농도에서 박테리아 성장에 대한 CI-1040의 영향 (B, C) 상이한 농도의 PD-184264에서 에스. 아우레우스 균주 6850(B) 또는 균주 USA300(C)에 대한 PD-0184264의 영향.
도 5: 단일 또는 동시 감염된 세포에 PD-0184264의 투여는 세포를 보호한다.
인간 폐 상피 세포(A549)를 PD-0184264(지시된 농도로) 또는 용매(DMSO)로 전처리하고, 인간 인플루엔자 바이러스 균주 A/푸에르토 리코/8/34(H1N1)로 감염시켰다. PD-0184264의 항바이러스 및 강력한 항균 효과(도 2 내지 4)를 감안할 때, 본 발명자들은 화합물의 이러한 특징이 또한 IAV(인플루엔자 A 바이러스) 및/또는 에스. 아우레우스 감염에 의해 유발된 세포 파괴성 세포 변성 효과(CPE)와 관련하여 거시적으로 관찰될 수 있는지를 분석했다. 세포 단층의 약간의 파괴가 IAV(H1N1)(중간 패널) 또는 에스. 아우레우스 균주 6850(상부 패널)에 의한 단일 감염 후 관찰되었다. 이 CPE는 두 병원체(하부 패널)에 의한 동시 감염시 강하게 증가되었지만, 증가하는 농도의 PD-0184264의 존재하에 억제되었다.
도 6: PD-0184264의 항균 작용과 일반적인 항생제의 비교.
일반적인 항생제의 작용으로 MEK-억제제 PD0184164의 항균 특성을 정렬시키기 위해, 본 발명자들은 박테리아를 밤새 용매, MEK-억제제 U0126 및 PD-0184264 또는 상이한 농도의 항생제 겐타마이신으로 처리했다. 용매 처리된 박테리아와 비교하여, 1세대 MEK-억제제 U0126에 의한 배양은 박테리아 역가의 최소한의 감소만을 초래한 반면, PD-0184264에 의한 치료는 박테리아 부하의 매우 강력한 감소를 초래했다. 이것은 두 박테리아 균주에 대해 마찬가지였다.
도 7: (a) PD-0184264의 항균 작용을 다른 MEK-억제 화합물 또는 항생제 겐타마이신과 비교하는 첨가 시간 검정 결과.
(b) 겐타마이신, 에리트로마이신에 의한 치료 또는 치료되지 않은 것과 비교된 에스. 아우레우스에서 MEK 억제제 PD0184264에 대한 내성에 대한 시험 결과.
도 8: 박테리아 키나제 PknB(상단)(Rakette et al. 2012)의 도메인 구조 및 포유류 MAP 키나제 p38, JNK 및 직접 MEK 표적 ERK의 활성화 부위를 갖는 PknB의 자동 인산화 부위의 서열 상동성(Miller et al. 2010).
도 9: 상이한 항생제의 최소 억제 농도(MIC)에 대한 억제제 치료의 영향의 결정.
도 10: PD-0184264로 처리될 때 에스. 아우레우스 균주 6850 및 MRSA 균주 USA300의 스트레스 내성.
도 11: PD-0184264에 의한 치료는 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 상이한 혈청 형의 성장을 손상시킨다.
(A) OD600에 의해 측정된 바와 같은 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주 TIGR4(혈청형 4) 및 D39 wt(혈청형 2)의 배양물에 대한 PD-0184264의 영향; (B) CFU/ml로 나타낸 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주 TIGR4(혈청형 4) 및 D39 wt(혈청형 2)의 배양물에 대한 PD-0184264의 영향; (C): CFU/ml로 나타낸 바실러스 서브틸리스의 배양물에 대한 PD-0184264의 영향.
도 12: 표 1: 항생제.
도 13:
PD-0184264에 의한 세포의 치료가 단일 박테리아(에스. 아우레우스) 또는 바이러스(인플루엔자 IV) 감염 및 동시 감염시 병원체-유도 CPE(세포 변성 효과)를 강하게 감소시킨다는 것을 보여주는 사진.
도 14: CI-1040(a) 또는 PD-0184264(b)로 치료시 세포내 박테리아 부하의 변화를 나타내는 그래프.
CI-1040 또는 PD-0184264가 진행 중인 감염 동안 나중에 투여될 때 필적할 만한 결과가 수득되었다(c).
도 15: 세포 생존력(A, B) 및 막 파열(C, D)을 나타내는 그래프.
(A, B)는 증가하는 농도의 PD-0184264의 존재하에 A549 세포 생존력을 보여준다. (C) 및 (D)에서, LDH-검정을 수행하여 억제제 치료로 인한 막 파열을 결정했다.
도 16: MEK 경로에 대한 CI-1040 및 PD-0184264의 억제 효과를 나타내는 무 세포 키나제 검정.
키나제의 활성은 ELISA 검정에 의해 인산화된 표적 단백질 ERK의 양을 결정함으로써 측정된다. 유사한 결과를 나타내는 3개의 독립적인 실험 시리즈가 수행되었다. 하나의 대표적인 실험이 여기에 제시된다.
도 17: 시험관내 검정에서 인플루엔자 바이러스 HlNlpdm09에 대한 PD-0184264의 항바이러스 활성.
(A) A549 세포를 바이러스(MOI= 0.001)로 감염시켜 바이러스 역가 감소를 결정했다. (B) A549 세포를 바이러스 RBI(MOI= 0.001)로 감염시키고 상이한 농도의 PD-0184264(100μM, 50μM, 10μM, 5μM, 1μM, 0.5μM 및 0.1μM)로 처리하여 EC50 값을 결정했다. (C) A549 세포를 상이한 농도의 PD-0184264(100μM, 50μM, 10μM, 5μM, 1μM, 0.5μM 및 0.1μM)로 24시간 동안 처리한 후 4시간 WST-염색하여 CC50 값을 측정했다.
도 18: PD-0184264에 의한 마우스 폐에서 바이러스 역가의 생체내 감소.
HlNlpdm09 바이러스 감염 후 암컷 C57BL/6 마우스를 2.8, 8.4 또는 25mg/kg PD-0184264(왼쪽 패널) 또는 25, 75 또는 150mg/Kg CI-1400(오른쪽 패널)으로 경구 경로로 처리했다. 감염 후 24시간에 동물을 사멸시키고, 표준 방법을 사용하여 바이러스 역가를 결정했다.
도 19: PD-0184264는 CI-1040보다 더 우수한 생체 이용률을 갖는다.
(A) 수컷 NMRI 마우스를 정맥내 경로로 75mg/kg CI-1040(암회색 영역) 또는 75mg/Kg PD-0184264로 처리했다. 투여 후 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간 및 24시간(시험 2일)에 혈액을 수집하고, 혈장을 약물의 존재에 대해 분석했다. (B) 수컷 NMRI 마우스를 경구 위관 영양법을 사용하여 경구로 150mg/kg CI-1040(암회색 영역) 또는 150mg/kg PD-0184264로 처리했다. 투여 후 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간 및 24시간(시험 2일)에 혈액을 수집하고, 혈장을 약물의 존재에 대해 분석했다.
다음의 설명은 본 발명을 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 정보가 종래 기술이거나 현재 청구된 발명과 관련이 있거나, 구체적으로 또는 암시적으로 참조된 임의의 공보가 종래 기술임을 인정하는 것은 아니다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명은 바이러스성 질환, 박테리아 감염 또는 박테리아 감염 및 바이러스 감염을 포함하는 동시 감염의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 PD-0184264에 관한 것이다. 실시예에 제시된 바와 같이, PD-0184264는 박테리아 키나제 PknB에 작용하는 것으로 보이며, 따라서 적어도 부분적으로 이의 정균 효과를 발휘할 수 있다.
또한, 첨부된 실시예에서 입증된 바와 같이, PD-0184264는 바이러스 및 박테리아 감염 시나리오뿐만 아니라 박테리아 및 바이러스 동시 감염 시나리오에서도 효과를 나타낸다. 이 효과는 놀랍게도 박테리아 및 바이러스 감염의 치료를 위해 종래 기술에 이미 공지된 MEK 억제제인 CI-1040보다 더 강력하다. 실시예 9에 나타낸 바와 같이 MEK 키나제에 대한 CI-1040 및 PD-0184264의 억제 효과를 비교할 때, MEK 억제제가 상기 효과를 달성하기 위해 종래 기술에서 사용되었기 때문에 실제로는 그 반대가 예상된다.
시험관내 검정에서 PD-0184264 및 CI-1040의 항바이러스 효과를 비교할 때도 마찬가지이다. 여기서, CI-1040은 실시예 10으로부터 알 수 있는 바와 같이 PD-0184264보다 더 효과적이다. 구체적으로, 동일한 억제 효과를 달성하기 위해 시험관내 검정에서 10배 더 높은 농도의 PD-0184264가 필요하다. 놀랍게도, 약한 시험관내 억제에도 불구하고, PD-0184264는 실시예 11로부터 알 수 있는 바와 같이 생체내 CI-1040보다 우수하다는 것이 발견되었다. 도 18에 도시된 바와 같이, 이미 2.8mg/kg PD-0184264는 바이러스 역가의 감소를 나타내는 반면, 25mg/kg PD-0184264는 폐에서 바이러스 역가의 90% 이상 감소를 나타낸다. 대조적으로, CI-1040은 150μM에서만 유사한 감소를 나타낸다. 또한, 실시예 1은 PD-0184264에 의한 폐의 바이러스 역가 감소를 보여준다. 실시예 1에서, 마우스를 인플루엔자 바이러스로 감염시키고, 각각 150mg/kg, 75mg/kg 또는 25mg/kg Cl-1040 또는 PD-0184264로 처리했다. 도 1에 도시된 바와 같이, 이미 25mg/kg PD-0184264는 150mg/kg CI-1040과 동일한 효과를 갖는다. 따라서, 본 발명자들의 놀라움에 많이, 이전의 시험관내 데이터가 PD-0184264로 작업을 계속할 임의의 인센티브를 제공하지 않았지만, PD-0184264는 생체내에서 강력한 항바이러스 효과를 나타낸다. 이 놀라운 효과는 실시예 12에 제시된 CI-1040과 비교하여 PD-0184264의 더 높은 생체 이용률에 기초할 수 있다.
실시예 2, 4 및 6-8은 또한 CI-1040 및 다른 MEK 억제제와 비교하여 PD-0184264의 강력한 항균 효과를 추가로 나타낸다. 실시예 2에서, 박테리아 성장에 대한 PD-0184264의 효과가 분석된다. 도 2는 PD-0184264가 박테리아의 성장을 억제하는 반면 CI-1040은 박테리아의 성장에 영향을 미치지 않음을 보여준다. 도 3에서, 박테리아 성장은 PD-0184264에 의해 농도 의존 방식으로 억제되어 50μM PD-0184264에서 출발하여 거의 완전한 성장 억제를 나타내는 것으로 나타난다. 유사하게, 도 4는 또한 박테리아 성장이 농도 의존 방식으로 PD-0184264에 의해 억제 된다 - 이미 10μM PD-0184264는 현저한 성장 감소를 나타내는 반면- CI-1040은 박테리아 성장에 영향을 미치지 않는다는 것을 도시한다. 실시예 4에서 PD-0184264의 항균 효과는 MEK 억제제 U0126 또는 항생제 겐타마이신과 비교된다. 도 6은 PD-184264가 겐타마이신과 유사한 항생제 효과를 갖는 반면, 종래 기술로부터 공지된 MEK 억제제 U0126은 박테리아 성장에 영향을 미치지 않음을 도시한다. 박테리아 성장 과정이 모니터링되는 도 7a에 대해서도 마찬가지이다. 도 7b에서, PD-0184264는 PD-0184264에 대한 내성을 유도하지 않는 반면, 박테리아는 겐타마이신 및 에리트로마이신에 대한 내성을 쉽게 발달시킨다는 것이 추가로 도시되어 있다. 따라서, PD-0184264는 박테리아 내성을 유도하지 않는다. 실시예 6에서, 항생제에 대한 박테리아의 민감성에 대한 PD-0184264의 영향을 분석했다. 도 9와 표 2에 도시된 바와 같이, PD-0184264로 치료하면 실제로 다른 항생제에 대한 박테리아의 민감성을 증가시키고, 이는 페니실린과 겐타마이신의 경우에 가장 현저했다. 추가로, 도 10은 PD-0184264가 박테리아의 스트레스 내성을 감소시킴을 도시한다. 실시예 7은 PD-0184264의 효과가 에스. 아우레우스에 제한되지 않고 스트렙토코쿠스 뉴모니애(도 11a 및 b 참조) 및 바실러스 서브틸리스(도 11c 참조)와 같은 다른 박테리아에도 영향을 미친다는 증거를 제공한다.
실시예 3 및 8은 박테리아 및 바이러스 동시 감염의 맥락 내에서 PD-0184264의 효능을 강조한다. 실시예 3은 바이러스 및/또는 박테리아 감염에 의해 유발된 세포 파괴성 세포 변성 효과(CPE)와 관련하여 PD-0184264의 효능이 또한 거시적으로 관찰될 수 있는지를 분석했다. 도 5는 PD-0184264가 15μM PD-0184264에서 이미 효과를 나타내는 농도-의존 방식으로 특히 박테리아 및 바이러스 동시 감염에 의해 유발된 세포 변성 효과를 감소시킨다는 것을 도시한다. 동일한 것이 또한 실시예 8에서 분석되었고, 이는 박테리아 및 바이러스 동시 감염 시나리오에서 PD-0184264의 양성 효과를 다시 도 13에 도시한다. 실시예 8은 동시 감염 시나리오에서 세포내 박테리아 역가에 대한 PD-0184264의 효과를 추가로 분석했다. 도 14는 PD-0184264가 세포내 박테리아 역가를 감소시키는 반면 CI-1040은 효과가 없음을 도시한다. 또한, 실시예 8 및 도 15는 PD-0184264가 세포 독성 효과를 발휘하지 않음을 나타낸다.
PD-0184264는 본원에 기재된 의학적 상태의 치료 및/또는 예방 방법에 사용될 수 있다. 이와 같이, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 바람직하게는 의약 형태의 PD-0184264를 박테리아 감염 및 바이러스성 질환을 포함하는 동시 감염으로 고통받는 대상체에게 이러한 감염을 동반하는 증상을 개선시키거나 향상시킬 목적으로 투여함을 포함한다. 유사하게, PD-0184264를 바람직하게는 의약 형태로 박테리아 감염으로 고통받는 대상체에게 또는 이러한 감염을 동반하는 증상을 개선시키거나 향상시킬 목적으로의 투여가 포함된다. 추가로, PD-0184264를 바람직하게는 의약의 형태로 바이러스 감염으로 고통받고 있는 대상체에게 또는 이러한 감염을 동반하는 증상을 개선시키거나 향상시킬 목적으로의 투여가 포함된다. 박테리아 감염 및 바이러스성 질환을 포함하는 동시 감염, 바이러스성 질환 및 박테리아 감염은 PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염에 의해 치료 또는 예방되는 의학적 상태이다.
또한, 본원에 사용된 용어 "예방"은 본원에 기재된 의학적 상태를 예방하는 것이 목적인 임의의 의학적 또는 공중 건강 절차를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "예방하다", "예방" 및 "예방하는"은 소정의 상태, 즉 바이러스 감염 및 박테리아 감염을 포함하는 동시 감염, 본원에 기재된 바와 같은 박테리아 감염 단독 또는 바이러스 감염 단독을 획득 또는 발생시킬 위험의 감소를 지칭한다. "예방"은 또한 대상체에서 인플루엔자 바이러스 감염 및 박테리아 감염을 포함하는 동시 감염, 박테리아 감염 단독 또는 바이러스 감염 단독의 재발의 감소 또는 억제를 의미한다.
본 발명의 PD-0184264는 실시예 3 및 8에 나타낸 바와 같은 동시 감염을 치료하는데 효과적이다. 본원에 사용된 "동시 감염"은 바이러스성 질환, 바람직하게는 인플루엔자 바이러스 감염 및 박테리아 감염을 포함한다. 이러한 동시 감염은 박테리아 및 인플루엔자 바이러스에 의한 숙주, 예를 들어, 대상체 및/또는 단일 세포의 동시 감염에 의해 일어날 수 있다. 그것은 또한, 숙주, 예를 들어, 대상체 및/또는 세포가 하나 이상의 바이러스 입자 및 하나 이상의 박테리아로 동시에 감염된다는 것일 수 있다. 그러나, 이러한 동시 감염은 순차적으로 발생할 수도 있다. 이러한 경우에, 대상체 및/또는 세포는 먼저 하나 이상의 바이러스 입자로 감염되고, 나중에 동일한 대상체 및/또는 세포는 하나 이상의 박테리아로 감염되거나 그 반대이다. 두 감염 사이의 시간은 최대 14일, 13일, 12일, 11일, 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일, 1일, 12시간, 6시간, 3시간, 1.5시간 또는 최소 30분의 시간일 수 있다.
이러한 상황은 또한 중복감염일 수 있으며, 여기서 제2 감염은 특히 제1 감염에 대해 사용된 치료에 내성인 외인성 또는 내인성 기원의 상이한 미생물 제제에 의해 이전 감염에 중첩된다.
동시 감염의 인플루엔자 바이러스 감염 내에서 인플루엔자 바이러스 감염은 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스에 의해 매개될 수 있으며, 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스는 H1N1, H2N2, H3N2, H5N6, H5N8, H6N1, H7N2, H7N7, H7N9, H9N2, H10N7, N10N8 또는 H5N1이다. 하나의 구현예에서, 인플루엔자 A 바이러스는 H1N1이다. 다른 구현예에서, 인플루엔자 A 바이러스는 H3N2, H5N1 및 H7N9이다. 추가의 구현예에서, 인플루엔자 A 바이러스는 H3N2, H5N1, H1N1, H5N6, H7N2 및 H7N9이다.
본 발명은 또한 상기 기재된 동시 감염의 환경에서 일어날 수 있거나 숙주, 예를 들어, 대상체 및/또는 세포에 존재하는 유일한 감염으로서 발생할 수 있는 "박테리아 감염"에 관한 것이다. 박테리아 감염은 임의의 박테리아에 의해 매개될 수 있으며; 바람직하게는 그것은 스타필로코카시에, 스트렙토코카시에, 레지오넬라시에, 슈도모나다시에, 바실라시에, 클라미디아시에, 마이코플라스마타시에, 엔테로박테리아시에, 슈도모나달레스 및/또는 파스테우렐라시에로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 박테리아에 의해 매개된다.
박테리아 감염은 스타필로코쿠스, 바람직하게는 스타필로코쿠스 아우레우스, 메티실린-민감성 및 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 판톤-발렌틴 류코시딘(PVL)-발현 스타필로코쿠스 아우레우스 및/또는 스트렙토코카시에, 스트렙토코쿠스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 또는 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 레지오넬라(Legionella), 바람직하게는 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 슈도모나스(Pseudomonas), 바람직하게는 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 바실러스(Bacillus), 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 클라미도필라(Chlamydophila), 바람직하게는 클라미도필라 뉴모니아(Chlamydophila pneumonia), 마이코플라스마(Mycoplasma), 바람직하게는 마이코플라스마 뉴모니아(Mycoplasma pneumonia), 클렙시엘라(Klebsiella), 바람직하게는 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia), 모락셀라(Moraxella), 바람직하게는 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis) 및/또는 헤모필루스(Haemophilus), 바람직하게는 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 박테리아에 의해 매개될 수 있다. 바람직하게는, 박테리아는 스타필로코쿠스 아우레우스, 스트렙토코쿠스 뉴모니아 또는 헤모필루스 인플루엔자로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 박테리아는 스타필로코쿠스 아우레우스이다.
본 발명이 또한 관련되는 "바이러스성 질환"또는 "바이러스 감염"은 상기 기재된 동시 감염의 환경에서 일어날 수 있거나 숙주, 예를 들어, 대상체 및/또는 세포에 존재하는 유일한 감염으로서 발생할 수 있다. 바이러스성 질환 또는 바이러스 감염은 임의의 바이러스에 의해 매개될 수 있으며; 바람직하게는 인플루엔자 바이러스에 의해 매개된다. 보다 바람직하게는, 인플루엔자 바이러스 감염은 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B 바이러스에 의해 매개되며, 여기서 인플루엔자 A 바이러스가 바람직하다. 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1, H2N2, H3N2, H5N6, H5N8, H6N1, H7N2, H7N7, H7N9, H9N2, H10N7, N10N8 및/또는 H5N1이 특히 바람직하다.
대안적인 구현예에서, PD-0184264는 하나 이상의 MEK 억제제와 조합하여 투여된다. MEK 억제제는, 예를 들어, U0126, PLX-4032, AZD6244, AZD8330, AS-703026, GSK-1120212, RDEA-119, RO-5126766, RO-4987655, CI-1040, PD-0325901, GDC-0973, TAK-733, PD98059, ARRY-438162, ARRY-162, ARRY-300, PF-3644022 및 PD184352를 포함한다. 추가의 MEK 억제제는 PD-0184264와 동시에, 이전에 또는 이후에 투여될 수 있다.
바람직하게는, PD-0184264는 본 발명의 동시 감염의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 것이며, 여기서 PD-0184264는 인플루엔자 바이러스 또는 박테리아를 표적화하는 하나 이상의 억제제와 조합된다. PD-0184264는 인플루엔자 바이러스를 표적화하는 하나 이상의 억제제와 동시에, 이전에 또는 이후에 투여될 수 있다.
일반적으로, 인플루엔자 바이러스를 표적화하는 억제제는 인플루엔자 요법에 효과적인 임의의 억제제 또는 의약이다. 다른 물질이 인플루엔자 바이러스 감염을 감소시키는 데 효과적인 것으로 공지되어 있다. 이들 중에는, 예를 들어, 바이러스성 뉴라미니다제에 대한 억제제, 바이러스 이온 채널 단백질(M2)을 표적화하는 화합물 및 바이러스성 폴리머라제 복합체의 성분: PB1, PB2, PA 또는 NP를 방해함으로써 바이러스성 폴리머라제 또는 엔도뉴클레아제 활성을 표적화하는 화합물이 있다. 본 발명에 의해 억제제의 약제학적으로 허용되는 염도 또한 예상된다. 그러나, 바람직한 억제제는 본원에 기재된 바와 같이, MEK 억제제, 특히 바람직한 PD-0184264이다.
"MEK 억제제"는 MEK(미토겐-활성화 단백질 키나제 키나제)를 억제함으로써 세포 또는 대상체에서 유사 분열 촉진 신호 전달 캐스케이드 Raf/MEK/ERK를 억제한다. 이 신호 전달 캐스케이드는 바이러스 복제를 촉진하기 위해 많은 바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스에 의해 장악된다. 따라서, 병목 현상(bottleneck) MEK에서 Raf/MEK/ERK 경로의 특정 차단은 바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스의 성장을 손상시킨다. 또한, MEK 억제제는 인간에서 낮은 독성을 나타내고, 부작용을 거의 나타내지 않는다. 바이러스 내성을 유도하는 경향도 또한 없다(Ludwig, 2009). 특히 바람직한 억제제는 PD-0184264이다.
"뉴라미니다제 억제제"는 인플루엔자 바이러스에서 표적화된 항바이러스성 약물이고, 이는 바이러스성 뉴라미니다제 단백질의 기능을 차단함으로써 작용하여 감염된 숙주 세포로부터 바이러스가 방출되는 것을 방지하는데, 이는 새롭게 생성된 바이러스가 그들이 복제되는 세포로부터 싹트지 못하기 때문이다. 뉴라미니다제 억제제의 약제학적으로 허용되는 염도 또한 포함된다. 바람직한 뉴라미니다제 억제제는 오셀타미비르, 자나미비르, 페라미비르, 라니나미비르 또는 임의의 이들 물질의 약제학적으로 허용되는 염, 예를 들어, 오셀타미비르 포스페이트, 오셀타미비르 카복실레이트 등이다. 가장 바람직한 뉴라미니다제 억제제는 오셀타미비르 포스페이트, 자나미비르, 오셀타미비르 또는 페라미비르이다.
바이러스 이온 채널 단백질(M2)을 표적화하는 화합물은, 예를 들어, 아만타딘 및/또는 리만타딘인 반면, 바이러스성 폴리머라제 복합체의 성분, PB1, PB2, PA 또는 NP를 방해함으로써 폴리머라제 또는 엔도뉴클레아제 활성을 표적화하는 화합물은, 예를 들어, NP 차단제 뉴클레오진 또는 폴리머라제 억제제 T-705(파비피라비르)이다.
또한, PD-0184264는 박테리아를 표적화하는 하나 이상의 억제제와 조합될 수 있다. 실시예 6은 PD-0184264가 항생제에 대한 박테리아의 민감성을 증가시킨다는 것을 보여준다. 박테리아를 표적화하는 억제제는 박테리아 감염을 감소시키는 데 효과적인 임의의 억제제일 수 있다. 본 발명에서, PD-0184264는 박테리아를 표적화하는 억제제로서 강력하게 바람직하지만, 당업자에게 공지된 박테리아를 표적화하는 다른 억제제는 항생제이다. 바람직한 항생제는 표 1에서 수득될 수 있다(도 12). 따라서, 하나의 구현예에서, 항생제는 표 1에 열거된 바와 같은 항생제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다(도 12). 추가의 구현예에서, 항생제는 표 1에 열거된 바와 같은 항생제 부류로 이루어진 그룹으로부터 선택된다(도 12). 다른 구현예에서, 항생제는 표 1에 나열된 바와 같은 항생제의 일반적인 명칭으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다(도 12). 보다 바람직한 것은 겐타마이신, 리팜피신, 리소스타핀, 에리트로마이신, 레보플록사신, 반코마이신, 테이코플라닌, 페니실린 및 옥사실린으로부터 선택된 항생제이다.
억제제, 특히 MEK 억제제, 또는 본 발명의 억제제의 조합에 의해 처리될 수있는 "대상체"는 바람직하게는 척추 동물이다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "대상체"는 본원에 기재된 바와 같은 동시 감염 또는 박테리아 또는 바이러스 감염 단독의 치료가 필요한 개체를 포함한다. 바람직하게는, 대상체는 동시 감염 또는 박테리아 또는 바이러스 감염 단독으로 고통 받고 있거나 이의 위험에 처한 환자이다. 바람직하게는, 환자는 척추 동물, 더욱 바람직하게는 포유동물이다. 포유동물은 농장 동물, 스포츠 동물, 애완 동물, 영장류, 마우스 및 랫트를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 포유동물은 인간, 말, 개, 고양이, 소, 돼지, 마우스, 랫트 등이고, 특히 바람직하게는 인간이다. 일부 구현예에서, 대상체는 임의로 1세 이상, 14세 미만, 50세 내지 65세, 18세 또는 50세 사이, 또는 65세 이상의 인간 대상체이다. 다른 구현예에서, 대상체는 50세 이상인 대상체, 만성 치료 시설에 거주하는 대상체, 폐 또는 심혈관 시스템의 만성 장애를 갖는 대상체, 만성 대사 질환, 신장 기능 장애, 혈색소병증 또는 면역 억제로 인해 전년도에 정기적인 의학적 후속 조치 또는 입원이 필요한 대상체, 14세 미만의 대상체, 장기간 아스피린 요법을 받고 있는 6개월 내지 18세의 대상체, 및 인플루엔자 계절 동안 임신 제2 또는 제3 삼분기에 있을 여성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 인간 대상체이다. 본 발명의 방법에서, PD-0184264는 경구, 정맥내, 흉막내, 근육내, 국소 또는 흡입을 통해 투여될 수 있다. 바람직하게는, PD-0184264는 흡입, 국소 또는 경구로 투여된다.
본 발명은 또한 상이한 조성물, 바람직하게는 약제학적 조성물을 고려한다. 본 발명은 박테리아 감염 및 바이러스성 질환을 포함하는 동시 감염의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 PD-0184264를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 유사하게 박테리아 감염 및/또는 바이러스성 질환의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 PD-0184264를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 박테리아 감염 및 바이러스 감염, 특히 인플루엔자 바이러스 감염을 포함하는 동시 감염의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 PD-0184264 및 바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스 및/또는 박테리아를 표적화하는 하나 이상의 억제제를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 박테리아 감염 또는 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 PD-0184264 및 박테리아를 표적화하는 하나 이상의 억제제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
상기 언급된 바와 같이, PD-0184264 및 결국 박테리아를 표적화하는 하나 이상의 억제제 및/또는 바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스를 표적화하는 하나 이상의 억제제를 포함하는 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다. 약제학적 조성물의 바람직한 구현예는 PD-0184264 및 인플루엔자 바이러스를 표적화하는 억제제, 특히 뉴라미니다제 억제제를 포함한다. 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 PD-0184264 및 추가의 MEK 억제제를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 조성물은 담체, 바람직하게는 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 조성물은 경구 투여 가능한 현탁액 또는 정제, 코 스프레이, 흡입 장치용 제제, 멸균 주사 가능한 제제(정맥내, 흉막내, 근육내), 예를 들어, 멸균 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액 또는 좌제의 형태일 수 있다.
본 발명의 용도용이고, PD-0184264 및 임의로 인플루엔자 바이러스를 표적화하는 하나 이상의 억제제 및/또는 박테리아를 표적화하는 하나 이상의 억제제를 포함하는 약제학적 조성물은 포유동물 또는 조류인 환자에게 투여된다. 적합한 포유동물의 예는 마우스, 랫트, 소, 염소, 양, 돼지, 개, 고양이, 말, 기니피그, 개, 햄스터, 밍크, 물개, 고래, 낙타, 침팬지, 붉은털 원숭이 및 인간을 포함하지만, 이에 제한되지 않고, 인간이 바람직하다. 적합한 조류의 예는 몇가지 예로 들면 칠면조, 닭, 거위, 오리, 상오리, 청둥오리, 찌르레기, 고방오리, 갈매기, 백조, 뿔닭 또는 물새를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 인간 환자는 본 발명의 특정 구현예이다.
억제제 또는 억제제들은 바람직하게는 치료적 유효량으로 투여된다. PD-0184264 또는 각각의 활성 화합물/억제제에 대한 "치료적 유효량"은 당업자에게 명백할 것과 같이, 사용된 화합물의 활성, 환자의 신체에서 활성 화합물의 안정성, 완화될 상태의 중증도, 치료될 환자의 총 중량, 투여 경로, 신체에 의한 화합물의 흡수 용이성, 분포 및 배설, 치료될 환자의 연령 및 민감성, 부작용 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 요인에 따라 달라질 수 있다. 투여량은 다양한 인자가 경시적으로 변함에 따라 조정될 수 있다.
본원에 기재된 억제제, 방법 및 용도는 인간 요법 및 수의학 적용 모두에 적용 가능하다. 본원에 기재된 화합물, 특히, PD-0184264 및 임의로, 인플루엔자 바이러스를 표적화하는 하나 이상의 억제제 및/또는 목적하는 치료 활성을 갖는 박테리아를 표적화하는 하나 이상의 억제제는 본원에 기재된 바와 같이 대상체에게 생리학적으로 허용되는 담체로 투여될 수 있다. 도입 방식에 따라, 화합물은 하기 논의되는 바와 같은 다양한 방식으로 제형화될 수 있다. 제형 중 치료적 활성 화합물의 농도는 약 0.1 내지 100wt.%로 다양할 수 있다. 제제는 단독으로 또는 다른 치료와 함께 투여될 수 있다. 실시예 1은 25 및 75mg/kg의 PD-0184264가 경구 투여에 의해 생체내에서 효과적임을 보여준다. 따라서, PD-0184264는 10 내지 100mg/kg PD-0184264 범위, 바람직하게는 25 내지 75mg/kg PD-0184264 범위의 용량으로 투여될 수 있다.
본 발명의 방법에서 약제학적 화합물은 임의의 적합한 단위 투여 형태로 투여될 수 있다. 적합한 경구 제형은 정제, 캡슐, 현탁액, 시럽, 츄잉 검, 웨이퍼, 엘릭서 등의 형태일 수 있다. 결합제, 부형제, 윤활제 및 감미제 또는 향미제와 같은 약제학적으로 허용되는 담체가 경구 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 목적하는 경우, 특수 형태의 맛, 색 및 형상을 변형시키기 위한 통상적인 제제가 또한 포함될 수 있다.
주사 가능한 제형의 경우, 약제학적 조성물은 적합한 바이알 또는 튜브에서 적합한 부형제와 혼합하여 동결 건조된 분말로 존재할 수 있다. 클리닉에서 사용하기 전에, 약물은 동결 건조된 분말을 적합한 용매 시스템에 용해시켜 정맥내 또는 근육내 주사에 적합한 조성물을 형성함으로써 재구성될 수 있다.
PD-0184264와 항바이러스성 제제, 예를 들어, 뉴라미니다제 억제제, 예를 들어, 오셀타미비르와의 조합은 상승 효과를 초래한다. 이러한 상승 효과는, 예를 들어, 바이러스 역가 감소 또는 치료 창의 연장을 초래하는 증가된 항바이러스 효과일 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 치료적 유효량의 PD-0184264 및 오셀타미비르, 오셀타미비르 포스페이트, 라니나미비르, 자나미비르 및 페라미비르의 그룹으로부터 선택된 뉴라미니다제 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
하나의 구현예에서, 조성물은 상기 기재된 바와 같은 뉴라미니다제 억제제의 치료적 유효량(예: 0.1mg 내지 2000mg, 0.1mg 내지 1000mg, 0.1mg 내지 500mg, 0.1mg 내지 500mg, 0.1mg 내지 200mg, 30mg 내지 300mg, 0.1mg 내지 75mg, 0.1mg 내지 30mg)을 갖는 경구 투여 가능한 형태(예: 정제 또는 캡슐 또는 시럽 등)일 수 있다.
추가의 구현예에서, PD-0184264는 본 발명의 동시 감염의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 것이며, 여기서 PD-0184264는 시험관내 시스템과 접촉시 바이러스 및 박테리아 감염 모두를 감소시키고, 이때 상기 시험 시스템은 접촉 전 시험관내 시험 시스템과 비교될 때 a) 인플루엔자 바이러스 및 b) 박테리아로 감염된 배양된 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, PD-0184264는 본 발명의 박테리아 감염의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 것이며, 여기서 PD-0184264는 시험관내 시험 시스템과 접촉시 박테리아 감염을 감소시키고, 이때 상기 시험 시스템은 접촉 전 시험관내 시험 시스템과 비교될 때 박테리아로 감염된 배양된 세포를 포함한다.
이와 같이, 본 발명은 또한 시험관내 시험 시스템에 관한 것이고, 여기서 상기 시험 시스템은 a) 인플루엔자 바이러스 및 b) 박테리아로 감염된 배양된 세포를 포함한다. 이 라인을 따라, 본 발명은 또한 시험관내 시험 시스템을 제공하며, 여기서 상기 시험관내 시험 시스템은 박테리아로 감염된 배양된 세포를 포함한다.
시험관내 시험 시스템이 바이러스 및 박테리아 감염을 포함하는 경우, 또한 이러한 감염은 순차적으로 또는 동시에 발생할 수 있다.
"배양된 세포" 또는 "배양된 세포들"은 자연 환경, 예를 들어, 식물 또는 동물 내에 존재하지 않는 세포이다. 오히려 배양된 세포는 그들의 자연 환경으로부터 단리된 세포 또는 세포주를 포함하는 1차 세포 배양물일 수 있다. 바람직하게는 배양된 세포는 인간 폐 상피 세포이다. 또한, 배양된 세포는 0.5ml, 1ml, 1.5ml, 2ml, 2.5ml, 3ml, 3.5ml, 4ml 배지, 예를 들어, DMEM에 약 lxlO5, 2xlO5, 3xlO5, 4xlO5, 5xlO5, 6xlO5, 7xlO5, 8xlO5, 9xlO5, 10xlO5, 11xlO5, 가장 바람직하게는 8xlO5 세포의 밀도로 시딩된다. 2ml DMEM 중 8xlO5의 밀도가 가장 바람직하다.
이러한 배양된 세포는 바이러스 및 박테리아로 감염되거나 다른 구현예에서 박테리아 단독으로 감염된다. 이미 상기 기재된 바와 같이, 동시 감염은 순차적 또는 동시 방식으로 일어날 수 있다. 예를 들어, 배양된 세포는 먼저 인플루엔자 바이러스로 감염되고, 30분 후에 박테리아/박테리아로 감염될 수 있다. 세포외 박테리아를 제거하기 위해 3시간 후에 항생제를 배양물에 추가로 첨가할 수도 있다. 이러한 시나리오에서 항생제는 다시 세척된다. 다른 구현예에서, 세포는 박테리아로만 감염된다.
본원에 사용된 용어 "접촉하는"은 PD-0184264에 공간적으로 근접한 인플루엔자 바이러스 및 박테리아를 포함하는 세포를 가져오는 것을 지칭한다. 이는, 예를 들어, 배양된 세포가 주사기를 통해 위치되는 배지에 억제제가 적용됨을 의미할 수 있다.
하나의 구현예에서, 바이러스 감염의 감소는 플라크 형성 단위(PFU)/ml의 감소이고, 박테리아 감염의 감소는 콜로니 형성 단위(CFU)/ml의 감소이다. "플라크 형성 단위"는 단위 용적당 플라크를 형성할 수 있는 입자, 예를 들어, 바이러스 입자의 수의 측정치이다. 이는 입자의 절대량을 측정하는 것이 아니라 기능적 측정이고, 결함이 있거나 표적 세포를 감염시키지 않는 바이러스 입자는 플라크를 생성하지 않고, 따라서 계수되지 않는다. 예를 들어, 1,000 PFU/μl 농도의 인플루엔자 바이러스의 용액은 1μl의 용액이 세포 단층에 1000개의 감염성 플라크를 생성하기에 충분한 바이러스 입자를 보유하고 있음을 나타낸다. 본 발명의 경우, 억제제로 처리된 세포 배양물은 PD-0184264로 치료하기 전의 배양물과 비교될 때, 치료 후 배양물 중 플라크 형성 단위의 감소된 수를 나타낸다.
가능한 "플라크 형성 단위(PFU)/ml의 감소"는 다음과 같은 방식으로 분석된다. 먼저 인플루엔자 바이러스 및 박테리아로 동시 감염된 배양된 세포는, 예를 들어, 페트리 접시에서 일부 세포를 흡인시키고, 형성될 박테리아 플라크를 계수하기 위해 그들을 플레이팅함으로써 플라크 형성 단위(PFU)/ml를 생성하는 능력에 대해 분석된다. 이어서, 이 결과는 억제제가 적용된 후 동일한 배양물의 세포에 의해 생성된 플라크 형성 단위(PFU)/ml의 수와 비교된다. 플라크 형성 단위(PFU)/ml의 수가 억제제 적용 전 생성된 수와 비교하여 억제제로 치료한 후 감소되면, 플라크 형성 단위가 감소된다.
"콜로니 형성 단위(CFU)/ml"는 샘플에서 생존 가능한 박테리아의 수를 추정한다. 다른 방법이 존재한다. 예를 들어, 콜로니 형성 단위를 생성하기 위해, 샘플(예: 작은 용적의 배양된 세포)이 영양소 한천 플레이트의 표면에 걸쳐 확산되고, 계수하기 위해 배양 전에 건조되도록 한다. 생존 가능한 박테리아는 통제된 조건하에 이분법을 통해 증식하는 능력으로서 정의된다. 세포 배양물에서 콜로니의 시각적인 출현은 상당한 성장을 필요로 한다- 콜로니를 계산할 때 콜로니가 하나의 세포 또는 1,000개의 세포에서 발생했는지는 확실하지 않다. 따라서, 결과는 이 불확실성(세포/ml 또는 세포/g 대신)을 반영하기 위해 액체의 경우 CFU/ml(ml당 콜로니 형성 단위) 및 고체의 경우 CFU/g(g당 콜로니 형성 단위)로서 보고된다.
"콜로니 형성 단위(CFU)/ml"는 다음과 같은 방식으로 분석될 수 있다. 먼저 인플루엔자 바이러스 및 박테리아 또는 박테리아 단독으로 동시 감염된 배양된 세포는, 예를 들어, 페트리 접시로부터 일부 세포를 흡인시키고, 계수하기 위해 그들을 플레이팅함으로써 콜로니 형성 단위(CFU)/ml를 생성하는 능력에 대해 분석된다. 이어서, 이 결과는 억제제가 적용된 후 동일한 배양물의 세포에 의해 생성된 콜로니 형성 단위(CFU)/ml의 수와 비교된다. 콜로니 형성 단위(CFU)/ml의 수가 억제제의 적용 전에 생성된 수로 감소되면, 감소가 존재한다.
일반적으로, 당업자는 박테리아 및 바이러스 감염을 분석하는 이러한 익히 공지된 기술을 알고 있다. 플라크 형성 단위(PFU)/ml 및 콜로니 형성 단위(CFU)/ml를 측정할 수 있는 방법은 문헌에 추가로 기재되어 있다(참조: Tuchscherr et al. 2011, Hrincius et al. 2010).
본 발명의 목적을 위해, 상기 정의된 활성 화합물은 또한 이의 약제학적으로 허용되는 염(들)을 포함한다. 본원에 사용된 어구 "약제학으로 또는 향장학적으로 허용되는 염(들)"은 목적하는 투여 형태에 대해 안전하고 효과적인 본 발명의 화합물의 염을 의미한다. 약제학적으로 허용되는 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 것들과 같은 음이온으로 형성된 것들, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 것들과 같은 양이온으로 형성된 것들을 포함한다.
본 발명은 또한 다음 항목을 특징으로 한다:
1. 바이러스성 질환의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
2. 항목 1에 있어서, 상기 바이러스가 음성 가닥 RNA 바이러스인, PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
3. 항목 1 또는 2에 있어서, 상기 바이러스가 인플루엔자 바이러스인, PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
4. 항목 1 내지 3 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스가 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스인, PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
5. 박테리아 감염의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
6. 항목 5에 있어서, 상기 박테리아 감염이 스타필로코카시에, 스트렙토코카시에, 레지오넬라시에, 슈도모나다시에, 바실라시에, 클라미디아시에, 마이코플라스마타시에, 엔테로박테리아시에, 슈도모나달레스 및/또는 파스테우렐라시에로 이루어진 그룹으로부터 선택된 박테리아로 매개되는, PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
7. 박테리아 감염 및 바이러스성 질환을 포함하는 동시 감염의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
8. 항목 7에 있어서, 상기 박테리아 감염이 스타필로코카시에, 스트렙토코카시에, 레지오넬라시에, 슈도모나다시에, 바실라시에, 클라미디아시에, 마이코플라스마타시에, 엔테로박테리아시에, 슈도모나달레스 및/또는 파스테우렐라시에로 이루어진 그룹으로부터 선택된 박테리아로 매개되는, PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
9. 항목 7 또는 8에 있어서, 상기 바이러스가 음성 가닥 RNA 바이러스인, PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
10. 항목 7 내지 9 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 바이러스 감염이 인플루엔자 바이러스에 의해 유발되는, PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
11. 항목 7 내지 10 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 바이러스 감염에서 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스에 의해 유발되는, PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
12. 항목 1 내지 4 및 7 내지 11 중 어느 한 항목에 있어서, PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 뉴라미니다제 억제제 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 조합하여 투여되는, PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
13. 항목 12에 있어서, 상기 뉴라미니다제 억제제가 오셀타미비르, 오셀타미비르 포스페이트, 자나미비르, 라니나미비르 또는 페라미비르 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는, PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
14. PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 약제학적 조성물.
15. PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 뉴라미니다제 억제제 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 약제학적 조성물.
16. 추가의 MEK 억제제를 포함하는 상기 항목의 임의의 사용.
17. 대상체, 바람직하게는 척추동물에서 전술한 항목 중 어느 한 항목에 따른 사용을 위한 PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
***
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 한, 복수의 지시대상을 포함한다는 것이 주시되어야 한다. 따라서, 예를 들어, "시약"에 대한 언급은 하나 이상의 이러한 상이한 시약을 포함하고, "방법"에 대한 언급은 본원에 기재된 방법으로 변형되거나 치환될 수 있는 당업자에게 공지된 동등한 단계 및 방법에 대한 언급을 포함한다.
본 개시에 인용된 모든 공보 및 특허는 그 전문이 참조로 포함된다. 참조로 포함된 자료가 본 명세서와 모순되거나 일치하지 않는 정도로, 본 명세서는 임의의 이러한 자료를 대체할 것이다.
달리 지시되지 않는 한, 일련의 요소에 선행하는 용어 "적어도"는 시리즈의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 본원에 기재된 본 발명의 특정 구현예와 많은 등가물을 일상적인 실험만을 사용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서 및 하기 청구범위 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다" 및 "포함한다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹을 포함하지만, 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본원에 사용될 때, "포함하는"이라는 용어는 "함유하는"이라는 용어로 또는 때때로 본원에 사용될 때 "갖는"이라는 용어로 치환될 수 있다.
본원에 사용될 때 "~로 구성되는"은 청구범위 요소에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원에 사용될 때, "본질적으로 ~로 구성되는"은 청구범위의 기본적 및 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다.
본원에서 각 경우에, "포함하는", "본질적으로 ~로 구성되는" 및 "~로 구성되는"이라는 용어는 다른 두 용어 중 하나로 대체될 수 있다.
본 명세서의 텍스트 전체에 걸쳐 몇몇 문서가 인용된다. 본원에 인용된 각각의 문헌(모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조업체의 사양, 지침 등 포함)은 상기든 하기든 전체로 참조로 포함된다. 본원의 어떠한 것도 본 발명이 종래 발명에 의해 이러한 개시를 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 예시한다. 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 실시예는 예시의 목적으로 포함되며, 본 발명은 청구범위에 의해서만 제한된다.
실시예 1: PD-0184264로 마우스를 치료하면 폐에서 바이러스 역가를 감소시킨다
8주령 C57BL/6 마우스(그룹당 5마리)를 1.5 x 105 PFU(5x MLD50)의 인플루엔자 바이러스 균주 A/Regensburg/D6/2009, (RBI, H1Nlpdm09)로 감염시켰다. 감염 1 시간 전에 출발하여 마우스를 150mg/kg CI-1040; 75mg/kg CI-1040, 25mg/kg CI-1040, 75mg/kg PD0184264, 25mg/kg PD0184264 또는 용매(대조군): 50μl DMSO/150μl 크레모포어/800μl PBS로 8시간 간격으로 처리했다. 모든 동물은 200μl의 용적을 경구로 받았다. 감염 24시간 후 마우스를 희생시키고, 폐를 칭량하고, Lysing Matrix D 튜브(MP Bio)로 옮기고, BSS(완충된 염 용액)를 폐의 10배 용적의 양으로 샘플에 적용했다. FastPrep FP 120 (Savant)을 사용하여 장기를 파쇄했다. 세포 잔해물을 제거하기 위해 균질화물을 2000rpm에서 15분 동안 원심분리하고, 상청액을 수집했다. 균질화물 중 바이러스 역가의 결정은 AVICEL® 플라크 검정을 사용하여 수행했다. 결과는 바이러스 역가(log10) pfu/ml(왼쪽) 또는 % 바이러스 역가(오른쪽)로서 도 1에 제시된다. 바이러스 역가는 두 명의 조사자에 의해 독립적으로 결정되었다. 모든 적정의 평균 값이 제시되었다.
실시예 2: CI-1040 또는 PD-0184264의 투여는 시험관내에서 MRSA를 포함하는 박테리아 성장에 대한 억제 효과를 나타낸다
일반적으로 박테리아 성장에 대한 CI-1040 또는 PD-0184264의 효과를 조사하기 위해, MRSA 균주 에스. 아우레우스(USA300)의 무세포 밤새 배양물은 50μM의 CI-1040 또는 PD-0184264 또는 용매로서 작용하는 동일 용적(40μl)의 DMSO를 보충했다(도 2). 박테리아 성장을 360분 동안 모니터링했다. PD-0184264는 박테리아 성장에 강한 영향을 미쳤으며, 이는 전체 관찰 기간 동안 거의 완전히 부재했다. CI-1040은 도 2로부터 알 수 있는 바와 같이 용매 대조군과 비교하여 실험 개시 후 120분에 출발하여 MRSA의 성장을 약간 억제했다. 이는 PD-0184264뿐만 아니라 CI-1040도 세포에서 MEK를 차단하는 것 외에 박테리아 성장을 담당하는 박테리아 성분을 또한 차단한다는 것을 나타낸다.
박테리아 성장을 억제하는데 필요한 PD-0184264의 농도를 조사하기 위해, PD-0184264를 에스. 아우레우스 USA300(MRSA)의 밤새 배양물에 상이한 농도로(도 3에 나타낸 바와 같이) 투여했다. MRSA 박테리아를 0 내지 100μM 범위의 상이한 농도의 MEK 억제제와 함께 배양하였고, 배양 6시간 후에 박테리아 성장을 모니터링했다. 박테리아 성장의 50%를 억제하는데 필요한 농도는 15-25μM의 범위였다.
이들 데이터는 약간 다른 실험 환경에서 검증되어 치료후 후기 시점에서 OD 대신 실제 박테리아 역가를 결정할 수 있었다. 에스. 아우레우스 6850의 하루 종일 배양물을 20CFU/ml로 설정하고, 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 지시된 바와 같이 상이한 농도의 CI-1040으로 처리했다. 이어서, 광학 밀도(OD600)를 측정했다. 잔류하는 배양물을 PBS로 세척하고, 일련의 희석액은 BHI 한천 플레이트에 적용했다. 박테리아 역가는 ml당 콜로니 형성 단위(CFU/ml)로 제시된다. 결과는 도 4a에 도시된 2개의 기술적 복제물에 의한 3개의 독립적인 생물학적 실험의 평균 + SD를 나타낸다. 또한, 에스. 아우레우스 6850(도 4b) 또는 MSA 균주 USA300(도 4c)의 하루 종일 배양물을 20CFU/ml로 설정하고, 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 지시된 바와 같이 상이한 농도의 PD-0184264로 처리했다. 아침에, 광학 밀도(OD600)를 측정했다. 잔류하는 배양물을 PBS로 1회 세척한 후, 일련의 희석액은 BHI 한천 플레이트에 적용했다. 테리아 역가는 콜로니 카운터 "프로토콜3"을 사용하여 결정하였고, 로그 스케일로 ml당 콜로니 형성 단위(CFU/ml)로서 제시된다. 결과는 2개의 기술적 복제물를 사용하는 3개의 독립적인 생물학적 실험의 평균 ± SD를 나타낸다. 통계적 유의성은 일원 ANOVA에 이어 던넷(Dunnett)의 다중 비교 시험으로 분석했다. CI-1040(도 4a) 및 PD-0184264(도 4b, c)는 모두 에스. 아우레우스 균주 6850(도 4a, b) 및 MRSA 균주 USA 300(도 4c)에 대한 이들 검정에 또한 효과적이었다. 최대 1.5-2 차수 크기의 역가의 매우 강한 감소가 20μM의 PD-0184264(도 4b, c)로 검출될 수 있었다.
실시예 3: 단일 또는 동시 감염된 세포에 PD-0184264를 투여하면 IAV 및/또는 에스. 아우레우스의 세포 변성 효과로부터 세포를 보호한다
PD-0184264의 항바이러스 및 강력한 항균 효과(상기 실시예 2의 도 2 내지 4)를 고려하여, 본 발명자들은 상기 화합물의 이 특징이 또한 IAV(인플루엔자 A 바이러스) 및/또는 에스. 아우레우스 감염에 의해 유발된 세포 파괴성 세포 변성 효과(CPE)와 관련하여 거시적으로 관찰될 수 있는지를 분석했다. 인간 폐 상피 세포(A549)를 PD-0184264(지시된 농도) 또는 용매(DMSO)로 전처리하고, 37℃에서 다수의 감염(MOI = 0.001)에서 인간 인플루엔자 바이러스 균주 A/푸에르토 리코/8/34(H1N1)으로 감염시켰다. 30분 후, 바이러스 희석액을 제거하고, 세포를 PBS로 세정하고, 지시된 농도의 억제제 또는 용매 대조군의 존재하에 에스. 아우레우스 6850(MOI = 0.1)의 존재 또는 부재하에 침습 배지 DMEM/INV(1% 인간 혈청 알부민, 25nM HEPES 함유)를 보충했다. 박테리아 감염 3시간 후 세포를 10% FBS, 2㎍/ml 리소스타핀을 함유하는 DMEM/FBS로 20분 동안 처리하여 세포외 박테리아를 제거했다. PBS로 추가 세척한 후, 세포는 억제제 또는 용매를 함유하는 감염 배지 DMEM/BA(0.2% BA, 1mM MgCl2, 0.9mM CaCl2, 100U/ml 페니실린, 0.1mg/ml 스트렙토마이신)를 보충했다. 37℃에서 24시간의 배양 기간 후, 세포 형태를 광 현미경으로 검사했다. 도 5에 도시된 바와 같이, 세포 단층의 약간의 파괴가 IAV(H1N1) 또는 에스. 아우레우스 균주 6850으로의 단일 감염 후 관찰되었다. 이 CPE는 두 병원체(하부 패널)로의 동시 감염시 강하게 증가되었다. 그러나, MEK-억제제의 양이 증가함에 따라 이 표현형은 세포 단층이 온전하게 유지되고 세포가 덜 원형으로 형상화될 때 농도 의존 방식으로 역전될 수 있다. PD-0184264의 이 세포 보호 효과는 이의 항바이러스 및 항균 특성을 완벽하게 반영한다(도 5).
실시예 4: PD-0184264의 항균 작용과 일반적인 항생제의 비교
일반적인 항생제의 작용으로 MEK-억제제 PD0184164의 항균 특성을 정렬시키기 위해, 본 발명자들은 박테리아를 용매, MEK-억제제 U0126 및 PD-0184264 또는 상이한 농도의 항생제 겐타마이신으로 밤새 처리했다. 에스. 아우레우스 6850 또는 MRSA 균주 USA300의 하루 종일 배양물을 20CFU/ml로 설정하고 37℃ 및 5% CO2에서 MEK 억제제 U0126 및 PD-0184264 또는 항생제 겐타마이신으로 밤새 지시된 바와 같이 처리했다. 아침에, 광학 밀도(OD600)를 측정했다. 잔류하는 배양물을 PBS로 한 번 세척한 후, 일련의 희석액은 BHI 한천 플레이트에 적용했다. 박테리아 역가는 콜로니 카운터 "프로토콜 3"을 사용하여 결정되었고, ml당 콜로니 형성 단위(CFU/ml)로서 제시된다. 도 6에 제시된 결과는 2개의 기술적 복제물을 사용하는 3개의 독립적인 생물학적 실험의 평균 ± SD를 나타낸다. 통계적 유의성은 일원 ANOVA에 이어 던넷의 다중 비교 시험으로 분석했다. 용매 처리된 박테리아와 비교하여, 1세대 MEK-억제제 U0126과의 배양은 박테리아 역가의 최소한의 감소만을 초래한 반면, PD-0184264로의 치료는 도 4에서 이전에 나타낸 바와 같이 박테리아 부하의 매우 강한 감소를 유도했다. 이것은 두 박테리아 균주에 대해 마찬가지였다. 예상된 바와 같이, 항생제의 항균 작용은 에스. 아우레우스 6850의 경우에 더 높았지만, 두 박테리아 균주의 성장은 1㎍/㎖보다 높은 농도의 겐타마이신 치료에 의해 강하게 억제되었다. 0.5㎍/㎖의 겐타마이신에서 박테리아 역가의 감소는 두 균주에 대해 검출될 수 없었다. 요약하면, 박테리아 성장에 대한 MEK-억제제 PD-0184264의 영향은 거의 저농도의 항생제 겐타마이신만큼 효율적이었다.
PD-0184264의 항균 작용을 다른 MEK-억제 화합물 또는 항생제 겐타마이신과 추가로 비교하기 위해, 첨가 시간 검정을 수행했다(도 7a). 에스. 아우레우스 6850의 밤새 배양물을 용매 DMSO 단독 또는 MEK-억제제 U0126 및 PD-0184264 중 하나 또는 2개의 상이한 농도의 항생제 겐타마이신(0,5 또는 2㎍/ml)과 함께 15ml의 BHI 배지를 함유하는 6개의 계대 배양물로 나누었다. 상이한 화합물을 첨가한 직후에, OD600을 측정하고, 일련의 희석액은 박테리아 역가를 계산하기 위해 BHI 한천 플레이트에 적용했다. 잔류하는 배양물을 물질 또는 용매 단독의 존재하에 5% CO2와 함께 37℃에서 추가로 배양했다. 이 절차는 접종 후 3시간 및 6시간에 2회 반복했다. 박테리아 역가는 콜로니 카운터 "프로토콜3"을 사용하여 결정하였고, ml당 콜로니 형성 단위(CFU/ml)로서 제시된다. MEK-억제제 PD-0184264로의 치료는 다른 모든 화합물과 비교하여 박테리아 성장의 가장 강한 억제를 나타냈다. 그 후, 배지 교환을 수행하고, 배양물을 임의의 물질의 첨가 없이 추가로 배양했다. 모든 배양물은 이전에 용매 처리된 배양물의 탁도에 도달하였으며, 이는 MEK 억제제 PD-0184264가 살균 작용보다는 정균 작용을 나타낸다는 것을 나타낸다.
일반적으로 사용되는 다양한 항생제에 대한 내성 발달은 정기적으로 발생하며, 클리닉에서 주요 문제를 나타낸다. MEK 억제제 PD0184264가 에스. 아우레우스에서 내성 발달을 유발하는지의 여부를 시험하기 위해, 배양물을 억제제, 겐타마이신, 에리트로마이신의 존재하에 거의 3주 동안 지속적으로 처리하거나 처리하지 않은 채로 정치시켰다. 구체적으로, 배양물을 물질의 존재 또는 부재하에 24시간 동안 성장시키고, OD600을 측정한 다음 배양물을 20CFU/ml로 설정하고 다시 24시간 동안 성장시켰다. 이 절차는 17일 동안 반복했다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균 + SD를 나타낸다. 통계적 유의성은 일원 ANOVA에 이어 던넷의 다중 비교 시험으로 분석했다(* p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001; **** p <0.0001). 겐타마이신에 대해 나타난 바와 같이, 마크롤리드 항생제인 에리트로마이신과 대조적으로, 치료 첫 주 동안 내성 발달이 일어났다. 특히, MEK 억제제에 의한 치료는 내성을 유도하지 않았다(도 7b에 도시된 결과 참조).
실시예 5: 박테리아 키나제 PknB는 박테리아에서 PD-0184264의 표적일 수 있다
억제제 PD-0184264는 포유동물에 존재하는 키나제 MEK에 특이적인 것으로 가정된다. 이의 직접적인 항균 효과는 원핵 생물에서의 작용 방식, 즉 PD-0184264에 의해 특이적으로 표적화될 수도 있는 MEK-유사 박테리아 성분이 있는지에 대한 의문을 제기한다. 이 시점에서, 박테리아 세린/트레오닌 키나제 PknB가 조사의 초점이 되었다. 이 키나제는 세포 세린/트레오닌 키나제, 더욱 정확하게는 포유류 세포 중 MEK-표적인 MAP 키나제, 예를 들어, p38, JNK 및 ERK와 높은 구조적 및 기능적 유사성을 나타낸다(참조: Miller et al., 2010, Rakette et al. 2012)(도 8). 흥미롭게도, 키나제는 자가 인산화에 의해 활성화되는 것으로 나타 났으며, 따라서 그것이 MEK-유사 활성을 나타낸다는 것을 강하게 시사한다.
실시예 6: PD-0184264는 항생제에 대한 스타필로코쿠스 아우레우스의 민감성을 증가시키고 박테리아 스트레스 내성을 감소시킨다
3개의 페니실린 결합 도메인(PASTA)의 발현으로 인해(도 8, 상부 패널 참조), PknB는 항생제 민감성의 조절에 관여한다. 키나제의 결여는 상이한 항생제, 특히 다양한 β-락탐에 대한 민감성을 증가시킨다는 것을 보여줄 수 있다(참조: Tamber et al. 2010). MEK-억제제 PD-0184264에 의한 박테리아의 치료가 박테리아 키나제에 영향을 미칠 수 있고 키나제의 녹아웃과 유사한 표현형을 초래하는지를 조사하기 위해, 박테리아 배양물을 밤새 용매(DMSO) 또는 20μM의 PD-0184264로 처리한 다음, 상이한 항생제의 최소 억제 농도(MIC)를 결정하기 위해 사용했다. 에스. 아우레우스 6850의 하루 종일 배양물을 20 CFU/ml로 설정하고, 밤새 37℃ 및 5% CO2에서 용매(DMSO) 또는 MEK-억제제 PD-0184264로 처리했다. 아침에, 광학 밀도(OD600)를 측정했다. 간략하게, 용매 및 억제제 처리된 배양물을 PBS로 1회 세척하고, 1:1 희석액은 BHI 한천 플레이트에 적용했다. 접종 직후, 상이한 항생제(Thermo Fischer Scientific)에 대한 MIC 시험 조각을 플레이트의 중앙에 위치시킨 후, 37℃에서 18 내지 24시간 동안 배양했다. 37℃에서 18시간 동안 배양한 후, MIC 농도를 플레이트의 시각적 분석을 통해 결정했다. 성장 억제가 더 이상 보이지 않는 농도는 각각의 개별적 항생제에 대한 MIC로 칭명되었다. PD-0184264에 의한 치료는 실제로 상이한 항생제에 대한 박테리아의 민감성을 증가시켰으며, 이는 페니실린 및 겐타마이신의 경우에 가장 두드러졌다(도 9, 표 2). 이 결과는 키나제가 결여된 돌연변이체 균주로 생성된 공개된 데이터와 완벽하게 일치한다(참조: Tamber et al. 2010).
키나제가 결여되는 박테리아의 표현형과 일치하는 PD-0184264로 치료시 항생제 민감성의 관찰된 증가(참조: Tamber et al. 2010)는 PknB가 억제제에 의해 직접 표적화될 수 있음을 강하게 시사한다. 키나제가 박테리아 스트레스 내성에 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있으므로, 열 응력하의 박테리아 성장은 억제제 PD-0184264에 의한 박테리아의 치료 후 모니터링했다. 에스. 아우레우스 균주 6850 및 MRSA 균주 USA300을 용매 또는 20μM의 PD-0184264로 밤새 처리했다. 다음날 동일한 양의 박테리아를 갖는 계대 배양물을 제조하고(OD600으로 확인하고 BHI 한천 상에 플레이팅함), 42℃에서 6시간 동안 추가로 배양했다. 이어서, 박테리아 역가를 BHI 한천 플레이트 상에서 일련의 희석액의 플레이팅을 통해 계산했다. 도 10에 도시된 바와 같이, PD-0184264-처리된 박테리아는 용매 처리된 병원체와 비교하여 이러한 조건하에서 크게 손상되었다. 이는 메티실린-민감성 균주 6850(검은 색 막대) 및 MRSA 균주 USA300(회색 막대) 모두에서 관찰된다. 억제제의 존재하에 손상된 스트레스 내성은 PD-0184264가 스트레스 내성의 중요한 매개체인 키나제 PknB를 직접 표적화한다는 또 다른 지표이다. 요약하면, 데이터는 PD-0184264가 박테리아 키나제 PknB의 억제에 의해 이의 항균 작용을 유발한다는 강력한 정황 증거를 제공한다.
실시예 7: PD-0184264의 투여는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 및 바실러스 서브틸리스의 성장에 대한 억제 효과를 나타낸다
에스. 아우레우스 외에, 환자에서 인플루엔자 바이러스(IV) 감염 후 2차 세균성 폐렴을 유발하는 것으로 공지된 다른 박테리아가 있다. 이 맥락에서 가장 풍부한 병원체는 스트렙토코쿠스 뉴모니애이다. 이들 박테리아는 지역 사회 획득 폐렴의 가장 흔한 원인이다. 에스. 아우레우스와 대조적으로, 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 의한 2차 감염은 오히려 IV 후 후기 단계에 발생하고, 따라서 말기 인플루엔자후 폐렴에 상응한다.
에스. 아우레우스와 유사하게, 대부분의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주는 상이한 속(genera) 사이에서 고도로 보존되는 PknB와 같은 진핵 생물-유사 세린/트레오닌 키나제를 발현한다. 또한, 이들 키나제는 세포 MAP 키나제(예: ERK, JNK, p38)에 대해 높은 상동성을 공유한다. 상이한 에스. 아우레우스 균주로 달성된 실시예 2 내지 6에 나타낸 결과는 이미 박테리아 성장에 대한 PD-0184264 치료의 억제 효과를 입증했고, 이는 관찰된 표현형에서 PknB와 같은 박테리아 키나제의 관여를 지적했다. 현저하게, 에스. 아우레우스 PknB의 상동체는 또한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 존재하며, 이들 박테리아가 또한 PD-0184264에 민감할 수 있음을 시사한다. 따라서, 스트렙토코키 뉴모니아의 상이한 균주에 대한 PD-0184264의 영향을 분석했다. 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주는 그들의 독성 및 전반적인 병원성이 상이한 다른 혈청형으로 나눌 수 있다. 혈청형 또는 균주-독립적 효과를 시험하기 위해, 본 발명자들은 둘 다 독성이지만 상이한 혈청형에 속하는 캡슐화된 균주 D39 및 TIGR4를 사용했다. PD-0184264에 의한 치료는 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 상이한 혈청형의 성장을 손상시키는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주 TIGR4(혈청형 4) 및 D39 wt(혈청형 2)의 하루 종일 배양물을 광학 밀도(OD600) 1로 설정하고, BHI 배지에서 1:2000으로 희석하고, 용매(DMSO) 또는 지시된 바와 같이 상이한 농도의 특이적 MEK 억제제 PD0184264(PD; CI-1040의 활성 대사산물)로 밤새 처리했다. 이어서, OD600을 다시 측정하고(도 11a에 도시된 결과), 희석 시리즈는 박테리아 역가를 결정하기 위해 BHI 한천 플레이트에서 적용했다(도 11b에 도시된 결과). 결과적으로, 두 혈청형이 PD-0184264에 민감하다는 것이 입증될 수 있었다(도 11a, b).
바실러스 서브틸리스의 경우도 마찬가지인데, 생존 가능한 박테리아 계수의 강한 감소가 또한 10μM PD-0184264의 존재하에서 관찰되었고 더 높은 농도에서 완전히 폐지되었다(도 11c의 결과 참조). 구체적으로, 비. 서브틸리스에 대한 잠재적 항균 효과를 시험하기 위해, 비. 서브틸리스의 밤새 배양물을 용매 또는 상이한 농도의 MEK 억제제 PD-0184264(표시된 바와 같이)와 함께 18시간 동안 배양했다. 그 후, 박테리아 부하는 OD600의 측정 및 BHI 한천 플레이트 상에 일련의 희석액의 플레이팅을 통해 결정했다. 도 11에 도시된 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균 + SD를 나타낸다.
요약하면, 이들 데이터는 항균 치료에서 PD-0184264의 광범위한 적용 가능성을 나타낸다.
실시예 8: CI-1040이 아닌 PD-0184264가 세포내 박테리아 역가를 감소시킨다
인플루엔자 바이러스(IV) 감염은 항바이러스성 사이토카인, 가장 중요하게는 중요한 하류 항바이러스 반응을 활성화시키고 후속적인 박테리아 감염을 강화시킬 수도 있는 유형 I IFN의 발현을 향상시킨다. CI-1040 또는 PD-0184264에 의한 치료가 2차 에스. 아우레우스 감염에 대해 세포를 감작시킬지의 여부를 확인하기 위해, 불멸화된 인간 폐포 기저 상피 세포(A549)의 세포 배양물을 억제제의 존재 또는 부재하에 인플루엔자 IV 및 에스. 아우레우스로 감염시켰다. 구체적으로, A549 세포를 10μ의 특이적 MEK-억제제 PD-0184264 또는 용매 대조군으로서 DMSO로 1시간 동안 전처리했다. 그 후, 세포를 PBS로 세정하고, 인플루엔자 바이러스(IV)(지시된 바와 같은 MOI)로 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 감염시켰다. 이어서, 세포를 PBS로 세척하고, 억제제의 존재 또는 부재하에 에스. 아우레우스 6850(지시된 바와 같은 MOI)으로 3시간 동안 감염시켰다. 박테리아 과성장을 피하기 위해, 리소스타핀(2㎍/mL)을 사용하는 항생제 세척 단계를 37℃에서 20분 동안 수행하여 비내재화된 박테리아를 제거했다. 이어서, 세포를 1회 세척하고, 억제제 또는 용매의 존재하에 24시간 p.i.까지 추가로 배양했다. 배양 기간의 말기에, 세포 단층은 광 현미경을 통해 분석했다. 현미경 검사는 두 병원체에 의한 슈퍼 감염이 단일 감염과 비교하여 매우 증가된 세포 변성 효과(CPE)를 초래했다는 것을 나타냈다(도 13, 상단 패널). CPE는 감소된 바이러스 복제를 나타내는 PD-0184264(도 13, 하부 패널)의 존재하에서 완전히 폐지되었다.
PD-0184264 및 CI-1040으로의 치료가 필적할 만했는지를 확인하기 위해, A549 세포를 10μM CI-1040, PD-0184264 또는 용매(DMSO)로 60분 동안 전처리한 후, 인플루엔자 IV(H7N7)로 37℃에서 0.001의 MOI로 감염시켰다. 결과는 각각 도 14a 및 14b에 도시되어 있다. 대안적으로, 세포를 처리하지 않은 채(DMSO) 방치하고, IV (H1N1)로 37℃에서 0.01의 MOI로 감염시켰다. 30분 후, 바이러스 희석액을 제거하고, 세포를 PBS로 세정하고, 10μM CI-1040, PD-0184264 또는 용매 대조군의 존재하에 에스. 아우레우스 6850(6850)(MOI 0.1)을 포함하거나 포함하지 않는 침입 배지를 보충했다. 박테리아 감염 3시간 후, 세포를 리소스타핀(2㎍/mL)으로 20분 동안 처리하여 세포외 박테리아를 제거했다. 이어서, 세포를 세척하고 억제제 또는 용매를 함유하는 감염 배지를 보충했다. 24시간(바이러스 감염 후)의 총 배양 기간 후, 세포내 박테리아 역가를 분석했다. 결과는 3개의 개별 실험의 평균 + SD를 나타낸다. 통계적 유의성은 일원 ANOVA에 이어 터키(Tukey)의 다중 비교 시험에 의해 평가되었다(* p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001; **** p <0.0001). 도 14a로부터 알 수 있는 바와 같이, CI-1040으로의 치료는 세포내 박테리아 부하의 변화가 검출될 수 없기 때문에 에스. 아우레우스에 의한 2차 감염에 대해 세포를 민감하게 하지 않았다. 놀랍게도, PD-0184264의 투여는 심지어 도 14b로부터 알 수 있는 바와 같이 세포내 박테리아 역가를 감소시켰다. 도 14c에 도시된 바와 같이, 진행 중인 감염 동안 CI-1040 또는 PD-0184264가 나중에 투여되었을 때 필적할 만한 결과가 수득되었다.
바이러스 및 세포내 박테리아 복제의 감소가 A549 세포에 대한 PD-0184264의 세포 독성 효과의 결과였음을 배제하기 위해, 증가하는 농도의 존재하에 세포 생존력을 24시간 및 48시간 동안 모니터링했다. 또한, LDH-검정을 수행하여 억제제 처리로 인한 막 파열을 결정했다. PD-0184264에 의한 A549 세포의 처리는 세포 독성을 유도하지 않는 것으로 나타났다. A549 세포는 증가하는 농도의 PD-0184264(1, 5, 10, 20, 50 또는 100μM)로 24시간 동안(도 15a 및 c에 도시된 바와 같이) 또는 48시간 동안(도 15b 및 d에 도시된 바와 같이) 처리했다. 배양 시간 후, 상청액은 제조업자의 지침에 따라 CytoSelect LDH 세포독성 검정 키트를 사용하여 LDH 방출의 측정을 위해 취했다(도 15c, d에 도시됨). 또한, 생존 가능한 세포는 트립판 블루로 염색하여 계수했다. 세포 생존력은 DMSO-처리된 세포로 정규화되었고, 생존율(%)로 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균 + SD를 나타낸다. 통계적 유의성은 일원 ANOVA에 이어 던넷의 다중 비교 시험으로 계산되었다(* p <0.05; ** p <0.01; 27 *** p <0.001).
실시예 9: CI-1040 및 PD-0184264에 대한 IC
50
값의 결정
억제제 분취액을 100% DMSO(마스터 용액 10mM)에 용해시켰다. IC50 값을 분석하기 위해, 다음 일련의 희석액을 마이크로타이터 플레이트에서 제조했다: 50μM, 25μM, 5μM, 2.5μM, 0.5μM, 0.25μM, 0.05μM, 0.025μM, 0.005μM. 각각의 희석액 1μl를 키나제 반응 혼합물 49μl에 첨가하여, 다음 시험 농도를 수득했다: 1μM, 500nM, 100nM, 50nM, 10nM, 5nM, 1nM, 0.5nM, O.1nM.
정제된 단백질 용액 3㎕ 활성 c-Rafl, 2㎕ MEKlwt 및 3㎕ ERK2wt를 키나제 완충제 및 1㎕ DMSO 또는 DMSO/억제제(최종 부피 45㎕)와 혼합했다. 혼합물을 암실에서 30분 동안 실온에서 배양했다. 이 예비 배양 후, MEK 단백질에 대한 억제제 결합을 보장하고, 5μl의 10mM ATP를 첨가하고 피펫과 혼합하여 키나제 반응을 시작했다. 샘플을 500rpm에서 26℃ 열 혼합기(Eppendorf)에서 30분 동안 배양했다. 키나제 반응을 중지시키기 위해, 5.5μl의 20% SDS 용액을 첨가하고, 이 혼합물을 이어서 50℃에서 10분 동안 배양했다. 이어서, 각 샘플을 190㎕ 차단 완충제(TBST 중 1% BSA)로 희석시켰다. 100㎕의 각각의 샘플을 96-웰-마이크로타이터 플레이트의 항-ERK 항체 코팅된 웰에 첨가했다.
키나제 반응 샘플(100㎕/웰)을 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 항-ERK 항체 코팅된 웰 및 BSA 차단된 웰에서 60분 동안 실온에서 배양했다. 이어서, 플레이트를 100㎕ TBST 세척 완충제로 3x5분 세척했다. 인산화된 ERK를 검출하기 위해,항 포스포-ERK (p44/p42) 항체(1:3000, 차단 완충제 중 100㎕/웰)를 첨가하고, 4℃에서 밤새 배양했다.
3회 세척 단계(3x100 ㎕/웰) 후, HRP-접합된 항-마우스 IgG 특이적 항체(TBST 중 1:1000)를 첨가하고, 60분 동안 실온에서 배양했다. 100㎕/웰의 퍼옥시다제 기질 ABTS를 3개의 추가 세척 단계(3 × 100㎕/웰 TBST) 후에 첨가하고, 30℃에서 30분 동안 배양했다. 2.5㎕의 20% SDS를 첨가하여 기질 반응을 중지시켰다. 혼합물의 광학 밀도(OD)는 ELISA 판독기에서 405nm의 파장에서 측정된다.
무세포 키나제 검정은, 실제로 MEK 키나제의 약한 억제제인 PD-0184264와 비교하여 12.5배 적은 CI-1040(도 16)이 MEK 활성의 50%를 억제하는데 필요하다는 것을 나타냈다. 따라서, 아무도 PD-0184264의 강력한 항바이러스 및 항균 효과를 기대하지 않는다. 그러나, 상기 실시예에서 나타낸 바와 같이, PD-0184264는 생체내 CI-1040과 비교하여 더 강한 항바이러스 및 항균 활성을 나타낸다.
실시예 10: 시험관내 검정에서 PD-0184264의 항바이러스 활성
약물
CI-1040[2-(2-클로로-4-요오도페닐아미노)-N-(사이클로프로필메톡시)-3,4-디 플루오로 벤즈아미드; 로트: CC-5395.0-16] 및 PD-0184264(PD0184264)[2-(2-클로로-4-요오도페닐아미노)-N-3,4-디플루오로 벤조산; 로트: CC-5595.4-10]를 ChemCon GmbH(독일 프라이부르크)에서 합성했다. 세포 배양 실험을 위해, CI-1040(M= 478,66g/mol) 및 PD-0184264(M= 409,55g/mol)의 10mM 저장 용액을 DMSO(Merck-Millipore; Germany)에서 제조했다.
바이러스 및 세포
0.001의 MOI를 갖는 인플루엔자 A 바이러스 균주 RBI[A/Regensburg/D6/09(H1Nlpdm09)]로 수행된 바이러스 억제 실험.
후대 바이러스 억제 검정
A549 세포를 5% CO2 대기에서 37℃에서 30분 동안 RBI로 감염시켰다. 배양 후, 바이러스 희석액을 흡인하고, 세포를 PBS로 세정하고, 10μM CI-1040 또는 상이한 농도의 PD-0184264(100μM, 50μM, 10μM, 5μM, 1μM, 0.5μM 및 0.1μM, 최종 DMSO 농도= 1%)의 존재하에 500㎕ IMDM(이스코브 변형 둘베코 배지; Iscove's Modified Dulbecco's Medium)/BA(소 알부민) - 배지(0.2% BA, 1mM MgCl2, 0.9mM CaCl2, 100U/mL 페니실린, 0.1mg/ml 스트렙토마이신) 및 0.6μl TPCK-처리된 트립신으로 5% C02 중 37℃에서 24시간 동안 보충했다. 용매 대조군은 1% DMSO를 갖는 IM DM/BA-배지였다. 이미 기재된 바와 같이(참조: Haasbach et al. 2011, Matrosovich et al. 2006) AVICELR 플라크 검정을 사용하여 MDCK II 세포에서 후대 바이러스 역가를 결정하기 위해 세포 배양 상청액을 수집했다.
WST-검정
A549 세포를 96-웰 평저 조직 플레이트(Greiner, Germany)에 시딩하고 밤새 성장시켰다. 그 후, 세포를 5% 태아 송아지 혈청(Sigma-Aldrich; Germany) 최종 DMSO 농도= 1%가 보충된 100㎕ IMDM(ThermoFisher, Germany)에 용해된 상이한 농도의 PD-0184264(100μM, 50μM, 10μM, 5μM, 1μM, 0.5μM 및 0.1μM)로 처리하고, 37℃ 및 5% C02에서 24시간 동안 배양을 수행했다. 그 후, 10㎕의 WST-1 시약(Roche, Germany)을 배양 배지에 첨가하고, 4시간 동안 배양했다. 이 시간 동안, 안정한 테트라졸륨 염 WST-1을 배양물에서 대사 활성 세포에 의해 가용성 포르마잔으로 절단했다. 이 배양 기간 후, 형성된 포르마잔 염료를 405nm에서 ELISA 판독기로 정량화했다. 측정된 흡광도는 생존 가능한 세포의 수와 직접 관련이 있었다.
결과
RB1에 대한 PD-0184264의 항바이러스 활성을 표준 바이러스 억제 검정에서 조사했다(도 17a). 100μM PD-0184264(P >0.0001)로 처리된 세포가 발견되었을 때 바이러스 역가의 98.87 ± 0.03% 감소가 발견되었다. 50μM PD-0184264(91.50 ± 2.08%; P >0.0001)로 유사한 감소가 발견되었다. 대조적으로, 10μM PD-0184264가 사용되었을 때(58.97 ± 4.45%), 바이러스 역가의 약한 감소만이 발견되었다. 1μM PD-0184264는 후대 바이러스를 거의 감소시키지 않았다. 따라서, 10μM CI-1040(96.78 ± 0.65%; P >0.0001)에 의한 바이러스 감소와 비교하여, 거의 10배 더 높은 농도의 PD-0184264가 후대 인플루엔자 바이러스의 유사한 감소를 달성하기 위해 필요하다. 이는 또한 CI-1040과 비교하여 PD-0184264의 EC50 값과도 일치한다. PD-0184264의 경우 EC50 값은 0.804μM이다(도 17b). 다른 연구에서, RBI에 대한 CI-1040의 EC50 값은 0.026μM로서 결정될 수 있다(참조: Haasbach et al. 2017). > 1576(도 17c)의 PD-0184264 CC50 값은 CI-1040과 비교하여 더 높다(> 312.3μM; Haasbach et al. 2017). 따라서, PD-0184264는 S.I. = 1960(선택성 지수)을 갖는다.
요약/토론
결과는 CI-1040과 비교하여 세포 배양물에서, 즉 시험관내에서 PD-0184264의 감소된 항바이러스 활성을 입증한다. 시험관내 검정에서의 CI-1040과 동일한 바이러스 바이러스 감소를 달성하기 위해서 거의 10배 더 높은 농도의 PD-0184264가 필요하다. 이 두 화합물 사이의 EC50 값 차이는 훨씬 더 두드러진다. 여기서, PD-0184264의 EC50 값은 CI-1040의 EC50 값과 비교하여 31배 더 높다(참조: Haasbach et al. 2017). A549 세포 상의 RB1에 대한 PD-0184264의 S.I.는 또한 CI-1040 발달과 비교하여 감소된다.
실시예 11: PD-0184264에 의한 마우스 폐에서 바이러스 역가의 생체내 감소
(A) H1Nlpdm09 감염 후 암컷 C57BL/6 마우스를 2.8, 8.4 또는 25mg/kg PD-0184264(왼쪽) 또는 25, 75 또는 150mg/kg CI-1400(왼쪽)으로 경구 경로로 처리했다. 감염 24시간 후에 동물을 사멸시키고, 폐를 취하여 10% 현탁액을 제조했다. 바이러스 역가는 표준 방법을 사용하여 결정되었다. 2개의 MEK 억제제로 처리된 마우스의 바이러스 역가를 용매(대조군) 단독으로 처리된 마우스의 바이러스 역가와 비교했다. 대조군 마우스의 폐에서 바이러스 역가를 100%(검정 막대)로 설정했다. Graphpad Prism 7 소프트웨어를 사용하여 두 도면을 예시했다.
약물
CI-1040[2-(2-클로로-4-요오도페닐아미노)-N-(사이클로프로필메톡시)-3,4-디 플루오로 벤즈아미드; 로트: CC-5395.0-16] 및 PD-0184264(PD0184264)[2-(2-클로로-4-요오도페닐아미노)-N-3,4-디플루오로 벤조산; 로트: CC-5595.4-10]를 ChemCon GmbH(독일 프라이부르크)에서 합성했다.
25mg/kg의 경구 적용을 위해, 2.5mg의 PD-0184264를 50㎕ DMSO(Sigma-Aldrich, Germany)에 용해시키고, 0.15ml 크레모포어 EL(Merck-Millipore, Germany) 및 0.8ml PBS(Gibco, Germany)로 추가로 희석시켰다. 8.4mg/kg 및 2.8mg/kg의 적용을 위해, 0.84mg 또는 0.28mg PD-0184264를 50μl DMSO(Sigma-Aldrich, Germany)에 용해시키고, 0.15ml 크레모포어 EL/0.8ml PBS로 추가로 희석시켰다. 202.5mg CI-1040을 0.5ml DMSO/0.15ml 크레모포어 EL/0.8ml PBS에 용해시키고, 크레모포어 EL 및 PBS로 추가로 희석시켰다.
동물
투여시 체중이 21.0 내지 24.0g인 8주령 암컷 C57BI/6 마우스(Charles River Laboratories)를 항바이러스 연구에 사용했다. 동물은 정상적으로 먹이를 주었다. 식수는 자유롭게 이용할 수 있었다.
약물 적용
약물은 시험 1일째에 경구 위관 영양법에 의해 단일 투여를 사용하여 투여했다. 적용 속도는 200㎕의 투여 용적으로 투여량당 15초였다.
폐 바이러스 적정 검정
감염 24시간 후 마우스를 희생시키고, 폐를 칭량하고, 용해 매트릭스 D 튜브(MP Bio)로 옮기고 BSS를 폐의 10배 용적의 양으로 적용했다. FastPrep FP 120(Savant)을 사용하여 장기를 파쇄했다. 세포 잔해물을 제거하기 위해, 균질물을 2000rpm에서 15분 동안 원심분리하고, 상청액을 수집했다. 균질물에서의 바이러스 역가의 결정은 이미 기재된 바와 같이 AVICELR 플라크 검정을 사용하여 수행 되었다(참조: Haasbach et al. 2011, Mastrosovich et al. 2006).
요약/토론
도 18은 실험 결과를 도시한다. 대조군 실험과 비교하여, 75mg/kg 이상의 농도의 CI-1040만이 바이러스 역가의 감소에 임의의 영향을 나타냈다. 대조적으로, PD-0184264는 이미 약 2.8mg/kg의 농도에서 폐에서 바이러스 역가의 약 70%로의 감소를 나타냈다. 8.4mg/kg의 농도에서, 바이러스 역가는 약 20%의 양으로 감소되는 반면, 약 25mg/kg에서 바이러스 역가는 약 10%로 감소된다. 따라서, 항바이러스 효과에 대한 PD-0184264의 높은 잠재력을 강조하는 150mg/kg CI-1040과 유사한 효과를 달성하기 위해 6배 더 낮은 농도의 PD-0184264가 필요하다.
실시예 12: PD-0184264는 CI-1040과 비교하여 더 높은 생체 이용률을 갖는다
(A) 수컷 NMRI 마우스를 정맥내 경로로 75mg/kg CI-1040(암회색 영역) 또는 75mg/kg PD-0184264로 처리했다. 투여 후 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간 및 24시간(시험 2일)에 혈액을 수집하고, 혈장을 약물의 존재에 대해 분석했다. (B) 수컷 NMRI 마우스를 경구 위관 영양법을 사용하여 150mg/kg CI-1040(암회색 영역) 또는 150mg/kg PD-0184264로 경구 처리했다. 투여 후 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간 및 24시간(시험 2일)에 혈액을 수집하고, 혈장을 약물의 존재에 대해 분석했다. 각 데이터 포인트는 3개의 혈장 샘플의 평균 값을 나타낸다. Graphpad Prism 7 소프트웨어를 사용하여 두 도면을 예시한다.
약물
CI-1040[2-(2-클로로-4-요오도페닐아미노)-N-(사이클로프로필메톡시)-3,4- 디플루오로 벤즈아미드; 로트: CC-5395.0-15] 및 PD-0184264(PD0184264)[2-(2-클로로-4-요오도페닐아미노)-N-3,4-디플루오로 벤조산; 로트: CC-5595.4-10]를 ChemCon GmbH(독일 프라이부르크)에서 합성했다. i.v. 적용을 위해, 30.65mg CI-1040을 0.075ml DMSO(Sigma-Aldrich, Switzerland)에 용해시키고, 0.225ml 크레모포어 EL(Merck-Millipore, Germany) 및 2.7ml PBS(Gibco, Germany)로 추가로 희석시켰다. 34.88mg PD-0184264를 0.075ml DMSO에 용해시키고, 0.225ml 크레모포어 EL/2.7ml PBS로 추가로 희석시켰다. 경구 적용을 위해, 202.5mg CI-1040을 0.5ml DMSO/1.5ml 크레모포어 EL/8.0ml PBS에 용해시켰다. 81.0mg PD-0184264를 0.2ml DMSO/0.6ml 크레모포어 EL/3.2ml PBS에 용해시켰다.
동물
투여시 체중이 23.9 내지 36.5g인 8주령 수컷 NMRI 마우스(Charles River Laboratories, Germany)를 약동학 연구에 사용했다. 동물은 정상적으로 먹이를 주었다. 식수는 자유롭게 이용할 수 있었다.
혈액 샘플링 및 혈장의 준비
실험은 LPT GmbH(독일 함부르크)에서 수행되었다. 충분한 전혈- 이소플루란 마취하에 취함-을 수집하여 다음 시간에 그룹 및 시점당 3마리 동물의 2 x 100μL Li-헤파린 혈장을 수득했다: 0(투여전), 투여 후 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간 및 24시간(시험 2일). 전혈 샘플은 철수 후 0.5시간 이내에 원심분리할 때까지 Iso-Therm-Rack 시스템(Eppendorf AG, Germany)을 사용하여 즉시 냉각시켰다. 원심분리 직후에, 샘플을 추가의 분석까지 -20℃에서 저장했다. 혈장 분석은 Prolytic GmbH(독일 프랑크푸르트)에서 표준 절차를 사용하여 수행되었다.
약물 적용
약물은 시험 1일째에 경구 위관 영양법 또는 꼬리 정맥에 정맥내 볼루스 주사에 의해 단일 투여를 사용하여 투여했다. 주입 속도는 200㎕의 투여 용적으로 15 초/투여량이었다.
결과
약동학적 실험 결과은 CI-1040의 값보다 훨씬 높은 1953.68㎍*h/ml PD-0184264의 AUC 값을 갖는 CI-1040과 비교하여 마우스의 혈장에서 i.v. 후(도 19a) 및 경구(도 19b) 적용에 의해 PD-0184264의 더 높은 노출이 발견되었다는 것을 나타냈다. CI-1040의 i.v. 적용 및 경구 적용 후 8시간에 혈장에서 약물이 거의 검출되지 않았음을 주목한다. 대조적으로, PD-0184264 2의 경구 적용 후 8시간 데이터 포인트에서 여전히 높은 농도가 발견되었다.
요약/토론
단일 i.v. 적용 후 PD-0184264 및 CI-1040에 대한 혈장 노출의 급격한 차이는 이미 CI-1040이 빠르게 저하될 수 있다는 가정을 일으킨다. 본 발명자들은 약물이 단일 지수 방식으로 감소한다고 가정했다. 일반적으로, 이 가정은 유효하다. 낮은 농도에서, 약물은 일반적으로 단일 지수 방식으로 감소한다. 그리고, 말기 제거 속도 상수는 경시적으로 또는 상이한 농도의 순환 약물에 따라 변하지 않는다. 그럼에도 불구하고, 이 시점에서 본 발명자들은 장간 원과 같은 다른 과정이 약동학적 프로파일의 말기 단계에서 중요한 역할을 하는지의 여부를 알 수 없다.
종합하면, PD-0184264는 생체내 CI-1040보다 높은 항바이러스 활성을 나타내며, 이는 약물의 더 높은 생체 이용률에 기초할 수 있다.
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Claims (20)
- 박테리아 감염의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
- 바이러스성 질환의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
- 박테리아 감염 및 바이러스성 질환을 포함하는 동시 감염(co-infection)의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 바이러스가 음성 가닥 RNA 바이러스인, PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
- 제4항에 있어서, 상기 바이러스가 인플루엔자 바이러스인, PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
- 제5항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스가 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스인, PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
- 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 박테리아 감염이 스타필로코카시에(Staphylococcaceae), 스트렙토코카시에(Streptococcaceae), 레지오넬라시에(Legionellaceae), 슈도모나다시에(Pseudomonadaceae), 바실라시에(Bacillaceae), 클라미디아시에(Chlamydiaceae), 마이코플라스마타시에(Mycoplasmataceae), 엔테로박테리아시에(Enterobacteriaceae), 슈도모나달레스(Pseudomonadales) 및 파스테우렐라시에(Pasteurellaceae)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 박테리아에 의해 매개되는, PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
- 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 뉴라미니다제 억제제 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 조합하여 투여되는, PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
- 제8항에 있어서, 상기 뉴라미니다제 억제제가 오셀타미비르, 오셀타미비르 포스페이트, 자나미비르, 라니나미비르 또는 페라미비르 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는, PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
- PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 약제학적 조성물.
- 제10항에 있어서, 뉴라미니다제 억제제 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
- 추가의 MEK 억제제를 포함하는 제1항 내지 제11항의 임의의 사용.
- 대상체, 바람직하게는 척추동물에서 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 사용을 위한 PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
- PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 박테리아 감염의 치료 방법.
- PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 바이러스성 질환의 치료 방법.
- PD-0184264 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 박테리아 감염 및 바이러스성 질환을 포함하는 동시 감염의 치료 방법.
- 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 바이러스가 음성 가닥 RNA 바이러스인, 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 바이러스가 인플루엔자 바이러스인, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스가 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스인, 방법.
- 제14항 또는 제16항에 있어서, 상기 박테리아 감염이 스타필로코카시에, 스트렙토코카시에, 레지오넬라시에, 슈도모나다시에, 바실라시에, 클라미디아시에, 마이코플라스마타시에, 엔테로박테리아시에, 슈도모나달레스 및 파스테우렐라시에로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 박테리아에 의해 매개되는, 방법.
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