CN111479566B - 用于治疗病毒和细菌感染的新mek抑制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于预防和/或治疗包括细菌感染和流感病毒感染的合并感染或单纯病毒或细菌感染的方法中的PD‑0184264。还提供包括用于预防和/或治疗包括细菌感染和流感病毒感染的合并感染或单纯病毒或细菌感染的方法中的抑制剂的组合物。
Description
背景技术
甲型流感病毒是导致高发病率和高死亡率的严重呼吸系统疾病的病因。流感病毒感染过程中的大多数死亡病例实际上是由不同细菌，如金黄色葡萄球菌(S.aureus)、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌(Morens等人，2008；Chertow等人，2013)引起的继发性肺炎所致。细菌合并感染最棘手的问题是突然增强的致病性(Iwao等人，2012；Paddock等人，2012；Parker等人，2012)以及针对不同病原体有限的有效抗感染药物库。流感病毒的高变异性和新病毒株的不断出现(Neumann等人，2009；Taubenberger等人，2010；Parry，2013)，细菌菌株的独特性(Grundmann等人，2006；Moran等人，2006；Gillet等人，2007；Shilo等人，2011)，以及流感病毒(Hayden等人，1992；Bright等人，2006；Pinto等人，2006；De Clercq等人，2007；Pinto等人，2007)和细菌(Grundmann等人，2006；Moran等人，2006；Shilo等人，2011)两者对现有药物/抗生素的快速耐药性发展是治疗方案不佳的主要原因。
WO 2001/076570提供了用MEK抑制剂来治疗或预防由(-)RNA病毒，特别是由流感病毒引起的感染的概念。WO 2014/056894提供了特定的MEK抑制剂，如AZD-6244、AZD-8330、RDEA-119、GSK-1120212(曲美替尼，Trametinib)、GDC-0973(Cobimetinib)、CI-1040、PD-0325901、RO-5126766和MSC1936369(AS-703026)用于治疗或预防流感病毒感染。在WO2015/173788 A1中公开了MEK抑制剂用于治疗流感病毒和细菌合并感染的方法中。
然而，尽管已经知道少数有前景的MEK抑制剂且已被提供用于治疗或预防病毒感染，特别是流感病毒感染，以及伴随病毒感染特别是流感感染的细菌合并感染，但是对于提供进一步理想的改进的MEK抑制剂以用于此种应用同时还特别应用于治疗细菌感染的需求仍然存在。因此，本申请解决的技术问题就是满足这一需求。
发明内容
解决所述技术问题的技术方案是提供PD-0184264，一种CI-1040的代谢产物，其应用于治疗或预防病毒性疾病(例如流感病毒感染)、细菌感染或包括细菌感染和病毒性疾病的合并感染。该方案也反映在下文描述的实施方案和权利要求中，并在实施例和附图中加以说明。本申请的发明人惊奇地发现，MEK抑制剂CI-1040的代谢产物PD-0184264具有比CI-1040本身更强的抗病毒和抗菌活性。因此，通过为病毒感染(特别是流感病毒感染)，以及病毒(特别是流感病毒)、细菌合并感染和细菌感染提供一种更有效的治疗方案，PD-0184264的应用解决了本申请所面临的技术问题。
尽管MEK抑制剂CI-1040已知在治疗或预防流感病毒感染和流感病毒或细菌合并感染方面有效，但发明人发现CI-1040的一种代谢产物(PD-0184264，式1)与CI-1040自身相比，在针对流感病毒和/或细菌感染或包括流感病毒和细菌感染的合并感染方面更有效。PD-0184264是CI-1040的几种代谢产物之一(Wabnitz等人，2004；LoRusso等人，2005)，但代谢产物比CI-1040更有效，既不是已知的也不是可以预测的。令发明人相当吃惊的是，他们确实发现一种代谢产物(PD-0184264，下面的结构式1)比CI-1040更有效并且具有更强的治疗潜力，就如在实施例中示出的那样。PD-0184264的这一特性是令人意想不到的，因为PD-0184264实际上在体外对MEK激酶的抑制作用比CI-1040弱(见实施例9)。此外，体外试验显示PD-0184264的抗病毒作用弱于CI-1040(见实施例10)，而体内试验则令人吃惊地显示出PD-0184264比CI-1040强得多的抗病毒作用(见实施例11)。
因此，本发明涉及PD-0184264或其药学上可接受的盐，其应用于预防和/或治疗细菌感染和/或病毒性疾病的方法中。优选地，引起所述病毒性疾病的病毒是负链RNA病毒，优选流感病毒，更优选甲型流感病毒或乙型流感病毒。
本发明还涉及PD-0184264或其药学上可接受的盐，其应用于预防和/或治疗细菌感染的方法中。所述细菌感染优选由选自葡萄球菌科、链球菌科、军团菌科、假单胞菌科、芽孢杆菌科、衣原体科、支原体科、肠杆菌科、假单胞菌目和/或巴氏杆菌科的细菌介导。
本发明还涉及PD-0184264或其药学上可接受的盐，其应用于预防和/或治疗包括细菌感染和病毒性疾病的合并感染的方法中。
优选地，PD-0184264或其药学上可接受的盐应用于预防和/或治疗包括细菌感染和病毒性疾病的合并感染的方法中，其中所述细菌感染由选自葡萄球菌科、链球菌科、军团菌科、假单胞菌科、芽孢杆菌科、衣原体科、支原体科、肠杆菌科、假单胞菌目和/或巴氏杆菌科的细菌介导。
优选地，PD-0184264或其药学上可接受的盐应用于预防和/或治疗包括细菌感染和病毒性疾病的合并感染的方法中，其中所述病毒是负链RNA病毒，优选流感病毒，更优选甲型流感病毒或乙型流感病毒。
优选地，PD-0184264或其药学上可接受的盐应用于预防和/或治疗病毒性疾病的方法中，其中PD-0184264或其药学上可接受的盐与神经氨酸酶抑制剂或其药学上可接受的盐联合给药。
优选地，PD-0184264或其药学上可接受的盐应用于预防和/或治疗包括细菌感染和病毒性疾病的合并感染的方法中，其中PD-0184264或其药学上可接受的盐与神经氨酸酶抑制剂或其药学上可接受的盐联合给药。
在一个替代的实施方案中，PD-0184264或其药学上可接受的盐应用于预防和/或治疗病毒性疾病的方法中，或应用于预防和/或治疗包括细菌性感染和病毒性疾病的合并感染的方法中，其中，所述神经氨酸酶抑制剂选自奥司他韦、磷酸奥司他韦、扎那米韦、拉尼那米韦或帕拉米韦或其药学上可接受的盐。
本发明还提供一种药物组合物，包括PD-0184264或其药学上可接受的盐和神经氨酸酶抑制剂或其药学上可接受的盐。
优选地，PD-0184264应用于预防和/或治疗病毒性疾病的方法中、和/或预防和/或治疗细菌性疾病的方法中、和/或用于预防和/或治疗包括细菌性感染和病毒性疾病的合并感染的方法中，其中PD-0184264与一种或者多种MEK抑制剂联合。
优选地，PD-0184264或其药学上可接受的盐应用于预防和/或治疗受试者，优选脊椎动物，更优选鸟类或哺乳动物，最优选人的细菌感染、病毒感染或合并感染。
本发明还涉及一种治疗受试者细菌感染的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的PD-0184264或其药学上可接受的盐。
此外，本发明涉及一种治疗受试者病毒性疾病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的PD-0184264或其药学上可接受的盐。
在另一个实施例中，本发明涉及治疗受试者包括细菌感染和病毒性疾病的合并感染的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的PD-0184264或其药学上可接受的盐。
优选地，所述病毒是负链RNA病毒；更优选地，所述病毒是流感病毒；最优选地，所述流感病毒是甲型流感病毒或乙型流感病毒。
优选地，所述细菌感染由选自葡萄球菌科、链球菌科、军团菌科、假单胞菌科、芽孢杆菌科、衣原体科、支原体科、肠杆菌科、假单胞菌目和巴氏杆菌科的细菌介导。
附图说明
附图示出：
图1：以PD-0184264或CI-1040治疗甲型流感病毒感染小鼠。
实施例1的实验结果以病毒滴度(log10)pfu/ml(左)或％病毒滴度(右)示出。
图2：显示PD-0184264和CI-1040对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)生长影响的曲线图。
在不同的时间点，如曲线图横坐标轴所示，测量无细胞的细菌培养物的光密度作为细菌生长的指标，结果在曲线图的纵坐标轴上以％(OD600)示出。数据表示实施例2中描述的三个生物性样本的平均值。
图3：不同浓度PD-0184264对细菌MRSA生长的抑制作用。
不同浓度的PD-0184264(如图所示)施用于金黄色葡萄球菌(S.aureus)菌株USA300(MRSA)的过夜培养物。6h后检测光密度。图中所示的数据代表实施例2中所描述的三个生物性样本之一的实验结果。
图4：CI-1040和PD-0184264对细菌生长的影响。
(A)不同浓度CI-1040对细菌生长的影响，(B，C)不同浓度PD-0184264对金黄色葡萄球菌菌株6850(B)或菌株USA300(C)的影响。
图5：对单纯或合并感染细胞给予PD-0184264以保护细胞。
人肺上皮细胞(A549)用PD-0184264(按所示的浓度)或溶剂(DMSO)预处理，并感染人流感病毒株A/Puerto Rico/8/34(H1N1)。鉴于PD-0184264的抗病毒和强抗细菌作用(图2至4)，我们分析了在IAV(甲型流感病毒)和/或金黄色葡萄球菌感染引起的导致细胞破坏的致细胞病变效应(cytopathic effects,CPE)方面是否也可以从宏观上观察到该化合物的这一特性。在单纯感染IAV(H1N1)(中间一行)或金黄色葡萄球菌菌株6850(最上一行)后，观察到细胞单层的轻微破坏。这种致细胞病变效应(CPE)在两种病原体合并感染时显著增强(最下一行)，但随PD-0184264浓度增加而被抑制。
图6：PD-0184264与常用抗生素的抗菌作用比较。
为了将MEK抑制剂PD-0184164的抗菌性能和常用抗生素的抗菌作用对标，我们用溶剂、MEK抑制剂U0126和PD-0184264或不同浓度的抗生素庆大霉素处理细菌过夜。与溶剂处理的菌株相比，第一代MEK抑制剂U0126孵育仅引起细菌滴度的轻微降低，而PD-0184264处理却导致细菌负荷的极大降低。两种菌株结果都是如此。
图7：(a)比较PD-0184264与其他MEK抑制化合物或抗生素庆大霉素抗菌作用的添加时间(time-of-addition)的结果。
(b)与庆大霉素、红霉素处理或未做处理的菌株对照，金黄色葡萄球菌对MEK抑制剂PD0184264的耐药性试验结果。
图8：细菌激酶PknB的结构域(上图)(Rakette等人2012年)以及PknB的自磷酸化位点与哺乳动物MAP激酶p38、JNK和直接MEK靶点ERK激活位点的序列同源性(Miller等人2010年)。
图9：确定抑制剂处理对不同抗生素最小抑菌浓度(MIC)的影响。
图10：金黄色葡萄球菌菌株6850和MRSA菌株USA300经PD-0184264处理后的耐逆性。
图11：以PD-0184264处理破坏不同血清型肺炎链球菌的生长。
(A)通过OD600反映的PD-0184264对肺炎链球菌菌株TIGR4(血清型4)和D39wt(血清型2)培养物的影响；(B)以CFU/ml示出的PD-0184264对肺炎链球菌菌株TIGR4(血清型4)和D39wt(血清型2)培养物的影响；(C)：以CFU/ml示出的PD-0184264对枯草芽孢杆菌培养物的影响。
图12：表1：抗生素
图13：
图中显示，对于单纯细菌(金黄色葡萄球菌)或病毒(流感病毒)感染和合并感染，用PD-0184264处理细胞可显著降低病原体诱导的CPE(致细胞病变效应)。
图14：图表显示出以CI-1040(a)或PD-0184264(b)处理后细胞内细菌负荷的变化。
在持续性感染后期给予CI-1040或PD-0184264，取得了类似的结果(c)。
图15：图表示出细胞活力(A，B)和细胞膜破裂(C，D)。
(A，B)示出在PD-0184264浓度升高的情况下A549细胞的活力。在(C)和(D)中示出，进行乳酸脱氢酶检测(LDH-Assay)以确定由于抑制剂处理而导致的细胞膜破裂。
图16：显示CI-1040和PD-0184264对MEK通路的抑制作用的无细胞激酶试验。
通过酶联免疫吸附(ELISA)试验确定磷酸化靶蛋白ERK的含量来检测酶的活性。开展了三个独立的实验系列，均示出了相似的结果。本文介绍了其中一个具有代表性的实验。
图17：在体外试验中，PD-0184264对流感病毒H1N1pdm09的抗病毒活性。
(A)用病毒感染A549细胞(MOI＝0.001)以测定病毒滴度的降低。(B)A549细胞用病毒RBI(MOI＝0.001)感染，并用不同浓度的PD-0184264(100μM、50μM、10μM、5μM、1μM、0.5μM和0.1μM)处理以测定EC50值。(C)A549细胞用不同浓度的PD-0184264(100μM、50μM、10μM、5μM、1μM、0.5μM和0.1μM)处理24小时，然后进行4小时的WST染色，以测定CC50值。
图18：PD-0184264体内降低小鼠肺部病毒滴度。
H1N1pdm09病毒感染后，雌性C57BL/6小鼠分别经口服给予2.8、8.4或25mg/kg PD-0184264(左柱)或25、75或150mg/kg CI-1400(右柱)。感染后24小时处死动物，用标准方法测定病毒滴度。
图19：与CI-1040相比较，PD-0184264具有更优的生物利用度。
(A)雄性NMRI小鼠静脉注射75mg/kg CI-1040(暗灰色区)或75mg/kg PD-0184264。给药后15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时和24小时(试验第2天)采集血液，分析血浆中存在的药物。(B)雄性NMRI小鼠150mg/kg CI-1040(暗灰色区域)或150mg/kgPD-0184264经口灌胃给药。给药后15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时和24小时(试验第2天)采集血液，分析血浆中存在的药物。
具体实施方式
以下描述包括对理解本发明可能有用的信息。但并不是承认本文提供的任何信息都是现有技术或与本申请要求保护的发明相关，也不是承认明确或间接引用的任何出版物都是现有技术。
如上所述，本发明涉及PD-0184264，其应用于预防和/或治疗病毒性疾病、细菌感染或包括细菌感染和病毒感染的合并感染的方法中。如实施例所示，PD-0184264似乎作用于细菌激酶PknB，并因此至少部分地可以发挥其抑菌作用。
此外，如所附实施例所示，PD-0184264对病毒和细菌感染的情况以及细菌和病毒合并感染的情况显示有效。这种作用比CI-1040出人意料地强得多，CI-1040是一种现有技术已知的用于治疗细菌和病毒感染的MEK抑制剂。当如实施例9所示比较CI-1040和PD-0184264对MEK激酶的抑制作用时，实际上本来预期的是相反的结果，因为在现有技术中MEK抑制剂就是用来实现所述效果的。
在体外试验中比较PD-0184264和CI-1040的抗病毒作用，结果确是如此。此处，从实施例10可以看出，CI-1040比PD-0184264更有效。具体地说，在体外试验中，PD-0184264需要高出10倍的浓度才能达到同样的抑制效果。出人意料的是，尽管发现体外抑制作用较弱，但从实施例11可以看出PD-0184264在体内的抑制作用优于CI-1040。如图18所示，2.8mg/kg的PD-0184264已经显示降低病毒滴度，而25mg/kg的PD-0184264显示肺中的病毒滴度至少降低90％。相反，CI-1040仅在150μM时才显示出类似的滴度降低。此外，实施例1显示PD-0184264降低了肺中的病毒滴度。在实施例1中，小鼠感染流感病毒，并分别用150mg/kg、75mg/kg或25mg/kg CI-1040或PD-0184264治疗。如图1所示，25mg/kg PD-0184264就具有与150mg/kg CI-1040相同的效果。因此，令发明人非常惊讶的是，尽管之前的体外实验数据并没有提供任何继续研究PD-0184264的启示，PD-0184264却在体内显示出很强的抗病毒作用。这种令人惊讶的效果可能是基于与CI-1040相较，PD-0184264具有更高的生物利用度，如实施例12所示。
实施例2、4和实施例6-8还显示了与CI-1040和其他MEK抑制剂相比，PD-0184264具有强抗菌作用。在实施例2中，分析了PD-0184264对细菌生长的影响。图2显示PD-0184264抑制细菌生长，而CI-1040对细菌生长没有影响。在图3中，PD-0184264以浓度依赖的方式抑制细菌生长，显示从50μM PD-0184264开始细菌生长几乎完全抑制。类似地，图4也显示PD-0184264以浓度依赖的方式抑制细菌生长——10μM PD-0184264就显示细菌生长的显著减少——而CI-1040对细菌生长没有影响。在实施例4中，将PD-0184264的抗菌效果与MEK抑制剂U0126或抗生素庆大霉素进行比较。图6显示PD-184264具有与庆大霉素相似的抗菌作用，而现有技术已知的MEK抑制剂U0126对细菌生长没有影响。图7A也是如此，其中监测了细菌的生长过程。在图7B中，还显示PD-0184264没有诱导对PD-0184264的抗性，而细菌很容易对庆大霉素和红霉素产生抗性。因此，PD-0184264不会诱导细菌产生抗性。在实施例6中，分析了PD-0184264细菌对抗生素敏感性的影响。如图9和表2所示，用PD-0184264治疗确实导致细菌对不同抗生素的敏感性增加，这对青霉素和庆大霉素而言最为突出。此外，图10显示PD-0184264降低了细菌的耐逆性。实施例7提供证据表明PD-0184264的作用不限于金黄色葡萄球菌，对其它细菌如肺炎链球菌(参见图11A和B)和枯草芽孢杆菌(参见图11C)也有效。
实施例3和实施例8强调了PD-0184264在细菌和病毒合并感染的情况下的疗效。实施例3分析了病毒和/或细菌感染引起的导致细胞破坏的致细胞病变效应(CPE)是否也可以从宏观上观察到PD-0184264的疗效。图5显示，PD-0184264以浓度依赖的方式降低致细胞病变效应，特别是由细菌和病毒合并感染引起的致细胞病变效应，在15μM PD-0184264时就已经显示出效果。在实施例8中也分析了同样的情况，图13再次显示了PD-0184264在细菌和病毒合并感染情况下的积极作用。实施例8进一步分析了在合并感染情况下PD-0184264对细胞内细菌滴度的影响。图14显示PD-0184264降低了细胞内细菌滴度，而CI-1040没有作用。此外，实施例8和图15显示PD-0184264没有细胞毒性作用。
PD-0184264能够用于治疗和/或预防本文所述疾病的方法中。因此，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”包括向患有包括细菌感染和病毒性疾病的合并感染的受试者施用PD-0184264，优选以药物形式施用，以减轻或改善伴随此类感染的症状。类似地还包括向患有细菌感染的受试者或者为了减轻或改善伴随此类感染的症状而施用PD-0184264，优选以药物的形式施用。另外还包括向患有病毒感染的受试者或为了减轻或改善伴随此类感染的症状而施用PD-0184264，优选以药物的形式施用。包括细菌感染和病毒性疾病的合并感染、病毒性疾病和细菌感染是PD-0184264或其药学上可接受的盐治疗或预防的疾病。
此外，本文所使用的术语“预防”是指旨在防止本文所述的疾病发生的任何医疗或公共卫生程序。如本文所使用的，术语“防止(prevent)”、“防止(prevention)”和“防止(preventing)”是指降低发生或发展特定疾病的风险，即如本文所述的包括病毒感染和细菌感染的合并感染、单纯细菌感染或单纯病毒感染。“预防”的另一含义是减少或抑制受试者包括流感病毒感染和细菌感染的合并感染、单纯细菌感染或单纯病毒感染的复发。
如实施例3和8所示，本发明的PD-0184264在治疗合并感染方面是有效的。本文所使用的“合并感染”包括病毒性疾病，优选流感病毒感染，和细菌感染。这种合并感染可通过宿主(如受试者和/或单个细胞)同时感染细菌和流感病毒而发生。也可能是宿主(如受试者和/或细胞)同时感染一种或多种病毒颗粒和一种或多种细菌。然而，这样的合并感染也可以先后发生。在这种情况下，受试者和/或细胞首先被一种或多种病毒颗粒感染，随后同一受试者和/或细胞被一种或多种细菌感染，反之亦然。两次感染之间的时间间隔最多为14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、1天、12小时、6小时、3小时、1.5小时或至少30分钟。
这种情况也可以是重叠感染，在这种情况下，第二次感染与先前的感染重叠，特别是由不同的对第一次感染的治疗耐药的外源或内源的微生物带来的重叠。
在所述合并感染的流感病毒感染中，流感病毒感染可以由甲型流感病毒或乙型流感病毒介导，优选甲型流感病毒为H1N1、H2N2、H3N2、H5N6、H5N8、H6N1、H7N2、H7N7、H7N9、H9N2、H10N7、N10N8或H5N1。在一个实施方案中，所述甲型流感病毒是H1N1。在其它实施方案中，所述甲型流感病毒为H3N2、H5N1和H7N9。在另外的实施方案中，所述甲型流感病毒为H3N2、H5N1、H1N1、H5N6、H7N2和H7N9。
本发明还涉及“细菌感染”，它可以发生在上述合并感染的过程中，或者可以作为存在于宿主(例如受试者和/或细胞)中的唯一感染而发生。所述细菌感染可由任何细菌介导；优选地，所述感染由选自葡萄球菌科、链球菌科、军团菌科、假单胞菌科、芽孢杆菌科、衣原体科、支原体科、肠杆菌科、假单胞菌目和/或巴氏杆菌科的细菌介导。
所述细菌感染可由选自葡萄球菌属(优选金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、甲氧西林敏感和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-sensitive andmethicillin-resistant Staphylococcus aureus)、杀白细胞素表达的金黄色葡萄球菌(Panton-Valentine leucocidin(PVL)-expressing Staphylococcus aureus))和/或链球菌属(优选缓症链球菌(Streptococcus mitis)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)或肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia))、军团菌属(优选嗜肺军团菌(Legionellapneumophila))、假单胞菌属(优选铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、芽孢杆菌属(优选枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、嗜衣原体属(优选肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumonia))、支原体属(优选肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia))、克雷伯氏菌属(优选肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia))、莫拉氏菌属(优选卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis))和/或嗜血杆菌属(优选流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenza))的细菌介导。优选地，所述细菌选自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)或流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenza)。最优选地，所述细菌是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
本发明还涉及的所述“病毒性疾病”或“病毒感染”可以发生在上述合并感染的过程中，或者可以作为存在于宿主(例如受试者和/或细胞)中的唯一感染而发生。所述病毒性疾病或病毒感染可以由任意病毒介导；优选由流感病毒介导。更优选地，所述流感病毒感染由甲型流感病毒或乙型流感病毒介导，其中优选甲型流感病毒。特别优选的是甲型流感病毒亚型H1N1、H2N2、H3N2、H5N6、H5N8、H6N1、H7N2、H7N7、H7N9、H9N2、H10N7、N10N8和/或H5N1。
在一个可供替代的实施方案中，PD-0184264与一种或多种MEK抑制剂联合给药。MEK抑制剂包括例如U0126、PLX-4032、AZD6244、AZD8330、AS-703026、GSK-1120212、RDEA-119、RO-5126766、RO-4987655、CI-1040、PD-0325901、GDC-0973、TAK-733、PD98059、ARRY-438162、ARRY-162、ARRY-300、PF-3644022和PD184352。所述其它的MEK抑制剂和PD-0184264可以同时、在其之前或在之后给药。
优选地，PD-0184264用于预防和/或治疗本发明所述的合并感染的方法中，其中PD-0184264与靶向流感病毒或细菌的一种或多种抑制剂联合使用。PD-0184264和所述针对流感病毒的一种或多种抑制剂可以同时、在其之前或在之后给药。
一般而言，靶向流感病毒的抑制剂是流感治疗中有效的任何抑制剂或药物。已知多种物质对减轻流感病毒感染都是有效的。其中，例如有抗病毒神经氨酸酶抑制剂、靶向病毒离子通道蛋白(M2)的化合物以及通过干扰病毒聚合酶复合物的成分(PB1、PB2、PA或NP)而靶向病毒聚合酶或核酸内切酶活性的化合物。本发明还包括了所述抑制剂的药学上可接受的盐。然而，如本文所述，优选的抑制剂是MEK抑制剂，特别优选PD-0184264。
“MEK抑制剂”通过抑制MEK(有丝分裂原活化蛋白激酶激酶)来抑制细胞或受试者的有丝分裂原信号级联通路Raf/MEK/ERK。这种信号级联通路被许多病毒，特别是被流感病毒利用，以促进病毒复制。因此，在瓶颈MEK处特异性阻断Raf/MEK/ERK通路会破坏病毒特别是流感病毒的生长。此外，MEK抑制剂对人体毒性低且副作用小。MEK抑制剂也没有诱导病毒耐药的趋势(Ludwig，2009年)。特别优选的抑制剂是PD-0184264。
“神经氨酸酶抑制剂”是一种靶向流感病毒的抗病毒药物，其通过阻断病毒神经氨酸酶蛋白的功能而发挥作用，从而阻止病毒从受感染的宿主细胞中释放，因为新产生的病毒无法从其复制的细胞中出芽。还包括神经氨酸酶抑制剂药学上可接受的盐。优选的神经氨酸酶抑制剂是奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦、拉尼那米韦或这些物质中任何一种的药学上可接受的盐，例如磷酸奥司他韦、羧酸奥司他韦等。最优选的神经氨酸酶抑制剂是磷酸奥司他韦、扎那米韦、奥司他韦或帕拉米韦。
靶向病毒离子通道蛋白(M2)的化合物是例如金刚烷胺和/或金刚乙胺，通过干扰病毒聚合酶复合物的成分(PB1、PB2、PA或NP)而靶向病毒聚合酶或核酸内切酶活性的化合物是例如NP阻断剂核苷或聚合酶抑制剂T-705(法匹拉韦(Favipiravir))。
此外，PD-0184264可与一种或多种靶向细菌的抑制剂联用。实施例6表明PD-0184264增强了细菌对抗生素的敏感性。靶向细菌的抑制剂可以是任何对减少细菌感染有效的抑制剂。在本发明中，PD-0184264是特别优选作为靶向细菌的抑制剂，但本领域技术人员已知的另一种靶向细菌的抑制剂是抗生素。优选的抗生素可从表1中获知(图12)。因此，在一个实施方案中，所述抗生素选自如表1所列的抗生素(图12)。在还有一个实施方案中，所述抗生素选自如表1所列的抗生素类别(图12)。在另一个实施方案中，抗生素选自如表1所列抗生素的通用名称(图12)。更优选的抗生素为庆大霉素、利福平、溶葡球菌酶、红霉素、左氧氟沙星、万古霉素、替考拉宁、青霉素和苯唑西林。
所述“受试者”，其可被所述抑制剂，特别是MEK抑制剂或本发明所述抑制剂组合治疗，优选为脊椎动物。在本发明的上下文中，术语“受试者”包括需要治疗如本文所述的合并感染或单纯的细菌或病毒感染的个体。优选地，所述受试者是患有合并感染或单纯细菌或病毒感染或有感染风险的患者。优选地，所述病患是脊椎动物，更优选哺乳动物。哺乳动物包括但不限于农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、小鼠和大鼠。优选地，哺乳动物是人、马、狗、猫、牛、猪、小鼠、大鼠等，特别优选地，是人。在一些实施方案中，所述受试者是人类受试者，其任选地为1岁以上和14岁以下、50岁到65岁、18岁或50岁之间、或65岁以上。在其他实施方案中，所述受试者是人类受试者，其选自至少50岁的受试者，居住在慢性病护理机构中的受试者，患有肺或心血管系统慢性疾病的受试者，因慢性代谢疾病、肾功能不全、血红蛋白病或免疫抑制而在上一年需要定期进行医疗随访或住院治疗的受试者，14岁以下的受试者，6个月至18岁接受长期阿司匹林治疗的受试者，以及在流感季节将处于孕中期或孕晚期的妇女。
在本发明所述方法中，PD-0184264可经口、静脉、胸膜内、肌肉内、局部或经吸入给药。优选地，PD-0184264通过吸入、局部或口服给药。
本发明还包括不同的组合物，优选药物组合物。本发明涉及一种包含PD-0184264的组合物，所述组合物用于预防和/或治疗包括细菌感染和病毒性疾病的合并感染的方法中。本发明类似地涉及一种包含PD-0184264的组合物，所述组合物用于预防和/或治疗细菌感染和/或病毒性疾病的方法中。本发明还提供一种包含PD-0184264和一种或多种靶向病毒(特别是流感病毒)和/或细菌的抑制剂，所述组合物用于预防和/或治疗包括细菌感染和病毒感染(尤其是流感病毒感染)的合并感染的方法中。此外，本发明还涉及一种包含PD-0184264和一种或多种靶向细菌的抑制剂的组合物，所述组合物用于预防和/或治疗细菌感染或病毒感染的方法中。
如上所述，包含PD-0184264和最终一个或多个靶向细菌的抑制剂和/或一个或多个靶向病毒(特别是流感病毒)的抑制剂的组合物可以是药物组合物。所述药物组合物的一个优选实施方案包括PD-0184264和靶向流感病毒的抑制剂，特别是神经氨酸酶抑制剂。在另一个实施方案中，所述药物组合物包括PD-0184264和另一种MEK抑制剂。优选地，所述组合物还包括载体，优选为药学上可接受的载体。所述组合物可以是经口服可给药的悬浮液或片剂、鼻喷雾剂、吸入装置用制剂、无菌注射制剂(静脉注射、胸膜内注射、肌肉注射)的形式，例如，可以是无菌注射的水性或油性悬浮液或栓剂。
用于本发明且包含PD-0184264和任选地一种或多种靶向流感病毒的抑制剂和/或一种或多种靶向细菌的抑制剂的药物组合物施用于患者，所述患者是哺乳动物或鸟类。适宜的哺乳动物的例子包括但不限于小鼠、大鼠、牛、山羊、绵羊、猪、狗、猫、马、豚鼠、犬、仓鼠、水貂、海豹、鲸鱼、骆驼、黑猩猩、恒河猴和人，优选人。适宜的鸟类的例子包括但不限于火鸡、鸡、鹅、鸭、短颈野鸭、绿头鸭、椋鸟、北细尾鸥、海鸥、天鹅、珍珠鸡或水禽，等等。人类患者是本发明的一个特定的实施方案。
所述抑制剂(inhibitor)或抑制剂(inhibitors)优选地以治疗有效量施用。对本领域技术人员而言是显而易见的，PD-0184264或每种活性化合物/抑制剂的“治疗有效量”可随一些因素变化，所述因素包括但不限于所用化合物的活性，所述活性化合物在患者体内的稳定性，需要缓解的疾病的严重程度，所治疗患者的总体重，给药途径，所述化合物在人体内吸收、分布和排泄的难易，待治疗患者的年龄和敏感性，不良反应，等等。能够根据各种因素随时间而变化调整给药量。
本文所述的抑制剂、方法和应用对人类治疗和兽医应用都适用。如本文所述，本文所述的化合物(特别是PD-0184264)和具有理想治疗活性的任意一种或多种靶向流感病毒的抑制剂和/或一种或多种靶向细菌的抑制剂，可以在生理上可接受的载体中给予受试者。根据给药方式的不同，所述化合物可以如下文所述的多种方式来配制。制剂中治疗活性化合物的浓度可在约0.1-100wt.％之间变化。所述药剂可以单独给药，也可以与其他治疗联用。实施例1表明25和75mg/kg PD-0184264口服给药在体内有效。因此，PD-0184264可以在10至100mg/kg PD-0184264剂量范围，优选25至75mg/kg PD-0184264的剂量范围给药。
本发明所述方法中的药物化合物能够以任何合适的单位剂量形式给药。合适的口服制剂可以是片剂、胶囊、悬浮液、糖浆、咀嚼胶，膜剂、酏剂等形式。药学上可接受的载体如粘合剂、赋形剂、润滑剂和甜味剂或矫味剂可以包括在所述口服药物组合物中。如果需要，还可以包括用于改变特定剂型的口味、颜色和形状的常规试剂。
对于注射制剂，所述药物组合物可以是在合适的小瓶或管中与合适的赋形剂混合的冻干粉末。在临床使用前，可以通过将冻干粉末溶解在合适的溶剂体系中以形成适于静脉注射或肌肉注射的组合物来重构所述药物。
PD-0184264与抗病毒剂如神经氨酸酶抑制剂(如奥司他韦)的联用会产生协同作用。所述协同作用可以是抗病毒效果增强导致例如病毒滴度的降低或治疗窗口的加宽。因此，本发明还涉及一种包含治疗有效量的PD-0184264以及一种治疗有效量的神经氨酸酶抑制剂的药物组合物，所述神经氨酸酶抑制剂选自奥司他韦、磷酸奥司他韦、拉尼那米韦、扎那米韦和帕拉米韦。
在一个实施方案中，所述组合物可以是包含治疗有效量(例如0.1mg至2000mg，0.1mg至1000mg，0.1mg至500mg，0.1mg至500mg，0.1mg至200mg，30mg至300mg，0.1mg至75mg，0.1mg至30mg)的上述神经氨酸酶抑制剂的口服给药制剂(例如，片剂或胶囊或糖浆等)。
在另外的实施方案中，PD-0184264用于预防和/或治疗本发明的合并感染的方法中，其中当PD-0184264与体外测试系统接触时，与接触前的体外测试系统进行比较，PD-0184264同时减少病毒和细菌感染，其中所述测试系统包括感染了
a)流感病毒，
b)细菌
的培养细胞。在另一个实施方案中，PD-0184264用于预防和/或治疗本发明的细菌感染的方法中，其中当PD-0184264与体外测试系统接触时，与接触前的体外测试系统相比，PD-0184264减少了细菌感染，其中所述测试系统包括感染了细菌的培养细胞。
因此，本发明还涉及一种体外测试系统，其中所述测试系统包括感染
a)流感病毒和
b)细菌
的培养细胞。
沿着这一思路，本发明还提供了一种体外测试系统，其中所述体外测试系统包括感染细菌的培养细胞。
在体外测试系统包括病毒和细菌感染的情况下，同样，这些感染可以先后或同时发生。
“培养细胞(cultured cell)”或“培养细胞(cultured cells)”是不存在于天然环境中，例如植物或动物中的细胞。相反，培养细胞可以是原代细胞培养物(其包括从它们的自然环境中分离的细胞)或细胞系。优选地，所述培养的细胞是人肺上皮细胞。优选地，所述培养的细胞以约1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×105、10×105、11×105个细胞，最优选8×105个细胞的密度接种在0.5ml、1ml、1.5ml、2ml、2.5ml、3ml、3.5ml、4ml培养基如DMEM中。最优选的密度为2ml DMEM中8×105个细胞。
这些培养细胞被病毒和细菌感染，或者在其它实施方案中仅被细菌感染。如上所述，合并感染可以按先后或同时的方式发生。例如，培养的细胞可以首先被流感病毒感染，30分钟后被细菌感染。也可以在3小时后向培养物中另外加入抗生素以除去胞外细菌。在这种情况下，所述抗生素随后也会被洗掉。在其它实施方案中，所述细胞仅被细菌感染。
本文所用术语“接触”是指使包含流感病毒和细菌的细胞在空间上接近PD-0184264。这例如可以意味着通过注射器将抑制剂施加到所述培养细胞所处的培养基中。
在一个实施方案中，所述病毒感染的减少是指每毫升空斑形成单位数(PFU/ml)的减少，细菌感染的减少是指每毫升菌落形成单位数(CFU/ml)的减少。所述“空斑形成单位数”是度量每单位体积能够形成空斑的颗粒(例如病毒颗粒)的数量。它是一种功能性度量，而不是颗粒绝对量的度量：有缺陷的或不能感染其靶细胞的病毒颗粒将不会产生空斑，因此不会被计数。例如，浓度为1,000PFU/μl的流感病毒溶液表示1μl所述溶液携带足以在细胞单层中产生1000个感染性空斑块的病毒颗粒。在本发明的情况下，与用PD-0184264处理前的培养物相比，用抑制剂处理的细胞培养物在处理后的培养物中显示出空斑块形成单位数目减少。
按如下方法分析可能的“每毫升空斑形成单位数(PFU/ml)的减少”。首先通过例如从培养皿中吸取一些细胞并将它们铺板以计数将形成的细菌空斑来分析被流感病毒和细菌合并感染的培养细胞产生每毫升空斑形成单位(PFU/ml)的能力。然后将该结果与施用抑制剂后由相同培养物的细胞产生的每毫升空斑形成单位(PFU/ml)的数目进行比较。如果与施用抑制剂前的空斑形成单位数目相比，用抑制剂处理后的每毫升空斑形成单位(PFU/ml)的数目减少，就是空斑形成单位的减少。
“每毫升菌落形成单位数(CFU/ml)”是对样品中活菌数量的估计。有多种估计方法。例如，为了产生菌落形成单元，将样品(例如小体积的培养细胞)铺展在营养琼脂平板的表面上，并在孵育之前使其干燥以进行计数。活细菌被定义为在控制条件下具有通过二元分裂来增殖的能力。细胞培养物中出现肉眼可见的菌落需要显著的生长——当计数菌落时，无法确定菌落是来自1个细胞还是1000个细胞。因此，对液体，结果被报告为CFU/ml(每毫升菌落形成单位数)，对固体，结果被报告为CFU/g(每克菌落形成单位数)，以反映这种不确定性(而不是每毫升细胞数(细胞/ml)或每克细胞数(细胞/g))。
“每毫升菌落形成单位数(CFU/ml)”可以按如下方式分析。首先通过例如从培养皿中吸取一些细胞并将它们铺板以进行计数来分析被流感病毒和细菌合并感染或仅被细菌感染的培养细胞产生每毫升菌落形成单位(CFU/ml)的能力。然后将该结果与施用抑制剂后由相同培养物的细胞产生的每毫升菌落形成单位(CFU/ml)数目进行比较。如果每毫升菌落形成单位(CFU/ml)的数目比施用抑制剂之前产生的数目少，就是每毫升菌落形成单位的减少。
通常，本领域技术人员知晓这些分析细菌和病毒感染的众所周知的技术。文献中进一步描述了如何测量每毫升空斑形成单位数(PFU/ml)和每毫升菌落形成单位数(CFU/ml)(Tuchscherr等人，2011；Hrinius等人，2010)。
为了本发明的目的，上述定义的活性化合物还包括其药学上可接受的盐。本文所用短语“药学上或化妆品上可接受的盐”是指对所需给药形式而言安全有效的本发明化合物的那些盐。药学上可接受的盐包括由阴离子形成的盐，例如由盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等衍生的盐，和由阳离子形成的盐，例如由钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等衍生的盐。
本发明的特征还在于以下项：
1.用于预防和/或治疗病毒性疾病的方法中的PD-0184264或其药学上可接受的盐。
2.根据第1项所述应用的PD-0184264或其药学上可接受的盐，其中所述病毒是负链RNA病毒。
3.根据第1项或第2项所述应用的PD-0184264或其药学上可接受的盐，其中所述病毒是流感病毒。
4.根据第1至3项中任一项所述应用的PD-0184264或其药学上可接受的盐，其中所述流感病毒是甲型流感病毒或乙型流感病毒。
5.用于预防和/或治疗细菌感染的方法中的PD-0184264或其药学上可接受的盐。
6.根据第5项所述应用的PD-0184264或其药学上可接受的盐，其中所述细菌感染由选自葡萄球菌科、链球菌科、军团菌科、假单胞菌科、芽孢杆菌科、衣原体科、支原体科、肠杆菌科、假单胞菌目和/或巴氏杆菌科的细菌介导。
7.用于预防和/或治疗包括细菌感染和病毒性疾病的合并感染的方法中的PD-0184264或其药学上可接受的盐。
8.根据第7项所述应用的PD-0184264或其药学上可接受的盐，其中细菌感染由选自葡萄球菌科、链球菌科、军团菌科、假单胞菌科、芽孢杆菌科、衣原体科、支原体科、肠杆菌科、假单胞菌目和/或巴氏杆菌科的细菌介导。
9.根据第7项或第8项所述应用的PD-0184264或其药学上可接受的盐，其中所述病毒是负链RNA病毒。
10.根据第7-9项中任一项所述应用的PD-0184264或其药学上可接受的盐，其中所述病毒感染由流感病毒引起。
11.根据第7-10项中任一项所述应用的PD-0184264或其药学上可接受的盐，其中所述病毒感染是由甲型流感病毒或乙型流感病毒引起的。
12.根据第7-11项中任一项所述应用的PD-0184264或其药学上可接受的盐，其中PD-0184264或其药学上可接受的盐与神经氨酸酶抑制剂或其药学上可接受的盐联合给药。
13.根据第12项所述应用的PD-0184264或其药学上可接受的盐，其中所述神经氨酸酶抑制剂选自奥司他韦、磷酸奥司他韦、扎那米韦、拉尼那米韦或帕那米韦或其药学上可接受的盐。
14.一种包含PD-0184264或其药学上可接受的盐的药物组合物。
15.一种药物组合物，其包含PD-0184264或其药学上可接受的盐和神经氨酸酶抑制剂或其药学上可接受的盐。
16.前述任一项所述应用，包含其它的MEK抑制剂。
17.根据前述任一项所述应用的PD-0184264或其药学上可接受的盐，其应用于受试者，优选脊椎动物。
***
必须注意的是，本文使用的单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数指代，除非上下文另有清楚地指明。因此，例如，“一种试剂”指代包括一种或多种这样的不同试剂，“所述方法”指代包括对本领域普通技术人员已知的等效步骤和方法，所述等效步骤和方法可以修改或替代本文所述的方法。
本公开说明书中引用的所有出版物和专利通过整体引用并入本文。在一定程度上，通过引入方式并入的材料或与本说明书矛盾或不一致，本说明书将取代任何这样的材料。
除非另有说明，在一系列元素之前的术语“至少”应理解为是指该系列中的每个元素。利用不超过常规的实验，本领域的技术人员将认识到，或者能够确定本发明所描述的特定实施例的许多等同替代。这些等同替代都包括在本发明中。
贯穿本说明书和所附权利要求书，除非上下文另有要求，词语“包含(comprise)”，以及诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”的变体将被理解为意味着包括所述整数或步骤或整数组或步骤组，但不排除任何其它整数或步骤或整数组或步骤组。当在本文中使用时，术语“包含(comprising)”可以用术语“含有(containing)”取代，或者有时当在本文中使用时用术语“具有(having)”取代。
当在本文中使用时，“由……组成(consisting of)”不包括未在权利要求要素中限定的任何元素、步骤或成分。当在本文使用时，“基本上由……组成(consistingessentially)”并不排除对权利要求的本质和新颖特征没有实质性影响的材料或步骤。
在本文每种情况下，术语“包含(comprising)”、“基本上由……组成(consistingessentially)”和“由……组成(consisting of)”中的任何一个可以用另外两个术语中的任一个代替。
在本说明书的全文中引用了数篇文献。本文引用的每一篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、操作指南等)，无论在前还是在后，其以全文并入本文。由于在先发明，本文不能被解释为承认本发明不早于这样的公开物。
实施例
以下实施例对本发明进行说明。这些实施例不应被解释为限制本发明的范围。例举实施例是为了阐述本发明的目的，本发明仅由权利要求书限定。
实施例1：以PD-0184264治疗小鼠以降低肺中病毒滴度
8周龄的C57BL/6小鼠(每组5只)用1,5×105PFU(5×MLD50)甲型流感病毒株A/Regensburg/D6/2009，(RB1，H1N1pdm09)感染。从感染前一小时开始，以8小时间隔，用150mg/kg CI-1040；75mg/kg CI-1040，25mg/kg CI-1040，75mg/kg PD0184264，25mg/kgPD0184264或溶剂(对照)：50μl DMSO/150μl Cremophor/800μlPBS处理小鼠。所有动物经口接受200μl体积药液。感染24小时后，将小鼠处死，肺脏称重，转移到裂解基质D管(MP Bio)中，将10倍肺体积的BSS(缓冲盐溶液)加入到样品中。使用FastPrep FP 120(Savant)切碎器官。为了除去细胞碎片，将匀浆以2000rpm离心15分钟，收集上清液。使用空斑检测试剂盒测定匀浆中的病毒滴度。结果在图1中以病毒滴度(log10)pfu/ml(左图)或％病毒滴度(右图)示出。病毒滴度由两名试验人员独立测定。示出了所有滴度的平均值。
实施例2：CI-1040或PD-0184264给药体外表现出对包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)在内的细菌生长的抑制作用
为了考察CI-1040或PD-0184264对细菌生长总体的影响，向耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株金黄色葡萄球菌(S.aureus)(USA300)的无细胞过夜培养物中补加50μM的CI-1040或PD-0184264或相同体积(40μl)的DMSO(作为溶剂)(图2)。监测细菌生长360分钟。PD-0184264对细菌生长具有强烈的影响，细菌在整个观察周期中几乎完全消失。如图2所示，与溶剂对照相比，CI-1040在实验开始120分钟后微弱抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的生长。这表明不仅PD-0184264也包括CI-1040除了阻断细胞中的MEK外，也阻断了负责细菌生长的细菌成分。
为了考察抑制细菌生长所需的PD-0184264的浓度，将不同浓度PD-0184264(如图3所示)加到金黄色葡萄球菌菌株USA300(MRSA)的过夜培养物。MRSA细菌与0-100μM浓度范围内不同浓度的MEK抑制剂孵育，培养6小时后监测细菌生长情况。抑制50％细菌生长所需的浓度在15-25μM范围内。
这些数据可以在略微不同的实验设置中加以验证，即在处理后较晚时间点测定实际的细菌滴度而不是OD值。将金黄色葡萄球菌菌株6850的全天培养物设定为20CFU/ml，并在37℃和5％CO2下用所示的不同浓度CI-1040处理过夜。然后测定光密度(OD600)。剩余的培养物用PBS洗涤，然后用BHI琼脂平板进行连续稀释。细菌滴度显示为每毫升菌落形成单位数(CFU/ml)。使用两个技术重复的三个独立生物学实验的结果在图4A中示出，所述结果代表平均值+SD。另外，将金黄色葡萄球菌菌株6850(图4B)或MRSA菌株USA300(图4C)的全天培养物设定为20CFU/ml，并在37℃和5％CO2下用所示的不同浓度PD-0184264处理过夜。在早上，测量光密度(OD600)。剩余的培养物用PBS洗涤一次，然后用BHI琼脂平板进行连续稀释。使用菌落计数器“方案3(protocol3)”测定细菌滴度，并显示为对数标度的每毫升菌落形成单位数(CFU/mL)。结果表示使用两个技术重复的三个独立生物学实验的平均值±SD。用单因素方差分析(one-wayANOVA)来分析统计学显著性，然后进行Dunnett多重比较检验。在这些对金黄色葡萄球菌菌株6850(图4的A和B)和MRSA菌株USA 300(图4C)的试验中，CI-1040(图4A)和PD-0184264(图4的B和C)也都是有效的。20μM的PD-0184264(图4B和C)就可以检测到非常显著的高达1.5-2个数量级的滴度降低。
实施例3：给单纯或合并感染细胞施用PD-0184264保护细胞免受甲型流感病毒(IAV)和/或金黄色葡萄球菌(S.aureus)的致细胞病变作用。
鉴于PD-0184264的抗病毒和强抗菌作用(上述实施例2中的图2至图4)，我们分析了对于由IAV(甲型流感病毒)和/或金黄色葡萄球菌(S.aureus)感染引起的破坏细胞的细胞致病变作用(CPE)，是否也可以从宏观上观察到该化合物的这一特性。人肺上皮细胞(A549)用PD-0184264(按照所示浓度)或溶剂(DMSO)预处理，在37℃以一定感染复数(MOI＝0.001)用人甲型流感病毒毒株A/PueroRico/8/34(H1N1)感染。30分钟后，移除病毒稀释液，细胞用PBS淋洗，并补充含有或不含金黄色葡萄球菌6850(MOI＝0.1)的侵入培养基DMEM/INV(含有1％人血清白蛋白，25nM HEPES)，该侵入培养基中存在所示浓度的抑制剂或溶剂对照。细菌感染后3小时，细胞用含有10％FBS，2μg/ml溶葡萄球菌酶的DMEM/FBS处理20分钟以除去细胞外细菌。细胞用PBS再次淋洗后，补充含有抑制剂或溶剂的感染培养基DMEM/BA(0.2％BA、1mM MgCl2、0.9mM CaCl2、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素)。37℃孵育24小时后，通过光学显微镜检查细胞形态。如图5所示，用甲型流感病毒(H1N1)或金黄色葡萄球菌菌株6850单一感染后观察到细胞单层轻微破坏。当两种病原体合并感染时，该致细胞病变效应(CPE)显著增强(下图)。然而，随着所述MEK-抑制剂量的增加，这种表型能够以浓度依赖性的方式被逆转，这是因为细胞单层保持完整且细胞较不圆整。PD-0184264的这种细胞保护作用完美地反映了其抗病毒和抗菌性能(图5)。
实施例4：PD-0184264的抗菌作用与普通抗生素的比较
为将MEK抑制剂PD0184164的抗菌性能与普通抗生素的作用对标，我们将细菌用溶剂、MEK抑制剂U0126和PD-0184264或不同浓度抗生素庆大霉素处理过夜。将金黄色葡萄球菌菌株6850或MRSA菌株USA300的全天培养物设定为20CFU/ml，并在37℃和5％CO2下用所示的MEK抑制剂U0126和PD-0184264或抗生素庆大霉素处理过夜。在早上，测量光密度(OD600)。剩余的培养物用PBS洗涤一次，然后用BHI琼脂平板进行连续稀释。使用菌落计数器“方案3(protocol3)”测定细菌滴度，显示为每毫升菌落形成单位数(CFU/ml)。图6所示的结果表示使用两个技术重复的三个独立生物学实验的平均值±SD。用单因素方差分析(one-wayANOVA)来分析统计学显著性，然后进行Dunnett多重比较检验。与溶剂处理的细菌相比，用第一代MEK抑制剂U0126孵育仅导致细菌滴度的轻微降低，而用PD-0184264处理引起细菌负载非常强烈的降低，正如之前的图4所示的那样。两种细菌菌株的结果都是如此。正如所预期的，两种菌株的生长都被浓度高于1μg/ml的庆大霉素强烈抑制，尽管所述抗生素对金黄色葡萄球菌菌株6850的抗菌作用更强。在0.5μg/ml庆大霉素作用下，两种菌株都检测不到细菌滴度的降低。总之，所述MEK抑制剂PD-0184264对细菌生长的影响几乎与低浓度抗生素庆大霉素一样有效。
为了进一步比较PD-0184264与其它MEK抑制化合物或抗生素庆大霉素的抗菌作用，进行了添加时间(time-of-addition)试验(图7A)。将金黄色葡萄球菌菌株6850的过夜培养物分成六个传代培养物，所述传代培养物含有15ml BHI培养基以及单独的溶剂DMSO或MEK抑制剂U0126和PD-0184264中的一个或两种不同浓度的抗生素庆大霉素(0,5或2μg/ml)。在加入不同的化合物之后立即测量OD600，并用BHI琼脂平板进行系列稀释以计算细菌滴度。剩余的培养物在所述物质或溶剂存在下进一步在37℃和5％CO2中孵育。在接种后3小时和6小时重复该操作两次。使用菌落计数器“方案3(protocol3)”测定细菌滴度，结果显示为每毫升菌落形成单位数(CFU/ml)。与其它所有化合物相比，用MEK抑制剂PD-0184264处理显示出对细菌生长最强的抑制作用。然后，更换培养液，并在不添加任何物质的情况下进一步孵育所述培养物。所有培养物都达到先前溶剂处理的培养物的浊度，这表明MEK抑制剂PD-0184264发挥抑菌作用而不是杀菌作用。
对各种常用抗生素的抗性发展是经常发生的，并且是临床的一个主要问题。为了测试MEK抑制剂PD0184264是否在金黄色葡萄球菌中引起抗性发展，将培养物用所述抑制剂、庆大霉素或红霉素连续处理近3周或不作处理。具体而言，培养物在存在或不存在上述物质的情况下生长24小时，测定OD600，然后将培养物设定为20CFU/ml并再次培养24小时。该操作重复17天。数据表示三个独立实验的平均值+SD。用单因素方差分析(one-way ANOVA)来分析统计学显著性，然后进行Dunnett多重比较检验(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001)。如庆大霉素的结果所示，与大环内酯抗生素红霉素形成鲜明对比，在治疗的第一周发生抗性发展。值得注意的是，用MEK抑制剂处理没有诱导抗性(参见图7b所示的结果)。
实施例5：细菌激酶PknB可能是PD-0184264在细菌中的靶点
抑制剂PD-0184264被认为对存在于哺乳动物中的激酶MEK是特异性的。其直接的抗菌作用引出了其在原核生物中的作用模式的问题，即是否存在MEK样的细菌成分，其也可以被PD-0184264特异性靶向。正是在这种情况下，细菌丝氨酸/苏氨酸激酶PknB成为研究焦点。该激酶显示出与细胞丝氨酸/苏氨酸激酶，更精确地说，与MAP激酶如p38、JNK和ERK(它们是哺乳动物细胞中的MEK-靶点)高度的结构和功能相似性(Miller等人，2010；Rakette等人，2012)(图8)。令人感兴趣的是，该激酶显示出通过自磷酸化活化，因此，强烈提示它发挥MEK样活性。
实施例6：PD-0184264提高了金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性并降低了细菌耐逆性
由于表达三个青霉素结合结构域(PASTA)(参见图8，上图)，PknB参与抗生素敏感性的调节。可以看出，缺乏所述激酶导致对不同抗生素，特别是各种β-内酰胺类抗生素敏感性的增加(Tamber等人2010)。为了考察用MEK抑制剂PD-0184264处理细菌是否可能对所述细菌激酶产生影响，并导致与敲除所述激酶相似的表型，细菌培养物用溶剂(DMSO)或20μM的PD-0184264处理过夜，然后用于测定不同抗生素的最小抑制浓度(MIC)。将金黄色葡萄球菌菌株6850全天培养物设定为20CFU/ml，在37℃和5％CO2下用溶剂(DMSO或MEK抑制剂PD-0184264处理过夜。在早上，测定光密度(OD600)。简而言之，用PBS洗涤溶剂和抑制剂处理过的培养物一次，并且对BHI琼脂平板进行1:1稀释。接种后立即将不同抗生素的MIC测试条(Thermo Fischer Scientific)放置在平板的中间，然后在37℃孵育18-24小时。37℃孵育18小时后，通过对平板的目测分析确定MIC浓度。观察不到任何生长抑制的浓度被称作每一种抗生素的MIC。用PD-0184264处理的确使得细菌对不同抗生素的敏感性增加，这对青霉素和庆大霉素最显著(图9，表2)。该结果与公开发表的由缺乏该激酶的突变株产生的数据完全一致(Tamber等人，2010)。
表2：以PD0184264过夜处理后测定的MIC
所观察到的PD-0184264处理后抗生素敏感性的增加，该结果与缺乏所述激酶的细菌的表型一致(Tamber等人，2010)，强烈提示PknB可能被所述抑制剂直接靶向作用。由于已知所述激酶在细菌抗逆性中起重要作用，因此在用抑制剂PD-0184264处理细菌之后，监测细菌在热应激下的生长。金黄色葡萄球菌菌株6850和MRSA菌株USA300用溶剂或20μM的PD-0184264处理过夜。第二天制备具有相同细菌数量的传代培养物(通过OD600以及在BHI琼脂上铺板进行确证)，并进一步在42℃下孵育6小时。然后通过在BHI琼脂平板上进行系列稀释铺板来计算细菌滴度。如图10所示，与溶剂处理的病原体相比，PD-0184264处理的细菌在这些条件下受到强烈损伤。在甲氧西林敏感菌株6850(黑条)以及MRSA菌株USA300(灰条)中都观察到同样的结果。在所述抑制剂存在下抗逆性受损是PD-0184264直接靶向激酶PknB的另一个证明，该激酶是抗逆性的重要中介物。总之，这些数据提供了有力的间接证据，即PD-0184264通过抑制细菌激酶PknB而发挥其抗菌作用。
实施例7：PD-0184264给药显示出对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)生长的抑制作用
除了金黄色葡萄球菌外，已知还有其它细菌在患者流感病毒(IV)感染后引起继发性细菌性肺炎。在这种情况中，最常见的病原体是肺炎链球菌。这些细菌代表了社区获得性肺炎最常见的病因。与金黄色葡萄球菌相反，肺炎链球菌的继发感染发生在流感病毒感染后的晚期，因此对应于流感后终末期肺炎。
与金黄色葡萄球菌相似，大多数肺炎链球菌菌株表达真核样丝氨酸/苏氨酸激酶，如PknB，其在不同属之间高度保守。另外，这些激酶与细胞MAP激酶(例如ERK、JNK、p38)具有高度同源性。从不同的金黄色葡萄球菌菌株获得的实施例2-6中所示的结果已经证实了PD-0184264处理对细菌生长的抑制作用，这表明细菌激酶例如PknB参与观察到的表型。令人惊奇的是，金黄色葡萄球菌PknB的同系物也存在于肺炎链球菌中，提示这些细菌也可能对PD-0184264敏感。因此，分析了PD-0184264对不同株肺炎链球菌的影响。肺炎链球菌菌株可分为不同的血清型，其毒力和总致病性不同。为了测试血清型无关或菌株无关的作用，我们使用了封装的菌株D39和TIGR4，它们都是有毒性的，但是属于不同的血清型。结果发现用PD-0184264处理会破坏不同血清型的肺炎链球菌的生长。具体地，肺炎链球菌菌株TIGR4(血清型4)和D39wt(血清型2)的全天培养物被设定成光密度(OD600)为1，在BHI培养基中以1:2000稀释，并用溶剂(DMSO)或所示的不同浓度的所述特异性MEK抑制剂PD0184264(PD；CI-1040的活性代谢物)处理过夜。然后，再次测定OD600(结果如图11A所示)，并对BHI琼脂平板进行系列稀释以确定细菌滴度(结果如图11B所示)。结果可以证明两种血清型都对PD-0184264敏感(图11a，b)。
对于枯草芽孢杆菌结果也是如此，在10μM PD-0184264存在下也观察到活菌数的剧烈减少，而在较高浓度下细菌完全消除(结果参见图11c)。具体地，为了测试对枯草芽孢杆菌的潜在抗菌作用，将枯草芽孢杆菌的过夜培养物与溶剂或不同浓度的MEK抑制剂PD-0184264(如所示)孵育18小时。然后，通过测量OD600和在BHI琼脂平板上铺板进行系列稀释来测定细菌滴度。图11所示的数据表示三个独立实验的平均值+SD。
总之，这些数据表明PD-0184264在抗菌治疗中具有广泛的适用性。
实施例8：PD-0184264而不是CI-1040降低了细胞内细菌滴度
流感病毒(IV)感染导致抗病毒细胞因子表达的增强，其中最重要的是I型干扰素(IFNs)，其会激活关键的下游抗病毒反应并且还可以加剧随后的细菌感染。为考察CI-1040或PD-0184264处理是否会使细胞对继发的金黄色葡萄球菌感染敏感，永生化的人肺泡基底上皮细胞(A549)的细胞培养物在抑制剂存在或不存在的情况下用流感病毒和金黄色葡萄球菌感染。具体地说，用10μM所述特定的MEK-抑制剂PD-0184264或DMSO(作为溶剂对照)预处理A549细胞1小时。然后，用PBS冲洗细胞，并在37℃，5％CO2下感染流感病毒(IV)(按所示的MOI)30分钟。随后，在所述抑制剂存在或不存在的情况下，用PBS洗涤细胞并用金黄色葡萄球菌菌株6850(按所示的感染复数(MOI))感染细胞3小时。为了避免细菌过度生长，在37℃下用溶葡萄球菌酶(2μg/ml)进行抗生素清洗步骤20分钟以除去未内化的细菌。然后，细胞洗涤一次，并在所述抑制剂或溶剂存在下继续孵育至接种后24小时。孵育期结束时，通过光学显微镜观察细胞单层。显微检查显示，与单一感染相比，两种病原体的重叠感染使细胞致病变效应(CPE)明显增强(图13，上图)。细胞致病变效应(CPE)在PD-0184264存在下完全消除(图13，下图)，表明病毒复制减少。
为了考察PD-0184264和CI-1040作用是否相当，A549细胞用10μMCI-1040、PD-0184264或溶剂(DMSO)预处理60分钟，然后按照感染复数(MOI)为0.001，37℃下用流感病毒(H7N7)感染。结果分别示于图14A和14B中。或者，细胞不作处理(DMSO)，按照感染复数(MOI)为0.01，37℃下用流感病毒(H1N1)感染。30分钟后，除去病毒稀释液，细胞用PBS冲洗，补充含有或不含有金黄色葡萄球菌菌株6850(6850)(感染复数(MOI)为0.1)的侵入培养基，所述侵入培养基还含有10μM CI-1040、PD-0184264或溶剂对照。细菌感染后3小时，用溶葡萄球菌酶(2μg/ml)处理的细胞20分钟以除去胞外细菌。然后洗涤细胞并补充含有所述抑制剂或溶剂的感染培养基。在(病毒感染后)24小时的总孵育期后，分析细胞内细菌滴度。结果表示三个单独实验的平均值+SD。用单因素方差分析(one-wayANOVA)来分析统计学显著性，然后进行Dunnett多重比较检验(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001)。如图14A所示，用CI-1040处理不会使细胞对金黄色葡萄球菌引起的继发感染敏感，这是因为检测不到细胞内细菌载量的变化。令人惊奇的是，如图14B所示，施用PD-0184264甚至导致细胞内细菌滴度降低。如图14C所示，当CI-1040或PD-0184264在持续感染的后期给药时，得到了类似的结果。
为了排除病毒和细胞内细菌复制的减少是PD-0184264对A549细胞的细胞毒性作用的结果，在浓度升高的情况下监测细胞活力24和48小时。另外，进行乳酸脱氢酶(LDH)测定以确定由于抑制剂处理而导致的膜破裂。结果显示用PD-0184264处理A549细胞不会诱导细胞毒性。A549细胞用浓度递增的PD-0184264(1、5、10、20、50或100μM)处理24小时(如图15A和C所示)或48小时(如图15B和D所示)。孵育时间结束后，取上清液，采用细胞选择LDH细胞毒性测定试剂盒(CytoSelect LDH Cytotoxicity Assay Kit)根据制造商的操作说明测定LDH释放(如图15C、D所示)。另外，活细胞通过台盼兰染色进行计数。将细胞活力与DMSO处理的细胞对标，并显示为％活力。数据显示的是三个独立实验的平均值+SD。用单因素方差分析(one-wayANOVA)来分析统计学显著性，然后进行Dunnett多重比较检验(*P<0.05；**P<0.01；27***P<0.001)。
实施例9：确定CI-1040和PD-0184264的IC50值
将抑制剂试样溶解在100％DMSO中(母液浓度10mM)。为了测定IC50值，在微量滴定板中制备以下系列稀释液：50μM、25μM、5μM、2.5μM、0.5μM、0.25μM、0.05μM、0.025μM、0.005μM。将1μl的各稀释液加入到49μl激酶反应混合液中，得到以下测试浓度：1μM、500nM、100nM、50nM、1nM、0.5nM、0.1nM。
将3μl活性c-Rafl、2μl MEK1wt和3μl ERK2wt的纯化蛋白溶液与激酶缓冲液以及1μl DMSO或DMSO/抑制剂混合(终体积45μl)。所述混合液在室温下避光孵育30分钟。在确保抑制剂结合至MEK蛋白的预孵育结束后，通过加入5μl 10mM的ATP并用移液管混合来启动激酶反应。在恒温混匀仪(Eppendorf)中，样品在26℃，500rpm下孵育30分钟。为了终止激酶反应，加入5.5μl的20％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，随后将该混合液在50℃孵育10分钟。然后用190μl封闭缓冲液(含1％牛血清蛋白(BSA)的TBST缓冲液)稀释每个样品。将100μl的每个样品加入96孔微量滴定板的抗ERK抗体包被孔中。
室温下，激酶反应样品(100μl/孔)在96孔微量滴定板的抗ERK抗体包被和BSA封闭孔中孵育60分钟。随后用100μl TBST洗涤缓冲液洗涤板3×5分钟。为了检测磷酸化ERK，加入抗磷酸化ERK(p44/p42)抗体(1:3000，封闭缓冲液中，100μl/孔)，并在4℃孵育过夜。
经过三次洗涤(3×100μl/孔)，加入辣根过氧化酶(HRP)-缀合的抗小鼠IgG特异性抗体(在TBST中1:1000)，并在室温下孵育60分钟。在另外三次洗涤步骤(3×100μl/孔TBST)之后，以100μl/孔加入过氧化物酶底物ABTS，并在30℃孵育30分钟。通过加入2.5μl的20％SDS终止底物反应。在ELISA酶标仪中，405nm波长下测定混合物的光密度(OD)。
无细胞激酶试验结果显示，抑制50％的MEK活性所需的CI-1040与PD-0184264相比低12.5倍，实际上PD-0184264是MEK激酶更弱的抑制剂(图16)。因此，没有人能预料到PD-0184264具有强的抗病毒和抗菌作用。然而，如前面实施例所示，与CI-1040相比，PD-0184264在体内显示出更强的抗病毒和抗菌活性。
实施例10：PD-0184264在体外测试中的抗病毒活性
药物
CI-1040[2-(2-氯-4-碘苯基氨基)-N-(环丙基甲氧基)-3,4-二氟苯甲酰胺；批号：CC-5395.0-16]和PD-0184264(PD0184264)[2-(2-氯-4-碘苯基氨基)-N-3,4-二氟苯甲酸；批号：CC-5595.4-10]，由Chemcon GmbH(Freiburg，德国)合成。为细胞培养实验，制备了在DMSO(Merck-Millipore；德国)中10mM的CI-1040(M＝478,66g/mol)和PD-0184264(M＝409,55g/mol)储备液。
病毒和细胞
用MOI为0.001的甲型流感病毒株RB1[A/Regensburg/D6/09(H1N1pdm09)]进行病毒抑制试验。
子代病毒抑制试验
在37℃，5％CO2，用RB1感染A549细胞30分钟。孵育后，吸去病毒稀释液，用PBS冲洗细胞，并在10μM CI-1040或不同浓度的PD-0184264(100μM、50μM、10μM、5μM、1μM、0.5μM和0.1μM，最终DMSO浓度＝1％)存在下补充500μl IMDM(Iscove′s Modified Dulbecco′sMedium)/BA(牛白蛋白)-培养基(0.2％牛白蛋白(BA)，1mM MgCl2，0.9mM CaCl2，100U/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素)和0.6μl TPCK处理的胰蛋白酶，在37℃和5％CO2下孵育24小时。溶剂对照是含有1％DMSO的IMDM/BA-培养基。收集细胞培养上清液，以便如前所述(Haasbach等人，2001；Matrosovich等人，2006)在MDCK II细胞上采用空斑测定仪测定子代病毒滴度。
WST测定
将A549细胞接种在96孔平底组织板(Greiner，德国)中，并生长过夜。随后，细胞用溶解在100μl IMDM(Thermofisher，德国)中的不同浓度的PD-0184264(100μM、50μM、10μM、5μM、1μM、0.5μM和0.1μM)处理，所述IMDM补充有5％胎牛血清(Sigma-Aldrich；德国)，最终DMSO浓度＝1％，在37℃和5％CO2下培养24小时。随后，向培养基中加入10μl WST-1试剂(Roche，德国)并孵育4小时。在此期间，稳定的四唑鎓盐WST-1被培养物中的代谢活性细胞分解为可溶性甲臜。在该孵育期之后，用ELISA酶标仪在405nm处对形成的甲臜染料进行定量测定。测定的吸光度与活细胞的数量直接相关。
结果
在标准病毒抑制试验中考察了PD-0184264对RB1的抗病毒活性(图17A)。当用100μM PD-0184264处理细胞时，发现病毒滴度降低98.87±0.03％(p>0.0001)。用50μM PD-0184264处理，发现类似的病毒滴度降低(91.50±2.08％；P>0.0001)。相反，当使用10μMPD-0184264时，却发现病毒滴度仅有微弱的降低(58.97±4.45％)。1μM PD-0184264几乎不引起子代病毒的减少。因此，与10μM CI-1040引起的病毒减少(96.78±0.65％；P>0.0001)相比，需要浓度大约高出10倍的PD-0184264才能实现类似的子代流感病毒减少。PD-0184264的EC50值与CI-1040相比的结果也与此相符。PD-0184264的EC50值为0.804μM(图17B)。在另一项研究中，测定得到的CI-1040对RBI的EC50值为0.026μM(HAASBACH等人，2017)。PD-0184264的CC50>1576，与CI-1040比较(>312.3μM；Haasbach等人，2017)，其CC50值更高(图17C)。因此，PD-0184264的S.I.(选择指数)＝1960。
总结/讨论
结果表明，与CI-1040相比，PD-0184264在细胞培养物中，即在体外具有降低的抗病毒活性。在体外试验中，达到与CI-1040相同的病毒减少作用需要大约高出10倍浓度的PD-0184264。这两种化合物之间EC50值的差甚至更明显。在这一点上，PD-0184264的EC50值比CI-1040的EC50值高31倍(Haasbach等人，2017)。与CI-1040相比，PD-0184264抗A549细胞中RB1病毒株的选择指数(S.I.)也降低。
实施例11：PD-0184264体内降低小鼠肺中的病毒滴度
(A)H1N1pdm09感染后，雌性C57BL/6小鼠口服给予2.8、8.4或25mg/kg PD-0184264(左侧)或25、75或150mg/kg CI-1400(左侧)。感染24小时后，处死动物，取肺脏制备10％悬浮液。使用标准方法测定病毒滴度。将用所述两种MEK-抑制剂治疗的小鼠的病毒滴度与仅用溶剂(对照)处理的小鼠的病毒滴度进行比较。将对照组小鼠肺中的病毒滴度设定为100％(黑条)。用GraphPad Prism 7软件来示出二者的图。
药物
CI-1040[2-(2-氯-4-碘苯基氨基)-N-(环丙基甲氧基)-3,4-二氟苯甲酰胺；批号：CC-5395.0-16]和PD-0184264(PD0184264)[2-(2-氯-4-碘苯基氨基)-N-3,4-二氟苯甲酸；批号：CC-5595.4-10]，由Chemcon GmbH(Freiburg，德国)合成。
对于25mg/kg的口服应用，2.5mg PD-0184264溶于50μl DMSO(Sigma-Aldrich，德国)，再用0.15ml Cremophor EL(Merck-Millipore，德国)和0.8ml PBS(Gibco，德国)稀释。对于8.4mg/kg和2.8mg/kg的应用，0.84mg或0.28mg PD-0184264溶于50μl DMSO(Sigma-Aldrich，德国)，并进一步用0.15ml Cremophor EL/0.8ml PBS稀释。202.5mg CI-1040溶于0.5ml DMSO/0.15ml Cremophor EL/0.8ml PBS中，并进一步用Cremophor EL和PBS稀释。
动物
给药时体重为21.0-24.0克的8周龄雌性C57BI/6小鼠(Charles RiverLaboratories，德国)用于抗病毒研究。动物正常喂养。不限制饮水。
给药
在试验第1天经灌胃单剂量给予药物。给药速度为每剂量15秒，给药体积200μl。
肺病毒滴度测定
感染24小时后处死小鼠，肺脏称重，转移到裂解管D(Lysing Matrix D tube)(MPBio)中，加入10倍肺体积的BSS液。使用FastPrep FP 120(Savant)切碎器官。为了除去细胞碎片，将匀浆以2000rpm离心15分钟，收集上清液。采用空斑测定仪按如前所述测定匀浆中的病毒滴度(Haasbach等人，2001；Mastrosovich等人，2006)。
总结/讨论
图18示出了实验结果。与对照实验相比，只有75mg/kg或更高浓度的CI-1040显示出一些降低病毒滴度的作用。相反，PD-0184264在2.8mg/kg的浓度下已经显示肺中病毒滴度降低到约70％。在8.4mg/kg的浓度下，病毒滴度降低到约20％的量，而在25mg/kg时，病毒滴度降低到约10％。因此，浓度低6倍的PD-0184264就能达到与150mg/kg CI-1040相似的效果，这突显了PD-0184264抗病毒作用的巨大潜力。
实施例12：与CI-1040相比，PD-0184264生物利用度更高
(A)雄性NMRI小鼠静脉给药75mg/kg CI-1040(深灰色区域)或75mg/kg PD-0184264。在给药后15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h和24h(试验第2天)收集血液，并分析血浆中存在的药物。
(B)雄性NMRI小鼠经口灌胃给予150mg/kg CI-1040(深灰色区域)或150mg/kg PD-0184264。在给药后15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h和24h(试验第2天)收集血液，并分析血浆中存在的药物。
每个数据点表示三个血浆样品的平均值。采用Graphpad Prism 7软件来显示两幅图。
药物
CI-1040[2-(2-氯-4-碘苯基氨基)-N-(环丙基甲氧基)-3,4-二氟苯甲酰胺；批号：CC-5395.0-15]和PD-0184264(PD0184264)[2-(2-氯-4-碘苯基氨基)-N-3,4-二氟苯甲酸；批号：CC-5595.4-10]，由Chemcon GmbH(Freiburg，德国)合成。对于静脉给药，30.65mg CI-1040溶于0.075ml DMSO(Sigma-Aldrich，瑞士)，并进一步用0.225ml Cremophor EL(Merck-Millipore，德国)和2.7ml PBS(Gibco，德国)稀释。34.88mg PD-0184264溶于0.075mL DMSO中，并进一步用0.225ml Cremophor EL/2.7mL PBS稀释。对于口服给药，202.5mg CI-1040溶于0.5ml DMSO/1.5ml Cremophor EL/8.0ml PBS。81.0mg PD-0184264溶于0.2ml DMSO/0.6ml Cremophor EL/3.2ml PBS。
动物
给药时体重23.9-36.5g的8周龄雄性NMRI小鼠(Charles River Laboratories，德国)用于药代动力学研究。动物正常喂养。不限制饮用水。
采血和血浆制备
实验在LPT GmbH(Hamburg，德国)进行。收集足量的全血——在异氟烷麻醉下采血——每组3只动物得到至少2×100μl的Li-肝素血浆，并在以下时间点进行：给药后0(给药前)、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h和24h(试验第2天)。使用Iso-Therm-Rack系统(Eppendorf AG，德国)立即冷却全血样品，以待取样后0.5小时内离心。离心后立即将样品在-20℃保存，以备进一步的分析。在Prolytic GmbH(法兰克福，德国)使用标准程序进行血浆分析。
给药
在试验第1天通过灌胃或通过尾静脉单次注射给予单剂量药物。注射速度为15s/剂量，给药体积为200μl。
结果
药代动力学实验显示，与CI-1040相比，静脉注射(图19A)和口服给药(图19B)后发现PD-0184264小鼠血浆暴露量更高，其AUC值为1953.68μg*h/ml PD-0184264，该值远高于CI-1040的AUC值。值得注意的是，CI-1040静脉注射和口服给药后8小时，血浆中几乎检测不到药物。相反，在PD-0184264 2口服给药8h数据点处，仍然检测到高浓度的药物。
总结/讨论
单次静脉给药后PD-0184264和CI-1040的血浆暴露量的显著差异足以引起了这样的假设：CI-1040可能迅速降解。发明人假设药物以单指数方式消退。通常，该假设是合理的。在低浓度下，药物通常以单指数方式消退。并且末期消除速率常数不随时间或循环药物的不同浓度而变化。然而，在这一点上，我们不知道诸如肠肝循环这样的其它过程是否在药物代谢分布的末期起重要作用。
综上所述，PD-0184264在体内显示出比CI-1040高的抗病毒活性，这可能是因为药物的生物利用度更高。
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Claims (26)
1.PD-0184264或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗细菌感染的药物中的应用；所述细菌感染由金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和/或枯草芽孢杆菌介导。
2.PD-0184264或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗病毒性疾病的药物中的应用，所述病毒是甲型流感病毒H1N1或H7N7。
3.PD-0184264或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗包括细菌感染和病毒性疾病的合并感染的药物中的应用，所述细菌感染由金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和/或枯草芽孢杆菌引起，所述病毒是甲型流感病毒H1N1或H7N7。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，PD-0184264或其药学上可接受的盐与神经氨酸酶抑制剂或其药学上可接受的盐联合给药。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述神经氨酸酶抑制剂选自奥司他韦、磷酸奥司他韦、扎那米韦、拉尼那米韦或帕那米韦或其药学上可接受的盐。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的应用，其特征在于，包含其它的MEK抑制剂。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包含其它的MEK抑制剂。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包含其它的MEK抑制剂。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的应用，其特征在于，应用于受试者。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，应用于脊椎动物。
11.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，应用于受试者。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，应用于脊椎动物。
13.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，应用于受试者。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，应用于脊椎动物。
15.根据权利要求1至3中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物是口服制剂。
16.根据权利要求1至3中任一项所述的应用，其特征在于，PD-0184264或其药学上可接受的盐按照2.8mg/kg或更高剂量口服给药。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，PD-0184264或其药学上可接受的盐在10-100mg/kg的剂量范围内口服给药。
18.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，PD-0184264或其药学上可接受的盐按照2.8mg/kg或更高剂量口服给药。
19.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，PD-0184264或其药学上可接受的盐在10-100mg/kg的剂量范围内口服给药。
20.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，PD-0184264或其药学上可接受的盐按照2.8mg/kg或更高剂量口服给药。
21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，PD-0184264或其药学上可接受的盐在10-100mg/kg的剂量范围内口服给药。
22.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，病毒感染经由被病毒感染的细胞的MEK通路，PD-0184264阻断被病毒感染的细胞的MEK，抑制病毒复制。
23.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，当PD-0184264和CI-1040给药剂量相同时，PD-0184264显示出比CI-1040更强的抗病毒活性。
24.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，当PD-0184264和CI-1040给药剂量相同时，给药后PD-0184264显示出比CI-1040更高的生物利用度。
25.PD-0184264或其药学上可接受的盐和抗生素联合在制备预防和/或治疗细菌感染的药物中的应用，所述抗生素是青霉素或庆大霉素，所述细菌感染是金黄色葡萄球菌介导的。
26.根据权利要求25所述的应用，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
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