ES2883639T3

ES2883639T3 - Nuevo inhibidor de MEK para el tratamiento de infecciones víricas y bacterianas

Info

Publication number: ES2883639T3
Application number: ES18800045T
Authority: ES
Inventors: Stephan Ludwig; Oliver Planz
Original assignee: Atriva Therapeutics GmbH
Current assignee: Atriva Therapeutics GmbH
Priority date: 2017-10-17
Filing date: 2018-10-17
Publication date: 2021-12-09
Anticipated expiration: 2038-10-17
Also published as: EP3973960A1; CY1124507T1; EP3697405A1; JP2020537659A; EP3697405B1; MX2022016066A; MX2020003473A; EA202090693A1; CA3078424A1; US11903917B2; CN111479566A; AU2024205853A1; PL3697405T3; SI3697405T1; BR112020007442A2; DK3697405T3; CN111479566B; LT3697405T; AU2018351475A1; PT3697405T

Abstract

PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para uso en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una infección bacteriana.

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevo inhibidor de MEK para el tratamiento de infecciones víricas y bacterianas

Antecedentes

Los virus de la gripe A son los agentes causantes de enfermedades respiratorias graves que provocan una morbilidad y una mortalidad significativas. La mayoría de los casos mortales en el curso de una infección con el virus de la gripe, son en realidad el resultado de una neumonía secundaria causada por diferentes bacterias, como Staphylococcus aureus (S. aureus), Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenza (Morens et al., 2008, Chertow et al., 2013). Los problemas más llamativos de una coinfección bacteriana son el aumento repentino de la patogenicidad (Iwao et al., 2012, Paddock et al., 2012, Parker et al., 2012) y un arsenal limitado de potentes agentes antiinfecciosos contra los diferentes agentes patógenos. La alta variabilidad de los virus de la gripe y la aparición continua de nuevas cepas (Neumann et al., 2009, Taubenberger et al., 2010, Parry, 2013), las características específicas de las cepas bacteria nas (Grundmann et al., 2006, Moran et al., 2006, Gillet et al., 2007, Shilo et al., 2011), así como el rápido desarrollo de resistencia de ambos, los virus de la gripe (Hayden et al, 1992, Bright et al., 2006, Pinto et al., 2006, De Clercq et al., 2007, Pinto et al., 2007) y las bacterias (Grundmann et al., 2006, Moran et al., 2006, Shilo et al. 2011) frente a los fármacos/antibióticos disponibles, son las principales causas de que las opciones de tratamiento sean insuficientes.

El documento WO 2001/076570 proporciona el concepto de tratar o prevenir las infecciones causadas por virus de ARN(-), en particular por virus de la gripe, por medio de inhibidores de MEK. El documento WO 2014/056894 propor ciona inhibidores específicos de MEK, tales como AZD-6244, AZD-8330, RDEA-119, GSK-1120212 (Trametinib), GDC-0973 (Cobimetinib), CI-1040, PD-0325901, RO-5126766, MSC1936369 (AS-703026) para uso en el tratamiento 0 la prevención de infecciones con el virus de la gripe. En el documento WO 2015/173788 A1, los inhibidores de MEK se describen para uso en un método de tratamiento de coinfecciones bacterianas y con el virus de la gripe.

Sin embargo, aunque ya se conocen algunos inhibidores de MEK prometedores y se proporcionan para uso en el tratamiento o la prevención de infecciones víricas, en particular infecciones con el virus de gripe, así como coinfeccio nes bacterianas que acompañan a infecciones víricas, en particular infecciones con el virus de la gripe, todavía existe una necesidad de proporcionar más inhibidores de MEK, idealmente mejorados para una aplicación de ese tipo, pero también adicionalmente en especial para el tratamiento de infecciones bacterianas. Por tanto, el problema técnico de la presente solicitud es satisfacer esta necesidad.

Compendio de la invención

La solución del problema técnico es proporcionar PD-0184264, un metabolito de CI-1040 para uso en el tratamiento o la prevención de enfermedades víricas, como una infección con el virus de la gripe, infecciones bacterianas o una coinfección que comprende una infección bacteriana y una enfermedad vírica. Esta solución también se refleja en las realizaciones descritas a continuación y en las reivindicaciones, y se ilustra en los Ejemplos y las Figuras. Los inven tores de la presente solicitud has descubierto sorprendentemente que el metabolito PD-0184264 del inhibidor de MEK, CI-1040, tiene una mayor actividad antivírica y antibacteriana que el propio CI-1040. Por lo tanto, el uso de PD-0184264 resuelve el problema técnico subyacente a la presente solicitud, al proporcionar una opción de tratamiento más eficaz contra las infecciones víricas, en particular las infecciones con el virus de la gripe, así como contra las coinfecciones víricas, en particular con el virus de la gripe, bacterianas y las infecciones bacterianas.

Aunque el inhibidor de MEK CI-1040 ya es eficaz en el tratamiento o la prevención de una infección con el virus de la gripe y una coinfección bacteriana o con el virus de la gripe, los inventores han encontrado que un metabolito (PD-0184264, fórmula 1) de CI-1040 es más efectivo que el propio CI-1040 para dirigirse contra infecciones o coinfecciones con el virus de la gripe y/o bacterianas que comprenden una infección con el virus de la gripe y una bacteriana. PD-0184264 es uno entre varios metabolitos de CI-1040 (Wabnitz et al., 2004, LoRusso et al., 2005), pero no se había podido saber ni suponer que un metabolito era más potente que CI-1040. Para sorpresa de los inventores, de hecho encontraron que un metabolito (PD-0184264, estructura 1 a continuación) es más eficaz y tiene un mayor potencial terapéutico que CI-1040, tal y como se muestra en los ejemplos. Esta propiedad de PD-0184264 no se podía esperar, ya que PD-0184264 en realidad muestra un efecto inhibidor in vitro más débil sobre las cinasas MEK que CI-1040 (véase el Ejemplo 9). Además, los ensayos in vitro mostraban un efecto antivírico de PD-0184264 más débil que en comparación con CI-1040 (véase el Ejemplo 10) mientras que los ensayos in vivo mostraban sorprendentemente un efecto antivírico de PD-0184264 mucho más fuerte que en comparación con CI-1040 (véase el Ejemplo 11).

Por consiguiente, la presente invención se refiere a PD-0184264 o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para uso en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una infección bacteriana y/o una enfermedad vírica. Preferiblemente, el virus que causa la enfermedad vírica es un virus de ARN de cadena negativa, preferiblemente el virus de la gripe y más preferiblemente el virus de la gripe A o la gripe B.

La presente invención también se refiere a PD-0184264 o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para uso en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una infección bacteriana. La infección bacteriana está mediada preferiblemente por una bacteria seleccionada a partir del grupo que consiste en Staphylococcaceae, Streptococcaceae, Legionellaceae, Pseudomonadaceae, Bacillaceae, Chlamydiaceae, Mycoplasmataceae, Enterobacteriaceae, Pseudomonadales y/o Pasteurellaceae.

La presente invención se refiere además a PD-0184264 o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para uso en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una coinfección que comprende una infección bacteriana y una enfermedad vírica.

Preferiblemente, PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo es para uso en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una coinfección que comprende una infección bacteriana y una enfermedad vírica, en donde la infección bacteriana está mediada por una bacteria seleccionada a partir del grupo que consiste en Staphy lococcaceae, Streptococcaceae, Legionellaceae, Pseudomonadaceae, Bacillaceae, Chlamydiaceae, Mycoplasmata ceae, Enterobacteriaceae, Pseudomonadales y/o Pasteurellaceae.

Preferiblemente, PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo es para uso en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una coinfección que comprende una infección bacteriana y una enfermedad vírica, en donde el virus es un virus de ARN de cadena negativa, preferiblemente un virus de la gripe, más preferiblemente el virus de la gripe A o el virus de la gripe B.

Preferiblemente, PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se usa en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una enfermedad vírica, en donde PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra en combinación con un inhibidor de la neuraminidasa o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Preferiblemente, PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se usa en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una coinfección que comprende una infección bacteriana y una enfermedad vírica, en donde se administra PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en combinación con un inhibidor de la neuraminidasa o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En una realización alternativa, PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo es para uso en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una enfermedad vírica o en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una coinfección que comprende una infección bacteriana y una enfermedad vírica, en donde el inhibidor de la neuraminidasa se selecciona a partir de oseltamivir, fosfato de oseltamivir, zanamivir, laninamivir o peramivir o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un inhibidor de la neuraminidasa o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Preferiblemente, PD-0184264 es para uso en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una enfermedad vírica y/o en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de enfermedades bacterianas y/o en un método para la profilaxis y/o o el tratamiento de una coinfección que comprende una infección bacteriana y una enfermedad vírica, en donde PD-0184264 se combina con uno o varios inhibidores de MEK.

Preferiblemente, PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo es para el uso en una profilaxis y/o un tratamiento de una infección bacteriana, una infección vírica o una coinfección en un sujeto, preferiblemente un vertebrado, más preferiblemente un ave o un mamífero, lo más preferiblemente un ser humano.

La presente descripción se refiere además a un método para tratar una infección bacteriana en un sujeto que com prende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo al sujeto que lo necesita.

Además, la presente descripción se refiere a un método para tratar una enfermedad vírica en un sujeto que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo al sujeto que lo necesita.

En una realización adicional, la presente descripción se refiere a un método para tratar una coinfección que comprende una infección bacteriana y una enfermedad vírica en un sujeto, en donde el método comprende administrar una can tidad terapéuticamente eficaz de PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo al sujeto que lo ne cesita.

Preferiblemente, el virus es un virus de ARN de cadena negativa, más preferiblemente el virus es el virus de la gripe y lo más preferiblemente, el virus de la gripe es el virus de la gripe A o el virus de la gripe B.

Preferiblemente, la infección bacteriana está mediada por una bacteria seleccionada a partir del grupo que consiste en Staphylococcaceae, Streptococcaceae, Legionellaceae, Pseudomonadaceae, Bacillaceae, Chlamydiaceae, Mycoplasmataceae, Enterobacteriaceae, Pseudomonadales y Pasteurellaceae.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras muestran:

Figura 1: Tratamiento de ratones infectados con la gripe A, con PD-0184264 o CI-1040.

Los resultados del experimento del Ejemplo 1 se presentan como título de virus (log10) en ufp/ml (izquierda) o título de % de virus (derecha).

Figura 2: Gráfico que muestra el impacto de PD-0184264 y CI-1040 sobre el crecimiento bacteriano de MRSA. En diferentes puntos de tiempo, tal y como se indica en el eje horizontal del gráfico, se midieron las densidades ópticas de los cultivos bacterianos exentos de células como una indicación del crecimiento bacteriano, que se muestra en el eje vertical del gráfico en % (DO600). Los datos representan el valor medio de tres duplicados biológicos descritos en el Ejemplo 2.

Figura 3: Inhibición del crecimiento bacteriano de MRSA con diferentes concentraciones de PD-0184264.

Se administró PD-0184264 en diferentes concentraciones (tal y como se indica) a un cultivo de una noche de S. aureus USA300 (MRSA). Después de 6 horas se analizó la densidad óptica. Los datos que se muestran en la figura repre sentan un experimento que parte de tres duplicados biológicos descritos en el Ejemplo 2.

Figura 4: El impacto de CI-1040 y PD-0184264 sobre el crecimiento bacteriano.

(A) Impacto de CI-1040 sobre el crecimiento bacteriano con diferentes concentraciones. (B, C) Impacto de PD-0184264 sobre la cepa 6850 de S. aureus (B) o la cepa USA300 (C) con diferentes concentraciones de PD-184264.

Figura 5: La administración de PD-0184264 a células infectadas una vez o coinfectadas protege las células.

Se trataron previamente células epiteliales de pulmón humano (A549) con PD-0184264 (con las concentraciones in dicadas) o con disolvente (DMSO) y se infectaron con la cepa A del virus de la gripe humana/Puerto Rico/8/34 (H1N1). Dado el efecto antivírico y antibacteriano fuerte de PD-0184264 (Fig. 2 a 4), analizamos si esa característica del com puesto también podía observarse macroscópicamente con respecto a los efectos citopáticos de una alteración celular (CPE) provocados por el IAV (virus de la gripe A) y/o una infección con S. aureus. Se observó una ligera alteración de la monocapa celular después de una infección solo con IAV (H1N1) (panel central) o la cepa 6850 de S. aureus (panel superior). Este CPE se incrementó fuertemente después de una coinfección con ambos agentes patógenos (panel inferior), pero se inhibió en presencia de concentraciones crecientes de PD-0184264.

Figura 6: Comparación de la acción antibacteriana de PD-0184264 con los antibióticos comunes.

Para uniformar las propiedades antibacterianas del inhibidor de MEK, PD0184164, con la acción de un antibiótico común, tratamos las bacterias durante una noche con disolvente, los inhibidores de MEK U0126 y PD-0184264 o diferentes concentraciones del antibiótico gentamicina. En comparación con las bacterias tratadas con disolvente, la incubación con el inhibidor de MEK de primera generación, U0126, daba como resultado solo una ligera reducción de los títulos bacterianos, mientras que el tratamiento con PD-0184264 conducía a una reducción muy fuerte de la carga bacteriana. Lo mismo podía decirse para ambas cepas bacterianas.

Figura 7: (a) Resultados de ensayos de tiempo de adición que comparan la acción antibacteriana de PD-0184264 con otros compuestos inhibidores de MEK o con el antibiótico gentamicina.

(b) Resultados de una prueba de resistencia frente al inhibidor de MEK PD0184264 en S. aureus, en comparación con un tratamiento con gentamicina, eritromicina o sin tratamiento.

Figura 8: Estructura del dominio de la cinasa bacteriana PknB (arriba) (Rakette et al. 2012) y homologías de la se cuencia del sitio de autofosforilación de PknB con los sitios de activación de las cinasas MAP de mamífero p38, JNK, y la diana directa de MEK, ERK (Miller et al. 2010).

Figura 9: Determinación del impacto del tratamiento con inhibidores sobre la concentración mínima inhibitoria (CMI) de diferentes antibióticos.

Figura 10: Tolerancia al estrés de la cepa 6850 de S. aureus y la cepa USA300 de MRSA cuando se tratan con PD-0184264.

Figura 11: El tratamiento con PD-0184264 altera el crecimiento de diferentes serotipos de Streptococcus pneumoniae. (A) Efecto de PD-0184264 sobre cultivos de las cepas de Streptococcus pneumoniae TIGR4 (serotipo 4) y D39 wt (serotipo 2), medido mediante DO600; (B) efecto de PD-0184264 sobre cultivos de las cepas de Streptococcus pneu moniae TIGR4 (serotipo 4) y D39 wt (serotipo 2) que se muestra en UFC/ml; (C): efecto de PD-0184264 sobre cultivos de Bacillus subtilis que se muestra en UFC/ml.

Figura 12: Tabla 1: antibióticos.

Figura 13: Imágenes que muestran que el tratamiento de las células con PD-0184264 disminuye fuertemente el CPE (efecto citopático) inducido por agentes patógenos después de una infección solo con bacterias (S. aureus) o una infección vírica (gripe IV) y una coinfección.

Figura 14: Gráfico que muestra los cambios en la carga bacteriana intracelular después del tratamiento con CI-1040 (a) o PD-0184264 (b).

Se obtuvieron resultados comparables cuando CI-1040 o PD-0184264 se administraron en momentos posteriores durante la infección en curso (c).

Figura 15: Gráfico que muestra la viabilidad celular (A, B) y la ruptura de la membrana (C, D).

(A, B) muestran la viabilidad de las células A549 en presencia de concentraciones crecientes de PD-0184264. En (C) y (D), se realizó un ensayo de LDH para determinar la rotura de la membrana debido a un tratamiento con inhibidor. Figura 16: Ensayo de cinasa exento de células que muestra los efectos inhibidores de CI-1040 y PD-0184264 sobre la ruta de MEK.

La actividad de las cinasas se mide determinando la cantidad de proteína diana fosforilada ERK mediante un ensayo ELISA. Se realizaron tres series experimentales independientes que mostraban resultados similares. Aquí se presenta un experimento representativo.

Figura 17: Actividad antivírica de PD-0184264 contra el virus de la gripe H1 N1pdm09 en un ensayo in vitro.

(A) Se infectaron células A549 con virus (MOI = 0,001) para determinar la reducción del título de virus. (B) Las células A549 se infectaron con el virus RBI (MOI = 0,001) y se trataron con diferentes concentraciones de PD-0184264 (100 pM, 50 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, 0,5 pM y 0,1 pM) para determinar el valor de CE⁵⁰. (C) Las células A549 se trataron con diferentes concentraciones de PD-0184264 (100 pM, 50 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, 0,5 pM y 0,1 pM) durante 24 h, seguido de cuatro horas de tinción WST para determinar el valor de CC⁵⁰.

Figura 18: Reducción in vivo del título de virus en el pulmón de ratones mediante PD-0184264.

Después de una infección con el virus H1N1pdm09, se trataron ratones hembra C57BL/6 con 2,8, 8,4 o 25 mg/kg de PD-0184264 (panel de la izquierda) o con 25, 75 o 150 mg/kg de CI-1400 (panel de la derecha) por vía oral. Los animales se sacrificaron 24 h después de la infección y se determinó el título de virus usando el método estándar. Figura 19: PD-0184264 tiene una mejor biodisponibilidad que CI-1040.

(A) Se trataron ratones NMRI macho con 75 mg/kg de CI-1040 (área gris oscura) o con 75 mg/kg de PD-0184264 por vía intravenosa. Se recogió sangre 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h y 24 h (día de prueba 2) después de la administración y se analizó el plasma para detectar la presencia del fármaco.

(B) Se trataron ratones NMRI macho con 150 mg/kg de CI-1040 (área gris oscura) o con 150 mg/kg de PD-0184264 por vía oral usando una sonda oral. Se recogió sangre 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h y 24 h (día de prueba 2) después de la administración y se analizó el plasma para detectar la presencia del fármaco.

Descripción detallada

La siguiente descripción incluye información que puede ser útil para comprender la presente invención. No es una admisión de que cualquier información proporcionada en este documento sea técnica anterior o relevante para las invenciones actualmente reivindicadas, o que cualquier publicación a la que se haga referencia de forma específica o implícitamente, sea técnica anterior.

Dicho esto, la presente invención se refiere a PD-0184264 para uso en un método de profilaxis y/o de tratamiento de una enfermedad vírica, una infección bacteriana o una coinfección que comprende una infección bacteriana y una infección vírica. Tal y como se muestra en los ejemplos, PD-0184264 parece actuar sobre la cinasa bacteriana PknB y, por lo tanto, al menos en parte, puede ejercer su efecto bacteriostático.

Además, tal y como se muestra en los Ejemplos adjuntos, PD-0184264 muestra tener efecto en situaciones de infec ción vírica y bacteriana así como en situaciones de coinfección bacteriana y vírica. Este efecto es sorprendentemente más fuerte que el de CI-1040, un inhibidor de MEK ya conocido en la técnica anterior para el tratamiento de infecciones bacterianas y víricas. Al comparar el efecto inhibidor de CI-1040 y PD-0184264 sobre una cinasa MEK, tal y como se muestra en el Ejemplo 9, se esperaría realmente lo contrario, ya que los inhibidores de MEK se usaban en la técnica anterior para lograr dichos efectos.

Lo mismo ocurre cuando se compara el efecto antivírico de PD-0184264 y CI-1040 en ensayos in vitro. En este docu mento, CI-1040 es más eficaz que PD-0184264 como se puede apreciar en el Ejemplo 10. Específicamente, se nece sita una concentración 10 veces mayor de PD-0184264 en un ensayo in vitro para lograr el mismo efecto inhibidor. Sorprendentemente, se encontró que a pesar de la débil inhibición in vitro, PD-0184264 es superior a CI-1040 in vivo, como se puede apreciar en el Ejemplo 11. Tal y como se muestra en la Figura 18, con 2,8 mg/kg de PD-0184264 ya se muestra una reducción del título de virus, mientras que con 25 mg/kg de PD-0184264 se muestra una reducción de al menos un 90% del título de virus en el pulmón. Por el contrario, CI-1040 muestra una reducción similar solo con 150 gM. Además, el Ejemplo 1 muestra una reducción del título de virus en el pulmón mediante PD-0184264. En el Ejemplo 1, los ratones se infectaron con un virus de la gripe y se trataron con 150 mg/kg, 75 mg/kg o 25 mg/kg de Cl-1040 o PD-0184264 respectivamente. Tal y como se muestra en la Figura 1, con 25 mg/kg de PD-0184264 ya se tiene el mismo efecto que con 150 mg/kg de CI-1040. Por lo tanto, para mayor sorpresa de los inventores, PD-0184264 mues tra un fuerte efecto antivírico in vivo, aunque los datos previos in vitro no proporcionaban ningún incentivo para conti nuar el trabajo con PD-0184264. Este efecto sorprendente se puede basar en una mayor biodisponibilidad de PD-0184264 en comparación con CI-1040, lo que se muestra en el Ejemplo 12.

Los Ejemplos 2, 4 y 6-8 muestran adicionalmente el fuerte efecto antibacteriano de PD-0184264, también en compa ración con CI-1040 y otros inhibidores de MEK. En el Ejemplo 2, se analiza el efecto de PD-0184264 sobre el creci miento bacteriano. La Figura 2 muestra que PD-0184264 inhibe el crecimiento de bacterias, mientras que CI-1040 no tiene ningún efecto sobre el crecimiento bacteriano. En la Figura 3 se muestra que el crecimiento bacteriano es inhibido por PD-0184264 de una manera dependiente de la concentración, mostrando una inhibición casi completa del creci miento a partir de PD-018426450 gM. De manera similar, también la Fig. 4 muestra que el crecimiento bacteriano es inhibido por PD-0184264 de una manera dependiente de la concentración (PD-0184264 10 gM ya muestra una reduc ción significativa del crecimiento) mientras que CI-1040 no tiene ningún efecto sobre el crecimiento bacteriano. En el Ejemplo 4, el efecto antibacteriano de PD-0184264 se compara con el inhibidor de MEK, U0126, o el antibiótico gentamicina. La Figura 6 muestra que PD-184264 tiene un efecto antibiótico similar al de la gentamicina mientras que el inhibidor de MEK, U0126, conocido de la técnica anterior, no tiene ningún efecto sobre el crecimiento bacteriano. Se puede decir lo mismo para la Figura 7A, en la que se hace un seguimiento del curso del crecimiento bacteriano. En la Figura 7B se muestra adicionalmente que PD-0184264 no induce una resistencia frente a PD-0184264 mientras que las bacterias desarrollan fácilmente resistencias frente a gentamicina y eritromicina. Por tanto, PD-0184264 no induce resistencia en las bacterias. En el Ejemplo 6 se analizó la influencia de PD-0184264 sobre la sensibilidad de las bac terias frente a un antibiótico. Tal y como se muestra en la Figura 9 y la Tabla 2, el tratamiento con PD-0184264 conduce de hecho a un aumento de la susceptibilidad de las bacterias frente a diferentes antibióticos, lo que era más prominente en el caso de la penicilina y la gentamicina. Además, la Figura 10 muestra que PD-0184264 disminuye la tolerancia frente al estrés de las bacterias. El Ejemplo 7 proporciona una evidencia de que el efecto de PD-0184264 no se limita a S. aureus, sino que también tiene un efecto sobre otras bacterias tales como Streptococcus pneumoniae (véanse las Figuras 11 A y B) y Bacillus subtilis (véase la Figura 11C).

Los Ejemplos 3 y 8 subrayan la eficacia de PD-0184264 dentro del contexto de una coinfección bacteriana y vírica. El Ejemplo 3 analizaba si la eficacia de PD-0184264 también podía observarse macroscópicamente con respecto a los efectos citopáticos de una alteración celular (CPE), provocados por una infección vírica y/o bacteriana. La Figura 5 muestra que PD-0184264 reduce el efecto citopático provocado especialmente por una coinfección bacteriana y vírica, de una manera dependiente de la concentración mostrando efectos ya con PD-0184264 15 gM. Lo mismo también se analizó en el Ejemplo 8, en donde se muestra en la Figura 13 nuevamente el efecto positivo de PD-0184264 en una situación de coinfección bacteriana y vírica. El Ejemplo 8 analizaba adicionalmente el efecto de PD-0184264 sobre el título bacteriano intracelular en una situación de coinfección. La Figura 14 muestra que PD-0184264 reduce el título bacteriano intracelular mientras que CI-1040 no tiene ningún efecto. Además, el Ejemplo 8 y la Figura 15 muestran que PD-0184264 no ejerce ningún efecto citotóxico.

PD-0184264 se puede usar en un método para el tratamiento y/o la profilaxis de las afecciones médicas descritas en el presente documento. Como tal, el término "tratar" o "tratamiento" incluye la administración de PD-0184264 preferi blemente en forma de un medicamento, a un sujeto que padece una coinfección que comprende una infección bacte riana y una enfermedad vírica, con el fin de aliviar o mejorar los síntomas que acompañan a tales infecciones. De forma similar se incluye la administración de PD-0184264, preferiblemente en forma de un medicamento, a un sujeto que padece una infección bacteriana o con el fin de aliviar o mejorar los síntomas que acompañan a tales infecciones. Además, se incluye la administración de PD-0184264, preferiblemente en forma de un medicamento, a un sujeto que padece una infección vírica o con el fin de aliviar o mejorar los síntomas que acompañan a tales infecciones. Una coinfección que comprende una infección bacteriana y una enfermedad vírica, una enfermedad vírica y una infección bacteriana es una afección médica que se trata o se previene con PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Además, el término "profilaxis" tal y como se usa en este documento, se refiere a cualquier procedimiento médico o de salud pública cuyo fin es prevenir una afección médica descrita en este documento. Tal y como se usa en el presente documento, los términos "prevenir", "prevención" y "que previene" se refieren a la reducción del riesgo de adquirir o desarrollar una afección determinada, es decir, una coinfección que comprende una infección vírica y una infección bacteriana, una infección bacteriana sola o una infección vírica sola, tal y como se describe en este docu mento. También se entiende por "profilaxis" la reducción o inhibición de la recurrencia de una coinfección que com prende una infección con el virus de la gripe y una infección bacteriana, una infección bacteriana sola o una infección vírica sola en un sujeto.

PD-0184264 de la presente invención es eficaz para tratar una coinfección tal y como se muestra en los Ejemplos 3 y 8. Una "coinfección" tal y como se usa en este documento, comprende una enfermedad vírica, preferiblemente una infección con el virus de la gripe y una infección bacteriana. Una coinfección de ese tipo puede tener lugar mediante una infección simultánea de un hospedador, p. ej., un sujeto y/o una sola célula con una bacteria y un virus de la gripe. También puede ser que un hospedador, p. ej., un sujeto y/o una célula se infecten simultáneamente con una o varias partículas víricas y una o varias bacterias. Sin embargo, esa coinfección también puede tener lugar de forma secuencial. En ese caso, un sujeto y/o una célula se infecta en primer lugar con una o varias partículas víricas y más tarde el mismo sujeto y/o célula se infecta con una o varias bacterias o viceversa. El período de tiempo entre las dos infecciones puede ser un período de tiempo de como máximo 14 días, 13 días, 12 días, 11 días, 10 días, 9 días, 8 días, 7 días, 6 días, 5 días, 4 días, 3 días, 2 días, 1 día, 12 horas, 6 horas, 3 horas, 1,5 horas o como mínimo 30 minutos.

Una situación de ese tipo también puede ser una sobreinfección, en la que una segunda infección se superpone a una anterior, especialmente a través de un agente microbiano diferente de origen exógeno o endógeno que es resistente al tratamiento utilizado contra la primera infección.

Dentro de la infección con un virus de la gripe en una coinfección, la infección con un virus de la gripe puede estar mediada por el virus de la gripe A o el virus de la gripe B, preferiblemente el virus de la gripe A es H1N1, H2N2, H3N2, H5N6, h 5n 8, H6N1, H7N2, H7N7, H7N9, H9N2, h 10N7, N10N8 o H5N1. En una realización, el virus de la gripe A es H1N1. En otras realizaciones, el virus de la gripe A es H3N2, H5N1 y H7N9. En realizaciones adicionales, el virus de la gripe A es H3N2, H5N1, H1N1, H5N6, H7N2 y H7N9.

La presente invención también se refiere a una "infección bacteriana" que puede tener lugar en el contexto de una coinfección descrita anteriormente o puede ocurrir como una única infección presente en un hospedador, p. ej., un sujeto y/o una célula. La infección bacteriana puede estar mediada por cualquier bacteria; preferiblemente está me diada por una bacteria seleccionada a partir del grupo que consiste en Staphylococcaceae, Streptococcaceae, Legionellaceae, Pseudomonadaceae, Bacillaceae, Chlamydiaceae, Mycoplasmataceae, Enterobacteriaceae, Pseudomonadales y/o Pasteurellaceae.

La infección bacteriana puede estar mediada por una bacteria seleccionada a partir del grupo que consiste en estafi lococos, preferiblemente Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus sensible a la meticilina y resistente a la meticilina, Staphylococcus aureus que expresa leucocidina de Panton-Valentine (PVL) y/o estreptococos, preferiblemente Streptococcus mitis, Streptococcus pyogenes o Streptococcus pneumonía, legionela, preferiblemente Legionella pneumophila, seudomonas, preferiblemente Pseudomonas aeruginosa, bacilo, preferiblemente Bacillus subtilis, clamidofilas, preferiblemente Chlamydophila pneumonia, micoplasma, preferiblemente Mycoplasma pneumonia, klebsiela, pre feriblemente Klebsiella pneumonia, moraxela, preferiblemente Moraxella catarrhalis y/o hemofilus, preferiblemente Haemophilus influenza. Preferiblemente, la bacteria se selecciona a partir del grupo que consiste en Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia o Haemophilus influenza. Lo más preferiblemente, la bacteria es Staphylococcus aureus.

La "enfermedad vírica" o "infección vírica" a la que también se refiere esta invención, puede tener lugar en el contexto de una coinfección descrita anteriormente o puede ocurrir como la única infección presente en un hospedador, p. ej., un sujeto y/o una célula. La enfermedad vírica o la infección vírica puede estar mediada por cualquier virus; preferiblemente está mediada por un virus de la gripe. Más preferiblemente, la infección con el virus de la gripe está mediada por el virus de la gripe A o el virus de la gripe B, prefiriéndose los virus de la gripe A. Particularmente prefe ridos son los subtipos de virus de la gripe A H1N1, H2N2, H3N2, H5N6, H5N8, H6N1, H7N2, H7N7, H7N9, H9N2, H10N7, N10N8 y/o H5N1.

En una realización alternativa, PD-0184264 se administra en combinación con uno o varios inhibidores de MEK. Los inhibidores de MEK comprenden, p. ej., U0126, PLX-4032, AZD6244, AZD8330, AS-703026, GSK-1120212, RDEA-119, RO-5126766, RO-4987655, CI-1040, PD-0325901, GDC-0973, TAK-733, PD98059, ARRY-438162, ARRY-162, Ar Ry -300, PF-3644022 y PD184352. El inhibidor de MEK adicional se puede administrar al mismo tiempo, antes o después de PD-0184264.

Preferiblemente, PD-0184264 es para uso en los métodos para la profilaxis y/o el tratamiento de una coinfección de la presente invención, en donde PD-0184264 se combina con uno o varios inhibidores dirigidos al virus de la gripe o a la bacteria. PD-0184264 se puede administrar al mismo tiempo, antes o después de uno o varios inhibidores que se dirigen al virus de la gripe.

En general, un inhibidor dirigido al virus de la gripe es cualquier inhibidor o medicamento eficaz en una terapia de la gripe. Se sabe que diferentes sustancias son eficaces para reducir una infección con el virus de la gripe. Entre ellas se encuentran, por ejemplo, inhibidores contra la neuraminidasa vírica, compuestos dirigidos contra una proteína vírica del canal de iones (M2) y compuestos dirigidos contra la actividad polimerasa o endonucleasa vírica que interfieren con un componente del complejo de la polimerasa vírica: PB1, PB2, PA o NP. La invención también incluye sales farmacéuticamente aceptables de los inhibidores. Sin embargo, un inhibidor preferido es un inhibidor de MEK, PD-0184264 se prefiere particularmente, tal y como se describe en el presente documento.

Los "inhibidores de MEK" inhiben la cascada de señalización mitógena Raf/MEK/ERK en las células o en un sujeto, al inhibir la MEK (proteína cinasa activada por mitógenos). Esa cascada de señalización es robada por muchos virus, en particular los virus de la gripe, para impulsar la replicación vírica. Por lo tanto, un bloqueo específico de la ruta Raf/MEK/ERK en el cuello de botella de MEK, impide el crecimiento de los virus, en particular de los virus de la gripe. Además, los inhibidores de MEK muestran una toxicidad baja y pocos efectos secundarios adversos en seres huma nos. Tampoco hay una tendencia a inducir resistencia vírica (Ludwig, 2009). Un inhibidor particularmente preferido es PD-0184264.

Un "inhibidor de la neuraminidasa" es un fármaco antivírico dirigido al virus de la gripe, que actúa bloqueando la función de la proteína neuraminidasa vírica, evitando de este modo que el virus se libere desde las células infectadas del hospedador, ya que los virus recién producidos no pueden salir de la célula en la que se han replicado. También se incluyen sales farmacéuticamente aceptables de un inhibidor de la neuraminidasa. Los inhibidores de la neuraminidasa preferidos son oseltamivir, zanamivir, peramivir, laninamivir o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de esas sustancias, tal como fosfato de oseltamivir, carboxilato de oseltamivir, etc. Los inhibidores de la neuraminidasa más preferidos son fosfato de oseltamivir, zanamivir, oseltamivir o peramivir.

Los compuestos que se dirigen a la proteína vírica del canal de iones (M2) son, por ejemplo, amantadina y/o rimantadina, mientras que los compuestos que se dirigen a la actividad polimerasa o endonucleasa interfiriendo con un com ponente del complejo de la polimerasa vírica PB1, PB2, PA o NP, son por ejemplo, el bloqueador de NP, nucleozina o el inhibidor de la polimerasa T-705 (Favipiravir).

Además, PD-0184264 se puede combinar con uno o varios inhibidores dirigidos a la bacteria. El Ejemplo 6 muestra que PD-0184264 aumenta la sensibilidad de las bacterias frente a los antibióticos. Un inhibidor que se dirige a la bacteria puede ser cualquier inhibidor eficaz para reducir una infección bacteriana. En la presente invención, PD-0184264 se prefiere especialmente como inhibidor que se dirige a la bacteria, pero otro inhibidor que se dirige a la bacteria conocido por el experto en la técnica, es un antibiótico. Los antibióticos preferidos se pueden obtener a partir de la tabla 1 (Figura 12). Por tanto, en una realización, el antibiótico se selecciona a partir del grupo que consiste en los antibióticos enumerados en la tabla 1 (Figura 12). En una realización adicional, el antibiótico se selecciona a partir del grupo que consiste en la clase de antibióticos que se enumeran en la tabla 1 (Figura 12). En otra realización, el antibiótico se selecciona a partir del grupo que consiste en el nombre genérico de los antibióticos enumerados en la tabla 1 (Figura 12). Son más preferidos los antibióticos seleccionados a partir de gentamicina, rifampicina, lisostafina, eritromicina, levofloxacina, vancomicina, teicoplanina, penicilina y oxacilina.

El "sujeto", que se puede tratar con los inhibidores, en particular los inhibidores de MEK, o combinaciones de inhibi dores de la presente invención, es preferiblemente un vertebrado. En el contexto de la presente invención, el término "sujeto" incluye un individuo que necesita un tratamiento de una coinfección tal y como se describe en el presente documento o una infección bacteriana o vírica sola. Preferiblemente, el sujeto es un paciente que padece una coin fección o una infección bacteriana o vírica sola o que corre el riesgo de padecerla. Preferiblemente, el paciente es un vertebrado, más preferiblemente un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales de granja, animales para deporte, mascotas, primates, ratones y ratas. Preferiblemente, un mamífero es un ser humano, un caballo, un perro, un gato, una vaca, un cerdo, un ratón, una rata, etc., se prefiere particularmente un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un sujeto humano, que opcionalmente tiene una edad de más de 1 año y menos de 14 años, entre 50 y 65 años, entre 18 o 50 años, o mayor de 65 años. En otras realizaciones, el sujeto es un sujeto humano, que se selecciona a partir del grupo que consiste en sujetos que tienen al menos 50 años de edad, sujetos que residen en centros para cuidados crónicos, sujetos que tienen trastornos crónicos del sistema pulmonar o cardio vascular, sujetos que requieren un seguimiento médico regular o una hospitalización durante el año anterior debido a enfermedades metabólicas crónicas, disfunción renal, hemoglobinopatías o inmunosupresión, sujetos menores de 14 años, sujetos entre 6 meses y 18 años que estén recibiendo aspirina como una terapia a largo plazo, y mujeres que están en el segundo o el tercer trimestre de embarazo durante la temporada de la gripe.

En el método de la invención, PD-0184264 se puede administrar por vía oral, intravenosa, intrapleural, intramuscular, tópica o por inhalación. Preferiblemente, PD-0184264 se administra mediante inhalación, por vía tópica u oral.

La presente invención también contempla diferentes composiciones, preferiblemente composiciones farmacéuticas. La presente invención se refiere a una composición que comprende PD-0184264 para uso en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una coinfección que comprende una infección bacteriana y una enfermedad vírica. La presente invención se refiere de manera similar a una composición que comprende PD-0184264 para uso en un mé todo para la profilaxis y/o el tratamiento de una infección bacteriana y/o una enfermedad vírica. La presente invención también proporciona una composición que comprende PD-0184264 y uno o varios inhibidores dirigidos al virus, en particular al virus de la gripe, y/o a la bacteria para uso en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una coinfección que comprende una infección bacteriana y una infección vírica, en particular una infección con el virus de la gripe. Además, la presente invención se refiere a una composición que comprende PD-0184264 y uno o varios inhibidores dirigidos a la bacteria para uso en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una infección bacteriana o una infección vírica.

Tal y como se ha mencionado anteriormente, la composición que comprende PD-0184264 y eventualmente uno o varios inhibidores que se dirigen a la bacteria y/o uno o varios inhibidores que se dirigen al virus, en particular el virus de la gripe, puede ser una composición farmacéutica. Una realización preferida de la composición farmacéutica com prende PD-0184264 y un inhibidor dirigido al virus de la gripe, en particular un inhibidor de la neuraminidasa. En otra realización, la composición farmacéutica comprende PD-0184264 y otro inhibidor de MEK. Preferiblemente, esas com posiciones comprenden además un vehículo, preferiblemente un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composi ción puede estar en forma de suspensiones o comprimidos administrables por vía oral, aerosoles nasales, prepara ciones para dispositivos de inhalación, preparaciones inyectables estériles (por vía intravenosa, intrapleural, intramus cular), por ejemplo, como suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles o supositorios.

La composición farmacéutica para el uso de la invención y que comprende PD-0184264 y opcionalmente uno o varios inhibidores dirigidos a un virus de la gripe y/o uno o varios inhibidores dirigidos a una bacteria, se administra a un paciente que es un mamífero o un ave. Ejemplos de mamíferos adecuados incluyen, pero no se limitan a, un ratón, una rata, una vaca, una cabra, una oveja, un cerdo, un perro, un gato, un caballo, un conejillo de indias, un cánido, un hámster, un visón, una foca, una ballena, un camello, un chimpancé, un mono rhesus y un ser humano, prefiriéndose un ser humano. Ejemplos de aves adecuadas incluyen, pero no se limitan a, un pavo, un pollo, un ganso, un pato, una cerceta, un ánade real, un estornino, un ánade rabudo, una gaviota, un cisne, una pintada o un anseriforme, por mencionar algunos. Los pacientes humanos son una realización particular de la presente invención.

El inhibidor o los inhibidores se administran preferiblemente en una cantidad terapéuticamente eficaz. La "cantidad terapéuticamente eficaz" para PD-0184264 o para cada compuesto activo/inhibidor puede variar con factores que incluyen, pero que no se limitan a, la actividad del compuesto utilizado, la estabilidad del compuesto activo en el cuerpo del paciente, la gravedad de las afecciones que se deben aliviar, el peso total del paciente tratado, la vía de adminis tración, la facilidad de absorción, la distribución y la excreción del compuesto por el cuerpo, la edad y la sensibilidad del paciente que se va a tratar, situaciones adversos y similares, como será evidente para un experto en la materia. La cantidad que se administra se puede ajustar a medida que los diversos factores cambian con el tiempo.

Los inhibidores y los usos descritos en este documento son aplicables tanto a una terapia humana como a aplicaciones veterinarias. Los compuestos descritos en el presente documento, en particular, PD-0184264 y opcionalmente uno o varios inhibidores dirigidos a un virus de la gripe y/o uno o varios inhibidores dirigidos a una bacteria, que tienen la actividad terapéutica deseada, se pueden administrar en un vehículo fisiológicamente aceptable a un sujeto, tal y como se describe en este documento. Dependiendo de la forma de introducción, los compuestos se pueden formular de diversas formas, tal y como se describe a continuación. La concentración del compuesto terapéuticamente activo en la formulación puede variar desde aproximadamente 0,1 a 100% en peso. Los agentes se pueden administrar solos o en combinación con otros tratamientos. El Ejemplo 1 muestra que 25 y 75 mg/kg de PD-0184264 son efectivos in vivo mediante administración oral. Por consiguiente, PD-0184264 se puede administrar en una dosificación en el intervalo de 10 a 100 mg/kg de PD-0184264, preferiblemente en el intervalo de 25 a 75 mg/kg de PD-0184264.

Los compuestos farmacéuticos para uso en el método de la presente invención se pueden administrar en cualquier forma de dosificación unitaria adecuada. Las formulaciones orales adecuadas pueden estar en forma de comprimidos, cápsulas, suspensión, jarabe, goma de mascar, oblea, elixir y similares. En las composiciones farmacéuticas orales se pueden incluir vehículos farmacéuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes, excipientes, lubricantes y edulcorantes o aromatizantes. Si se desea, también se pueden incluir agentes convencionales para modificar sabo res, colores y el moldeado de las formas especiales.

Para las formulaciones inyectables, las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de polvo liofilizado mez clado por adición con excipientes adecuados en un vial o un tubo adecuado. Antes del uso en la clínica, los fármacos se pueden reconstituir disolviendo el polvo liofilizado en un sistema disolvente adecuado, para formar una composición adecuada para inyección intravenosa o intramuscular.

La combinación de PD-0184264 con un agente antivírico tal como un inhibidor de la neuraminidasa, como el oseltamivir, produce un efecto sinérgico. Ese efecto sinérgico puede ser un efecto antivírico incrementado que da lugar, p. ej., a un título de virus reducido o a una ventana terapéutica prolongada. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de PD-0184264 así como una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la neuraminidasa, seleccionado a partir del grupo de oseltamivir, fosfato de oseltamivir, laninamivir, zanamivir y peramivir.

En una realización, la composición puede estar en una forma administrable por vía oral (p. ej., comprimido o cápsula o jarabe, etc.) con una cantidad terapéuticamente eficaz (p. ej., de 0,1 mg a 2000 mg, 0,1 mg a 1000 mg, 0,1 mg a 500 mg, 0,1 mg a 500 mg, 0,1 mg a 200 mg, 30 mg a 300 mg, 0,1 mg a 75 mg, 0,1 mg a 30 mg) de inhibidor de la neuraminidasa como se ha descrito anteriormente.

En realizaciones adicionales, PD-0184264 es para uso en los métodos para la profilaxis y/o el tratamiento de una coinfección de la presente invención, en donde PD-0184264 reduce tanto la infección vírica como la bacteriana, cuando se pone en contacto con un sistema de prueba in vitro, en donde el sistema de prueba comprende células cultivadas infectadas con

a) un virus de gripe

b) una bacteria

en comparación con el sistema de prueba in vitro antes de la puesta en contacto. En otra realización, PD-0184264 es para uso en los métodos para la profilaxis y/o el tratamiento de una infección bacteriana de la presente invención, en donde PD-0184264 reduce la infección bacteriana, cuando se pone en contacto con un sistema de prueba in vitro, en donde el sistema de prueba comprende células cultivadas infectadas con una bacteria, en comparación con el sistema de prueba in vitro antes de la puesta en contacto.

Como tal, la presente invención también se refiere a un sistema de prueba in vitro, en donde el sistema de prueba comprende células cultivadas infectadas con

a) un virus de la gripe y

b) una bacteria.

En esta línea, la presente invención también proporciona un sistema de prueba in vitro, en donde el sistema de prueba in vitro comprende células cultivadas infectadas con una bacteria.

En los casos en los que el sistema de prueba in vitro incluye una infección vírica y bacteriana, nuevamente, esas infecciones pueden tener lugar de forma secuencial o simultánea.

Una "célula cultivada" o "células cultivadas" son células que no están presentes en su entorno natural, p. ej., dentro de una planta o un animal. Más bien, una célula cultivada puede ser un cultivo celular primario, que comprende células aisladas de su entorno natural, o una línea celular. Preferiblemente, las células cultivadas son células epiteliales de pulmón humano. Preferiblemente, las células cultivadas se siembran con una densidad de aproximadamente 1 x 105, 2 x 105, 3 x 105, 4 x 105, 5 x 105, 6 x 105, 7 x 105, 8 x 105, 9 x 105, 10 x 105, 11 x 105, lo más preferiblemente 8 x 105 células en 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml, 2 ml, 2,5 ml, 3 ml, 3,5 ml, 4 ml de medio tal como DMEM. La más preferida es una densidad de 8 x 105 en 2 ml de DMEM.

Esas células cultivadas se infectan con un virus y una bacteria o en otras realizaciones con una bacteria sola. Como ya se ha descrito anteriormente, una coinfección puede tener lugar de manera secuencial o simultánea. Por ejemplo, las células cultivadas se pueden infectar primero con el virus de la gripe y 30 minutos después con la o las bacteria/bacterias. También es posible añadir adicionalmente un antibiótico al cultivo después de 3 horas, para eliminar las bacterias extracelulares. En una situación de ese tipo, el antibiótico se volvería a eliminar por lavado. En otras realiza ciones, las células solo se infectan con una bacteria.

La expresión "poner en contacto", tal y como se usa en este documento, se refiere al acercamiento espacial a PD-0184264 de una célula que comprende un virus de la gripe y una bacteria. Esto puede significar, por ejemplo, que se aplica un inhibidor al medio en el que se encuentran las células cultivadas mediante una jeringa.

En una realización, la reducción de la infección vírica es una reducción de las unidades formadoras de placa (UFP)/ml y la reducción de la infección bacteriana es una reducción de las unidades formadoras de colonias (UFC)/ml. Las "unidades formadoras de placa" son una medición del número de partículas capaces de formar placas por unidad de volumen, tales como las partículas de virus. Es una medición funcional más que una medición de la cantidad absoluta de partículas: las partículas víricas que son defectuosas o que no infectan su célula diana, no producirán una placa y, por lo tanto no entrarán en el recuento. Por ejemplo, una solución de virus de la gripe con una concentración de 1000 UFP/gl, indica que 1 gl de la solución es portador de suficientes partículas de virus para producir 1000 placas infec ciosas en una monocapa celular. En el caso de la presente invención, un cultivo celular tratado con un inhibidor mues tra un número reducido de unidades formadoras de placa en un cultivo después del tratamiento, en comparación con un cultivo antes del tratamiento con PD-0184264.

Una posible "reducción de las unidades formadoras de placa (UFP)/ml" se analiza de la siguiente manera. Primero, las células cultivadas, que están coinfectadas con un virus de la gripe y una bacteria, se analizan para determinar su capacidad para generar unidades formadoras de placa (UFP)/ml, p. ej., succionando algunas células desde la placa de Petri y extendiéndolas sobre placas para el recuento de las placas bacterianas que formarán. A continuación, ese resultado se compara con el número de unidades formadoras de placa (UFP)/ml generadas por células del mismo cultivo después de la aplicación del inhibidor. Si el número de unidades formadoras de placa (UFP)/ml se reduce después del tratamiento con un inhibidor, en comparación con el número generado antes de la aplicación del inhibidor, existe una reducción de las unidades formadoras de placa.

Las "unidades formadoras de colonias (UFC)/ml" estiman el número de bacterias viables en una muestra. Existen diferentes métodos. Por ejemplo, para generar unidades formadoras de colonias, se extiende una muestra (por ejem plo, células cultivadas en un volumen pequeño) a lo largo de la superficie de una placa de agar nutritivo y se deja secar antes de una incubación para el recuento. Una bacteria viable se define como la que tiene capacidad de multi plicarse mediante una fisión binaria en condiciones controladas. La apariencia visual de una colonia en un cultivo celular requiere un crecimiento significativo; cuando se cuentan las colonias, no se sabe con certeza si la colonia surgió a partir de una célula o de 1000 células. Por lo tanto, los resultados se indican como UFC/ml (unidades formadoras de colonias por mililitro) para los líquidos y UFC/g (unidades formadoras de colonias por gramo) para los sólidos, para reflejar esa incertidumbre (en lugar de células/ml o células/g).

Las "unidades formadoras de colonias (UFC)/ml" se pueden analizar de la siguiente manera. Primero, las células cultivadas, que están coinfectadas con un virus de la gripe y una bacteria o con una bacteria sola, se analizan para determinar su capacidad para generar unidades formadoras de colonias (UFC)/ml, p. ej., succionando algunas células desde la placa de Petri y extendiéndolas sobre placas para el recuento. A continuación, ese resultado se compara con el número de unidades formadoras de colonias (UFC)/ml generadas por células del mismo cultivo después de la apli cación del inhibidor. Si el número de unidades formadoras de colonias (UFC)/ml se reduce en comparación con la cantidad generada antes de la aplicación del inhibidor, hay una reducción.

En general, el experto en la materia conoce esas técnicas bien conocidas de análisis de infecciones bacterianas y víricas. Cómo se pueden medir las unidades formadoras de placa (UFP)/ml y las unidades formadoras de colonias (UFC)/ml se describe con más detalle en la bibliografía (Tuchscherr et al. 2011, Hrincius et al. 2010).

Para los fines de la invención, el compuesto activo tal y como se ha definido anteriormente, también incluye la sal o las sales farmacéuticamente aceptables del mismo. La expresión "sal(es) farmacéutica o cosméticamente acepta ble^)", tal y como se usa en este documento, significa aquellas sales de compuestos de la invención que son seguras y efectivas para la forma de administración deseada. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas for madas con aniones, tales como las obtenidas a partir de los ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y las formadas con cationes tales como las obtenidas a partir de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, etc.

La invención también se caracteriza por los siguientes puntos:

1. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para uso en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una enfermedad vírica.

2. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según el punto 1, en el que el virus es un virus de ARN de cadena negativa.

3. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según el punto 1 o 2, en el que el virus es el virus de la gripe.

4. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según uno cualquiera de los puntos 1 - 3, en el que el virus de la gripe es el virus de la gripe A o el virus de la gripe B.

5. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para uso en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una infección bacteriana.

6. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según el punto 5, en el que la infección bacteriana está mediada por una bacteria seleccionada a partir del grupo que consiste en Staphylococcaceae, Streptococcaceae, Legionellaceae, Pseudomonadaceae, Bacillaceae, Chlamydiaceae, Mycoplasmataceae, Enterobacteriaceae, Pseudomonadales y/o Pasteurellaceae.

7. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para uso en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una coinfección que comprende una infección bacteriana y una enfermedad vírica.

8. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según el punto 7, en el que la infección bacteriana está mediada por una bacteria seleccionada a partir del grupo que consiste en Staphylococcaceae, Streptococcaceae, Legionellaceae, Pseudomonadaceae, Bacillaceae, Chlamydiaceae, Mycoplasmataceae, Enterobacteriaceae, Pseudomonadales y/o Pasteurellaceae.

9. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según el punto 7 u 8, en el que el virus es un virus de ARN de cadena negativa.

10. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según uno cualquiera de los puntos 7 - 9, en el que la infección vírica está causada por un virus de la gripe.

11. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según uno cualquiera de los puntos 7 - 10, en el que la infección vírica está causada por el virus de la gripe A o el virus de la gripe B.

12. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según uno cualquiera de los puntos 1 - 4 y 7 - 11, en el que PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra en combinación con un inhibidor de la neuraminidasa o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

13. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según el punto 12, en el que el inhibidor de la neuraminidasa se selecciona a partir de oseltamivir, fosfato de oseltamivir, zanamivir, laninamivir o peramivir o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

14. Una composición farmacéutica que comprende PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

15. Una composición farmacéutica que comprende PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un inhibidor de la neuraminidasa o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

16. Cualquier uso de los puntos anteriores que comprende un inhibidor de MEK adicional.

17. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según uno cualquiera de los elementos anteriores en un sujeto, preferiblemente un vertebrado.

Se debe tener en cuenta que, tal y como se usa en este documento, las formas singulares "un", "una" y "el o ella" incluyen referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un reactivo" incluye uno o varios de esos reactivos diferentes y la referencia al "método" incluye una referencia a etapas y a métodos equivalentes conocidos por los expertos en la técnica que podrían modificarse o sustituirse por los métodos descritos en este documento.

Todas las publicaciones y patentes citadas en esta descripción se incorporan como referencia en su totalidad. En la medida en que el material incorporado como referencia contradiga o sea incompatible con esta memoria descriptiva, la memoria descriptiva sustituirá a ese material.

A menos que se indique lo contrario, la expresión "al menos" que precede a una serie de elementos debe entenderse que se refiere a cada elemento de la serie. Los expertos en la técnica reconocerán o serán capaces de determinar utilizando únicamente una experimentación rutinaria, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de la in vención descrita en el presente documento. Se entiende que esos equivalentes están incluidos en la presente inven ción.

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprender" y las variaciones tales como "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de un número entero o una etapa o un grupo de números enteros o etapas establecidos pero no la exclusión de ningún otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas. Cuando se usa en el presente documento, la expresión "que comprende" puede sustituirse por la expresión "que contiene" o, a veces, cuando se usa en el presente documento, por la expresión "que tiene".

Cuando se usa en el presente documento, "que consiste en", excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en el elemento de la reivindicación. Cuando se usa en el presente documento, "que consiste esencial mente en", no excluye materiales o etapas que no afectan materialmente a las características básicas y novedosas de la reivindicación.

En cada caso del presente documento, cualquiera de las expresiones "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en", se puede reemplazar por cualquiera de las otras dos expresiones.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos ilustran la invención. Estos ejemplos no se deben interpretar como limitantes del alcance de la invención. Los ejemplos se incluyen con fines ilustrativos y la presente invención está limitada únicamente por las reivindicaciones.

Ejemplo 1: El tratamiento de ratones con PD-0184264 conduce a una reducción del título de virus en el pulmón

Se infectaron ratones C57BL/6 de 8 semanas de edad (cinco por grupo) con 1,5 x 105 UFP (5x MLD⁵⁰) de la cepa A/Regensburg/D6/2009 del virus de la gripe, (RB1, H1N1pdm09). Comenzando una hora antes de la infección, los ratones se trataron con 150 mg/kg de CI-1040; 75 mg/kg de CI-1040, 25 mg/kg de CI-1040, 75 mg/kg de PD0184264, 25 mg/kg de PD0184264 o disolvente (control): 50 gl de DMSO/150 gl de Cremophor/800 gl de PBS en un intervalo de 8 h. Todos los animales recibieron un volumen de 200 gl por vía oral. Los ratones se sacrificaron 24 h después de la infección y se pesaron los pulmones, se transfirieron a un tubo de Lysing Matrix D (MP Bio) y se aplicó BSS (solución salina tamponada) a las muestras en una cantidad 10 veces mayor que el volumen del pulmón. Los órganos se tritu raron utilizando FastPrep FP 120 (Savant). Para eliminar los restos celulares, el material homogeneizado se centrifugó durante 15 min a 2000 rpm y se recogió el material sobrenadante. La determinación del título de virus en el material homogeneizado se realizó mediante el ensayo en placa AVICEL®. Los resultados se presentan en la Figura 1 como título de virus (log 10) en ufp/ml (izquierda) o título de virus en % (derecha). El título de virus fue determinado por dos investigadores de forma independiente. Se presentaron los valores medios de todas las titulaciones.

Ejemplo 2: La administración de CI-1040 o PD-0184264 muestra efectos inhibidores sobre el crecimiento bacteriano, incluyendo MRSA in vitro

Para investigar el efecto de CI-1040 o PD-0184264 sobre el crecimiento de las bacterias en general, un cultivo durante una noche exento de células de la cepa MRSA de S. aureus (USA300) se complementó con 50 gM de CI-1040 o PD-0184264 o el mismo volumen (40 gl) de DMSO, que servía como disolvente (Fig. 2). Se realizó un seguimiento del crecimiento bacteriano durante 360 minutos. PD-0184264 tenía un fuerte impacto sobre el crecimiento bacteriano, que estaba casi completamente ausente durante todo el período de observación. CI-1040 inhibía ligeramente el creci miento de MRSA comenzado 120 minutos después del inicio del experimento, en comparación con el control de disol vente como se puede ver en la Figura 2. Esto indica que PD-0184264 pero también CI-1040 además de bloquear a MEK en las células, también bloquea un componente bacteriano responsable del crecimiento bacteriano.

Para la investigación de las concentraciones de PD-0184264 necesarias para inhibir el crecimiento bacteriano, se administró PD-0184264 con diferentes concentraciones (tal y como se indica en la Figura 3) a un cultivo de una noche de S. aureus USA300 (MRSA). Las bacterias MRSA se incubaron con diferentes concentraciones del inhibidor de MEK en el intervalo de 0 - 100 gM y se realizó un seguimiento del crecimiento bacteriano seis horas después del cultivo. La concentración necesaria para inhibir el 50% del crecimiento bacteriano estaba en el intervalo de 15 - 25 gM.

Estos datos se podían verificar en un entorno experimental ligeramente diferente, determinando los títulos bacterianos reales en lugar de la DO en momentos posteriores al tratamiento. Un cultivo durante un día de S. aureus 6850 se fijó en 20 UFC/ml y se trató con diferentes concentraciones de CI-1040 según lo indicado, durante una noche a 37°C y 5% de CO². A continuación, se midió la densidad óptica (DO⁶⁰⁰). El cultivo restante se lavó con PBS y se transfirieron diluciones seriadas a placas de agar BHI. Los títulos bacterianos se muestran como unidades formadoras de colonias por ml (UFC/ml). Los resultados representan la media DE de tres experimentos biológicos independientes con dos duplicados técnicos que se muestran en la Figura 4A. Además, los cultivos de un día de S. aureus 6850 (Figura 4B) o la cepa de MRSA USA300 (Figura 4C), se establecieron en 20 UFC/ml y se trataron con diferentes concentraciones de PD-0184264 tal y como se indica durante una noche a 37°C y 5% de CO². Por la mañana, se midió la densidad óptica (DO⁶⁰⁰). Los cultivos restantes se lavaron una vez con PBS y luego se transfirieron diluciones en serie a placas de agar BHI. Los títulos bacterianos se determinaron usando el "protocolo 3" del recuento de colonias y se muestran como unidades formadoras de colonias por ml (UFC/ml) en una escala logarítmica. Los resultados representan las medias ± DE de tres experimentos biológicos independientes con dos duplicados técnicos. La significación estadística se analizó mediante ANOVA de una vía seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. Tanto CI-1040 (Fig. 4A) como PD-0184264 (Fig. 4B, C) también eran eficaces en estos ensayos contra la cepa 6850 de S. aureus (Fig. 4A, B) y la cepa USA 300 de MRSA (Fig. 4C). Se pudo detectar una reducción muy fuerte de los títulos, de hasta 1,5-2 órdenes de magnitud con 20 gM de PD-0184264 (Fig. 4B, C).

Ejemplo 3: La administración de PD-0184264 a células infectadas una vez o coinfectadas protege a las células de los efectos citopáticos de IAV y/o de S. aureus

Dado el fuerte efecto antivírico y antibacteriano de PD-0184264 (Fig. 2 a 4 en el Ejemplo 2 anterior), analizamos si esa característica del compuesto también podía observarse macroscópicamente con respecto a los efectos citopáticos de alteración celular (CPE) provocados por IAV (virus de la gripe A) y/o una infección con S. aureus. Se trataron previamente células epiteliales de pulmón humano (A549) con PD-0184264 (a las concentraciones indicadas) o con disolvente (DMSO) y se infectaron con la cepa del virus de la gripe humana A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) con una mul tiplicidad de infección (MOI = 0,001) a 37°C. Después de 30 minutos, se retiró la dilución del virus, se lavaron las células con PBS y se complementaron con medio de invasión DMEM/INV (que contenía albúmina de suero humano al 1%, HEPES 25 nM) con o sin S. aureus 6850 (MOI = 0,1), en presencia de las concentraciones indicadas del inhibidor o de control de disolvente. Tres horas después de la infección bacteriana, las células se trataron con DMEM/FBS que contenía FBS al 10%, 2 pg/ml de lisostafina durante 20 min para eliminar las bacterias extracelulares. Después de un lavado adicional con PBS, las células se complementaron con medio de infección DMEM/BA (BA al 0,2%, MgCl²1 mM, CaCl²0,9 mM, 100 U/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina) que contenía inhibidor o disolvente. Después de un período de incubación de 24 h a 37°C, se examinó la morfología celular mediante micros copía óptica. Como se muestra en la Fig.5, se observó una ligera alteración de la monocapa celular después de una infección solo con IAV (H1N1) o la cepa de S. aureus 6850. Este CPE se incrementó fuertemente después de una coinfección con ambos agentes patógenos (panel inferior). Sin embargo, con cantidades crecientes del inhibidor de MEK, ese fenotipo se podía revertir de una manera dependiente de la concentración, ya que la monocapa celular permanecía intacta y las células tenían una forma menos redondeada. Ese efecto protector de las células de PD-0184264 refleja perfectamente sus propiedades antivíricas y antibacterianas (Fig. 5).

Ejemplo 4: Comparación de la acción antibacteriana de PD-0184264 con los antibióticos comunes

Para alinear las propiedades antibacterianas del inhibidor de MEK PD0184164 con la acción de un antibiótico común, tratamos las bacterias durante una noche con disolvente, los inhibidores de MEK, U0126 y PD-0184264 o diferentes concentraciones del antibiótico gentamicina. Cultivos de un día de S. aureus 6850 o la cepa de MRSA USA300 se establecieron en 20 UFC/ml y se trataron tal y como se ha indicado durante una noche con los inhibidores de MEK U0126 y PD-0184264 o el antibiótico gentamicina a 37°C y 5% de CO². Por la mañana, se midió la densidad óptica (DO⁶⁰⁰). Los cultivos restantes se lavaron una vez con PBS y luego se transfirieron diluciones en serie a placas de agar BHI. Los títulos bacterianos se determinaron usando el "protocolo 3" de recuento de colonias y se muestran como unidades formadoras de colonias por ml (UFC/ml). Los resultados que se muestran en la Figura 6 representan las medias ± DE de tres experimentos biológicos independientes con dos duplicados técnicos. La significación estadística se analizó mediante ANOVA de una vía seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. En comparación con las bacterias tratadas con disolvente, la incubación con el inhibidor de MEK de primera generación U0126 daba lugar solo a una ligera reducción de los títulos bacterianos, mientras que el tratamiento con PD-0184264 conducía a una reducción muy fuerte de la carga bacteriana, tal y como se muestra antes en la Fig.4. Esto era el caso para ambas cepas bacterianas. Como era de esperar, el crecimiento de ambas cepas bacterianas estaba fuertemente inhibido por el tratamiento con gentamicina con concentraciones superiores a 1 pg/ml, aunque la acción antibacteriana del antibió tico era mayor en el caso de S. aureus 6850. Con 0,5 pg/ml de gentamicina no se pudo detectar una reducción de los títulos bacterianos en ambas cepas. En resumen, el impacto del inhibidor de MEK PD-0184264 sobre el crecimiento bacteriano era casi tan eficaz como con concentraciones bajas del antibiótico gentamicina.

Para comparar adicionalmente la acción antibacteriana de PD-0184264 con otros compuestos inhibidores de MEK o con el antibiótico gentamicina, se realizaron ensayos de tiempo de adición (Fig. 7a). Un cultivo de una noche de S. aureus 6850 se dividió en seis subcultivos que contenían 15 ml de medio BHI junto con el disolvente DMSO solo o con uno de los inhibidores de MEK, U0126 y PD-0184264, o dos concentraciones diferentes del antibiótico gentamicina (0,5 o 2 pg/ml). Inmediatamente después de la adición de los diferentes compuestos, se midió la DO600 y se transfi rieron diluciones en serie a placas de agar BHI para calcular los títulos bacterianos. Los cultivos restantes se incubaron adicionalmente a 37°C con 5% de CO²en presencia de las sustancias o solo con disolvente. Este procedimiento se repitió dos veces 3 h y 6 h después de la inoculación. Los títulos bacterianos se determinaron usando el "protocolo 3" de recuento de colonias y se muestran como unidades formadoras de colonias por ml (UFC/ml). El tratamiento con el inhibidor de MEK PD-0184264 mostraba la inhibición más fuerte del crecimiento bacteriano, en comparación con todos los demás compuestos. Posteriormente, se realizó un intercambio de medio y los cultivos se incubaron adicionalmente sin adición de ninguna sustancia. Todos los cultivos alcanzaron la turbidez del cultivo tratado previamente con disol vente, lo que indicaba que el inhibidor de MEK PD-0184264 muestra una acción bacteriostática en lugar de bactericida.

El desarrollo de resistencia frente a una variedad de antibióticos de uso común ocurre con regularidad y representa un problema importante en las clínicas. Para someter a ensayo si el inhibidor de MEK PD0184264 provoca el desarrollo de resistencia en S. aureus, los cultivos se trataron constantemente durante casi tres semanas o bien en presencia del inhibidor, de gentamicina, eritromicina o se dejaron sin tratar. Específicamente, se permitió que los cultivos crecie ran durante 24 h en presencia o ausencia de las sustancias, la DO⁶⁰⁰se midió y luego los cultivos se fijaron en 20 UFC/ml y se cultivaron nuevamente durante 24 h. Este procedimiento se repitió durante 17 días. Los datos representan las medias DE de tres experimentos independientes. La significación estadística se analizó mediante ANOVA de una vía seguida de una prueba de comparaciones múltiples de Dunnett (*p <0,05; **p <0,01; ***p <0,001; ****p <0,0001). Como se podía observar con la gentamicina, el desarrollo de resistencia tenía lugar durante la primera semana de tratamiento en contraste con el antibiótico macrólido eritromicina. En particular, el tratamiento con el inhi bidor de MEK no inducía resistencia (véanse los resultados que se muestran en la Figura 7b).

Ejemplo 5: La cinasa bacteriana PknB puede ser una diana de PD-0184264 en las bacterias

Se supone que el inhibidor PD-0184264 es específico de la cinasa MEK que está presente en los mamíferos. Su efecto antibacteriano directo plantea la pregunta sobre el modo de acción en procariotas, es decir, ¿existe un componente bacteriano similar a MEK, que también pueda ser la diana específica de PD-0184264? En este punto, la cinasa bac teriana de serina/treonina PknB se puso en el foco de una investigación. Esta cinasa muestra una similitud estructural y funcional elevada con las cinasas de serina/treonina celulares, más precisamente con las cinasas de MAP, tales como p38, JNK y ERK (Miller et al., 2010, Rakette et al. 2012) (Fig. 8), que son dianas de MEK en las células de mamíferos. Curiosamente, se mostró que la cinasa se activa por autofosforilación, lo que sugiere fuertemente que muestra una actividad similar a MEK.

Ejemplo 6: PD-0184264 aumenta la sensibilidad de Staphylococcus aureus frente a los antibióticos y reduce la resistencia bacteriana frente al estrés

Debido a la expresión de tres dominios de unión a penicilina (PASTA) (véase la Figura 8, panel superior), PknB parti cipa en la regulación de la susceptibilidad frente a los antibióticos. Se pudo mostrar que una falta de la cinasa daba como resultado una mayor susceptibilidad frente a diferentes antibióticos, especialmente frente a una variedad de plactamas (Tamber et al. 2010). Para investigar si el tratamiento de bacterias con el inhibidor de MEK PD-0184264 puede tener un impacto sobre la cinasa bacteriana y dar como resultado un fenotipo similar al de la inactivación de la cinasa, los cultivos bacterianos se trataron durante una noche con disolvente (DMSO) o 20 gM de PD-0184264 y luego se usaron para determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) de diferentes antibióticos. Cultivos durante un día de S. aureus 6850 se establecieron en 20 UFC/ml y se trataron o bien con disolvente (DMSO o con el inhibidor de MEK PD-0184264 durante una noche a 37°C y 5% de CO². Por la mañana, se midió la densidad óptica (DO600). Brevemente, los cultivos tratados con disolvente e inhibidor se lavaron una vez con PBS y se transfirieron diluciones 1:1 a placas de agar BHI. Poco después de la inoculación, se colocaron tiras de prueba de CMI para diferentes anti bióticos (Thermo Fischer Scientific) en el medio de la placa y luego se incubaron durante 18 a 24 h a 37°C. Después de 18 h de incubación a 37°C, se determinaron las concentraciones de CMI mediante un análisis visual de las placas. La concentración, a la que ya no era visible una inhibición del crecimiento, se denominó CMI para cada antibiótico individual. De hecho, el tratamiento con PD-0184264 conducía a un aumento de la susceptibilidad de las bacterias frente a diferentes antibióticos, lo que era más prominente en el caso de la penicilina y la gentamicina (Fig. 9, Tabla 2). Este resultado concuerda perfectamente con los datos publicados generados con la cepa mutante, que carece de la cinasa (Tamber et al. 2010).

Tabla 2: Determinación de las CMIs después de un tratamiento durante una noche con PD0184264

El aumento observado de la susceptibilidad frente a los antibióticos después de un tratamiento con PD-0184264, lo que coincide con el fenotipo de las bacterias que carecen de la cinasa (Tamber et al. 2010), sugiere fuertemente que PknB podría ser la diana directa del inhibidor. Ya que la cinasa es conocida por tener un papel importante en la resistencia bacteriana frente al estrés, se realizó un seguimiento del crecimiento bacteriano bajo estrés por calor después del tratamiento de las bacterias con el inhibidor PD-0184264. La cepa 6850 de S. aureus y la cepa USA300 de MRSA se trataron durante una noche con disolvente o 20 gM de PD-0184264. Al día siguiente se prepararon subcul tivos con la misma cantidad de bacterias (confirmada por DO600 y sembrada sobre agar BHI) y se incubaron adicio nalmente a 42°C durante 6 h. A continuación, se calcularon los títulos bacterianos mediante la siembra en placas de diluciones en serie sobre placas con agar BHI. Como se muestra en la Fig. 10, las bacterias tratadas con PD-0184264 se vieron fuertemente afectadas en esas condiciones, en comparación con los agentes patógenos tratados con disol vente. Esto se observa tanto para la cepa 6850 sensible a la meticilina (barras negras) como para la cepa USA300 de MRSA (barras grises). La tolerancia alterada frente al estrés en presencia del inhibidor es otra indicación de que PD-0184264 se dirige directamente a la cinasa PknB, que es un mediador importante de la resistencia frente al estrés. En resumen, los datos proporcionan una fuerte evidencia circunstancial de que PD-0184264 desencadena su acción antibacteriana mediante la inhibición de la cinasa bacteriana PknB.

Ejemplo 7: La administración de PD-0184264 muestra efectos inhibidores sobre el crecimiento de Streptococcus pneumoniae y Bacillus subtilis

Junto a S. aureus, existen otras bacterias que se sabe que causan neumonía bacteriana secundaria después de infecciones con el virus de la gripe (IV) en los pacientes. El agente patógeno más abundante en ese contexto es Streptococcus pneumoniae. Estas bacterias representan la causa más común de neumonía adquirida en una comu nidad. En contraste con S. aureus, las infecciones secundarias con Streptococcus pneumoniae tienen lugar más bien en una fase tardía después de IV y, por lo tanto, corresponden a la neumonía postgripal terminal.

De forma similar a S. aureus, la mayoría de las cepas de Streptococcus pneumoniae expresan cinasas de serina/treonina de tipo eucariota, como PknB, que están altamente conservadas entre diferentes géneros. Además, esas cinasas comparten una alta homología con las cinasas celulares de MAP (por ejemplo, ERK, JNK, p38). Los resultados mos trados en los Ejemplos 2-6 obtenidos con diferentes cepas de S. aureus ya demostraron un efecto inhibidor del trata miento con PD-0184264 sobre el crecimiento bacteriano, lo que apuntaba hacia la implicación de cinasas bacterianas, como PknB, en el fenotipo observado. Sorprendentemente, ya existe un homólogo de PknB de S. aureus en Strepto coccus pneumoniae lo que sugiere que esas bacterias también pueden ser sensibles frente a PD-0184264. Por tanto, se analizó el impacto de PD-0184264 sobre diferentes cepas de Streptococcus pneumoniae. Las cepas de Streptoco ccus pneumoniae se pueden dividir en diferentes serotipos, que difieren en su virulencia y patogenicidad general. Para someter a ensayo un efecto independiente del serotipo o de la cepa, usamos las cepas encapsuladas D39 y TIGR4, que son ambas virulentas, pero pertenecen a diferentes serotipos. Se encontró que el tratamiento con PD-0184264 altera el crecimiento de diferentes serotipos de Streptococcus pneumoniae. Específicamente, los cultivos de un día de las cepas de Streptococcus pneumoniae TIGR4 (serotipo 4) y D39 wt (serotipo 2) se establecieron con una densidad óptica (DO600) de 1, se diluyeron 1:2000 en medio BHI y se trataron durante una noche con disolvente (DMSO) o con diferentes concentraciones del inhibidor específico de MEK, PD0184264 (PD; metabolito activo de CI-1040) tal y como se ha indicado. A continuación, se midió de nuevo la DO600 (los resultados se muestran en la Figura 11 A) y se transfirieron series de diluciones a placas de agar BHI para determinar los títulos bacterianos (resultados mostrados en la Figura 11B). Como resultado, se pudo demostrar que ambos serotipos son sensibles a PD-0184264 (Fig. 11 a, b).

Se puede aplicar lo mismo para Bacillus subtilis, para el cual también se observó una fuerte disminución de los re cuentos de bacterias viables en presencia de PD-0184264 10 pM y una abolición completa con concentraciones más altas (véanse los resultados en la Figura 11 c). Específicamente, para someter a ensayo un posible efecto antibacte riano en B. subtilis, cultivos de una noche de B. subtilis se incubaron con disolvente o con diferentes concentraciones del inhibidor de MEK, PD-0184264 (como se ha indicado) durante 18 h. Posteriormente, se determinó la carga bacte riana mediante una medición de la DO600 y la siembra de diluciones en serie en placas de agar BHI. Los datos que se muestran en la Figura 11 representan las medias DE de tres experimentos independientes.

En resumen, estos datos indican una amplia aplicabilidad de PD-0184264 en tratamientos antibacterianos.

Ejemplo 8: PD-0184264 pero no CI-1040 disminuye los títulos bacterianos intracelulares

Una infección con el virus de la gripe (IV) da como resultado una mayor expresión de citocinas antivíricas, principal mente los IFNs de tipo I que activan respuestas antivíricas decisivas aguas abajo y también pueden potenciar infec ciones bacterianas posteriores. Para saber si el tratamiento con CI-1040 o PD-0184264 podría sensibilizar las células para una infección secundaria con S. aureus, cultivos celulares de células epiteliales basales alveolares humanas inmortalizadas (A549) se infectaron con el virus de la gripe IV y S. aureus en presencia o ausencia de los inhibidores. Específicamente, las células A549 se trataron previamente durante 1 h con 10 pM del inhibidor específico de MEK, PD-0184264, o DMSO como control de disolvente. Posteriormente, las células se lavaron con PBS y se infectaron con el virus de la gripe (IV) (MOI como se ha indicado) durante 30 min a 37°C, 5% de CO². Posteriormente, las células se lavaron con PBS y se infectaron con S. aureus 6850 (MOI como se ha indicado) en presencia o ausencia del inhibidor durante 3 h. Para evitar un crecimiento excesivo de las bacterias, se realizó una etapa de lavado con antibiótico con lisostafina (2 pg/mL) durante 20 min a 37°C para eliminar las bacterias no internalizadas. A continuación, las células se lavaron una vez y se incubaron adicionalmente hasta 24 h p.i. en presencia del inhibidor o del disolvente. Al final del período de incubación, la monocapa celular se analizó mediante microscopía óptica. El examen microscópico reveló que una superinfección con ambos agentes patógenos daba como resultado un efecto citopático (CPE) muy incrementado, en comparación con las infecciones aisladas (Figura 13, panel superior). El CPE se suprimió comple tamente en presencia de PD-0184264 (Figura 13, panel inferior), lo que indica una replicación vírica reducida.

Para ver si el tratamiento con PD-0184264 y con CI-1040 era comparable, las células A549 se trataron previamente con CI-1040, PD-0184264 10 pM o con disolvente (DMSO) durante 60 min y luego se infectaron con el virus de la gripe IV (H7N7) con una MOI de 0,001 a 37°C. Los resultados se muestran en las Figuras 14A y 14B, respectivamente. Alternativamente, las células se dejaron sin tratar (DMSO) y se infectaron con IV (H1N1) con una MOI de 0,01 a 37°C. Después de 30 min, se retiró la dilución del virus, las células se lavaron con PBS y se complementaron con medio de invasión con o sin S. aureus 6850 (6850) (MOI 0,1) en presencia de CI-1040, PD-0184264 10 pM o control de disol vente. Tres horas después de la infección bacteriana, las células se trataron con lisostafina (2 pg/mL) durante 20 min para eliminar las bacterias extracelulares. A continuación, las células se lavaron y se complementaron con medio de infección que contenía el inhibidor o el disolvente. Después de un período de incubación total de 24 h (después de la infección vírica) se analizaron los títulos bacterianos intracelulares. Los resultados representan la media DE de tres experimentos individuales. La significación estadística se evaluó mediante ANOVA de una vía seguida de una prueba de comparaciones múltiples de Tukey (*p <0,05; **p <0,01; ***p <0,001; ****p <0,0001). Como se puede observar en la Figura 14A, el tratamiento con CI-1040 no sensibilizaba las células para una infección secundaria con S. aureus, ya que no se pudieron detectar cambios en la carga bacteriana intracelular. Sorprendentemente, la administración de PD-0184264 incluso daba como resultado una reducción de los títulos bacterianos intracelulares, como se puede observar en la Figura 14B. Se obtuvieron resultados comparables cuando se administraron CI-1040 o PD-0184264 en momen tos posteriores durante la infección en curso, tal y como se muestra en la Figura 14C.

Para descartar que la reducción de la replicación vírica e intracelular bacteriana fuera un resultado de un efecto citotóxico de PD-0184264 sobre las células A549, se realizó un seguimiento de la viabilidad celular en presencia de con centraciones crecientes durante 24 y 48 horas. Además, se realizó un ensayo de LDH para determinar la ruptura de la membrana debido al tratamiento con los inhibidores. Se mostró que el tratamiento de las células A549 con PD-0184264 no inducía toxicidad celular. Las células A549 se trataron durante 24 (como se muestra en las Figuras 15 A y C) o 48 (como se muestra en las Figuras 15 B y D) horas con concentraciones crecientes de PD-0184264 (1,5, 10, 20, 50 o 100 pM). Después de los tiempos de incubación, se tomaron materiales sobrenadantes para medir la libera ción de LDH (que se muestra en las Figuras 15 C, D) usando el kit de ensayo de citotoxicidad CytoSelect LDH de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Además, las células viables se contaron mediante tinción con azul tripán. La viabilidad celular se normalizó frente a las células tratadas con DMSO y se muestra como el % de viabilidad. Los datos muestran medias DE de tres experimentos independientes. La significación estadística se calculó mediante ANOVA de una vía seguida de una prueba de comparaciones múltiples de Dunnett (*p <0,05; **p <0,01; 27 ***p <0,001).

Ejemplo 9: Determinación de los valores de CI⁵⁰para CI-1040 y PD-0184264

Se disolvieron partes alícuotas de inhibidor en DMSO al 100% (solución maestra 10 mM). Para analizar los valores de CI50 se prepararon las siguientes diluciones en serie en una placa de microtitulación: 50 pM, 25 pM, 5 pM, 2,5 pM, 0,5 pM, 0,25 pM, 0,05 pM, 0,025 pM, 0,005 pM. Se añadió 1 pl de cada dilución a 49 pl de la mezcla de reacción de cinasa, obteniéndose las siguientes concentraciones de prueba: 1 pM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 0,5 nM, 0,1 nM.

Se mezclaron 3 pl de c-Raf1 activo, 2 pl de MEK1wt y 3 pl de ERK2wt de soluciones de proteína purificada, con tampón de cinasa y 1 pl de DMSO o DMSO/inhibidor (volumen final 45 pl). La mezcla se incubó durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de esta preincubación, asegurando la unión del inhibidor a la proteína MEK, se inició la reacción de la cinasa añadiendo 5 pl de ATP 10 mM y mezclando con la pipeta. Las muestras se incubaron durante 30 min a 26°C en un termomezclador (Eppendorf) a 500 rpm. Para detener la reacción de la cinasa, se aña dieron 5,5 pl de una solución de SDS al 20% y esta mezcla se incubó posteriormente durante 10 min a 50°C. A continuación, cada muestra se diluyó con 190 pl de tampón de bloqueo (BSA al 1% en TBST). Se añadieron 100 pl de cada muestra a los pocillos recubiertos con anticuerpo anti-ERK de una placa de microtitulación de 96 pocillos.

Las muestras de la reacción de cinasa (100 pl/pocillo) se incubaron durante 60 min a temperatura ambiente en los pocillos recubiertos con anticuerpo anti-ERK y bloqueados con BSA de una placa de microtitulación de 96 pocillos. Las placas se lavaron posteriormente 3 x 5 min con 100 pl de tampón de lavado TBST. Para detectar ERK fosforilada, se añadió un anticuerpo anti fosfo-ERK (p44/p42) (1:3000, 100 pl/pocillo en tampón de bloqueo) y se incubó durante una noche a 4°C.

Después de tres etapas de lavado (3x100 pl/pocillo], se añadió un anticuerpo específico de IgG anti-ratón conjugado con HRP (1:1000 en TBST) y se incubó durante 60 min a temperatura ambiente. Se añadieron 100 pl/pocillo de sus trato de peroxidasa ABTS después de tres etapas de lavado adicionales (3x100 pl/pocillo de TBST) y se incubaron durante 30 min a 30°C. La reacción del sustrato se detuvo añadiendo 2,5 pl de SDS al 20%. La densidad óptica (DO) de la mezcla se midió a una longitud de onda de 405 nm en un lector de ELISA.

El ensayo con cinasa exento de células reveló que se necesitan 12,5 veces menos cantidad de CI-1040 (Figura 16) para inhibir el 50% de la actividad de MEK, en comparación con PD-0184264 que en realidad es un inhibidor más débil de la cinasa MEK. Por lo tanto, nadie hubiera esperado los fuertes efectos antivíricos y antibacterianos de PD-0184264. Sin embargo, tal y como se muestra en los Ejemplos anteriores, PD-0184264 muestra una actividad antivírica y anti bacteriana más fuerte en comparación con CI-1040 in vivo.

Ejemplo 10: Actividad antivírica de PD-0184264 en un ensayo in vitro

Fármacos

CI-1040 [2-(2-cloro-4-yodofenilamino)-N-(ciclopropilmetoxi)-3,4-difluoro benzamida; lote: CC-5395.0-16] y PD-0184264 (PD0184264) [ácido 2-(2-cloro-4-yodofenilamino)-N-3,4-difluorobenzoico; lote: CC-5595.4-10] se sintetizaron en ChemCon GmbH (Friburgo, Alemania). Para los experimentos de cultivos celulares, se preparó una solución madre 10 mM de CI-1040 (M = 478,66 g/mol) y PD-0184264 (M = 409,55 g/mol) en DMSO (Merck-Millipore; Alemania).

Virus y células

Los experimentos de inhibición de virus se realizaron con la cepa RB1 del virus de la gripe A [A/Regensburg/D6/09 (H1 N1pdm09)] con una MOI de 0,001.

Ensayo de inhibición del virus de la progenie

Las células A549 se infectaron con RB1 durante 30 min a 37°C en una atmósfera con 5% de CO². Después de la incubación, se aspiró la dilución del virus y las células se lavaron con PBS y se complementaron con 500 pl de IMDM (medio de Dulbecco modificado con Iscove)/BA (albúmina bovina) - Medio (BA al 0,2%, MgCl²1 mM, CaCl²0,9 mM, 100 U/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina) y 0,6 pl de tripsina tratada con TPCK en presencia de o bien CI-1040 10 pM o diferentes concentraciones de PD-0184264 (100 pM, 50 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, 0,5 pM y 0,1 pM, concentración final de DMSO = 1%) durante 24 h a 37°C en 5% de CO². El control de disolvente era medio Im Dm /BA con DMSO al 1%. Los materiales sobrenadantes de los cultivos celulares se recogieron para determinar los títulos de virus de la progenie en células MDCK II, utilizando el ensayo de placa AVICEL®, como se ha descrito anteriormente (Haasbach et al. 2011, Matrosovich et al. 2006).

Ensayo WST

Se sembraron células A549 en una placa para tejidos de fondo plano de 96 pocillos (Greiner, Alemania) y se cultivaron durante una noche. Posteriormente, las células se trataron con diferentes concentraciones de PD-0184264 (100 pM, 50 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, 0,5 pM y 0,1 pM) disuelto en 100 pl de IMDM (ThermoFisher, Alemania) complementado con suero de ternera fetal al 5% (Sigma-Aldrich; Alemania) concentración final de DMSO = 1% y el cultivo se realizó a 37°C y 5% de CO²durante 24 h. A continuación, se añadieron 10 pl de reactivo WST-1 (Roche, Alemania) al medio de cultivo y se incubó durante cuatro horas. Durante ese tiempo, la sal de tetrazolio estable WST-1 se escindió en un formazán soluble mediante células metabólicamente activas en el cultivo. Después de ese período de incubación, el colorante formazán formado se cuantificó con un lector de ELISA a 405 nm. La absorbancia medida se correlacionaba directamente con el número de células viables.

Resultados

La actividad antivírica de PD-0184264 contra RB1 se investigó en el ensayo de inhibición de virus estándar (Figura 17A). Se encontró una reducción de 98,87 ± 0,03% del título de virus cuando las células se trataban con PD-0184264 100 pM (P >0,0001). Se encontró una reducción similar con PD-0184264 50 pM (91,50 ± 2,08%; P >0,0001). Por el contrario, solo se encontró una reducción débil del título de virus cuando se utilizaba PD-0184264 10 pM (58,97 ± 4,45%). PD-0184264 1 pM daba como resultado casi ninguna reducción de la progenie del virus. Por tanto, en com paración con la reducción del virus con CI-104010 pM (96,78 ± 0,65%; P >0,0001) se necesita una concentración casi 10 veces mayor de PD-0184264 para lograr una reducción similar de la progenie del virus de la gripe. Esto también está en línea con el valor de CE50 para PD-0184264 en comparación con CI-1040. Para PD-0184264, el valor de CE⁵⁰es de 0,804 pM (Figura 17B). En otro trabajo, el valor de CE⁵⁰para CI-1040 contra RB1 se podía determinar como 0,026 pM (Haasbach et al. 2017). Para PD-0184264, el valor CC⁵⁰de >1576 (Figura 17C) es mayor que en compara ción con CI-1040 (>312,3 pM; Haasbach et al. 2017). Por tanto, PD-0184264 tiene un I.S. = 1960 (índice de selectivi dad).

Resumen/Discusión

Los resultados muestran una actividad antivírica reducida de PD-0184264 en un cultivo celular, es decir in vitro, en comparación con CI-1040. Se requiere una concentración casi 10 veces mayor de PD-0184264 para lograr la misma reducción de virus que con CI-1040 en un ensayo in vitro. La diferencia del valor de CE⁵⁰entre estos dos compuestos es aún más pronunciada. En este caso, el valor de CE⁵⁰de PD-0184264 es 31 veces mayor que en comparación con el valor de CE⁵⁰de CI-1040 (Haasbach et al. 2017). El I.S. de PD-0184264 contra RB1 en células A549 también se reduce en comparación con el desarrollo de CI-1040.

Ejemplo 11: Reducción in vivo del título de virus en el pulmón de ratones a través de PD-0184264

(A) Después de una infección con H1N1pdm09, se trataron ratones hembra C57BL/6 con 2,8, 8,4 o 25 mg/kg de PD-0184264 (lado izquierdo) o con 25, 75 o 150 mg/kg de CI-1400 (lado izquierdo) por vía oral. Los animales se sacrifi caron 24 horas después de la infección y se extrajeron los pulmones para preparar una suspensión al 10%. El título de virus se determinó usando el método estándar. El título de virus de los ratones tratados con los dos inhibidores de MEK se comparó con el título de virus de los ratones tratados con disolvente (control) solo. El título de virus en los pulmones de los ratones de control se estableció en 100% (barra negra). Se utilizó el programa informático Graphpad Prism 7 para ilustrar ambas figuras.

Fármacos

CI-1040 [2-(2-cloro-4-yodofenilamino)-N-(ciclopropilmetoxi)-3,4-difluoro benzamida; lote: CC-5395.0-16] y PD-0184264 (PD0184264) [ácido 2-(2-cloro-4-yodofenilamino)-N-3,4-difluorobenzoico; lote: CC-5595.4-10] se sintetizaron en ChemCon GmbH (Friburgo, Alemania). Para la aplicación oral de 25 mg/kg, se disolvieron 2,5 mg de PD-0184264 en 50 pl de DMSO (Sigma-Aldrich, Alemania) y se diluyeron adicionalmente con 0,15 ml de Cremophor EL (Merck-Millipore, Alemania) y 0,8 ml de PBS (Gibco, Alemania). Alemania). Para la aplicación de 8,4 mg/kg y 2,8 mg/kg, se disolvieron 0,84 mg o 0,28 mg de PD-0184264 con 50 pl de DMSO (Sigma-Aldrich, Alemania) y se diluyeron adicio nalmente con 0,15 ml de Cremophor EL/0,8 ml de PBS. Se disolvieron 202,5 mg de CI-1040 en 0,5 ml de DMSO/0,15 ml de Cremophor EL/0,8 ml de PBS y se diluyeron adicionalmente con Cremophor EL y PBS.

Animales

Se utilizaron ratones hembra C57BI/6 de ocho semanas de edad (Charles River Laboratories, Alemania) con un peso corporal de 21,0 - 24,0 g en el momento de la administración para los estudios antivíricos. Los animales se alimentaron normalmente. Había agua potable disponible a voluntad.

Aplicación de fármacos

Los fármacos se administraron utilizando una sola dosificación el día 1 de la prueba mediante sonda oral. La tasa de aplicación era de 15 s por dosis con un volumen de administración de 200 gl.

Ensayo de titulación de virus pulmonares

Los ratones se sacrificaron 24 h después de la infección y se pesaron los pulmones, se transfirieron a un tubo de Lysing Matrix D (MP Bio) y se aplicó BSS en una cantidad que era 10 veces el volumen del pulmón. Los órganos se trituraron utilizando FastPrep FP 120 (Savant). Para eliminar los restos celulares, los materiales homogeneizados se centrifugaron durante 15 min a 2000 rpm y se recogió el material sobrenadante. La determinación del título de virus en los materiales homogeneizados se realizó utilizando el ensayo en placa de AVICEL®, tal y como se ha descrito anteriormente (Haasbach et al. 2011, Mastrosovich et al. 2006).

Resumen/Discusión

La Figura 18 muestra los resultados de los experimentos. En comparación con el experimento de control, solo las concentraciones de 75 mg/kg o más de CI-1040 mostraban algún efecto en la reducción del título del virus. Por el contrario, PD-0184264 ya mostraba una reducción del título de virus en el pulmón con una concentración de 2,8 mg/kg, de aprox. el 70%. Con una concentración de 8,4 mg/kg, el título de virus se reduce hasta una cantidad de aprox. el 20%, mientras que con 25 mg/kg el título de virus se reduce a aprox. el 10%. Por lo tanto, se necesita una concentra ción 6 veces menor de PD-0184264 para lograr un efecto similar al que se obtiene con 150 mg/kg de CI-1040, lo que subraya el alto potencial de PD-0184264 para tener efectos antivíricos.

Ejemplo 12: PD-0184264 tiene una mayor biodisponibilidad que en comparación con CI-1040

(B) Se trataron ratones NMRI macho con 150 mg/kg de CI-1040 (área gris oscura) o con 150 mg/kg de PD-0184264 por vía oral usando una sonda oral. Se recogió sangre 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h y 24 h (día de prueba 2) después de la administración y se analizó el plasma para detectar la presencia del fármaco. Cada punto de datos representa el valor medio de tres muestras de plasma. Se utilizó el programa informático Graphpad Prism 7 para ilustrar ambas figuras.

Fármacos

CI-1040 [2-(2-cloro-4-yodofenilamino)-N-(ciclopropilmetoxi)-3,4-difluoro benzamida; lote: CC-5395.0-15] y PD-0184264 (PD0184264) [ácido 2-(2-cloro-4-yodofenilamino)-N-3,4-difluorobenzoico; lote: CC-5595.4-10] se sintetizaron en ChemCon GmbH (Friburgo, Alemania). Para una aplicación i.v., se disolvieron 30,65 mg de CI-1040 en 0,075 ml de DMSO (Sigma-Aldrich, Suiza) y se diluyeron adicionalmente con 0,225 ml de Cremophor EL (Merck-Millipore, Ale mania) y 2,7 ml de PBS (Gibco, Alemania). Se disolvieron 34,88 mg de PD-0184264 en 0,075 ml de dMs O y se diluyeron adicionalmente con 0,225 ml de Cremophor EL/2,7 ml de PBS. Para la aplicación oral, se disolvieron 202,5 mg de CI-1040 en 0,5 ml de dMs O/1,5 ml de Cremophor El/8,0 ml de PBS. Se disolvieron 81,0 mg de PD-0184264 en 0,2 ml de DMSO/0,6 ml de Cremophor EL/3,2 ml de PBS.

Animales

Se utilizaron ratones NMRI macho de ocho semanas de edad (Charles River Laboratories, Alemania) con un peso corporal de 23,9 - 36,5 g en el momento de la administración para los estudios farmacocinéticos. Los animales se alimentaron normalmente. Había agua potable disponible a voluntad.

Toma de muestras de sangre y preparación del plasma

Los experimentos se realizaron en LPT GmbH (Hamburgo, Alemania). Se recogió suficiente sangre completa, extraída bajo anestesia con isoflurano, para obtener al menos 2 x 100 gL de plasma con heparina Li de 3 animales por grupo y en los siguientes puntos temporales: 0 (predosis), 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h y 24 h (día de prueba 2) después de la administración. Las muestras de sangre completa se enfriaron instantáneamente usando un sistema Iso-Therm-Rack (Eppendorf AG, Alemania) hasta la centrifugación, hasta 0,5 horas después de la extracción. Inme diatamente después de la centrifugación, las muestras se almacenaron a -20°C hasta su posterior análisis. El análisis del plasma se realizó utilizando procedimientos estándar en Prolytic GmbH (Frankfurt, Alemania).

Aplicación de los fármacos

Los fármacos se administraron utilizando una sola dosificación el día 1 de la prueba mediante sonda oral o mediante inyección intravenosa en bolo en la vena de la cola. La tasa de inyección era de 15 s/dosis con un volumen de administración de 200 |ul.

Resultados

Los experimentos farmacocinéticos revelaron que se encontraba una mayor exposición de PD-0184264 después de una aplicación i.v. (Figura 19A) y por vía oral (Figura 19B) en el plasma de los ratones, que en comparación con CI-1040, con valores de AUC de 1953,68 |ug*h/ml de PD-0184264, que son mucho más altos que los valores para Cl-1040. Se debe tener en cuenta que ocho horas después de la aplicación i.v. y después de la aplicación por vía oral de CI-1040, casi no se detectaba fármaco en el plasma. Por el contrario, después la aplicación por vía oral de PD-0184264 2 en el punto de datos de 8 h, todavía se encontraba una concentración elevada.

Resumen/Discusión

La drástica diferencia de la exposición en plasma para PD-0184264 y CI-1040 después de una aplicación única i.v., ya da lugar a la suposición de que CI-1040 podría degradarse rápidamente. Los inventores supusieron que el fármaco disminuye de forma monoexponencial. En general, esta suposición es válida. A concentraciones bajas, el fármaco suele disminuir de forma monoexponencial. Y la constante de la tasa de eliminación terminal no cambia con el tiempo o con diferentes concentraciones de fármaco circulante. Sin embargo, en este punto no sabemos si otros procesos como el círculo enterohepático tienen un papel significativo en la fase terminal del perfil farmacocinético.

En conjunto, PD-0184264 muestra una actividad antivírica más elevada que CI-1040 in vivo, lo que se puede basar en la mayor biodisponibilidad del fármaco.

Referencias

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Claims

REIVINDICACIONES

1. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para uso en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una infección bacteriana.

2. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para uso en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una enfermedad vírica.

3. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para uso en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una coinfección que comprende una infección bacteriana y una enfermedad vírica.

4. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según la reivindicación 2 o 3, en donde el virus es un virus de ARN de cadena negativa.

5. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según la reivindicación 4, en donde el virus es el virus de la gripe.

6. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según la reivindicación 5, en donde el virus de la gripe es el virus de la gripe A o el virus de la gripe B.

7. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según la reivindicación 1 o 3, en donde la infección bacteriana está mediada por una bacteria seleccionada a partir del grupo que consiste en Staphylococcaceae, Streptococcaceae, Legionellaceae, Pseudomonadaceae, Bacillaceae, Chlamydiaceae, Mycoplasmataceae, Enterobacteriaceae, Pseudomonadales y/o Pasteurellaceae.

8. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según una cualquiera de las reivindica ciones 2-6, en donde PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra en combinación con un inhibidor de la neuraminidasa o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

9. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según la reivindicación 8, en donde el inhibidor de la neuraminidasa se selecciona a partir de oseltamivir, fosfato de oseltamivir, zanamivir, laninamivir o peramivir o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

10. Una composición farmacéutica que comprende PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

11. La composición farmacéutica según la reivindicación 10, que comprende adicionalmente un inhibidor de la neuraminidasa o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

12. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según una cualquiera de las reivindi caciones 1 a 9, que comprende un inhibidor de MEK adicional.

13. PD-0184264 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según una cualquiera de las reivindi caciones 1 a 9, en un sujeto, preferiblemente un vertebrado.

14. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, para uso en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una enfermedad vírica o una coinfección que comprende una infección bacteriana y una enfermedad vírica.

15. La composición farmacéutica según la reivindicación 10, para uso en un método para la profilaxis y/o el tratamiento de una infección bacteriana.