KR20200068746A - Il8의 emt 경로 차단 및 암 줄기 세포 극복(il8 bloking emt pathway and overcoming cancer stem cells) - Google Patents

Il8의 emt 경로 차단 및 암 줄기 세포 극복(il8 bloking emt pathway and overcoming cancer stem cells) Download PDF

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시호 타나카
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Abstract

종양-발현 또는 내인성 IL-8을 표적화하기 위해 IL-8에 대한 높은 친화성을 갖는 재조합 재조합 IL-8 항체, 이의 단편 또는 단쇄 가변 단편(scFv)의 조성물, 방법, 및 용도가 제시된다. 바람직하게는, 재조합 IL-8 항체 또는 scFv 단편은 SEQ ID NO. 1 내지 15, 31 내지 32로부터 선택된 제1 아미노산 서열을 포함하는 VH 절편, 및/또는 SEQ ID NO. 16 내지 30, 33 내지 34로부터 선택된 제2 아미노산 서열을 포함하는 VL 절편을 포함한다. 재조합 IL-8 항체 또는 scFv 단편은 종양의 전이를 감소시키거나, 종양 미세환경에서 면역 억제를 감소시키거나, Th2 매개 면역 반응을 감소시키기 위해 종양이 있는 환자에게 투여하기 위한 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있다.

Description

IL8의 EMT 경로 차단 및 암 줄기 세포 극복(IL8 BLOKING EMT PATHWAY AND OVERCOMING CANCER STEM CELLS)
본 출원은 2017년 11월 1일에 출원된 일련 번호 제62/580,232호를 갖는 본 출원인의 공동계류 중인 미국 가특허 출원에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명의 분야는 종양의 전이를 감소시키거나 종양 미세환경에서 면역 억제를 감소시키도록 종양이 있는 환자를 치료하기 위한 인터류킨-8(interleukin-8: IL-8)에 대한 재조합 scFv 또는 항체의 조성물, 방법, 및 용도이다.
배경 설명은 본 발명을 이해하는 데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 이는 본원에 제공된 임의의 정보가 선행 기술이거나 본원에서 청구되는 발명에 관련된다거나, 구체적으로 또는 암시적으로 참조되는 임의의 간행물이 선행 기술이라고 인정하는 것이 아니다.
각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 지시된 정도와 동일한 정도로, 본원의 모든 간행물 및 특허 출원이 참조로 포함된다. 포함된 참조문헌에서 용어의 정의 또는 사용이 본원에 제공된 해당 용어의 정의와 불일치하거나 상반되는 경우, 본원에 제공된 해당 용어의 정의가 적용되며, 참조문헌에서의 해당 용어의 정의는 적용되지 않는다.
호중구 주화성 인자(neutrophil chemotactic factor)로도 알려진 인터류킨-8(IL-8)은 주로 대식 세포 및 상피 세포에 의해 생성되며, 면역 세포(예를 들어, 호중구)를 감염 부위로 동원함으로써 면역계에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 최근, 특히 종양 전이 및 종양 미세환경에서의 면역-억제 메커니즘에서, 종양-생성 IL-8과 종양의 발달 사이의 관계를 확인하는 것에 대한 관심이 증가하고 있다. 예를 들어, 여러 연구에 따르면, 종양-생성 IL-8이 전이성 종양 세포에서 고도 발현되고, 실제로, 종양 세포의 상피-간엽 이행(epithelial-mesenchymal transition)을 유발하여 종양-개시 세포(예를 들어, 종양 줄기 세포)를 생성할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 그 밖의 연구에 따르면, 종양-생성 IL-8이 골수-유래 억제 세포(Myeloid-Derived Suppressor Cell: MDSC)를 끌어당기고, 이것이 종양 미세환경에서 T-세포 매개 면역 반응을 방해함으로써 종양 주위에 면역-억제 미세환경을 제공할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
종양 발달에서 IL-8의 작용을 완화시키기 위해, IL-8에 대항하는 인간 또는 인간화 항체, IL-8에 대항하는 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 또는 마이크로RNA를 제공함으로써 종양-발현 또는 내인성 IL-8을 중화하려는 노력이 이루어졌다. 예를 들어, Bar-Eli의 미국 특허 공개 제2003/0068319호에는 완전히 인간화되고 단리된 단클론성 또는 다클론성 IL-8에 의한 종양의 혈관신생 및 전이의 저해가 개시되어 있다. 또 다른 예에서, Petrzkowski의 미국 특허 제5,849,903호에는 흑색종 또는 폐 암종의 성장을 감소시키기에 효과적인 IL-8에 대항하는 20개 염기쌍-길이의 안티-센스 올리고뉴클레오타이드가 교시되어 있다. 그러나, 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 또는 마이크로RNA의 작용은 종양의 유형, 및 이러한 조성물의 전달 방법에 따라 달라질 수 있다. 또한, 단리된 인간 또는 인간화 항체는 일부 종양 미세환경에서 효과적이지 않을 수 있으며, 여기서 단리된 인간 또는 인간화 항체는 종양 미세환경에서 내인성 메탈로프로테아제에 의해 절단된다.
이와 같이, 종양 미세환경에서 IL-8의 발현 또는 활성을 저해하려는 여러 접근법이 연구되었지만, IL-8에 대한 높은 친화도의 아미노산 서열을 갖는 재조합 IL-8 항체 또는 단쇄 가변 단편(single chain variable fragment: scFv)을 사용하여 IL-8을 표적화하는 것은 많이 조사되지 않은 채로 남아있다. 따라서, 종양 미세환경에서 종양-발현 또는 내인성 IL-8을 표적화하여 암 치료법의 효과를 증진시키기 위한 재조합 IL-8 항체 또는 단쇄 가변 단편(scFv)의 개선된 조성물, 이를 위한 방법 및 이의 용도에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
본 발명의 주제는, 종양-발현 또는 내인성 IL-8을 표적화하고, 종양 세포의 EMT(상피-간엽 이행), 및/또는 종양 미세환경에서 면역-억제를 촉진하는 데 있어서의 IL-8의 작용을 중화하는, IL-8에 대해 높은 친화도를 갖는 재조합 IL-8 항체, 단쇄 가변 단편(scFv), 또는 항체의 다른 부분(특히 TxM에서, 융합 산물을 포함함)의 다양한 조성물, 이를 위한 방법, 및 이의 용도에 관한 것이다.
따라서, 주제의 일 양태는 단쇄 가변 단편(scFv) 펩타이드를 포함한다. scFv 펩타이드는 제1 아미노산 서열을 포함하는 VH 절편 및/또는 제2 아미노산 서열을 포함하는 VL 절편을 포함한다. 제1 및 제2 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO. 1 내지 15, 31 내지 32 또는 SEQ ID NO. 16 내지 30, 33 내지 34로부터 선택된다.
본 발명의 주제의 또 다른 양태에서, 본 발명자들은 암이 있는 환자를 치료하기 위한 약제학적 조성물을 고려한다. 약제학적 조성물은 제1 아미노산 서열을 포함하는 VH 절편 및/또는 제2 아미노산 서열을 포함하는 VL 절편을 갖는 포함하는 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함한다. 제1 및 제2 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO. 1 내지 15, 31 내지 32 또는 SEQ ID NO. 16 내지 30, 33 내지 34로부터 선택된다. 바람직하게는, scFv 펩타이드는 약리학적으로 허용되는 담체에 존재한다.
본 발명의 주제의 추가의 또 다른 양태는 재조합 핵산에 관한 것이다. 재조합 핵산은 SEQ ID NO. 1 내지 15, 31 내지 32로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 아미노산 서열을 갖는 VH 절편을 인코딩하는 제1 핵산 절편, 및/또는 SEQ ID NO. 16 내지 30, 33 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 아미노산 서열을 갖는 VL 절편을 인코딩하는 제2 핵산 절편을 포함한다. 선택적으로, 제1 및 제2 절편은 동일한 해독틀에 존재한다.
본 발명의 주제의 추가의 또 다른 양태에서, 본 발명자들은 재조합 단리된 항체 또는 이의 단편을 고려한다. 재조합 단리된 항체 또는 이의 단편은 각각의 제1 및 제2 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 포함한다. 바람직하게는, 제1 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 1 내지 15, 31 내지 32로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하고, 제2 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 16 내지 30, 33 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하다.
본 발명의 주제의 추가의 또 다른 양태에서, 본 발명자들은 또한 조직에서의 IL-8 작용을 감소시키는 방법을 고려한다. 이러한 방법에서, 제1 아미노산 서열을 포함하는 VH 절편 및/또는 VL 절편을 갖는 포함하는 단쇄 가변 단편(scFv)이 제공된다. 바람직하게는, 제1 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 1 내지 15, 31 내지 32로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하고, 제2 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 16 내지 30, 33 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하다. 본 방법은 조직에서의 IL-8 작용을 감소시키기에 효과적인 용량 및 일정으로 scFv 펩타이드로 조직을 치료하는 단계로 이어진다.
본 발명의 주제의 추가의 또 다른 양태에서, 본 발명자들은 종양이 있는 환자를 치료하는 방법을 고려한다. 이러한 방법에서, 제1 아미노산 서열을 포함하는 VH 절편 및/또는 VL 절편을 갖는 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 바람직하게는, 제1 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 1 내지 15, 31 내지 32로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하고, 제2 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 16 내지 30, 33 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하다. 약제학적 조성물은 종양을 치료하기에 효과적인 용량 및 일정으로 환자에게 투여된다.
본 발명의 주제의 추가의 또 다른 양태에서, 본 발명자들은 종양이 있는 환자의 면역 억제를 감소시키는 방법을 고려한다. 이러한 방법에서, 제1 아미노산 서열을 포함하는 VH 절편 및/또는 VL 절편을 갖는 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 바람직하게는, 제1 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 1 내지 15, 31 내지 32로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하고, 제2 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 16 내지 30, 33 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하다. 약제학적 조성물은 종양 미세환경에서 골수-유래 억제 세포의 존재를 감소시키기에 효과적인 용량 및 일정으로 환자에게 투여된다.
본 발명의 주제의 추가의 또 다른 양태에서, 본 발명자들은 종양이 있는 환자의 Th-2 매개 면역 반응을 감소시키는 방법을 고려한다. 이러한 방법에서, 제1 아미노산 서열을 포함하는 VH 절편 및/또는 VL 절편을 갖는 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 바람직하게는, 제1 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 1 내지 15, 31 내지 32로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하고, 제2 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 16 내지 30, 33 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하다. 약제학적 조성물은 환자의 Th-2 매개 면역 반응을 감소시키기에 효과적인 용량 및 일정으로 환자에게 투여된다.
본 발명의 주제의 추가의 또 다른 양태에서, 본 발명자들은 환자의 종양 세포의 상피-간엽 이행을 감소시키는 방법을 고려한다. 이러한 방법에서, 제1 아미노산 서열을 포함하는 VH 절편 및/또는 VL 절편을 갖는 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 바람직하게는, 제1 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 1 내지 15, 31 내지 32로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하고, 제2 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 16 내지 30, 33 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하다. 약제학적 조성물은 종양 세포의 상피-간엽 이행을 감소시키기에 효과적인 용량 및 일정으로 환자에게 투여된다.
본 발명의 주제의 추가의 또 다른 양태에서, 본 발명자들은 종양이 있는 환자의 Th-2 매개 면역 반응을 감소시키기 위한 상술된 scFv 펩타이드의 용도를 고려한다. 또한, 본 발명자들은 환자의 종양 세포의 상피-간엽 이행을 감소시키기 위한 상술된 scFv 펩타이드의 용도를 고려한다. 또한, 본 발명자들은 종양이 있는 환자의 종양의 전이를 감소시키기 위한 상술된 scFv 펩타이드의 용도를 추가로 고려한다.
본 발명의 주제의 다양한 목적, 특징, 양태 및 이점은 첨부된 도면과 함께, 바람직한 구현예의 하기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용으로부터 보다 명백해질 것이다.
도 1a는 IL-8 또는 IL-8 동원체 또는 이원체와 scFv 펩타이드(43-12) 중 하나 사이의 결합 동역학의 그래프를 나타낸다.
도 1b는 IL-8 또는 IL-8 동원체 또는 이원체와 scFv 펩타이드(49-31) 중 하나 사이의 결합 동역학의 그래프를 나타낸다.
도 2의 A 내지 도 2의 D는 IL-8 처리(도 2의 A, 도 2의 C) 및 IL-8과 scFv 펩타이드 공동-처리(도 2의 B, 도 2의 D) 시 호중구 유출의 그래프를 나타낸다.
도 3은 IL-8 처리(CTRL) 및 IL-8과 scFv 펩타이드 공동-처리(43-2, 43-12) 시 호중구 유출의 그래프를 나타낸다.
도 4a 내지 도 4c는 특정 pH 조건 하의 IL-8과 scFv 펩타이드(43-12) 중 하나 사이의 결합 동역학(4a), 및 특정 pH 조건 하의 선택된 친화도 성숙 변이형 scFv 펩타이드(43-12a 및 43-12b)에 대한 결합 동역학의 그래프를 나타낸다.
최근 본 발명자들은 종양 발달, 특히, 상피-간엽 이행 경로를 통한 IL-8 매개 종양 전이를 포함하는 다양한 IL-8 매개 작용이 IL-8 작용을 완화시킴으로써 유의하게 감소되거나 심지어 없어질 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 완화 작용은 재조합 IL-8 항체 또는 이의 단편(예를 들어, IL-8에 대항하는 높은 친화도를 갖는 IL-8에 대항하는 scFv 단편)을 이용하여 종양 미세환경에서 IL-8을 포획하거나 달리 결합시킴으로써 달성될 수 있다.
이를 위해, 본 발명자들은 재조합 항체 또는 이의 단편, 또는 scFv 단편이 종양 미세환경에서 종양-생성 또는 내인성 IL-8을 포획할 수 있도록 IL-8에 대항하는 높은 친화도를 갖는 scFv와 같은 다양한 재조합 항체 또는 이의 단편이 생성될 수 있다는 것을 발견하였다. 종양 미세환경으로부터 IL-8의 결합 또는 포획은 종양 세포의 전이를 촉발시키는 종양 세포에 대한 IL-8 작용을 감소시키는 것으로 사료된다. 또한, IL-8의 결합 또는 포획은 골수-유래 억제 세포(MDSC)를 축적함으로써 종양 미세환경에서 면역 억제를 증가시키는 IL-8 작용을 감소시킬 수 있다. 추가로, IL-8의 결합 또는 포획은 종양 미세환경에서 Th2-매개 면역 반응을 증가시키는 IL-8 작용을 감소시킬 수 있고, 이는 종양 미세환경에서 골수-유래 억제 세포의 동원에 기여할 수 있다. 임의의 특정 이론 또는 가설로 국한시키려는 것은 아니지만, 항체 또는 단편에 대한 IL-8 번드(bund)는, 아마도 입체 효과로 인해, 더 이상 이의 생물학적 신호전달 기능을 발휘할 수 없을 것으로 고려된다. 더욱이, 결합이 입자 또는 다른 표면 상에서 매개됨으로써 IL-8을 포획하는 경우, 신호전달에 필요한 IL-8 농도는 감소될 수 있고, 그에 따라 IL-8 작용을 감소시키거나 없앨 수 있다. 따라서, 용어 결합 및 포획은 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "종양"은 인체 내 하나 이상의 해부학적 위치에 배치되거나 그곳에서 발견될 수 있는 하나 이상의 암 세포, 암 조직, 악성 종양 세포, 또는 악성 종양 조직을 지칭하고, 이들과 상호 교환 가능하게 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "~을 결합하다"는 10-3 M, 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M 이하, 또는 10-7 M 이하의 KD와 높은 친화도를 갖는 두 분자 사이의 상호작용을 지칭하고, 용어 "~을 인식하다" 및/또는 "~을 검출하다"와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "~을 제공하다" 또는 "~을 제공하는"은 제조, 생성, 배치, 사용 가능화, 또는 사용 준비의 임의의 행위를 지칭하고 이들을 포함한다.
본 발명의 주제의 예시적이고 특히 바람직한 하나의 양태에서, 본 발명자들은 IL-8에 결합하는 VH 절편 및 VL 절편을 갖는 단쇄 가변 단편(scFv) 펩타이드를 고려한다. scFv의 펩타이드 서열은 IL-8에 대한 요망되는 결합 친화도를 제공하는 임의의 적합한 서열일 수 있는 것으로 고려되지만, 본 발명자들은 scFv 펩타이드가 표 1의 SEQ ID: 1 내지 34에서의 펩타이드 서열 중 적어도 하나 이상을 이용하여 생성될 수 있다는 것을 발견하였다.
대안적으로 및 추가로, 본 발명자들은 또한 표 1에 제시된 VH 절편 및/또는 VL 절편의 아미노 서열이 재조합, 단리된 항체 또는 이의 단편을 생성시키는 데 사용될 수 있는 것으로 고려한다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉, 항원을 면역-특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 함유하는 분자를 지칭한다. 따라서, "항체 및 이의 단편"은 전체 면역글로불린 분자(예를 들어, 전장의 모든 IgG1 등), 전체 항체 분자의 단편을 포함한다. 따라서, 이의 단편은 scFv, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2, 디설파이드 연결 Fvs(sdFvs), Fvs, 및 VH 절편 및/또는 VL 절편을 포함하는 임의의 단편을 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다. 항체가 면역글로불린인 경우, 면역글로불린은 상이한 유형의 면역글로불린을 구성하기 위해 중쇄 또는 불변 도메인의 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY) 및 임의의 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)를 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 또한, "항체"는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단클론성 항체, 다클론성 항체를 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다. 따라서, 표 1에 나타나 있는 바와 같은 VH 및/또는 VL 도메인은 당업계에 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 임의의 기존(전형적으로, 인간 또는 인간화) 항체 또는 항체 단편으로 그래프팅될 수 있다는 것이 인지되어야 한다.
본 발명자들은 표 1에 제시된 VH 절편 및/또는 VL 절편의 아미노 서열은 IL-8이 혼성 단백질에 의해 포집될 수 있도록 이의 표면 상에 VH 절편 및/또는 VL 절편을 갖는 혼성 단백질을 생성시키기 위해 운반 단백질과 커플링되어 사용될 수 있음을 추가로 고려하였다. VH 절편 및/또는 VL 절편을 안정되게 운반하고 바람직하게는 종양 미세환경에 대한 접근을 제공할 수 있는 임의의 적합한 형태의 운반 단백질이 고려된다. 하나의 특히 바람직한 운반 단백질은 알부민, 리폴딩된 알부민, 및 하나 이상의 VH 절편 및/또는 VL 절편과 커플링된 항체 부분(예를 들어, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 Z)에 친화도를 갖는 다른 단백질을 포함한다.
전형적으로, VH 절편 및/또는 VL 절편은 앵커 분자와 커플링되고, 앵커 분자에 의해 VH 절편 및/또는 VL 절편이 운반 단백질과 커플링될 수 있다. 예를 들어, 운반 단백질이 알부민인 경우, 앵커 분자는 알부민의 Sudlow 부위 I 및 II 중 하나 또는 알부민의 임의의 다른 소수성 영역에 맞는 임의의 적합한 크기의 소수성 펩타이드 또는 당지질일 수 있다. 예를 들어, 상술된 바와 같은 IL-8에 대항하는 재조합 면역글로불린 단백질은 이의 Fc 도메인을 통해 운반 단백질과 커플링될 수 있다. 다른 구현예에서, 앵커 분자는 (적어도 10개 아미노산, 15개 아미노산, 20개 아미노산, 30개 아미노산 등의 길이의) 소수성 펩타이드를 포함할 수 있다. 이러한 구현예들에서, (예를 들어, scFv의 형태로서의) VH 절편 및/또는 VL 절편의 다양한 입체형태(configuration) 및 소수성 펩타이드가 고려될 수 있다. 예를 들어, 1가 scFv 도메인이 소수성 펩타이드에 직접적으로 연결될 수 있거나, 다가 scFv가 소수성 펩타이드에 직접적으로 연결될 수 있다. 대안적으로, 하나의 scFv 도메인이 복수의 소수성 펩타이드에 직접적으로 연결될 수 있거나, 복수의 scFv 도메인이 복수의 소수성 펩타이드에 직접적으로 연결될 수 있다.
대안적으로, 또는 추가로, 하나 이상의 VH 절편 및/또는 VL 절편은 운반 단백질에 결합하기 위한 앵커 부분을 갖는 중간체 분자와 커플링될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명자들은 다중 표적 인식 도메인이 운반 단백질 상에 단일 결합 부위를 통해 운반될 수 있도록 중간체 분자가 VH 절편 및/또는 VL 절편에 대한 복수의 결합 부위를 제공하는 것으로 고려한다. 적합한 중간체 분자는 나이브 조직에 임의의 유의한 독성을 제공하지 않는 임의의 단백질, 당지질, 유기 분자, 또는 무기 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 적합한 중간체 분자는 나노입자(예를 들어, 양자점, 금 나노입자, 자성 나노입자, 나노튜브, 폴리머 나노입자, 덴드리머 등), 또는 비드(예를 들어, 폴리스티렌 비드, 라텍스 비드, 다이나비드 등)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 나노입자 및/또는 비드는 1 μm 미만, 바람직하게는 100 nm 미만의 치수를 갖는다. 나노입자는 운반 단백질(예를 들어, 알부민)에 앵커를 제공하는 소수성 꼬리에 가교되거나 이러한 소수성 꼬리로 부분적으로 코팅될 수 있다. 하나 이상의 VH 절편 및/또는 VL 절편이 또한 (예를 들어, 가교 등을 위한 표적 인식 도메인에 연결된 추가 꼬리 도메인을 통해) 나노입자에 가교되거나 나노입자 상에 부분적으로 코팅될 수 있다.
또 다른 예에서, 적합한 중간체 분자는 운반 단백질에 대항하는 항체와 커플링된 비드(예를 들어, 폴리스티렌 비드, 라텍스 비드, 다이나비드 등)를 포함할 수 있다. 따라서, 운반 단백질이 알부민인 경우, 비드가 높은 친화도 및 특이성을 갖는 운반 단백질에 결합할 수 있도록 비드는 α-알부민 항체와 커플링(예를 들어, 가교, 코팅 등)될 수 있다. 하나 이상의 VH 절편 및/또는 VL 절편이 또한 (예를 들어, 가교, 티올-매개 가교 등을 위한 표적 인식 도메인에 연결된 추가 꼬리 도메인을 통해) 비드에 가교되거나 비드 상에 부분적으로 코팅될 수 있다.
일부 구현예에서, scFv 펩타이드는 ALT-803(IL-15 초항진제(superagonist) 복합체, 예를 들어, 문헌[Blood 2015 126:1957] 참조) 또는 TxM(표적화된 ALT-803-기반 스캐폴드 플랫폼, 예를 들어, URL altorbioscience.com/our-science/il-15-protein-superagonist-and-scaffold-technology/ 참조) 구조를 포함하거나 모사하는 재조합 면역글로불린 단백질 복합체를 형성할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명자들은 면역글로불린 단백질 복합체가 TxM 구조를 모사하는 경우, scFv 펩타이드는 하나 이상의 인터류킨-15(IL-15) 결합 모티프, 및/또는 IL-15 결합 모티프에 대한 하나 이상의 리간드(예를 들어, IL-15, IL-15N72D 등)에 직접적으로(또는 링커를 통해 간접적으로) 커플링될 수 있는 것으로 고려한다. 따라서, 재조합 면역글로불린 단백질 복합체가 TxM IgG1 구조를 모사하는 경우, 재조합 면역글로불린 단백질 복합체는 IL-8에 대항하는 1-4 scFv 펩타이드를 포함할 수 있다.
추가로, IL-15 결합 모티프 또는 이의 리간드와 커플링된 하나 이상의 scFv 펩타이드를 갖는 TxM 구조를 모사하는 재조합 면역글로불린 단백질 복합체는 또한 종양 특이적 항원 또는 환자- 및 종양 특이적 네오에피토프에 대항하는 결합 도메인(예를 들어, 네오에피토프 등에 대항하는 scFv 펩타이드)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 면역글로불린 단백질 복합체는 두 개의 IL-15 결합 모티프와 커플링된 IL-8에 대항하는 두 개의 scFv 펩타이드 및 두 개의 IL-15 결합 모티프 리간드와 커플링된 네오에피토프에 대항하는 두 개의 ScFv 펩타이드를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 네오에피토프는 환자-특이적 및 종양-특이적이며, 이는 US 2012/0059670A1호 및 US 2012/0066001A1호에 개시된 바와 같은 서열 데이터의 오믹스 분석에 의해 확인된다.
일부 구현예에서, scFv, 재조합 항체 또는 이의 단편은 SEQ ID No. 1 내지 15, 31 내지 32 중에서 VH 절편을 인코딩하는 하나의 서열을 이용하여 생성될 수 있다. 다른 구현예에서, scFv, 재조합 항체 또는 이의 단편은 SEQ ID No. 16 내지 30, 33 내지 34 중에서 VL 절편을 인코딩하는 하나의 서열을 이용하여 생성될 수 있다. 추가의 다른 구현예에서, scFv, 재조합 항체 또는 이의 단편은 SEQ ID No. 1 내지 15, 31 내지 32 중에서 VH 절편을 인코딩하는 하나의 서열 및 SEQ ID No. 16 내지 30, 33 내지 34 중에서 VL 절편을 인코딩하는 하나의 서열을 이용하여 생성될 수 있다. 이러한 구현예들에서, VH 절편을 인코딩하는 서열 및 VL 절편을 인코딩하는 서열은 한 쌍인 것이 바람직하다(예를 들어, scFv 49-31의 경우 SEQ ID NO. 1 및 16, scFv 49-22의 경우 SEQ ID NO. 2 및 17, scFv 49-7의 경우 SEQ ID NO. 3 및 18 등). 그러나, VH 절편 및 VL 절편의 임의의 쌍은 SEQ ID No. 1 내지 15, 31 내지 32로부터 하나의 VH 절편 및 SEQ ID No. 16 내지 30, 33 내지 34로부터 하나의 VL 절편을 선택함으로써 생성될 수 있는 것으로 고려된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
본 발명자들은 또한 scFv, 재조합 항체 또는 이의 단편이 각각 SEQ ID No. 1 내지 15, 31 내지 32 중 어느 하나 또는 SEQ ID No. 16 내지 30, 33 내지 34 중 어느 하나와 적어도 85% 동일한, 바람직하게는 적어도 90% 동일한, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 동일한 VH 절편 및/또는 VL 절편을 인코딩하는 아미노산 서열로 생성될 수 있는 것으로 고려한다. 이러한 구현예에서, scFv 펩타이드, 재조합 항체 또는 이의 단편의 결합 친화도는 SEQ ID No. 1 내지 15, 31 내지 32 중 어느 하나 또는 SEQ ID No. 1 내지 15, 31 내지 32 중 어느 하나로 생성된 scFv 펩타이드, 재조합 항체 또는 이의 단편의 결합 친화도의 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상인 것이 바람직하다. 실제로, 그리고 이하에서 더 상세하게 논의되는 바와 같이, 본 발명자들은 선택된 scFv(43-12)를 사용하였고, VH 및 VL에 대한 CDR 영역에서 무작위 돌연변이유발을 통해 scFv가 친화도 성숙을 거치게 하였다. 다른 결합제들 중에서 주목할 만한 두 개의 scFv(43-12a 및 43-12b)는 개선된 결합 특징을 갖는 친화도 성숙 공정으로부터 단리되었다.
가장 전형적으로, scFv 펩타이드, 재조합 항체 또는 이의 단편에서 VH 절편 및 VL 절편은, 전형적으로 5개 내지 40개 아미노산, 바람직하게는 10개 내지 30개 아미노산, 더욱 바람직하게는 20개 내지 30개 아미노산인 링커 또는 스페이서를 통해 커플링된다. 일부 구현예에서, 링커는 VH 절편의 N-말단과 VL 절편의 C-말단을 커플링할 수 있다. 다른 구현예에서, 링커는 VL 절편의 N-말단과 VH 절편의 C-말단을 커플링할 수 있다. 본 발명자들은 VH 절편과 VL 절편 사이에 구조적 유연성을 제공하기 위해 링커에 대한 글리신-풍부 서열(예를 들어, n이 1 내지 5 인 (G4S)n 등)이 바람직한 것으로 고려한다. 또한, 링커는 scFv 펩타이드, 재조합 항체 또는 이의 단편의 가용성을 증가시키기 위해 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 포함하는 것으로 고려된다. 당업계에 공지되어 있는 다수의 링커, 및 scFv를 제조하는 방법이 있으며, 이러한 공지된 모든 방법은 본원에서 사용하기에 적합한 것으로 여겨진다.
추가로, scFv 펩타이드는 2가 또는 다가 scFv를 형성하기 위해 복수의 VH 절편 및 VL 절편을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 VH 절편 및/또는 VL 절편은 동일한 아미노 서열을 가질 수 있다(예를 들어, 3개의 VH 절편 및 3개의 VL 절편을 갖는 다가 scFv에서, 모든 VH 절편은 49-31 VH(SEQ ID. No. 1)를 갖고, 모든 VL 절편은 49-31 VL(SEQ ID. No. 16)을 갖는다. 다른 구현예에서, VH 절편 및/또는 VL 절편 중 적어도 두 개는 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다(예를 들어, 3개의 VH 절편 및 3개의 VL 절편을 갖는 다가 scFv에서, VH 절편 중 두 개는 49-31 VH(SEQ ID. No. 1)이고 VH 절편 중 하나는 49-22 VH(SEQ ID. No. 2)이며, VL 절편 중 두 개는 49-31 VL(SEQ ID. No. 16)이고 VH 절편 중 하나는 49-22 VL(SEQ ID. No. 17)이다.
바람직하게는, IL-8(72-mer IL-8 및 77-mer IL-8 중 적어도 하나)에 대한 scFv, 재조합 항체 또는 이의 단편의 결합 친화도(Kd)는, 25℃ 내지 37℃의 온도에서 측정되고 5.5 내지 7.5의 pH 범위에서 측정된 경우, 적어도 1×10-7 M 미만, 바람직하게는 1×10-8 M 미만, 및 더욱 바람직하게는 1×10-9 M 미만이다. 본 발명자들은 scFv, 재조합 항체 또는 이의 단편이 VH 절편 및/또는 VL 절편의 동일한 아미노산 서열을 이용하여 생성되더라도 IL-8에 대한 scFv, 재조합 항체 또는 이의 단편의 결합 친화도가 구조적 차이로 인해 상이할 수 있는 것으로 고려한다. 예를 들어, 표 2는 여러 클론의 scFv 및 재조합 항체(IgG1)의 상이한 친화도(KD 값으로 측정됨)를 제공한다. 클론 49-31은 VH 절편(SEQ ID No. 1) 및 VL 절편(SEQ ID No. 16)을 인코딩하는 아미노산 서열을 이용하여 생성된 scFv 또는 재조합 항체(IgG1)이고, 클론 43-2는 VH 절편(SEQ ID No. 8) 및 VL 절편(SEQ ID No. 23)을 인코딩하는 아미노산 서열을 이용하여 생성된 scFv 또는 재조합 항체(IgG1)이며, 클론 43-12는 VH 절편(SEQ ID No. 10) 및 VL 절편(SEQ ID No. 25)을 인코딩하는 아미노산 서열을 이용하여 생성된 scFv 또는 재조합 항체(IgG1)이다. 예비 KD 값은 표면 플라스몬 공명 측정에 의해 결정된 것이고, IL-8에 대한 친화도의 범위를 추정하기 위해 최고 및 최저 값이 나타나 있다. 표 2에서 Kd 값의 모든 단위는 10-9 M이다.
Figure pct00004
표 3은 표 1에 나타나 있는 바와 같은 서열을 갖는 분자에 대한 추가의 예시적인 데이터를 제공한다. 여기서, scFv 및 상응하는 인간화 IgG1은 지시된 바와 같은 서열을 이용하여 제조되었고, KD는 고정화된 IL-8을 갖는 SPR을 칩 표면 상에서 피분석물로서 이용하여 결정되었다. 모든 값은 명시된 바와 같은 온도에서 나노M 값으로 표현된다.
Figure pct00005
scFv 펩타이드(또는, 항체 또는 이의 단편의 VH 절편 및 VL 절편)가 단일 재조합 핵산에 의해 인코딩될 수 있음이 추가로 고려된다. 이러한 구현예에서, 재조합 핵산은 적어도 두 개의 핵산 절편, 즉, VH 절편을 인코딩하는 제1 핵산 절편(서열 요소) 및 VL 절편을 인코딩하는 제2 핵산 절편을 포함한다. 제1 핵산 절편은 SEQ ID. No 1 내지 15, 31 내지 32의 아미노산 서열 중 적어도 하나를 인코딩하도록 선택되고, 제2 핵산 절편은 SEQ ID. No 16 내지 30, 33 내지 34의 아미노산 서열 중 적어도 하나를 인코딩하도록 선택되는 것이 바람직하다. 그러나, 또한, 제1 및 제2 핵산 절편은 SEQ ID No. 1 내지 15, 31 내지 32 중 어느 하나 또는 SEQ ID No. 16 내지 30, 33 내지 34 중 어느 하나와 적어도 85% 동일한, 바람직하게는 적어도 90% 동일한, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 절편을 각각 인코딩하는 것으로 고려된다. 가장 바람직하게는, 두 개의 핵산 절편은 두 개의 핵산 절편이 두 개의 펩타이드 절편을 갖는 단일 단백질로 번역될 수 있도록 동일한 해독틀에 있다.
추가로, 재조합 핵산은, 전형적으로 5개 내지 40개 아미노산, 바람직하게는 10개 내지 30개 아미노산, 더욱 바람직하게는 20개 내지 30개 아미노산인 링커 펩타이드(바람직하게는, G-풍부 또는 그 밖의 가요성 링커 펩타이드)를 인코딩하는 제1 핵산 절편과 제2 핵산 절편 사이의 제3 핵산 절편을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 세 개의 핵산 절편은 세 개의 핵산 절편이 세 개의 펩타이드 절편을 갖는 단일 단백질로 번역될 수 있도록 동일한 해독틀에 있는 것이 특히 바람직하다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 각 세트가 각각의 제1 핵산 절편 및 제2 핵산 절편 중 하나를 포함하는 제1 및 제2 핵산 절편의 복수의 세트를 포함할 수 있다. 이러한 구현예들에서, 재조합 핵산은 바람직하게는 제1 및 제2 핵산 절편의 각 세트 사이에 위치된 커넥터 펩타이드를 인코딩하는 제4 핵산 절편을 포함한다. 따라서, 한 가지 예시적인 재조합 핵산은 [제1 세트]-커넥터 펩타이드를 인코딩하는 제4 핵산-[제2 세트]-커넥터 펩타이드를 인코딩하는 제4 핵산-[제3 세트]를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 제1, 제2, 및 제3 세트는 [VH 절편을 인코딩하는 제1 핵산-링커를 인코딩하는 제3 핵산-VL 절편을 인코딩하는 제2 핵산]을 포함하고, 제1 및 제2 핵산의 위치는 서로 교대될 수 있다. 커넥터 펩타이드의 서열은 단일 펩타이드에서의 세트의 수에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는, 커넥터 펩타이드는 5개 내지 50개 아미노산, 바람직하게는 10개 내지 40개 아미노산, 더욱 바람직하게는 20개 내지 30개 아미노산일 수 있다. 또한, 본 발명자들은 VH 절편 세트와 VL 절편 세트 사이에 커넥터 펩타이드의 가요성을 제공하기 위해 글리신-풍부 서열(예를 들어, G4S 등)이 바람직한 것으로 고려한다.
본 발명자들은 scFv 펩타이드, 항체 또는 이의 단편이 IL-8의 내인성 작용을 감소시키거나 저해하기 위해 종양이 있는 환자에게 투여될 수 있도록 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있음을 추가로 고려한다. 따라서, scFv 펩타이드, 항체 또는 이의 단편은 치료적 제형을 위해 투여 단위 당 적어도 1 ml, 바람직하게는 적어도 5 ml, 그리고 더욱 바람직하게는 적어도 20 ml의 양의 임의의 약제학적으로 허용되는 담체(예를 들어, 멸균 주사용 조성물)로 제형화될 수 있는 것으로 고려된다. 그러나, 대안적인 제형이 또한 본원에서 사용하기에 적합한 것으로 여겨지며, 공지된 모든 투여 경로 및 방식이 본원에서 고려된다. 본원에서 사용되는 용어 "~을 투여하는"은 본원에서 고려되는 화합물 및 조성물의 직접 투여와 간접 투여 둘 모두를 지칭하며, 여기서 직접 투여는 전형적으로 건강 관리 전문가(예를 들어, 의사, 간호사 등)에 의해 수행되는 반면, 간접 투여는 전형적으로 직접 투여를 위해 건강 관리 전문가가 이용 가능한 화합물 및 조성물을 제공하거나 제조하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 제형은 피하, 진피하 주사, 또는 정맥내 주사를 포함하는 전신 주사를 통해 투여된다. 다른 구현예에서, 전신 주사가 효율적이지 않을 수 있는 경우(예를 들어, 뇌 종양의 경우 등), 제형은 종양내 주사를 통해 투여되는 것으로 고려된다.
상술된 VH 및 VL 절편을 포함하는 scFv 펩타이드, 항체 또는 이의 단편을 포함하는 약제학적 조성물의 한 가지 예시적인 방법 및 용도는 표적 조직에서 IL-8 매개 작용을 감소시키는 것이다. 본원에서 사용되는 IL-8 매개 작용은 조직 또는 조직의 미세환경에서 IL-8의 존재에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 유발되는 임의의 생물학적 결과를 지칭한다. 따라서, IL-8 작용은, 조직 내(예를 들어, 면역 적격 세포, 예컨대, 림프구 등) 또는 조직 외(예를 들어, 종양 부근의 건강한 조직 등)에서 종양 세포 및/또는 비-종양 세포에 의해 방출되고(또는 분비되고) 종양 미세환경에서 임의의 주어진 시점에 존재하는 IL-8로부터 유래될 수 있다.
구체적으로 고려되는 구현예에서, 본 발명자들은, 특히 환자의 종양 미세환경에서, IL-8 매개 작용이 세포의 유출을 촉발시키고, 종양의 상피-간엽 이행을 촉발시키고, 종양의 전이를 촉발시키고, 종양 미세환경에서의 면역 억제, MDSC 발달의 자극을 증가시키고, 종양 미세환경에서 Th2-편향 면역 반응을 촉발시키는 것을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 것으로 고려한다. 따라서, 특정 이론으로 국한시키려는 것은 아니지만, 본 발명자들은 유리 IL-8(IL-8 수용체에 결합되지 않은 IL-8)을 포획함으로써 종양 미세환경으로부터 IL-8의 양을 감소시키는 것이 IL-8 작용을 감소시키거나 심지어 종양 세포에 대한 IL-8 작용을 역전시키는, 즉, 종양의 상피-간엽 이행을 감소시키고, 종양의 전이를 감소시키거나 예방하고, Th2-편향 면역 반응을 감소시키거나 Th1- 및 Th2-매개 면역 반응을 재균등화시키고, 종양 미세환경에서의 면역 억제를 감소시키거나 예방하는 것으로 고려한다. 특히, 상응하는 건강한 조직에 비해 특정 유형의 암(예를 들어, 췌장암(pancreatic cancer), 삼중 음성 유방암(triple negative breast cancer), 교모세포종(glioblastoma) 등)에서 IL-8 발현(또는 축적)의 과도하거나 비정상적인 증가가 나타나는 경우, IL-8의 결합 또는 포획은 이러한 유형들의 암의 예후를 더욱 효과적으로 변화시킬 수 있는 것으로 예상된다.
환자에 대한 약제학적 조성물 투여의 용량 및 일정과 관련하여, 용량 및/또는 일정은 펩타이드의 유형(예를 들어, scFv, 항체, 항체 단편, 이들 중 임의의 두 개의 조합, 이들 모두의 조합 등), 질병의 유형 및 예후(예를 들어, 종양 유형, 크기, 위치), 환자의 건강 상태(예를 들어, 연령, 성별 등을 포함함)에 따라 달라질 수 있는 것으로 고려된다. 달라질 수 있지만, 용량 및 일정은 제형이 숙주 정상 세포에 임의의 유의한 독성 작용을 제공하지 않으면서도 종양 미세환경에서 IL-8 작용을 3시간 미만, 6시간, 12시간, 24시간, 72시간, 또는 1주 이내에 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 40%, 가장 바람직하게는 적어도 50% 감소시키기에 충분하도록 선택되고 조절될 수 있다.
일부 구현예에서, IL-8의 작용 및 IL-8 작용의 감소는 조직에서 유리 IL-8(72-mer 또는 77-mer)의 양에 의해 측정될 수 있다. 이러한 구현예들에서, 투여 조건은 전형적으로 약제학적 조성물을 투여한 후 3시간 미만, 6시간, 12시간, 24시간, 72시간, 또는 1주 이내에 적어도 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 40%, 가장 바람직하게는 적어도 50% 감소된 72-mer 또는 77-mer 유리 IL-8 중 적어도 하나의 양 또는 농도를 갖도록 조절된다. 다른 구현예에서, IL-8의 작용 및 IL-8 작용의 감소는 생물학적 활성의 시험관내 또는 생체내 측정을 통해 측정될 수 있다. 예를 들어, 종양의 세포 이동 또는 전이를 감소시키기 위한 용량 및 치료 일정은 IL-8에 의한 시험관내 세포 이동 검정에 의해 결정될 수 있다. 이러한 예에서, 투여 조건은 전형적으로 약제학적 조성물(또는, 약제학적으로 허용되는 담체가 없는 scFv, 항체 또는 이의 단편)로 치료한 후 1시간, 3시간, 6시간, 12시간 이내에 이동 세포의 이동 거리를 감소시키거나 원래의 위치로부터 이동하는 세포의 수를 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 40%, 가장 바람직하게는 적어도 50% 감소시키도록 조절된다. 다른 예에서, 골수-유래 억제 세포에 의해 면역 억제를 감소시키기 위한 용량 및 치료 일정은 종양에서 골수-유래 억제 세포의 축적 또는 존재를 측정함으로써 결정될 수 있다. 따라서, 이러한 예에서, 투여 조건은 전형적으로 약제학적 조성물을 투여한 후 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 72시간, 또는 1주 이내에 (전체 종양 조직에서 또는 종양 조직의 cm2 당) 골수-유래 억제 세포의 수를 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 40%, 가장 바람직하게는 적어도 50% 감소시키도록 조절된다.
추가의 다른 구현예에서, IL-8의 작용 및 IL-8 작용의 감소는 국소적 사이토카인 분자의 양 또는 농도를 측정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, Th-2 매개 면역 반응을 감소시키기 위한 용량 및 치료 일정은 종양 미세환경에서 IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-19, 및 IL-13 중 적어도 하나의 양 또는 농도를 측정함으로써 결정될 수 있다. 따라서, 이러한 예에서, 투여 조건은 전형적으로 약제학적 조성물을 투여한 후 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 72시간, 또는 1주 이내에 IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-19, 및 IL-13 중 적어도 하나의 양 또는 농도를 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 40%, 가장 바람직하게는 적어도 50% 감소시키도록 조절된다.
추가의 다른 구현예에서, IL-8의 작용 및 IL-8 작용의 감소는 하나 이상의 세포 마커의 시험관내 또는 생체내 발현 수준을 측정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 종양 세포의 상피-간엽 이행을 감소시키기 위한 용량 및 치료 일정은 종양 세포에서 E-카드헤린 상피 마커 및 N-카드헤린 간엽 마커의 발현을 측정함으로써 결정될 수 있다. 따라서, 투여 조건은 전형적으로 약제학적 조성물을 투여한 후 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 72시간, 또는 1주 이내에 N-카드헤린 간엽 마커의 발현 수준을 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 40%, 가장 바람직하게는 적어도 50% 감소시키거나, 약제학적 조성물을 투여한 후 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 72시간, 또는 1주 이내에 E-카드헤린 상피 마커의 발현 수준을 (단독의 IL-8 치료에 비해) 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 40%, 가장 바람직하게는 적어도 50% 증가시키도록 조절된다. 또한, 종양 세포에서 N-카드헤린과 E-카드헤린 발현 사이의 비율이 또한 IL-8의 작용 및 IL-8 작용 감소의 지표일 수 있는 것으로 고려된다. 이러한 예에서, 투여 조건은 전형적으로 약제학적 조성물을 투여한 후 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 72시간, 또는 1주 이내에 E-카드헤린 : N-카드헤린 발현 수준의 비율을 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 40%, 가장 바람직하게는 적어도 50% 증가시키도록 조절된다.
상이한 관점에서 볼 때, 생체내 IL-8 매개 작용의 감소는 또한 생리학적 현상에 의해 관찰될 수 있다. 예를 들어, 감소된 IL-8 농도는 종양 세포의 EMT(상피-간엽 이행)의 감소 또는 무효화 및 관련된 신호전달 경로의 감소를 통해 관찰될 수 있다. 유사하게, 환자 및 특히 종양 미세환경에서의 감소된 IL-8 농도는 적절한 줄기 세포 마커에 의해 용이하게 관찰될 수 있는 바와 같이 종양 세포의 줄기능을 감소시킬 것이다. IL-8 감소의 추가의 다른 생리학적 효과에서, MDSC의 발달이 전형적으로 감소되고, 뿐만 아니라 종양 내 T 세포에서의 Th2 편향 면역 반응이 감소된다(이에 따라, Th1/Th2 균형을 Th1 유형 반응으로 바꿈.
추가로, 본 발명자들은 특정 유형의 암에서 종양 세포의 상피-간엽 이행을 감소시키기 위해 IL-8에 대항하는 scFv, 항체 또는 이의 단편의 작용이 하나 이상의 암 약제의 공동-투여에 의해 상승될 수 있는 것으로 고려한다. 암 약제는 풀베스트란트(Fulvestrant), 알독소루비신(Aldoxorubicin), 도세탁셀(Docetaxel), 종양 괴사 치료제(tumor necrosis treatment agent)(예를 들어, 131I-chTNT-3 등), 아벨루맙(Avelumab)(PD-L1과 이의 수용체 사이의 상호작용을 차단하는 인간 단클론성 IgG1 항체), 브라큐리(Brachyury)-표적화 백신(예를 들어, ETBX-051(Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리)), Her2-표적화 백신(예를 들어, ETBX-021 등), MUC-1-표적화 백신(예를 들어, ETBX-061(Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1)), 및 효모 백신(예를 들어, GI-4000(GI-4014, GI-4015, GI-4016, GI-4020), GI-6207, GI-6301)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이러한 암 약제들의 세부 사항은 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 PCT/US17/40297호에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명자들은 IL-8에 대항하는 scFv, 항체 또는 이의 단편의 작용이 하나 이상의 체크포인트 저해제의 공동-투여로 상승될 수 있는 것으로 고려한다. 체크포인트 저해를 방해하거나 하향 조절하는 단백질과 관련하여, 체크포인트 수용체에 결합하는 임의의 적합한 펩타이드 리간드가 고려되는 것으로 상정된다. 가장 전형적으로, 결합은 수용체를 통해 신호전달을 저해하거나 적어도 감소시킬 것이고, 특히 고려되는 수용체는 CTLA-4(특히 CD8+ 세포의 경우), PD-1(특히 CD4+ 세포의 경우), TIM1 수용체, 2B4, 및 CD160을 포함한다. 예를 들어, 적합한 펩타이드 결합제는 항체 단편 및 특히 scFv뿐만 아니라, 수용체에 특이적으로 결합하는 소분자 펩타이드 리간드(예를 들어, RNA 디스플레이 또는 파지 패닝을 통해 단리됨)를 포함할 수 있다. 펩타이드 분자의 발현은 바람직하게는 네오에피토프 또는 폴리토프가 펩타이드 리간드 중 하나 이상과 동시에 발현되도록 조정될 것임을 다시 한 번 인지해야 한다. 따라서, 전형적으로, 펩타이드 리간드는, 예를 들어 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry site) 또는 2A 서열을 이용하는 단일 전사체(폴리토프를 인코딩하는 서열 부분을 포함하거나 포함하지 않을 수 있음), 또는 다중 전사체로부터 생성되는 것으로 고려된다.
다른 구현예에서, 본 발명자들은 하나 이상의 면역-자극 사이토카인이 IL-8에 대항하는 scFv, 항체 또는 이의 단편의 작용을 조정하도록 공동-투여될 수 있는 것으로 고려한다. 예를 들어, 면역 자극 사이토카인은 CD4+ T 세포/나이브 Th 세포 분극화의 요망되는 면역 반응 또는 방향(들)을 기초로 하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 나이브 CD4+ T 세포로부터 Treg 세포의 분극화가 요망되는 구현예에서, 면역 자극 사이토카인은 IL-2 및 TGF-β를 포함하도록 선택될 수 있다. 나이브 CD4+ T 세포로부터 Th17 세포의 분극화가 요망되는 또 다른 구현예에서, 면역 자극 사이토카인은 IL-6 및 TGF-β를 포함하도록 선택될 수 있다. 마찬가지로, Th1 세포 분극화를 위한 면역 자극 사이토카인은 IL-12 및 IFN-γ를 포함할 수 있고, Th2 세포 분극화를 위한 면역 자극 사이토카인은 IL-4를 포함할 수 있다. 추가로, Tfh 세포(소포 조력 T 세포) 분극화를 위한 면역 자극 사이토카인은 IL-6 및 IL-12를 포함할 수 있고, CD4+ 세포독성 T 세포 분극화를 위한 면역 자극 사이토카인은 IL-2를 포함할 수 있다.
본 발명자들은 IL-8에 대항하는 scFv, 항체 또는 이의 단편이 활성화 또는 변형 면역 세포를 갖는 암 환자에게 공동-치료(또는 공동-투여)될 수 있음을 추가로 고려하고, 상기 활성화 또는 변형 면역 세포는 IL-8에 대항하는 scFv, 항체 또는 이의 단편의 작용이 최대화될 수 있도록 종양 미세환경에서 종양 세포 또는 골수-유래 억제 세포에 의한 면역 억제의 작용을 감소시킴으로써 종양 미세환경에 대한 보다 우수한 접근을 IL-8에 대항하는 scFv, 항체 또는 이의 단편에 제공할 수 있다. 예를 들어, 활성화 또는 변형 면역 세포는 나이브 NKT 세포, 또는 NKT 세포 면역 반응을 유발하고/하거나 종양의 미세환경을 변화시키도록(예를 들어, 골수-유래 억제 세포의 활성을 억제함으로써) 키메라 단백질 또는 T 세포 수용체 복합체를 발현시키는 유전자 변형 NKT 세포를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 유전자 변형 NKT 세포의 키메라 단백질 또는 T 세포 수용체는 종양 (네오)에피토프, 종양 관련 항원, 또는 종양 세포 상에 존재하는 자가-지질을 결합한다. 다른 예의 경우, 변형 면역 세포는, 바람직하게는 이들의 세포 표면 상에, CD40L 및 Fas-L 중 적어도 하나를 발현시키도록 유전자 변형된 NKT 세포를 포함할 수 있다. 암 미세환경에서 면역 억제를 감소시키는 유전자 변형 및/또는 나이브 활성화 NKT 세포의 세부 사항은 그 전체가 본원에 포함되는 국제 출원 번호 PCT/US18/53506호(및 이의 상응하는 공개된 미국 국내 단계 출원)에 기재되어 있다. 마찬가지로, 활성화 또는 변형 면역 세포는 나이브 T 세포, 또는 T 세포 면역 반응을 유발하고/하거나 종양의 미세환경을 변화시키도록(예를 들어, 골수-유래 억제 세포의 활성을 억제함으로써) 키메라 단백질 또는 T 세포 수용체 복합체를 발현시키는 유전자 변형 T 세포를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 유전자 변형 NKT 세포의 키메라 단백질 또는 T 세포 수용체는 종양 (네오)에피토프, 종양 관련 항원, 또는 종양 세포 상에 존재하는 자가-지질을 결합한다.
추가의 다른 예의 경우, 활성화 또는 변형 면역 세포는, NK 세포 수용체에 대한 데코이 리간드로서 작용함으로써 효과적인 NK 세포 활성을 방지하는, 가용성 NK 세포 수용체 리간드(예를 들어, NKG2D, Nkp-30, Nkp-44, Nkp-46 등)를 표적화하는 킬러 활성화 수용체(KAR)를 발현시키는 유전자 변형 NK 세포를 포함할 수 있다. KAR로 유전자 변형된 NK 세포의 세부 사항은 그 전체가 본원에 포함되는 미국 가출원 번호 제62/569503호에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 상기 암 약제, 면역 자극 사이토카인, 체크포인트 저해제, 및/또는 나이브 또는 유전자 변형 NK 세포 또는 NKT 세포는 IL-8에 대항하는 scFv, 항체 또는 이의 단편을 갖는 동일한 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 다른 구현예에서, 암 약제는, scFv, 항체 또는 이의 단편의 약제학적 조성물과 함께 제공되거나, 환자가 scFv, 항체 또는 이의 단편의 약제학적 조성물을 투여받기 전에 투여될 수 있는 별개의 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다.
따라서, 본원에서 제시된 IL-8 결합 분자는 본원에서 제시된 IL-8 결합 분자의 투여를 포함하는 치료 요법의 형태일 수 있다는 것이 인지되어야 한다. 예를 들어, 암 환자(예를 들어, 췌장암, 삼중 음성 유방암, 교모세포종)의 치료는, 제1 약물(예를 들어, 풀베스트란트)이 투여되어 EMT를 MET로 역전시키고(간엽에서 상피로의 이행), 제2 약물(예를 들어, 알독소루비신)이 투여되어 저산소 종양 미세환경을 특이적으로 표적화하는 조화된 방식으로 수행될 수 있는 것으로 고려된다. 이러한 치료 요법은 종양 세포에서 면역 억제 환경을 감소시키고 세포 스트레스를 증가시킴으로써 면역계에 대한 종양 세포의 면역원성을 증가시키는 것으로 사료된다. 더욱이, 치료는 또한, 괴사성 종양 세포를 '표지'하고, 그에 따라 NK 세포 및/또는 세포독성 T 세포에 의한 공격에 대한 민감성을 증가시킬 종양 괴사 표적화 항체를 포함할 수 있다. 본원에서 제시된 IL-8 결합 분자는 상기 언급된 바와 같은 IL-8 매개 면역 억제 작용을 추가로 억제하기 위해 공동-투여된다. 추가로, 상기 언급된 바와 같은 면역 억제 조건의 감소 시, 환자는 이후, 전형적으로 브라큐리, 종양 또는 암 관련 항원, 및/또는 환자- 및 종양 특이적 신생항원 중 하나 이상을 발현시키는 재조합 백신을 사용하여 면역 치료법을 제공받을 수 있다. 따라서, 암 치료는 다음 중 적어도 두 개(또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개)를 포함할 것이다: 종양 괴사 표적화 약물, 저산소 종양 미세환경을 표적화하는 약물, EMT를 MET로 역전시키는 약물, 백신 성분(재조합 바이러스, 효모, 및/또는 박테리아), 및 본원에서 제시된 바와 같은 IL-8 결합 분자.
실시예
본 발명자들은 VH 절편을 인코딩하는 SEQ ID No. 10(43-12 VH) 및 VL 절편을 인코딩하는 SEQ ID No. 25(43-12 VL)의 핵산 서열을 이용하여 scFv 분자(43-12)를 생성시키고, IL-8(72-mer 및 77-mer)에 대한 결합 친화도 및 IL-8의 다른 동원체 또는 이원체에 대한 교차 반응성을 결정하였다. 도 1a에 나타나 있는 바와 같이, 43-12 scFv 분자는 IL-8의 72-mer과 77-mer 둘 모두에 대해 강한 친화도(385 pM 및 440 pM의 KD를 가짐) 및 존재하는 경우, 이원체(hCXCL1, hCXCL2, hCXCL7) 또는 동원체(mCXCL1)와의 매우 낮은 교차 반응성을 나타낸다.
본 발명자들은 또한 VH 절편을 인코딩하는 SEQ ID No. 1(49-31 VH) 및 VL 절편을 인코딩하는 SEQ ID No. 16(49-31 VL)의 핵산 서열을 이용하여 scFv 분자(49-31)를 생성시키고, IL-8(72-mer 및 77-mer)에 대한 결합 친화도 및 IL-8의 다른 동원체 또는 이원체에 대한 교차 반응성을 결정하였다. 도 1b에 나타나 있는 바와 같이, 49-31 scFv 분자는 IL-8의 72-mer과 77-mer 둘 모두에 대해 강한 친화도(147 pM 및 120 pM의 KD를 가짐) 및, 존재하는 경우, 이원체(hCXCL1, hCXCL2, hCXCL7) 또는 동원체(mCXCL1)와의 매우 낮은 교차 반응성을 나타낸다.
그 다음, 본 발명자들은 이들의 IL-8 중화 작용을 결정하기 위해 상기와 같이 생성된 scFv 분자(43-2, 43-12, 49-31 등, 또한 표 3에 나타나 있는 모든 것)를 시험하였다. 한 가지 예시적인 실험 세트에서, IL-8 매개 호중구 주화성을 중화시키는 scFv 분자(여기서, 43-2, 43-12, 49-31)의 능력을 평가하기 위해 일차 인간 호중구를 혈액으로부터 단리시켰다. 3 mM 공극 크기의 트랜스웰 플레이트에서, 1 nM의 재조합 인간 IL-8을 좌측 패널에 나타낸 바와 같은 항체의 적정으로 인큐베이션하고, 50,000개의 칼세인-AM 표지된 호중구를 1.5시간 및 3시간 동안 상부 챔버에 첨가하였다. 호중구의 유출을 하부 챔버에서 총 형광에 대해 검정하여 평가하고, 단독의 블랭크 배지 웰에 대해 배경 제거하였다. 도 2의 패널 A 내지 D는 IL-8 단독(도 2의 A, 도 2의 C) 및 IL-8과 scFv 분자(43-2, 43-12, 49-31) 중 하나의 1.5시간(도 2의 B) 또는 3시간(도 2의 D) 동안의 처리 시 시험관내 호중구 이동을 나타내는 그래프를 보여준다. 도 2의 B 및 도 2의 D에 나타나 있는 바와 같이, 모든 scFv 분자(43-2, 43-12, 49-31)는 1.5시간과 3시간 둘 모두에서 1 uM 미만의 농도로 호중구의 유출을 30% 내지 70% 감소시킬 수 있었으며, 이는 모든 scFv 분자(43-2, 43-12, 49-31)가 혈청(또는 배지)에서 유리 IL-8을 포획함으로써 IL-8의 작용을 완화시키는 데 효과적이라는 것을 나타낸다.
도 3은 1 nM 농도에서 IL-8(CTRL) 단독 및 IL-8과 scFv 분자(43-2, 43-12) 중 하나의 처리 시 호중구 유출을 보여주는 그래프를 나타낸다. scFv 분자(43-2, 43-12) 둘 모두는 scFv 분자(43-2, 43-12) 처리를 이용한 호중구 이동의 수준이 배지 단독과 유사하거나 거의 동일하도록 IL-8의 작용을 완전히 역전시킬 수 있었고, 한편 IL-8 처리 단독은 호중구 이동을 단독의 배지에 비해 거의 3배 증가시킬 수 있었다.
추가의 또 다른 실험 세트에서, 본 발명자들은 종래에 확인된 하나의 IL-8 결합제(여기서, 43-12, 표 1에서의 서열)의 친화도 성숙(여기서, VH 및 VL 쇄에서 CDR 영역의 무작위 돌연변이유발 및 mRNA 디스플레이 선택)을 이용하였고, pH 7.4 및 pH 6.0의 두 가지 상이한 pH 조건을 이용하여, 선택된 돌연변이 형태에 대해 SPR 분석을 수행하였다. 도 4a 내지 도 4c(도 4a는 모 scFv 43-12에 대한 결과를 도시함)에서의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 유도체 돌연변이 형태 둘 모두는 모 scFv에 비해 개선된 결합을 가졌다. 구체적으로, 도 4b는 43-12a(표 1에 나타나 있는 서열)에 대한 예시적인 결과를 보여주고, 도 4c는 43-12b(표 1에 나타나 있는 서열)에 대한 예시적인 결과를 보여준다.
본원에서 본 발명의 개념을 벗어나지 않고 이미 기재된 것들 이외의 더 많은 수정이 가능하다는 것이 당업자에게 명백해야 한다. 따라서, 본 발명의 주제는 첨부된 청구항의 범위를 제외하고는 제한되지 않을 것이다. 더욱이, 본 명세서와 청구항 둘 모두를 해석함에 있어서, 모든 용어는 문맥과 일치하는 가능한 가장 넓은 방식으로 해석되어야 한다. 특히, 용어 "~을 포함하다" 및 "~을 포함하는"은 요소, 성분, 또는 단계를 비-배제적인 방식으로 언급하는 것으로 해석되어야 하며, 이는 언급된 요소, 성분, 또는 단계가 존재하거나, 이용되거나, 분명하게 언급되지 않은 다른 요소, 성분, 또는 단계와 조합될 수 있다는 것을 나타낸다. 본원의 설명에서 그리고 이하의 청구항 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 단수 형태("a", "an", 및 "the")의 의미는 문맥에서 달리 분명하게 지시되지 않는 한, 복수의 참조물을 포함한다. 또한, 본원의 설명에서 사용되는 "~에서(in)"의 의미는 문맥에서 달리 분명하게 지시되지 않는 한, "~에서" 및 "~ 상에(on)"를 포함한다. 본 명세서의 청구항에 A, B, C .... 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 적어도 하나가 언급된 경우, 그러한 내용은 A + N, 또는 B + N 등이 아니라 군으로부터의 하나의 요소만을 필요로 하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (71)

  1. SEQ ID NO. 1 내지 15, 31 내지 32로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 아미노산 서열을 포함하는 VH 절편, 또는 SEQ ID NO. 16 내지 30, 33 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 아미노산 서열을 포함하는 VL 절편 중 적어도 하나를 포함하는 단쇄 가변 단편(single chain variable fragment: scFv) 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, VH 절편 및 VL 절편은 링커 펩타이드와 커플링되는, 펩타이드.
  3. 제2항에 있어서, 링커 펩타이드는 글리신-풍부 펩타이드인, 펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드는 약리학적으로 허용되는 담체에 존재하는, 펩타이드.
  5. 제1항에 있어서, 적어도 두 쌍의 VH 절편 및 VL 절편을 추가로 포함하고, 적어도 두 쌍은 연결되어 다가 scFv를 형성하는, 펩타이드.
  6. 단쇄 가변 단편(scFv) 펩타이드를 포함하는, 암이 있는 환자를 치료하기 위한 약제학적 조성물로서,
    단쇄 가변 단편(scFv) 펩타이드는 SEQ ID NO. 1 내지 15, 31 내지 32로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 아미노산 서열을 포함하는 VH 절편, 또는 SEQ ID NO. 16 내지 30, 33 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 아미노산 서열을 포함하는 VL 절편 중 적어도 하나를 포함하고,
    펩타이드는 약리학적으로 허용되는 담체에 존재하는, 약제학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, VH 절편 및 VL 절편은 링커 펩타이드와 커플링되는, 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 링커 펩타이드는 글리신-풍부 펩타이드인, 조성물.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드는 적어도 두 쌍의 VH 절편 및 VL 절편을 추가로 포함하고, 적어도 두 쌍은 연결되어 다가 scFv를 형성하는, 조성물.
  10. SEQ ID NO. 1 내지 15, 31 내지 32로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 아미노산 서열을 갖는 VH 절편을 인코딩하는 제1 핵산 절편, 또는 SEQ ID NO. 16 내지 30, 33 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 아미노산 서열을 갖는 VL 절편을 인코딩하는 제2 핵산 절편 중 적어도 하나를 포함하는 재조합 핵산으로서,
    제1 및 제2 절편은 선택적으로 동일한 해독틀에 존재하는, 재조합 핵산.
  11. 제10항에 있어서, 링커 펩타이드를 인코딩하는 제3 핵산 절편을 추가로 포함하는 재조합 핵산.
  12. 제11항에 있어서, VH 절편 및 VL 절편은 링커 펩타이드와 커플링되는, 재조합 핵산.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 링커 펩타이드는 글리신-풍부 펩타이드인, 재조합 핵산.
  14. 제10항에 있어서, 재조합 핵산은 제1 및 제2 핵산 절편의 제1 및 제2 세트를 포함하는, 재조합 핵산.
  15. 제14항에 있어서, 제1 및 제2 세트는 커넥터 펩타이드를 인코딩하는 제4 핵산 절편과 커플링되는, 재조합 핵산.
  16. 각각의 제1 및 제2 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 또는 VL 도메인 중 적어도 하나를 포함하는 재조합 단리된 항체 또는 이의 단편으로서,
    제1 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 1 내지 15, 31 내지 32로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하고;
    제2 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 16 내지 30, 33 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한, 재조합 단리된 항체 또는 이의 단편.
  17. 제16항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 10-7 M 미만의 IL-8에 대한 결합 친화도를 갖는, 항체 또는 이의 단편.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은
    (a) 모든 면역글로불린 분자;
    (b) scFv;
    (c) 단클론성 항체;
    (d) 인간 항체;
    (e) 인간화 항체;
    (f) 키메라 항체;
    (g) Fab 단편;
    (h) Fab' 단편;
    (i) F(ab')2;
    (j) Fv; 및
    (k) 디설파이드 연결 Fv
    로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 단편.
  19. 제16항에 있어서,
    (b) 인간 IgG1 불변 도메인;
    (c) 인간 IgG2 불변 도메인;
    (d) 인간 IgG3 불변 도메인;
    (e) 인간 IgG4 불변 도메인; 및
    (f) 인간 IgA 불변 도메인
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 추가로 포함하는, 항체 또는 이의 단편.
  20. 제16항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 약리학적으로 허용되는 담체에 존재하는, 항체 또는 이의 단편.
  21. SEQ ID NO. 1 내지 15, 31 내지 32로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 아미노산 서열을 포함하는 VH 절편, 또는 SEQ ID NO. 16 내지 30, 33 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 아미노산 서열을 포함하는 VL 절편 중 적어도 하나를 포함하는, 단쇄 가변 단편(scFv) 펩타이드를 제공하는 단계; 및
    조직에서의 IL-8 작용을 감소시키기에 효과적인 용량 및 일정으로 scFv 펩타이드로 조직을 치료하는 단계
    를 포함하는, 조직에서의 IL-8 작용을 감소시키는 방법.
  22. 제21항에 있어서, VH 절편 및 VL 절편은 링커 펩타이드와 커플링되는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 링커 펩타이드는 글리신-풍부 펩타이드인, 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물은 풀베스트란트(Fulvestrant), 알독소루비신(Aldoxorubicin), 도세탁셀(Docetaxel), 종양 괴사 치료제(tumor necrosis treatment agent: TNT) 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 방법.
  25. 제21항에 있어서, scFv는 10-7 M 미만의 IL-8에 대한 결합 친화도를 갖는, 방법.
  26. 제21항에 있어서, IL-8 작용은 조직으로부터 분비되는 내인성 IL-8로부터 발생하는, 방법.
  27. 제21항에 있어서, IL-8 작용은 조직으로부터 유래되지 않은 외인성 IL-8로부터 발생하는, 방법.
  28. 제21항에 있어서, IL-8 작용은 세포의 유출을 촉발시키는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 제21항에 있어서, 조직은 종양이고, IL-8 작용은 종양의 미세환경에서 MDSC의 축적을 촉발시키는 단계를 포함하는, 방법.
  30. 제21항에 있어서, IL-8 작용은 Th2-매개 면역 반응을 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
  31. 단쇄 가변 단편(scFv) 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 단계로서,
    scFv는 SEQ ID NO. 1 내지 15, 31 내지 32로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 아미노산 서열을 포함하는 VH 절편, 또는 SEQ ID NO. 16 내지 30, 33 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 아미노산 서열을 포함하는 VL 절편 중 적어도 하나를 포함하는, 단계; 및
    종양을 치료하기에 효과적인 용량 및 일정으로 환자에게 약제학적 조성물을 투여하는 단계
    를 포함하는, 종양이 있는 환자를 치료하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, VH 절편 및 VL 절편은 링커 펩타이드와 커플링되는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 링커 펩타이드는 글리신-풍부 펩타이드인, 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물은 풀베스트란트, 알독소루비신, 도세탁셀, 종양 괴사 치료제(TNT) 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 방법.
  35. 제31항에 있어서, 용량 및 일정은 환자의 종양의 상피-간엽 이행(epithelial-mesenchymal transition)을 적어도 30% 차단하기에 효과적인, 방법.
  36. 제31항에 있어서, 종양은 췌장암(pancreatic cancer), 삼중 음성 유방암(triple negative breast cancer), 교모세포종(glioblastoma) 중 적어도 하나인, 방법.
  37. 제31항에 있어서, scFv는 10-7 M 미만의 IL-8에 대한 결합 친화도를 갖는, 방법.
  38. 제31항에 있어서, 풀베스트란트, 알독소루비신, 도세탁셀, 종양 괴사 치료제(TNT), 및 브라큐리(Brachyury) 중 적어도 하나를 환자에게 공동 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  39. 제31항에 있어서, IL-2, IL-12, IL-15, IL-15 초항진제(super agonist)(ALT803), IL-21, IPS1, 및 LMP1로 이루어진 군으로부터 선택된 면역-자극 사이토카인을 환자에게 공동 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  40. 제31항에 있어서, 체크포인트 저해제를 환자에게 공동 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  41. 단쇄 가변 단편(scFv) 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 단계로서,
    scFv는 SEQ ID NO. 1 내지 15, 31 내지 32로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 아미노산 서열을 포함하는 VH 절편, 및 SEQ ID NO. 16 내지 30, 33 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 아미노산 서열을 포함하는 VL 절편을 포함하는, 단계; 및
    종양 미세환경에서 골수-유래 억제 세포의 존재를 감소시키기에 효과적인 용량 및 일정으로 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 종양이 있는 환자의 면역 억제를 감소시키는 방법.
  42. 제41항에 있어서, VH 절편 및 VL 절편은 링커 펩타이드와 커플링되는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 링커 펩타이드는 글리신-풍부 펩타이드인, 방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 약리학적 조성물은 풀베스트란트, 알독소루비신, 도세탁셀, 및 종양 괴사 치료제(TNT) 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 방법.
  45. 제41항에 있어서, 용량 및 일정은 종양의 미세환경에서 골수-유래 억제 세포의 증식을 적어도 30% 감소시키기에 효과적인, 방법.
  46. 제41항에 있어서, 종양은 췌장암, 삼중 음성 유방암, 교모세포종 중 적어도 하나인, 방법.
  47. 제41항에 있어서, 용량 및 일정은 환자의 종양의 상피-간엽 이행을 적어도 30% 차단하기에 효과적인, 방법.
  48. 제41항에 있어서, scFv는 10-7 M 미만의 IL-8에 대한 결합 친화도를 갖는, 방법.
  49. 제41항에 있어서, 풀베스트란트, 알독소루비신, 도세탁셀, 종양 괴사 치료제(TNT), 및 브라큐리 중 적어도 하나를 환자에게 공동 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  50. 제41항에 있어서, IL-2, IL-12, IL-15, IL-15 초항진제(ALT803), IL-21, IPS1, 및 LMP1로 이루어진 군으로부터 선택된 면역-자극 사이토카인을 환자에게 공동 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  51. 단쇄 가변 단편(scFv) 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 단계로서,
    scFv는 SEQ ID NO. 1 내지 15, 31 내지 32로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 아미노산 서열을 포함하는 VH 절편, 및 SEQ ID NO. 16 내지 30, 33 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 아미노산 서열을 포함하는 VL 절편을 포함하는, 단계; 및
    환자의 Th-2 매개 면역 반응을 감소시키기에 효과적인 용량 및 일정으로 환자에게 약제학적 조성물을 투여하는 단계
    를 포함하는, 종양이 있는 환자의 Th-2 매개 면역 반응을 감소시키는 방법.
  52. 제51항에 있어서, VH 절편 및 VL 절편은 링커 펩타이드와 커플링되는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 링커 펩타이드는 글리신-풍부 펩타이드인, 방법.
  54. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 약리학적 조성물은 풀베스트란트, 알독소루비신, 도세탁셀, 및 종양 괴사 치료제(TNT) 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 방법.
  55. 제51항에 있어서, 용량 및 일정은 종양의 미세환경에서 IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-19, 및 IL-13 중 적어도 하나의 양을 적어도 30% 감소시키기에 효과적인, 방법.
  56. 제51항에 있어서, 종양은 췌장암, 삼중 음성 유방암, 교모세포종 중 적어도 하나인, 방법.
  57. 제51항에 있어서, scFv는 10-7 M 미만의 IL-8에 대한 결합 친화도를 갖는, 방법.
  58. 제51항에 있어서, 풀베스트란트, 알독소루비신, 도세탁셀, 종양 괴사 치료제(TNT), 및 브라큐리 중 적어도 하나를 환자에게 공동 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  59. 제51항에 있어서, IL-2, IL-12, IL-15, IL-15 초항진제(ALT803), IL-21, IPS1, 및 LMP1로 이루어진 군으로부터 선택된 면역-자극 사이토카인을 환자에게 공동 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  60. 단쇄 가변 단편(scFv) 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 단계로서,
    scFv는 SEQ ID NO. 1 내지 15, 31 내지 32로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 아미노산 서열을 포함하는 VH 절편, 및 SEQ ID NO. 16 내지 30, 33 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 아미노산 서열을 포함하는 VL 절편을 포함하는, 단계; 및
    종양 세포의 상피-간엽 이행을 감소시키기에 효과적인 용량 및 일정으로 환자에게 약제학적 조성물을 투여하는 단계
    를 포함하는, 환자의 종양 세포의 상피-간엽 이행을 감소시키는 방법.
  61. 제60항에 있어서, VH 절편 및 VL 절편은 링커 펩타이드와 커플링되는, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 링커 펩타이드는 글리신-풍부 펩타이드인, 방법.
  63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 약리학적 조성물은 풀베스트란트, 알독소루비신, 도세탁셀, 종양 괴사 치료제(TNT), 및 브라큐리 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 방법.
  64. 제60항에 있어서, 종양은 췌장암, 삼중 음성 유방암, 교모세포종 중 적어도 하나인, 방법.
  65. 제60항에 있어서, scFv는 10-7 M 미만의 IL-8에 대한 결합 친화도를 갖는, 방법.
  66. 제60항에 있어서, 풀베스트란트, 알독소루비신, 도세탁셀, 종양 괴사 치료제(TNT), 및 브라큐리 중 적어도 하나를 환자에게 공동 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  67. 제60항에 있어서, IL-2, IL-12, IL-15, IL-15 초항진제(ALT803), IL-21, IPS1, 및 LMP1로 이루어진 군으로부터 선택된 면역-자극 사이토카인을 환자에게 공동 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  68. 종양이 있는 환자의 면역 억제를 감소시키기 위한 용도를 가지는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단쇄 가변 단편(scFv).
  69. 종양이 있는 환자의 Th-2 매개 면역 반응을 감소시키기 위한 용도를 가지는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단쇄 가변 단편(scFv).
  70. 환자의 종양 세포의 상피-간엽 이행을 감소시키기 위한 용도를 가지는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단쇄 가변 단편(scFv).
  71. 종양이 있는 환자의 종양의 전이를 감소시키기 위한 용도를 가지는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단쇄 가변 단편(scFv).
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