KR20200061398A - Wnt/sfrp 복합체, wnt-함유 조성물, wnt-발현 세포, 및 이들을 제조하고, 정제하고, 이용하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 개시는 Wnt 및 sFRP를 포함하는 분리된 단백질 복합체; Wnt를 포함하는 조성물; Wnt 및 sFRP를 과발현하는 세포; Wnt를 과발현하는 세포 및 sFRP를 과발현하는 세포를 포함하는 조성물; 단백질 복합체, 조성물 및 세포를 제조하는 방법; 및 분리된 단백질 복합체, 조성물 및 세포를 사용하는 방법을 기재한다. 본 발명의 개시는 Wnt 및 sFRP를 포함하는 복합체를 형성시키는 방법 및 Wnt를 분리하기 위한 방법을 추가로 기재한다. 세제의 사용 없이 Wnt를 정제하는 데 이용될 수 있는 방법이 또한 본원에 기재된다.
Description
계속 출원 데이터
본 출원은 본원에 참조로서 포함되는 2017년 10월 9일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/569,748호의 이익을 주장한다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 미국 특허청에 전자적으로 제출된, 84 킬로바이트 크기를 갖고 2018년 10월 9일에 생성된 "541-00060201_ST25.txt"를 제목으로 하는 ASCII 텍스트 파일로서 서열 목록을 함유한다. 서열 목록의 전자 출원으로 인해, 전자적으로 제출된 서열 목록은 37 CFR §1.821(c)에 의해 요구되는 논문 사본 및 §1.821(e)에 의해 요구되는 CRF 둘 모두로서 기능한다. 서열 목록에 함유된 정보는 본원에 참조로서 포함된다.
발명의 개요
본 발명의 개시는 Wingless/Integrated-1 단백질(Wnt) 및 분비된 Frizzled-관련 단백질(sFRP)을 포함하는 분리된 단백질 복합체; 세제를 실질적으로 비함유하는, Wnt를 포함하는 조성물; Wnt 및 sFRP를 과발현하는 세포; Wnt를 과발현하는 세포 및 sFRP를 과발현하는 세포를 포함하는 조성물; 단백질 복합체, 조성물 및 세포를 제조하는 방법; 및 단백질 복합체, 조성물 및 세포를 사용하는 방법을 기재한다. 일부 구현예에서, Wnt는 바람직하게는 활성 Wnt를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 배지 첨가제로서 사용될 수 있고, 세제를 포함하는 조성물이 비해 장점을 제공할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 개시는 Wnt 및 sFRP를 포함하는 분리된 단백질 복합체를 기재한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는 Wnt를 포함하는 조성물을 기재하며, 상기 조성물은 세제를 실질적으로 비함유한다.
추가 양태에서, 본 발명의 개시는 Wnt 및 sFRP를 과발현하는 세포를 기재한다.
추가 양태에서, 본 발명의 개시는 Wnt를 과발현하는 세포 및 sFRP를 과발현하는 세포를 포함하는 조성물을 기재한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는 Wnt 및 sFRP를 포함하는 복합체를 형성시키고, Wnt를 분리하는 것을 포함하는 방법을 기재한다.
용어 "바람직한" 및 "바람직하게는"은 특정 환경하에서 특정한 이익을 발생시킬 수 있는 본 발명의 구현예를 나타낸다. 그러나, 동일하거나 다른 환경하에서 다른 구현예가 또한 바람직할 수 있다. 또한, 하나 이상의 바람직한 구현예의 언급은 다른 구현예가 유용하지 않음을 의미하지는 않고, 본 발명의 범위로부터 다른 구현예를 배제하고자 하는 것이 아니다.
용어 "포함하다" 및 이의 변형은 이들 용어가 설명 및 청구항에서 나타나는 경우 제한적인 의미를 갖지 않는다. "구성되는"은 어구 "구성되는"에 따르는 것을 포함하며, 이로 제한되는 것을 의미한다. 따라서, 어구 "구성되는"은 나열된 요소가 필요하거나 필수적이며, 다른 요소가 존재할 수 없음을 나타낸다. "필수적으로 포함하는"은 어구 뒤에 열거된 임의의 요소를 포함하는 것을 의미하며, 열거된 요소에 대한 본 발명의 개시에 특정된 활성 또는 작용을 방해하지 않거나 이에 기여하는 다른 요소로 제한된다. 따라서, 어구 "필수적으로 포함하는"은 열거된 요소가 필요하거나 필수적이나, 다른 요소는 선택적이고, 열거된 요소의 활성 또는 작용에 실질적으로 영향을 미치거나 미치지 않는지의 여부에 따라 존재하거나 존재하지 않을 수 있음을 나타낸다.
달리 명시하지 않는 한, 단수 용어 및 "적어도 하나"는 상호교환적으로 사용되며, 하나 또는 하나 초과를 의미한다.
또한 본원에서, 종점에 의한 숫자상의 범위의 언급은 이러한 범위 내에 포함되는 모든 수를 포함한다(예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5 등을 포함한다).
별개의 단계를 포함하는 본원에 개시된 임의의 방법에 대해, 단계는 임의의 실행가능한 순서로 수행될 수 있다. 그리고, 적절한 경우, 2개 이상의 단계의 임의의 조합이 동시에 수행될 수 있다.
본 발명의 상기 개요는 본 발명의 각각의 개시된 구현예 또는 모든 수행을 기재하고자 하는 것이 아니다. 후속되는 설명은 예시적 구현예를 더욱 상세히 예시한다. 본 출원 전체에 걸쳐 여러 곳에서, 예시의 목록을 통해 지침이 제공되며, 상기 예시는 다양한 조합으로 이용될 수 있다. 각각의 예에서, 언급된 목록은 단지 대표적 그룹으로 제공되며, 배타적 목록으로 해석되어선 안된다.
"일 구현예", "구현예", "특정 구현예" 또는 "일부 구현예" 등에 대한 본 명세서 전체에 걸친 언급은 구현예와 관련하여 기재된 특정 특징, 구성, 조성 또는 특성이 본 발명의 개시의 적어도 하나의 구현예에 포함되는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 곳에서 상기 어구의 출현은 본 발명의 개시의 동일 구현예를 반드시 언급하는 것은 아니다. 또한, 특정 특징, 구성, 조성 또는 특성은 하나 이상의 구현예에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
달리 나타내지 않는 한, 명세서 및 청구항에서 사용되는 성분, 분자량 등의 양을 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 반대로 나타내지 않는 한, 명세서 및 청구항에 제시된 수치 파라미터는 본 발명에 의해 획득하고자 하는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 아주 최소한, 동등물의 교리를 청구항의 범위로 제한하고자 하는 것이 아니라, 각각의 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 자릿수의 수에 비추어 일반적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다.
본 발명의 넓은 범위를 설명하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에 기재된 수치 값은 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나, 모든 수치 값은 본질적으로 각각의 시험 측정에서 발견된 표준 편차로부터 필연적으로 발생하는 범위를 함유한다.
모든 표제는 독자의 편의를 위한 것이며, 명시되지 않는 한 표제를 따르는 본문의 의미를 제한하는 데 사용되어서는 안 된다.
도면의 간단한 설명
도 1(a-b)은 CHO 세포에서의 마우스 sFRP1(msFRP1) 및 마우스 Wnt1(mWnt1)의 공동 발현이 상층액(본원에서 조건화 배지(conditioned media)로도 언급됨)에서 더 높은 수준의 활성 mWnt1 단백질을 발생시키는 것을 제시한다. 도 1a. 동일한 양의 조건화 배지(CM)의 웨스턴 블롯은 CHO 대조군 세포 CM(레인 1), CHO mWnt1 CM(레인 3) 및 CHO msFRP1(레인 4)에서의 mWnt1 수준에 비해 mWnt1/msFRP1-His(레인 2) 및 mWnt1/msFRP1(레인 5)을 발현하는 CHO 세포에서 mWnt1의 향상된 수준을 나타낸다. msFRP1 웨스턴 블롯은 CHO CM(레인 1) 및 CHO mWnt1 CM(레인 3)에 비해 CHO mWnt1/msFRP1-His CM(레인 2), CHO msFRP1 CM(레인 4) 및 CHO mWnt1/msFRP1 CM(레인 5)에서 향상된 msFRP1 발현을 제시한다. 도 1b. CHO 세포(청색 원), CHO mWnt1(적색 사각형), CHO mWnt1/msFRP1(녹색 삼각형), CHO mWnt1/msFRP1-His(오렌지색 다이아몬드) 및 CHO msFRP1(적색 원)으로부터의 조건화 배지는 가장 높은 농도의 배지로 시작하고 1:2로 희석하여 HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5 Wnt 리포터 세포에 첨가되었다. CHO 세포가 mWnt1 및 msFRP1 또는 msFRP1-His를 함께 발현한 경우에만 조건화 배지에서 Wnt1 활성이 검출되었다. CHO-s mWnt1/msFRP1 세포(녹색 삼각형)으로부터의 조건화 배지는 상기 HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5 Wnt 리포터 검정에서 백그라운드보다 22배 높은 유도를 발생시킨 반면, CHO mWnt1/msFRP-His(오렌지색 다이아몬드)는 17배 높은 유도를 발생시켰다. 다른 CHO 세포주로부터의 조건화 배지는 HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5 Wnt 리포터 세포주에서 활성을 유도하지 않았다.
도 2a는 mWnt1 및 msFRP1-His 둘 모두를 발현하는 CHO 조건화 배지에서 msFRP1-His가 mWnt1에 결합하는 것을 제시한다. 면역침전 실험은 항-Wnt1 항체(레인 2, 레인 4), 항-His 항체(레인 3, 레인 5) 또는 항체가 없는 대조군(레인 1, 레인 6)을 동일한 양의 mWnt1 및 msFRP1-His 둘 모두를 과발현하는 CHO 세포 조건화 배지에 첨가함으로써 수행되었다. 항체/조건화 배지 혼합물이 단백질 G 아가로스 비드에 복합체화되었고, 면역침전 실험이 수행되었다. 항체가 CHO mWnt1/msFRP/His 발현 조건화 배지에 첨가되지 않은 경우, msFRP1 및 mWnt1은 웨스턴 블롯에서 검출되지 않았다(각각 레인 1 및 6). 항-mWnt1 항체가 사용되어 면역침전되는 경우, 항-His 항체로 블로팅되는 경우 His 태깅된 msFRP1/His 단백질이 약 37 킬로달톤(kDa)에서 검출되었다(레인 2). 항-His 항체가 사용되어 면역침전되는 경우, 항-mWnt1 항체는 약 42 kDa에서 mWnt1 밴드를 검출하였다(레인 5). 레인 3에서 50 kDa 및 25 kDa의 밴드는 항-His 항체에 의해 인지되는 중쇄 및 경쇄 IgG이다. 도 2b는 msFRP1이 mWnt2b 및 msFRP1 둘 모두를 발현하는 CHO 조건화 배지에서 mWnt2b에 결합하는 것을 제시한다. 면역침전 실험은 mWnt2b 단독 또는 mWnt2b 및 msFRP1을 과발현하는 동일한 양의 CHO 세포 조건화 배지에 항-마우스 Wnt2b, 항-인간 sFRP1 또는 항체가 없는 대조군을 첨가함으로써 수행되었다(클론 18). 항-mWnt2b 항체를 이용한 면역침전 후, 항-hsFRP1 항체를 이용한 블로팅은 약 35 kDa에서 sFRP1 단백질의 검출을 발생시켰고(흑색 화살표로 표시됨), 이는 mWnt2b 및 msFRP1이 mWnt2b 및 msFRP1 둘 모두를 발현하는 CHO 세포의 조건화 배지에서 물리적으로 상호작용함을 입증한다. 이러한 35 kDa 밴드는 면역침전이 항-mWnt2b로 수행되고, 항-hsFRP1로 블로팅되는 경우 mWnt1만을 발현하는 CHO 세포의 조건화 배지에서 검출되지 않았다. 도 2c는 msFRP1이 mWnt2b 및 msFRP1 둘 모두를 발현하는 CHO 조건화 배지에서 mWnt2b에 결합하는 것을 제시한다. 면역침전 실험은 mWnt2b 단독 또는 mWnt2b 및 msFRP1을 과발현하는 동일한 양의 CHO 세포 조건화 배지에 항-Wnt2b, 항-hsFRP1 또는 항체가 없는 대조군을 첨가함으로써 수행되었다(클론 18). 항-hsFRP1 항체를 이용한 면역침전 후, 항-mWnt2b 항체를 이용한 블로팅은 약 42 kDa에서 mWnt2b 단백질의 검출을 발생시켰고(흑색 화살표로 표시됨), 이는 mWnt2b 및 msFRP1이 mWnt2b 및 msFRP1 둘 모두를 발현하는 CHO 세포의 조건화 배지에서 물리적으로 상호작용함을 입증한다. 이러한 42 kDa mWnt1 밴드는 면역침전이 항-hsFRP1으로 수행되고, 항-mWnt1으로 블로팅된 경우 mWnt1만 발현하는 CHO 세포의 조건화 배지에서 검출되지 않았다.
도 3은 마우스 sFRP1(msFRP1)이 마우스 Wnt1(mWnt1) 활성을 향상시키고, 억제하는 것을 제시한다. 조건화 배지를 HEK293 hFz4/hLRP5 Wnt 리포터 세포에 첨가하기 전에 24시간 동안 재조합 msFRP1 단백질이 CHO mWnt1 발현 세포에 첨가되었다. sFRP1 단백질은 첨가된 6.25 마이크로그램/밀리리터(μg/mL)의 단백질에서 mWnt1 활성의 최대 향상을 나타내었고, 25 μg/mL 및 50 μg/mL의 용량은 mWnt1 활성을 기준선 수준까지 감소시켰다.
도 4(a-f)는 양이온 교환기 SP 세파로스 컬럼에서 sFRP1과 공동 용리된 Wnt-1(도 4(a-c)) 및 젤 여과 컬럼 상의 유리 sFRP1으로부터의 sFRP1/Wnt-1 복합체의 분리(도 4(d-e))를 제시한다. 도 4a. msFRP1 및 mWnt-1을 공동 발현하는 CHO 세포로부터의 조건화 배지가 SP 세파로스 컬럼에 로딩되었고, 결합된 단백질은 고염 완충액의 선형 구배로 용리되었다. 뚜렷한 후기 용리 피크는 sFRP가 일반적으로 용리된 위치였다. 도 4b. SP 용리로부터 수집된 분획은 15 퍼센트(%) SDS-PAGE에 로딩되었고, 은으로 염색되었다. 37 kDa 밴드는 sFRP1을 나타낸다. 도 4c. 도 4b의 동일 분획은 mWnt-1에 대한 항체로 프로빙된 웨스턴 블롯에 적용되었다. mWnt-1은 sFRP1이 검출된 동일한 분획에 존재하는 약 52 kDa 밴드로서 검출되었다. 도 4d. SP 세파로스 컬럼으로부터의 푸울이 로딩되고, 젤 여과(Superdex 200) 컬럼으로부터 용리되었다. 초기에 용리된 피크는 sFRP1/Wnt-1 복합체를 함유한 반면, 후기에 용리된 피크는 유리 sFRP를 함유하였다. 도 4e. 젤 여과 용리로부터 수집된 분획은 15% SDS-PAGE 젤에 로딩되고, 쿠마시 블루로 염색되었다. 하단 밴드(37 kDa)는 sFRP1을 나타내고, 상단 밴드(52 kDa)는 Wnt-1을 나타낸다. 도 4f. 젤 여과 컬럼으로부터 정제된 sFRP1/Wnt-1 복합체는 15% SDS-PAGE 젤에 로딩되고, 쿠마시 블루로 염색되었다. 37 kDa 및 52 kDa에서 2개의 밴드가 대략 1:1 몰비로 관찰되었다.
도 5는 정제된 재조합 mWnt1/msFRP1 복합체가 SDS-PAGE 젤에서 영동되는 경우 웨스턴 블롯에 의해 mWnt1 및 msFRP1 단백질 둘 모두가 검출된 것을 제시한다. 0.001 나노그램/밀리리터(ng/mL)의 mWnt1/msFRP1(레인 1), 0.01 ng/mL의 mWnt1/msFRP1(레인 2), 0.1 ng/mL의 mWnt1/msFRP1(레인 3), 1 ng/mL의 mWnt1/msFRP1(레인 4), 10 ng/mL의 mWnt1/msFRP1(레인 5), 100 ng/mL의 mWnt1/msFRP1(레인 6), 500 ng/mL의 mWnt1/msFRP1(레인 7) 및 1 마이크로그램/밀리리터(μg/mL)의 mWnt1/msFRP1(레인 8)이 환원 조건하에서 4-20% 아크릴아미드 젤에서 영동되었고, 이후 PVDF 막으로 옮겨졌다. 웨스턴 블로팅이 염소 항-Wnt-1 항체(1 μg/mL) 및 염소 항-msFRP1 항체(1 μg/mL)로 수행되었다. 검출을 위해 이차 항체(당나귀 항-염소 HRP 항체)가 1 μg/mL로 사용되었다.
도 6(a-d)은 정제된 재조합 mWnt1/msFRP1 단백질 복합체가 hFz4 및 hLRP5 둘 모두를 발현하는 HEK293 Wnt 리포터 세포에서 Wnt 신호전달 경로를 활성화시키는 것을 제시한다. 도 6a에서, mWnt1/msFRP1 단백질 복합체는 hFz4/Hlrp5를 발현하는 HEK293 Wnt 리포터 세포에서 시험되었고, 재조합 마우스 Wnt10B 단백질에 비해 더 활성인 것으로 나타났다. 도 6b. 인간 Fz4 및 인간 LRP5를 발현하는 HEK293 Wnt 리포터 세포는 재조합 마우스 sFRP1 단백질(청색 사각형) 또는 재조합 마우스 Wnt1/sFRP1(mWnt1/msFRP1) 단백질 복합체(적색 원)으로 처리되었다. mWnt1/msFRP1 복합체는 용량 반응 방식으로 HEK293 Wnt 리포터 세포의 명백한 유도를 나타낸 반면, msFRP1 단백질은 활성 단독을 나타내지 않았다. 도 6c. 재조합 mWnt1/msFRP1 단백질 복합체 정제는 유사한 생물학적 활성을 나타내는 다수의 로트(lot)로 재현 가능하다. 2개의 상이한 mWnt1/msFRP1 복합체는 정제되고, HEK293 hFz4/hLRP5 Wnt 리포터 검정에서 서로 비교되었고, 둘 모두 유사한 활성을 나타내는 것으로 제시되었다. Wnt 리포터 활성의 최대 향상은 110 ng/mL의 복합체에서 검출되었고; 이들 mWnt1/msFRP1 복합체의 활성은 110 ng/mL 미만 또는 110 ng/mL 초과의 용량이 더 낮은 활성을 나타내는 종형(bell shaped) 곡선을 생성시켰다. 도 6d. 도 4에 기재된 바와 같이 정제된 마우스 Wnt1/sFRP1 복합체는 매우 강력하며, CHAPS 완충액에서 정제되고 보관된 가장 활성인 Wnt(재조합 마우스 Wnt3a)에 비해 HEK293 Wnt 리포터 검정에서 더 나은 효능을 나타낸다. mWnt1/msFRP1에 대해 관찰된 50 퍼센트 유효 용량(ED50)은 1.8 ng/mL인 반면, 재조합 마우스 Wnt3a에 대해 관찰된 ED50은 12.2 ng/mL였다.
도 7(a-c)은 sFRP가 세포 비자율적 방식으로 예시적인 Wnt(Wnt1, Wnt2b 및 Wnt6) 활성을 향상시키는 것을 제시한다. 도 7a. msFRP1, msFRP3, msFRP4 및 msFRP5를 발현하는 세포로부터의 조건화 배지가 HEK293 Wnt 리포터 세포에 첨가되었고, HEK293 Wnt 리포터 활성 단독을 초과하는 Wnt 리포터 활성을 유도하지 않았다. mWnt1을 발현하는 세포가 24시간 동안 msFRP1 및 msFRP5를 발현하는 세포와 함께 배양된 경우, 이러한 공동 배양된 조건화 배지는 HEK293 Wnt 리포터 세포에 첨가되는 경우 Wnt 경로 활성을 유도하였다. 도 7b. 유사한 실험은 msFRP1과 함께 마우스 Wnt2b를 발현하는 세포의 공동 배양으로부터의 조건화 배지가 또한 Wnt 경로 활성화를 발생시킨 것을 제시한다. 도 7c. msFRP1 또는 msFRP5 발현 세포와 공동 배양된 인간 Wnt6 발현 세포로부터의 조건화 배지는 또한 Wnt 리포터 활성에서 유의한 증가를 발생시켰다.
도 8은 분비된 Wnt 단백질(예를 들어, Wnt3a)이 sFRP 동족체에 결합하는 것을 제시하며, 이는 테더링된 Wnt(예를 들어, Wnt1, Wnt2b 및 Wnt6)와 마찬가지로 분비된 Wnt 단백질이 또한 sFRP 단백질과 함께 과발현될 수 있고, (3-((3-콜라미도프로필)디메틸암모니오)-1-프로판설포네이트)(CHAPS) 없이 활성 상태로 정제될 수 있음을 나타낸다. 정제된 재조합 마우스 sFRP 단백질은 비오티닐화된 마우스 Wnt3a 단백질을 이용한 ELISA 결합 검정에서 시험되었다(상이한 sFRP 단백질에 대해 상이한 태그가 사용되었으므로, 상대 결합 활성은 이들 데이터를 이용하여 비교될 수 없다). msFRP1 및 msFRP4는 각각 염소 항-sFRP1 및 양 항-sFRP4 항체로 검출되었다. His 태깅된 마우스 sFRP2 및 His 태깅된 마우스 sFRP3는 마우스 항-His 항체로 검출되었다. HA 태깅된 마우스 sFRP5는 마우스 항-HA 항체로 검출되었다.
예시적 구현예의 상세한 설명
본 발명의 개시는 Wingless/Integrated-1 단백질(Wnt) 및 분비된 Frizzled-관련 단백질(sFRP)을 포함하는 분리된 단백질 복합체; 세제를 실질적으로 비함유하는, Wnt를 포함하는 조성물; Wnt 및 sFRP를 과발현하는 세포; Wnt를 과발현하는 세포 및 sFRP를 과발현하는 세포를 포함하는 조성물; 단백질 복합체, 조성물 및 세포를 제조하는 방법; 및 단백질 복합체, 조성물 및 세포를 사용하는 방법을 기재한다. 본 발명의 개시는 Wnt 및 sFRP를 포함하는 복합체를 형성시키고, Wnt를 분리하는 방법을 추가로 기재한다. 예를 들어, 본 발명의 시점에서 이용 가능한 Wnt 정제 프로토콜을 이용하여 정제될 수 없는 테더링된 Wnt를 포함하는 Wnt를 정제하는 데 사용될 수 있는 방법이 또한 본원에 기재된다. 본 발명의 개시는 세제의 사용 없이, 예를 들어, 분비된 Wnt를 포함하는 Wnt를 정제하는 데 사용될 수 있는 방법을 추가로 기재한다.
Wnt 단백질은 활성 상태에서 정제하기가 극도로 어려운 것으로 입증된 당화 및 팔미토일화 단백질이다(Willert et al. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology, 4:a007864 (2012)). Wnt는 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 및 Wnt16 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
Wnt 패밀리 구성원은 배아형성 조절에 관여하고, 줄기 세포에서 세포 증식, 생존, 이동, 극성, 세포 운명의 전문화 및 자가 재생을 포함하는 생애의 후반의 다양한 과정을 제어한다. Wnt 수준의 교란, 또는 Wnt의 다운스트림 효과기의 변경된 활성은 발달 결함을 발생시킬 수 있고, 질병 병인에 기여할 수 있다.
Wnt 단백질의 지질 변형으로 인해, 이들 성장 인자는 Wnt-생성 세포의 외막과 회합할 수 있으며, 이는 제한된 분비 및 Wnt-생성원으로부터 떨어진 신호전달을 발생시킬 수 있다. 2003년에, (3-((3-콜라미도프로필)디메틸암모니오)-1-프로판설포네이트)(CHAPS) 세제를 이용하여 팔미토일화된 Wnt 단백질을 정제하는 절차가 공개되었고; 이러한 절차를 위해 소수성 환경에서 Wnt를 유지시키는 것이 Wnt 활성을 보전하는데 필수적임이 입증되었다(Willert et al. Nature 423:448-452 (2003); Reya et al. Nature 423:409-414 (2003)). 그러나, CHAPS로 정제된 Wnt3a 단백질은 이의 소수성 특성으로 인해 세포 배양 배지에서 신속하게 활성을 잃고, 세제의 존재는, 예를 들어, 줄기 세포 자가 재생을 포함하는 정상 세포 기능을 방해할 수 있거나, 세포 배양에서 독성을 나타낼 수 있다(Tuysuz et al. Nature Communications 8:14578 (2017)).
일부 Wnt는, 예를 들어, Wnt3a, Wnt5a, Wnt5b, Wnt8a 및 Wnt10a를 포함하는 Wnt를 과발현하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포의 조건화 배지(본원에서 상층액으로도 언급됨)에서 활성 상태로 검출될 수 있다. 이들 "분비된 Wnt"는 일반적으로 상기 언급된 CHAPS 정제 프로토콜을 이용하여 정제할 수 있다. 예를 들어, Wnt1, Wnt2b, Wnt6, Wnt7a를 포함하는 다른 Wnt 또는 "테더링된 Wnt"는 이들 Wnt를 생성하는 세포의 세포막과 주로 회합되어 있는 것으로 보인다. 이들 테더링된 Wnt를 제조하는 세포의 조건화 배지에서는 활성 Wnt 단백질이 검출되지 않는다. 테더링된 Wnt를 과발현하는 세포로부터의 조건화 배지는 주변분비 방식으로 Wnt 신호전달을 활성화시키지 않으며, 데더링된 Wnt를 제조하는 세포가 Wnt 반응성 세포와 공동 배양되는 경우에만 Wnt 활성이 실현될 수 있다. 막 회합 단백질을 정제하려는 노력은 매우 어려운 것으로 입증되었으며, 제품을 경제적으로 비실용적이게 만드는 비활성 단백질의 정제 및 낮은 생산 수율을 발생시킨다.
분비된 Frizzled-관련 단백질(sFRP)은 원래 Wnt 신호전달의 길항제로서 기재된 분비된 Wnt 결합 단백질의 패밀리이다. 인간 및 마우스 유전체에는 5개의 sFRP가 존재한다. sFRP1-5는 모두 Frizzled 7-통과 막횡단 수용체의 Wnt 결합 시스테인 풍부 도메인(CRD)와 구조적 유사성을 나타낸다. 7-통과 막횡단 Frizzled 수용체와 달리, sFRP는 CRD의 다운스트림에 네트린-유사 도메인을 함유하는 분비된 단백질이며, 이러한 네트린-유사 도메인은 Frizzled 수용체에 존재하지 않는다.
sFRP는 원래 Wnt에 결합하고 Wnt 활성을 억제하는 분비된 단백질로 기재되었지만, 후속 연구는 sFRP가 또한, 예를 들어, 생물학적 관련 수준으로 발현되는 경우를 포함하여 Wnt 활성을 향상시킬 수 있음을 입증하였다(Mii and Taira, Development 136:4083-4088 (2009); Holly et al., Developmental Biology 388:192-204 (2014).
Wnt 생성 세포에서 발현된 sFRP가 세포 표면으로부터의 테더링된 Wnt에 결합하고 이를 유리시킬 수 있음을 제시하는 실험 결과가 본원에 기재된다. Wnt1 발현 세포에서의 sFRP1 또는 sFRP5의 과발현은 조건화 배지에서 활성 Wnt1/sFRP 복합체의 검출을 발생시킨다. 이러한 Wnt1/sFRP1 복합체는 이후 CHAPS와 같은 세제의 사용을 필요로 하지 않는 수성 정제 절차에서 정제될 수 있다.
본 발명의 개시는 또한 sFRP-발현 세포 또는 sFRP 재조합 단백질이 세포 자율 및 비-세포 자율 방식 둘 모두로 Wnt1 발현 세포의 막으로부터 활성 Wnt1/sFRP 복합체를 유리시킬 수 있음을 입증하는 실험 결과를 제공한다. 예를 들어, 표 1에 요약된 데이터는 마우스 sFRP1(msFRP1)이 세포막으로부터의 마우스 Wnt 1(mWnt1)에 결합하고 이를 유리시킬 수 있음을 시사한다. 분비된 단백질 sFRP1 또는 sFRP5가 mWnt1 발현 세포의 표면에서 mWnt1과 접촉되는 경우에만 조건화 배지에서 mWnt1 활성이 검출될 수 있다. 따라서, 세포 표면에서 Wnt에 결합하는 sFRP는 Wnt 단백질이 "분비된" 모르포겐(morphogen)으로서 작용하게 할 수 있다.
본원에 제공된 실험 결과는 또한 sFRP가 또한 Wnt 발현 세포의 외부 형질막으로부터 다른 Wnt(예를 들어, Wnt2b 및 Wnt6을 포함함)를 유리시켜, Wnt2b 또는 Wnt6을 발현하는 세포의 조건화 배지에서 Wnt2b/sFRP 및 Wnt6/sFRP 복합체를 발생시킬 수 있음을 제시한다. 이들 데이터는 sFRP가 Wnt 결합 파트너로서 작용할 수 있음을 입증한다. 그러나, Wnt 신호전달의 상황에서 sFRP의 2상 반응이, 예를 들어, 도 3, 도 6c에서 관찰되었다.
이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, sFRP는 Wnt 상의 팔미토일화 모이어티에 결합하여 수성 환경으로부터 이러한 지질 변형을 보호할 수 있고, 따라서 테더링된 Wnt가 활성 Wnt/sFRP 복합체에서 정제되는 것을 가능하게 할 수 있는 것으로 생각된다. 다시, 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, sFRP는 Wnt에 결합하고, Wnt 결합을 포화시키는 sFRP의 양까지 Wnt 신호전달을 향상시키는 것으로 생각된다(도 3, 도 6c 참조). 그러나, 이용 가능한 Wnt 단백질 모두가 sFRP와 복합체화되면, sFRP 단백질은, 예를 들어, Frizzled 수용체를 포함하는 Wnt 경로의 다른 비-Wnt 성분과 상호작용함으로써 Wnt 신호전달을 억제할 수 있다(Bafico et al. The Journal of Biological Chemistry 274, 16180-16187 (1999)). 예를 들어, 과량의 sFRP는 Wnt 단백질이 Frizzled 수용체를 활성화시키는 것을 억제할 수 있다.
Wnt
Wnt는 임의의 Wnt 단백질 또는 Wnt 단백질의 조합물을 포함할 수 있다. Wnt 단백질은 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 및 Wnt16 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Wnt는 분비된 Wnt 및/또는 테더링된 Wnt를 포함한다. 일부 구현예에서, 분비된 Wnt는 Wnt3a, Wnt5a, Wnt5b, Wnt8a 및 Wnt10a 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, Wnt는 진핵생물 Wnt를 포함한다. Wnt는, 예를 들어, 포유동물, 양서류(예를 들어, 제노푸스(Xenopus)), 조류(예를 들어, 닭) 또는 어류(예를 들어, 제브라피쉬)를 포함하는 임의의 적합한 진핵생물로부터의 Wnt일 수 있다. 일부 구현예에서, Wnt는 바람직하게는 포유동물 Wnt를 포함한다. 포유동물 Wnt는, 예를 들어, 인간 Wnt, 마우스 Wnt, 래트 Wnt, 말과 Wnt, 개과 Wnt, 염소과 Wnt, 소과 Wnt 등을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, Wnt는 태깅된 Wnt를 포함한다. Wnt는, 예를 들어, 히스티딘(His) 태그, FLAG 태그, 적혈구응집소(HA) 태그, Fc 태그, 글루타티온 S-트랜스페라제(GST) 태그, 형광 태그(예를 들어, GFP 태그, YFP 태그, BFP 태그) 등을 포함하는 임의의 적합한 단백질 태그로 태깅될 수 있다. 일부 구현예에서, 태그는 C-말단에 존재할 수 있고; 일부 구현예에서, 태그는 N-말단에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, Wnt는 활성 Wnt를 포함한다. 본원에서 사용되는 "활성 Wnt"는 표준 β-카테닌 신호전달을 활성화시키는 Wnt이다.
sFRP
sFRP는 임의의 sFRP 단백질 또는 sFRP 단백질의 조합물을 포함할 수 있다. sFRP는, 예를 들어, sFRP1, sFRP2, sFRP3, sFRP4 및 sFRP5 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, sFRP는 진핵생물 sFRP를 포함한다. sFRP는, 예를 들어, 포유동물, 양서류(예를 들어, 제노푸스), 조류(예를 들어, 닭) 또는 어류(예를 들어, 제브라피쉬)를 포함하는 임의의 적합한 진핵생물로부터의 sFRP일 수 있다. 일부 구현예에서, sFRP는 바람직하게는 포유동물 sFRP를 포함한다. 포유동물 sFRP는, 예를 들어, 인간 sFRP, 마우스 sFRP, 래트 sFRP, 말과 sFRP, 개과 sFRP, 염소과 sFRP, 소과 sFRP 등을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, sFRP는 태깅된 sFRP를 포함한다. sFRP는, 예를 들어, 히스티딘(His) 태그, FLAG 태그, 적혈구응집소(HA) 태그, Fc 태그, 글루타티온 S-트랜스페라제(GST) 태그, 형광 태그(예를 들어, GFP 태그, YFP 태그, BFP 태그) 등을 포함하는 임의의 적합한 단백질 태그로 태깅될 수 있다. 일부 구현예에서, 태그는 C-말단에 존재할 수 있고; 일부 구현예에서, 태그는 N-말단에 존재할 수 있다.
분리된 단백질 복합체 및 조성물
일부 양태에서, 본 발명의 개시는 Wnt 및 sFRP를 포함하는 분리된 단백질 복합체를 기재한다. 일부 구현예에서, "분리된 단백질 복합체"는 자연에서 발견되는 것과 상이한, 즉, 고유 또는 원래의 세포 또는 신체 환경에서 발견되는 것과 상이한 조성물 또는 환경에 존재하는 단백질 복합체를 의미한다. "분리된 단백질 복합체"는 다른 자연적으로 공존하는 세포 또는 조직 성분의 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90% 또는 적어도 95%로부터 분리될 수 있다. "분리된 단백질 복합체"는 인공 제조물 및/또는 비-자연 숙주 세포에서 자연적으로 존재하는 단백질 복합체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, "분리된 Wnt/sFRP 단백질 복합체"는 비자연적으로 높은 수준의 재조합 Wnt 및 sFRP를 발현하도록 조작된 세포로부터 분리된 Wnt/sFRP 복합체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 비-자연 숙주 세포를 포함할 수 있고/있거나 세포는 세포의 유전체에 통합된 비-자연 DNA를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 분리된 단백질 복합체는 바람직하게는 세제를 실질적으로 비함유한다. 세제를 "실질적으로 비함유하는" 분리된 단백질 복합체는 분리된 단백질 복합체에서 Wnt의 활성 또는 작용에 실질적으로 영향을 주기에 충분한 세제를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, "세제를 실질적으로 비함유하는"은 2 중량/부피%(w/v) 미만, 1%(w/v) 미만, 0.5%(w/v) 미만, 0.1%(w/v) 미만 또는 0.01%(w/v) 미만의 세제를 함유하는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 세제는 쯔비터이온성 및/또는 양쪽성 세제를 포함한다. 일부 구현예에서, 세제는 CHAPS(3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트로도 언급됨), CHAPSO(3-([3-콜라미도프로필]디메틸암모니오)-2-하이드록시-1-프로판설포네이트로도 언급됨), Triton-X-100, Tween 20, Tween 80, SDS, 데옥시콜레이트, 콜레이트, 사르코실, DDM, 디지토닌 및 우레아 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 세제는 CHAPS를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는 Wnt를 포함하는 조성물을 기재한다. 조성물은 바람직하게는 세제를 실질적으로 비함유한다. 세제를 "실질적으로 비함유하는" 조성물은 조성물에서 Wnt의 활성 또는 작용에 실질적으로 영향을 주기에 충분한 세제를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 분리된 단백질 복합체 또는 조성물의 Wnt는 바람직하게는 활성 Wnt를 포함한다. 본원에서 사용되는 "활성 Wnt"는 표준 β-카테닌 신호전달을 활성화시키는 Wnt이다.
표준 β-카테닌 신호전달은 당업자에게 공지된 임의의 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 표준 β-카테닌 신호전달은 β-카테닌, LRP5, LRP6, GSK3B, 악신(Axin) 및/또는 Dishevelled의 Wnt 매개 인산화를 검정함으로써 측정될 수 있다. 인산화는 웨스턴 블롯을 이용하여 측정될 수 있다. 제노푸스 라에비스(Xenopus laevis) 또는 제브라피쉬의 자가분비 및 주변분비 C57MG 세포, 세포 형질전환 검정 및 배아 축의 중복이 또한 Wnt 매개 표준 β-카테닌 활성을 시험하기 위한 확립된 검정이다. (예를 들어, 문헌[Shimizu et al., Cell Growth Differ. 1997, 8(12):1349-58; Wong et al., Mol. Cell. Biol. 1994, 14(9):6278-86; McMahon and Moon, Cell. 1989, 58(6):1075-1084; Lustig et al., Mol. Cell. Biol. 2002, 22(4):1184-93; Tamai et al., Mol. Cell. 2004, 13(1):149-156; Van Noort et al., J Biol Chem. 2002, 277(20):17901-17905; Molenaar et al., Cell. 1996, 86(3):391-399; Klein and Melton, Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93(16):8455-8459] 참조).
일부 구현예에서, 표준 β-카테닌 신호전달은 실시예 1에 기재된 HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5 Wnt 리포터 검정을 포함하는 분비된 알칼리성 포스파타제(SEAP) 리포터 검정을 이용하여 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 활성 Wnt를 포함하는 단백질 복합체는 SEAP 리포터 검정을 이용하여 측정된 바와 같이 Wnt를 포함하지 않는 복합체보다 2배 이상의 Wnt 리포터 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 활성 Wnt를 포함하는 조성물은 SEAP 리포터 검정을 이용하여 측정된 바와 같이 Wnt를 포함하지 않는 조성물보다 2배 이상의 Wnt 리포터 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, 활성 Wnt 또는 분리된 단백질 복합체는, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5 Wnt 리포터 검정을 이용하여 측정된 바와 같이 1000 ng/mL 미만, 500 ng/mL 미만, 100 ng/mL 미만, 50 ng/mL 미만, 40 ng/mL 미만, 30 ng/mL 미만, 20 ng/mL 미만, 15 ng/mL 미만, 10 ng/mL 미만, 8 ng/mL 미만, 5 ng/mL 미만, 4 ng/mL 미만, 3 ng/mL 미만 또는 2 ng/mL 미만의 50 퍼센트 유효 용량(ED50)을 나타낸다.
일부 구현예에서, 활성 Wnt 또는 분리된 단백질 복합체는, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5 Wnt 리포터 검정을 이용하여 측정된 바와 같은 적어도 2 ng/mL, 적어도 3 ng/mL, 적어도 4 ng/mL, 적어도 5 ng/mL, 적어도 8 ng/mL, 적어도 10 ng/mL, 적어도 15 ng/mL, 적어도 20 ng/mL, 적어도 30 ng/mL, 적어도 40 ng/mL, 적어도 50 ng/mL, 적어도 100 ng/mL 또는 적어도 500 ng/mL의 50 퍼센트 유효 용량(ED50)을 나타낸다.
일부 구현예에서, 분리된 단백질 복합체 또는 조성물은 Wnt-sFRP 융합 단백질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Wnt는, 예를 들어, 펩티드 링커를 포함하는 링커를 통해 sFRP1에 융합될 수 있다. 임의의 적합한 링커가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 GGGS(SEQ ID NO:1), GGGGS(SEQ ID NO:2), GSGSG(SEQ ID NO:3), GGGGG(SEQ ID NO:4) 및 GSGSGGSGSG(SEQ ID NO:5) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는, 예를 들어, (GGGS)X(SEQ ID NO:6), (GGGGS)X(SEQ ID NO:7); (GSGSG)X(SEQ ID NO:8), (GSGSGGSGSG)X(SEQ ID NO:9) 및/또는 GX(여기서, X = 1-400)를 포함하는 상기 기재된 펩티드 링커 중 하나 이상의 다수의 반복을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 분리된 단백질 복합체 또는 조성물은, 예를 들어, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4 중 적어도 하나를 포함하는 R-스폰딘 패밀리의 구성원을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, R-스폰딘은 sFRP1 및/또는 Wnt에 융합되어 융합 단백질을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, R-스폰딘은, 예를 들어, 펩티드 링커를 포함하는 링커를 통해 sFRP1 및/또는 Wnt에 융합될 수 있다. 임의의 적합한 링커가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 GGGS(SEQ ID NO:1), GGGGS(SEQ ID NO:2), GSGSG(SEQ ID NO:3), GGGGG(SEQ ID NO:4) 및 GSGSGGSGSG(SEQ ID NO:5) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는, 예를 들어, (GGGS)X(SEQ ID NO:6), (GGGGS)X(SEQ ID NO:7); (GSGSG)X(SEQ ID NO:8), (GSGSGGSGSG)X(SEQ ID NO:9) 및/또는 GX(여기서, X = 1-400)를 포함하는 상기 기재된 펩티드 링커 중 하나 이상의 다수의 반복을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 분리된 단백질 복합체 또는 조성물은 리포칼린7을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 분리된 단백질 복합체 또는 조성물은 WIF1을 포함할 수 있다.
제조 방법
추가 양태에서, 본 발명의 개시는 Wnt 및 sFRP를 포함하는 복합체를 형성시키고 Wnt를 분리하는 것을 포함하는 방법을 기재한다. 일부 구현예에서, Wnt는 Wnt 및 sFRP를 포함하는 복합체를 형성시키기 전에 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, Wnt는 Wnt 및 sFRP를 포함하는 복합체로부터 분리될 수 있다. Wnt가 Wnt 및 sFRP를 포함하는 복합체로부터 분리되는 경우를 포함하는 일부 구현예에서, Wnt는 바람직하게는 세제를 사용하지 않고 분리될 수 있다.
예를 들어, Wnt가 Wnt 및 sFRP를 포함하는 복합체를 형성시키기 전에 분리되는 경우를 포함하는 일부 구현예에서, Wnt를 분리하는 것은 세제를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 세제는, 예를 들어, CHAPS를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 Wnt 및 sFRP를 포함하는 복합체로부터 세제를 제거하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, Wnt를 분리하는 것은 수성 정제 절차를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Wnt를 분리하는 것은 크로마토그래피 분리를 포함할 수 있다. 크로마토그래피 분리는, 예를 들어, SEPHAROSE 컬럼을 사용한 분리를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 Wnt 및 sFRP 중 적어도 하나를 생성시키고/시키거나 발현시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Wnt 및/또는 sFRP는 과발현될 수 있다. Wnt 및/또는 sFRP는 적절한 프로모터의 제어하에서 포유동물 세포, 효모, 박테리아, 곤충 세포(S2, Sf9, Sf21) 또는 다른 세포에서 발현될 수 있다. 세포 비함유 번역 시스템은 또한 RNA를 사용하여 Wnt 및/또는 sFRP를 생성시키는 데 이용될 수 있다. 원핵생물 및 진핵생물 숙주와 함께 사용하기에 적절한 클로닝 및 발현 벡터는, 예를 들어, 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, Wnt 및 sFRP를 포함하는 복합체를 형성시키는 것은 Wnt 발현 세포를 sFRP 발현 세포와 공동 배양하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Wnt 및 sFRP를 포함하는 복합체를 형성시키는 것은 Wnt 발현 세포를 sFRP 발현 세포와 공동 배양하는 것을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 Wnt 및 sFRP를 발현하는 세포로부터 또는 Wnt 발현 세포와 sFRP 발현 세포의 공동 배양물로부터 조건화 배지를 분리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 조건화 배지로부터 Wnt 및 sFRP를 포함하는 복합체를 분리하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
사용 방법
또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는 본원에 기재된 바와 같이 분리된 단백질 복합체를 사용하는 방법을 기재한다. 예를 들어, 본원에 기재된 분리된 단백질 복합체, 분리된 Wnt 및/또는 조성물은 배지 첨가제로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 배지 첨가제는, 예를 들어, 줄기 세포 배양물 또는 오가노이드(organoid) 배양물을 포함하는 세포 배양물에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 분리된 단백질 복합체, 분리된 Wnt 및/또는 조성물은 질병 모델에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 분리된 단백질 복합체, 분리된 Wnt 및/또는 조성물은, 예를 들어, 배아 줄기 세포 또는 유도된 다능성 줄기 세포를 포함하는 세포의 분화를 지시하는 데 사용될 수 있다. 세포는, 예를 들어, 뉴런, 신경외배엽, 심장 근육세포, 중간엽 줄기 세포 및/또는 중내배엽 유도체를 포함하는 임의의 바람직한 세포 유형으로 분화될 수 있다(예를 들어, 문헌[Lam et al., 2014, Semin Nephrol, 34(4):445-461; Spence et al., 2011, Nature, 470:105-109; Paige et al., 2010, PLoS One 5(6):e11134. doi: 10.1371/journal.pone.0011134; Murashov et al., 2004 FASEB 19(2):252-4] 참조).
예시적 구현예
분리된 단백질 복합체 구현예
1. Wnt 및 sFRP를 포함하는 분리된 단백질 복합체.
2. 구현예 1에서, Wnt가 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 및 Wnt16 중 적어도 하나를 포함하는 분리된 단백질 복합체.
3. 구현예 1 또는 2에서, Wnt가 Wnt3a, Wnt5a, Wnt5b, Wnt8a 및 Wnt10a 중 적어도 하나를 포함하는 분리된 단백질 복합체.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에서, sFRP가 sFRP1, sFRP2, sFRP3, sFRP4 및 sFRP5 중 적어도 하나를 포함하는 분리된 단백질 복합체.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에서, Wnt가 활성 Wnt를 포함하는 분리된 단백질 복합체.
6. 구현예 5에서, 활성 Wnt가 β-카테닌 신호전달을 활성화시키는 Wnt를 포함하는 분리된 단백질 복합체.
7. 구현예 5 또는 6에서, 활성 Wnt가 분비된 알칼리성 포스파타제(SEAP) 리포터 검정을 이용하여 측정된 바와 같은 Wnt 리포터 활성을 갖는 Wnt를 포함하는 분리된 단백질 복합체.
8. 구현예 7에서, 분리된 단백질 복합체가 SEAP 리포터 검정을 이용하여 측정된 바와 같이 Wnt를 포함하지 않는 분리된 단백질 복합체보다 2배 이상의 Wnt 리포터 활성을 갖는 분리된 단백질 복합체.
9. 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에서, 단백질 복합체가 세제를 실질적으로 비함유하는 분리된 단백질 복합체.
10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에서, 단백질 복합체가 HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5 Wnt 리포터 검정을 이용하여 측정된 바와 같은 1000 ng/mL 미만, 500 ng/mL 미만, 또는 100 ng/mL 미만의 50 퍼센트 유효 용량(ED50)을 나타내는 분리된 단백질 복합체.
11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에서, Wnt가 포유동물 Wnt를 포함하는 분리된 단백질 복합체.
12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에서, Wnt가 인간 Wnt 또는 마우스 Wnt를 포함하는 분리된 단백질 복합체.
13. 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에서, sFRP가 포유동물 sFRP를 포함하는 분리된 단백질 복합체.
14. 구현예 1 내지 13 중 어느 하나에서, sFRP가 인간 sFRP 또는 마우스 sFRP를 포함하는 분리된 단백질 복합체.
15. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에서, sFRP가 태깅된 sFRP를 포함하는 분리된 단백질 복합체.
16. 구현예 15에서, 태깅된 sFRP가 히스티딘-태깅된 sFRP를 포함하는 분리된 단백질 복합체.
17. 구현예 15 또는 16에서, 태깅된 sFRP가 C-말단 태깅된 sFRP를 포함하는 분리된 단백질 복합체.
18. 구현예 1 내지 17 중 어느 하나에서, Wnt가 태깅된 Wnt를 포함하는 분리된 단백질 복합체.
19. 구현예 18에서, 태깅된 Wnt가 히스티딘-태깅된 Wnt를 포함하는 분리된 단백질 복합체.
20. 구현예 18 또는 19에서, 태깅된 Wnt가 C-말단 태깅된 Wnt를 포함하는 분리된 단백질 복합체.
21. 구현예 1 내지 20 중 어느 하나에서, 복합체가 Wnt-sFRP 융합 단백질을 포함하는 분리된 단백질 복합체.
22. 구현예 21에서, Wnt-sFRP 융합 단백질이 링커를 포함하는 분리된 단백질 복합체.
23. 구현예 22에서, 링커가 펩티드 링커를 포함하는 분리된 단백질 복합체.
24. 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에서, 분리된 단백질 복합체가 R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 분리된 단백질 복합체.
25. 구현예 24에서, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4 중 적어도 하나가 sFRP1에 융합되어 융합 단백질을 형성하는 분리된 단백질 복합체.
26. 구현예 25에서, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4 중 적어도 하나가 링커를 통해 sFRP1에 융합되는 분리된 단백질 복합체.
27. 구현예 26에서, 링커가 펩티드 링커를 포함하는 분리된 단백질 복합체.
28. 구현예 25 내지 27 중 어느 하나에서, 융합 단백질이 Wnt를 추가로 포함하는 분리된 단백질 복합체.
29. 구현예 24 또는 구현예 28에서, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4 중 적어도 하나가 Wnt에 융합되어 융합 단백질을 형성하는 분리된 단백질 복합체.
30. 구현예 29에서, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4 중 적어도 하나가 링커를 통해 Wnt에 융합되는 분리된 단백질 복합체.
31. 구현예 30에서, 링커가 펩티드 링커를 포함하는 분리된 단백질 복합체.
32. 구현예 23, 27 또는 31에서, 펩티드 링커가 GGGS(SEQ ID NO:1), GGGGS(SEQ ID NO:2), (SEQ ID NO:3), GGGGG(SEQ ID NO:4) 및 GSGSGGSGSG(SEQ ID NO:5) 중 적어도 하나를 포함하는 분리된 단백질 복합체.
33. 구현예 1 내지 구현예 32 중 어느 하나에서, 분리된 단백질 복합체가 리포칼린7을 추가로 포함하는 분리된 단백질 복합체.
34. 구현예 1 내지 구현예 33 중 어느 하나에서, 분리된 단백질 복합체가 WIF1을 추가로 포함하는 분리된 단백질 복합체.
35. 구현예 1 내지 34 중 어느 하나의 분리된 단백질 복합체를 이용하는 방법.
Wnt 조성물 구현예
1. Wnt를 포함하는 조성물로서, 세제를 실질적으로 비함유하는, 조성물.
2. 구현예 1에서, Wnt가 활성 Wnt를 포함하는 조성물.
3. Wnt를 포함하는 조성물로서, 상기 Wnt가 활성 Wnt를 포함하는, 조성물.
4. 구현예 2 또는 3에서, 활성 Wnt가 표준 β-카테닌 신호전달을 활성화시키는 Wnt를 포함하는 조성물.
5. 구현예 2 또는 3에서, 활성 Wnt가 분비된 알칼리성 포스파타제(SEAP) 리포터 검정을 이용하여 측정된 바와 같은 Wnt 리포터 활성을 갖는 Wnt를 포함하는 조성물.
6. 구현예 5에서, 조성물이 SEAP 리포터 검정을 이용하여 측정된 바와 같이 Wnt를 포함하지 않는 조성물보다 2배 이상의 Wnt 리포터 활성을 갖는 조성물.
7. 구현예 2 내지 6 중 어느 하나에서, 활성 Wnt가 HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5 Wnt 리포터 검정을 이용하여 측정된 바와 같은 1000 ng/mL 미만, 500 ng/mL 미만, 또는 100 ng/mL 미만의 50 퍼센트 유효 용량(ED50)을 나타내는 조성물.
8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에서, Wnt가 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 및 Wnt16 중 적어도 하나를 포함하는 조성물.
9. 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에서, Wnt가 Wnt3a, Wnt5a, Wnt5b, Wnt8a 및 Wnt10a 중 적어도 하나를 포함하는 조성물.
10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에서, Wnt가 포유동물 Wnt를 포함하는 조성물.
11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에서, Wnt가 인간 Wnt 또는 마우스 Wnt를 포함하는 조성물.
12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에서, 조성물이 sFRP를 추가로 포함하는 조성물.
13. 구현예 12에서, sFRP가 sFRP1, sFRP2, sFRP3, sFRP4 및 sFRP5 중 적어도 하나를 포함하는 조성물.
14. 구현예 12 또는 13에서, 조성물이 Wnt-sFRP 융합 단백질을 포함하는 조성물.
15. 구현예 14에서, Wnt-sFRP 융합 단백질이 링커를 포함하는 조성물.
16. 구현예 15에서, 링커가 펩티드 링커를 포함하는 조성물.
17. 구현예 12 내지 15 중 어느 하나에서, sFRP가 포유동물 sFRP를 포함하는 조성물.
18. 구현예 12 내지 17 중 어느 하나에서, sFRP가 인간 sFRP 또는 마우스 sFRP를 포함하는 조성물.
19. 구현예 12 내지 18 중 어느 하나에서, sFRP가 태깅된 sFRP를 포함하는 조성물.
20. 구현예 19에서, 태깅된 sFRP가 히스티딘-태깅된 sFRP를 포함하는 조성물.
21. 구현예 20 또는 21에서, 태깅된 sFRP가 C-말단 태깅된 sFRP를 포함하는 조성물.
22. 구현예 1 내지 21 중 어느 하나에서, Wnt가 태깅된 Wnt를 포함하는 조성물.
23. 구현예 22에서, 태깅된 Wnt가 히스티딘 태깅된 Wnt를 포함하는 조성물.
24. 구현예 22 또는 23에서, 태깅된 Wnt가 C-말단 태깅된 Wnt를 포함하는 조성물.
25. 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에서, 조성물이 R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 조성물.
26. 구현예 25에서, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4 중 적어도 하나가 Wnt에 융합되어 융합 단백질을 형성하는 조성물.
27. 구현예 23에서, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4 중 적어도 하나가 펩티드 링커를 통해 Wnt에 융합되는 조성물.
28. 구현예 25 내지 27 중 어느 하나에서, 조성물이 sFRP를 포함하고, Wnt, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4 중 적어도 하나가 sFRP에 융합되어 융합 단백질을 형성하는 조성물.
29. 구현예 28에서, Wnt, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4 중 적어도 하나가 펩티드 링커를 통해 sFRP에 융합되는 조성물.
30. 구현예 16, 27 또는 29에서, 펩티드 링커가 GGGS(SEQ ID NO:1), GGGGS(SEQ ID NO:2), (SEQ ID NO:3), GGGGG(SEQ ID NO:4) 및 GSGSGGSGSG(SEQ ID NO:5) 중 적어도 하나를 포함하는 조성물.
31. 구현예 1 내지 30 중 어느 하나에서, 조성물이 리포칼린7을 추가로 포함하는 조성물.
32. 구현예 1 내지 31 중 어느 하나에서, 조성물이 WIF1을 추가로 포함하는 조성물.
33. 구현예 1 내지 32 중 어느 하나의 조성물을 이용하는 방법.
세포 구현예
1. Wnt 및 sFRP를 과발현하는 세포.
2. 구현예 1에서, Wnt가 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 및 Wnt16 중 적어도 하나를 포함하는 세포.
3. 구현예 1 또는 2에서, Wnt가 Wnt3a, Wnt5a, Wnt5b, Wnt8a 및 Wnt10a 중 적어도 하나를 포함하는 세포.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에서, sFRP가 sFRP1, sFRP2, sFRP3, sFRP4 및 sFRP5 중 적어도 하나를 포함하는 세포.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에서, Wnt가 활성 Wnt를 포함하는 세포.
6. 구현예 5에서, 활성 Wnt가 β-카테닌 신호전달을 활성화시키는 Wnt를 포함하는 세포.
7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에서, Wnt가 HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5 Wnt 리포터 검정을 이용하여 측정된 바와 같은 1000 ng/mL 미만, 500 ng/mL 미만, 또는 100 ng/mL 미만의 50 퍼센트 유효 용량(ED50)을 나타내는 세포.
8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에서, Wnt가 포유동물 Wnt를 포함하는 세포.
9. 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에서, Wnt가 인간 Wnt 또는 마우스 Wnt를 포함하는 세포.
10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에서, sFRP가 포유동물 sFRP를 포함하는 세포.
11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에서, sFRP가 인간 sFRP 또는 마우스 sFRP를 포함하는 세포.
12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에서, sFRP가 태깅된 sFRP를 포함하는 세포.
13. 구현예 12에서, 태깅된 sFRP가 히스티딘-태깅된 sFRP를 포함하는 세포.
14. 구현예 12 또는 13에서, 태깅된 sFRP가 C-말단 태깅된 sFRP를 포함하는 세포.
15. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에서, Wnt가 태깅된 Wnt를 포함하는 세포.
16. 구현예 15에서, 태깅된 Wnt가 히스티딘 태깅된 Wnt를 포함하는 세포.
17. 구현예 15 또는 16에서, 태깅된 Wnt가 C-말단 태깅된 Wnt를 포함하는 세포.
18. 구현예 1 내지 17 중 어느 하나에서, 세포가 Wnt-sFRP 융합 단백질을 발현하는 세포.
19. 구현예 18에서, Wnt-sFRP 융합 단백질이 링커를 포함하는 세포.
20. 구현예 19에서, 링커가 펩티드 링커를 포함하는 세포.
21. 구현예 1 내지 20 중 어느 하나에서, 세포가 R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4 중 적어도 하나를 추가로 발현하는 세포.
22. 구현예 21에서, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4 중 적어도 하나가 sFRP1에 융합되어 융합 단백질을 형성하는 세포.
23. 구현예 22에서, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4 중 적어도 하나가 링커를 통해 sFRP1에 융합되는 세포.
24. 구현예 23에서, 링커가 펩티드 링커를 포함하는 세포.
25. 구현예 22 내지 27 중 어느 하나에서, 융합 단백질이 Wnt를 추가로 포함하는 세포.
26. 구현예 21 또는 구현예 25에서, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4 중 적어도 하나가 Wnt에 융합되어 융합 단백질을 형성하는 세포.
27. 구현예 26에서, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4 중 적어도 하나가 링커를 통해 Wnt에 융합되는 세포.
28. 구현예 27에서, 링커가 펩티드 링커를 포함하는 세포.
29. 구현예 20, 24 또는 28에서, 펩티드 링커가 GGGS(SEQ ID NO:1), GGGGS(SEQ ID NO:2), (SEQ ID NO:3), GGGGG(SEQ ID NO:4) 및 GSGSGGSGSG(SEQ ID NO:5) 중 적어도 하나를 포함하는 세포.
30. 구현예 1 내지 29 중 어느 하나의 세포를 이용하는 방법.
세포 조성물 구현예
1. Wnt를 과발현하는 세포; 및 sFRP를 과발현하는 세포를 포함하는 조성물.
2. 구현예 1에서, Wnt가 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 및 Wnt16 중 적어도 하나를 포함하는 조성물.
3. 구현예 1 또는 2에서, Wnt가 Wnt3a, Wnt5a, Wnt5b, Wnt8a 및 Wnt10a 중 적어도 하나를 포함하는 조성물.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에서, sFRP가 sFRP1, sFRP2, sFRP3, sFRP4 및 sFRP5 중 적어도 하나를 포함하는 조성물.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에서, Wnt가 활성 Wnt를 포함하는 조성물.
6. 구현예 5에서, 활성 Wnt가 β-카테닌 신호전달을 활성화시키는 Wnt를 포함하는 조성물.
7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에서, Wnt가 HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5 Wnt 리포터 검정을 이용하여 측정된 바와 같은 1000 ng/mL 미만, 500 ng/mL 미만, 또는 100 ng/mL 미만의 50 퍼센트 유효 용량(ED50)을 나타내는 조성물.
8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에서, Wnt가 포유동물 Wnt를 포함하는 조성물.
9. 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에서, Wnt가 인간 Wnt 또는 마우스 Wnt를 포함하는 조성물.
10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에서, sFRP가 포유동물 sFRP를 포함하는 조성물.
11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에서, sFRP가 인간 sFRP 또는 마우스 sFRP를 포함하는 조성물.
12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에서, sFRP가 태깅된 sFRP를 포함하는 조성물.
13. 구현예 12에서, 태깅된 sFRP가 히스티딘-태깅된 sFRP를 포함하는 조성물.
14. 구현예 12 또는 13에서, 태깅된 sFRP가 C-말단 태깅된 sFRP를 포함하는 조성물.
15. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에서, Wnt가 태깅된 Wnt를 포함하는 조성물.
16. 구현예 15에서, 태깅된 Wnt가 히스티딘 태깅된 Wnt를 포함하는 조성물.
17. 구현예 15 또는 16에서, 태깅된 Wnt가 C-말단 태깅된 Wnt를 포함하는 조성물.
18. 구현예 1 내지 17 중 어느 하나에서, 조성물이 R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 추가로 포함하는 조성물.
19. 구현예 18에서, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4 중 적어도 하나가 sFRP1에 융합되어 융합 단백질을 형성하는 조성물.
20. 구현예 19에서, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4 중 적어도 하나가 링커를 통해 sFRP1에 융합되는 조성물.
21. 구현예 20에서, 링커가 펩티드 링커를 포함하는 조성물.
22. 구현예 18에서, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4 중 적어도 하나가 Wnt에 융합되어 융합 단백질을 형성하는 조성물.
23. 구현예 22에서, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4 중 적어도 하나가 링커를 통해 Wnt에 융합되는 조성물.
24. 구현예 23에서, 링커가 펩티드 링커를 포함하는 조성물.
25. 구현예 21 또는 24에서, 펩티드 링커가 GGGS(SEQ ID NO:1), GGGGS(SEQ ID NO:2), (SEQ ID NO:3), GGGGG(SEQ ID NO:4) 및 GSGSGGSGSG(SEQ ID NO:5) 중 적어도 하나를 포함하는 조성물.
26. 구현예 1 내지 25 중 어느 하나에서, Wnt를 과발현하는 세포 및 sFRP를 과발현하는 세포 중 적어도 하나가 플라스미드로 형질감염되는 조성물.
27. 구현예 1 내지 26 중 어느 하나의 조성물을 이용하는 방법.
방법 구현예
1. Wnt 및 sFRP를 포함하는 복합체를 형성시키는 단계; 및 Wnt를 분리하는 단계를 포함하는 방법.
2. 구현예 1에서, Wnt를 분리하는 단계가 수성 정제 절차를 포함하는 방법.
3. 구현예 1 또는 2에서, Wnt를 분리하는 단계가 크로마토그래피 분리를 포함하는 방법.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에서, 상기 방법이 Wnt를 과발현시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에서, 상기 방법이 sFRP를 과발현시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에서, Wnt 및 sFRP를 포함하는 복합체를 형성시키는 단계가 Wnt 발현 세포를 sFRP 발현 세포와 공동 배양하는 것을 포함하는 방법.
7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에서, Wnt 및 sFRP를 포함하는 복합체가 Wnt를 분리한 후에 형성되는 방법.
8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에서, Wnt를 분리하는 단계가 세제를 사용하는 것을 포함하는 방법.
9. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에서, Wnt 및 sFRP를 포함하는 복합체가 Wnt를 분리하기 전에 형성되는 방법.
10. 구현예 1 내지 7 또는 9 중 어느 하나에서, Wnt를 분리하는 단계가 세제를 사용하는 것을 포함하지 않는 방법.
11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에서, Wnt가 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 및 Wnt16 중 적어도 하나를 포함하는 방법.
12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에서, Wnt가 Wnt3a, Wnt5a, Wnt5b, Wnt8a 및 Wnt10a 중 적어도 하나를 포함하는 방법.
13. 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에서, sFRP가 sFRP1, sFRP2, sFRP3, sFRP4 및 sFRP5 중 적어도 하나를 포함하는 방법.
14. 구현예 1 내지 13 중 어느 하나에서, Wnt가 포유동물 Wnt를 포함하는 방법.
15. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에서, Wnt가 인간 Wnt 또는 마우스 Wnt를 포함하는 방법.
16. 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에서, sFRP가 포유동물 sFRP를 포함하는 방법.
17. 구현예 1 내지 16 중 어느 하나에서, sFRP가 인간 sFRP 또는 마우스 sFRP를 포함하는 방법.
18. 구현예 1 내지 17 중 어느 하나에서, sFRP가 태깅된 sFRP를 포함하는 방법.
19. 구현예 18에서, 태깅된 sFRP가 히스티딘-태깅된 sFRP를 포함하는 방법.
20. 구현예 18 또는 19에서, 태깅된 sFRP가 C-말단 태깅된 sFRP를 포함하는 방법.
21. 구현예 1 내지 20 중 어느 하나에서, Wnt가 태깅된 Wnt를 포함하는 방법.
22. 구현예 21에서, 태깅된 Wnt가 히스티딘 태깅된 Wnt를 포함하는 방법.
23. 구현예 21 또는 22에서, 태깅된 Wnt가 C-말단 태깅된 Wnt를 포함하는 방법.
24. 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에서, 복합체가 R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3, R-스폰딘 4, 리포칼린7 및 WIF1 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 방법.
25. 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에서, 상기 방법이 Wnt를 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
26. 구현예 1 내지 25 중 어느 하나에서, 상기 방법이 sFRP를 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
27. 제26항에 있어서, Wnt를 과발현하는 세포 및 sFRP를 과발현하는 세포가 공동 배양되는 방법.
28. 구현예 1 내지 27 중 어느 하나에서, 상기 방법이 Wnt 및 sFRP를 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
29. 구현예 25 내지 28 중 어느 하나에서, 상기 방법이 조건화 배지를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
30. 구현예 29에서, 상기 방법이 조건화 배지로부터 Wnt 및 sFRP를 포함하는 복합체를 분리하는 단계를 포함하는 방법.
31. 구현예 1 내지 30 중 어느 하나에서, 상기 방법이 Wnt 및 sFRP를 포함하는 복합체로부터 세제를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
32. 구현예 1 내지 31 중 어느 하나에서, 상기 방법이 복합체를 배지 첨가제로서 사용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
33. 구현예 1 내지 32 중 어느 하나에서, 상기 방법이 복합체를 줄기 세포 배양물 또는 오가노이드 배양물에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
본 발명은 하기 실시예에 의해 예시된다. 특정 예, 재료, 양 및 절차는 본원에 기재된 본 발명의 범위 및 사상에 따라 광범위하게 해석되어야 하는 것이 이해되어야 한다.
실시예
실시예 1
본 실시예는 세제의 사용을 제거하지만, 재조합 Wnt 단백질의 활성을 유지하는 Wnt 단백질을 정제하는 방법을 기재한다. 상기 방법은 Wnt에 결합하는 sFRP를 공동 발현시키는 것을 포함한다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, sFRP는 수성 환경으로부터 Wnt 단백질의 지질 변형을 보호하는 것으로 생각된다. 본원에 제시된 데이터는 또한 sFRP가 Wnt를 생성하는 세포의 조건화 배지에서 활성 Wnt와 복합체화되고, 이의 양을 향상시키는 데 사용될 수 있음을 입증한다.
방법
세포 배양 및 세포 형질감염
CHO, CHO mWnt-1, CHO msFRP-1, CHO mWnt-1/msFRP-1 및 CHO mWnt-1/msFRP-1-His를 포함하는 모든 세포주를 2 밀리몰(mM)의 L-글루타민-페니실린-스트렙토마이신(Sigma)뿐만 아니라 적절한 선택 항생제(퓨로마이신, G418 및/또는 하이그로마이신; 모두 ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)를 갖는 IMDM(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), 5% FBS(Corning, Corning, NY)에서 배양하였다. 세포를 제조업체(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)의 설명서에 따라 Lipofectamine 2000 시약을 사용하여 발현 플라스미드로 형질감염시켰다.
HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5 Wnt 리포터 검정 및 웨스턴 블롯을 위한 조건화 배지를 획득하기 위해, 5 x 104개의 세포를 12-웰 접시에 시딩하고, 4일 동안 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 조건화 배지(즉, 상층액)를 수집하고, 원심분리에 의해 세포 잔해를 제거하였다.
HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5 Wnt 리포터 검정
전장 인간 LRP5, 전장 인간 FZ4 및 분비된 알칼리성 포스파타제(SEAP) 업스트림의 9 x T-세포 인자 DNA 결합 부위(TCF9)를 발현하는 클론 HEK293 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하고, 37℃+ 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 18시간 동안 조건화 배지 또는 단백질로 처리하였다. 내인성 알칼리성 포스파타제의 열 비활성화 후, 각각의 웰로부터의 10 마이크로리터(μL)의 조건화 배지를 50 μL SEAP 리포터 검정 완충액/기질(0.1 M Tris-HCl, pH 9.0, 0.1 mM DiFMUP(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA))과 혼합하고, 15분 내지 30분 동안 실온에서 어두운 곳에서 인큐베이션하였다. SEAP 활성을 마이크로플레이트 판독기(Spectra Max Gemini EM, Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA)에서 350 나노미터(nm)의 여기, 450 nm의 방출 및 435 nm 컷오프로 측정하였다.
웨스턴 블롯 분석
조건화 배지 또는 재조합 단백질을 3분 동안 95℃에서 변성된 2x 환원 샘플 완충액(20 mM 디티오트레이톨, 6% SDS, 0.25몰(M) Tris, pH 6.8, 10% 글리세롤, 10 mM NaF 및 브로모페닐 블루)에서 용해시키고, 4-20% SDS-PAGE 젤에서 분해하였다. 젤을 PVDF 막(Millipore, Billerica, MA)으로 옮기고, 밤새 4℃에서 5% 무지방 분유를 함유하는 차단 완충액(25 mM Tris, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20)에서 일차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 광범위한 세척 후, 막을 1시간 동안 실온에서 차단 완충액 중에서 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 면역표지화는 SuperSignal West Pico 화학발광 기질(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)을 사용한 화학발광 반응에 의해 밝혀졌다. 웨스턴 블로팅에 사용된 항체는 다음과 같았다; Gt x mWnt-1, 1 μg/mL(카탈로그 번호 AF1620, Bio-Techne, Minneapolis, MN). Gt x hsFRP-1, 1 μg/mL(카탈로그 번호 AF1384, Bio-Techne, Minneapolis, MN). Dk x Gt IgG, HRP, 1:1000 희석(카탈로그 번호 HAF109, Bio-Techne, Minneapolis, MN).
mWnt1 및 msFRP1의 면역침전
5 x 104개의 CHO mWnt-1/msFRP1 세포를 12-웰 접시에 시딩하고, 4일 동안 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 조건화 배지를 수집하고, 세포 잔해를 원심분리에 의해 제거하였다. 500 μL의 조건화 배지를 먼저 4℃에서 2시간 내지 4시간 동안 면역침전 항체와 함께 인큐베이션한 후, 50 μL의 단백질 G-아가로스 비드(Pierce Protein Biology/ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)를 첨가하고, 2시간 동안 인큐베이션하였다. 결합된 면역 복합체를 회수하고, 둘베코 인산염 완충 염수(DPBS)에서 3회 세척하였다. 단백질을 SDS-PAGE로 분해하고, 웨스턴 블롯 분석을 위해 PVDF 막으로 옮겼다. 면역침전 및 웨스턴 블로팅에 사용된 항체는 다음과 같았다; Gt x mWnt-1, 1 μg/mL(카탈로그 번호 AF1620, Bio-Techne, Minneapolis, MN). Ms x His, 1 μg/mL(카탈로그 번호 MAB050R, Bio-Techne, Minneapolis, MN). Dk x Gt IgG, HRP, 1:1000 희석(카탈로그 번호 HAF109, Bio-Techne, Minneapolis, MN). Gt x Ms IgG, HRP(카탈로그 번호 HAF007, Bio-Techne, Minneapolis, MN).
CHO mWnt2b/msFRP1 조건화 배지의 면역침전
5 x 104개의 CHO mWnt2b/msFRP1 세포를 12-웰 접시에 시딩하고, 4일 동안 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 조건화 배지를 수집하고, 세포 잔해를 원심분리에 의해 제거하였다. 500 μL의 조건화 배지를 먼저 4℃에서 2시간 내지 4시간 동안 면역침전 항체와 함께 인큐베이션한 후, 50 μL의 단백질 G-아가로스 비드(Pierce Protein Biology/ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)를 첨가하고, 2시간 동안 인큐베이션하였다. 결합된 면역 복합체를 회수하고, DPBS 중에서 3회 세척하였다. 단백질을 SDS-PAGE로 분해하고, 웨스턴 블롯 분석을 위해 PVDF 막으로 옮겼다. 면역침전 및 웨스턴 블로팅에 사용된 항체는 다음과 같았다; Gt x mWnt2b, 1 μg/mL(카탈로그 번호 AF3900, Bio-Techne, Minneapolis, MN). Gt x hsFRP-1, 1 μg/mL(카탈로그 번호 AF1384 Bio-Techne, Minneapolis, MN). Dk x Gt IgG, HRP, 1:1000 희석(카탈로그 번호 HAF109, Bio-Techne, Minneapolis, MN).
Wnt 발현 세포와 msFRP 발현 세포의 공동 배양
5 x 104개의 Wnt 발현 세포를 12-웰 접시에 시딩하고, 3일 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 2 x 105개의 msFRP 발현 세포를 Wnt 발현 세포에 첨가하고, 1일 동안 공동 배양하였다. 조건화 배지를 수집하고, HEK293 Wnt 리포터 세포에 적용하였다.
sFRP-1 단백질을 이용한 CHO mWnt-1 세포 처리
12-웰 플레이트에 0.6 밀리리터(mL)의 배양 배지 중 4 x 105개의 CHO mWnt-1 세포를 시딩하였다. 세포를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 50 μg/mL에서 시작하여 1:2로 연속 희석하여 msFRP-1 단백질 처리를 첨가하였다. 24시간 후, 조건화 배지를 5분 동안 원심분리에 의해 수집하여 세포 잔해를 제거한 후 리포터 세포에 첨가하였다.
마우스 Wnt-1/마우스 sFRP 복합체의 정제
마우스 Wnt-1 및 마우스 sFRP1을 공동 발현한 CHO 세포로부터의 조건화 배지를 20 mM MOPS, 0.1 M NaCl, pH 6.8로 평형화된 SP 세파로스 고속 흐름 컬럼(SP sepharose Fast Flow column)(GE Healthcare, Chicago, IL)에 로딩하였다. 고염 완충액(20 mM MOPS, 1.6 M NaCl, pH 6.8)의 선형 구배를 적용하여 결합된 단백질을 용리시켰다. 마우스 sFRP1(약 37 kDa)의 용리를 모니터링하기 위해 은 염색과 함께 SDS-PAGE가 사용된 반면, 마우스 Wnt-1(약 40 kDa)의 용리를 모니터링하기 위해 항-마우스 Wnt-1으로 프로빙되는 웨스턴 블롯이 사용되었다. Wnt-1 및 sFRP1 둘 모두를 포함한 단백질 피크를 수집하였다. 농축 후, 푸울링된 피크를 Superdex-200 컬럼(GE Healthcare, Chicago, IL)에 로딩하여 유리 sFRP1으로부터 Wnt-1/sFRP1 복합체를 분리하고, 이전 단계에서와 같이 SDS-PAGE 은 염색 및 웨스턴 블롯에 의해 모니터링하였다.
Wnt3a/sFRP ELISA 결합 검정
96-웰 조직 배양 플레이트를 PBS 중 1% BSA로 차단하고, 용액 내 결합 플레이트로 사용하였다. 100ng/mL 재조합 마우스(rm) Wnt3a 비오티닐화 단백질 및 sFRP(1:3 연속 희석)를 함유하는 120 μL의 전체 부피를 결합 플레이트에서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이후, 100 μL의 결합 용액을 스트렙타비딘 코팅된 96-웰 ELISA 플레이트로 옮기고, 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후 HRP 검출하였다. 마우스 sFRP1을 염소 항-마우스 sFRP1 항체로 검출하였고, 마우스 sFRP2 및 마우스 sFRP3을 His 태깅하고, 마우스 항-His 항체로 검출하였고, 마우스 sFRP4를 양 항-마우스 sFRP4 항체로 검출하였고, HA-태깅된 마우스 sFRP5를 마우스 항-HA 펩티드로 검출하였다. 항-HRP 이차 항체를 사용하여 일차 항체를 검출한 후, 비색 판독을 수행하였다.
결과
마우스 sFRP1(msFRP1) 또는 마우스 sFRP1-His(msFRP1-His) 발현이 CHO 세포의 조건화 배지(CM)에서 마우스 Wnt1(mWnt1)의 양을 향상시킬지의 여부를 결정하기 위해, mWnt1, msFRP1, mWnt1 및 msFRP1, 및 mWnt1 및 msFRP1-His를 발현하는 안정한 클론 세포주를 제조하였다. 조건화 배지의 웨스턴 블롯 분석은 msFRP1 또는 msFRP1-His와 함께 mWnt1의 공동 발현이 CHO, CHO mWnt1 또는 CHO msFRP1 조건화 배지에 비해 조건화 배지에서 mWnt1의 유의하게 더 높은 수준을 발생시킨 것을 입증하였다(도 1a). msFRP1을 과발현하는 CHO 세포는 또한 CHO 또는 CHO mWnt1 조건화 배지에서의 msFRP1 수준에 비해 더 높은 수준의 msFRP1을 명확하게 나타내었다(도 1a).
도 1a의 웨스턴 블롯 분석에 사용된 동일한 조건화 배지를 또한 인간 Frizzled4(hFz4) 및 인간 LRP5(hLRP5)를 발현하는 HEK293 Wnt 리포터 세포주에서 시험하였다(본원에서 HEK293 hFz4/hLRP5 Wnt 리포터 검정을 수행하는 것으로도 언급됨). CHO 세포로부터의 조건화 배지는 mWnt1이 msFRP1 또는 msFRP1-His와 공동 발현된 경우에만 Wnt 리포터 활성화를 발생시켰다(도 1b). 야생형 CHO, CHO mWnt1 및 CHO msFRP1 조건화 배지는 백그라운드 이상의 수준에서 Wnt 리포터를 활성화시키지 않았다. 이들 데이터는 mWnt1 및 msFRP1 또는 msFRP1-His 둘 모두를 발현하는 세포의 조건화 배지에서 활성 mWnt1의 더 높은 수준을 발생시키는 msFRP1 또는 msFRP1-His 과발현과 일치한다(도 1).
복합체에서 Wnt 및 sFRP가 서로 결합할 수 있는지 시험하기 위해, mWnt1 및 msFRP1의 상호작용을 시험하였다. 면역침전 실험은 mWnt1 및 msFRP1-His가 복합체로 결합되어 있음을 입증하였다(도 2). 항-Wnt1 항체를 이용한 면역침전 및 항-His 항체를 이용한 블로팅은 msFRP1-His의 예상 크기인 37 kDa의 밴드의 검출을 발생시켰다(도 2, 레인 2). 항-His 항체를 이용한 면역침전 및 항-Wnt1 항체를 이용한 블로팅은 mWnt1의 예상 크기인 42 kDa의 밴드의 검출을 발생시켰다(도 2, 레인 5). 이들 데이터는 mWnt1 및 msFRP1이 mWnt1 및 msFRP1 둘 모두를 발현하는 CHO 세포의 조건화 배지에서 복합체로 서로 결합됨을 시사한다.
마우스 sFRP1(msFRP1)이 마우스 Wnt2b(mWnt2b) 및 msFRP1 둘 모두를 발현하는 CHO 조건화 배지에서 mWnt2b에 결합하는지 시험하였다. 면역침전 실험은 mWnt2b 단독 또는 mWnt2b 및 msFRP1을 과발현하는 동일한 양의 CHO 세포 조건화 배지에 항-Wnt2b, 항-hsFRP1 또는 항체가 없는 대조군을 첨가함으로써 수행되었다(클론 18). 도 2b는 항-mWnt2b 항체를 이용한 면역침전 후, 항-hsFRP1 항체를 이용한 블로팅이 약 35 kDa에서 sFRP1 단백질의 검출을 발생시킨 것을 제시하며(도 2b의 화살표), 이는 mWnt2b 및 msFRP1이 mWnt2b 및 msFRP1 둘 모두를 발현하는 CHO 세포의 조건화 배지에서 물리적으로 상호작용함을 입증한다. 이러한 35 kDa 밴드는 면역침전이 항-mWnt2b로 수행되고, 항-hsFRP1로 블로팅되는 경우 mWnt1만을 발현하는 CHO 세포의 조건화 배지에서 검출되지 않았다.
추가의 면역침전 실험은 msFRP1이 mWnt2b 및 msFRP1 둘 모두를 발현하는 CHO 조건화 배지에서 mWnt2b에 결합하는 것을 입증한다. 면역침전 실험은 mWnt2b 단독 또는 mWnt2b 및 msFRP1을 과발현하는 동일한 양의 CHO 세포 조건화 배지에 항-Wnt2b, 항-hsFRP1 또는 항체가 없는 대조군을 첨가함으로써 수행되었다(클론 18). 도 2c는 항-hsFRP1 항체를 이용한 면역침전 후, 항-mWnt2b 항체를 이용한 블로팅이 약 42 kDa에서 mWnt2b 단백질의 검출을 발생시킨 것을 제시하며(도 2c의 화살표), 이는 mWnt2b 및 msFRP1이 mWnt2b 및 msFRP1 둘 모두를 발현하는 CHO 세포의 조건화 배지에서 물리적으로 상호작용함을 입증한다. 이러한 42 kDa mWnt1 밴드는 면역침전이 항-hsFRP1으로 수행되고, 항-mWnt1으로 블로팅된 경우 mWnt1만 발현하는 CHO 세포의 조건화 배지에서 검출되지 않았다.
mWnt1 및 msFRP1 둘 모두를 발현하는 세포의 조건화 배지에서 활성 mWnt1의 수준 증가가 관찰된 이유를 이해하기 위해 추가 실험을 설계하였다. mWnt1만을 발현하는 CHO 세포가 HEK293 hFz4/hLRP5 Wnt 리포터 세포(본원에서 HEK293 Wnt 리포터 세포로도 언급됨)와 공동 배양되는 경우, Wnt 리포터 활성의 강한 활성화가 검출되며, 이는 mWnt1을 발현하는 CHO 세포가 활성 mWnt1 단백질을 제조하는 것을 입증한다(표 1, 3행). CHO mWnt1 세포로부터의 조건화 배지가 HEK293 Wnt 리포터 세포에 첨가되는 경우, Wnt 리포터 활성화가 검출되지 않는다(표 1, 4행). 이들 데이터는 활성 mWnt1 단백질이 조건화 배지에 있지 않고, 오히려 CHO mWnt1 세포의 세포 표면에 위치하는 것을 시사한다. msFRP1 또는 msFRP5 단독을 발현하는 CHO 세포가 HEK293 Wnt 리포터 세포와 공동 배양되는 경우, 활성이 검출되지 않았다(표 1, 5행). 또한, msFRP1 또는 msFRP5를 발현하는 CHO 세포로부터의 조건화 배지가 HEK293 Wnt 리포터 세포에 첨가된 경우, 활성이 검출되지 않았으며(표 1, 6행), 이는 sFRP1 또는 sFRP5가 mWnt1의 공동 발현 없이 Wnt 신호전달을 향상시킬 수 없음을 시사한다. CHO mWnt1의 조건화 배지 및 CHO msFRP1 또는 msFRP5의 조건화 배지가 HEK293 Wnt 리포터에 첨가되기 전에 함께 조합되는 경우, 활성이 검출되지 않았다(표 1, 7행). CHO mWnt1 세포의 조건화 배지를 CHO msFRP1 또는 msFRP5 발현 세포에 첨가하고, HEK293 Wnt 리포터 세포에 조건화 배지를 첨가하기 전에 밤새 배양한 경우, 활성이 검출되지 않았다(표 1, 8행). CHO msFRP1 또는 msFRP5 조건화 배지를 밤새 CHO mWnt1 발현 세포에 첨가한 후 이러한 조건화 배지를 HEK293 Wnt 리포터 세포에 첨가하는 경우, 리포터 활성이 검출되었다(표 1, 9행). 재조합 hsFRP1 또는 hsFRP5 단백질을 밤새 CHO mWnt1 발현 세포에 첨가한 후 이러한 조건화 배지를 HEK293 Wnt 리포터 세포에 첨가하는 경우, Wnt 리포터의 활성화가 관찰되었다(표 1, 11행). 최종적으로, mWnt1 및 msFRP1 또는 msFRP5 둘 모두가 동일한 CHO 세포에서 공동 발현된 경우, 조건화 배지는 HEK293 Wnt 리포터를 활성화시켰다(표 1, 10행).
표 1.
sFRP는 Wnt 활성의 양성 및 음성 조절제 둘 모두로서 작용하는 것으로 관찰되었다. 초기에, 몇몇 간행물은 Wnt 활성의 sFRP 억제를 입증하였으나(Leyns et al. Cell 88:747-756 (1997); Wang et al. Cell 88:757-766 (1997)), 이후의 연구는 sFRP가 sFRP의 생리학적 용량에서 Wnt 신호전달을 강화할 수 있음을 제시하였다(Mii et al. Development 136:4083-4088 (2009); Holly et al. Dev. Biol. 388:192-204 (2014)). 이러한 sFRP의 2상 활성을 시험하기 위해, 일련의 용량의 재조합 sFRP1 단백질을 24시간 동안 CHO mWnt1 발현 세포에 첨가한 후, 이러한 조건화 배지를 제거하여 HEK293 Wnt 리포터 세포를 처리하였다. mWnt1 활성의 향상을 발생시키는 비교적 더 적은 용량의 sFRP 및 기준선 수준으로 Wnt 신호전달을 다시 복귀시키는 더 높은 농도의 sFRP1으로 종형 곡선이 관찰되었다(도 3).
CHO mWnt1/msFRP1 발현 세포를 사용하여 mWnt1/msFRP1 단백질 복합체를 정제하였다. CHO mWnt1/msFRP1 발현 세포를 5% FBS 함유 배지에서 2% FBS 함유 배지로 전이시켜 현탁액에서 성장시킬 수 있었다. 배양 9일 후, CHO mWnt1/msFRP1 조건화 배지를 분리하고, mWnt1/msFRP1 복합체를 이온 교환 크로마토그래피(도 4 a-c) 후 젤 여과 크로마토그래피(도 4 d-e)로 정제하였다. sFRP1은 양이온 교환기 SP 세파로스 컬럼에 단단히 결합하고, 단백질을 용리시키기 위해 1 몰(M) 초과의 MaCl 농도가 필요한 반면, Wnt-1은 일반적으로 0.3 M 미만의 NaCl 농도로 용리된다. sFRP 및 Wnt1이 복합체를 형성하지 않는 경우, sFRP1 및 Wnt-1은 상이한 피크에서 용리되어야 한다. 그러나, 항-Wnt-1 항체로 프로빙된 웨스턴 블롯(도 4b)은 Wnt-1이 SP 세파로스 컬럼(도 4a)으로부터의 이후 피크에서 sFRP1(도 4c)과 공동 용리된 것을 나타내었고, 이는 sFRP1과 Wnt-1 사이의 복합체 형성을 시사한다. sFRP1은 은 염색으로 검출되었지만, Wnt-1은 거의 보이지 않았으며, 이는 많은 양의 유리 sFRP1이 존재함을 나타낸다. sFPR1/Wnt-1 복합체와 유리 sFRP 사이의 크기 차이로 인해, 젤 여과 크로마토그래피는 이들 2개의 상이한 집단을 성공적으로 분리하였다. sFRP1/Wnt-1 복합체는 초기 피크에서 용리된 반면, 유리 sFRP1은 후기 피크에서 용리되었다(도 4d). sFRP1 및 Wnt-1 둘 모두는 SDS-PAGE에서 쿠마시 블루 염색과 함께 복합체(초기) 피크에서 검출되었다(도 4e). 정제된 sFRP1/Wnt-1 복합체를 SDS-PAGE에 로딩하고, 쿠마시 블루로 염색하였다. 밀도측정 분석에 기초하여 대략 1:1 몰비로 37 kDa 및 52 kDa에서 2개의 밴드가 관찰되었다(도 4f). 웨스턴 블로팅에 의한 단백질 복합체의 특성규명은 정제된 복합체 샘플에서 mWnt1 및 msFRP1 둘 모두를 검출하였다(도 5). 정제된 복합체의 N-말단 시퀀싱은 임의의 다른 단백질 서열이 검출됨이 없이 마우스 Wnt-1 및 마우스 sFRP-1 서열 둘 모두를 확인하였다. 조건화 배지에서의 mWnt1 및 msFRP1의 결합은 mWnt1 및 msFRP1이 정제되는 경우 복합체에 회합될 가능성이 있음을 시사한다.
재조합 mWnt1/msFRP1 정제 단백질을 HEK293 Wnt 리포터 검정에서 활성에 대해 시험하였다. 재조합 msFRP1 단백질에 의한 HEK293 Wnt 리포터 세포의 처리는 미처리된 백그라운드 수준 이상의 Wnt 리포터의 활성화를 발생시키지 않았다(도 6b). mWnt1/msFRP1 단백질 복합체에 의한 HEK293 Wnt 리포터 세포의 처리는 Wnt 리포터의 강력한 활성화를 발생시켰다(도 6a, 도 6b). 추가 정제 단계가 mWnt1/msFRP1 정제 절차에 추가됨에 따라(도 4), CHAPS 완충액 중의 현재 이용 가능한 가장 강력한 정제된 Wnt(Wnt3a)에 비해 훨씬 더 강력한 mWnt1/msFRP1 복합체가 획득되었다(도 6d).
이들 데이터는 sFRP가 mWnt1을 제조하는 CHO 세포와 상호작용하는 경우 sFRP가 조건화 배지에서 활성 mWnt1 단백질의 양을 증가시킬 수 있음을 입증한다. Wnt의 sFRP 유도 유리가 mWnt1에 특이적인지 또는 sFRP가 다른 Wnt 패밀리 구성원과 유사한 방식으로 작동할 수 있는지의 여부를 해결하기 위해, mWnt1, mWnt2b 및 인간 Wnt6(hWnt6)으로 추가 sFRP 공동 배양 실험을 수행하였다.
msFRP1을 발현하는 CHO 세포를 mWnt2b를 발현하는 CHO 세포와 공동 배양하고, 생성된 조건화 배지를 HEK293 Wnt 리포터 세포에 첨가한 경우, Wnt 리포터의 활성화가 검출되었다(도 7b). 흥미롭게도, CHO mWnt2b 세포와 CHO msFRP5의 공동 배양은 CHO mWnt1 및 CHO msFRP5 세포의 공동 배양으로부터의 조건화 배지(도 7a)와 유사하게 조건화 배지에서의 Wnt 활성을 발생시키지 않았다(도 7b). CHO msFRP1 및 msFRP5와 공동 배양된 hWnt6을 발현하는 HEK293으로부터의 조건화 배지는 CHO sFRP1 및 sFRP5를 사용한 CHO mWnt1 공동 배양 실험(도 7a)에서 관찰된 것과 유사하게 HEK293 Wnt 리포터 세포를 활성화시켰다(도 7c). 이들 데이터는 sFRP가 mWnt1 발현 세포의 세포 표면으로부터 mWnt1의 유리를 향상시킬 수 있을뿐만 아니라 sFRP가 mWnt2b 또는 hWnt6를 발현하는 세포의 세포 표면으로부터 mWnt2b 및 hWnt6를 유리시킬 수 있음을 입증한다. 이들 데이터는 또한 sFRP가 활성 Wnt/sFRP 복합체의 정제를 촉진하기 위해 세포막에 결합된 전부는 아니지만 많은 Wnt 단백질을 유리시키는 데 사용될 수 있음을 시사한다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물, 및 전자적으로 이용가능한 자료(예를 들어, GenBank 및 RefSeq에서의 뉴클레오티드 서열 제출, 및 예를 들어, SwissProt, PIR, PRF, PDB에서의 아미노산 서열 제출, 및 GenBank 및 RefSeq에서의 주석이 달린 코딩 영역으로부터의 번역을 예를 들어 포함함)의 전체 개시는 참조로서 포함된다. 본 출원의 개시와 참조로서 본원에 포함되는 임의의 문헌의 개시(들) 사이에 임의의 불일치가 존재하는 경우, 본 출원의 개시가 우선할 것이다. 상기 상세한 설명 및 실시예는 단지 이해의 명확성을 위해 제공되었다. 이로부터의 불필요한 제한이 해석되어선 안 된다. 본 발명은 제시되거나 기재된 정확한 상세한 설명으로 제한되지 않으며, 당업자에게 명백한 변형이 청구항에 의해 정의된 본 발명의 범위 내에 포함될 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> BIO-TECHNE CORPORATION
<120> WNT/SFRP COMPLEXES, WNT-CONTAINING COMPOSITIONS, WNT-EXPRESSING
CELLS, AND METHODS OF MAKING, PURIFYING, AND USING SAME
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3995 4000
Claims (26)
- Wnt 및 sFRP를 포함하는 분리된 단백질 복합체.
- 제1항에 있어서, Wnt가 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 및 Wnt16 중 하나 이상을 포함하는 분리된 단백질 복합체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, sFRP가 sFRP1, sFRP2, sFRP3, sFRP4 및 sFRP5 중 하나 이상을 포함하는 분리된 단백질 복합체.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Wnt가 활성 Wnt를 포함하는 분리된 단백질 복합체.
- 제4항에 있어서, 활성 Wnt가 분비된 알칼리성 포스파타제(SEAP) 리포터 검정을 이용하여 측정된 바와 같은 Wnt 리포터 활성을 갖는 Wnt를 포함하는 분리된 단백질 복합체.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 복합체가 세제를 실질적으로 비함유하는 분리된 단백질 복합체.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, Wnt가 마우스 Wnt를 포함하고, sFRP가 마우스 sFRP를 포함하는 분리된 단백질 복합체.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Wnt가 마우스 Wnt1을 포함하고, sFRP가 마우스 sFRP1을 포함하는 분리된 단백질 복합체.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 복합체가 HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5 Wnt 리포터 검정을 이용하여 측정된 바와 같은 500 ng/mL 미만의 50 퍼센트 유효 용량(ED50)을 나타내는 분리된 단백질 복합체.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 복합체가 HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5 Wnt 리포터 검정을 이용하여 측정된 바와 같은 100 ng/mL 미만의 50 퍼센트 유효 용량(ED50)을 나타내는 분리된 단백질 복합체.
- Wnt를 포함하는 조성물로서, 세제를 실질적으로 비함유하는, 조성물.
- 제11항에 있어서, Wnt가 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 및 Wnt16 중 하나 이상을 포함하는 조성물.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, Wnt가 활성 Wnt를 포함하는 조성물.
- 제13항에 있어서, 활성 Wnt가 분비된 알칼리성 포스파타제(SEAP) 리포터 검정을 이용하여 측정된 바와 같은 Wnt 리포터 활성을 갖는 Wnt를 포함하는 조성물.
- 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 sFRP를 추가로 포함하는 조성물.
- 제15항에 있어서, sFRP가 sFRP1, sFRP2, sFRP3, sFRP4 및 sFRP5 중 하나 이상을 포함하는 조성물.
- 제15항 또는 제16항에 있어서, Wnt가 마우스 Wnt를 포함하고, sFRP가 마우스 sFRP를 포함하는 조성물.
- 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, Wnt가 마우스 Wnt1을 포함하고, sFRP가 마우스 sFRP1을 포함하는 조성물.
- 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, Wnt가 HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5 Wnt 리포터 검정을 이용하여 측정된 바와 같은 100 ng/mL 미만의 50 퍼센트 유효 용량(ED50)을 나타내는 조성물.
- 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3, R-스폰딘 4, 리포칼린7 또는 WIF1 중 하나 이상을 추가로 포함하는 조성물.
- Wnt 및 sFRP를 과발현시키는 단계;
Wnt 및 sFRP를 포함하는 복합체를 형성시키는 단계; 및
Wnt를 분리하는 단계로서, Wnt 분리가 수성 정제 절차를 포함하는, 단계를 포함하는,
방법. - 제21항에 있어서, Wnt 및 sFRP를 포함하는 복합체가 Wnt를 분리하기 전에 형성되는 방법.
- 제21항 또는 제22항에 있어서, Wnt 분리가 세제를 사용하는 것을 포함하지 않는 방법.
- 제21항 또는 제22항에 있어서, Wnt 분리가 Wnt 및 sFRP를 포함하는 복합체로부터 세제를 제거하는 것을 포함하는 방법.
- 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, Wnt가 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 및 Wnt16 중 하나 이상을 포함하는 방법.
- 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, sFRP가 sFRP1, sFRP2, sFRP3, sFRP4 및 sFRP5 중 하나 이상을 포함하는 방법.
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