CN111511382A - Wnt/sfrp复合物,含wnt的组合物,表达wnt的细胞及其制备、纯化和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本公开内容描述了包括Wnt和sFRP的分离的蛋白质复合物;包括Wnt的组合物;过表达Wnt和sFRP的细胞;包括过表达Wnt的细胞和过表达sFRP的细胞的组合物;制备蛋白质复合物、组合物和细胞的方法;以及使用分离的蛋白质复合物、组合物和细胞的方法。本公开内容进一步描述了形成包括Wnt和sFRP的复合物的方法,以及用于分离Wnt的方法。本文还描述的是可以用于纯化Wnt而无需使用去污剂的方法。
Description
继续申请数据
本申请要求于2017年10月9日提交的美国临时申请序列号62/569,748的权益,所述美国临时申请引入本文作为参考。
序列表
本申请含有作为名称为“541-00060201_ST25.txt”的ASCII文本文件、经由EFS-Web电子提交给美国专利及商标局(United States Patent and Trademark Office)的序列表,所述ASCII文本文件具有84千字节的大小且于2018年10月9日创建。由于序列表的电子提交,电子提交的序列表充当由37 CFR §1.821(c)要求的纸质副本、以及由§1.821(e)要求的CRF两者。序列表中包含的信息引入本文作为参考。
发明概述
本公开内容描述了分离的蛋白质复合物,其包括无翅/整合-1蛋白(Wingless/Integrated-1 protein)(Wnt)和分泌型卷曲相关蛋白(secreted Frizzled-relatedprotein)(sFRP);包括Wnt的组合物,其中所述组合物基本上不含去污剂;过表达Wnt和sFRP的细胞;包括过表达Wnt的细胞和过表达sFRP的细胞的组合物;制备蛋白质复合物、组合物和细胞的方法;以及使用蛋白质复合物、组合物和细胞的方法。在一些实施方案中,Wnt优选地包括活性Wnt。在一些实施方案中,该组合物可以用作培养基添加剂,并且可以提供相对于包括去污剂的组合物的优点。
在一个方面,本公开内容描述了包括Wnt和sFRP的分离的蛋白质复合物。
在另一个方面,本公开内容描述了包括Wnt的组合物,其中所述组合物基本上不含去污剂。
在一个进一步方面,本公开内容描述了过表达Wnt和sFRP的细胞。
在一个另外的方面,本公开内容描述了包括过表达Wnt的细胞和过表达sFRP的细胞的组合物。
在另外一个方面,本公开内容描述了包括形成包括Wnt和sFRP的复合物,并且分离Wnt的方法。
词语“优选的”和“优选地”指在某些情况下,可以提供某些益处的本发明的实施方案。然而,在相同或其它情况下,其它实施方案也可以是优选的。此外,一个或多个优选实施方案的叙述并非暗示其它实施方案是无用的,并且不预期从本发明的范围中排除其它实施方案。
术语“包含”及其变化在说明书和权利要求中出现这些术语时不具有限制意义。“由……组成”意欲包括且限于在短语“由……组成”之后的任何内容。因此,短语“由……组成”指示所列出的要素是必需的或强制性的,并且可以不存在其它要素。“基本上由……组成”意欲包括在短语之后列出的任何要素,并且限于不干扰或促成本公开内容中对于所列出的要素指定的活性或动作的其它要素。因此,短语“基本上由……组成”指示所列出的要素是必需的或强制性的,但其它要素是任选的并且可以存在或不存在,取决于它们是否实质上影响所列出的要素的活性或作用。
除非另有说明,否则“一个”、“一种”、“该/所述”和“至少一个/种”是可互换使用的,并且意指一个/种或多于一个/种。
另外在本文中,通过端点的数目范围的叙述包括在该范围内所包含的所有数目(例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
对于本文公开的包括不连续步骤的任何方法,该步骤可以以任何可行的次序进行。并且,适当时,可以同时进行两个或更多个步骤的任何组合。
本发明的上文概述并不预期描述本发明的每个公开的实施方案或每一个实施方式。下述描述更特别地例证了示例性实施方案。在申请自始至终的几个地方,通过实例的列表提供了指导,所述实例可以以各种组合使用。在每种情况下,所叙述的列表仅充当代表组,并且不应该被解释为排他性列表。
本说明书自始至终对“一个实施方案(one embodiment)”、“一个实施方案(anembodiment)”、“某些实施方案”或“一些实施方案”等的提及,意指与实施方案结合描述的特定特点、配置、组合物或特征包括在本公开内容的至少一个实施方案中。因此,此类短语在本说明书自始至终的各个地方的出现不一定指本公开内容的相同实施方案。此外,在一个或多个实施方案中,可以以任何合适的方式组合特定特点、配置、组合物或特征。
除非另有说明,否则在说明书和权利要求使用的表示组分数量、分子量等等的所有数目都应理解为在所有情况下通过术语“约”进行修饰。相应地,除非另有相反说明,否则说明书和权利要求中阐述的数目参数是近似值,其可以根据通过本发明寻求获得的所需特性而变。至少,并且并非试图将等同原则限制于权利要求的范围,每个数目参数应该至少按照所报告的有效数字的数目,并通过应用普通的舍入技术加以解释。
尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值,但在具体实例中阐述的数值被尽可能精确地报告。然而,所有数值固有地含有必然起因于其各自的测试测量中发现的标准差的范围。
所有标题都是为了读者的方便,并且除非另有说明,否则不应该用于限制标题之后的文字的含义。
附图简述
图1(A-B)显示了小鼠sFRP1(msFRP1)和小鼠Wnt1(mWnt1)在CHO细胞中的共表达,导致上清液(在本文中也称为条件培养基)中的较高水平的活性mWnt1蛋白。图1A. 等量的条件培养基(CM)的蛋白质印迹显示,与CHO对照细胞CM(泳道1)、CHO mWnt1 CM(泳道3)和CHOmsFRP1(泳道4)中的mWnt1水平相比,表达mWnt1/msFRP1-His(泳道2)和mWnt1/msFRP1(泳道5)的CHO细胞中的增强水平的mWnt1。msFRP1蛋白质印迹显示与CHO CM(泳道1)和CHO mWnt1CM(泳道3)相比,CHO mWnt1/msFRP1-His CM(泳道2)、CHO msFRP1 CM(泳道4)和CHO mWnt1/msFRP1 CM(泳道5)中增强的msFRP1表达。图1B. 将来自CHO细胞(蓝色圆圈)、CHO mWnt1(红色正方形)、CHO mWnt1/msFRP1(绿色三角形)、CHO mWnt1/msFRP1-His(橙色菱形)和CHOmsFRP1(红色圆圈)的条件培养基加入HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5 Wnt Reporter细胞中,从最高浓度的培养基开始,并且1:2稀释。仅当CHO细胞一起表达mWnt1和msFRP1或msFRP1-His时,才在条件培养基中检测到Wnt1活性。在该HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5Wnt Reporter测定中,来自CHO-s mWnt1/msFRP1细胞(绿色三角形)的条件培养基导致22倍的诱导,而CHO mWnt1/msFRP-His(橙色菱形)导致高于背景17倍的诱导。来自其它CHO系的条件培养基在HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5 Wnt Reporter细胞系中未诱导活性。
图2A显示了在表达mWnt1和msFRP1-His两者的CHO条件培养基中,msFRP1-His与mWnt1结合。通过将抗Wnt1抗体(泳道2、泳道4),抗His抗体(泳道3、泳道5)、或无抗体对照(泳道1、泳道6)加入等量的过表达mWnt1和msFRP1-His两者的CHO细胞条件培养基中,来执行免疫沉淀实验。抗体/条件培养基混合物与G蛋白琼脂糖珠复合,并且执行免疫沉淀实验。当未向CHO mWnt1/msFRP/His表达条件培养基中添加抗体时,在蛋白质印迹中未检测到msFRP1和mWnt1(分别为泳道1和6)。当抗mWnt1抗体用于免疫沉淀时,当用抗His抗体(泳道2)印迹时,在约37千道尔顿(kDa)处检测到加上His标签的msFRP1/His蛋白。当抗His抗体用于免疫沉淀时,抗mWnt1抗体检测到在约42 kDa处的mWnt1条带(泳道5)。在泳道3中的50kDa和25 kDa处的条带是被抗His抗体识别的重链和轻链IgG。图2B显示了在表达mWnt2b和msFRP1两者的CHO条件培养基中,msFRP1与mWnt2b结合。通过将抗小鼠Wnt2b、抗人sFRP1、或无抗体对照加入等量的过表达单独的mWnt2b或mWnt2b和msFRP1(克隆18)的CHO细胞条件培养基中,来执行免疫沉淀实验。用抗mWnt2b抗体的免疫沉淀,随后为用抗hsFRP1抗体的印迹,导致在约35 kDa处(通过黑色箭头指示)的sFRP1蛋白的检测,证实mWnt2b和msFRP1在表达mWnt2b和msFRP1两者的CHO细胞的条件培养基中物理相互作用。当用抗mWnt2b执行免疫沉淀并用抗hsFRP1印迹时,在仅表达mWnt1的CHO细胞的条件培养基中未检测到该35 kDa条带。图2C显示了在表达mWnt2b和msFRP1两者的CHO条件培养基中,msFRP1与mWnt2b结合。通过将抗Wnt2b、抗hsFRP1、或无抗体对照加入等量的过表达单独的mWnt2b或mWnt2b和msFRP1(克隆18)的CHO细胞条件培养基中,来执行免疫沉淀实验。用抗hsFRP1抗体的免疫沉淀,随后为用抗mWnt2b抗体的印迹,导致在约42 kDa处(通过黑色箭头指示)的mWnt2b蛋白的检测,证实mWnt2b和msFRP1在表达mWnt2b和msFRP1两者的CHO细胞的条件培养基中物理相互作用。当用抗hsFRP1执行免疫沉淀并用抗mWnt1印迹时,在仅表达mWnt1的CHO细胞的条件培养基中未检测到该42 kDa mWnt1条带。
图3显示了小鼠sFRP1(msFRP1)既增强又抑制小鼠Wnt1(mWnt1)活性。在将条件培养基加入HEK293 hFz4/hLRP5 Wnt报道细胞中之前,将重组msFRP1蛋白加入CHO mWnt1表达细胞中24小时。在添加6.25微克/毫升(µg/mL)的蛋白质时,sFRP1蛋白显示了mWnt1活性的最大增强,其中25 µg/mL和50 µg/mL的剂量导致mWnt1活性下降至基线水平的减少。
图4(A-F)显示了在阳离子交换剂SP Sepharose柱上,与sFRP1共洗脱的Wnt-1(图4(A-C)),以及在凝胶过滤柱上,sFRP1/Wnt-1复合物与游离sFRP1的分开(图4(D-E))。图4A.将来自共表达msFRP1和mWnt-1的CHO细胞的条件培养基加载到SP Sepharose柱上,并且用线性梯度的高盐缓冲液洗脱结合的蛋白质。独特的后洗脱峰是sFRP通常洗脱的位置。图4B.将从SP洗脱收集的级分加载到15百分比(%)SDS-PAGE上,并且用银染色。37 kDa条带代表sFRP1。图4C. 使图4B的相同级分进行用针对mWnt-1的抗体探测的蛋白质印迹。mWnt-1被检测为~52 kDa条带,其存在于其中检测到sFRP1的相同级分中。图4D. 加载来自SPSepharose柱的库,并且从凝胶过滤(Superdex 200)柱中洗脱。较早洗脱的峰含有sFRP1/Wnt-1复合物,而较晚洗脱的峰含有游离sFRP。图4E. 将从凝胶过滤洗脱中收集的级分加载到15% SDS-PAGE凝胶上,并且用考马斯蓝染色。较低的条带(37 kDa)代表sFRP1,而较高的条带(52 kDa)代表Wnt-1。图4F. 将从凝胶过滤柱中纯化的sFRP1/Wnt-1复合物加载到15%SDS-PAGE凝胶上,并且用考马斯蓝染色。观察到在37 kDa和52 kDa处的两个条带,具有大致1:1的摩尔比。
图5显示了当纯化的重组mWnt1/msFRP1复合物在SDS-PAGE凝胶上运行时,通过蛋白质印迹检测到mWnt1和msFRP1蛋白两者。0.001纳克/毫升(ng/mL)的mWnt1/msFRP1(泳道1)、0.01 ng/mL的mWnt1/msFRP1(泳道2)、0.1 ng/mL的mWnt1/msFRP1(泳道3)、1 ng/mL的mWnt1/msFRP1(泳道4)、10 ng/mL的mWnt1/msFRP1(泳道5)、100 ng/mL的mWnt1/msFRP1(泳道6)、500 ng/mL的mWnt1/msFRP1(泳道7)、以及1微克/毫升(µg/mL)的mWnt1/msFRP1(泳道8)在还原条件下在4-20%的丙烯酰胺凝胶上运行,然后转移到PVDF膜。用山羊抗Wnt-1抗体(1 µg/mL)和山羊抗msFRP1抗体(1 µg/mL)执行蛋白质印迹。二抗(驴抗山羊HRP抗体)以1 µg/mL用于检测。
图6(A-D)显示了在表达hFz4和hLRP5两者的HEK293 Wnt报道细胞中,纯化的重组mWnt1/msFRP1蛋白质复合物激活Wnt信号传导途径。图6A,mWnt1/msFRP1蛋白质复合物在表达hFz4/Hlrp5的HEK293 Wnt报道细胞中进行测试,并且显示与重组小鼠Wnt10B蛋白相比是更活跃的。图6B. 用重组小鼠sFRP1蛋白(蓝色正方形)、或重组小鼠Wnt1/sFRP1(mWnt1/msFRP1)蛋白质复合物(红色圆圈),处理表达人Fz4和人LRP5的HEK293 Wnt Reporter细胞。mWnt1/msFRP1复合物以剂量响应方式证实HEK293 Wnt报道细胞的明确诱导,而单独的msFRP1蛋白并未证实活性。图6C. 重组mWnt1/msFRP1蛋白质复合物纯化是可重现的,其中多个批次显示相似的生物活性。纯化了两种不同的mWnt1/msFRP1复合物,并且在HEK293hFz4/hLRP5 Wnt报道分子测定中针对彼此进行比较,并且显示两者均显示相似的活性。在110 ng/mL的复合物下检测到Wnt报道分子活性的最大增强;这些mWnt1/msFRP1复合物的活性产生钟形曲线,其中小于110 ng/mL或大于110 ng/mL的剂量显示较低的活性。图6D. 与纯化并贮存于CHAPS缓冲液中的最活跃的Wnt(重组小鼠Wnt3a)相比,如图4中所述纯化的小鼠Wnt1/sFRP1复合物是高度有力的,并且在HEK293 Wnt报道分子测定中证实更好的效力。对于mWnt1/msFRP1观察到的50百分比有效剂量(ED50)为1.8 ng/mL,而对于重组小鼠Wnt3a观察到的ED50为12.2 ng/mL。
图7(A-C)显示了sFRP以细胞非自主方式增强示例性Wnt(Wnt1、Wnt2b和Wnt6)活性。图7A. 将来自表达msFRP1、msFRP3、msFRP4和msFRP5的细胞的条件培养基加入HEK293Wnt报道细胞中,并且不诱导高于单独的HEK293 Wnt报道分子活性的Wnt报道分子活性。当表达mWnt1的细胞连同表达msFRP1和msFRP5的细胞一起培养24小时时,当加入HEK293 Wnt报道细胞中时,这种共培养的条件培养基诱导Wnt途径活性。图7B. 相似的实验显示,来自表达小鼠Wnt2b连同msFRP1的细胞的共培养物的条件培养基也导致Wnt途径激活。图7C. 来自与表达msFRP1或msFRP5的细胞共培养的表达人Wnt6的细胞的条件培养基也导致Wnt报道分子活性的显著增加。
图8显示了分泌型Wnt蛋白(例如Wnt3a)结合sFRP同源物,指示如同栓系型Wnt(例如Wnt1、Wnt2b和Wnt6),分泌型Wnt蛋白也可能与sFRP蛋白一起过表达,并且无需(3-((3-胆酰胺丙基)二甲氨基)-1-丙磺酸)(CHAPS),以活性状态纯化。在用生物素化的小鼠Wnt3a蛋白的ELISA结合测定中,测试了纯化的重组小鼠sFRP蛋白。(由于不同的标签用于不同的sFRP蛋白,因此使用这些数据无法比较相对结合亲和力。)分别用山羊抗sFRP1和绵羊抗sFRP4抗体检测msFRP1和msFRP4。用小鼠抗His抗体检测加上His标签的小鼠sFRP2和加上His标签的小鼠sFRP3。用小鼠抗HA抗体检测加上His标签的小鼠sFRP5。
发明详述
本公开内容描述了分离的蛋白质复合物,其包括无翅/整合-1蛋白(Wnt)和分泌型卷曲相关蛋白(sFRP);包括Wnt的组合物,其中所述组合物基本上不含去污剂;过表达Wnt和sFRP的细胞;包括过表达Wnt的细胞和过表达sFRP的细胞的组合物;制备蛋白质复合物、组合物和细胞的方法;以及使用蛋白质复合物、组合物和细胞的方法。本公开内容进一步描述了形成包括Wnt和sFRP的复合物,并且分离Wnt的方法。本文还描述的是可以用于纯化Wnt包括例如栓系型Wnt的方法,所述Wnt使用在本发明时可用的Wnt纯化方案无法进行纯化。本公开内容进一步描述了可以用于纯化Wnt包括例如分泌型Wnt而无需使用去污剂的方法。
Wnt蛋白是糖基化和棕榈酰化蛋白,其已证明在活性状态下极难纯化(Willert等人Cold Spring Harbor Perspectives In Biology,4:a007864(2012))。Wnt可以包括Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和Wnt16中的至少一种。
Wnt家族成员涉及调节胚胎发生并控制生命后期的各种过程,包括细胞增殖、存活、迁移、极性、细胞命运的指定以及干细胞中的自我更新。Wnts水平的扰动或Wnts下游效应子的活性改变可以导致发育缺陷,并且可以促成疾病病因学。
由于Wnt蛋白的脂质修饰,这些生长因子可能与Wnt产生细胞的外膜结合,导致有限的分泌并且远离Wnt产生源发信号。在2003年,公开了使用(3-((3-胆酰胺丙基)二甲氨基)-1-丙磺酸)(CHAPS)去污剂来纯化棕榈酰化的Wnt蛋白的程序;对于该程序,将Wnt维持在疏水环境中证明对于保持Wnt活性是必要的(Willert等人Nature 423:448-452(2003);Reya等人Nature 423:409-414(2003))。然而,由于其疏水性,用CHAPS纯化的Wnt3a蛋白在细胞培养基中快速丧失活性,并且去污剂的存在可能干扰正常的细胞功能,包括例如干细胞的自我更新,或可能证明在细胞培养中的毒性(Tuysuz等人Nature Communications 8:14578(2017))。
在过表达Wnt的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的条件培养基(在本文中也称为上清液)中,可以以活性状态检测到一些Wnt,包括例如Wnt3a、Wnt5a、Wnt5b、Wnt8a和Wnt10a。这些“分泌型Wnt”通常顺应使用前述CHAPS纯化方案的纯化。其它Wnt或“栓系型Wnt”,包括例如Wnt1、Wnt2b、Wnt6、Wnt7a,似乎主要与产生这些Wnt的细胞的细胞膜结合。在制备这些栓系型Wnt的细胞的条件培养基中未检测到活性Wnt蛋白。来自过表达栓系型Wnt的细胞的条件培养基不以旁分泌方式激活Wnt信号传导,并且仅当制备栓系型Wnt的细胞与Wnt响应细胞共培养时,才能实现Wnt活性。纯化膜结合蛋白的努力已证明极其困难,导致非活性蛋白的纯化或低产率,其使得产物在经济上不可行。
分泌型卷曲相关蛋白(sFRP)是分泌型Wnt结合蛋白家族,其最初被描述为Wnt信号传导的拮抗剂。在人和小鼠基因组中存在5种sFRP。sFRP1-5都显示与卷曲的7次跨膜受体的Wnt结合的富含半胱氨酸结构域(CRD)的结构相似性。与7次跨膜卷曲受体不同,sFRPs是分泌型蛋白,其含有在CRD下游的轴突导向因子(netrin)样结构域,而这种轴突导向因子样结构域在卷曲受体中不存在。
尽管sFRP最初被描述为结合并抑制Wnt活性的分泌型蛋白,但后续研究证实sFRP也可以增强Wnt活性,包括例如当在生物学相关水平下表达时(Mii和Taira,Development136:4083-4088(2009);Holly等人,Developmental Biology 388:192-204(2014)。
本文所述的实验结果显示,在产生Wnt的细胞中表达的sFRP可以与栓系型Wnt结合,并且从细胞表面中释放其。在表达Wnt1的细胞中sFRP1或sFRP5的过表达导致在条件培养基中的活性Wnt1/sFRP复合物的检测。这种Wnt1/sFRP1复合物可以随后在水性纯化程序中进行纯化,所述水性纯化程序不需要使用去污剂如CHAPS。
本公开内容还提供了实验结果,其证实表达sFRP的细胞或sFRP重组蛋白质,可以以细胞自主和非细胞自主方式,从表达Wnt1的细胞的膜释放活性Wnt1/sFRP复合物。例如,表1中概括的数据提示,小鼠sFRP1(msFRP1)可以与小鼠Wnt 1(mWnt1)结合,并且从细胞膜中将其释放。仅当分泌型蛋白sFRP1或sFRP5已与表达mWnt1的细胞的表面上的mWnt1接触时,才能在条件培养基中检测到mWnt1活性。因此,与细胞表面处的Wnt结合的sFRP可以允许Wnt蛋白充当“分泌的”形态发生素。
本文提供的实验结果还显示,sFRP还可以从表达Wnt的细胞的外质膜中释放其它Wnt(包括例如Wnt2b和Wnt6),导致在表达Wnt2b或Wnt6的细胞的条件培养基中的Wnt2b/sFRP和Wnt6/sFRP复合物。这些数据证实sFRP可以充当Wnt结合配偶体。然而,在例如图3、图6C中观察到在Wnt信号传导的背景下sFRP的双相应答。
不希望受理论束缚,认为sFRP可以与Wnt上的棕榈酰化部分结合,使这种脂质修饰从水性环境屏蔽,并且因此,允许在活性Wnt/sFRP复合物中纯化栓系型Wnt。再次,不希望受理论束缚,认为sFRP与Wnt结合,并且增强Wnt信号传导直至使Wnt结合饱和的sFRP量(参见图3、图6C)。然而,一旦所有可用的Wnt蛋白都与sFRP复合,sFRP蛋白就可能通过与Wnt途径的其它非Wnt组分(包括例如卷曲受体)相互作用来抑制Wnt信号传导(Bafico等人TheJournal of Biological Chemistry 274,16180-16187(1999))。例如,过量的sFRP可以抑制Wnt蛋白激活卷曲受体。
Wnt
Wnt可以包括任何Wnt蛋白或Wnt蛋白的组合。Wnt蛋白可以包括Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和Wnt16中的至少一种。在一些实施方案中,Wnt包括分泌型Wnt和/或栓系型Wnt。在一些实施方案中,分泌型Wnt可以包括Wnt3a、Wnt5a、Wnt5b、Wnt8a和Wnt10a中的至少一种。
在一些实施方案中,Wnt包括真核Wnt。Wnt可以是来自任何合适的真核生物的Wnt,所述真核生物包括例如哺乳动物、两栖动物(例如,爪蟾属(Xenopus))、鸟(例如,鸡)或鱼(例如,斑马鱼)。在一些实施方案中,Wnt优选包括哺乳动物Wnt。哺乳动物Wnt可以包括例如人Wnt、小鼠Wnt、大鼠Wnt、马Wnt、犬Wnt、山羊Wnt、牛Wnt等。
在一些实施方案中,Wnt包括加上标签的Wnt。Wnt可以用任何合适的蛋白质标签加上标签,所述蛋白质标签包括例如组氨酸(His)标签、FLAG标签、血凝素(HA)标签、Fc标签、谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签、荧光标签(包括例如GFP标签、YFP标签、BFP标签)等。在一些实施方案中,标签可以是C末端;在一些实施方案中,标签可以是N末端。
在一些实施方案中,Wnt包括活性Wnt。如本文使用的,“活性Wnt”是激活经典β-连环蛋白信号传导的Wnt。
sFRP
sFRP可以包括任何sFRP蛋白或sFRP蛋白的组合。sFRP可以包括例如sFRP1、sFRP2、sFRP3、sFRP4和sFRP5中的至少一种。
在一些实施方案中,sFRP包括真核sFRP。sFRP可以是来自任何合适的真核生物的sFRP,所述真核生物包括例如哺乳动物、两栖动物(例如,爪蟾属)、鸟(例如,鸡)或鱼(例如,斑马鱼)。在一些实施方案中,sFRP优选包括哺乳动物sFRP。哺乳动物sFRP可以包括例如人sFRP、小鼠sFRP、大鼠sFRP、马sFRP、犬sFRP、山羊sFRP、牛sFRP等。
在一些实施方案中,sFRP包括加上标签的sFRP。sFRP可以用任何合适的蛋白质标签加上标签,所述蛋白质标签包括例如组氨酸(His)标签、FLAG标签、血凝素(HA)标签、Fc标签、谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签、荧光标签(包括例如GFP标签、YFP标签、BFP标签)等。在一些实施方案中,标签可以是C末端;在一些实施方案中,标签可以是N末端。
分离的蛋白质复合物和组合物
在一些方面,本公开内容描述了包括Wnt和sFRP的分离的蛋白质复合物。在一些实施方案中,“分离的蛋白质复合物”意指存在于组合物中或环境中的蛋白质复合物,其不同于自然界中发现的那种,即不同于天然或原始细胞或体内环境中发现的那种。“分离的蛋白质复合物”可以与至少50%、至少75%、至少90%、或至少95%的其它天然共存的细胞或组织组分分开。“分离的蛋白质复合物”可以包括在人工制剂中和/或在非天然宿主细胞中的天然存在的蛋白质复合物。在一些实施方案中,“分离的Wnt/sFRP蛋白质复合物”可以包括从经改造为表达非天然高水平的重组Wnt和sFRP的细胞中分离的Wnt/sFRP复合物。在一些实施方案中,细胞可以包括非天然宿主细胞和/或细胞可以包括整合到细胞的基因组内的非天然DNA。
在一些实施方案中,分离的蛋白质复合物优选基本上不含去污剂。“基本上不含”去污剂的分离的蛋白质复合物不包括足够以实质上影响分离的蛋白质复合物中Wnt的活性或作用的去污剂。在一些实施方案中,“基本上不含去污剂”意指含有小于2%重量/体积(w/v)、小于1%(w/v)、小于0.5%(w/v)、小于0.1%( w/v)、或小于0.01%(w/v)的去污剂。在一些实施方案中,去污剂包括两性离子和/或两性去污剂。在一些实施方案中,去污剂包括CHAPS(也称为3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸)、CHAPSO(也称为3-([3-胆酰胺丙基]二甲氨基)-2-羟基-1-丙磺酸)、Triton-X-100、Tween 20、Tween 80、SDS、脱氧胆酸盐、胆酸盐、sarkosyl、DDM、毛地黄皂苷和尿素中的至少一种。在一些实施方案中,去污剂包括CHAPS。
在另一个方面,本公开内容描述了包括Wnt的组合物。该组合物优选基本上不含去污剂。“基本上不含”去污剂的组合物不包括足够的去污剂,以实质上影响组合物中Wnt的活性或作用。
在一些实施方案中,分离的蛋白质复合物或组合物的Wnt优选包括活性Wnt。如本文使用的,“活性Wnt”是激活经典β-连环蛋白信号传导的Wnt。
可以使用本领域技术人员已知的任何方法来测量经典β-连环蛋白信号传导。例如,可以通过测定Wnt介导的β-连环蛋白、LRP5、LRP6、GSK3B、Axin和/或Dishevelled的磷酸化,来测量经典β-连环蛋白信号传导。磷酸化可以使用蛋白质印迹进行测量。自分泌和旁分泌的C57MG细胞、细胞转化测定、以及非洲爪蟾(Xenopus laevis)或斑马鱼中胚轴的复制也是建立的测定,以测试Wnt介导的经典β-连环蛋白活性。(参见例如,Shimizu等人,CellGrowth Differ. 1997,8(12):1349-58;Wong等人,Mol. Cell. Biol. 1994,14(9):6278-86;McMahon和Moon,Cell. 1989,58(6):1075-1084;Lustig等人,Mol. Cell. Biol. 2002,22(4):1184-93;Tamai等人,Mol. Cell. 2004,13(1):149-156;Van Noort等人,J BiolChem. 2002,277(20):17901-17905;Molenaar等人,Cell. 1996,86(3):391-399;Klein和Melton,Proc Natl Acad Sci USA 1996,93(16):8455-8459.)
在一些实施方案中,可以使用分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报道分子测定,包括实施例1中所述的HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5 Wnt Reporter测定,来测量经典β-连环蛋白信号传导。在一些实施方案中,如使用SEAP报道分子测定测量的,包括活性Wnt的蛋白质复合物相比不包括Wnt的复合物具有2倍或更多倍的Wnt报道分子活性。在一些实施方案中,如使用SEAP报道分子测定测量的,包括活性Wnt的组合物相比不包括Wnt的组合物具有2倍或更多倍的Wnt报道分子活性。
在一些实施方案中,如本文所述,如使用例如HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5 WntReporter测定测量的,活性Wnt或分离的蛋白质复合物显示出小于1000 ng/mL、小于500ng/mL、小于100 ng/mL、小于50 ng/mL、小于40 ng/mL、小于30 ng/mL、小于20 ng/mL、小于15 ng/mL、小于10 ng/mL、小于8 ng/mL、小于5 ng/mL、小于4 ng/mL、小于3 ng/mL、或小于2ng/mL的50%有效剂量(ED50)。
在一些实施方案中,如本文所述,如使用例如HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5 WntReporter测定测量的,活性Wnt或分离的蛋白质复合物显示出至少2 ng/mL、至少3 ng/mL、至少4 ng/mL、至少5 ng/mL、至少8 ng/mL、at last 10 ng/mL、至少15 ng/mL、至少 20 ng/mL、至少30 ng/mL、至少40 ng/mL、至少50 ng/mL、至少100 ng/mL、或至少500 ng/mL的50%有效剂量(ED50)。
在一些实施方案中,分离的蛋白质复合物或组合物可以包括Wnt-sFRP融合蛋白。在一些实施方案中,Wnt可以经由接头包括例如肽接头与sFRP1融合。可以使用任何合适的接头。在一些实施方案中,肽接头可以包括GGGS(SEQ ID NO:1)、GGGGS(SEQ ID NO:2)、GSGSG(SEQ ID NO:3)、GGGGG(SEQ ID NO:4)、以及GSGSGGSGSG(SEQ ID NO:5)中的至少一种。在一些实施方案中,肽接头可以包括上述肽接头中的一种或多种的多个重复,包括例如(GGGS)X(SEQ ID NO:6)、(GGGGS)X(SEQ ID NO:7);(GSGSG)X(SEQ ID NO:8)、(GSGSGGSGSG)X(SEQ ID NO:9)和/或GX,其中X = 1-400。
在一些实施方案中,分离的蛋白质复合物或组合物可以包括R-Spondin家族的成员,包括例如R-Spondin 1、R-Spondin 2、R-Spondin 3和R-Spondin 4中的至少一种。
在一些实施方案中,R-Spondin可以与sFRP1和/或Wnt融合,形成融合蛋白。在一些实施方案中,R-Spondin可以经由接头包括例如肽接头与sFRP1和/或Wnt融合。可以使用任何合适的接头。在一些实施方案中,肽接头可以包括GGGS(SEQ ID NO:1)、GGGGS(SEQ IDNO:2)、GSGSG(SEQ ID NO:3)、GGGGG(SEQ ID NO:4)、以及GSGSGGSGSG(SEQ ID NO:5)中的至少一种。在一些实施方案中,肽接头可以包括上述肽接头中的一种或多种的多个重复,包括例如(GGGS)X(SEQ ID NO:6)、(GGGGS)X(SEQ ID NO:7);(GSGSG)X(SEQ ID NO:8)、(GSGSGGSGSG)X(SEQ ID NO:9)和/或GX,其中X = 1-400。
在一些实施方案中,分离的蛋白质复合物或组合物可以包括脂质运载蛋白7。在一些实施方案中,分离的蛋白质复合物或组合物可以包括WIF1。
制备方法
在一个进一步方面,本公开内容描述了包括形成包括Wnt和sFRP的复合物,并且分离Wnt的方法。在一些实施方案中,可以在形成包括Wnt和sFRP的复合物之前分离Wnt。在一些实施方案中,可以从包括Wnt和sFRP的复合物中分离Wnt。在一些实施方案中,包括当从包含Wnt和sFRP的复合物中分离Wnt时,可以优选无需使用去污剂来分离Wnt。
在一些实施方案中,包括例如当在形成包括Wnt和sFRP的复合物之前分离Wnt时,分离Wnt可以包括使用去污剂。去污剂可以包括例如CHAPS。在一些实施方案中,该方法可以进一步包括从包括Wnt和sFRP的复合物中去除去污剂。
在一些实施方案中,分离Wnt可以包括水性纯化程序。在一些实施方案中,分离Wnt可以包括色谱分离。色谱分离可以包括例如使用SEPHAROSE柱的分离。
在一些实施方案中,该方法可以包括产生和/或表达Wnt和sFRP中的至少一种。在一些实施方案中,Wnt和/或sFRP可以是过表达的。Wnt和/或sFRP可以在适当启动子的控制下,在哺乳动物细胞、酵母、细菌、昆虫细胞(S2、Sf9、Sf21)或其它细胞中表达。无细胞翻译系统也可以用于使用RNA产生Wnt和/或sFRP。用于与原核和真核宿主一起使用的适当的克隆和表达载体由例如Sambrook,等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)描述。
在一些实施方案中,形成包括Wnt和sFRP的复合物可以包括使表达Wnt的细胞与表达sFRP的细胞共培养。在一些实施方案中,形成包括Wnt和sFRP的复合物可以包括使表达Wnt的细胞与表达sFRP的细胞共培养。
在一些实施方案中,该方法可以包括从表达Wnt和sFRP的细胞中、或从表达Wnt的细胞与表达sFRP的细胞的共培养物中分离条件培养基。在一些实施方案中,该方法可以进一步包括从条件培养基中分离包括Wnt和sFRP的复合物。
使用方法
在另一个方面,本公开内容描述了使用分离的蛋白质复合物的方法,如本文所述。例如,本文描述的分离的蛋白质复合物、分离的Wnt和/或组合物可以用作培养基添加剂。在一些实施方案中,培养基添加剂可以用于细胞培养,包括例如干细胞培养或类器官培养中。在一些实施方案中,本文所述的分离的蛋白质复合物、分离的Wnt和/或组合物可以用于疾病模型中。在一些实施方案中,本文所述的分离的蛋白质复合物、分离的Wnt和/或组合物可以用于指导细胞的分化,所述细胞包括例如胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。细胞可以分化为任何期望的细胞类型,包括例如神经元、神经外胚层、心肌细胞、间充质干细胞和/或中内胚层衍生物(参见例如,Lam等人,2014,Semin Nephrol,34(4):445-461;Spence等人,2011,Nature,470:105-109;Paige等人,2010,PLoS One 5(6):e11134. doi: 10.1371/journal.pone.0011134;Murashov等人,2004 FASEB 19(2):252-4)。
示例性实施方案
分离的蛋白质复合物实施方案
1. 一种分离的蛋白质复合物,其包含Wnt和sFRP。
2. 实施方案1的分离的蛋白质复合物,其中所述Wnt包含Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和Wnt16中的至少一种。
3. 前述实施方案中任一个的分离的蛋白质复合物,其中所述Wnt包含Wnt3a、Wnt5a、Wnt5b、Wnt8a和Wnt10a中的至少一种。
4. 前述实施方案中任一个的分离的蛋白质复合物,其中所述sFRP包含sFRP1、sFRP2、sFRP3、sFRP4和sFRP5中的至少一种。
5. 前述实施方案中任一个的分离的蛋白质复合物,其中所述Wnt包含活性Wnt。
6. 实施方案5的分离的蛋白质复合物,其中所述活性Wnt包含激活β-连环蛋白信号传导的Wnt。
7. 实施方案5或6的分离的蛋白质复合物,其中如使用分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报道分子测定测量的,所述活性Wnt包含具有Wnt报道分子活性的Wnt。
8. 实施方案7的分离的蛋白质复合物,其中如使用SEAP报道分子测定测量的,所述分离的蛋白质复合物相比不包含Wnt的分离的蛋白质复合物具有2倍或更多倍的Wnt报道分子活性。
9. 前述实施方案中任一个的分离的蛋白质复合物,其中所述蛋白质复合物基本上不含去污剂。
10. 前述实施方案中任一个的分离的蛋白质复合物,其中如使用HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5 Wnt Reporter测定测量的,蛋白质复合物显示出小于1000 ng/mL、小于500 ng/mL或小于100 ng/mL的50%有效剂量(ED50)。
11. 前述实施方案中任一个的分离的蛋白质复合物,其中所述Wnt包含哺乳动物Wnt。
12. 前述实施方案中任一个的分离的蛋白质复合物,其中所述Wnt包含人Wnt或小鼠Wnt。
13. 前述实施方案中任一个的分离的蛋白质复合物,其中所述sFRP包含哺乳动物sFRP。
14. 前述实施方案中任一个的分离的蛋白质复合物,其中所述sFRP包含人sFRP或小鼠sFRP。
15. 前述实施方案中任一个的分离的蛋白质复合物,其中所述sFRP包含加上标签的sFRP。
16. 实施方案15的分离的蛋白质复合物,其中所述加上标签的sFRP包含加上组氨酸标签的sFRP。
17. 实施方案15或16的分离的蛋白质复合物,其中所述加上标签的sFRP包含加上C末端标签的sFRP。
18. 前述实施方案中任一个的分离的蛋白质复合物,其中所述Wnt包含加上标签的Wnt。
19. 实施方案18的分离的蛋白质复合物,其中所述加上标签的Wnt包含加上组氨酸标签的Wnt。
20. 实施方案18或19的分离的蛋白质复合物,其中所述加上标签的Wnt包含加上C末端标签的Wnt。
21. 前述实施方案中任一个的分离的蛋白质复合物,其中所述复合物包含Wnt-sFRP融合蛋白。
22. 实施方案21的分离的蛋白质复合物,其中所述Wnt-sFRP融合蛋白包含接头。
23. 实施方案22的分离的蛋白质复合物,其中所述接头包含肽接头。
24. 前述实施方案中任一个的分离的蛋白质复合物,所述分离的蛋白质复合物进一步包含R-Spondin 1、R-Spondin 2、R-Spondin 3和R-Spondin 4中的至少一种。
25. 实施方案24的分离的蛋白质复合物,其中所述R-Spondin 1、R-Spondin 2、R-Spondin 3和R-Spondin 4中的至少一种与sFRP1融合,形成融合蛋白。
26. 实施方案25的分离的蛋白质复合物,其中所述R-Spondin 1、R-Spondin 2、R-Spondin 3和R-Spondin 4中的至少一种经由接头与sFRP1融合。
27. 实施方案26的分离的蛋白质复合物,其中所述接头包含肽接头。
28. 实施方案25至27中任一个的分离的蛋白质复合物,所述融合蛋白进一步包含Wnt。
29. 实施方案24或实施方案28的分离的蛋白质复合物,其中所述R-Spondin 1、R-Spondin 2、R-Spondin 3和R-Spondin 4中的至少一种与Wnt融合,形成融合蛋白。
30. 实施方案29的分离的蛋白质复合物,其中所述R-Spondin 1、R-Spondin 2、R-Spondin 3和R-Spondin 4中的至少一种经由接头与Wnt融合。
31. 实施方案30的分离的蛋白质复合物,其中所述接头包含肽接头。
32. 实施方案23、27或31中任一个的分离的蛋白质复合物,其中所述肽接头包含GGGS(SEQ ID NO:1)、GGGGS(SEQ ID NO:2)、(SEQ ID NO:3)、GGGGG(SEQ ID NO:4)、以及GSGSGGSGSG(SEQ ID NO:5)中的至少一种。
33. 前述实施方案中任一个的分离的蛋白质复合物,所述分离的蛋白质复合物进一步包含脂质运载蛋白7。
34. 前述实施方案中任一个的分离的蛋白质复合物,所述分离的蛋白质复合物进一步包含WIF1。
35. 一种使用前述实施方案中任一个的分离的蛋白质复合物的方法。
Wnt组合物实施方案
1. 一种包含Wnt的组合物,其中所述组合物基本上不含去污剂。
2. 实施方案1的组合物,其中所述Wnt包含活性Wnt。
3. 一种包含Wnt的组合物,其中所述Wnt包含活性Wnt。
4. 实施方案2或3中任一的组合物,其中所述活性Wnt包含激活经典β-连环蛋白信号传导的Wnt。
5. 实施方案2或3中任一的组合物,其中如使用分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报道分子测定测量的,所述活性Wnt包含具有Wnt报道分子活性的Wnt。
6. 实施方案5的组合物,其中如使用SEAP报道分子测定测量的,所述组合物相比不包含Wnt的组合物具有2倍或更多倍的Wnt报道分子活性。
7. 实施方案2至6中任一个的组合物,其中如使用HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5Wnt Reporter测定测量的,所述活性Wnt显示出小于1000 ng/mL、小于500 ng/mL或小于100ng/mL的50%有效剂量(ED50)
8. 前述实施方案中任一个的组合物,其中所述Wnt包含Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和Wnt16中的至少一种。
9. 前述实施方案中任一个的组合物,其中所述Wnt包含Wnt3a、Wnt5a、Wnt5b、Wnt8a和Wnt10a中的至少一种。
10. 前述实施方案中任一个的组合物,其中所述Wnt包含哺乳动物Wnt。
11. 前述实施方案中任一个的组合物,其中所述Wnt包含人Wnt或小鼠Wnt。
12. 前述实施方案中任一个的组合物,所述组合物进一步包含sFRP。
13. 实施方案12的组合物,其中所述sFRP包含sFRP1、sFRP2、sFRP3、sFRP4和sFRP5中的至少一种。
14. 实施方案12或13中任一个的组合物,其中所述组合物包含Wnt-sFRP融合蛋白。
15. 实施方案14的组合物,其中所述Wnt-sFRP融合蛋白包含接头。
16. 实施方案15的组合物,其中所述接头包含肽接头。
17. 实施方案12至15中任一个的组合物,其中所述sFRP包含哺乳动物sFRP。
18. 实施方案12至17中任一个的组合物,其中所述sFRP包含人sFRP或小鼠sFRP。
19. 实施方案12至18中任一个的组合物,其中所述sFRP包含加上标签的sFRP。
20. 实施方案19的组合物,其中所述加上标签的sFRP包含加上组氨酸标签的sFRP。
21. 实施方案20或21的组合物,其中所述加上标签的sFRP包含加上C末端标签的sFRP。
22. 前述实施方案中任一个的组合物,其中所述Wnt包含加上标签的Wnt。
23. 实施方案22的组合物,其中所述加上标签的Wnt包含加上组氨酸标签的Wnt。
24. 实施方案22或23的组合物,其中所述加上标签的Wnt包含加上C末端标签的Wnt。
25. 前述实施方案中任一个的组合物,所述组合物进一步包含R-Spondin 1、R-Spondin 2、R-Spondin 3和R-Spondin 4中的至少一种。
26. 实施方案25的组合物,其中所述R-Spondin 1、R-Spondin 2、R-Spondin 3和R-Spondin 4中的至少一种与Wnt融合,形成融合蛋白。
27. 实施方案23的组合物,其中所述R-Spondin 1、R-Spondin 2、R-Spondin 3和R-Spondin 4中的至少一种经由肽接头与Wnt融合。
28. 实施方案25至27中任一个的组合物,所述组合物包含sFRP,并且其中所述Wnt、R-Spondin 1、R-Spondin 2、R-Spondin 3和R-Spondin 4中的至少一种与sFRP融合,形成融合蛋白。
29. 实施方案28的组合物,其中所述Wnt、R-Spondin 1、R-Spondin 2、R-Spondin3和R-Spondin 4中的至少一种经由肽接头与sFRP融合。
30. 实施方案16、27或29的组合物,其中所述肽接头包含GGGS(SEQ ID NO:1)、GGGGS(SEQ ID NO:2)、(SEQ ID NO:3)、GGGGG(SEQ ID NO:4)、以及GSGSGGSGSG(SEQ ID NO:5)中的至少一种。
31. 前述实施方案中任一个的组合物,所述组合物进一步包含脂质运载蛋白7。
32. 前述实施方案中任一个的组合物,所述组合物进一步包含WIF1。
33. 一种使用前述实施方案中任一个的组合物的方法。
细胞实施方案
1. 一种过表达Wnt和sFRP的细胞。
2. 实施方案1的细胞,其中所述Wnt包含Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和Wnt16中的至少一种。
3. 前述实施方案中任一个的细胞,其中所述Wnt包含Wnt3a、Wnt5a、Wnt5b、Wnt8a和Wnt10a中的至少一种。
4. 前述实施方案中任一个的细胞,其中所述sFRP包含sFRP1、sFRP2、sFRP3、sFRP4和sFRP5中的至少一种。
5. 前述实施方案中任一个的细胞,其中所述Wnt包含活性Wnt。
6. 实施方案5的细胞,其中所述活性Wnt包含激活β-连环蛋白信号传导的Wnt。
7. 前述实施方案中任一个的细胞,其中如使用HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5Wnt Reporter测定测量的,所述Wnt显示出小于1000 ng/mL、小于500 ng/mL或小于100 ng/mL的50%有效剂量(ED50)。
8. 前述实施方案中任一个的细胞,其中所述Wnt包含哺乳动物Wnt。
9. 前述实施方案中任一个的细胞,其中所述Wnt包含人Wnt或小鼠Wnt。
10. 前述实施方案中任一个的细胞,其中所述sFRP包含哺乳动物sFRP。
11. 前述实施方案中任一个的细胞,其中所述sFRP包含人sFRP或小鼠sFRP。
12. 前述实施方案中任一个的细胞,其中所述sFRP包含加上标签的sFRP。
13. 实施方案12的细胞,其中所述加上标签的sFRP包含加上组氨酸标签的sFRP。
14. 实施方案12或13的细胞,其中所述加上标签的sFRP包含加上C末端标签的sFRP。
15. 前述实施方案中任一个的细胞,其中所述Wnt包含加上标签的Wnt。
16. 实施方案15的细胞,其中所述加上标签的Wnt包含加上组氨酸标签的Wnt。
17. 实施方案15或16的细胞,其中所述加上标签的Wnt包含加上C末端标签的Wnt。
18. 前述实施方案中任一个的细胞,其中所述细胞表达Wnt-sFRP融合蛋白。
19. 实施方案18的细胞,其中所述Wnt-sFRP融合蛋白包含接头。
20. 实施方案19的细胞,其中所述接头包含肽接头。
21. 前述实施方案中任一个的细胞,所述细胞进一步表达R-Spondin 1、R-Spondin 2、R-Spondin 3和R-Spondin 4中的至少一种。
22. 实施方案21的细胞,其中所述R-Spondin 1、R-Spondin 2、R-Spondin 3和R-Spondin 4中的至少一种与sFRP1融合,形成融合蛋白。
23. 实施方案22的细胞,其中所述R-Spondin 1、R-Spondin 2、R-Spondin 3和R-Spondin 4中的至少一种经由接头与sFRP1融合。
24. 实施方案23的细胞,其中所述接头包含肽接头。
25. 实施方案22至27中任一个的细胞,所述融合蛋白进一步包含Wnt。
26. 实施方案21或实施方案25的细胞,其中所述R-Spondin 1、R-Spondin 2、R-Spondin 3和R-Spondin 4中的至少一种与Wnt融合,形成融合蛋白。
27. 实施方案26的细胞,其中所述R-Spondin 1、R-Spondin 2、R-Spondin 3和R-Spondin 4中的至少一种经由接头与Wnt融合。
28. 实施方案27的细胞,其中所述接头包含肽接头。
29. 实施方案20、24或28中任一个的细胞,其中所述肽接头包含GGGS(SEQ ID NO:1)、GGGGS(SEQ ID NO:2)、(SEQ ID NO:3)、GGGGG(SEQ ID NO:4)、以及GSGSGGSGSG(SEQ IDNO:5)中的至少一种。
30. 一种使用前述实施方案中任一个的细胞的方法。
细胞组合物实施方案
1. 一种组合物,其包含:
过表达Wnt的细胞;和
过表达sFRP的细胞。
2. 实施方案1的组合物,其中所述Wnt包含Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和Wnt16中的至少一种。
3. 前述实施方案中任一个的组合物,其中所述Wnt包含Wnt3a、Wnt5a、Wnt5b、Wnt8a和Wnt10a中的至少一种。
4. 前述实施方案中任一个的组合物,其中所述sFRP包含sFRP1、sFRP2、sFRP3、sFRP4和sFRP5中的至少一种。
5. 前述实施方案中任一个的组合物,其中所述Wnt包含活性Wnt。
6. 实施方案5的组合物,其中所述活性Wnt包含激活β-连环蛋白信号传导的Wnt。
7. 前述实施方案中任一个的组合物,其中如使用HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5Wnt Reporter测定测量的,所述Wnt显示出小于1000 ng/mL、小于500 ng/mL或小于100 ng/mL的50%有效剂量(ED50)。
8. 前述实施方案中任一个的组合物,其中所述Wnt包含哺乳动物Wnt。
9. 前述实施方案中任一个的组合物,其中所述Wnt包含人Wnt或小鼠Wnt。
10. 前述实施方案中任一个的组合物,其中所述sFRP包含哺乳动物sFRP。
11. 前述实施方案中任一个的组合物,其中所述sFRP包含人sFRP或小鼠sFRP。
12. 前述实施方案中任一个的组合物,其中所述sFRP包含加上标签的sFRP。
13. 实施方案12的组合物,其中所述加上标签的sFRP包含加上组氨酸标签的sFRP。
14. 实施方案12或13的组合物,其中所述加上标签的sFRP包括加上C末端标签的sFRP。
15. 前述实施方案中任一个的组合物,其中所述Wnt包含加上标签的Wnt。
16. 实施方案15的组合物,其中所述加上标签的Wnt包含加上组氨酸标签的Wnt。
17. 实施方案15或16的组合物,其中所述加上标签的Wnt包含加上C末端标签的Wnt。
18. 前述实施方案中任一个的组合物,所述组合物进一步包含表达R-Spondin 1、R-Spondin 2、R-Spondin 3和R-Spondin 4中的至少一种的细胞。
19. 实施方案18的组合物,其中所述R-Spondin 1、R-Spondin 2、R-Spondin 3和R-Spondin 4中的至少一种与sFRP1融合,形成融合蛋白。
20. 实施方案19的组合物,其中所述R-Spondin 1、R-Spondin 2、R-Spondin 3和R-Spondin 4中的至少一种经由接头与sFRP1融合。
21. 实施方案20的组合物,其中所述接头包含肽接头。
22. 实施方案18的组合物,其中所述R-Spondin 1、R-Spondin 2、R-Spondin 3和R-Spondin 4中的至少一种与Wnt融合,形成融合蛋白。
23. 实施方案22的组合物,其中所述R-Spondin 1、R-Spondin 2、R-Spondin 3和R-Spondin 4中的至少一种经由接头与Wnt融合。
24. 实施方案23的组合物,其中所述接头包含肽接头。
25. 实施方案21或24的组合物,其中所述肽接头包含GGGS(SEQ ID NO:1)、GGGGS(SEQ ID NO:2)、(SEQ ID NO:3)、GGGGG(SEQ ID NO:4)、以及GSGSGGSGSG(SEQ ID NO:5)中的至少一种。
26. 前述实施方案中任一个的组合物,其中所述过表达Wnt的细胞和所述过表达sFRP的细胞中的至少一种用质粒进行转染。
27. 一种使用前述实施方案中任一个的组合物的方法。
方法实施方案
1. 一种方法,其包括:
形成包含Wnt和sFRP的复合物;和
分离Wnt。
2. 前述实施方案中任一个的方法,其中分离所述Wnt包括水性纯化程序。
3. 前述实施方案中任一个的方法,其中分离所述Wnt包括色谱分离。
4. 前述实施方案中任一个的方法,所述方法进一步包括过表达Wnt。
5. 前述实施方案中任一个的方法,所述方法进一步包括过表达sFRP。
6. 前述实施方案中任一个的方法,其中形成包含Wnt和sFRP的复合物包括使表达Wnt的细胞与表达sFRP的细胞共培养。
7. 前述实施方案中任一个的方法,其中在分离所述Wnt之后形成包含Wnt和sFRP的复合物。
8. 前述实施方案中任一个的方法,其中分离所述Wnt包括使用去污剂。
9. 实施方案1至7中任一个的方法,其中在分离所述Wnt之前形成包含Wnt和sFRP的复合物。
10. 实施方案1至7或9中任一个的方法,其中分离所述Wnt不包括使用去污剂。
11. 前述实施方案中任一个的方法,其中所述Wnt包含Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和Wnt16中的至少一种。
12. 前述实施方案中任一个的方法,其中所述Wnt包含Wnt3a、Wnt5a、Wnt5b、Wnt8a和Wnt10a中的至少一种。
13. 前述实施方案中任一个的方法,其中所述sFRP包含sFRP1、sFRP2、sFRP3、sFRP4和sFRP5中的至少一种。
14. 前述实施方案中任一个的方法,其中所述Wnt包含哺乳动物Wnt。
15. 前述实施方案中任一个的方法,其中所述Wnt包含人Wnt或小鼠Wnt。
16. 前述实施方案中任一个的方法,其中所述sFRP包含哺乳动物sFRP。
17. 前述实施方案中任一个的方法,其中所述sFRP包含人sFRP或小鼠sFRP。
18. 前述实施方案中任一个的方法,其中所述sFRP包含加上标签的sFRP。
19. 实施方案18的方法,其中所述加上标签的sFRP包含加上组氨酸标签的sFRP。
20. 实施方案18或19的方法,其中所述加上标签的sFRP包含加上C末端标签的sFRP。
21. 前述实施方案中任一个的方法,其中所述Wnt包含加上标签的Wnt。
22. 实施方案21的方法,其中所述加上标签的Wnt包含加上组氨酸标签的Wnt。
23. 实施方案21或22的方法,其中所述加上标签的Wnt包含加上C末端标签的Wnt。
24. 前述实施方案中任一个的方法,其中所述复合物进一步包含R-Spondin 1、R-Spondin 2、R-Spondin 3、R-Spondin 4、Lipocaline7和WIF1中的至少一种。
25. 前述实施方案中任一个的方法,所述方法包括培养表达Wnt的细胞。
26. 前述实施方案中任一个的方法,所述方法包括培养表达sFRP的细胞。
27. 权利要求26的方法,其中使所述过表达Wnt的细胞和所述表达sFRP的细胞共培养。
28. 前述实施方案中任一个的方法,所述方法包括培养表达Wnt和sFRP的细胞。
29. 实施方案25至28中任一个的方法,所述方法进一步包括分离条件培养基。
30. 实施方案29的方法,所述方法包括从条件培养基中分离包含Wnt和sFRP的复合物。
31. 前述实施方案中任一个的方法,所述方法进一步包括从包含Wnt和sFRP的复合物中去除去污剂。
32. 前述实施方案中任一个的方法,所述方法进一步包括使用复合物作为培养基添加剂。
33. 前述实施方案中任一个的方法,所述方法进一步包括将复合物加入干细胞培养物或类器官培养物中。
通过下述实施例示出本发明。应理解特定实例、材料、量和程序将根据如本文阐述的本发明的范围和精神广泛地加以解释。
实施例
实施例1
该实施例描述了纯化Wnt蛋白的方法,其消除了去污剂的使用,但维持了重组Wnt蛋白的活性。该方法包括共表达与Wnt结合的sFRP。不希望受理论束缚,认为sFRP保护Wnt蛋白的脂质修饰免于水性环境。本文呈现的数据还证实,sFRP可以用于与产生Wnt的细胞的条件培养基中的活性Wnt复合并且增强其量。
方法
细胞培养和细胞转染
所有细胞系,包括CHO、CHO mWnt-1、CHO msFRP-1、CHO mWnt-1/msFRP-1和CHO mWnt-1/msFRP-1-His,都在具有2毫摩尔(mM)的L-谷氨酰胺-青霉素-链霉素(Sigma)、以及适当的选择抗生素(嘌呤霉素、G418和/或潮霉素;全部都来自ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)的IMDM(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)、5% FBS(Corning,Corning,NY)中培养。根据制造说明书(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA),使用Lipofectamine 2000试剂用表达质粒转染细胞。
为了获得用于HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5 Wnt Reporter测定和蛋白质印迹的条件培养基,将5 x 104个细胞接种在12孔皿中,并且在37℃、5% CO2下在培养箱中温育四天。收集条件培养基(其为上清液),并且通过离心去除细胞碎片。
HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5 Wnt报道分子测定
将表达全长人LRP5、全长人FZ4和分泌型碱性磷酸酶(SEAP)上游的9 x T细胞因子DNA结合位点(TCF9)的克隆HEK293细胞接种在96孔板中,并且在37℃ + 5% CO2下温育过夜。然后将细胞用条件培养基或蛋白质处理18小时。在内源性碱性磷酸酶的热灭活后,将来自每个孔的10微升(µL)条件培养基与50 µL SEAP Reporter Assay Buffer/Substrate(0.1 MTris-HCl,pH 9.0,0.1 mM DiFMUP(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA))混合,并且在黑暗中在室温下温育15分钟至30分钟。用在350纳米(nm)激发、在450 nm发射和在微板阅读器(Spectra Max Gemini EM,Molecular Devices,LLC,Sunnyvale,CA上在435 nm截断,测量SEAP活性。
蛋白质印迹分析
使条件培养基或重组蛋白质在2x还原样品缓冲液(20 mM二硫苏糖醇、6% SDS、0.25摩尔(M)Tris pH 6.8、10%甘油、10 mM NaF和溴酚蓝)中裂解,在95℃下变性3分钟,并且在4-20% SDS-PAGE凝胶上分辨。将凝胶转移至PVDF膜(Millipore,Billerica,MA),并且与一抗一起在含有5%脱脂奶粉的封闭缓冲液(25 mM Tris pH 7.4、0.15 M NaCl、0.1% Tween-20)中在4℃下温育过夜。在充分洗涤后,使膜与二抗一起在封闭缓冲液中在室温下温育1小时。使用SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA),通过化学发光反应揭示免疫标记。用于蛋白质印迹的抗体如下: Gt x mWnt-1,1 µg/mL(目录号AF1620,Bio-Techne,Minneapolis,MN)。Gt x hsFRP-1,1 µg/mL(目录号AF1384,Bio-Techne,Minneapolis,MN)。Dk x Gt IgG,HRP,1:1000稀释(目录号HAF109,Bio-Techne,Minneapolis,MN)。
mWnt1和msFRP1的免疫沉淀
将5 x 104个CHO mWnt-1/msFRP1细胞接种在12孔皿中,并且在37℃、5% CO2下在培养箱中温育四天。收集条件培养基,并且通过离心去除细胞碎片。首先使500 µL条件培养基与免疫沉淀抗体一起在4℃下温育2小时至4小时,然后添加50 µL蛋白G-琼脂糖珠(PierceProtein Biology/ThermoFisher Scientific,Waltham,MA),并且温育2小时。回收结合的免疫复合物,并且在达尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中洗涤3次。蛋白质通过SDS-PAGE进行分辨,转移到PVDF膜用于蛋白质印迹分析。用于免疫沉淀和蛋白质印迹的抗体如下:Gt xmWnt-1,1 µg/mL(目录号AF1620,Bio-Techne,Minneapolis,MN)。Ms x His,1 µg/mL(目录号MAB050R,Bio-Techne,Minneapolis,MN)。Dk x Gt IgG,HRP,1:1000稀释(目录号HAF109,Bio-Techne,Minneapolis,MN)。Gt x Ms IgG,HRP(目录号HAF007,Bio-Techne,Minneapolis,MN)。
CHO mWnt2b/msFRP1条件培养基的免疫沉淀
将5 x 104个CHO mWnt2b/msFRP1细胞接种在12孔皿中,并且在37℃、5% CO2下在培养箱中温育四天。收集条件培养基,并且通过离心去除细胞碎片。首先使500 µL条件培养基与免疫沉淀抗体一起在4℃下温育2小时至4小时,然后添加50 µL蛋白G-琼脂糖珠(PierceProtein Biology/ThermoFisher Scientific,Waltham,MA),并且温育2小时。回收结合的免疫复合物,并且在DPBS中洗涤3次。蛋白质通过SDS-PAGE进行分辨,转移到PVDF膜用于蛋白质印迹分析。用于免疫沉淀和蛋白质印迹的抗体如下:Gt x mWnt2b,1 µg/mL(目录号AF3900,Bio-Techne,Minneapolis,MN)。Gt x hsFRP-1,1 µg/mL(目录号AF1384 Bio-Techne,Minneapolis,MN)。Dk x Gt IgG,HRP,1:1000稀释(目录号HAF109,Bio-Techne,Minneapolis,MN)。
表达Wnt的细胞与表达msFRP的细胞的共培养
将5 x 104个表达Wnt的细胞接种在12孔皿中,并且在37℃、5% CO2培养箱中温育三天。将2 x 105个表达msFRP的细胞加入表达Wnt的细胞中,并且共培养一天。收集条件培养基并且应用于HEK293 Wnt报道细胞。
用sFRP-1蛋白处理CHO mWnt-1细胞
用在0.6毫升(mL)培养基中的4 x 105个CHO mWnt-1细胞接种12孔板。使细胞在37℃下温育1小时,然后添加msFRP-1蛋白处理,从50 µg/mL开始,并且以1:2系列稀释。在24小时后,通过离心5分钟收集条件培养基,以在添加报道细胞之前去除细胞碎片。
小鼠Wnt-1/小鼠sFRP复合物的纯化
将来自共表达小鼠Wnt-1和小鼠sFRP1的CHO细胞的条件培养基加载到用20 mM MOPS,0.1 M NaCl,pH 6.8平衡的SP琼脂糖Fast Flow柱(GE Healthcare,Chicago,IL)上。应用高盐缓冲液(20 mM MOPS,1.6 M NaCl,pH 6.8)的线性梯度,以洗脱结合的蛋白质。具有银染色的SDS-PAGE用于监测小鼠sFRP1(~37 kDa)的洗脱,而用抗小鼠Wnt-1探测的蛋白质印迹用于监测小鼠Wnt-1(~40 kDa)的洗脱。收集了包括Wnt-1和sFRP1两者的蛋白质峰。在浓缩后,将合并的峰加载到Superdex-200柱(GE Healthcare,Chicago,IL)上,以使Wnt-1/sFRP1复合物与游离sFRP1分开,如先前步骤中通过SDS-PAGE银染色和蛋白质印迹两者进行监测。
Wnt3a/sFRP ELISA结合测定
96孔组织培养板用PBS中的1% BSA进行封闭,并且用作溶液中结合板。含有100 ng/mL重组小鼠(rm)Wnt3a生物素化蛋白和sFRP(1:3系列稀释)的120μL总体积在4℃下在结合板中温育过夜。然后将100 µL结合溶液转移到链霉抗生物素蛋白包被的96孔ELISA板,在4℃下温育过夜,随后为HRP检测。小鼠sFRP1用山羊抗小鼠sFRP1抗体进行检测,小鼠sFRP2和小鼠sFRP3加上His标签,并且用小鼠抗His抗体进行检测,小鼠sFRP4用绵羊抗小鼠sFRP4抗体进行检测,并且加上HA标签的小鼠sFRP5用小鼠抗HA肽进行检测。抗HRP二抗用于检测一抗,随后为比色读出。
结果
为了确定表达小鼠sFRP1(msFRP1)或小鼠sFRP1-His(msFRP1-His)是否增强CHO细胞的条件培养基(CM)中的小鼠Wnt1(mWnt1)量,制备表达mWnt1、msFRP1、mWnt1和msFRP1、以及mWnt1和msFRP1-His的稳定的克隆系。条件培养基的蛋白质印迹分析证实,与CHO、CHOmWnt1或CHO msFRP1条件培养基相比,mWnt1连同msFRP1或msFRP1-His的共表达导致条件培养基中显著更高水平的mWnt1(图1A)。与CHO或CHO mWnt1条件培养基中的msFRP1水平相比,过表达msFRP1的CHO细胞也明确地显示更高水平的msFRP1(图1A)。
在图1的蛋白质印迹分析中使用的相同条件培养基也在表达人卷曲4(hFz4)和人LRP5(hLRP5)的HEK293 Wnt Reporter系中进行测试(在本文中也称为进行HEK293 hFz4/hLRP5 Wnt报道测定)。仅当mWnt1与msFRP1或msFRP1-His共表达时,来自CHO细胞的条件培养基才导致Wnt报道分子激活(图1B)。野生型CHO、CHO mWnt1和CHO msFRP1条件培养基并未激活在超过背景的水平下的Wnt报道分子。这些数据与msFRP1或msFRP1-His的过表达一致,导致在表达mWnt1和msFRP1或msFRP1-His两者的细胞的条件培养基中更高水平的活性mWnt1(图1)。
为了测试Wnt和sFRP是否可以在复合物中彼此结合,测试了mWnt1和msFRP1的相互作用。免疫沉淀实验证实mWnt1和msFRP1-His在复合物中结合(图2)。用抗Wnt1抗体的免疫沉淀和用抗His抗体的印迹导致检测到37 kDa的条带(msFRP1-His的预期大小)(图2,泳道2)。用抗His抗体的免疫沉淀和用抗Wnt1抗体的印迹导致检测到42kDa的条带(mWnt1的预期大小)(图2,泳道5)。这些数据提示mWnt1和msFRP1在表达mWnt1和msFRP1两者的CHO细胞的条件培养基中的复合物中彼此结合。
测试在表达小鼠Wnt2b(mWnt2b)和msFRP1两者的CHO条件培养基中,小鼠sFRP1(msFRP1)是否与mWnt2b结合。通过将抗小鼠Wnt2b、抗人sFRP1、或无抗体对照加入等量的过表达单独的mWnt2b或mWnt2b和msFRP1(克隆18)的CHO细胞条件培养基中,来执行免疫沉淀实验。图2B显示了用抗mWnt2b抗体的免疫沉淀,随后为用抗hsFRP1抗体的印迹,导致在约35kDa处(图2B中的箭头)的sFRP1蛋白的检测,证实mWnt2b和msFRP1在表达mWnt2b和msFRP1两者的CHO细胞的条件培养基中物理相互作用。当用抗mWnt2b执行免疫沉淀并用抗hsFRP1印迹时,在仅表达mWnt1的CHO细胞的条件培养基中未检测到该35 kDa条带。
进一步的免疫沉淀实验证实,在表达mWnt2b和msFRP1两者的CHO条件培养基中,msFRP1的确与mWnt2b结合。通过将抗Wnt2b、抗hsFRP1、或无抗体对照加入等量的过表达单独的mWnt2b或mWnt2b和msFRP1(克隆18)的CHO细胞条件培养基中,来执行免疫沉淀实验。图2C显示了用抗hsFRP1抗体的免疫沉淀,随后为用抗mWnt2b抗体的印迹,导致在约42 kDa处(图2C中的箭头)的mWnt2b蛋白的检测,证实mWnt2b和msFRP1在表达mWnt2b和msFRP1两者的CHO细胞的条件培养基中物理相互作用。当用抗hsFRP1执行免疫沉淀并用抗mWnt1印迹时,在仅表达mWnt1的CHO细胞的条件培养基中未检测到该42 kDa mWnt1条带。
设计了进一步的实验,以理解为何在表达mWnt1和msFRP1两者的细胞的条件培养基中,观察到活性mWnt1的水平增加。当仅表达mWnt1的CHO细胞与HEK293 hFz4/hLRP5 Wnt报道细胞(在本文中也称为HEK293 Wnt报道细胞)共培养时,检测到Wnt报道分子活性的强激活,证实表达mWnt1的CHO细胞制备活性mWnt1蛋白(表1,第3行)。当将来自CHO mWnt1细胞的条件培养基加入HEK293 Wnt报道细胞中时,未检测到Wnt报道分子激活(表1,第4行)。这些数据提示活性mWnt1蛋白不在条件培养基中,而是位于CHO mWnt1细胞的细胞表面上。当使表达单独的msFRP1或msFRP5的CHO细胞与HEK293 Wnt报道细胞共培养时,未检测到活性(表1,第5行)。另外,当将来自表达msFRP1或msFRP5的CHO细胞的条件培养基加入HEK293Wnt报道细胞中时,未检测到活性(表1,第6行),提示如果没有mWnt1的共表达,sFRP1或sFRP5不能增强Wnt信号传导。当在加入HEK293 Wnt报道分子中之前,将CHO mWnt1的条件培养基和CHO msFRP1或msFRP5的条件培养基合并在一起时,未检测到活性(表1,第7行)。当将CHO mWnt1细胞的条件培养基加入表达CHO msFRP1或msFRP5的细胞中,并且在将条件培养基加入HEK293 Wnt报道细胞中之前培养过夜时,未检测到活性(表1,第8行)。当将CHOmsFRP1或msFRP5条件培养基加入表达CHO mWnt1的细胞中过夜,随后将这种条件培养基加入HEK293 Wnt报道细胞中时,检测到报道分子活性(表1,第9行)。当将重组hsFRP1或hsFRP5蛋白加入表达CHO mWnt1的细胞中过夜,随后将这种条件培养基加入HEK293 Wnt报道细胞中时,观察到Wnt报道分子的激活(表1,第11行)。最后,如果mWnt1和msFRP1或msFRP5两者在相同的CHO细胞中共表达,则条件培养基激活HEK293 Wnt报道分子(表1,第10行)。
表1.
处理 | 报道分子活性 | |
1 | CHO细胞(与报道细胞共培养) | - |
2 | CHO细胞条件培养基(CM) | - |
3 | CHO mWnt1细胞 | + |
4 | CHO mWnt1细胞CM | - |
5 | CHO mFRP1或msFRP5细胞 | - |
6 | CHO mFRP1或msFRP5细胞CM | - |
7 | CHO mWnt1 CM + CHO sFRP1/5 CM | - |
8 | CHO mWnt1 CM + CHO sFRP1/5细胞 | - |
9 | CHO mWnt1细胞与CHO sFRP1/5 CM培养过夜,然后将这种CM加入Wnt报道细胞中 | + |
10 | CHO mWnt1/sFRP1/5 CM(在相同细胞中表达mWnt1和sFRP1或sFRP5两者的稳定系) | + |
11 | 将sFRP1/5蛋白加入表达CHO mWnt1的细胞中过夜,然后将这种CM加入Wnt报道细胞中。 | + |
已观察到sFRP既充当Wnt活性的正调节剂,又充当负调节剂。最初,几个出版物证实Wnt活性的sFRP抑制(Leyns等人Cell 88:747-756(1997);Wang等人Cell 88:757-766(1997)),但以后的研究显示sFRP可以在sFRPs的生理剂量下加强Wnt信号传导(Mii等人Development 136:4083-4088(2009);Holly等人Dev. Biol. 388:192-204(2014))。为了测试sFRP的这种双相活性,将一系列剂量的重组sFRP1蛋白加入表达CHO mWnt1的细胞中24小时,随后为这种条件培养基的取出,以处理HEK293 Wnt报道细胞。观察到钟形曲线,其中相对较低剂量的sFRP导致mWnt1活性的增强,而较高浓度的sFRP1导致Wnt信号传导回复到基线水平(图3)。
CHO mWnt1/msFRP1表达细胞用于纯化mWnt1/msFRP1蛋白质复合物。将CHO mWnt1/msFRP1表达细胞从含有5% FBS的培养基转变为含有2% FBS的培养基,使得它们可以在悬浮液中生长。在培养9天后,分离CHO mWnt1/msFRP1条件培养基,并且通过离子交换色谱(图4A-C),随后为凝胶过滤色谱(图4D-E),来纯化mWnt1/msFRP1复合物。sFRP1与阳离子交换剂SP琼脂糖柱紧密结合,并且需要大于1摩尔(M)的NaCl浓度以洗脱蛋白质,而Wnt-1通常用小于0.3 M的NaCl浓度洗脱。如果sFRP1和Wnt-1不形成复合物,则sFRP和Wnt1应该在不同的峰处洗脱。然而,用抗Wnt-1抗体探测的蛋白质印迹(图4B)显示Wnt-1与sFRP1一起(图4C)在较晚的峰中从SP琼脂糖柱中共洗脱(图4A),提示在sFRP1和Wnt-1之间的复合物形成。用银染色检测到sFRP1,但Wnt-1几乎不可见,指示存在大量的游离sFRP1。由于sFPR1/Wnt-1复合物和游离sFRP之间的大小差异,凝胶过滤色谱成功地分开了这两个不同的群体。sFRP1/Wnt-1复合物在较早的峰中洗脱,而游离sFRP1在较晚的峰中洗脱(图4D)。在SDS-PAGE上用考马斯蓝染色在复合物(较早的)峰中检测到sFRP1和Wnt-1两者(图4E)。将纯化的sFRP1/Wnt-1复合物加载到SDS-PAGE上,并且用考马斯蓝染色。基于密度测定分析,观察到在37 kDa和52kDa处的两个条带,具有大致1:1的摩尔比(图4F)。通过蛋白质印迹的蛋白质复合物表征,在纯化的复合物样品中检测到mWnt1和msFRP1两者(图5)。纯化的复合物的N末端测序鉴定了小鼠Wnt-1和小鼠sFRP-1序列两者,而未检测到任何其它蛋白质序列。mWnt1和msFRP1在条件培养基中的结合提示,当纯化时,mWnt1和msFRP1在复合物中可能是结合的。
在HEK293 Wnt报道分子测定中测试了重组mWnt1/msFRP1纯化蛋白的活性。用重组msFRP1蛋白处理HEK293 Wnt报道细胞并未导致Wnt报道分子的激活高于未处理的背景水平(图6B)。用mWnt1/msFRP1蛋白质复合物处理HEK293 Wnt报道细胞的确导致了Wnt报道分子的强激活(图6A,图6B)。当将另外的纯化步骤加入mWnt1/msFRP1纯化程序中(图4)时,获得与CHAPS缓冲液中当前可用的最有力的纯化Wnt(Wnt3a)相比,甚至更有力的mWnt1/msFRP1复合物(图6D)。
这些数据证实,当sFRP与制备mWnt1的CHO细胞相互作用时,sFRP可以增加条件培养基中的活性mWnt1蛋白的量。为了解决sFRP诱导的Wnt释放是否对于mWnt1特定性,或者sFRP是否可以以类似的方式对其它Wnt家族成员起作用,用mWnt1、mWnt2b和人Wnt6(hWnt6)执行另外的sFRP共培养实验。
当使表达msFRP1的CHO细胞与表达mWnt2b的CHO细胞共培养,并且将所得到的条件培养基加入HEK293 Wnt报道细胞中时,检测到Wnt报道分子的激活(图7B)。有趣的是,CHOmWnt2b细胞与CHO msFRP5的共培养并不导致条件培养基中的Wnt活性(图7B),类似于来自CHO mWnt1和CHO msFRP5细胞的共培养物的条件培养基(图7A)。来自与CHO msFRP1和msFRP5共培养的表达hWnt6的HEK293的条件培养基激活HEK293 Wnt报道细胞(图7C),类似于用CHO mWnt1与CHO sFRP1和sFRP5的共培养实验可见的那种(图7A)。这些数据证实sFRP不仅可以增强mWnt1从表达mWnt1的细胞的细胞表面中的释放,而且sFRP还可以从表达mWnt2b或hWnt6的细胞的细胞表面中释放mWnt2b和hWnt6。这些数据还提示,sFRP可以用于释放与细胞膜结合的许多(如果不是全部的话)Wnt蛋白,以促进活性Wnt/sFRP复合物的纯化。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物的完整公开内容,以及电子可用材料(包括例如GenBank和RefSeq中的核苷酸序列提交,以及例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中的氨基酸序列提交,以及来自GenBank和RefSeq中注释的编码区的翻译)引入作为参考。在本申请的公开内容与引入本文作为参考的任何文件的公开内容之间存在任何不一致的情况下,应以本申请的公开内容为准。仅出于清楚理解的目的给出了前述详细描述和实例。不应从中理解不必要的限制。本发明并不限于所显示且描述的确切细节,对于本领域技术人员显而易见的变化包括在由权利要求限定的本发明内。
Claims (26)
1.一种分离的蛋白质复合物,其包含Wnt和sFRP。
2.权利要求1的分离的蛋白质复合物,其中所述Wnt包含Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和Wnt16中的一种或多种。
3.权利要求1或权利要求2的分离的蛋白质复合物,其中所述sFRP包含sFRP1、sFRP2、sFRP3、sFRP4和sFRP5中的一种或多种。
4.前述权利要求中任一项的分离的蛋白质复合物,其中所述Wnt包含活性Wnt。
5.权利要求4的分离的蛋白质复合物,其中如使用分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报道分子测定测量的,所述活性Wnt包含具有Wnt报道分子活性的Wnt。
6.前述权利要求中任一项的分离的蛋白质复合物,其中所述蛋白质复合物基本上不含去污剂。
7.前述权利要求中任一项的分离的蛋白质复合物,其中所述Wnt包含小鼠Wnt,并且所述sFRP包含小鼠sFRP。
8.前述权利要求中任一项的分离的蛋白质复合物,其中所述Wnt包含小鼠Wnt1,并且所述sFRP包含小鼠sFRP1。
9.前述权利要求中任一项的分离的蛋白质复合物,其中如使用HEK293 TCF9-SEAPhFz4/hLRP5 Wnt Reporter测定测量的,所述蛋白质复合物显示出小于500 ng/mL的50%有效剂量(ED50)。
10.前述权利要求中任一项的分离的蛋白质复合物,其中如使用HEK293 TCF9-SEAPhFz4/hLRP5 Wnt Reporter测定测量的,所述蛋白质复合物显示出小于100 ng/mL的50%有效剂量(ED50)。
11.一种包含Wnt的组合物,其中所述组合物基本上不含去污剂。
12.权利要求11的组合物,其中所述Wnt包含Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和Wnt16中的一种或多种。
13.权利要求11或权利要求12的组合物,其中所述Wnt包含活性Wnt。
14.权利要求13的组合物,其中如使用分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报道分子测定测量的,所述活性Wnt包含具有Wnt报道分子活性的Wnt。
15.权利要求11至14中任一项的组合物,其中所述组合物进一步包含sFRP。
16.权利要求15的组合物,其中所述sFRP包含sFRP1、sFRP2、sFRP3、sFRP4和sFRP5中的一种或多种。
17.权利要求15或权利要求16的组合物,其中所述Wnt包含小鼠Wnt,并且所述sFRP包含小鼠sFRP。
18.权利要求15至17中任一项的组合物,其中所述Wnt包含小鼠Wnt1,并且所述sFRP包含小鼠sFRP1。
19.权利要求11至18中任一项的组合物,其中如使用HEK293 TCF9-SEAP hFz4/hLRP5Wnt Reporter测定测量的,所述Wnt显示出小于100 ng/mL的50%有效剂量(ED50)。
20.权利要求11至19中任一项的组合物,所述组合物进一步包含R-Spondin 1、R-Spondin 2、R-Spondin 3、R-Spondin 4、脂质运载蛋白7或WIF1中的一种或多种。
21.一种方法,其包括:
过表达Wnt和sFRP;
形成包含Wnt和sFRP的复合物;和
分离Wnt,其中分离所述Wnt包括水性纯化程序。
22.权利要求21的方法,其中在分离所述Wnt之前形成包含Wnt和sFRP的复合物。
23.权利要求21或22的方法,其中分离所述Wnt不包括使用去污剂。
24.权利要求21或22的方法,其中分离所述Wnt包括从包含所述Wnt和所述sFRP的复合物中去除去污剂。
25.权利要求21至24中任一项的方法,其中所述Wnt包含Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和Wnt16中的一种或多种。
26.权利要求21至25中任一项的方法,其中所述sFRP包含sFRP1、sFRP2、sFRP3、sFRP4和sFRP5中的一种或多种。
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Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070072239A1 (en) * | 2005-09-26 | 2007-03-29 | Wyeth | Pharmaceutical compositions and methods of using secreted frizzled related protein |
US20120202749A1 (en) * | 2000-04-10 | 2012-08-09 | The University Of Massachusetts | Secreted frizzled related protein, sfrp, fragments and methods of use thereof |
US20140171356A1 (en) * | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Chemically immobilized wnt protein and methods of use |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2283160A4 (en) * | 2008-05-07 | 2012-01-04 | Wintherix Llc | METHOD FOR IDENTIFYING WNT SIGNALING MODULATING COMPOUNDS IN CANCER CELLS |
WO2014194267A2 (en) * | 2013-05-30 | 2014-12-04 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Wnt peptide pharmacophore compositions and methods of use thereof |
CN109072179B (zh) * | 2016-02-18 | 2022-04-01 | 学校法人庆应义塾 | 细胞培养基、培养方法以及类器官 |
US11649285B2 (en) * | 2016-08-03 | 2023-05-16 | Bio-Techne Corporation | Identification of VSIG3/VISTA as a novel immune checkpoint and use thereof for immunotherapy |
-
2018
- 2018-10-09 KR KR1020207012870A patent/KR20200061398A/ko active IP Right Grant
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-
2021
- 2021-06-18 US US17/351,452 patent/US20210380649A1/en not_active Abandoned
-
2023
- 2023-09-08 JP JP2023146057A patent/JP2024001013A/ja active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120202749A1 (en) * | 2000-04-10 | 2012-08-09 | The University Of Massachusetts | Secreted frizzled related protein, sfrp, fragments and methods of use thereof |
US20070072239A1 (en) * | 2005-09-26 | 2007-03-29 | Wyeth | Pharmaceutical compositions and methods of using secreted frizzled related protein |
US20140171356A1 (en) * | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Chemically immobilized wnt protein and methods of use |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
刘曼等: "ANP及其受体NPR-A与肿瘤关系的研究进展", 《临床与实验病理学杂志》, vol. 33, no. 8, pages 900 - 904 * |
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