KR20200043711A - 대황 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질 개선용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 대황 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질 개선용 조성물에 관한 것으로, 상기 대황 줄기 에탄올 추출물은 세포독성 없이 농도의존적으로 마이오스타틴과 결합하여 마이오스타틴과 수용체의 결합을 방해함으로써 항 마이오스타틴 효과를 나타내는 것이 확인되었으며, 상기 대황 줄기 에탄올 추출물의 60% 에탄올 분획물에서도 항 마이오스타틴 효과가 우수한 것으로 확인됨에 따라, 상기 대황 줄기 에탄올 추출물 및 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 근육질 개선용 조성물 및 마이오스타틴 관련 질환 예방 또는 개선용 조성물로 제공될 수 있다.
Description
본 발명은 대황 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질 개선용 조성물에 관한 것이다.
사람의 근육은 40세 이후부터 매년 1% 이상씩 감소하여 80세가 되면 최대 근육량의 50% 수준이 감소되며, 노년의 근육 감소는 전반적인 신체기능을 떨어뜨리는 가장 중요한 요소로 인식되고 있다.
노화가 진행될수록 근육과 지방의 함량, 골격 왜곡 등 체형이 변화되는 것을 인지하게 되는데, 노년기 근 감소에 의한 비만 유병률은 전 세계적으로 30% 이상 수준에서 지속적인 증가 추세를 보이고 있다. 또한, 인슐린 분비 이상인 경우 세포에 에너지를 제대로 공급하지 못해 근육발달장애를 일으킬 수 있어, 일반인보다 당뇨병 환자에게 근감소증이 증가한다. 이러한 근감소증은 골다공증, 인슐린저항성 및 관절염과 같은 노인성 만성질환과도 밀접하게 관계가 있는 것으로 알려져있다.
또한, 근 감소에 의한 또 다른 질병인 근 위축은 근육량의 점진적 감소에 의하여 발생하는 것으로, 비활동, 산화적 스트레스, 만성 염증 등에 의해 단백질 분해가 합성보다 더 일어날 때 발생되며, 근육의 약화 및 퇴행이 나타난다. 이러한 근감소의 치료법으로 미토콘드리아 생성 증가, 근육 단백질 분해억제, 항염제 등이 제시되고 있으나 뚜렷한 치료약이 없는 실정이다.
최근 많은 사람들은 단백질 보충제를 대안으로 선택하고 있지만 단백질 보충제는 단백질 과다 섭취의 원인이 되어 부작용이 나타날 가능성이 높으며, 더욱이 신장질환이 있는 경우 고단백질 식이를 할 수 없으며 노화에 따라 신장 기능 또한 감소되므로, 근감소증 예방 및 개선을 위한 새로운 대안이 필요한 실정이다.
마이오스타틴 (Myostatin)은 형질전화 생장인자-β (TGF-β, Transforming growth factor-β) 슈퍼패밀리 중의 하나로 근육성장 및 분화를 억제하는 기능을 가진 단백질이다. 이러한 마이오스타틴은 TGF 작용기전과 유사하게 세포표면에 존재하는 세린/트레오닌 키나아제 (serin/threonine kinase) 활성도를 가진 특이 수용체와 결합하여 SMAD 신호전달계를 활성화시켜 핵에서 근육의 추가적인 합성을 방해하는 역할을 하기 때문에 마이오스타틴의 과다한 방출은 핵의 세포분열을 방해하여 근육의 생성을 억제하는 효과를 나타낸다.
대황은 다시마목 감태과에 속하는 갈조류로, 주로 일본 남해안에 분포하며 우리나라의 경우 경북 영덕 및 울릉도, 독도 연안에 분포하며, 주로 암반에 군락을 이루어 서식하는 다년생 해조류이다. 이러한 대황은 요오드와 칼륨이 다량 함유되어 있으며 예로부터 다시마 대용으로 이용되어 왔다.
대황이 함유하고 있는 laminaran은 혈청지질을 저하시키는 것으로 보고되어 있으며, 대황이 함유하고 있는 다량의 생리활성 물질들은 항산화, 항고지혈증 및 항당뇨 기능을 나타내는 것으로 알려져 있다. 또한, 조골세포의 증식, 분화 유도와 석회화능을 촉진하며, 파골세포의 증식과 분화를 억제하는 것으로 알려져 있으나 대황의 근력증가 효과에 대해서는 아직까지 전혀 보고된 바가 없다.
본 발명은 생체에 안전하고 우수한 근육질 개선효과를 나타내는 대황 추출물을 근육질 개선용 조성물로 제공하고자 한다.
본 발명은 대황 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명은 대황 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질 개선용 사료첨가제를 제공한다.
본 발명은 대황 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 마이오스타틴 관련 질환 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다.
본 발명은 대황 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 마이오스타틴 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 대황 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 마이오스타틴 관련 질환 예방 또는 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 대황 줄기 에탄올 추출물은 세포독성 없이 농도의존적으로 마이오스타틴과 결합하여 마이오스타틴과 수용체의 결합을 방해함으로써 항 마이오스타틴 효과를 나타내는 것이 확인되었으며, 상기 대황 줄기 에탄올 추출물의 60% 에탄올 분획물에서도 항 마이오스타틴 효과가 우수한 것으로 확인됨에 따라, 상기 대황 줄기 에탄올 추출물 및 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 근육질 개선용 조성물 및 마이오스타틴 관련 질환 예방 또는 개선용 조성물로 제공될 수 있다.
도 1은 대황 에탄올 추출물을 준비과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 대황 에탄올 추출물에서 항-MSTN 활성을 확인한 결과로, 도 2(A)는 대황 뿌리 추출물(EBRE; Eisenia bicyclis root extract) 결과이며, 도 2(B)는 대황 줄기 에탄올 추출물 (EBSE; Eisenia bicyclis stem extract)의 결과이며, 도 2(C)는 대황 잎 추출물 (EBLE; Eisenia bicyclis leaf extract)의 결과로, 오차막대는 표준오차를 나타낸다(n=3).
도 3은 대황 줄기 에탄올 추출물(EBSE)의 세포독성, 항-액티빈 A 및 항-GDF11 활성을 확인한 결과로, 도 3(A)는 세포독성을 확인한 결과이며, 도 3(B)는 항-액티빈 A 활성을 확인한 결과이며, 도 3(C)는 항-GDF11 활성을 확인한 결과이다.
도 4는 HepG2 세포에서 대황 줄기 에탄올 추출물(EBSE)이 Smad 신호과정에서 마이오스타틴 신호를 차단하는 효과를 확인한 웨스턴 블롯 분석결과로, 레인 1은 아무것도 처리되지 않은 대조군이며, 레인 2는 10 nM MSTN이 처리된 실험군이며, 레인 3은 10 nM MSTN 및 10 μM SB431542이 함께 처리된 실험군이며, 레인 4는 10 nM MSTN 및 EBSE 95 μg/ml이 처리된 실험군이며, 레인 5는 10 nM MSTN 및 EBSE 0.03 μg/ml이 처리된 실험군이다.
도 5는 대황 줄기 에탄올 추출물(EBSE)의 유기용매 분획물 준비과정을 나타내는 모식도이다.
도 6은 대황 줄기 에탄올 추출물(EBSE)로부터 분획된 유기 용매 분획물의 항 마이오스타틴(MSTN) 효과를 확인한 결과로, 도 6(A)는 물 분획물, 도 6(B)는 헥산 분획물, 도 6(C)는 클로로포름 분획물, 도 6(D)는 60% 에탄올 분획물의 결과이며, 오차막대는 표준오차를 나타낸다(n=3).
도 2는 대황 에탄올 추출물에서 항-MSTN 활성을 확인한 결과로, 도 2(A)는 대황 뿌리 추출물(EBRE; Eisenia bicyclis root extract) 결과이며, 도 2(B)는 대황 줄기 에탄올 추출물 (EBSE; Eisenia bicyclis stem extract)의 결과이며, 도 2(C)는 대황 잎 추출물 (EBLE; Eisenia bicyclis leaf extract)의 결과로, 오차막대는 표준오차를 나타낸다(n=3).
도 3은 대황 줄기 에탄올 추출물(EBSE)의 세포독성, 항-액티빈 A 및 항-GDF11 활성을 확인한 결과로, 도 3(A)는 세포독성을 확인한 결과이며, 도 3(B)는 항-액티빈 A 활성을 확인한 결과이며, 도 3(C)는 항-GDF11 활성을 확인한 결과이다.
도 4는 HepG2 세포에서 대황 줄기 에탄올 추출물(EBSE)이 Smad 신호과정에서 마이오스타틴 신호를 차단하는 효과를 확인한 웨스턴 블롯 분석결과로, 레인 1은 아무것도 처리되지 않은 대조군이며, 레인 2는 10 nM MSTN이 처리된 실험군이며, 레인 3은 10 nM MSTN 및 10 μM SB431542이 함께 처리된 실험군이며, 레인 4는 10 nM MSTN 및 EBSE 95 μg/ml이 처리된 실험군이며, 레인 5는 10 nM MSTN 및 EBSE 0.03 μg/ml이 처리된 실험군이다.
도 5는 대황 줄기 에탄올 추출물(EBSE)의 유기용매 분획물 준비과정을 나타내는 모식도이다.
도 6은 대황 줄기 에탄올 추출물(EBSE)로부터 분획된 유기 용매 분획물의 항 마이오스타틴(MSTN) 효과를 확인한 결과로, 도 6(A)는 물 분획물, 도 6(B)는 헥산 분획물, 도 6(C)는 클로로포름 분획물, 도 6(D)는 60% 에탄올 분획물의 결과이며, 오차막대는 표준오차를 나타낸다(n=3).
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 대황의 다양한 생리활성을 연구하던 중 대황 추출물이 항 마이오스타틴 활성을 나타내는 것을 확인함에 따라, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 대황 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질 개선용 조성물을 제공할 수 있다.
보다 상세하게는 상기 대황 추출물은 뿌리, 줄기, 잎 모든 부위를 용매를 이용하여 추출한 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 대황 줄기 부위를 추출한 것일 수 있다.
상기 대황 추출물은 물, C1 내지 C4의 알콜 또는 이들의 혼합용매로 추출된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 에탄올 추출물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 분획물은 에탄올 수용액 분획물일 수 있다. 보다 상세하게는 대황 줄기 에탄올 추출물을 클로로포름과 물 혼합용액을 이용하여 분획하고 추출하여 얻은 클로로포름 분획물에 90% 에탄올과 헥산 혼합용액을 이용하여 분획하고 추출하여 얻은 90% 에탄올 분획물에 클로로포름과 60% 에탄올 혼합액을 이용하여 분획하고 추출하여 수득한 60% 에탄올 분획물일 수 있다.
상기 대황 추출물 또는 이의 분획물은 항 마이오스타틴 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 대황 줄기 에탄올 추출물(ERSE)이 마이오스타틴 신호전달 경로에 미치는 영향을 확인하기 위해, Smad2 전사인자의 인산화 정도를 웨스턴 블롯 분석으로 확인한 결과, 도 4와 같이 마이오스타틴만 처리된 실험군에서는 마이오스타틴의 신호가 전달되어 인산화된 Samd2의 발현이 증가된 반면, 마이오스타틴과 ERSE이 동시에 처리된 실험군에서는 SB431542이 처리된 양성대조군과 동일하게 ERSE이 마이오스타틴 신호를 억제하여 Samd2의 인산화가 억제된 것이 확인되었으며, 낮은 농도의 ERSE가 처리된 실험군에서는 마이오스타틴 신호를 완전히 억제하지 못하여 Samd2의 인산화가 확인되었다.
상기 결과로부터 ERSE는 농도의존적으로 마이오스타틴과 결합하여 마이오스타틴이 수용체 결합을 방해함으로써 Samd2 신호 전달을 억제하는 것이 확인되었다.
따라서, 본 발명은 대황 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질 개선용 사료첨가제를 제공할 수 있다.
상기 사료첨가제는 가축의 육질을 개선하기 위한 가축용으로 사용될 수 있으며, 적합한 동물로서는 산란계 닭, 오리, 칠면조 및 거위등의 가금류, 소, 말, 염소 및 양 등의 반추동물, 돼지류, 토끼 등의 설치류 및 어류를 포함하여 매우 광범위하게 사용될 수 있다.
본 발명의 사료첨가제에 포함되는 물질은 대황 추출물 또는 이의 분획물 외에 통상의 가축용 사료첨가제에 사용되는 물질이라면 특별히 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 대황 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 마이오스타틴 관련 질환 예방 또는 개선용 건강식품을 제공할 수 있다.
상기 마이오스타틴 관련 질환은 근육 감소(muscle wasting) 질환, 퇴행성 골 질환, 성기능 항진증(hypogonadism) 및 악액질(cachexia)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 근육 감소 질환은 근이영양증(muscular dystrophy), 경직성 척추 증후군(rigid spine syndrome), 근육-눈-뇌병(muscle-eye-brain disease), 근위축성 측삭경화증(루게릭병, amyotrophic lateral sclerosis), 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease), 만성 염증성 신경증(chronic inflammatory neuropathy) 및 말단근병증(distal myopathy)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 퇴행성 골 질환은 골다공증일 수 있다.
상기 건강식품은 상기 대황 추출물 또는 이의 분획물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강식품에 함유된 화합물의 유효용량은 상기 치료제의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제등을 들 수 있다.
본 발명은 대황 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 마이오스타틴 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 대황 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 마이오스타틴 관련 질환 예방 또는 치료용 수의학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 대황 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 마이오스타틴 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 대황 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 마이오스타틴 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
상기 대황 추출물 또는 이의 분획물의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 대황 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하며, 상기 대황 추출물 또는 이의 분획물은 생체 외 (in vitro)에서 세포의 마이오스타틴 활성을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 마이오스타틴 활성 억제용 시약조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 생체 외 (in vitro)에서 대황 추출물 또는 이의 분획물을 세포에 처리하는 단계;를 포함하는 마이오스타틴 활성 억제 방법을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<
실시예
1>
대황
추출물 준비
건조된 대황(울릉도 1~2 년생)을 뿌리, 줄기, 잎 부위별로 에탄올을 이용하여 도 1과 같은 과정으로 추출하였다.
먼저, 대황 에탄올 추출물은 부위별 건조된 대황 20mg에 100% 에탄올 1ml을 첨가하여 24시간 동안 암실에서 추출하였다. 회전 감압농축기를 이용하여 추출된 시료에서 용매를 제거하고 4000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다.
pore size 0.2 μM 필터를 이용하여 상등액 내 입자를 완전히 제거한 후 원심회전 농축기를 이용하여 시료의 농도를 측정하였다.
대황 추출물은 3회 반복추출되었으며, 각 부위별 추출 수율은 뿌리 1.2%, 줄기 3.75%, 잎 4.14%로 확인되었다.
<
실시예
2>
대황
부위별
항마이오스타틴
활성 확인
루시퍼레이즈 분석을 수행하여 세포수준에서 항 마이오스타틴 활성을 확인하였다.
HEK293 세포를 96 웰 플레이트에 웰 당 2.0×104 세포로 분주하고 10% 태아소혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% 겐타마이신(geneticine)이 포함된 DMEM 배지를 이용하여 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
24시간 배양 후, FBS가 제거된 DMEM 배지로 교체하고, 1 nM 재조합 마이오스타틴 (R&D system, USA)과 대황 뿌리 (EBRE), 대황 줄기 (ERSE), 대황 잎 (EBLE)을 0.1, 1, 10 및 100 μg/ml 농도별로 처리하여 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다.
24시간 배양 후 배지를 제거하고 DMEM 배지 65 μl와 시약 (Bright-Glo luciferase assay system, USA) 65 μl를 처리하여 마이크로플레이트 발광측정기(microplate luminometer)에서 발광을 확인하였다.
확인된 수치는 양성 대조군과 음성 대조군의 수치를 이용하여 하기 계산식 1로 계산하여 항마이오스타틴 활성(%)으로 나타내었다.
[계산식 1]
항 마이오스타틴 활성(%) = [(Firefly RLU of 1nM Myostatin (positive control) - Firefly RLU of the group treated with the extracts) × 100) / (Firefly RLU of 1nM Myostatin (positive control) - Firefly RLU of no treatment group (negative group)]
그 결과, 도 2와 같이 1nM 마이오스타틴에 대한 대황 뿌리(EBRE)의 IC50 값은 0.113 μg/ml이었으며, 대황 줄기(EBSE)의 IC50 값은 0.176 μg/ml이었으며, 대황 잎(EBLE)의 IC50 값은 2.541 μg/ml로 나타났다.
대황의 부위별 항마이오스타틴의 IC50 값 및 추출수율, 바이오매스 등으로 보아 줄기부위가 가장 적합한 것으로 판단되었다.
<
실시예
3>
대황
추출물의 세포독성 확인
대황 줄기 에탄올 추출물 (EBSE)의 세포독성을 확인하기 위해, HSK293 세포를 96 웰 플레이트에 웰 당 1×104 세포로 분주하여 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였으며, 10% 태아소혈청(FBS)와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지를 사용하였다.
24시간 배양 후 EBSE를 0.1, 1, 10 및 100 μg/ml 농도로 처리하여 5% CO2 배양기에서 12시간 추가 배양한 후, WST 시약 (DaeilLab, Korea) 10 μl를 1시간 동안 처리하여 반응시키고 415 nm에서 흡광도를 측정한 후, 하기 계산식 2를 이용하여 세포독성 값을 나타내었다.
양성 대조군은 어떠한 처리도 하지 않은 세포군을 이용하였으며, H2O2 처리군은 음성 대조군으로 세포사멸을 유도하였다.
그 결과, 도 3 A와 같이 EBSE은 HEK293 세포에서 100 μg/ml 이하의 농도에서 세포독성이 확인되지 않았다.
[계산식 2]
세포 생존율(Cell viability; %) = [(absorbance value of positive control-absorbance value of the group treated with extracts) × 100 / (absorbance value of positive control - absorbance value of negative control)].
<
실시예
4>
대황
추출물의 항
액티빈
A 및 항
GDF
11 활성 확인
루시퍼레이즈 분석을 수행하여 세포수준에서 항 마이오스타틴 활성을 확인하였다.
HEK293 세포를 96 웰 플레이트에 웰 당 2.0×104 세포로 분주하고 10% 태아소혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% 겐타마이신(geneticine)이 포함된 DMEM 배지를 이용하여 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
24시간 배양 후 FBS가 포함되지 않은 DMEM 배지로 교체하고, 1nM 재조합 마이오스타틴(R&D system, USA)과 대황 줄기 에탄올 추출물(EBSE)을 0.1, 1 및 10 μg/ml로 처리한 후 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다.
24시간 배양 후 배지를 제거하고 DMEM 배지 65 μl와 시약(Bright-Glo luciferase assay system, USA) 65 μl을 처리하여 마이크로플레이트 발광측정기(microplate luminometer)에서 발광을 측정하였다.
측정된 수치는 양성 대조군과 음성 대조군의 수치 및 하기 계산식 3을 이용하여 항 액티빈 A 및 항 GDF11 활성(%)으로 나타내었다.
[계산식 3]
항 액티빈 A와 항 GDF11 활성 (%) = [(Firefly RLU of 1nM ligand (positive control) - Firefly RLU of the group treated with the extracts) × 100) / (Firefly RLU of 1nM ligand (positive control) - Firefly RLU of no treatment group (negative group)]
그 결과, 도 3B 및 도 3C와 같이 1nM 항 액티빈 A에 대한 EBSE의 IC50 값은 202.85 μg/ml이었으며, 같은 슈퍼패밀리에 속하는 1nM GDF11에 대한 EBSE의 IC50 값은 4.26 μg/ml로 확인되었다.
상기 결과로부터 대황 줄기 에탄올 추출물(EBSE)은 세포독성 없이 마이오스타틴을 특이적으로 억제하는 것이 확인되었다.
<
실시예
5>
대황
추출물에 의한
마이오스타틴
신호전달 억제 확인
대황 줄기 에탄올 추출물(EBSE)가 마이오스타틴 신호전달 경로에 미치는 영향을 확인해 보기 위해 웨스턴 블롯을 통해 Smad2 전사인자의 인산화 정도를 확인하였다.
HepG2 세포는 DMEM 배지 (10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)에서 6 웰 플레이트에 웰 당 2.0×105 세포로 분주하여 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
24시간 후, FBS가 제거된 DMEM으로 배지를 교체하였고, 4시간 뒤 10 nM 재조합 마이오스타틴과 95 μg/ml의 EBSE와 0.03 μg/ml의 EBSE를 각각 30분간 처리하였다 (레인 4 : 95 μg/ml의 EBSE, 레인 5 : 0.03 μg/ml의 EBSE).
30분 처리 후, 세포는 PBS로 2회 세척하고 리파 버퍼 [RIPA buffer; 20 mM Tris-HCl, pH7.5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40, 1% 소듐 디옥시콜레이트, 2.5 mM 피로인산나트륨(sodium pyrophosphate), 1 mM β-글리세로포스파트(glycerophosphate), 1 mM NA3VO4, 1 μg/ml 류펩틴(leupeptin; cell signaling, USA)]와 프로테아제 억제제 칵테일, 포스파타아제 억제제 칵테일(phosphatase inhibitor cocktail; Roche, USA)을 처리하였다.
수집한 세포는 초음파 분쇄기를 이용하여 파쇄하였으며 4℃, 12,000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 상등액을 얻었다. 상등액은 BCA assay를 통해 단백질 정량을 하였고, 10% 폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동하였다.
전기영동 후 PVDF 막에 옮기고 5% BSA 또는 5% 탈지유를 이용하여 실온에서 3시간 동안 블로킹하였다. 상기 막을 TBS-T 버퍼로 상온에서 10분간 3회 세척하고 1차 항체 [Samd2(monoclonal antibody), P-Smad2(monoclonal antibody), β-actin(polyclonal antibody) (Cell signaling, USA)]을 4℃에서 12시간 동안 반응 시켰다. 이후 TBS-T 버퍼를 이용하여 실온에서 10분간 3회 세척하고 2차 항체 [β-액틴의 항-래빗 IgG, Smad2 및 p-Smad2 (Cell signaling, USA)의 항-마우스 IgG]를 상온에서 3시간 동안 반응시켰다.
반응 후 막을 TBS-T 버퍼로 상온에서 10분간 3회 세척한 후 ECL western blotting substrate (Thermo Scientific, USA)를 이용하여 x-ray 필름에 감광하였다.
그 결과, 도 4와 같이 EBSE가 농도의존적으로 마이오스타틴 신호 전달을 방해함으로써 Smad2 전사인자의 인산화를 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 보다 상세하게 마이오스타틴만 처리된 레인 2에서는 마이오스타틴의 신호가 전달이 되어 인산화된 smad2 (p-smad2)의 발현량이 높아진 것을 확인할 수 있다. 또한, 양성 대조군으로 마이오스타틴과 SB431542 (마이오스타틴이 결합하는 수용체의 인산화를 억제하는 small molecule)를 동시에 처리한 레인 3에서는 마이오스타틴에 의해 높아져야 할 인산화된 Smad2 발현량 (p-smad2)이 높아지지 않는 것이 확인됨에 따라, 마이오스타틴의 신호가 SB431542에 의해서 억제되어 Smad2로 신호가 전달이 되지 않아 인산화가 일어나지 않은 것을 확인할 수 있었다.
레인 4는 마이오스타틴과 EBSE (95 μg/ml)을 동시에 처리한 실험군으로, SB431542를 처리한 레인 3과 같이 추출물이 마이오스타틴 신호를 완전히 억제함으로써 smad2의 인산화 (p-smad2)가 억제되는 것이 확인되었다.
한편, 마이오스타틴과 낮은 농도의 EBSE (0.03 ug/ml)를 동시에 처리한 레인 5에서는 마이오스타틴의 신호를 완전히 억제하지 못하여 smad2가 인산화된 것 (p-smad2)을 확인하였다.
상기 결과로부터 EBSE가 농도의존적으로 마이오스타틴과 결합하여 마이오스타틴이 수용체에 결합하는 것을 방해함으로써 Smad2에 신호를 전달하지 못하게 하여 Smad2의 인산화를 억제시키는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 루시퍼레이즈 분석과 웨스턴 블롯 분석 결과를 종합하면, 대황 줄기 에탄올 추출물이 마이오스타틴과 직접 결합하여 마이오스타틴의 수용체와 결합을 방해함으로써, 신호가 Smad2로 전달되지 못하여 Smad2의 인산화가 억제되는 것이 확인되었다.
<
실시예
6>
대황
추출물
유기용매
분획 및 이의 활성 확인
1.
대황
추출물
유기용매
분획물
준비
대황 줄기 에탄올 추출물(EBSE)에서 항마이오스타틴 활성을 가진 유효물질을 분리정제하기 위하여 다양한 유기용매를 이용하여 도 5와 같은 과정으로 분리하였다.
건조된 대황 줄기를 20 mg/ml의 농도로 에탄올 추출을 하였다. 상기 대황 줄기 에탄올 추출물(EBSE)은 회전감압농축기를 이용하여 용매를 제거하고 클로로포름(chloroform)과 물 혼합액 (1:1, v:v)을 첨가하여 분별 깔데기에서 분획하였다.
각각 회전감압 농축기를 이용하여 클로로포름 분획 층과 물 분획 층에서 용매를 제거하고, 물 분획층은 사용하기 전까지 -20℃에서 보관하였다.
클로로포름 분획 층에 90% 에탄올과 헥산 혼합액 (1:1, v:v)을 첨가하여 분별깔데기에서 분획하였다.
각각 회전감압 농축기로 90% 에탄올 분획 층과 헥산 분획 층에서 용매를 제거하였고, 헥산 분획층은 사용하기 전까지 -20℃에서 보관하였다.
90% 에탄올 분획 층에 클로로포름과 60% 에탄올 혼합액 (1:1, v:v)을 첨가하여 분별 깔데기에서 분획하였다.
클로로포름 분획 층과 60% 에탄올 분획층은 회전 감압농축기를 이용하여 용매를 제거하였다. 총 4개의 분획 층 ( Water, hexane, chloroform, 60% ethanol)을 에탄올로 용리하고 진공 원심농축기에서 용매를 제거하여 농도를 측정하였다.
2. 항
마이오스타틴
활성 확인
세포수준에서 항마이오스타틴 활성을 루시페레이즈 분석 시스템을 통해 확인하였다. HEK293 세포는 DMEM 배지 (10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, 1% geneticine)에서 96 웰 플레이트에 웰 당 2.0×104 세포로 분주하여 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
24시간 후, FBS가 제거된 DMEM로 배지를 교체하고, 1 nM 재조합 마이오스타틴 (R&D system, USA)과 EBSE의 물 분획 층, EBSE의 헥산 분획 층, EBSE의 클로로포름 분획 층, EBSE의 60% 에탄올 분획 층을 각각 농도별 (10, 1 및 0.1 μg/ml)로 처리하여 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 배지를 제거하고 65 μl의 DMEM 배지와 65 μl의 시약(Bright-Glo luciferase assay system, USA)을 처리하여 microplate luminometer에서 발광을 측정하였다.
측정된 수치는 양성 대조군과 음성 대조군의 수치를 이용하여 상기 계산식 1을 이용하여 항마이오스타틴 활성을 계산하고 백분율로 나타내었다.
그 결과, 도 6과 같이 60% 에탄올 분획 층에서 10 μg/ml 일 때 약 60%의 항마이오스타틴 활성이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과부터 EBSE에서 항마이오스타틴 활성을 나타내는 물질은 60% 에탄올 분획 층에 다량 존재하는 것이 확인되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (10)
- 대황 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질 개선용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 대황 추출물은 물, C1 내지 C4의 알콜 또는 이들의 혼합용매로 추출된 것을 특징으로 하는 근육질 개선용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 분획물은 에탄올 수용액 분획물인 것을 특징으로 하는 근육질 개선용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 대황 추출물 또는 이의 분획물은 항 마이오스타틴 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 근육질 개선용 조성물.
- 대황 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질 개선용 사료첨가제.
- 대황 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 마이오스타틴 관련 질환 예방 또는 개선용 건강식품.
- 청구항 6에 있어서, 상기 마이오스타틴 관련 질환은 근육 감소(muscle wasting) 질환, 퇴행성 골 질환, 성기능 항진증(hypogonadism) 및 악액질(cachexia)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 마이오스타틴 관련 질환 예방 또는 개선용 건강식품.
- 청구항 7에 있어서, 상기 근육 감소 질환은 근이영양증(muscular dystrophy), 경직성 척추 증후군(rigid spine syndrome), 근육-눈-뇌병(muscle-eye-brain disease), 근위축성 측삭경화증(루게릭병, amyotrophic lateral sclerosis), 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease), 만성 염증성 신경증(chronic inflammatory neuropathy) 및 말단근병증(distal myopathy)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 마이오스타틴 관련 질환 예방 또는 개선용 건강식품.
- 대황 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 마이오스타틴 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 대황 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 마이오스타틴 관련 질환 예방 또는 치료용 수의학적 조성물.
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