KR20200026123A - 세포 내에서 nag-1 단백질의 이동을 조절하는 펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포 내에서 NAG-1 단백질의 이동을 조절하는 펩티드 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 펩티드는 세포질에 NAG-1 단백질의 축적을 증가시켜 항암, 항비만, 항염증 치료에 유용한 NAG-1 단백질의 작용을 극대화시킬 수 있다.

Description

세포 내에서 NAG-1 단백질의 이동을 조절하는 펩티드 및 이의 용도{Peptide controlling migration of NAG-1 protein in cell and uses thereof}

본 발명은 세포 내에서 NAG-1 단백질의 이동을 조절하는 펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다.

단백질 중에서 세포 내 위치에 따라 다양한 기능을 나타낼 때 "부가적 기능 단백질(moonlighting protein)"이라 명명되는데, 기존의 전통적인 세포연구에서 더 나아가 부가적 기능 단백질인 NAG-1(또는 NAG-1/GDF15라 함)을 이용하여 단백질이 어떻게 핵 안으로 들어가는지와 어떻게 세포 밖으로 나가는지에 대한 새로운 기작을 통하여, 이런 이동 경로를 통해서 각 세포 내 위치에 따른 생리학적 기능을 밝히는 연구가 필요하다.

NAG-1(nonsteroidal anti-inflammatory drug-activated gene-1)은 염기서열 분석상 TGF-β superfamily 사이토카인을 특징짓는 7-시스테인 영역(도메인)과 15-29%의 동일성을 보여 TGF-β superfamily에 속하는 사이토카인으로, 대식세포 억제 사이토카인 1(Macrophage inhibitory cytokine 1; MIC-1), 성장 분화 인자 15(growth differentiation factor 15; GDF15), 전립선-유래 인자(prostate-derived factor; PDF), 태반 뼈 형성 단백질(placental bone morphogenetic protein; PLAB) 및 태반 전환 성장 인자(placental transforming growth factor-β; PTGF-β)로도 알려져 있다. NAG-1 단백질은 다른 TGF-β 단백질처럼 많은 생물학적 활성기능이 있다고 알려져 있으며, 암, 염증 또는 비만과 같은 성인병의 진행과 예방에 영향을 미친다고 알려져 있다. NAG-1은 세포 안에서 308개의 아미노산으로 이루어진 pro-NAG-1으로 합성되고, 소포(vesicle)를 이용하여 세포 밖으로 분비되는데, 이때 특정 이황화 결합에 의해 C-터미널 112개의 아미노산이 합체를 형성한다. 형성된 C-터미널 이합체와 pro-NAG-1 이합체는 세포 밖에서 여러 가지 작용을 하는데, 정확한 작용기작은 여러 논문에서 상반된 결과를 보이는 바, 아마도 세포 내 발현과 수용체 유무에 따라 서로 다른 작용을 하는 것으로 판단된다. 최근에는 분비 단백질인 NAG-1이 핵에서도 발현이 되고, 전사(transcription)를 조절하는 등의 다양한 작용기작에 이용되고 있어, 이러한 NAG-1의 다양한 기능에 대한 연구가 요구되고 있다.

본 발명에 따르면, NAG-1이 세포질에서 만들어진 후에 핵으로 이동한 후, 다시 세포 밖으로 이동하는 역동적인 이동 패턴을 보여주는데, 각각의 세포 내 위치에 따라 NAG-1의 기능이 달라지는 것을 알 수 있었다. 세포이동에 중요한 핵 단백질인 CRM1(chromosome region maintenance 1)과 같은 핵 수용체 조절기작과 NAG-1의 이동경로를 연구함으로써 암, 염증, 비만 등 연구에 기여할 것이다.

한편, 한국등록특허 제1998029호에는 'MIC-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도'가 개시되어 있으며, 한국공개특허 제2010-0114259호에는 '6,7-디하이드록시-2,4-디메톡시 페난트렌을 함유하는 암세포 증식억제 활성 조성물'에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 '세포 내에서 NAG-1 단백질의 이동을 조절하는 펩티드 및 이의 용도'에 대해 아직까지 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 NAG-1(nonsteroidal anti-inflammatory drug-activated gene-1) 단백질의 핵 위치 시그널을 모방하여 제작한 NLS(nuclear localization signal) 펩티드를 대장암 세포에 처리하였을 때, NAG-1 단백질의 핵으로의 이행이 저해되는 것을 관찰하였으며, 대장암 세포의 미토콘드리아 막 전위 손실이 확인되어 대장암 세포의 세포사멸을 유도할 수 있음 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, NAG-1(nonsteroidal anti-inflammatory drug-activated gene-1) 단백질의 핵으로의 이동을 저해하는 NLS(nuclear localization signal) 펩티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 NLS 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 NLS 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 과발현시키는 단계를 포함하는 NLS 펩티드의 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 NLS 펩티드를 유효성분으로 함유하는 암, 염증성 질환 또는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 NAG-1 단백질의 핵으로의 이동을 저해하는 NLS 펩티드를 제공함으로써 세포질에 NAG-1 단백질의 축적을 증가시켜 항암, 항비만 및 항염증 치료에 유용한 NAG-1 단백질의 작용을 극대화시킬 수 있다.

도 1은 NAG-1(nonsteroidal anti-inflammatory drug-activated gene-1) 단백질의 핵 위치 시그널(nuclear localization signal)을 모방하여 제작한 NLS 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. A는 N-말단에 아세틸화(acetylation) 및 C-말단에 아미노화(amidation) 안정성을 높인 NLS 펩티드를 나타내며, B는 N-말단에 아세틸화 대신에 FITC(fluorescein isothiocyanate)를 태깅한 NLS 펩티드를 나타낸다.
도 2는 PULSin 전달 시약을 이용하여 NLS 펩티드를 HCT116 세포에 트랜스펙션한 후, 형광현미경으로 촬영한 사진이다. A는 HEPES 버퍼만을 처리한 음성 대조군(negative control)이며; B는 HEPES 버퍼, R-PE(R-phycoerythrin) 및 PULSin을 처리한 양성 대조군(positive control)이며; C는 HEPES 버퍼, NLS-FITC 펩티드 및 PULSin을 처리한 실험군이며; D는 PULSin 없이 HEPES 버퍼 및 NLS-FITC 펩티드를 처리한 실험군이다. 주황색 형광은 R-PE(R-phycoerythrin)을 나타내며, 녹색 형광은 NLS 펩티드에 태깅된 FITC를 나타낸다.
도 3은 PULSin 전달 시약을 이용하여 NLS 펩티드를 HCT116 세포에 트랜스펙션한 후, 4% 파라포름알데히드로 고정하고 DAPI로 핵을 염색한 후 공초점 현미경으로 촬영한 사진이다. 왼쪽은 HEPES 버퍼만을 처리한 음성 대조군이며, 오른쪽은 HEPES 버퍼, NLS-FITC 펩티드 및 PULSin을 처리한 실험군이다. 푸른색 형광은 DAPI 염색이 된 핵을 나타내며, 녹색 형광은 NLS 펩티드에 태깅된 FITC를 나타낸다.
도 4는 살아있는 세포들의 시간적 또는 공간적인 활동을 확인하기 위해, CellInsight CX7 LZR HCS(High-Content Screening) Platform을 이용하여 NLS-FITC 펩티드가 세포 안으로 들어가는 것을 타임 랩스(time lapse)로 촬영한 사진이다. 왼쪽은 NLS-FITC 펩티드 및 PULSin을 처리하고 1시간 30분 후 사진이며, 오른쪽은 3시간 30분 후 사진이다.
도 5는 GFP(Green fluorescence protein)가 결합된 NAG-1을 과발현하는 HCT116 세포(HCT116-NAG-1-GFP)에 NLS 펩티드 및 PULSin 전달 시약을 이용하여 트렉스펙션하고 일정기간 배양한 후, CellInsight CX7 LZR HCS Platform을 이용하여 세포 핵 및 세포질에서 발현되는 GFP 형광 강도를 확인한 사진(A)과 NAG-1의 핵 및 세포질 분포 비율을 확인한 그래프(B)이다. (B)에서 ***는 NLS 펩티드를 처리하지 않은 군(Control)에 비해 NLS 펩티드를 처리하였을 때, NAG-1 단백질의 핵/세포질 분포 비율 감소가 통계적으로 유의하다는 것을 의미하며 p값이 0.001 미만인 것을 의미하며, **는 NLS 펩티드를 처리하지 않은 군(Control)에 비해 NLS 펩티드를 처리하였을 때, NAG-1 단백질의 핵/세포질 분포 비율 감소가 통계적으로 유의하다는 것을 의미하며 p값이 0.01 미만인 것을 의미하고, N.S는 통계적으로 유의한 차이가 없다는 것을 의미한다.
도 6은 GFP가 결합된 NAG-1을 과발현하는 HCT116 세포(HCT116-NAG-1-GFP)에 NLS 펩티드 및 PULSin 전달 시약을 이용하여 트렉스펙션하고 6시간 동안 배양한 후, MitoTracker^TM Orange CMTMRos를 이용하여 생존 세포의 미토콘드리아를 염색한 후 촬영한 사진(A) 및 MitoTracker^TM Orange CMTMRos의 형광 강도를 측정하여 미토콘드리아 막 전위(mitochondrial membrane potential)를 나타낸 그래프(B)이다. (A)에서 푸른색 형광은 DAPI 염색을 나타내며, 녹색 형광은 NAG-1에 태깅된 GFP를 나타내며, 오렌지 형광은 MitoTracker^TM Orange CMTMRos 염색을 나타내고, (B)에서 트랜스-칼콘(trans-chalcone)은 미토콘드리아 막 전위를 감소시키는 양성 대조군으로 사용하였으며, ***는 NLS 펩티드를 처리하지 않은 군(Control)에 비해 NLS 펩티드를 처리하였을 때, 미토콘드리아 막 전위 손실이 통계적으로 유의하다는 것과; 트랜스-칼콘을 단독 처리한 군(trans-chalcone)에 비해 NLS 펩티드를 처리하고 트랜스-칼콘을 처리하였을 때, 미토콘드리아 막 전위 손실이 통계적으로 유의하다는 것을 의미하며 p값이 0.001 미만인 것을 의미한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, NAG-1(nonsteroidal anti-inflammatory drug-activated gene-1) 단백질의 핵으로의 이동을 저해하는 NLS(nuclear localization signal) 펩티드를 제공한다.

본 발명에 따른 NLS 펩티드의 범위는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 NLS 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 NLS 펩티드를 코딩하는 DNA 또는 RNA일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함하며, DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다. 본 발명의 서열번호 2의 염기서열은 전장의 NLS 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다. 진핵세포에서 이용가능한 번역 조절 요소인 인핸서(enhancer), 리보솜 결합 부위, 종결신호, 폴리아데닐레이션 신호 및 프로모터는 당업계에 공지되어 있다. 상기 발현 벡터는 당업계에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부의 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(E. coli)이 이용되는 경우, 대장균의 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파지(λ)의 좌향 프로모터(pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다. 한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유 동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 대장균(E. coli) JM109, 대장균 BL21, 대장균 RR1, 대장균 LE392, 대장균 B, 대장균 X1776, 대장균 W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 사람 세포(예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)) 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci.,87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 NLS 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 과발현시키는 단계를 포함하는 NLS 펩티드의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 펩티드를 생산하는 방법은 형질전환된 숙주세포를 공지된 기술을 이용하여 재조합 단백질(펩티드)의 생산에 적합한 배지에서 배양한다. 예를 들어, 숙주세포들은 적합한 배지와 단백질이 발현 및/또는 분리되는 것을 허용하는 조건 하에 실시된 실험실 또는 산업용 발효기에서 소규모 또는 대규모 발효, 쉐이크 플라스크 배양에 의해서 배양될 수 있다. 배양은 공지기술을 사용하여 탄소, 질소원 및 무기염을 포함하는 적합한 배지에서 일어난다. 적합한 배지는 상업적으로 입수하거나 예를 들면, ATCC(American Type Culture Collection)의 카탈로그와 같은 간행물에 기재된 성분 및 조성비에 따라 제조할 수 있다.

상기 생산 방법에서는 발현된 단백질(펩티드)을 당업계에 공지된 단백질 분리방법을 이용하여 회수할 수 있다. 예를 들어 단백질은 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 통상적인 방법에 의해서 영양배지로부터 분리될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 더 나아가 단백질은 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하여 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 NLS 펩티드를 유효성분으로 함유하는 암, 염증성 질환 또는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 약학 조성물에 있어서, NLS 펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에서, 상기 암은 후두암, 폐암, 식도암, 췌장암, 대장암, 간암, 위암, 설암, 피부암, 뇌종양, 자궁암, 유방암, 자궁경부암, 난소암, 신장암, 담낭암, 구강암, 결장암, 간암, 방광암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 대장암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 NLS 펩티드는 암세포 내에서 NAG-1 단백질의 핵 내로의 이행을 억제시켜, 암세포의 미토콘드리아 막 전위를 감소시켜 암세포의 사멸을 유도할 수 있다.

또한, 상기 염증성 질환은 알레르기, 피부염, 아토피, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학 조성물은 상기 NLS 펩티드 이외에 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 약학적 투여 형태는 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 조합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제제, 외용제, 좌제 및 주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트,탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제,붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 발효물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이 외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 세포 준비

고압멸균(Autoclave)하고 PBS로 세척한 커버슬립(coverslip)을 6-웰 플레이트 바닥에 깔아 놓은 후, 각 웰에 대장암 세포주 HCT116(6×10⁵ cell/well)을 접종(seeding)하였으며, 웰 당 FBS(fetal bovine serum)를 함유하는 RPMI 1640 배지를 3㎖씩 분주하였다.

2. 시약 혼합 제제(Reagent mix formulation)

음성 대조군(negative control)으로 20mM의 HEPES 버퍼 200㎕만을 처리한 것을 사용하였고, 양성 대조군(positive control)으로 20mM의 HEPES 버퍼 200㎕, 형광 단백질인 R-PE(R-phycoerythrin) 4㎍ 및 16㎕의 PULSin^TM 전달 시약(Polyplus-transfection)을 처리한 것을 사용하였으며, 실험군으로 20mM의 HEPES 버퍼 200㎕, NAG-1 단백질의 NLS(nuclear localization signal)를 모방하여 제작한 본 발명의 NLS 펩티드(아미노산 서열: CRLHTVRA, 서열번호 1) 및 16㎕의 PULSin을 처리한 것과 PULSin 처리 없이 20mM의 HEPES 버퍼 200㎕ 및 4㎍의 NLS 펩티드를 처리한 것을 사용하였다.

3. 펩티드 트랜스펙션(transfection)

20mM의 HEPES 버퍼 200㎕에 4㎍의 NLS 펩티드를 희석한 후, 천천히 볼텍싱하고 잠시 스핀다운 시켰다. PULSin 전달 시약은 5초 동안 볼텍싱한 후 사용하기 전에 스피다운 시켰다. 상기 16㎕의 PULSin 전달 시약을 준비한 HEPES 버퍼 및 NLS 펩티드 혼합물에 첨가하여 볼텍싱한 후, 잠시 스피다운 시켰으며, 상온에서 15분 동안 배양하여 복합체를 형성시켰다. HCT116이 접종되어있는 웰은 혈청이 없는 배지 또는 1×PBS(phosphate buffer saline)로 세척하였다. 이후에, 웰 당 혈청이 없는 2.8㎖의 배양 배지를 분주하고 200㎕의 NLS 펩티드 및 PULSin 복합체를 첨가하여 혼합한 후, 서서히 균질화시킨 다음, 37℃에서 4시간 동안 배양시켰다. 배양이 끝난 후, 배지를 제거하고 1×PBS로 교체하였다.

4. 세포 고정

상기 펩티드 트랜스펙션 과정 이후에, 1×PBS를 제거하고 각 웰에 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 처리하여 세포를 고정하였다.

5. DAPI 염색 및 봉입

100㎕의 DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole) working solution을 커버슬립에 떨어뜨리고 플레이트를 은박지로 감싼 후 상온에서 15분간 배양한 후, 1X PBS로 3~4회 정도 세척하였다. 이후에, 커버슬립을 웰에서 꺼내고 잘 말린 후 슬라이드글래스에 봉입제(mounting medium)를 한 방울 떨어뜨린 후 커버슬립으로 덮었다.

실시예 1. NLS 펩티드의 세포 내 유입 확인

본 발명에서 NAG-1(nonsteroidal anti-inflammatory drug-activated gene-1) 단백질의 핵 위치 시그널(nuclear localization signal)을 모방하여 제작한, FITC(fluorescein isothiocyanate)가 태깅된 NLS-FITC 펩티드(도 1)를 HCT116 세포에 트랜스펙션(transfection)한 후, 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 도 2에 개시한 바와 같이 PULSin 전달 시약을 이용하여 NLS-FITC 펩티드를 처리하였을 때 세포에서 녹색 형광이 뚜렷하게 관찰되었다. 또한, PULSin 전달 시약을 이용하여 NLS-FITC 펩티드를 HCT116 세포에 트랜스펙션한 후, 4% 파라포름알데히드로 고정하고 DAPI로 핵을 염색한 다음 PBS로 세척한 후 공초점 현미경으로 촬영한 결과, 핵 주위와 함께 핵 내부에서도 녹색 형광을 확인할 수 있었다(도 3).

한편, 살아있는 세포들의 시간적 또는 공간적인 활동을 확인하기 위해, CellInsight CX7 LZR HCS(High-Content Screening) Platform을 이용하여 NLS-FITC 펩티드가 세포 안으로 들어가는지를 타임 랩스(time lapse)로 촬영한 결과, 도 4에 개시한 바와 같이 NLS-FITC 펩티드가 세포 안으로 들어가는 것을 실시간으로 확인할 수 있었다.

실시예 2. NLS 펩티드 처리에 따른 NAG-1의 세포 핵으로의 이동 저해 확인

GFP(Green fluorescence protein)가 결합된 NAG-1을 과발현하는 HCT116 세포(HCT116-NAG-1-GFP)에서 선택 마커인 G148을 이용하여 단일 콜로니(HCT116-NAG-1-GFP-#1)를 분리하였다. 상기 분리한 HCT116-NAG-1-GFP-#1 세포에 PULSin 전달 시약을 이용하여 NLS 펩티드를 트렉스펙션하고 6시간, 12시간 및 18시간 동안 배양한 후, CellInsight CX7 LZR HCS(High-Content Screening) Platform을 통해 핵 및 세포질에서 발현되는 GFP 형광 강도를 측정하여 핵 및 세포질의 분포 비율을 확인하였다. 그 결과, 도 5에 개시한 바와 같이 NLS 펩티드를 트렉스펙션하고 6시간 및 12시간 후 측정에서 NLS 펩티드 처리에 의해 NAG-1의 핵/세포질 분포 비율이 대조군(Control)에 비해 현저하게 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 즉, NLS 펩티드 처리에 의해 NAG-1이 핵에 들어가지 못하고 세포질에 머무르는 현상이 증가한 것을 알 수 있었다.

실시예 3. NLS 펩티드 처리에 따른 대장암 세포의 미토콘드리아 막 전위 손실 효과

GFP(Green fluorescence protein)가 결합된 NAG-1을 과발현하는 HCT116 세포(HCT116-NAG-1-GFP)에서 선택 마커인 G148을 이용하여 분리한 HCT116-NAG-1-GFP-#1 세포에 NLS 펩티드 및 PULSin을 이용하여 트렉스펙션하고 6시간 동안 배양하였다. 살아있는 세포의 미토콘드리아를 염색하는 오렌지색 형광 염료로서 막 전위(membrane potential)에 따라 축적되는 MitoTracker^TM Orange CMTMRos를 이용하여 세포를 염색하고 4% 파라포름알데히드로 고정한 후, DAPI로 대비염색(counterstaining)하였다. 이후에, CellInsight CX7 LZR HCS(High-Content Screening) Platform을 이용하여 MitoTracker^TM Orange CMTMRos의 형광 강도를 측정하여 세포의 미토콘드리아 막 전위를 확인하였다. 그 결과, NLS 펩티드를 처리한 세포에서 대조군(Contorl) 대비 낮은 미토콘드리아 막 전위를 확인하였고, 미토콘드리아 막 전위를 감소시키는 트랜스-칼콘(trans-chalcone)을 처리한 세포를 양성 대조군으로 두고, NLS 펩티드 및 트랜스-칼콘을 처리한 세포와 비교하였을 때에도 상기 결과와 비슷한 패턴을 나타내었다(도 6). 즉, 본 발명의 NLS 펩티드가 대장암 세포의 미토콘드리아 막 전위 손실을 일으켜 대장암 세포의 세포사멸을 유도할 수 있다는 것을 확인하였다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Peptide controlling migration of NAG-1 protein in cell and uses thereof <130> PN19274 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 1 Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala 1 5 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 2 tgccgtctgc acacggtccg cgcg 24

Claims (6)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, NAG-1(nonsteroidal anti-inflammatory drug-activated gene-1) 단백질의 핵으로의 이동을 저해하는 NLS(nuclear localization signal) 펩티드.
2. 제1항의 NLS 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
3. 제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
4. 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
5. 제4항의 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 NLS 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 과발현시키는 단계를 포함하는 NLS 펩티드의 생산 방법.
6. 제1항의 NLS 펩티드를 유효성분으로 함유하는 암, 염증성 질환 또는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.

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