KR20200022618A - 디아미노페나진 기반의 신규 화합물 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 본 발명은 신규 화합물 및 그의 용도에 관한 것으로서, 더 상세하게는 알츠하이머의 질환에 원인 중 하나인 타우(Tau)의 응집을 효율적으로 저해할 수 있는 디아미노페나진 기반의 신규 화합물 및 그의 용도를 제공한다.
Description
본 발명은 신규 화합물 및 그의 용도에 관한 것으로서, 더 상세하게는 알츠하이머의 질환에 원인 중 하나인 타우(Tau)의 응집을 저해할 수 있는 디아미노페나진 기반의 신규 화합물 및 그의 용도를 제공하는 것이다.
평균 수명이 증가함에 따라 사회의 고령화가 진행되고 있다. 그로 인해 노화 및 그에 따른 질병 특히 뇌졸중(stroke), 치매(dementia), 파킨스병(Parkinson's disease) 등의 뇌신경질환과 같이 신경세포 손상과 퇴행성 신경 질환에 대한 관심이 커지고 있다. 특히 치매는 해당 환자와 그 가족의 삶의 질에 큰 영향을 미치는 중요한 노인성 질환으로 중년 및 고령 인구에서 전 세계적으로 약 4천 4백만 명의 사람들이 고통을 받고 있다. 현재 치매에 주요한 원인으로는 알츠하이머 질환 (Alzheimer＇s dieses, AD)과 혈관성 치매가 보고되었으며 그 중 약 50~70%에 해당하는 환자가 알츠하이머 질환에 의한 것으로 보고되고 있다(Burns, A. et al., Dementia. BMJ, 338. 2009). 이러한 알츠하이머 질환에 주요한 원인 중 하나는 타우(Tau)의 비정상적인 응집 및 축적이며 AD 환자의 뇌에서는 타우(Tau)로 구성된 세포 내 신경 원 섬유 엉킴(neurofibrillary tangles, NFT) 현상이 나타나고 상기 NFT의 밀도는 질병의 발전단계와 직접적으로 관련되어 있다(Iqbal, K. et al., Nature reviews. Neurology, 12 (1), 15-27. 2016). 따라서 현재 알츠하이머 치료에 있어 과인산화(hyperphosphorylation)된 타우의 응집체에 대한 직접적인 접근 방법이 주목받고 있다.
그러나 상기 선행기술의 경우, 인산화 억제제는 타우 뿐만 아니라 세포에 기능을 조절하는 다른 단백질의 인산화도 억제하여 다양한 부작용을 수반하는 문제점을 갖고 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 알츠하이머의 질환에 원인 중 하나인 타우(Tau)의 응집을 효율적으로 저해할 수 있는 디아미노페나진 기반의 신규 화합물 및 그의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
하기 화학식 1의 구조를 갖는 신규 화합물 또는 그의 허용가능한 염이 제공된다:
(상기 화학식에서 R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸로서,단 R1 내지 R4 모두 수소인 경우는 제외한다).
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 타우 응집 저해용 조성물이 제공된다:
(상기 화학식에서 R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸이다).
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 치료용 약학적 조성물이 제공된다:
(상기 화학식에서 R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸이다).
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면 치료적으로 유효한 양의 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 허용가능한 염을 알츠하이머병에 걸린 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 환자의 알츠하이머병 치료방법이 제공된다:
(상기 화학식에서 R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸이다).
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 디아미노페나진 기반의 신규 화합물 및 그의 용도에 따르면, 알츠하이머의 질환에 원인 중 하나인 타우(Tau)의 응집을 효율적으로 저해할 수 있는 타우 응집으로 인한 알츠하이머 치매증 치료제 생산효과를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 신규 화합물인 DMP에 의한 타우(Tau) 응집 억제를 분석한 그래프이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "알츠하이머형 치매증(alzheimer's dementia, AD)"은 운동력과 인지능력 저하의 파행적인 진행과 함께 다양한 심리적, 행동장애 증상이 동반되며 초기의 경미한 증상에서 시작하여 최종적으로 자발적인 개인생활이 불가능할 정도로 진행되어 그 피해가 심각하다. AD에 있어서는, 환자의 아세틸콜린(acetylcholine)계, 글루타민산(glutamic acid)계, 신경펩티드(neuropeptides)계 및 모노아민(monoamine)계에서의 신경전달의 기능저하가 나타나, 이들 신경전달계의 기능 장해가 AD의 주된 원인인 것으로 추정되고 있다. 또한, β-아밀로이드 펩티드(β-amyloid peptide)에 의해 유발된 신경세포 독성작용의 관점으로부터, β-아밀로이드 펩티드의 세포 밖으로의 노인 반점의 집적을 통한 해마 신경세포의 탈락에 의한 발증기전도 AD의 주요 원인 중 하나로 추정되고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "타우(Tau)"는 미세소관(microtubule)을 안정화시키고 미세소관의 조립을 촉진하는 분자량이 50,000~70,000의 미세소관결합단백질이다. 타우는 미세소관의 동적 불안정성을 조절하여 신경세포의 구조네트워크를 조절하나, AD 환자에서는 타우가 비정상적으로 과인산화(Hyperphosphorylation)되어 미세소관에서 해리되고 NFT로 응집될 가능성이 높다. 상기 해리 및 응집은 타우에 의한 미세소관 조절을 억제하며 세포막, 미토콘드리아 기능 및 단백질 항상성 조절에 영향을 미친다. 또한, 상기 응집된 타우는 다양한 방식으로 인접 뉴런으로 전파되어 프리온(prion)처럼 정상적인 타우의 잘못된 접힘(folding)과 응집을 유도하여 질병의 전파에 중요한 역할을 하고 있다.
발명의 상세한 설명:
하기 화학식 1의 구조를 갖는 신규 화합물 또는 그의 허용가능한 염이 제공된다:
(상기 화학식에서 R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸로서,단 R1 내지 R4 모두 수소인 경우는 제외한다).
상기 신규 화합물 또는 그의 허용가능한 염은 하기로 구성되는 군으로 부터 선택될 수 있다:
N 2 -Methylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 3 -Dimethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 2 ,N 3 -Trimethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 2 ,N 3 ,N 3 -Tetramethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 -Ethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 3 -Diethylphenazine-2,3-diamine 및
N 2 ,N 2 ,N 3 -Triethylphenazine-2,3-diamine.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 타우 응집 저해용 조성물이 제공된다:
(상기 화학식에서 R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸이다).
상기 조성물에 있어서, 상기 화합물은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다:
2,3-diaminophenazine,
N 2 -Methylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 3 -Dimethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 2 ,N 3 -Trimethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 2 ,N 3 ,N 3 -Tetramethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 -Ethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 3 -Diethylphenazine-2,3-diamine 및
N 2 ,N 2 ,N 3 -Triethylphenazine-2,3-diamine.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 치료용 약학적 조성물이 제공된다:
(상기 화학식에서 R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸이다).
상기 조성물에 있어서, 상기 화합물은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다:
2,3-diaminophenazine,
N 2 -Methylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 3 -Dimethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 2 ,N 3 -Trimethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 2 ,N 3 ,N 3 -Tetramethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 -Ethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 3 -Diethylphenazine-2,3-diamine 및
N 2 ,N 2 ,N 3 -Triethylphenazine-2,3-diamine.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면 치료적으로 유효한 양의 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 허용가능한 염을 알츠하이머병에 걸린 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 환자의 알츠하이머병 치료방법이 제공된다:
(상기 화학식에서 R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸이다).
상기 방법에 있어서, 상기 화합물은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다:
2,3-diaminophenazine,
N 2 -Methylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 3 -Dimethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 2 ,N 3 -Trimethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 2 ,N 3 ,N 3 -Tetramethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 -Ethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 3 -Diethylphenazine-2,3-diamine 및
N 2 ,N 2 ,N 3 -Triethylphenazine-2,3-diamine.
상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물은 하기 반응식 1의 방법을 이용하여 합성될 수 있다:
상기 반응식에서 단계 a에서는 FeCl3, 및 H2O이 첨가되고 실온에서 6 시간 동안 반응이 수행되며, 단계 b에서는 요오드화 메틸 또는 요오드화 에틸, NaH, 및 DMF이 사용되고, 4℃ 내지 상온에서 0.5 내지 4 시간 동안 반응이 수행될 수 있다.
일반적으로 타우(Tau)는 크게 MTBR(Microtubule-binding domain)과 그 외의 지역으로 나뉘어 있는데 다른 형태의 타우에 비해 MTBR만이 존재할 시에 보다 빠른 응집이 이루어지기 때문에 MTBR이 타우의 응집에 핵심지역이라 현재까지 판단되고 있다. 현재 주목받고 있는 알츠하이머 치료방법은 과인산화된 타우의 응집체에 대한 직접적인 접근이다. 상기 타우의 과인산화를 억제하기 위해, 인산화 억제제가 AD 환자에 적용되었지만 인산화 억제제는 타우뿐만 아니라 세포에 기능을 조절하는 다른 단백질의 인산화 역시도 억제하기 때문에 다양한 부작용을 수반하였다. 예컨대 대표적인 타우 인산화 효소인 GSK3β를 억제하는 Tideglusib를 경증부터 중등도의 AD 환자에 투여하였지만 질병치료에 있어 이점을 나타내지 않았다(Lovestone, S et al., Journal of Alzheimer's disease : JAD, 45 (1), 75-88. 2015). 그러나 타우를 타겟으로 한 치료법들은 의미있는 치료효과를 보여주고 있다. 타우의 응집 억제제로 알려진 Methylene blue의 유도체인 LMTX를 환자에 투여한 결과 타우의 응집 억제를 통하여 질병의 전파를 확실히 저해하는 것을 확인함에 따라 새로운 타우의 응집 억제제를 개발하는 것이 알츠하이머 치료법 연구에 있어 전기를 마련할 수 있는 것으로 사료된다. 이에 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 인식하고 예의노력한 결과, 알츠하이머의 질환에 원인 중 하나인 타우의 응집을 효율적으로 저해할 수 있는 신규 화합물 DMP(diaminophenazine)를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있으나, 비경구를 위한 제형인 것이 바람직하다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있는데, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주사, 비강내 흡입, 근육내 투여, 복강내 투여, 경피흡수 등 다양한 경로를 통해 투여하는 것이 가능하다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예:
시약 및 조건
본 발명에서 사용된 모든 시약은 Sigma-Aldrich, Alfa-Aesar 및 TCI에서 구입하여 추가 정제하지 않고 사용하였고 반응은 건조 질소(dry nitrogen) 분위기 하에서 수행하였으며 Biotage Initiator 마이크로파 시스템을 마이크로파 보조 반응(microwave-assisted reaction)에 사용하였다. 또한, LC-MS는 Shimadzu LCMS-2020 액체 크로마토그래피-질량 분석기(컬럼: Shim-pack GIS, 100 x 3.0 mm, 3μm ODS) 내의 전기 분사 이온화(ESI) 공급원으로 구성된 시스템 상에서 수행하였다. 다양한 사전 충전(prepacked)된 실리카 겔 카트리지(silica gel cartridges)가 있는 Teledyne ISCO 플래시 정제 시스템을 플래시 컬럼 크로마토그래피(flash column chromatography)에 사용하였고 1H 스펙트럼은 Bruker AVANCE Ⅲ HD(400 MHz) 분광계에서 지시된 용매로 기록하였다. 아울러 화학적 이동(chemical shifts)은 DMSO-d 6 또는 CDCl3의 내부 표준(internal standard)으로서 TMS(δ 0.0)로부터 다운필드(downfield) 백만분율로 δ값으로 보고되었고 화합물의 순도(purity)는 Shimadzu 역상 분석 HPLC 시스템(컬럼:Ace C18, 150 x 4.6 mm, 3 ㎛)상에서 평가하였으며 생물학적 분석을 실시한 모든 화합물의 순도는 > 95%로 나타났다.
2,3-diaminophenazine(DAP) 및 유도체의 합성
실시예 1: DAP의 합성
본 발명의 출발물질인 2,3-diaminophenazine(DAP)은 기존의 알려진 방법(Journal of Molecular Structure, 2014, 1062, 44-47; Canadian Journal of Chemistry, 89(10), 1202-1206; 2011)을 이용하여 합성하였다. 구체적으로 실온에서 o-페닐렌디아민 4.0 g(37.0 mmol)이 물 300 ml에 용해된 페닐렌디아민 수용액에 FeCl3 18.0 g(111.0 mmol)이 물 150 ml에 용해된 염화제이철 수용액을 적가(dropwise)하였다. 그 후 상기 반응 혼합물(reaction mixture)을 동일한 온도에서 6시간 동안 교반하여 반응시킨 후, 생성된 침전물을 여과하고 물 500 ml로 4회 세척한 후 침전물을 건조하여 암적색 분말(dark red powder)로 화학식 2로 기재되는 2,3-diaminophenazine('DAP'로 약칭함)를 수득하였다(2.5 g, 수율 32.1 %).
실시예 2: DAP-1과 DAP-3의 합성
상기 실시예 1에서 제조된 DAP 0.1 g(0.48 mmol)을 무수 DMF(10 ml)에 용해시킨 DAP 용액에 미네랄 오일에 분산된 60% NaH 0.011 g(0.48 mmol)을 4℃에서 가하였다. 반응 혼합물을 4℃의 온도에서 10분간 교반하면서, 요오드화 메틸 0.071 g(0.5 mmol)을 천천히 첨가하였다. 반응이 끝난 후에, 혼합물을 상온에서 0.5 내지 4시간 동안 추가적으로 교반하였다. 생성된 혼합물을 에틸아세테이트로 희석하고 물, 염수, 및 건조 황산마그네슘으로 세척하였다. 조 혼합물을 이동상으로 n-헥산에 20% 에틸아세테이트가 용해된 용매를 이용한 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 그 결과 N 2-methylphenazine-2,3-diamine(DAP-1、수율: 40％)와 N 2,N 3-dimethylphenazine-2,3-diamine(DAP-3； 수율: 16%)를 수득하였다. 생성된 DAP-1와 DAP-3의 1H NMR 데이터와 MS(ESI) 분석결과는 하기와 같다:
DAP-1: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.12 - 8.06 (m, 2 H), 7.67 - 7.54 (m, 2 H), 7.56 (s, 1 H), 7.12 (s, 1 H), 6.68 (s, 1 H), 4.84 (br s, 2 H), 2.88 (s, 3 H); MS (ESI): m/z = 225.12 [M+H].
DAP-3: 1H NMR (400 MHz, CDCl3)d 8.10 (t, J=7.09 Hz, 2 H), 7.83 - 7.60 (m, 2 H), 7.58 (s, 1 H), 7.20 (s, 1 H), 4.69 (d, J=0.98 Hz, 2 H), 2.91 (s, 6 H); MS (ESI): m/z = 239.25 [M+H].
실시예 3: DAP-2 및 DAP-6의 합성
상기 실시예 1에서 제조된 DAP 0.1 g(0.48 mmol)을 무수 DMF에 용해시킨 DAP 용액에 미네랄 오일에 분산된 60% NaH 0.011 g(0.48 mmol)을 4℃에서 가하였다. 반응 혼합물을 4℃의 온도에서 10분간 교반하면서, 요오드화 에틸 0.117 g(0.75 mmol)을 천천히 첨가하였다. 반응이 끝난 후에, 혼합물을 상온에서 0.5 내지 4시간 동안 추가적으로 교반하였다. 생성된 혼합물을 에틸아세테이트로 희석하고 물, 염수, 및 건조 황산마그네슘으로 세척하였다. 조 혼합물을 이동상으로 n-헥산에 20% 에틸아세테이트가 용해된 용매를 이용한 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 그 결과 N 2-ethylphenazine-2,3-diamine(DAP-2; 수율: ３４％)와 N 2 ,N 3 -Diethylphenazine-2,3-diamine(DAP-6; 수율: 12%)를 수득하였다. 생성된 DAP-2와 DNAP-6의 1H NMR 데이터와 MS(ESI) 분석결과는 하기와 같다:
DAP-2: 1H NMR (400 MHz, CDCl3)d 8.10 (t, J=7.09 Hz, 2 H), 7.83 - 7.60 (m, 2 H), 7.58 (s, 1 H), 7.20 (s, 1 H), 4.69 (d, J=0.98 Hz, 2 H), 2.91 (s, 6 H); MS (ESI): m/z = 239.25 [M+H].
DAP-6: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.12 - 8.07 (m, 2 H), 7.73 - 7.63 (m, 2 H), 7.62 (s, 1 H), 7.20 (s, 1 H), 4.80 (br s, 1 H), 3.23 (q, J=7.09 Hz, 4 H), 1.13 (t, J=7.09 Hz, 6 H). MS (ESI): m/z = 267.15 [M+H].
실시예 ４: DAP-4 및 DAP-5의 합성
상기 실시예 2에서 제조된 DAP-3 0.1 g(0.42 mmol)을 무수 DMF에 용해시킨 DAP 용액에 미네랄 오일에 분산된 60% NaH 0.018 g(0.44 mmol)을 4℃에서 가하였다. 반응 혼합물을 4℃의 온도에서 10분간 교반하면서, 요오드화 메틸 0.090 g (0.63 mmol)을 천천히 첨가하였다. 반응이 끝난 후에, 혼합물을 상온에서 0.5 내지 4시간 동안 추가적으로 교반하였다. 생성된 혼합물을 에틸아세테이트로 희석하고 물, 염수, 및 건조 황산마그네슘으로 세척하였다. 조 혼합물을 이동상으로 n-헥산에 20% 에틸아세테이트가 용해된 용매를 이용한 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 그 결과 화학식 5의 구조를 갖는 N 2 ,N 2 ,N 3 - Trimethylphenazine-2,3-diamine(DAP-4;수율: 31%)와 N 2 ,N 2 ,N 3 ,N 3 - Tetramethylphenazine-2,3-diamine(DAP-5; 수율: 11%)를 수득하였다. 생성된 DAP-4와 DAP-5의 1H NMR 데이터와 MS(ESI) 분석결과는 하기와 같다:
DAP-4: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.09 (td, J=8.44, 0.98 Hz, 2 H), 7.73 - 7.60 (m, 2 H), 7.55 (s, 1 H), 6.94 (s, 1 H), 5.37 (d, J=4.40 Hz, 1 H), 3.07 (d, J=5.14 Hz, 3 H), 2.86 (s, 6 H)；. MS (ESI): m/z = 253.13 [M+H].
DAP-5: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.14 - 8.04 (m, 2 H), 7.72 - 7.64 (m, 2 H), 7.38 (s, 2 H), 3.02 (s, 12 H). MS (ESI): m/z = 267.25 [M+H].
실시예 ５: DAP-7의 합성
상기 실시예 ３에서 제조된 DAP-6 0.1 g(0.48 mmol)을 무수 DMF에 용해시킨용액에 미네랄 오일에 분산된 60% NaH 0.011 g(0.48 mmol)을 4℃에서 가하였다. 반응 혼합물을 4℃의 온도에서 10분간 교반하면서, 요오드화 에틸 0.078 g(０.5 mmol)을 천천히 첨가하였다. 반응이 끝난 후에, 혼합물을 상온에서 6시간 동안 추가적으로 교반하였다. 생성된 혼합물을 에틸아세테이트로 희석하고 물, 염수, 및 건조 황산마그네슘으로 세척하였다. 조 혼합물을 이동상으로 n-헥산에 20% 에틸아세테이트가 용해된 용매를 이용한 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 그 결과 N 2 ,N 2 ,N 3 -Triethylphenazine-2,3-diamine(DAP-7; 수율: 16%)를 수득하였다. 생성된 DAP-7의 1H NMR 데이터와 MS(ESI) 분석결과는 하기와 같다:
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.12 - 8.02 (m, 2 H), 7.72 - 7.67 (m, 1 H), 7.64 - 7.59 (m, 1 H), 7.58 (s, 1 H), 6.92 (s, 1 H), 5.53 (br s, 1 H), 3.42 - 3.33 (m, 2 H), 3.17 (q, J=7.08 Hz, 4 H), 1.41 (t, J=7.21 Hz, 3 H), 1.11 (t, J=7.09 Hz, 6 H); MS (ESI): m/z = 295.10 [M+H].
상기 제조한 신규 화합물 DAP 및 DAP 유도체의 개별 화합물에 대한 요약정보는 하기 표 1과 같다.
| 실시예 | 약칭 | 구조식 | IUPAC name |
| 1 | DAP |
 |
2,3-diaminophenazine |
| 2 | DAP-1 |
 |
N 2 -Methylphenazine-2,3-diamine |
| 3 | DAP-2 |
 |
N 2 -Ethylphenazine-2,3-diamine |
| 4 | DAP-3 |
 |
N 2 ,N 3 -Dimethylphenazine-2,3-diamine |
| 5 | DAP-4 |
 |
N 2 ,N 2 ,N 3 -Trimethylphenazine-2,3-diamine |
| 6 | DAP-5 |
 |
N 2 ,N 2 ,N 3 ,N 3 -Tetramethylphenazine-2,3-diamine |
| 7 | DAP-6 |
 |
N 2 ,N 3 -Diethylphenazine-2,3-diamine |
| 8 | DAP-7 |
 |
N 2 ,N 2 ,N 3 -Triethylphenazine-2,3-diamine |
실험예 1: 재조합된 타우(Tau) 발현 플라스미드 설계
본 발명자들은 시험관 내(In vitro)에서 타우(Tau) 응집을 구현하기 위해 응집에 핵심지역만을 지닌 Tau K18 절편(서열번호 1)을 사용하였고 정제의 편의성을 위해 N-말단에 6개의 His-태그를 부착하였다. 구체적으로 상기 Tau K18 절편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 2)의 앞쪽에 XhoⅠ부위, 뒤쪽에 BamHI 부위가 삽입되도록 DNA 프라이머를 제작하였고 인간 타우 전장 DNA(Human Tau full length DNA)를 주형(template)으로 하여 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 조건은 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 40초의 cycle을 36번 반복하는 방법으로 진행하였다. 상기 PCR로 제한효소 부위를 가진 채 증폭된 Tau K18 유전자 및 pET-16b를 제한효소 XhoⅠ과 BamHI로 처리한 후 결찰(ligation)하여 N-말단에 His-tag된 Tau K18을 수득하였다. 상기 PCR 증폭에 사용한 프라이머의 핵산서열 정보를 하기 표 2에 요약하였다.
| 프라이머 | 핵산서열(5'-->3') | 서열번호 |
| 포워드 | AAAA CTCGAG CAGACAGCCCCCGTGC | 3 |
| 리버스 | TTTT GGATCC CTA TTTATTTCCTCCGCCAGGGACR | 4 |
실험예 2: 재조합 타우(Tau)의 분리정제
본 발명자들은 상기 실험예 1을 통해 제조한 재조합 플라스미드를 BL21 (DE3)/RIL에 형질전환시킨 후 37℃ LB 배지에서 OD600이 0.8에 도달할 때까지 성장시켰다. 그런 다음 재조합 Tau K18의 발현을 1 mM IPTG(isopropyl-D-thiogalacto- pyranoside )로 유도하였고 37℃에서 2시간 더 배양했다. 그 다음, 상기 발현된 세포를 4,000 xg으로 15분간 원심분리하여 수득하였고 PBS 완충액(5 mM DTT 및 1 mM PMSF)에 재현탁한 후 초음파를 통하여 파쇄하였으며 16,000 xg으로 15분간 원심분리하여 세포 찌꺼기(cell debris)를 제거하였다. 이어서 깨끗해진 용해물을 Ni Sepharose 6 Fast Flow 수지(GE healthcare)에 통과시킨 다음, 수지에 결합된 재조합 타우 K18을 250 mM 이미다졸(imidazole)로 용출시켰다. 마지막으로 상기 용출된 재조합 단백질을 Snakeskin 투석 튜브(ThermoFisher)를 사용하여 4℃에서 PBS 완충액으로 밤새 투석하여 이미다졸을 제거하였고 분해된 Tau K18을 수득하였으며 정제 된 Tau K18 농도는 OD280의 흡광 계수를 측정하여 결정하였다.
실험예 3:
in vitro
상에서의 타우(Tau)에 응집과 측정
본 발명자들은 실험관 내(in vitro)에서 타우(Tau)의 응집을 측정하였다. 구체적으로 100 μM의 분리 정제된 재조합 Tau K18을 PBS 완충액에서 2 mM DTT과 50 μM 옥타데실 설페이트(octadecyl sulfate)와 함께 37℃의 조건으로 6시간 동안 배양하였다. 상기 배양한 샘플들의 응집도는 Thioflavin T(ThT) 형광 프로브를 이용하여 확인하였고 ThT 형광 프로브는 PBS 완충액에 1 mM로 용해시켜 응집된 각 샘플에 5 μM로 처리하였으며 형광 플레이트 판독기(plate-reader)의 조건을 여기(excitation) 440 nm 및 방출(emission) 485 nm로 설정하여 응집에 의해 나타나는 형광수치를 정량하였다.
실험예 4: 2,3-diaminophenazine 유도체들에 의한 응집저해
본 발명자들은 상술한 Tau K18의 응집조건하에서 본 발명의 실시예 1 내지 8의 DAP 유도체 10 μM를 첨가하여 37℃에서 6시간 동안 배양하여 응집도(cohesion)를 관찰하였고 상기 측정한 형광값은 대조군인 DMSO가 처리된 샘플로 표준화하였으며 각 독립적인 실험을 3번 반복으로 수행하였다.
그 결과, 8개의 DAP 유도체들 중에서 DAP가 가장 높은 약 70%의 응집 억제효과를 나타내었으며 DAP-2,3,6은 약 60%, DAP-4,5,7은 약 40%를 나타내었으나 DAP-1은 약 15%로 가장 낮은 효과를 나타내는 것으로 확인되었다(도 1).
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation
<120> novel compound based on diaminophenazine and use thererof
<130> PD18-5691
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 148
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tau K18 fragment
<400> 1
His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His Ile Glu
1 5 10 15
Gly Arg His Met Leu Glu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu
20 25 30
Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln
35 40 45
Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser
50 55 60
Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro
65 70 75 80
Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys
85 90 95
Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly
100 105 110
Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg
115 120 125
Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly
130 135 140
Gly Gly Asn Lys
145
<210> 2
<211> 459
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide encoding Tau K18 fragment
<400> 2
atgggccatc atcatcatca tcatcatcat catcacagca gcggccatat cgaaggtcgt 60
catatgctcg agcagacagc ccccgtgccc atgccagacc tgaagaatgt caagtccaag 120
atcggctcca ctgagaacct gaagcaccag ccgggaggcg ggaaggtgca gataattaat 180
aagaagctgg atcttagcaa cgtccagtcc aagtgtggct caaaggataa tatcaaacac 240
gtcccgggag gcggcagtgt gcaaatagtc tacaaaccag ttgacctgag caaggtgacc 300
tccaagtgtg gctcattagg caacatccat cataaaccag gaggtggcca ggtggaagta 360
aaatctgaga agcttgactt caaggacaga gtccagtcga agattgggtc cctggacaat 420
atcacccacg tccctggcgg aggaaataaa tagggatcc 459
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for Tau K18 fragment
<400> 3
aaaactcgag cagacagccc ccgtgc 26
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for Tau K18 fragment
<400> 4
ttttggatcc ctatttattt cctccgccag ggacr 35
Claims (6)
- 하기 화학식 1의 구조를 갖는 신규 화합물 또는 그의 허용가능한 염:
(화학식 1)
(상기 화학식에서 R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸로서,단 R1 내지 R4 모두 수소인 경우는 제외한다). - 제1항에 있어서,
하기 군으로부터 선택되는, 화합물 또는 그의 허용가능한 염:
N 2 -Methylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 3 -Dimethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 2 ,N 3 -Trimethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 2 ,N 3 ,N 3 -Tetramethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 -Ethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 3 -Diethylphenazine-2,3-diamine 및
N 2 ,N 2 ,N 3 -Triethylphenazine-2,3-diamine. - 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 타우 응집 저해용 조성물:
(화학식 1)
(상기 화학식에서 R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸이다). - 제3항에 있어서,
상기 화합물은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는, 조성물.
2,3-diaminophenazine,
N 2 -Methylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 3 -Dimethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 2 ,N 3 -Trimethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 2 ,N 3 ,N 3 -Tetramethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 -Ethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 3 -Diethylphenazine-2,3-diamine 및
N 2 ,N 2 ,N 3 -Triethylphenazine-2,3-diamine. - 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 치료용 약학적 조성물:
(화학식 1)
(상기 화학식에서 R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸이다). - 제5항에 있어서,
상기 화합물은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는, 조성물.
2,3-diaminophenazine,
N 2 -Methylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 3 -Dimethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 2 ,N 3 -Trimethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 2 ,N 3 ,N 3 -Tetramethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 -Ethylphenazine-2,3-diamine,
N 2 ,N 3 -Diethylphenazine-2,3-diamine 및
N 2 ,N 2 ,N 3 -Triethylphenazine-2,3-diamine.
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|---|
| Mahran, Asma M. 등, European Journal of Medicinal Chemistry, 2015, 제90권, 페이지 568-576 * |
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