KR20200021553A - 합성 메신저 rna에 의한 인간 유도 만능 줄기 세포의 피더프리 유래 - Google Patents

합성 메신저 rna에 의한 인간 유도 만능 줄기 세포의 피더프리 유래 Download PDF

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Abstract

본 개시는 일반적으로, 동역학적으로 통제된 과정을 통해, 유도 만능 줄기 세포(iPSC)의 생성을 위해 엔지니어링된 재프로그래밍 인자(들)을 사용하는 신규 방법 및 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 이 개시는 다양한 유형의 세포를 재프로그래밍하는데에 최적화된, 전사활성 도메인과 종래의 재프로그래밍 인자간의 융합을 포함하는 재프로그래밍 인자의 조합을 확립하는 것에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본원에 개시된 예시적 방법은, 인간 섬유모세포를 포함하는 다양한 포유류 세포 유형으로부터 유도 만능 줄기 세포를 생성하는데 사용될 수 있다. 합성 메신저 RNA를 사용한 인간 유도 만능 줄기 세포의 피더프리 유래의 예시적 방법도 또한 개시된다.

Description

합성 메신저 RNA에 의한 인간 유도 만능 줄기 세포의 피더프리 유래{FEEDER-FREE DERIVATION OF HUMAN-INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS WITH SYNTHETIC MESSENGER RNA}
<관련 출원>
이 출원은 2012년 5월 13일자 출원된 US 가 출원 제USSN 61/646,292호의 우선권을 주장한다. 그의 내용은 그의 전부가 본원에 포함된다.
<기술 분야>
본 개시는 일반적으로, 동역학적으로 통제된 과정으로 유도 만능 줄기 세포(iPSC)의 생성을 위해 엔지니어링된 재프로그래밍 인자(들)을 사용하는 신규 방법 및 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 이 개시는 다양한 유형의 세포를 재프로그래밍하는데에 최적화된, 전사활성(transactivation) 도메인과 종래의 재프로그래밍 인자간의 융합을 포함하는 재프로그래밍 인자의 조합을 확립하는 것에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본원에 개시된 예시적 방법은, 인간 섬유모세포를 포함하는 다양한 포유류 세포 유형으로부터 유도 만능 줄기 세포를 생성하는데 사용될 수 있다. 합성 메신저 RNA를 사용한 인간 유도 만능 줄기 세포의 피더프리(feeder-free) 유래의 예시적 방법도 또한 개시된다.
다음은 본 개시의 다양한 측면과 실시양태를 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 이는 본원에 제공된 임의의 정보가 본원에 기재되거나 청구된 발명의 선행 기술이거나, 또는 관련된다는 점, 또는 구체적으로 또는 함축적으로 참조된 임의의 간행물 또는 문서가 선행 기술이라는 점을 인정하는 것이 아니다.
유도 만능 줄기 세포(iPSC)의 치료 가능성은 만능 상태로의 재프로그래밍을 수행하기 위해 체세포를 유전적으로 변형할 필요성을 회피하는 재프로그래밍 방법을 개발하는 노력에 박차를 가했다. 이에 관한 성공을 달성하기 위한 최초의 "비인테그레이션" 접근법―단백질 형질도입(transduction), 플라스미드 트랜스펙션(transfection) 및 아데노바이러스 벡터의 사용―은 수득되는 iPSC 전환의 낮은 효율 때문에 적용이 제한되었다. 보다 최근에, 에피솜 DNA, 센다이(Sendai) 바이러스, 및 합성 메신저 RNA(mRNA)를 이용하는 기법이 바이러스 벡터의 인테그레이션을 사용하여 수득된 것에 비견되거나 또는 이를 능가하는 효율로 "풋프린트 없는" iPSC를 생성하는 것으로 나타났다. RNA 트랜스펙션은 재프로그래밍 인자(RF) 발현 시간 경과에 걸친 정확한 통제를 제공하면서도, 벡터의 잔류 흔적을 제거하기 위해 재프로그래밍된 세포의 "클린업"의 임의의 요건을 완전히 배제하기 때문에 원칙적으로 이들 방법 중 가장 매력적이다. 그러나, mRNA 기반의 재프로그래밍의 현재 프로토콜은 인간 세포에서 만능성의 유도를 위해 요구되는 ~2 주 동안 매일의 재트랜스펙션의 필요성 때문에 상대적으로 노동 집약적이다. 이들 과정은 인간 외에서 유래된("제노(xeno)") 생물학적 물질에 의한 오염의 잠재적 공급원을 도입하면서도 과정에 복잡성 및 기술적 가변성을 부가하는 피더 세포의 사용에도 또한 의존한다.
유도 만능 줄기 세포(iPSC)의 생산의 주요 난점은 분화된 세포에서 만능 세포로의 재프로그래밍의 낮은 효율이었다. 이전에, Sox2, Klf4 및 c-Myc(SKM)과 함께 Oct4 및 MyoD(M3O라 불림)의 전사활성 도메인으로 구성된 융합 유전자에 의해 형질도입될 때 쥐 배아 섬유모세포(MEF)의 5 %가 iPSC로 재프로그래밍된다고 보고되었다. 추가로, iPSC가 되지 않은 세포를 포함한 대부분의 형질도입된 MEF에서 M3O는 만능 유전자의 염색질 리모델링을 촉진했다. 이들 관찰은 5 % 초과의 세포가 보다 선호되는 배양 조건 하에서 iPSC가 되는 능력을 획득한다는 가능성을 제안했다.
*이에 따라, 이들 결점을 다루기 위해, 본 개시는 인체의 모든 상이한 조직을 생성할 수 있는 줄기 세포를 생성하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 특정 측면에서, 본원에 개시된 방법은 메신저 RNA 분자를 사용하고 바이러스 벡터, 동물 생성물 또는 피더 세포의 필요 없이, 인간 섬유모세포에서 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로의 재프로그래밍에 사용될 수 있다. 예시적 방법 및 조성물의 사용은 이전에 보고된 세포 재프로그래밍 방법론에 비해 놀랍고 예측하지 못한 개선된 효율을 가져왔다.
이에 따라, 공지된 강력한 전사 인자, 예컨대 VP16 및 MyoD의 전사활성 도메인을 도입한, 종래의 재프로그래밍 인자, 예컨대 Oct4(Oct3/4로도 언급됨), Sox2 등의 엔지니어링된 변이체의 적용을 통해, 재프로그래밍 인자(RF) 칵테일을 개선함으로써 mRNA 매개된 재프로그래밍을 가속하는데 유용한 방법, 시약 및/또는 조성물이 제공된다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은 mRNA 기반의 재프로그래밍에 관여된 시간, 비용 및 노력을 극적으로 낮추는 피더프리, 제노프리 프로토콜을 제공한다.
일 측면에서, 본 개시는 a) Oct4, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog, 및 Lin28로부터 선택되는 임의의 하나 이상의 합성 mRNA 재프로그래밍 인자 및 전사활성 도메인간의 융합 생성물의 유효량을 포함하는 조성물로 단리된 체세포를 트랜스펙션하여 체세포를 재프로그래밍되거나 역분화시키기는 것을 포함하는, 체세포의 역분화 또는 재프로그래밍 방법을 제공한다.
일 실시양태에서, 조성물이 N-말단 MyoD 전사활성 도메인에 융합된 Oct4를 포함하는 것인 청구항 1의 방법이 제공된다. 일 실시양태에서, Oct4가 3회 일렬 반복(tandem triplicate)의 N-말단 MyoD 전사활성 도메인에 융합된다.
일 측면에서, a) 피더프리 표면의 표준 6-웰 플레이트에서 25k 내지 250k 세포/웰의 밀도로 표적 세포를 성장시키고; b) 재프로그래밍 동안 각 시간 대에 50 ng 내지 800 ng/ml mRNA의 가변 용량으로 세포를 트랜스펙션하는 것을 포함하는, 청구항 1의 임의의 하나 이상의 합성 mRNA 재프로그래밍 인자를 사용하는 포유류 세포의 재프로그래밍 방법이 제공된다.
일 실시양태에서, 표적 세포가 피더프리 표면의 표준 6-웰 플레이트에서 50k, 75k, 100k, 또는 150k 세포/웰의 밀도로 성장하고; b) 나중 시점보다 초기 시점에 더 낮은 용량이 사용되도록 재프로그래밍 동안 각 시간 대에 50 ng 내지 800 ng/ml mRNA의 가변 용량으로 세포를 트랜스펙션하며; c) 계대배양 없이 iPSC를 수득한다.
일 실시양태에서, 표적 세포가 피더프리 표면의 표준 6-웰 플레이트에서 50k, 75k, 100k, 또는 150k 세포/웰의 밀도로 성장하되, 각 웰의 부피가 적절한 배지 0.5 ml 내지 5 ml로 조정되고; b) 나중 시점보다 초기 시점에 더 낮은 용량이 사용되도록 재프로그래밍 동안 각 시간 대에 50 ng 내지 800 ng/ml mRNA의 가변 용량으로 세포를 트랜스펙션하며; c) 계대배양 없이 iPSC를 수득한다.
일 실시양태에서, 포유류 세포는 인간 세포이다. 일 실시양태에서, 방법은 제노프리이다.
일 실시양태에서, 하나 이상의 인자가 mRNA, 조절 RNA, siRNA, miRNA, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 실시양태에서, 체세포가 둘 이상의 상이한 RNA로 트랜스펙션된다. 일 실시양태에서, 체세포가 단능, 다능, 만능, 및 분화 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 실시양태에서, 하나 이상의 RNA가 체세포에서 단능, 다능, 또는 만능 세포로의 역분화를 유도한다.
일 실시양태에서, 하나 이상의 인자가 OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, KLF4 및 MYC mRNA로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 실시양태에서, OCT4, SOX2, NANOG, 및 LIN28 mRNA가 병행하여 투여된다. 일 실시양태에서, OCT4, SOX2, KLF4 및 MYC mRNA가 병행하여 투여된다.
일 실시양태에서, 트랜스펙션된 세포가 유도 만능 줄기(iPS) 세포로서 배양되어 유지된다. 일 실시양태에서, 트랜스펙션된 세포가 유도 만능 줄기 세포를 형성하고, iPS 세포를 유도하여 분화된 세포를 형성하는 단계를 더 포함한다.
일 실시양태에서, 체외에서 세포를 역분화시키고 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료하거나 또는 억제하는 방법이 제공된다. 일 실시양태에서, 조성물은 Rarg 및 LrH-1 트랜스액션 활성화 도메인을 더 포함한다. 일 실시양태에서, 조성물이 VP16 전사활성 도메인에 융합된 Oct4를 포함한다.
본원에 기재되고 청구된 발명은 이 [발명의 내용]에 제시되거나 기재되거나 또는 언급된 것들을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 많은 속성 및 실시양태를 가진다. 이는 모두를 포괄할 의도는 아니며 본원에 기재되고 청구된 발명은 오직 예시할 뿐 제한하지 않을 목적으로 포함된, 이 [발명의 내용]에서 확인된 특징 또는 실시양태에 의해 또는 그 실시양태 내로 제한되지 않는다. 추가의 실시양태가 하기 [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용]에 개시될 수 있다.
도 1. M 3 O 기반의 mRNA 재프로그래밍 칵테일에 의해 유래된 iPSC 콜로니. (A) 최초 M3O 기반의 BJ 재프로그래밍 시도로부터 유래된 2 가지 증식된 iPSC 클론의 10x 명시야(bright-field) 이미지. (B) 만능성 마커에 대한 증식된 클론의 면역염색.
도 2. M 3 O 기반의 칵테일을 사용한 피더프리 재프로그래밍. (A) c-Myc 및 L-Myc 기반의 칵테일 및 4 시간 및 24 시간 트랜스펙션 기법과 비교하는, 50K XFF 섬유모세포 상의 피더프리 유래로부터 TRA-1-60+ 콜로니 수득을 나타내는 면역형광 이미징. 모든 웰을 9 일 동안 트랜스펙션했다. 4 시간 트랜스펙션 배양물을 실험 15 일째에, 24 시간 트랜스펙션 배양물을 11일 째에 염색을 위해 고정시켰다. (B) 유래 9일 째 배양물에 현출하는 거의 충만한(confluent) hESC 유사 콜로니를 보여주는 동일한 실험에서 400 ng/ml 스템펙트(Stemfect) 웰의 10x 명시야 이미징. (C) 상피세포화 및 hESC 유사 콜로니의 후속 출현을 보여주는, 400 ng/ml 스템펙트 기법을 사용하여 100K XFF가 다시 9 일 동안 트랜스펙션되는 후속 시도에서 마킹된 시야(marked field)의 10x 명시야 시간 경과.
도 3. 4 가지 상이한 mRNA 칵테일을 사용한 재프로그래밍 효율의 비교. 4 가지 칵테일 비교 실험을 요약한 플로우차트.
도 4. HDF-a 피더프리 재프로그래밍 배양물 내 hESC 유사 콜로니. 스템펙트 트랜스펙션 시약을 사용하여 배지 보충(media supplement)으로 전달된 400 ng/ml mRNA 칵테일(M3O+ c-Myc+ Nanog+)로 9 일 동안의 처리된, 75K HDF-a 성체 섬유모세포로부터의 피더프리 유래 9 일째 출현한 hESC 유사 콜로니의 10x 명시야 이미지.
도 5. 합성 mRNA 칵테일의 생성. (A) mRNA 재프로그래밍 칵테일을 만드는 절차의 도식 요약. (B) SYBR E-겔 상의 다수의 RF를 코딩하는 합성 mRNA 및 형광 리포터. 한 레인 당 500 ng의 RNA를 로딩했다.
본 발명을 기재할 때, 본원에서 정의되지 않은 모든 용어는 당업계에서 인식된 그들의 통상적 의미를 가진다. 하기 기재가 본 발명의 특정 실시양태 또는 구체적 용도에 대한 것이므로 이는 예시적일 뿐 청구된 발명을 제한할 의도가 아니다. 하기 기재는 본 발명의 사상 및 범위에 포함되는 모든 대안, 수정 및 동등물을 커버하도록 의도된다.
분화된 세포가 선택적 군의 전사 인자의 발현에 의해 만능성 상태로 복구될 수 있음은 환자 특이적 세포가 체외에서 유전적 질환의 연구를 위해 그리고 궁극적으로 세포 대체 요법을 위해 임의의 원하는 유형의 세포를 생성하는데 사용될 수 있다는 전망을 열었다. 재프로그래밍 인자의 발현은 게놈에 인테그레이션되는 바이러스 벡터의 적용을 통해 달성될 수 있고, iPSC 유래는 여전히 레트로바이러스 또는 렌티바이러스의 인테그레이션으로 보통 수행된다. 수반되는 게놈의 변형은 iPSC의 치료 적용에 중요한 장애물을 나타내는 반면, 인테그레이션된 바이러스 카세트로부터의 재활성화된 발현의 가능성은 체외 연구에서조차 중요하다. 게놈-변형 문제점을 완화 또는 배제하는 신규 발현 벡터의 적용에서 최근 상당한 진척이 이뤄졌다. lox 재조합 부위에 근접한 단일 폴리시스트론 카세트에서 iPSC 도입에 필요한 멀티플 인자를 코딩하는 렌티바이러스 벡터가 이제 이용가능하며, 이는 Cre 재조합효소의 일시적 발현을 통한 재프로그래밍 이후 흔적이 거의 없는 전이유전자(transgene)의 절단을 가능하게 한다. 후속 절단 및 전이유전자 삽입은 트랜스포존 벡터를 사용한 뒤 트랜스포사아제의 짧은 발현에 의해서도 또한 완수될 수 있다. 아데노바이러스, 플라스미드 및 에피좀 DNA를 포함하는, 만능성을 유도하기 위해 충분한 시간 동안 재프로그래밍 인자를 일시적으로 발현할 수 있는 수 개의 상이한 유형의 비인테그레이션 DNA 벡터가 이용되었다. 낮은 효율이기는 하지만, 세포 투과 펩티드를 도입하는 재조합 RF 단백질로의 세포의 반복되는 형질도입에 의해 iPSC를 생성하는 것이 가능하다는 점 또한 증명되었다. 상대적으로 효율적인 iPSC 전환은 이제 완전히 RNA 기반의 번식 주기를 갖는 센다이(Sendai) 바이러스를 사용하거나, 또는 야마나카(Yamanaka) 인자를 코딩하는 합성 mRNA 전사물의 지속적 트랜스펙션에 의해 달성될 수 있다.
재프로그래밍(및 잠재적으로 직접 분화 및 전환분화)을 위한 mRNA 트랜스펙션의 적용은, 이 시스템이 단순히 어떤 전사물을 세포 배양액에 첨가할지를 변경함으로써 재프로그래밍 칵테일과 심지어 개별 요소 인자의 발현을 매일 조절되게 하기 때문에 매력적이다. 일단 특정 인자의 트랜스펙션이 종결되면, 세포질 내 mRNA의 빠른 붕괴 때문에 표적 세포 내 이소성(ectopic) 발현이 즉시 중단된다. 비인테그레이션 DNA 벡터 또는 RNA 바이러스와 대조적으로, 어떤 클린업도 mRNA 트랜스펙션에 요구되지 않으며, 무작위적 게놈 인테그레이션 또는 잔류 바이러스 감염의 어떠한 위험도 없다. 만약 우리가 수 회의 이소성 RF 발현이 궁극적으로 환자 생검으로부터 iPSC 중간체를 통해 원하는 유형의 전문화된 세포가 되는데 이용될 수 있다고 상상한다면, 이들 장점은 훨씬 큰 중요성을 상정한다. 그럼에도 불구하고, 현재 실행되는 것과 같은 mRNA 기반의 재프로그래밍은 결점이 있다. RF의 발현은 mRNA가 트랜스펙션된 이후 대략 24 시간 동안은 통상적으로 강하지만, 인간 세포에서 만능성을 유도하기 위해서는 약 2 주의 인자 발현이 필요하며, 따라서 이 기법으로 세포를 재프로그래밍하는데 요구되는 체험 시간은 상대적으로 길다. 모든 세포 유형과 세포 배양액이 효율적 mRNA 전달을 위해 동일하게 공헌하지는 않으며, 현재 이는 혈액 세포를 포함하는 특정 관심 세포 유형의 mRNA 기반의 재프로그래밍에 장애물이다. 지금까지는, mRNA 방법을 사용하여 세포를 iPSC로 성공적으로 재프로그래밍하기 위해 유사분열에서 정지된 섬유모세포의 피더 층을 이용하는 것이 필요하다고 밝혀졌다. 이들 피더 세포는 표적 세포가 iPSC 도입에 요구되는 장기 시간 동안 낮은 출발 농도로부터 성장함에 따라 배양물의 군집 밀도를 완충시켜, 전달된 용량의 RNA 및 트랜스펙션 시약(둘 다 관련 독성을 가짐)의 전달되는 용량을 균일하게 하고 재프로그래밍 과정에 의해 일어나는 프로-아폽토시스 및 정균 경향에 직면한 표적 세포의 생존력을 지지한다. 이 요건은 절차에 복잡도와 체험 시간을 부가하며 특히 피더가 스스로 트랜스펙션을 받을 경우 기술적 변동성의 중요한 원천이 된다. 피더 층의 존재는 재프로그래밍 과정의 모니터링 및 분석도 또한 지연시킨다. 마지막으로, 현재 인간 피더 세포가 mRNA 재프로그래밍에 대해 표준임에도 불구하고, 이들 세포는 인간이 아닌 동물 생성물이 이들의 유래 및 증식에 사용될 때 제노-생물학적 오염의 잠재적 공급원이다.
이에 따라, 이전에 공지된 절차에 관한 문제점을 고려하여, 개선된 효율의 재프로그래밍 및 개선된 질의 생성된 세포를 갖는 iPSC를 생성하기 위한 신규 방법, 물질 및 프로토콜이 본원에 제공된다. 본 발명의 실시양태는 세포에 전달된 RF 칵테일의 강화를 통해 상당히 놀랍고 예측하지 못한 개선을 성공적으로 달성하는데 사용되었다. 본 발명의 실시양태는 mRNA 재프로그래밍 과정을 압축하고 간결하게 하며, 피더 세포 또는 임의의 다른 잠재적 제노 오염된 시약의 사용 없이 인간 섬유모세포로부터 풋프린트 없는 iPSC의 생성을 지원하는 신규 프로토콜(들)을 또한 제공한다. 본원에 제공되는 신규 방법 및 조성물은 이전에 공지된 mRNA 방법의 이점을 확대하고 iPSC 기술의 치료 적용에 남아있는 걸림돌을 해결하는데 도움을 줄 것이다.
본 개시는 일반적으로, 동역학적으로 통제된 방법으로 유도 만능 줄기 세포(iPSC)의 생성을 위해 엔지니어링된 재프로그래밍 인자(들)을 사용하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 이 발명은 다양한 유형의 세포를 재프로그래밍하는데에 최적화된, 전사활성 도메인을 갖는 종래의 재프로그래밍 인자간의 융합을 포함하는 재프로그래밍 인자의 조합을 확립하는 것에 관한 것으로, 합성 메신저 RNA(mRNA)로서 이들 인자를 전이유전자 발현의 적절한 수준을 발생시키는 방법에 의해 바람직한 밀도로 배양된 포유류 세포에 도입하고, 정의된 조건 하에서 세포를 유지하여 이전에 수득할 수 없었던 효율의 재프로그래밍을 달성한다. 당업계에 공지된 다른 방법에 비해, 본 발명은 완전히 피더프리 및 제노프리일 것을 조건으로, 및 계대배양 없이, 재프로그래밍에 관여된 시간, 비용 및 노력을 극적으로 낮춘다. 본원에 개시된 물질 및 절차는 인간 섬유모세포를 포함하는 상이한 유형의 표유류 세포로부터 유도 만능 줄기 세포를 생성하는데 유용하다.
개시의 측면은 바이러스 벡터, 동물 생성물 또는 피더 세포의 필요 없이 메신저 RNA 분자를 사용하여 인체의 다양한 상이한 조직을 생성할 수 있는 줄기 세포를 생성하는 방법을 또한 제공한다. 본원에 개시된 신규 방법은 최적의 조건 하에서 놀랍고 예측하지 못한 효율로 인간 섬유모세포를 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로 재프로그래밍하는데 사용될 수 있다.
<정의>
본원에 사용되기로, 본 방법에 사용되기에 적합한 세포는 일차 세포, 및 확립된 세포주, 배아 세포, 면역 세포, 줄기 세포; 및 섬유모세포, 실질세포, 조혈 세포, 및 상피 세포를 포함한, 외배엽, 내배엽, 및 중배엽으로부터 유래된 세포를 포함하지만 이들에 제한되지 않는 분화된 세포를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 본원에 사용되기로, 줄기 세포는 단능 세포, 다능 세포, 및 만능 세포; 배아 줄기 세포, 및 성체 줄기 세포 예컨대 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 및 근육 위성 세포를 포함한다. 일 실시양태에서, 체세포는 역분화되거나 재프로그래밍된다. 임의의 적합한 체세포가 사용될 수 있다. 대표적 체세포는 섬유모세포, 각질세포, 지방세포, 근육 세포, 기관 및 조직 세포; 및 조혈 줄기 세포를 포함하는 조혈 세포 및 단기 또는 장기 조혈 이식을 제공하는 세포를 포함하지만 이들에 제한되지 않는 다양한 혈액 세포를 포함한다. 가장 선호되는 세포 유형은 인간 섬유모세포, 각질세포 및 조혈 줄기 세포를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 본 방법은 세포 게놈의 영구적 변형 없이 세포를 역분화시키거나 또는 임의적으로 재분화시키는데 특히 유용하다.
개시된 방법에 유용한 RNA는 mRNA, 조절 RNA, 또는 스몰 RNA 예컨대 siRNA 또는 miRNA를 포함하며, 여기서 하나 이상의 mRNA가 세포를 역분화시키거나 또는 재프로그래밍하도록 기능하는 폴리펩티드를 코딩한다. 트랜스펙션의 효율은 높다. 통상적으로 90 % 초과의 트랜스펙션 세포군이 도입된 RNA를 발현할 것이다. 따라서, 하나 이상의 구별되는 RNA로 세포를 트랜스펙션할 수 있다. 예컨대, 세포군은 하나 이상의 구별되는 mRNA, 하나 이상의 구별되는 siRNA, 하나 이상의 구별되는 miRNA, 또는 이들의 조합으로 트랜스펙션될 수 있다. 세포군은 단일 투여로 동시에 다수의 RNA로 트랜스펙션될 수 있거나, 또는 수 회 투여가 수 분, 수 시간, 수 일, 또는 수 주의 시차를 둘 수 있다. 다수의 구별되는 RNA의 트랜스펙션이 시차를 둘 수 있다. 예컨대, 만약 원한다면 최초 RNA가 하나 이상의 추가적 RNA의 발현 전에 발현된다.
트랜스펙션된 RNA의 발현 수준은 주입 RNA의 양을 변화시킴으로써 넓은 범위에 걸쳐 조절될 수 있어, 각 트랜스펙션된 RNA의 발현 수준을 개별적으로 조작할 수 있게 만든다. 주입 RNA의 유효량은 원하는 결과에 기초하여 결정된다. 추가로, PCR 기반의 mRNA 생성 기법은 상이한 구조 및 도메인 조합을 갖는 mRNA의 디자인을 촉진한다. 개시된 방법에 유용한 RNA는 당업계에 공지되어 있고, 표적 숙주 세포 유형 및 조작되는 경로 또는 세포 활성에 기초하여 선택될 것이다. 세포를 역분화시키는데, 예컨대, 성체 분화 체세포를 줄기 세포로 전환시키는데 유용한 구축물은 공지된 유전자, mRNA, 또는 다른 뉴클레오티드 또는 단백질 서열에 기초하여 구축될 수 있다.
본원에서 교환가능하게 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드인 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미한다. 따라서, 이 용어는 단일, 이중, 또는 다중 가닥의 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 혼성체, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 천연의, 화학적으로나 생화학적으로 변형된 비천연의, 또는 유도된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 약 5 내지 약 100 뉴클레오티드의 단일 또는 이중 가닥의 DNA의 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 그러나, 이 개시의 목적상, 올리고뉴클레오티드의 길이의 상한은 없다. 올리고뉴클레오티드는 올리고머 또는 올리고로도 또한 공지되어 있고 당업계에 공지된 방법에 의해 유전자로부터 단리될 수 있거나, 또는 화학적으로 합성될 수 있다.
본원에 사용되기로, 용어 "마이크로RNA"은 내생 마이크로RNA 및 인공 마이크로RNA(예컨대, 합성 miRNA)를 포함하지만 이들에 제한되지 않는 임의의 유형의 간섭 RNA를 의미한다. 내생 마이크로RNA는 mRNA의 생성 활용을 조절할 수 있는 게놈 내에서 천연적으로 코딩되는 스몰 RNA이다. 인공 마이크로RNA는 mRNA의 활성을 조절할 수 있는, 내생 마이크로RNA 외의 임의의 유형의 RNA 서열일 수 있다. 마이크로RNA 서열은 임의의 하나 이상의 이들 서열로 구성된 RNA 분자일 수 있다. "마이크로RNA 전구체"(또는 "전-miRNA")는 그 안에 도입된 마이크로RNA 서열을 갖는 줄기-고리 구조를 갖는 핵산을 의미한다. "성숙한 마이크로RNA"(또는 "성숙한 miRNA")는 마이크로RNA 전구체("전-miRNA")로부터 절단되거나, 또는 합성된(예컨대, 무세포 합성에 의해 실험실에서 합성됨) 마이크로RNA를 포함하고, 약 19 뉴클레오티드 내지 약 27 뉴클레오티드의 길이를 가지며, 예컨대, 성숙한 마이크로RNA는 19 nt, 20 nt, 21 nt, 22 nt, 23 nt, 24 nt, 25 nt, 26 nt, 또는 27 nt의 길이를 가질 수 있다. 성숙한 마이크로RNA는 표적 mRNA에 결합하여 표적 mRNA의 번역을 억제할 수 있다.
OCT4에 대한 예시적 게놈, mRNA(cDNA), 및 단백질 서열은 당업계에 공지되어 있다: 예컨대, 명칭 호모 사피엔스 POU 클래스 5 호메오박스 1 전사물 변이체 3, mRNA(Homo sapiens POU class 5 homeobox 1(POU5F1), transcript variant 3, mRNA)의 진뱅크(Genbank) 기탁 번호 NM_001173531.1; 명칭 호포 사피엔스 POU 클래스 5 호메오박스 1(POU5F1) 전사물 변이체 1, mRNA의 진뱅크 기탁 번호 NM_002701.4; 명칭 호모 사피엔스 POU 클래스 5 호메오박스 1(POU5F1), 전사물 변이체 2, mRNA의 진뱅크 기탁 번호 NM_203289.4의 mRNA(cDNA) 서열을 제공하는 (OCT4) POU5F1 POU 클래스 5 호메오박스 [호모 사피엔스] 진(Gene) ID: 5460를 참조. SOX2에 대한 예시적 게놈, mRNA(cDNA), 및 단백질 서열도 당업계에 공지되어 있다: 예컨대, mRNA (cDNA) 명칭 mRNA 서열 호모 사피엔스 SRY(성 결정 영역 Y)-박스 2, mRNA(mRNA sequence Homo sapiens SRY (sex determining region Y)-box 2 (SOX2), mRNA)의 진뱅크 기탁 번호 NM_003106.2를 제공하는 SOX2 SRY (성 결정 영역 Y)-박스 2 [호모 사피엔스], 진 ID: 6657을 참조. NANOG에 대한 예시적 게놈, mRNA(cDNA), 및 단백질 서열도 당업계에 공지되어 있다: 예컨대, 명칭 호모 사피엔스 Nanog 호메오박스(NANOG), mRNA의 mRNA(cDNA) 서열 진뱅크 기탁 번호 NM_024865.2를 제공하는 NANOG Nanog 호메오박스 [호모 사피엔스], 진 ID: 79923을 참조. LIN28에 대한 예시적 게놈, mRNA(cDNA), 및 단백질 서열도 또한 당업계에 공지되어 있다: 예컨대, 명칭 호모 사피엔스 lin-28 호몰로그 A (C. 엘레강스(C. elegans)) (LIN28A), mRNA의 mRNA(cDNA) 진뱅크 기탁 번호 NM_024674.4를 제공하는 LIN28A 호몰로그 A (C. 엘레강스) [호모 사피엔스], 진 ID: 79727]를 참조. KLF4에 대한 예시적 게놈, mRNA(cDNA), 및 단백질 서열은 당업계에 공지되어 있다: 예컨대, 명칭 호모 사피엔스 크루펠 유사 인자(Kruppel-like factor) 4 (장(gut)) (KLF4), mRNA의 mRNA (cDNA) 진뱅크 기탁 번호 NM_004235.4를 제공하는 KLF4 크루펠 유사 인자 4 (장) [호모 사피엔스], 진 ID: 9314]를 참조할 것. MYC에 대한 mRNA 서열도 또한 당업계에 공지되어 있다: 예컨대, 명칭 호모 사피엔스 조류 골수세포증 바이러스 발암유전자 호몰로그, mRNA(Homo sapiens v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog avian) (MYC), mRNA)의 mRNA (cDNA) 진뱅크 기탁 번호 NM_002467.4]를 제공하는 MYC v-myc 골수세포증 바이러스 발암유전자 호몰로그 (조류) [호모 사피엔스], 진 ID:4609를 참조.
"줄기-고리 구조"는 대부분 단일 가닥의 뉴클레오티드의 영역(고리 부분)에 의해 일방에 연결된 이중 가닥(줄기 부분)을 형성하도록 알려지거나 또는 예상되는 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 이차 구조를 갖는 핵산을 의미한다. 용어 "헤어핀" 및 "폴드백" 구조 또한 줄기-고리 구조를 의미하는 것으로 본원에서 또한 사용된다. 이러한 구조는 당업계에 잘 공지되어 있고 이들 용어는 당업계에서 이들의 공지된 의미로 일관되게 사용된다. 줄기-고리 구조 내 뉴클레오티드의 실체 일차 서열은 이차 구조가 존재하는 한 본 발명의 실시에 결정적이지는 않다. 당업계에 공지된 것처럼, 이차 구조는 정확한 염기쌍 형성을 필요로 하지 않는다. 따라서, 줄기는 하나 이상의 염기 불일치를 포함할 수 있다. 또는, 염기쌍 형성은 정확할 수 있다(즉, 어떤 불일치도 포함하지 않음).
본원에서 사용되기로, 용어 "줄기 세포"는 증식을 위해 유도될 수 있는 미분화된 세포를 의미한다. 줄기 세포는 각 세포 분열과 함께, 하나의 딸 세포가 또한 줄기 세포임을 의미하는 자가 유지를 할 수 있다. 줄기 세포는 배아, 태아, 생후, 유년, 또는 성체 조직으로부터 얻을 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "기원 세포"는 줄기 세포로부터 유래된 미분화된 세포를 의미하며, 그 자체로 줄기 세포는 아니다. 일부 기원 세포는 하나 초과의 세포 유형으로 분화될 수 있는 자손을 생산할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "유도 만능 줄기 세포"(또는 "iPS 세포")는 체세포, 예컨대, 분화된 체세포부터 유도되고, 상기 체세포보다 더 높은 분화능을 갖는 줄기 세포를 의미한다. iPS 세포는 자기 재생 및 성숙한 세포, 예컨대, 평활근 세포로의 분화가 가능하다. iPS는 평활근 기원 세포로의 분화가 또한 가능할 수 있다.
본원에서 사용되는 세포에 관한 용어 "단리된"은 세포가 천연적으로 존재하는 곳, 예컨대, 다세포 생물에서 세포가 천연적으로 존재하는 곳과 상이한 환경에 있는 세포로서, 이 세포가 다세포 생물로부터 제거되면 세포는 "단리된다". 단리된 유전적으로 변형된 숙주 세포는 유전적으로 변형된 숙주 세포의 혼합 군집 내에 또는 유전적으로 변형된 숙주 세포 및 유전적으로 변형되지 않은 숙주 세포를 포함하는 혼합 군집 내에 존재할 수 있다. 예컨대, 단리된 유전적으로 변형된 숙주 세포는 체외에서 유전적으로 변형된 숙주 세포의 혼합 군집 내에, 또는 유전적으로 변형된 숙주 세포 및 유전적으로 변형되지 않은 숙주 세포를 포함하는 혼합된 체외 군집 내에 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 "숙주 세포"는 핵산(예컨대, 외생 핵산)의 수령자로서 사용되거나 또는 사용될 수 있는 체내 또는 체외 세포(예컨대, 단세포 독립체로서 배양되는 진핵 세포)를 나타내며, 핵산에 의해 유전적으로 변형된 원 세포의 자손을 포함한다. 단일 세포의 자손은 자연적, 돌발적, 또는 의도적 돌연변이 때문에 원 부모와 형태학적으로 또는 게놈 또는 전체 상보적 DNA와 반드시 완전히 동일하지는 않을 수 있다고 이해된다.
용어 "유전적 변형"은 새로운 핵산(즉, 세포 외 핵산)의 도입 이후 세포에서 유도된 영구적 또는 일시적 유전적 변화를 의미한다. 유전적 변화("변형")는 새로운 핵산을 숙주 세포의 게놈으로 도입함으로써, 또는 염색체 외 요소로서의 새로운 핵산의 일시적이거나 안정적인 유지에 의해 달성될 수 있다. 세포가 진핵 세포인 경우, 영구적 유전적 변화는 핵산을 세포의 게놈으로 도입함으로써 달성될 수 있다. 유전적 변형의 적합한 방법은 바이러스 감염, 트랜스펙션, 접합(conjugation), 원형질체 융합, 전기천공법, 입자 총 기술, 칼슘 포스페이트 침전법, 직접적 미세주입법 등을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "외생 핵산"은 통상적으로나 자연적으로 발견되지 않고/않거나 자연에서 세포에 의해 생산되지 않고/않거나 (예컨대, 전기천공법, 트랜스펙션, 감염, 리포펙션, 또는 핵산을 세포로 도입하는 임의의 다른 수단에 의해) 세포로 도입되는 핵산을 의미한다.
본원에 사용되는 용어 "치료", "치료하는" 등은 원하는 약학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 효과는 질환 또는 그의 증상을 완전히 또는 부분적으로 방지하는 측면의 예방일 수 있고/있거나 질환 및/또는 질환에 의한 부작용의 부분적 또는 완전한 치유의 측면의 요법일 수 있다. 본원에서 사용되는 "치료"는 포유류에서, 특히 인간에서 질환의 임의의 치료를 커버하며, (a) 질환에 취약할 수 있지만 질환을 가진다고 아직 진단되지는 않은 대상체에서 질환이 발병하지 않도록 예방; (b) 질환의 억제, 즉, 질환의 전개의 정지; 및 (c) 질환의 완화, 즉 질환의 퇴행의 유발을 포함한다.
본원에서 교환가능하게 사용되는 용어 "개체", "대상체", "숙주" 및 "환자"는 인간, 인간이 아닌 영장류, 설치류(예컨대, 쥐, 래트 등), 유제류, 개과, 토끼목, 고양이과 등을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 포유류를 의미한다. 일부 실시양태에서, 관심 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이 아닌 동물 예컨대 설치류 또는 토끼목이다.
"치료학적 유효량" 또는 "효과량"은 질환을 치료하기 위해 대상체에 투여될 때 질환에 대한 이러한 치료를 완수하는데 충분한 양의 화합물, 핵산, 또는 충분한 수의 세포를 의미한다. "치료학적 유효량"은 화합물 또는 세포, 질환 및 그의 중증도 및 치료되는 개체의 중증도 및 연령, 중량 등에 따라 달라질 것이다.
본 발명이 추가로 기술되기 전에, 이 발명은 기재된 특정 실시양태에 제한되지 않고, 당연히 가변적일 수 있음을 이해하여야 한다. 본 발명의 범위가 첨부된 청구항에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 본원에서 사용되는 용어는 오직 특정 실시양태만을 기재할 목적이며 제한할 목적이 아님을 또한 이해하여야 한다.
수치의 범위가 제공되는 경우 사이 값은, 그 범위 및 임의의 달리 언급되거나 그 언급된 범위 내 사이 값의 상한 및 하한 사이에서 문맥상 달리 명시되지 않으면, 하한의 단위의 십분의 일까지 본 발명 내로 포섭되는 것으로 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 이 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있고, 언급된 범위 내 임의의 구체적으로 배제된 한계치 외에는 본 발명에도 또한 포섭된다. 언급된 범위가 한계치의 한쪽 또는 두쪽 모두를 포함할 때, 이들 포함된 한계치의 한쪽 또는 두쪽 모두를 배제하는 범위가 본 발명에 또한 포함된다.
달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 이 발명이 속한 분야의 통상의 기술자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 테스트에 또한 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질은 하기에 기재된다. 본원에서 언급된 모든 간행물은 그와 관련하여 간행물에서 인용되는 방법 및/또는 물질을 개시하고 기재하도록 본원에 참조문헌으로 포함된다.
본 개시의 일 측면에서, mRNA 기반의 재프로그래밍은 N-말단 MyoD 전사활성 도메인(문헌[Hirai et al, Stem Cells, 2011]) 또는 C-말단 VP16 전사활성 도메인의 3중 반복부(문헌[Wang et al, EMBO Reports, 2011]; 여기서 합성 재프로그래밍 인자가 VP16 전사활성 도메인을 OCT4(Pou5f1로도 또한 알려짐), NANOG 및 SOX2에 각각 융함함으로써 제조되며, 이들 합성 인자는 쥐와 인간 섬유모세포 둘 모두를 강화된 효율 및 가속된 동역학으로 재프로그래밍할 수 있음)를 도입한 Oct4 또는 Sox2의 엔지니어링된 변이체의 사용을 통해, 또는 "표준" RF 칵테일을 두 가지 추가 인자, Rarg 및 Lrh-1로 증강시킴으로써(문헌[Wang et al, PNAS, 2011]) 강화될 수 있다. 그의 각 내용은 본원에 참조문헌으로 포함된다. 강한 전사 활성자는 특이적 부위의 DNA에 결합될 때 다수의 염색질 리모델링 복합체를 효과적으로 동원할 수 있다. 좋은 예시는 분화 세포의 운명을 스위칭할 수 있는 골격근 형성의 마스터 전사 인자인 MyoD이다. 히라이(Hirai) 등은 MyoD가 그토록 강력한 전사 인자이기 때문에, 이는 만약 함께 융합된다면 iPS 인자에의 염색질 접근성을 증가시킬 수 있을 것이라 추측했다. 쥐 또는 인간 세포가 Sox2 및 Klf4와 함께 Oct- MyoD TAD 융합 유전자를 운반하는 레트로바이러스 벡터로 형질도입되면 이들은 iPSC 콜로니의 수를 정규(canonical) iPS 인자에 비해 50 배까지 높였다. 유사하게, 그의 강한 전사 활성자로서 광범위하게 공지된 VP16은 상이한 iPS 인자에 융합될 때 재프로그래밍의 강한 촉진 효과를 나타낼 수 있다.
<인간 iPSC의 예시적 제조>
본 방법은 예컨대, 추가로 조절되어 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 및 근육 위성 세포; 또는 적혈구, 림프구를 포함하는 백혈구, 혈소판, 기질 세포, 지방 세포; 파골 세포를 포함하는 골 세포, 피부 세포를 포함하는 상피 조직, 평활근, 골격근, 및 심근을 포함하는 근육 조직, 내피 세포를 포함하는 혈관 조직, 간세포를 포함하는 간 조직, 및 뉴런을 포함하는 신경 조직을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 인간 조직의 분화 세포를 형성하도록 추가로 조절될 수 있는 iPS 세포를 생산하기 위해 세포의 재분화 또는 재프로그래밍에도 또한 광범위하게 사용될 수 있다. iPS 세포에서 심근세포, 조혈 줄기 세포, 골 세포, 예컨대 파골세포, 간세포, 망막 세포, 및 뉴런; 단리된 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 및 유도 만능 줄기 세포를 포함하지만 이들에 제한되지 않는 줄기 세포를 포함하지만 이들에 제한되지 않는 다양한 분화 세포 유형으로의 분화를 유도하는 방법은 분화를 유도하는 RNA에 의한 일시적 트랜스펙션에 의해 분화되도록 유도될 수 있다. 추가로, 또는 대안으로, 세포는 세포 유형 특이적 조건 하에서 세포를 배양시킴으로써 재분화될 수 있다. 예컨대, iPS 세포는 CF-1 피더 상에서 유지되고 피더프리 조건에 후속 적응될 수 있다. iPS 세포는 노긴(noggin), Dkk-1, 및 IGF-1의 존재 하에서 세포를 배양시킴으로써 분화된 망막 세포를 형성하도록 유도될 수 있다.
이전에 보고된 방법론은 변형된 인자를 수행하기 위해 벡터, 즉 바이러스 또는 플라스미드를 인테그레이션하는 것에 의존했다. 일 실시양태에서, 재프로그래밍 시도는 5 개의 mRNA 재프로그래밍 인자(Oct4, Sox2, Klf4, cMyc-T58A 및 Lin28), 전사물, 또는 Rarg 및 Lrh-1을 포함하는 7-재프로그래밍 인자 RF 칵테일을 포함하는 6 가지 상이한 mRNA 조합 칵테일의 성능을 비교하면서 수행됐고, 각 조합은 야생형의 Oct4 및 MyoD- 및 VP16-Oct4 융합 구축물(M3O 및 VPx3으로 각각 표시됨) 기반의 3 가지 변이에서 테스트됐다. BJ 섬유모세포는 피더 기반의 재프로그래밍 배양으로 11 일 동안 트랜스펙션됐으며, 이때까지 진화된 형태학이 수 개의 웰에서 분명했다. 다음 수 일 동안, 특징적 hESC 형태학을 갖는 콜로니가 야생형 Oct4 및 M3O에 기반한 칵테일로 트랜스펙션된 웰에 출현했다. VPx3-트랜스펙션된 배양에서의 표적 세포는 섬유모세포의 형태학을 유지했으나, 가속된 성장 및 증식소로 응집되는 일부 경향을 보여줬고 콜로니가 출현하지 않았다. 야생형 Oct4 및 M3O 기반의 칵테일의 5-인자 및 7-인자 실시양태는 유사한 콜로니 생산성을 보여줬고, 따라서 칵테일 내 Rarg 및 Lrh-1의 포함으로부터의 이점이 없었다. 그러나, M3O 칵테일은 야생형 Oct4에 의해 생산된 콜로니의 수의 수 배를 제공했다. 이 결과에 따라, 콜로니를 증식 및 추가 분석을 위해 M3O 5-인자 웰로부터 피킹했다(도 1). M3O 유래된 콜로니의 만능성은 핵과 세포 표면 마커에 대한 면역염색 및 3 가지 일차 배엽 층으로의 체외 분화에 의해 확인됐다. 6 가지 증식된 iPSC 클론은 핵형 분석 및 DNA 핑거프린팅을 받았고, 세포의 정상 핵형과 BJ 혈통이 모든 경우에서 확인됐다.
본 방법은 예컨대, 추가로 조절되어 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 및 근육 위성 세포; 또는 적혈구, 림프구를 포함하는 백혈구, 혈소판, 기질 세포, 지방 세포, 파골세포를 포함하는 골 세포, 피부 세포를 포함하는 상피 조직, 평활근, 골격근, 및 심근을 포함하는 근육 조직, 내피 세포를 포함하는 혈관 조직, 간세포를 포함한는 간 조직, 및 뉴런을 포함하는 신경 조직을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 인간 조직의 분화 세포를 형성할 수 있는 iPS 세포를 생산하기 위한 세포의 재분화 또는 재프로그래밍에도 또한 광범위하게 사용될 수 있다. iPS 세포에서 심근세포, 조혈 줄기 세포, 골 세포, 예컨대 파골세포, 간세포, 망막 세포, 및 뉴런을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 다양한 분화 세포 유형으로의 분화를 유도하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(문헌[Song at al., Cell Res., 19(11):1233-42 (2009), Lamba et al., PLoS One, 5(1):e8763 (2010), Gai et al., Cell Biol Int. 200933(11):1184-93 (2009). Grigoriadis et al., Blood, 115(14):2769-76 (2010)]). 단리된 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 및 유도 만능 줄기 세포를 포함하지만 이들에 제한되지 않는 줄기 세포는 분화를 유도하는 RNA에 의한 일시적 트랜스펙션에 의해 분화되도록 유도될 수 있다. 추가로, 또는 대안으로, 세포는 세포 유형 특이적 조건 하에서 세포를 배양함으로써 재분화될 수 있다. 예컨대, iPS 세포는 CF-1 피더 상에서 유지되고 피더프리 조건에 후속 적응될 수 있다. iPS 세포는 노긴, Dkk-1, 및 IGF-1의 존재 하에서 세포를 배양함으로써 분화된 망막 세포를 형성하도록 유도될 수 있다. 또다른 측면에서, mRNA 칵테일의 효능은 Nanog 전사물의 포함에 의해 추가로 강화될 수 있다. 이 실시양태에서, 피더 상에서 50K BJ 섬유모세포를 함유하는 4 가지 웰이 야생형 Oct4 또는 M3O 기반의 5-인자 또는 6-인자 칵테일로 6 일 동안 트랜스펙션됐고, 그 다음 각 배양물을 6-웰 플레이트에서 군집화되도록 신선한(fresh) 피더 상에서 1:6으로 계대배양했다(도 4). 트랜스펙션은 각 플레이트에서 추가로 0-5 일 동안 계속됐다. iPSC 생산성에 관한 상이한 칵테일 및 트랜스펙션 시간 경과의 영향력을 평가하기 위해 배양물은 TRA-1-60 항체로 18 일째(0 일째는 최초 트랜스펙션에 해당됨) 고정되고 염색됐다. 결과는 칵테일에의 Nanog의 첨가는 이용된 Oct4 변이체와 무관하게 매우 유리한 반면, M3O와 Nanog가 함께 사용될 때 최대의 전환 효율이 수득된다는 점을 보여줬다.
일 실시양태에서, M3O 기반의 5-인자 또는 6 인자 칵테일의 효능이 3 가지 추가적 인간 섬유모세포주(HDF-f, HDF-n 및 XFF)를 사용한 추가의 피더 기반의 실험에서 확인됐다. 재프로그래밍 동역학 및 효율은 이들 3 가지 낮은 계대 세포주 모두에 의해 현저히 개선되어, 정상 증식 배양의 BJ보다 더 빠른 원 군집 2 배화 시간을 나타냈다. 일부 경우에서, 우리는 트랜스펙션 최소 6일만에 hESC 유사 콜로니를 얻었으나, 수율은 트랜스펙션이 추가 수 일 동안 계속된 실험에서 훨씬 더 높았다. 신선한 세포의 첨가에 의한 피더 층의 주기적 강화에 관한 실험은, 이 전략이 일부 이점을 제공할 수 있지만, 그 결과로 발생하는 프로토콜의 복잡성으로 인해 상쇄된다는 점을 제안했다. 따라서 우리는 간소화된 피더프리 프로토콜의 개발을 위해 더 강력한 칵테일을 적용하는데 초점을 맞추기로 결정했다.
본 개시는 피더프리 iPSC의 생성에 관한 것이다. 피더 독립적 iPSC 유래는 일반적으로 이용되는 재프로그래밍 기술과 무관하게 다소 난해하다고 밝혀졌으나, 지속 트랜스펙션 기법의 맥락에서 특수한 난점을 부가한다. 세포 생존력 및 증식 활성을 손상시키지 않으면서 섬유모세포가 플레이팅될 수 있는 밀도에는 하한이 존재한다. 세포가 드문(sparse) 배양에서 유사분열적 정지 또는 아폽토시스를 겪는 세포의 경향은 세포가 트랜스펙션에 의해 및 재프로그래밍 인자의 이소성 발현에 의해 스트레스를 받으면 악화된다. 더욱이, 피더 기반의 재프로그래밍에서 높은 세포 밀도 특성에 대한 내성이 충분한 RNA 용량은 세포가 거의 없는 분포일 때 더 심각한 세포독성 효과를 발생시킨다. 동시에, mRNA 트랜스펙션에 의해 달성될 수 있는 발현의 침투는 아마도 접촉 억제(contact inhibition)와 연관된 엔도사이토시스의 하향조절 및 G1 정지 때문에 섬유모세포가 충만성(confluence)에 도달한 뒤에 급격히 하강한다. 밀집 배양에서 트랜스펙션의 이러한 감소된 허용도는 세포에서 상피-중간엽 전환(MET)이 일어난 후 재프로그래밍 동안 완화되는 것으로 보인다. 그러나, 현재의 mRNA 칵테일을 사용할 때 인간 섬유모세포가 MET에 도달하기 위해 통상적으로 요구되는 ~7 일은 심지어 세포가 최저 생존가능한 최초 밀도로 플레이팅된다고 하더라도 섬유모세포의 과성장의 문제를 저지하는 것을 어렵게 만든다. 세포는 이 운명을 연기하기 위해 계대배양에 의해 얇아질 수 있지만, 그러나 매우 스트레스 받은 재프로그래밍 중간체의 플레이팅 효율은 예측하기 어렵고, 어떤 경우에도, 계대배양 기반의 유래 프로토콜은 편의성을 희생하고 고용량 적용에 들어맞지 않는다.
본 개시는 MET의 표현형 표시(섬유모세포 과정의 퇴화, 및 증식소의 출현 및 조약돌 형태)에 관한 것이다. 일 실시양태에서, MET는 다양한 저 밀도에서(웰 당 50K 대 100K 대 150K) 표적 세포의 계대배양, 시딩 없이 6-인자 M3O 칵테일을 사용한 피더프리 재프로그래밍을 가능하게 하는 강화된 칵테일을 사용한 우리의 발명에 의해 가속됐다.
본 발명의 일 측면은 이들 재프로그래밍 배양의 운명에 관한 것으로, 이는 아마도 과도한 세포독성과 섬유모세포 과성장의 효과가 모두 트랜스펙션 기법의 경과에 걸쳐 자기 강화되기 때문에 시딩 밀도에 매우 민감한 것으로 밝혀졌다. "표준" RNA 용량(웰 당 1200 ng)을 사용한 실험에서, 12 개의 hESC 유사 콜로니가 웰 당 100K로 플레이팅된 HDF-n 및 XFF 섬유모세포로부터 얻어진 반면, 상응하는 50K 및 150K 배양은 각각 군집 파괴 및 섬유모세포 과성장에 의한 결과로서 오직 약간의 콜로니만을 제공했다. 2 가지 상이한 섬유모세포주 BJ 및 HDF-a에 의해 시도된 유래에서, 가장 유망한(150K) 배양조차 충만성에 도달한 직후 사실상 정적으로 유지됐고 이후 지연된 동역학을 갖는 드문 콜로니만을 제공했다.
본 발명의 일 특정 실시양태에서, 우리는 대기에서 5 % 산소 배양으로 스위칭했고 스트레스에 의해 유도된 세포 노화를 최소화하려고 트랜스펙션의 최초 4 일에 걸쳐 1/4 용량에서부터 전체 RNA 용량으로 늘렸다.
본 발명의 일 예시에서, 이들 신규 조건을 사용하여 발명자들은 만약 c-Myc의 L-Myc로의 치환이 추가로 재프로그래밍 칵테일을 개선할 수 있는지 테스트했다.
또다른 실시양태에서 우리는 RNA를 4 시간 전에 분리 단계에서 전달하기보다 매일 배지를 갈아주면서 세포에 첨가함으로써 간소화된 트랜스펙션 계획을 평가했다. RNA 투여량은 예상되는 세포독성의 증가를 보상하기 위해 "24 시간 트랜스펙션" 웰에서 양을 낮췄고 2 가지 상이한 트랜스펙션 시약을 테스트했다(RNAiMAX 및 스템펙트(Stemfect)). XFF 세포를 웰 당 50K로 플레이팅했고 9 일 동안 트랜스펙션했다. 종래의 "4 시간 트랜스펙션" 기법은 c-Myc 기반의 칵테일에서 웰 당 수 백 배 수준의 TRA-1-60+ 콜로니를 제공한 반면 L-Myc 칵테일은 비교적 저조하게 수행됐다(도 2). "24 시간 트랜스펙션" 배양의 결과는 보다 더 인상적이었다. 이들 웰에서 가장 생산적인 경우(c-Myc 400 ng/ml 스템펙트 조건에 해당됨), 배양물은 9 일째, 마지막 트랜스펙션 24 시간 이후 hESC 유사 세포에 의해 거의 과성장되었다. "24 시간 트랜스펙션"의 더 우수한 성능에 대한 기계적 기저는 세포에 의해 방출된 확산 인자를 집중시킴으로써 묽은 배양물의 유효 밀도를 증가시키는 효과를 제공할 수 있다. 이들 선호되는 프로토콜 조건이 웰 당 75K 세포로 시딩된 배양에서 HDF-a 섬유모세포를 사용한 유래의 또다른 예시적 실험에 적용될 때, 생산성은 활발히 증식하는 XFF 세포일 때 달성된 것보다 덜 극적이었지만, 그러나 많은 hESC 유사 콜로니가 이미 프로토콜의 9일째에 다시 출현했다(도 4).
일 특정 실시양태에서, 세포가 흔히 사용되는 부피, 예컨대, 1 ml, 0.75 ml, 0.5 ml, 또는 세포 배양을 여전히 지속할 수 있는 최소 양의 배지보다 더 낮은 부피의 배지에 시딩될 때, 상기 개시된 조건을 사용한 재프로그래밍의 효율은 명백히 개선된다. 재프로그래밍 동안의 이러한 저 부피 조건은 본 발명에서 본원에 포함된다.
본원에 기재된 실시양태는 물론 본 발명의 유일한 적용이 아니다. 당업계의 통상의 기술자는 본 개시가 약간 가변적인 조건 하에서나 또는 재프로그래밍, 직접 분화, 또는 전환분화를 위한 종래의 또는 엔지니어링된 인자의 유사한 조합으로 다른 세포를 재프로그래밍하는데에도 또한 유용하다는 점을 인식할 것이다.
다른 실시양태에서, 인자 화학양론의 추가 최적화가 재프로그래밍의 페이스를 또한 강화시킨다―실제로, mRNA 방법은 ipPSC 유도의 초기 및 후기 단계를 독립적으로 취급하는 칵테일을 정의할 기회를 제공한다. M3O를 사용하여 얻는 점은 iPSC 생성을 위한 신규, 엔지니어링된 재프로그래밍 인자의 최근 적용에 대한 새로운 확인을 제공한다. 이렇게 엔지니어링된 다른 재프로그래밍 인자는 VP16 또는 MYOD, 예컨대 GAL4, GATA1, P53 등 외의 인자의 전사활성 도메인과 SOX2, KLF4, CMYC, LMYC, LIN28, NANOG 등의 융합을 포함한다. mRNA를 전달하는데 사용되는 시약 및 방법론은 siRNA 및 miRNA를 공동 트랜스펙션하는데 또한 사용될 수 있으며, iPSC 생성에서 이들의 가치는 이미 증명되었음을 알야야 한다. 그럼에도 불구하고, 본원에 개시된 피더프리 프로토콜은 노동 및 재료비에서의 동일하거나 더 큰 감소와 함께 재프로그래밍에 요구되는 시간을 절반까지 낮추고, 절차에서 번거로운 단계를 제거하고, 성장 인자 또는 시토카인―즉, 배지 보충과 거의 동일한 용이함으로 mRNA가 세포에 전달되게 하여, 현재의 프로토콜에 비해 상당한 진보를 보여준다.
일부 실시양태에서, 세포는 면역 반응을 조절하도록 재프로그래밍된다. 예컨대, 림프구는 면역 내성, 특히 자가-내성의 증가 또는 전달을 위해 그를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있는 조절 T 세포로 재프로그래밍될 수 있다. Foxp3 양성 T 세포의 유도 또는 투여는 자가면역 반응 예컨대 이식 거부를 낮추고 및/또는 자가면역 질환 또는 장애, 예컨대, 당뇨병, 다발성 경화증, 천식, 염증성 장 질환, 갑상선염, 신질환, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 원형 탈모증, 강직 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨(Addison) 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이 질환, 자가면역 림프증식성 증후군(ALPS), 자가면역 혈소판감소성 자반증(ATP), 베체트(Behcet) 질환, 수포성 유천포창, 심근병증, 복강 스프루-피부염, 만성 피로 증후군 면역 결핍 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 반흔성 유천포창, 한랭 응집소 질환, 크레스트 증후군, 크론 질환, 데고(Dego) 질환, 피부근염, 피부근염―소아, 원판상 루푸스, 원발성 혼합 한냉-글로블린증, 섬유근육통―섬유근염, 그레이브(Grave) 질환, 기안-바레(Guillain-Barre), 하시모토(Hashimoto) 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소증 자반증(ITP), IgA 신병증, 인슐린 의존성 당뇨병(유형 I), 소아 관절염, 메니에르(Meniere) 질환, 혼합 결합 조직 질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다분비선 증후군, 류마티스성 다발근육통, 다발근염 및 피부근염, 일차 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 레이노(Raynaud) 현상, 라이터(Reiter) 증후군, 류마티스성 열, 사르코이드증, 경피증, 쇼그렌(Sjogren) 증후군, 강직 증후군, 다카야스(Takayasu) 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 궤양성 결장염, 포도막염, 혈관염, 백반증, 및 베게너(Wegener) 육아종증의 하나 이상의 증상을 감소, 억제 또는 경감시키는데 유용할 수 있다.
본 방법은 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 상처 치유, 및 다발성 경화증과 같은 질환을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 다양한 질환 및 장애의 치료에 유용할 수 있는 세포를 생성하는데 사용될 수 있다. 본 방법은 기관 재생 및 면역 체계의 복원 또는 보충에도 또한 유용하다. 예컨대, 분화의 상이한 스테이지의 세포, 예컨대 iPS 세포, 조혈 줄기 세포, 다능 세포 또는 단능 세포 예컨대 전구 세포, 예컨대, 상피 전구 세포 등이 정맥 내로 또는 국부 수술에 의해 투여될 수 있다. 본 방법은 다른 종래의 방법 예컨대, 약제 처방법, 수술, 호르몬 요법, 화학요법 및/또는 방사선요법과 병행하여 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 키트는 RNA, 세포, 및 세포로 RNA를 트랜스펙션하는 수단을 포함한다. RNA는 동결건조될 수 있거나 또는 용액 내에 있을 수 있다. 키트는 다른 물질 예컨대, 세포 배양 시약을 임의적으로 포함할 수 있다. 대안의 실시양태에서, 키트는 개시된 방법에 따라 제조된 재분화되거나, 역분화되거나, 또는 재프로그래밍된 세포를 제공하고, 추후 사용을 위해 냉동 또는 동결되어 저장 및/또는 선적된다. 세포는 통상적으로 생존력을 유지하는 용액으로 저장된다. 세포를 포함하는 키트는 세포가 4 ℃ 미만, 바람직하게는 -20 ℃ 미만으로 유지되도록 드라이 아이스를 함유하는 냉각기 안과 같은 생존력을 보장하는 방법을 사용하여 저장 또는 선적되어야 한다.
키트는 임의적으로 하기 중 하나 이상을 포함한다: 생물활성제, 배지, 부형제; 및 주사기, 바늘, 실, 거즈, 붕대, 소독제, 항생제, 국소 마취제, 진통제, 수술용 실, 가위, 메스, 멸균 유체, 및 멸균 용기 중 하나 이상. 키트의 부품은 별도 포장될 수 있고 멸균될 수 있다. 키트는 일반적으로 용기, 예컨대, 시판하는데 적합한 플라스틱, 판지, 또는 금속 용기 내에 제공된다. 임의의 키트는 사용을 위한 지시사항을 포함할 수 있다. 본 방법은 신경변성 질환 예컨대 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 및 다발성 경화증을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 다양한 질환 및 장애의 치료에 유용할 수 있는 세포를 생성하는데 사용될 수 있다. 본 방법은 장기 재생 및 면역 체계의 복원 또는 보충에도 또한 유용하다. 예컨대, 분화의 상이한 스테이지에서의 세포 예컨대 iPS 세포, 조혈 줄기 세포, 다능 세포 또는 단능 세포 예컨대 전구 세포, 예컨대 상피 전구 세포 등이 정맥 내로 또는 국부 수술에 의해 투여될 수 있다. 본 방법은 다른 종래의 방법 예컨대, 약제 처방법, 수술, 호르몬 요법, 화학요법 및/또는 방사선요법과 병행하여 사용될 수 있다.
본 개시의 측면은 줄기 세포의 배양 시스템 및 상처 치료를 위한 피부 조직 세포 생성을 위한의 분화 방법, 및 관절염, 루푸스, 및 다른 자가면역-관련 질환의 치료를 위한 줄기 세포 요법을 제공한다.
<실시예>
이제 본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 기재된다. 이들 실시예는 오직 예시적 목적으로만 제공되며 본 발명은 이들 실시예에 제한되지 않으며, 오히려 본원에 제공되는 사상의 결과로서 자명한 모든 변형을 포괄한다.
<실시예 1: IVT 주형의 생성>
체외 전사(IVT) 주형에서의 선형 PCR-생성물의 생성을 위한 플라스미스 구축물을 라이게이션 독립적 클로닝(Ligation Independent Cloning; LIC)을 사용하여 구축했다. 우리는 관심 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF) 인서트를 수용하도록 디자인된 삽입 부위와 인접한 5' 및 3' 미번역 부위(UTR)를 도입한 부모 플라스미드(pIVT)를 먼저 구축했다. ORF 인접 서열은 문헌[Warren et al, Cell Stem Cell]에 기재되며, 낮은 이차 구조 리더 및 강한 코자크(Kozak) 부위(5' UTR) 및 뮤린 α-글로빈 3' UTR를 포함한다. 5' 돌출부(overhang)을 갖는 선형화된 형태의 pIVT 벡터를 말단 프라이머를 사용하여 플라스미드로부터 증폭된 2 가지 PCR 생성물의 재어닐링에 의해 생산했다. 상보적 돌출부를 갖는 ORF PCR 생산물을 유사한 절차에 의해 생산했고, 벡터 PCR 생산물과 풀링(pool)하였고, 유전자 특이적 구축물(pIVT-KLF4 등)을 클로닝하기 위해 열 충격에 의해 DH5α 박테리아로 형질전환했다. 문헌[Warren et al, Cell Stem Cell, 2010]에 기재된 것처럼, 생성된 플라스미드를 T7 프로모터, UTR 인접 ORF 및 폴리A 꼬리의 부가를 일으키기 위한 T120 꼬리를 도입한 선형 IVT 주형을 만들기 위해 PCR 반응의 주형으로 사용했다. T120 꼬리 영역을 말단 역방향 프라이머(T120CTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCA)의 사용을 통해 도입했다. M3O 및 VPx3 융합 구축물을 위해, 전사활성 도메인을 코딩하는 서열을 말단 프라이머를 사용한 PCR에 의해 ORF에 부가했다. PCR 생산물 주형 스톡을 ~100 ng/uL의 농도로 유지했다.
<실시예 2: mRNA 칵테일의 생산>
mRNA 합성 과정은 도 5에 요약된다. 높은 퍼센트의 캡핑된 전사물을 생성하기 위해 4:1의 ARCA 캡 유사체 대 GTP의 비율을 사용하여 IVT 반응으로 합성 mRNA를 생성했다. 뉴클레오티드 트리포스페이트(NTP) 혼합물 중 CTP의 5m-CTP로의 치환 및 UTP의 의사(pseudo)-UTP로의 전체 치환을 이용하여 RNA 생산물의 면역원성을 감소시켰다. 캡 유사체 및 변형된 NTP를 트리링크 바이오테크놀로지스(Trilink Biotechnologies)에서 구입했다. IVT 반응을 수행하는데 사용된 메가스크립트(MEGAscript) T7 키트(앰비온(Ambion))에서 제공되는 표준 NTP을 대체하여 2.5x NTP 혼합물을 제조했다(15:15:3.75:3.75:3.75 mM의 ARCA:ATP:5m-CTP:GTP:의사-UTP ). 각 40 uL IVT 반응물은 16 uL NTP 혼합물, 4 uL 10x T7 완충액, 16 uL DNA 주형 및 4 uL T7 효소를 포함했다. 반응물을 37 ℃에서 4-6 시간 동안 인큐베이션하였고 그 다음 2 uL TURBO DNA 분해효소로 37 ℃에서 추가 15 분 동안 처리한 후 메가클리어(MEGAclear)(앰비온) 스핀 컬럼 상에서 정제하여 RNA 생산물을 100 uL의 부피로 용출했다. 캡핑되지 않은 전사물로부터 면역원인 5'-트리포스페이트 부분을 제거하기 위해, 10 uL의 안타르틱 포스파타제(Antarctic Phosphatase) 반응 완충액 및 3 uL의 안타르틱 포스파타제(NEB)를 각 프렙에 첨가했다. 포스파타제 반응물을 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션했고 IVT 생산물을 재정제했다. RNA 수율을 나노드롭(써모사이언티픽(Thermo Scientific)으로 정량화했고, 프렙을 TE pH 7.0(앰비온)의 첨가에 의해 100 ng/uL의 표준화된 작업 농도로 최종 조정했다. 원하는 화학양론 비율로 다양한 RF를 나타내는 프렙을 풀링함으로써 RNA 칵테일을 제조했다. 각 RF의 분획을, 3x 몰 농도로 포함된 Oct4와 그의 유래물을 제외하면 모든 RF가 동일 몰로서 각 전사물의 예측된 분자량을 고려하여 사용했다. 짧은 수명의 핵 위치선정된 단량체 LanYFP 형광 단백질을 코딩하는 mRNA의 10 % 스파이크를 칵테일에 첨가하여 재프로그래밍 시도 동안 트랜스펙션 효율의 모니터링을 촉진했다.
<실시예 3: 세포 및 배양액>
재프로그래밍을 위한 표적 세포는 BJ 신생아 섬유모세포(ATCC), HDF-f 태아 섬유모세포, HDF-n 신생아 섬유모세포 및 HDF-a 성체 섬유모세포(사이언셀(ScienCell), 및 XFF 제노프리 신생아 섬유모세포(밀리포어(Millipore))를 포함했다. 증식 배양을 BJ, HDF 및 XFF 세포 각각에 대해 BJ 배지(DMEM +10 % FBS), 사이언셀 섬유모세포 배지, 및 피브로그로(FibroGRO) 제노프리 인간 섬유모세포 증식 배지(밀리포어)에서 수행했다. 사용된 피더 세포는 3001G 조사된 신생아 인간 포피 섬유모세포(글로벌스템(GlobalStem)) 및 피브로그로 미토마이신 C-불활성화된 제노프리 인간 신생아 섬유모세포(밀리포어)였다. 제노프리 피더 기반 및 피더프리 재프로그래밍 시도에 적합한 세포 계대배양 단계를 트립LE 셀렉트(TrypLE Select)(지브코(Gibco)), 동물 생성물이 없는 세포 해리제를 사용하여 수행했다.
<실시예 4: 인간 섬유모세포의 재프로그래밍>
기재된 모든 재프로그래밍 실험을 제조자의 지시에 따라 셀스타트(CELLstart)(지브코) 제노프리 기질로 코팅된 6-웰 조직 배양 플레이트에서 수행했다. 글로벌스템 피더를 FBS 함유 BJ 배지를 사용하여 초기 BJ 재프로그래밍 실험에서 웰 당 250K로 플레이팅했다. 일부 나중의 피더 기반의 시도에서, 시딩 밀도가 증가하여 신규 RF 칵테일을 사용하면서 접하게 되는 고 소모율에 대한 반응으로 거의 충만한 피더 층을 지속시키기 위해 배지 변경 동안 즉석에서 피더를 즉석에서 보충했다. 사용된다면, 제노프리 피더는 무혈청으로 플루리톤(Pluriton) 기반의 재프로그래밍 배지에 플레이팅됐다. 표적 세포를 항생제 추가 플루리톤 무혈청 배지(스템젠트(Stemgent), 플루리톤 보충제 및 200 ng/ml B18R 인터페론 억제자(이바이오사이언스(eBioscience))로 플레이팅했다. 배지를 최종 트랜스펙션 하루 후에 B18R 보충을 중단하면서 재프로그래밍 동안 및 재프로그래밍 후에 매일 교체했다. 재프로그래밍 동안 세포를 신선한 피더 상에 분포시킨 실험에서, 10 uM Y27632(스템젠트)를 재플레이팅에 사용되는 배지에 포함시켰다. 트랜스펙션을 표적 세포의 시딩 하루 후에 시작했고, 문헌에 표시된 기간 동안 24 시간 간격으로 반복했다. 달리 언급되지 않으면, 매일의 배지 교체 4 시간 전에 RNAiMAX(인비트로젠(Invitrogen))를 사용하여 각 웰에 1200 ng의 RNA 용량을 전달했다. RNAiMAX 기반의 트랜스펙션 칵테일을 칼슘/마그네슘 없는 DPBS로 100 ng/uL RNA를 5 x로, 및 동일한 희석제로 1 ug의 RNA 당 5 uL의 RNAiMAX를 10 x로 희석하여 만들었고, 10 ug/uL RNA/비히클 현탁액을 생성하도록 풀링했고 15 분의 상온 인큐베이션 이후 배양액에 분배했다. 스템펙트 시약(스템젠트)을 사용한 트랜스펙션을 위해, RNA 및 스템펙트(1 ug의 RNA 당 4 uL)을 스템펙트 완충액에 혼합하여 10 ng/uL의 RNA 농도를 제공했다. 혼합물을 15 분 동안 인큐베이션했고, 그 다음 배양액에 전달하거나 추후 사용을 위해 냉장시켰다.
<실시예 5: iPSC 콜로니의 특성화>
iPSC 콜로니 생산성을 평가하기 위해, 재프로그래밍 배양물을 (칼슘/마그네슘과 함께) DPBS 내 4 % 파라포름알데히드를 사용하여 고정시켰고 (칼슘/마그네슘과 함께) DPBS로 100 배 희석된 스테인얼라이브(StainAlive) TRA-1-60 알렉사(Alexa) 488 항체(스템젠트)로 면역염색했다. 만능성의 분자 및 기능적 확인을 위한 콜로니 피킹, 증식, 및 후속 면역염색 및 트리리니지(trilineage) 분화 분석법을 수행했다. DNA 핑거프린팅 및 핵형 분석법을 수행했다. 하나 초과의 쥐 모델의 세트에서 기형종 형성을 수행했고 확인했다. 이로써 줄기 세포의 만능성이 설명된다.
iPSC가 약 9 일 내, 때때로 6, 또는 심지어 5 일 내에도 생산될 수 있는 방식으로, 표적 세포를 엔지니어링된 재프로그래밍 인자 및 비엔지니어링된 재프로그래밍 인자의 조합에 접촉시키는 줄기 세포가 아닌 세포에서 만능 줄기 세포로의 고 효율의 재프로그래밍을 위한 신규 방법이 개시된다. 이들 iPS 세포는 피더프리, 제노프리, 및 풋프린트프리 iPSC로 생산될 수 있다. 본 발명의 과정에 의해 극적으로 증가된 재프로그래밍의 효율에 더하여, 신규 기술은 임의의 바이러스 또는 벡터와 접촉되지 않아서, 생성된 iPSC가 "깨끗하다"는 점에서 모든 이전에 공지된 기술과 또한 구별된다. 본 발명의 활용도는 세포 및 발달 연구 및 임상 적용에서의 줄기 세포 확립, 분화, 활용에 관한 사실상 모든 영역에서 찾을 수 있다. 유사한 절차가 직접 분화 또는 전환분화에도 또한 유용할 수 있다.
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Claims (20)

  1. Oct4, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog, 및 Lin28로부터 선택되는 임의의 하나 이상의 합성 mRNA 재프로그래밍 인자 및 전사활성(transactivation) 도메인간의 융합 생성물의 유효량을 포함하는 조성물로, 단리된 체세포를 트랜스펙션하여 체세포를 재프로그래밍하거나 역분화시키는 것을 포함하는, 체세포의 역분화 또는 재프로그래밍 방법.
  2. 제1항에 있어서, 조성물이 N-말단 MyoD 전사활성 도메인에 융합된 Oct4를 포함하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, Oct4가 3회 일렬 반복(tandem triplicate)의 N-말단 MyoD 전사활성 도메인에 융합된 것인 방법.
  4. 제1항의 임의의 하나 이상의 합성 mRNA 재프로그래밍 인자를 사용하고,
    a) 피더프리(feeder-free) 표면의 표준 6-웰 플레이트에서 25k 내지 250k 세포/웰의 밀도로 또는 다른 표면적의 웰에서 비례적으로 감소된 수의 세포/웰로 표적 세포를 성장시키고;
    b) 재프로그래밍 동안 각 시간 대에 50 ng 내지 800 ng/ml mRNA의 가변 용량으로 세포를 트랜스펙션하는 것을
    포함하는, 포유류 세포의 재프로그래밍 방법.
  5. 제4항에 있어서, 표적 세포가 피더프리 표면의 표준 6-웰 플레이트에서 50k, 75k, 100k, 또는 150k 세포/웰의 밀도로 성장하고,
    a) 나중 시점보다 초기 시점에 더 낮은 용량이 사용되도록 재프로그래밍 동안 각 시간별로 50 ng 내지 800 ng/ml mRNA의 가변 용량으로 세포를 트랜스펙션하고;
    b) 계대배양 없이 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 수득하는, 재프로그래밍 방법.
  6. 제4항에 있어서, 표적 세포가 피더프리 표면의 표준 6-웰 플레이트에서 50k, 75k, 100k, 또는 150k 세포/웰의 밀도로 성장하되, 각 웰의 부피가 적절한 배지 0.5 ml 내지 5 ml로 조정되고
    a) 나중 시점보다 초기 시점에 더 낮은 용량이 사용되도록 재프로그래밍 동안 각 시간별로 50 ng 내지 800 ng/ml mRNA의 가변 용량으로 세포를 트랜스펙션하고;
    b) 계대배양 없이 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 수득하는, 재프로그래밍 방법.
  7. 제4항에 있어서, 포유류 세포가 인간 세포인 방법.
  8. 제4항에 있어서, 방법이 제노프리(Xeno-free)인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 하나 이상의 인자가 mRNA, 조절 RNA, siRNA, miRNA, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 체세포가 둘 이상의 상이한 RNA로 트랜스펙션되는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 체세포가 단능, 다능, 만능, 및 분화 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 하나 이상의 RNA가 체세포에서 단능, 다능, 또는 만능 세포로의 역분화를 유도하는 것인 방법.
  13. 제4항에 있어서, 하나 이상의 인자가 OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, KLF4 및 MYC mRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 제4항에 있어서, OCT4, SOX2, NANOG, 및 LIN28 mRNA가 병행하여 투여되는 것인 방법.
  15. 제4항에 있어서, OCT4, SOX2, KLF4 및 MYC mRNA가 병행하여 투여되는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 트랜스펙션된 세포가 유도 만능 줄기(iPS) 세포로서 배양되어 유지되는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 트랜스펙션된 세포가 유도 만능 줄기(iPS) 세포를 형성하고, 이 iPS 세포를 유도하여 분화된 세포를 형성하는 단계를 더 포함하는 방법.
  18. 제1항의 방법에 따라 체외에서 세포를 역분화시키고 이 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료하거나 또는 억제하는 방법.
  19. 제2항에 있어서, 조성물이 Rarg 및 LrH-1 전사활성 도메인을 더 포함하는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 조성물이 VP16 전사활성 도메인에 융합된 Oct4를 포함하는 것인 방법.
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