CN110241087A - 使用合成的信使rna无饲养细胞地衍生人类诱导性多能干细胞 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及使用合成的信使RNA无饲养细胞地衍生人类诱导性多能干细胞。具体来说,本公开涉及建立被优化用于重编程各种不同类型细胞的重编程因子的组合,包括常规重编程因子与反式激活结构域之间的融合体。更具体来说,本文中公开的示例性方法可用于从各种不同的哺乳动物细胞类型、包括人类成纤维细胞产生诱导性多能干细胞。还公开了使用合成的信使RNA无饲养细胞地衍生人类诱导性多能干细胞的示例性方法。
Description
本申请是申请日为2013年5月13日,申请号为201380025010.4,发明名称为“使用合成的信使RNA无饲养细胞地衍生人类诱导性多能干细胞”的申请的分案申请。
相关申请
本申请要求2012年5月13日提交的美国临时申请USSN 61/646,292的优先权利益,其内容整体并入本文。
技术领域
本公开总的来说涉及使用工程化的重编程因子通过动力学受控过程产生诱导性多能干细胞(iPSC)的新方法和组合物。具体来说,本公开涉及建立被优化用于重编程各种不同类型细胞的重编程因子的组合,包括常规重编程因子与反式激活结构域之间的融合体。更具体来说,本文中公开的示例性方法可用于从各种不同的哺乳动物细胞类型、包括人类成纤维细胞产生诱导性多能干细胞。还公开了使用合成的信使RNA无饲养细胞(feeder-free)地衍生人类诱导性多能干细胞的示例性方法。
背景技术
下面包括了可用于理解本公开的各个方面和实施方式的信息。这并不是承认这里提供的任何信息是本文中描述或要求的发明的现有技术或与其相关,或者任何明确或隐含地参考的出版物或文献是现有技术。
诱导性多能干细胞(iPSC)的治疗潜力,刺激了避开对体细胞进行遗传修饰以引起向多能状态的重编程的需要的重编程方法的开发尝试。就此而言获得成功的第一种“非整合”方法——蛋白质转导、质粒转染和腺病毒载体的使用,由于获得的iPSC转化的效率低而在应用上受限。更近些时候,已显示利用游离体DNA、仙台病毒和合成的信使RNA(mRNA)的技术,以与使用整合病毒载体所获得的效率可比或更高的效率产生“无足迹”iPSC。在原理上,RNA转染是这些方法中最具吸引力的,因为它对重编程因子(RF)表达的时间过程提供精确控制,同时完全避免了对“清除”重编程的细胞以除去载体的残留痕迹的任何需要。然而,基于mRNA的重编程的现有流程,由于在人类细胞中诱导多能性所需的~2周时间内需要每日进行重复转染,因此是相对劳动密集的。这些程序也依赖于饲养细胞的使用,为方法增添了复杂性和技术可变性,同时引入了具有非人类来源的(“外来的”)生物材料的潜在污染源。
生产诱导性多能干细胞(iPSC)的主要难点是将分化的细胞重编程成多能细胞的低效率。以前已报道,当用由Oct4和MyoD的反式激活结构域构成的融合基因(被称为M3O)以及Sox2、Klf4和c-Myc(SKM)转导时,5%的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)被重编程成iPSC。此外,M3O在大多数被转导的MEF、包括没有变成iPSC的细胞中促进了多能性基因的染色质重塑。这些观察表明了在提供更有利的培养条件的情况下,超过5%的细胞获得了变成iPSC的能力的可能性。
发明内容
因此,为了应对这些缺点,本公开提供了用于产生干细胞的方法和组合物,所述干细胞能够产生人体的所有不同组织。在某些情况下,使用信使RNA分子并且不需病毒载体、动物产物或饲养细胞,本文公开的方法可用于将人类成纤维细胞重编程成诱导性多能干细胞(iPSC)。所述示例性方法和组合物的使用导致与以前报告的细胞重编程方法相比,效率惊人且出人意料地提高。
因此,提供了通过改进重编程因子(RF)混合物,尤其是通过使用并入了已知的强转录因子例如VP16和MyoD的反式激活结构域的常规重编程因子例如Oct4(也称为Oct3/4)、Sox 2等的工程化变体而可用于加速mRNA介导的重编程的方法、试剂和/或组合物。本文中公开的方法和组合物产生了无饲养细胞、无外来物的方案,其极大减少了基于mRNA的重编程中所涉及的时间、成本和工作量。
一方面,本公开提供了一种用于去分化或重编程体细胞的方法,所述方法包括:a)用组合物转染分离的体细胞,所述组合物包含有效量的、任一种或多种合成的mRNA重编程因子与反式激活结构域之间的融合产物,由此将所述体细胞重编程或去分化,所述合成的mRNA重编程因选自Oct4、Sox2、Klf4、cMyc、Nanog和Lin28。
在一种实施方式中,提供了一种权利要求1的方法,其中所述组合物包含融合到N-端MyoD反式激活结构域的Oct4。在一种实施方式中,所述Oct4被融合到采取串联三联体形式的N-端MyoD反式激活结构域。
一方面,提供了一种使用权利要求1中的任一种或多种合成的mRNA重编程因子来重编程哺乳动物细胞的方法,所述方法包括:a)以标准6孔板的每个孔25k至250k个细胞的密度在无饲养细胞表面中生长靶细胞;b)在重编程期间,每次用50ng至800ng/ml mRNA的不同剂量转染细胞。
在一种实施方式中,以标准6孔板的每个孔50k、75k、100k或150k个细胞的密度在无饲养细胞表面中生长所述靶细胞;b)在重编程期间,每次用50ng至800ng/ml mRNA的不同剂量转染细胞,其中在较早时间点使用比较晚时间点更低的剂量;c)无需传代,获得iPSC。
在一种实施方式中,以标准6孔板的每个孔50k、75k、100k或150k个细胞的密度在无饲养细胞表面中生长所述靶细胞,其中将每个孔的体积调整到相当于0.5ml至5ml之间的适当培养基:b)在重编程期间,每次用50ng至800ng/ml mRNA的不同剂量转染细胞,其中在较早时间点使用比较晚时间点更低的剂量;c)无需传代,获得iPSC。
在一种实施方式中,所述哺乳动物细胞是人类细胞。在一种实施方式中,所述方法是无外来物的。
在一种实施方式中,所述一种或多种因子选自mRNA、调控RNA、siRNA miRNA及其组合。
在一种实施方式中,将所述体细胞用至少两种不同RNA转染。在一种实施方式中,所述体细胞选自单能、专能(multipotent)、多能和分化的细胞。在一种实施方式中,所述一种或多种RNA诱导所述体细胞去分化成单能、专能或多能细胞。
在一种实施方式中,所述至少一种因子选自OCT4、SOX2、NANOG、LIN28、KLF4和MYCmRNA。在一种实施方式中,所述OCT4、SOX2、NANOG和LIN28mRNA被组合给药。在一种实施方式中,所述OCT4、SOX2、KLF4和MYC mRNA被组合给药。
在一种实施方式中,将所述被转染的细胞作为诱导性多能干(iPS)细胞维持在培养物中。在一种实施方式中,所述被转染的细胞形成诱导性多能干细胞,并且还包括诱导所述iPS细胞以形成分化的细胞。
一方面,提供了一种在患者中治疗或抑制疾病或障碍的一种或多种症状的方法,所述方法包括将细胞在体外去分化,并将所述细胞给药于所述患者。在一种实施方式中,所述组合物还包含Rarg和LrH-1反式作用激活结构域。在一种实施方式中,所述组合物包含融合到VP16反式激活结构域的Oct4。
本文描述和要求权利的本发明具有许多特性和实施方式,包括但不限于在本概述中提出或描述或指称的。它不打算是全包含性的,并且本文描述和要求权利的本发明不限于在本概述中认定的特点或实施方式或不受其限制,包含所述特点或实施方式仅仅是出于说明而不是限制的目的。其他实施方式可能公开在下面的详细描述中。
附图说明
图1.使用基于M3O的mRNA重编程混合物衍生的iPSC集落。(A)源自于第一次基于M3O的BJ重编程试验的两个扩增的iPSC克隆的10x亮视野图像。(B)扩增的克隆的多能性标志物的免疫染色。
图2.使用基于M3O的混合物的无饲养细胞重编程。(A)免疫荧光成像示出了来自于50K个XFF成纤维细胞上的无饲养细胞衍生的TRA-1-60+集落产量,比较了基于c-Myc和L-Myc的混合物以及4小时和24小时的转染方式。所有孔被转染9天。4小时转染的培养物在实验的第15天被固定用于染色,24小时转染的培养物则在第11天。(B)来自于同一实验的400ng/ml Stemfect孔的10x亮视野成像,示出了在衍生的第9天培养物上的接近铺满状态(near-confluent)的hESC样集落。(C)跟踪试验中标记的视野的10x亮视野时间过程,其中使用400ng/ml Stemfect方式对100K个XFF再次进行9天的转染,示出了上皮形成和随后hESC样集落的出现。
图3.使用4种不同mRNA混合物的重编程效率的比较。流程图概述了4种混合物的比较实验。
图4.HDF-a无饲养细胞重编程培养物中的hESC样集落。在来自于75K个HDF-a成人成纤维细胞的无饲养细胞衍生的第9天时,出现的hESC样集落的10x亮视野图像,所述成纤维细胞用作为培养基增补物使用Stemfect转染试剂递送的400ng/ml mRNA混合物(M3O+c-Myc+Nanog+)处理9天。
图5合成的mRNA混合物的产生。(A)示意性概述了用于制造mRNA重编程混合物的程序。(B)SYBR E-凝胶上的编码多个RF和荧光报告物的合成的mRNA。每条泳道上样500ngRNA。
具体实施方式
当描述本发明时,在本文中没有定义的所有术语具有它们在本领域中公认的通常意义。在下面的描述是本发明的具体实施方式或特定应用的意义上,它的意图仅仅是说明而不是限制所要求的发明。下面的描述打算涵盖包括在本发明的精神和范围之内的所有可替选方案、改良方案和等同方案。
通过表达一组选定的转录因子可以将分化的细胞恢复到多能状态,这为可以使用患者特异性细胞产生用于遗传病的体外研究并最终用于细胞替换疗法的任何所需类型的细胞开辟了前景。重编程因子的表达可以通过使用整合到基因组中的病毒载体来实现,并且iPSC衍生仍通常使用整合型反转录病毒或慢病毒来进行。随着而来的基因组修饰代表了iPSC的治疗性应用的重要障碍,同时从整合的病毒表达盒重新激活表达的可能性即使对于体外研究来说也是一种顾虑。最近,在应用新的表达载体减轻或消除基因组修饰问题中已取得相当大的进展。现在可以获得在两侧带有lox重组位点的单一多顺反子盒中编码iPSC诱导所需的多个因子的慢病毒载体,所述单一多顺反子盒允许在重编程后通过Cre重组酶的瞬时表达几乎无缝地切除转入基因。转入基因的插入和随后的切除,也可以使用转座子载体并随后简短表达转座酶来实现。已使用了几种不同类型的可以瞬时表达重编程因子足够长的时间以诱导多能性的非整合型DNA载体,包括腺病毒、质粒和游离体DNA。通过用合并有细胞穿透肽的重组RF蛋白重复地转导细胞,也已被证明可能产生iPSC,尽管效率低。相对高效的iPSC转化,现在可以使用具有完全基于RNA的繁殖周期的仙台病毒,并通过编码Yamanaka因子的合成的mRNA转录本的持续转染来实现。
将mRNA转染应用于重编程(并潜在地应用于定向分化和转分化)是有吸引力的,因为这种系统允许简单地通过改变向细胞培养基添加的转录本种类,在每日基础上调节重编程混合物以及甚至各个组分因子的表达。在特定因子的转染结束后,由于mRNA在细胞质中的快速衰减,靶细胞内的异位表达在短时间内停止。与非整合型DNA载体或RNA病毒相反,使用mRNA转染时不需清除,也不存在随机基因组整合或持续病毒感染的任何风险。如果我们设想最终可以利用多轮异位RF表达从患者活体组织出发经iPSC中间体得到所需类型的特化细胞,这些优点将呈现出更大的重要性。然而,当前实施的基于mRNA的重编程存在缺点。尽管在mRNA被转染后RF的表达通常在24小时的量级上是鲁棒的,但是因子的表达要花费约2周才能在人类细胞中诱导多能性,因此使用这种技术重编程细胞所需的实际动手时间相对长。不是所有细胞类型和培养基都同等地有利于有效的mRNA递送,并且这在目前是某些感兴趣的细胞类型、包括血细胞的基于mRNA的重编程的障碍。到目前为止还证明,为了使用mRNA方法将细胞成功地重编程成iPSC,必需利用有丝分裂停止的成纤维细胞的饲养层。随着靶细胞在iPSC诱导所需的长时间过程中从低的起始密度开始长出,这些饲养细胞缓冲培养物的群体密度,平衡掉递送的RNA和转染试剂的剂量(两者都具有相伴的毒性),并在重编程过程所造成的促凋亡和抑制细胞生长的力量面前支持靶细胞的生存力。这种需要为所述程序增添了复杂性和实际动手时间,并引入了重要的技术可变性来源,特别是如果饲养细胞本身经历转染的话。饲养细胞层的存在也妨碍重编程过程的监测和分析。最后,尽管人类饲养细胞目前是mRNA重编程的标准,但是当将非人类动物产品用于它们的衍生和扩增时,即使是这些细胞也是外来生物污染的潜在来源。
因此,有鉴于与以前已知的程序相关的问题,在本文中提供了以提高的重编程效率和得到的细胞的改进的品质生产iPSC的新方法、材料和流程。通过递送到细胞的RF混合物的增强作用,本发明的实施方式被成功地用于获得明显惊人和出人意料的改进。本发明的实施方式还提供了新的流程,其压缩并简化mRNA重编程过程,并支持不使用饲养细胞或任何其他可能被外来物质污染的试剂而从人类成纤维细胞生产无足迹的iPSC。本文提供的新方法和组合物将扩展以前已知的mRNA方法的优点,并帮助扫清通向iPSC技术的治疗性应用的其余障碍。
总的来说,本公开涉及使用工程化的重编程因子通过动力学受控过程产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法。更具体来说,本发明涉及建立被优化用于重编程各种不同类型细胞的重编程因子的组合,包括常规重编程因子与反式激活结构域之间的融合体;通过引起转入基因的适当水平表达的方法,将这些因子作为合成的信使RNA(mRNA)导入到处于优选密度下的哺乳动物细胞中;将细胞维持在确定的条件下以产生以前不能获得的重编程效率。与本领域中已知的其他方法相比,本发明由于使用了完全无饲养细胞和无外来物的选择并且不需传代,极大减少了重编程中所涉及的时间、成本和工作量。本文中公开的材料和程序可用于从不同类型的哺乳动物细胞包括人类成纤维细胞产生诱导性多能干细胞。
本公开的方面还提供了使用信使RNA分子,不需病毒载体、动物产品或饲养细胞,生产能够产生人体各种不同组织的干细胞的方法。本文公开的新方法可用于在优化条件下,以惊人且出人意料的效率将人类成纤维细胞重编程成诱导性多能干细胞(iPSC)。
定义
当在本文中使用时,适合于与所述方法一起使用的细胞包括但不限于原代细胞和建立的细胞系、胚胎细胞、免疫细胞、干细胞和分化的细胞,包括但不限于源自于外胚层、内胚层和中胚层的细胞,包括成纤维细胞、实质细胞、造血细胞和上皮细胞。当在本文中使用时,干细胞包括单能细胞、专能细胞和多能细胞;胚胎干细胞和成年干细胞例如造血干细胞、间充质干细胞、上皮干细胞和肌卫星细胞。在一种实施方式中,体细胞被去分化或重编程。可以使用任何适合的体细胞。代表性的体细胞包括成纤维细胞、角化细胞、脂肪细胞、肌细胞、器官和组织细胞以及各种血细胞,包括但不限于造血细胞包括造血干细胞和提供短期或长期造血移植的细胞。最优选的细胞类型包括但不限于人类成纤维细胞、角化细胞和造血干细胞。所述方法对于对细胞进行去分化并任选地重分化而不永久改变细胞基因组来说特别有用。
在本公开的方法中有用的RNA包括mRNA、调控RNA或小RNA例如siRNA或miRNA,其中一种或多种mRNA编码起到去分化或重编程细胞作用的多肽。转染的效率高。通常,超过90%的被转染的细胞群体将表达导入的RNA。因此,可以使用一种或多种不同RNA转染细胞。例如,可以将细胞群体用一种或多种不同mRNA、一种或多种不同siRNA、一种或多种不同miRNA或其组合转染。可以将细胞群体在单次给药中用多种RNA同时转染,或者多次给药可以错开数分钟、数小时、数日或数周时间。多种不同RNA的转染可以错开。例如,如果需要第一种RNA在一种或多种其他RNA表达之前表达的话。
通过改变输入RNA的量,可以在广范围内操纵被转染的RNA的表达水平,使得可以单个地调控每个被转染的RNA的表达水平。输入的RNA的有效量根据所需结果来确定。此外,基于PCR的mRNA生产技术便于设计具有不同结构和结构域组合的mRNA。可用于本公开方法的RNA在本领域中是已知的,并且将根据靶宿主细胞类型以及待操纵的途径或细胞活性或治疗应用来选择。可用于去分化细胞,例如将成年的分化体细胞转变成干细胞的构建物,可以基于已知的基因、mRNA或其他核苷酸或蛋白质序列来构建。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用,是指任何长度的核苷酸、可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的聚合形式。因此,这个术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生物化学修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。“寡核苷酸”一般是指单链或双链DNA的约5至约100个核苷酸之间的多核苷酸。然而,出于本公开的目的,对于寡核苷酸的长度没有上限。寡核苷酸也被称为寡聚体,并且可以从基因分离或者通过本领域中已知的方法化学合成。
当在本文中使用时,术语“微RNA”是指任何类型的干扰RNA,包括但不限于内源微RNA和人造微RNA(例如合成的miRNA)。内源微RNA是在基因组中天然编码的能够调节mRNA的生产性利用的小RNA。人造微RNA可以是内源微RNA之外的能够调节mRNA的活性的任何类型的RNA序列。微RNA序列可以是由这些序列中的任一种或多种构成的RNA序列。“微RNA前体”(或“前miRNA”)是指具有其中合并有微RNA序列的茎环结构的核酸。“成熟微RNA”(或“成熟miRNA”)包括已从微RNA前体(“前miRNA”)切下或已被合成(例如在实验室中通过无细胞合成来合成)的微RNA,并具有约19个核苷酸至约27个核苷酸的长度,例如,成熟微RNA可以具有19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt或27nt的长度。成熟微RNA可以结合于靶mRNA并抑制靶mRNA的翻译。
OCT4的示例性的基因组mRNA(cDNA)和蛋白质序列在本领域中是已知的,参见例如(OCT4)POU5F1 POU 5类同源框[智人(Homo sapiens)]基因ID:5460,其提供mRNA(cDNA)序列Genbank登记号NM_001173531.1,题为智人POU 5类同源框1(POU5F1),转录本变体3,mRNA;Genbank登记号NM_002701.4,题为智人POU 5类同源框1(POU5F1)转录本变体1,mRNA;和Genbank登记号NM_203289.4,题为智人POU 5类同源框1(POU5F1),转录本变体2,mRNA。SOX2的示例性的基因组mRNA(cDNA)和蛋白质序列在本领域中是已知的,参见例如SOX2 SRY(性别决定区Y)-盒2[智人],基因ID:6657,其提供mRNA(cDNA)序列Genbank登记号NM_003106.2,题为mRNA序列智人SRY(性别决定区Y)-盒2(SOX2),mRNA。NANOG的示例性的基因组mRNA(cDNA)和蛋白质序列在本领域中也是已知的,参见例如NANOG Nanog同源框[智人],基因ID:79923,其提供mRNA(cDNA)序列Genbank登记号NM_024865.2,题为智人Nanog同源框(NANOG),mRNA。LIN28的示例性的基因组mRNA(cDNA)和蛋白质序列在本领域中也是已知的,参见例如LIN28A同源物A(秀丽隐杆线虫(C.elegans))[智人],基因ID:79727,其提供mRNA(cDNA)序列Genbank登记号NM_024674.4,题为智人lin-28同源物A(C.elegans)(LIN28A),mRNA。KLF4的示例性的基因组mRNA(cDNA)和蛋白质序列在本领域中是已知的,参见例如KLF4 Kruppel样因子4(肠)[智人],基因ID:9314,其提供mRNA(cDNA)序列Genbank登记号NM_004235.4,题为智人Kruppel样因子4(肠)(KLF4),mRNA。MYC的mRNA序列在本领域中也是已知的,参见例如MYC v-myc髓细胞组织增生病毒癌基因同源物(禽)[智人],基因ID:4609,其提供mRNA(cDNA)序列Genbank登记号NM_002467.4,题为智人v-myc髓细胞组织增生病毒癌基因同源物(禽类)(MYC),mRNA。
“茎环结构”指的是具有一定二级结构的核酸,其包括已知或预测形成双链的核苷酸区域(茎部分),该区域在一侧连接有主要为单链核苷酸的区域(环部分)。术语“发夹”和“回折”结构在本文中也被用于指称茎环结构。这样的结构在本领域中是公知的,并且这些术语与它们在本领域中已知的意义相一致使用。茎环结构内核苷酸的真正一级序列对于本发明的实践来说不是关键的,只要存在所述二级结构即可。正如在本领域中已知的,二级结构不需要精确的碱基配对。因此,茎可以包括一个或多个碱基错配。或者,碱基配对可以是精确的,即不包括任何错配。
当在本文中使用时,术语“干细胞”是指可以被诱导而增殖的未分化的细胞。干细胞能够自我维持,意味着通过每次细胞分裂,一个子细胞也将是干细胞。干细胞可以从胚胎、胎儿、新生儿、青少年或成人组织获得。术语“祖细胞”当在本文中使用时是指源自于干细胞的未分化的细胞,并且其本身不是干细胞。某些祖细胞可以产生能够分化成超过一种细胞类型的后代。
当在本文中使用时,术语“诱导性多能干细胞”(或“iPS细胞”)是指从体细胞例如分化的体细胞诱导,并且与所述体细胞相比具有更高潜力的干细胞。iPS细胞能够自我更新并分化成成熟细胞例如平滑肌细胞。iPS可能也能分化成平滑肌祖细胞。
当在本文中使用时,术语“分离的”在指称细胞时,是指处于与细胞天然存在的环境不同的环境中的细胞,例如在细胞天然存在于多细胞生物体中,并且将所述细胞从多细胞生物体取出的情况下,所述细胞是“分离的”。分离的遗传修饰的宿主细胞可以存在于遗传修饰的宿主细胞的混合群体中,或存在于包含遗传修饰的宿主细胞和没有遗传修饰的宿主细胞的混合群体中。例如,分离的遗传修饰的宿主细胞可以存在于体外遗传修饰的宿主细胞的混合群体中,或存在于包含遗传修饰的宿主细胞和没有遗传修饰的宿主细胞的混合的体外群体中。
当在本文中使用时,“宿主细胞”是指体内或体外细胞(例如作为单细胞实体培养的真核细胞),所述真核细胞可以被用作或已被用作核酸(例如外源核酸)的受体,并且包括已通过核酸进行遗传修饰的原始细胞的后代。应该理解,由于天然、偶然或蓄意的突变,单个细胞的后代可能不一定在形态、基因组或总DNA互补物上与原始亲代完全一致。
术语“遗传修饰”是指在引入新的核酸(即对细胞来说外源的核酸)后在细胞中引起的永久或暂时的遗传变化。遗传变化(“修饰”)可以通过将新的核酸并入宿主细胞的基因组中,或通过将新的核酸作为染色体外元件暂时或稳定地维持来实现。当细胞是真核细胞时,永久的遗传变化可以通过将核酸导入到细胞的基因组中来实现。遗传修饰的适合方法包括病毒感染、转染、接合、原生质体融合、电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射等。
当在本文中使用时,术语“外源核酸”是指通常或天然情况下不存在于天然细胞中和/或不由其生产,和/或被导入到细胞中(例如通过电穿孔、转染、感染、脂质体转染或将核酸导入到细胞中的其他手段)的核酸。
当在本文中使用时,术语“治疗”是指获得所需的药理和/或生理效果。所述效果就完全或部分阻止疾病或其症状而言可以是预防性的,和/或就疾病和/或归因于疾病的不利影响的部分或完全治愈而言可以是治疗性的。当在本文中使用时,“治疗”覆盖了哺乳动物中,尤其是人类中疾病的任何治疗,并包括:(a)在对疾病具有易感性但是尚未被诊断为患有它的受试者中阻止疾病的发生;(b)抑制疾病,即停止疾病的发展;和(c)缓解疾病,即引起疾病减退。
在本文中可互换使用的术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”是指哺乳动物,包括但不限于人类、非人类灵长动物、啮齿动物(例如小鼠、大鼠等)、有蹄类动物、犬科动物、兔形目动物、猫科动物等。在某些实施方式中,目标受试者是人类。在某些实施方式中,受试者是非人类动物例如啮齿动物或兔形目动物。
“治疗有效量”或“有效量”意味着当给药于受试者以治疗疾病时,足以执行这种对疾病的治疗的化合物、核酸的量或细胞的数量。“治疗有效量”将随着化合物或细胞、疾病及其严重性和待治疗受试者的年龄、体重等而变。
在进一步描述本发明之前,应该理解,本发明不限于所描述的具体实施方式,因为它们当然可以改变。还应该理解,本文中使用的术语仅仅是出于描述具体实施方式的目的,并且不打算是限制性的,因为本发明的范围将仅由随附的权利要求书限定。
当提供值的范围时,应该理解,除非上下文明确陈述,否则在所述范围的上限与下限或所陈述范围中的任何其他陈述的或居间的值之间的精确到下限的单位的十分之一的每个居间值,被涵盖在本发明之内。这些较小的范围的上限和下限,除了在所陈述的范围内任何具体排除的限值之外,可以被独立地包含在所述较小的范围内,并且也涵盖在本发明之内。当所陈述的范围包括一个或两个所述限值时,排除了任一个或两个所述被包含的限值的范围,也包括在本发明中。
除非另有定义,否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的意义。尽管与本文中描述的相似或等同的任何方法和材料也可用于本发明的实践或试验,但现在将描述优选的方法和材料。本文中提到的所有出版物,通过参考并入本文,以公开和描述与被引用的出版物相关的方法和/或材料。
在本公开的一个方面,通过使用分别合并有N-端MyoD反式激活结构域(Hirai等,Stem Cells,2011)或C-端VP16反式激活结构域的三联体重复序列的Oct4或Sox 2的工程化变体(Wang等,EMBO Reports,2011;其中通过将VP16反式激活结构域分别融合到OCT4(也被称为Pou5f1)、NANOG和SOX2来制备合成的重编程因子,这些合成的因子可以以提高的效率和加速的动力学重编程小鼠和人类两者的成纤维细胞),或通过用两种其他因子Rarg和Lrh-1扩大“标准”RF混合物(Wang等,PNAS,2011),可以增强基于mRNA的重编程。每个所述文献的内容通过参考并入本文。强转录激活子当结合于DNA的特定位点处时,可以有效地召集多种染色质重塑复合物。一个良好的实例是MyoD,骨骼肌形成的主要转录因子,其可以改变分化的细胞的命运。Hirai等推测,由于MyoD是非常强的转录因子,因此如果被融合在一起,它可以增加iPS因子对染色质的可接近性。当用带有Oct-MyoD TAD融合基因以及Sox2和Klf4的反转录病毒载体转导小鼠或人类细胞时,与标准的iPS因子相比,它们将iPSC集落的数量提高~50倍。同样地,广为人知的鲁棒的转录激活子VP16,当融合到不同iPS因子时,可以对重编程表现出强刺激效果。
人类iPSC的示例性制备
所述方法还广泛用于细胞的重分化或重编程,以例如产生iPS细胞,其能够被进一步调制以形成造血干细胞、间充质干细胞、上皮干细胞和肌卫星细胞或人类组织的分化的细胞,包括但不限于红细胞,白细胞包括淋巴细胞,血小板,基质细胞,脂肪细胞,骨细胞包括破骨细胞,上皮组织包括皮肤细胞,肌肉组织包括平滑肌、骨骼肌和心肌,血管组织包括内皮细胞,肝组织包括肝细胞,和神经组织包括神经元。诱导iPS细胞分化成各种分化的细胞类型,包括但不限于心肌细胞、造血干细胞、骨细胞例如破骨细胞、肝细胞、视网膜细胞和神经元的方法,可以通过用诱导分化的RNA进行瞬时转染来诱导干细胞、包括但不限于分离的胚胎干细胞、造血干细胞和诱导性多能干细胞的分化。此外或可替选地,可以通过将细胞在细胞类型特异性的条件下进行培养,使细胞重分化。例如,可以将iPS细胞维持在CF-1饲养细胞上,随后适应于无饲养细胞的条件。可以通过将细胞在头蛋白(noggin)、Dkk-1和IGF-1存在下进行培养,来诱导iPS细胞形成分化的视网膜细胞。
以前报道的方法依赖于整合载体即病毒或质粒来携带修饰的因子。在一种实施方式中,进行了重编程试验以比较6种不同mRNA组合混合物的性能,所述混合物组合包括用于mRNA重编程的5种因子(Oct4、Sox2、Klf4、cMyc-T58A和Lin28)的转录本,或包括Rarg和Lrh-1的7种重编程因子RF混合物,每种组合以基于野生型Oct4以及MyoD-和VP16-Oct4融合构建物(分别命名为M3O和VPx3)的三种变化形式进行试验。将BJ成纤维细胞在基于饲养细胞的重编程培养中转染11天,到此时为止在几个孔中高级的形态是显而易见的。在接下来的几天中,在用基于野生型Oct4和M3O的混合物转染的孔中出现了具有特征性hESC形态的集落。VPx3-转染的培养物中的靶细胞尽管显示出加速生长和聚集成灶点的某些趋势,但保持成纤维细胞的形态,并且没有出现集落。基于野生型Oct4和M3O的混合物的5因子和7因子实施方式显示出相近的集落产率,因此在混合物中包含Rarg和Lrh-1没有带来优势。然而,M3O混合物给出了数倍于由野生型Oct4生成的集落数。根据这一结果,从M3O 5因子孔挑取集落,用于扩增和进一步分析(图1)。M3O来源的集落的多能性通过对核和细胞表面标志物的免疫染色,并通过体外分化成三种原始胚层得到证实。对6个扩增的iPSC克隆进行核型分析和DNA指纹分析,在所有情况下证实了细胞的核型正常性和BJ谱系。
所述方法还可以广泛用于细胞的重分化或重编程,以例如产生iPS细胞,其能够被进一步调制以形成造血干细胞、间充质干细胞、上皮干细胞和肌卫星细胞或人类组织的分化的细胞,包括但不限于红细胞,白细胞包括淋巴细胞,血小板,基质细胞,脂肪细胞,骨细胞包括破骨细胞,上皮组织包括皮肤细胞,肌肉组织包括平滑肌、骨骼肌和心肌,血管组织包括内皮细胞,肝组织包括肝细胞,和神经组织包括神经元。诱导iPS细胞分化成各种分化的细胞类型,包括但不限于心肌细胞、造血干细胞、骨细胞例如破骨细胞、肝细胞、视网膜细胞和神经元的方法,在本领域中是已知的(Song等,Cell Res.,19(11):1233-42(2009),Lamba等,PLoS One,5(1):e8763(2010),Gai等,Cell Biol Int.200933(11):1184-93(2009),Grigoriadis等,Blood,115(14):2769-76(2010))。可以通过用诱导分化的RNA进行瞬时转染来诱导干细胞、包括但不限于分离的胚胎干细胞、造血干细胞和诱导性多能干细胞的分化。此外或可替选地,可以通过将细胞在细胞类型特异性的条件下进行培养,使细胞重分化。例如,可以将iPS细胞维持在CF-1饲养细胞上,随后适应于无饲养细胞的条件。可以通过将细胞在头蛋白、Dkk-1和IGF-1存在下进行培养,来诱导iPS细胞形成分化的视网膜细胞。另一方面,可以通过包含Nanog转录本进一步增强mRNA混合物的效能。在这种实施方式中,将在饲养细胞上含有50K个BJ成纤维细胞的4个孔用基于野生型Oct4或M3O的5因子或6因子混合物转染6天,然后将每种培养物在新鲜的饲养细胞上以1:6传代,以在6孔板中扩增(4)。在每块板中将转染继续进行另外0-5天。在第18天将培养物固定并用TRA-1-60抗体染色(其中第0天对应于第一次转染),以便评估不同混合物和转染时间过程对iPSC生产率的影响。结果显示,不论使用何种Oct4变体,向混合物添加Nanog都是非常有益的,而当M3O和Nanog被一起使用时,获得了最高的转化效率。
在一种实施方式中,在其他基于饲养细胞的实验中,使用其他三种人类成纤维细胞系(HDF-f、HDF-n和XFF),证实了基于M3O的5因子或6因子混合物的效能。使用所有这三种与BJ相比在正常扩增培养中表现出更快的本源群体倍增时间的低传代细胞系时,重编程动力学和效率明显改进。在某些情况下,我们从少至6天的转染获得了hESC样集落,尽管在转染继续进行另外几天的实验中产率高得多。包括了通过添加新鲜细胞来定期加强饲养层的实验表明,尽管这种策略可能提供一些益处,但它们被得到的流程的复杂性所抵消。因此我们决定聚焦于使用更强效的混合物来开发简化的无饲养细胞的流程。
本公开涉及无饲养细胞的iPSC的产生。不论使用何种重编程技术,不依赖于饲养细胞的iPSC衍生一般被证明略具挑战性,但是在持续转染方式的背景中产生特殊困难。对于成纤维细胞可以被铺板而不损害细胞生存力和增殖活性的密度,存在下限。当细胞面对转染和重编程因子的异位表达的压力时,细胞在稀疏培养中经历有丝分裂停止或凋亡的倾向加剧。此外,在基于饲养细胞的重编程特征性的高细胞密度下被良好耐受的RNA剂量,当在更少的细胞之间分配时,产生更严重的细胞毒性效应。同时,在成纤维细胞达到铺满状态后,可以使用mRNA转染实现的表达的外显率急剧降低,这可能是由于与接触抑制和G1停止相关的细胞内吞作用的下调。在细胞经历间充质向上皮的转变(MET)后,在重编程期间这种在拥挤培养中对转染的接纳性的降低似乎被减轻。然而,对于人类成纤维细胞来说,当使用目前的mRNA混合物时达到MET通常需要的~7天,使得即使将细胞以最低可存活初始密度铺板,也难以绕过成纤维细胞过度生长的问题。可以通过传代使细胞稀化以延迟这种命运,但是高度受激的重编程中间体的铺板效率难以预测,并且在任何情况下,基于传代的衍生流程将牺牲方便性,并且很难放大到高通量应用。
本公开涉及MET的表型指征(成纤维细胞过程的退化,以及焦点和鹅卵石形态的出现)。在一种实施方式中,通过我们的发明,使用增强的混合物来加速MET,能够使用6因子M3O混合物,不需传代,以各种低浓度(每孔50K比100K比150K)接种靶细胞,进行无饲养细胞的重编程。
本发明的一个方面涉及这些重编程培养物的命运,所述培养物被证明对接种密度高度敏感,推测是由于在转染方式的过程中过量细胞毒性和成纤维细胞过度生长的影响两者被自我加强。在使用“标准”RNA剂量(每孔1200ng)的实验中,从以每孔100K的密度铺板的HDF-n和XFF成纤维细胞获得几十个hESC样集落,而相应的50K和150K培养分别在屈服于种群崩溃和成纤维细胞过度生长后,仅给出几个集落。在尝试使用两种其他成纤维细胞系BJ和HDF-a的衍生中,在达到铺满状态后不久,即使是最有希望(150K)的培养物也变得基本上是静止不动的,随后仅产生具有延迟的动力学的零星集落。
在本发明的一种特定实施方式中,我们从环境切换到5%氧气培养,并在转染的前4天从四分之一剂量逐渐升高到全RNA剂量,以试图最小化应激诱导的细胞衰老。
在本发明的一个实例中,使用这些新的条件,本发明人试验了用L-Myc替代c-Myc是否能够进一步改进重编程混合物。
在另一种实施方式中,我们评估了一个简化的转染方案,其中将RNA随着每日培养基更换添加到细胞,而不是在早4小时的独立步骤中递送。在“24小时转染”孔中将RNA剂量降低以补偿预期的细胞毒性增加,并且试验了两种不同转染试剂(RNAiMAX和Stemfect)。将XFF细胞以每孔50K铺板并转染9天。常规的“4小时转染”方式使用基于c-Myc的混合物时给出每孔一百个TRA-1-60+集落的量级,而L-Myc混合物的表现相比不良(图2)。来自于“24小时转染”培养的结果甚至更令人印象深刻。在生产率最高的这些孔中(对应于c-Myc 400ng/ml Stemfect条件),在第9天,即最后一次转染后24小时,培养物变得几乎长满hESC样细胞。“24小时转染”的优越表现的机制基础,可能有通过浓缩由细胞释放的扩散因子而提高薄培养物的有效密度的效应。当将这些优选的流程条件应用于另一个示例性实验,即使用HDF-a成纤维细胞的衍生中时,在以每孔75K个细胞接种的培养物中,生产率不如使用高增殖性XFF细胞获得的那样壮观,但是早在流程的第9天,再一次出现大量hESC样集落(图4)。
在一种特定实施方式中,当将细胞以比常规使用的体积更小的培养基体积例如1ml、0.75ml、0.5ml或仍能维持细胞培养的最小量的培养基接种时,使用上面公开的条件的重编程效率明显得到提高。重编程过程中的这种小体积条件由此并入本发明。
本文中已描述的实施方式绝不仅仅应用于本发明。本领域技术人员将会认识到,在略微可变的条件下,或使用用于重编程、定向分化或转分化的常规或工程化因子的类似组合,本公开也可用于重编程其他细胞。
在其他实施方式中,对因子的化学计量进行进一步优化,也将加快重编程的步伐——事实上,mRNA方法提供了确定独立地针对ipPSC诱导的早期和晚期阶段的混合物的机会。使用M3O获得的提高,为最近将新的工程化的重编程因子应用于ipsc产生提供了最新的验证。其他这样的工程化的重编程因子包括将SOX2、KLF4、CMYC、LMYC、LIN28、NANOG等融合到来自于VP16或MYOD之外的因子例如GAL4、GATA1、P53等的反式激活结构域。应该指出,用于递送mRNA的试剂和方法也可用于共转染在iPSC产生中的价值已得到证明的siRNA和miRNA。然而,本文中公开的无饲养细胞的流程代表了与当前流程相比显著的进步,使重编程所需的时间减少了多达一半,并同等或更大地减少了劳动力和材料成本,剔除了程序中的繁琐步骤,并允许以与生长因子或细胞因子几乎相同的容易性将mRNA递送到细胞——即作为培养基增补剂。
在某些实施方式中,对细胞进行重编程以调节免疫应答。例如,可以将淋巴细胞重编程成调节性T细胞,其可以被给药于需要的患者以提高或转移免疫耐受,特别是自身耐受。Foxp3阳性T细胞的诱导或给药可能可用于减轻免疫应答例如移植物排斥,和/或减少、抑制或减轻自体免疫疾病或障碍的一种或多种症状,所述疾病或障碍例如糖尿病、多发性硬化症、哮喘、炎性肠病、甲状腺炎、肾脏疾病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、斑秃、强制性脊柱炎、抗磷脂综合征、自体免疫性Addison病、自体免疫性溶血性贫血、自体免疫性肝炎、自体免疫性内耳疾病、自体免疫性淋巴增生综合征(ALPS)、自体免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、白塞病、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜性皮炎、慢性疲劳综合征的免疫缺乏综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、CREST综合征、克罗恩病、Dego's病、皮肌炎、青少年皮肌炎、盘状狼疮、特发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-肌纤维组织炎、Grave's病、Guillain-Barre病、桥本甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病(I型)、幼年型关节炎、美尼尔氏病、混合型结缔组织病、多发性硬化症、重症肌无力、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体(polyglancular)综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、雷诺氏现象、莱特尔综合征、风湿热、结节病、硬皮病、干燥综合征、僵人综合征、多发性大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、脉管炎、白癜风和韦格纳肉芽肿。
所述方法可用于产生可能在各种疾病和障碍的治疗中有用的细胞,所述疾病和障碍包括但不限于诸如帕金森氏病、阿兹海默氏病、伤口愈合和多发性硬化症的疾病。所述方法还可用于器官再生,并用于免疫系统的恢复或补充。例如,处于分化的不同阶段的细胞例如iPS细胞、造血干细胞、专能细胞或单能细胞例如前体细胞如上皮前体细胞等,可以静脉内或通过局部手术来给药。所述方法可以与其他常规方法例如处方药物方式、手术、激素疗法、化疗和/或放疗组合使用。
在一种实施方式中,试剂盒包含RNA、细胞和将RNA转染到细胞中的器件。RNA可以被冷冻干燥或在溶液中。试剂盒可以任选包括其他材料例如细胞培养试剂。在可替选实施方式中,试剂盒提供按照本公开的方法制备的重分化、去分化或重编程的细胞,并冷藏或冷冻储存和/或运输用于以后使用。细胞通常被储存在维持生存力的溶液中。含有细胞的试剂盒应该使用与生存力相一致的方法,例如在含有干冰的冷却器中储存或运输,以使细胞维持低于4℃,优选地低于-20℃。
试剂盒任选地包括下列一种或多种物质:生物活性药剂,培养基,赋形剂和下列一种或多种:注射器,针头,线,纱布,绷带,消毒剂,抗生素,局部麻醉剂,镇痛剂,手术线,剪刀,手术刀,无菌流体和无菌容器。试剂盒的组分可以单独包装并且可以是无菌的。试剂盒通常提供在容器中,例如适合于商业化销售的塑料、纸板或金属容器。任何试剂盒均可以包括使用说明书。所述方法可用于产生可能在各种疾病和障碍的治疗中有用的细胞,所述疾病和障碍包括但不限于神经变性疾病例如帕金森氏病、阿兹海默氏病和多发性硬化症。所述方法还可用于器官再生,并用于免疫系统的恢复或补充。例如,处于分化的不同阶段的细胞例如iPS细胞、造血干细胞、专能细胞或单能细胞例如前体细胞如上皮前体细胞等,可以静脉内或通过局部手术来给药。所述方法可以与其他常规方法例如处方药物方式、手术、激素疗法、化疗和/或放疗组合使用。
本公开的方面提供了干细胞的培养系统和用于生产伤口治疗用的皮肤组织细胞的分化方法,以及用于关节炎、狼疮和其他自体免疫相关疾病的治疗的干细胞疗法。
实施例
现在参考下面的实施例来描述本发明。提供这些实施例仅仅是出于说明的目的,并且本发明不限于这些实施例,而是涵盖了明显是本文提供的教示的结果的所有变化方式。
实施例1-IVT模板的产生
用于产生线性PCR产物体外转录(IVT)模板的质粒构建物,使用不依赖于连接的克隆(LIC)来构建。我们首先构建了并入有5’和3’非翻译区(UTR)的亲本质粒(pIVT),所述非翻译区侧翼带有被设计用于接受编码目的蛋白的开放阅读框(ORF)插入片段的插入位点。ORF侧翼的序列如Warren等,Cell Stem Cell,2010中所述,包含低二级结构前导序列和强Kozak位点(5’UTR)和鼠类α-球蛋白3’UTR。通过使用带尾引物从质粒扩增的两个PCR产物的重新退火,产生带有5’突出部分的pIVT载体的线性化形式。通过类似程序产生具有互补突出部分的ORF PCR产物,与载体PCR产物合并,并通过热休克转化到DH5α细菌中,以克隆基因特异性构建物(pIVT-KLF4等)。将得到的质粒用作PCR反应的模板,制造并入有T7启动子、侧翼带有UTR的ORF和T120尾的线性IVT模板,以驱动polyA尾的添加,如Warren等,Cell StemCell,2010中所述。通过使用带尾反向引物(T120CTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCA)引入T120尾区域。对于M3O和VPx3融合构建物来说,使用带尾引物,通过PCR将编码反式激活结构域的序列附连到ORF。以~100ng/μL的浓度维持PCR产物模板储用物。
实施例2–mRNA混合物的产生
mRNA合成过程概述在图5中。在IVT反应中,使用4:1的ARCA帽类似物与GTP的比率产生合成的mRN,以产生高百分率的加帽转录本。在核苷酸三磷酸(NTP)混合物中用5m-CTP完全代替CTP和用假UTP完全代替UTP,被用于降低RNA产物的免疫原性。帽类似物和修饰的NTP购自Trilink Biotechnologies。制备2.5x NTP混合物(ARCA:ATP:5m-CTP:GTP:假UTP为15:15:3.75:3.75:3.75mM)以替换随着用于进行IVT反应的MEGAscript T7试剂盒(Ambion)提供的标准NTP。每个40μL IVT反应包含16μL NTP混合物、4μL 10x T7缓冲液、16μL DNA模板和4μL T7酶。将反应在37℃温育4-6小时,然后用2μL TURBO DNase在37℃继续处理15分钟,然后在MEGAclear(Ambion)离心柱上纯化,将RNA产物洗脱在100μL体积中。为了从未加帽的转录本除去免疫原性的5’三磷酸组成部分,向每个制备物加入10μL Antarctic磷酸化酶反应缓冲液和3μL Antarctic磷酸化酶(NEB)。磷酸化酶反应在37℃温育30分钟,并重新纯化IVT产物。通过Nanodrop(Thermo Scientific)定量RNA产量,并依此通过加入TE pH7.0(Ambion)将制备物调整到100ng/μL的标准化工作浓度。通过将代表各种RF的制备物以所需化学计量比合并,组装RNA混合物。使用的每种RF的比例考虑到了相应转录本的预测分子量,所有RF为等摩尔,例外的是Oct4及其衍生物,其以3x摩尔浓度被包含。向混合物加入编码短寿命核化单体LanYFP荧光蛋白的mRNA的10%掺入物,以便于在重编程试验期间监测转染效能。
实施例3–细胞和培养基
重编程的靶细胞包括BJ新生儿成纤维细胞(ATCC)、HDF-f胎儿成纤维细胞、HDF-n新生儿成纤维细胞和HDF-a成人成纤维细胞(ScienCell)以及XFF无外来物的新生儿成纤维细胞(Millipore)。对于BJ、HDF和XFF细胞来说,扩增培养分别在BJ培养基(DMEM+10%FBS)、ScienCell成纤维细胞培养基和FibroGRO无外来物的人类成纤维细胞扩增培养基(Millipore)中进行。使用的饲养细胞是3001G辐照过的新生儿人类包皮成纤维细胞(GlobalStem)和FibroGRO丝裂霉素C失活的无外来物的人类新生儿成纤维细胞(Millipore)。与无外来物的基于饲养细胞和无饲养细胞的重编程试验相关的细胞传代步骤,使用TrypLE Select(Gibco)这种无动物产品的细胞解离试剂来进行。
实施例4–人类成纤维细胞的重编程
所描述的所有重编程实验在包被有CELLart(Gibco)无外来物基材的6孔组织培养板中,按照制造商的指导来进行。在初始的BJ重编程实验中,使用含FBS的BJ培养基将GlobalStem饲养细胞以每孔250K的密度铺板。在一些后续的基于饲养细胞的试验中,提高接种密度并在培养基更换期间临时补充饲养细胞,以力图对使用新的RF混合物时遇到的高消耗率做出响应维持接近铺满状态的饲养细胞层。无外来物的饲养细胞在使用时,在不含血清的基于Pluriton的重编程培养基中铺板。靶细胞在添加有抗生素、Pluriton增补剂和200ng/ml B18R干扰素抑制剂(eBioscience)的Pluriton无血清培养基(Stemgent)中铺板。在重编程期间和之后每日更换培养基,其中在最后一次转染后一天终止B18R的补充。在重编程期间将细胞在新鲜饲养细胞上分拆的实验中,在用于重新铺板的培养基中包含10uMY27632(Stemgent)。转染在靶细胞接种后一天开始,并且在本文中指明的持续时间中以24小时的时间间隔重复。除非另有注明,否则在每日培养基更换之前4小时,使用RNAiMAX(Invitrogen)将剂量为1200ng的RNA递送到每个孔。通过将100ng/μL RNA在无钙/镁的DPBS中稀释5倍,将5μL RNAiMAX/μg RNA在相同的稀释剂中稀释10倍,合并以产生10ng/μL RNA/载体的悬液,并在15分钟室温温育后分发到培养基,来制造基于RNAiMAX的转染混合物。对于使用Stemfect试剂(Stemgent)的转染来说,将RNA和Stemfect(4μL/μg RNA)在Stemfect缓冲液中混合,以给出10ng/μL的RNA浓度。将所述混合物温育15分钟,然后递送到培养基或冷藏以备后续使用。
实施例5.iPSC集落的表征
为了评估iPSC集落生产率,使用DPBS(含有钙/镁)中的4%聚甲醛将重编程培养物固定,并用在DPBS(含有钙/镁)中稀释100倍的StainAlive TRA-1-60Alexa 488抗体(Stemgent)进行免疫染色。进行集落挑取、扩增和随后的免疫染色和用于多能性的分子和功能验证的三谱系分化测定法。进行DNA指纹分析和核型分析。在超过一套的小鼠模型中进行和验证畸胎瘤形成。由此证实干细胞的多能性。
公开了用于将非干细胞高效重编程成多能干细胞的新方法,所述方法通过将靶细胞与工程化的重编程因子和非工程化的重编程因子的组合相接触,使得可以在约9天、有时短至6或甚至5天内产生iPSC。这些iPS细胞可以被生产成无饲养细胞的、无外来物的和无足迹的iPSC。除了本发明方法的显著提高的重编程效率之外,这种新技术与所有以前已知的技术的区别还在于如此产生的iPSC是“干净的”,因为它们没有与任何病毒或载体接触。本发明可以在事实上涉及干细胞建立、分化、细胞和发育研究应用以及临床应用的所有领域中发现用途。类似的程序也可用于定向分化或转分化。
序列表
<110> 美国绿阳生物技术及医药公司 (ALLELE BIOTECHNOLOGY ANDPHARMACEUTICALS, INC.)
<120> 使用合成的信使RNA无饲养细胞地衍生人类诱导性多能干细胞 (FEEDER-FREEDERIVATION OF HUMAN-INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS WITH SYNTHETIC MESSENGERRNA)
<130> SCT145681-90
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 1
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tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120
<210> 2
<211> 149
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 2
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tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120
cttcctactc aggctttatt caaagacca 149
Claims (5)
1.一种用于去分化或重编程无饲养细胞、无外来物且无整合的哺乳动物体细胞的方法,所述方法包括:
a)用补充有以下组合物的培养基转染分离的哺乳动物体细胞,所述组合物包含:1)有效量的编码M3O的合成的mRNA,以及2)编码Sox2、Klf4、Nanog、Lin28和cMyc-T58A的合成的mRNA;其中所述合成的mRNA是通过使用4:1比率的ARCA帽类似物与GTP体外转录反应来合成,并且核苷酸三磷酸混合物具有5m-CTP对CTP和假UTP对UTP的完全代替;以及
b)在无饲养细胞和无外来物的培养条件下培养所述体细胞足够长的时间,并且每天重复步骤a)一次直到将所述体细胞重编程或去分化,产生无饲养细胞、无外来物且无整合的诱导的多能干细胞。
2.一种用于去分化或重编程无饲养细胞、无外来物且无整合的哺乳动物体细胞的方法,所述方法包括:
a.在培养基中将所述哺乳动物体细胞以一细胞密度铺板,所述细胞密度等同于标准6孔组织培养板的每个孔50,000至150,000个细胞,并在无饲养细胞、无外来物且无整合的条件下培养;
b.在铺板后一天,通过将步骤a的培养基换成新鲜培养基来转染细胞,所述新鲜培养基补充有包含以下的组合物:1)有效量的编码M3O的合成的mRNA,以及2)编码Sox2、Klf4、Nanog、Lin28和cMyc-T58A的合成的mRNA,其中所述合成的mRNA是通过使用4:1比率的ARCA帽类似物与GTP体外转录反应来合成,并且核苷酸三磷酸混合物具有5m-CTP对CTP和假UTP对UTP的完全代替,并且在无饲养细胞和无外来物的培养条件下培养所述分离的哺乳动物体细胞;
c.重复步骤b足够多的次数,由此将所述体细胞重编程或去分化,产生无饲养细胞、无外来物且无整合的诱导的多能干细胞。
3.权利要求2的方法,其中所述哺乳动物体细胞是人类细胞。
4.一种用于去分化或重编程无饲养细胞、无外来物且无整合的哺乳动物体细胞的方法,所述方法包括:
a.在无饲养细胞和无外来物的培养条件下在培养基中培养分离的哺乳动物体细胞,所述培养基补充有包含以下的组合物:1)有效量的编码M3O的合成的mRNA,以及2)编码Sox2、Klf4、Nanog、Lin28和cMyc-T58A的合成的mRNA,其中1)和2)中的所述合成的mRNA使用4:1比率的ARCA帽类似物与GTP通过体外转录反应来合成,并且核苷酸三磷酸混合物具有5m-CTP对CTP和假UTP对UTP的完全代替;
b.在24小时后将步骤a的培养基换成新鲜培养基,所述新鲜培养基补充有所述组合物,并且在无饲养细胞和无外来物的培养条件下培养所述分离的哺乳动物体细胞;
c.重复步骤b足够多的次数,由此将所述体细胞重编程或去分化,产生无饲养细胞、无外来物且无整合的诱导的多能干细胞。
5.一种制备药剂的方法,所述药剂用于在患者中治疗或抑制疾病或障碍的一种或多种症状,所述方法包括:
使用权利要求1、2或4的方法以获得所述诱导的多能干细胞;以及
使用所获得的诱导的多能干细胞制备药剂。
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