KR20200005560A - 녹내장의 치료 - Google Patents

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Abstract

본 실시형태는 일반적으로 녹내장의 치료, 억제 또는 예방에 사용하기 위한 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 관계한다. 실시형태의 덱스트란 설페이트는 안압의 감소 및 정상화, 망막 신경절 세포 및 망막 신경 섬유층을 보존하는 관점에서 신경 보호 효과, 그리고 형성된 섬유주대 반흔 요소를 용해시킨다.

Description

녹내장의 치료
본 실시형태는 일반적으로 녹내장의 예방, 치료 또는 억제에 관한 것으로, 특히 녹내장의 예방, 치료 또는 억제에 있어서 덱스트란 설페이트의 사용에 관한 것이다.
녹내장은 돌이킬 수 없는 실명을 유발할 수 있는 진행성 시신경 병증의 그룹을 나타내며, 여기서 주요 위험 인자는 안압(IOP)의 상승이다. 일차 개방각 녹내장(primary open-angle glaucoma: POAG)에서, IOP의 증가는 일반적으로 TM 세포성, TM 수축 및 세포 외 매트릭스(ECM) 수준 이상으로 결과된, 섬유주대(trabecular meshwork)(TM)를 통한 방수(aqueous humor)(AqH) 유출이 감소될 때 발생한다. TM의 탄성-섬유는 콜라겐 IV, 라미닌 및 피브로넥틴으로 구성된 무정형 ECM에 매립된 미세한 원섬유(fibril)의 집(sheath)에 둘러싸여 있다. TM 내의 소관주변 조직(JCT)에서 탄성-유사 섬유의 집과 관련된 플라크(plaque) 물질의 존재, 소위 집-유래(SD) 플라크는 또한 POAG의 병리학적 특징이다. 따라서, POAG 환자는 연령대-일치 대조군의 눈과 비교하여, 이들의 TM에서 훨씬 더 많고, 더 두꺼운 SD-플라크를 가지고 있다. 그러나, 이러한 SD-플라크는 거짓비늘(psuedoexfoliation) 녹내장을 갖는 눈과 건강한 눈을 비교할 때, 유사한 수준의 SD-플라크 물질을 가졌지만, 그러나 여전히 더 높은 수준의 IOP를 갖는 것으로 나타났기 때문에, 증가된 유출 저항에 기여하지 않는 것으로 간주된다. 그럼에도 불구하고, TM 집 주변에서 ECM의 수준이 증가하고, 이 증착(deposition)은 유출 저항 증가에 기여할 수 있다. TM에서 이들 세포 및 ECM 변화는 변경된 TM 세포 수축 능력과 함께 기능 장애 TM을 초래하고, 궁극적으로 AqH 유출(outflow)의 엄격한 제어가 상실된다.
POAG에서 TM 기능 장애를 유발하는 메커니즘은 아마도 다요인성일 수 있지만, AqH 내에서 병리학적으로 높은 수준의 형질전환 성장 인자-β(TGF-β)가 기여하는 것으로 생각된다. 일부 POAG 환자는 백내장 또는 다른 형태의 녹내장을 갖는 연령-일치 환자로부터 취한 AqH와 비교하여, AqH에서 TGF-β의 수준이 상승하였다. TM ECM 증착 및 IOP 증가에서 TGF-β의 역할은 인간의 눈 관류(perfusion) 실험 및 설치류 녹내장 모델에서 입증되었다. 배양된 인간 TM 세포로부터의 유전자 발현 연구는 또한 TGF-β1 및 TGF-β2 동형(isoform)이 녹내장에서 보여지는 TM 변화에 기여할 수 있는 ECM 단백질의 과발현을 유도한다는 주장을 뒷받침한다. 추가로, TGF-β는 플라스미노겐 활성화제 억제제(PAI)-1 및 메탈로프로테이나제의 조직 억제제(TIMP) 수준 증가를 통하여, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)의 활성화를 억제함으로써, ECM의 파괴를 방지한다. PAI-1은 플라스미노겐을 플라스민으로 전환하는 것을 억제하는데, 이는 MMP의 플라스민-의존적 활성화에 필요하다. TGF-β의 IOP-증가 효과는 TM 세포의 증식을 감소시키고 세포 자가사멸을 유도하여, 전체 TM 세포 수를 감소시키는 사이토킨의 능력에 또한 기여하였다.
TGF-β는 또한 RhoA-Rho-관련된 단백질 키나제(ROCK) 신호 경로를 통해 TM 세포의 수축을 자극하고, TM 수축성은 IOP에 유의적으로 영향을 미친다. Rho/ROCK 억제제를 사용하여 RhoA-매개된 TM 수축을 감소 시키거나 또는 제거하였던 연구는 녹내장 및 IOP의 증가와 관련된 다른 의학적 상태를 치료하는 것으로 간주되는 새로운 종류의 IOP 저하제로 이어졌다. 그러나, Rho/ROCK 억제제 단독으로는 POAG를 가진 일부 환자에서 발생하는 만성 섬유성 병리를 해결할 수 있을 것 같지 않으며, 그 효능은 여전히 조사 중이다. 궁극적으로, IOP 상승은 시신경 머리 및 망막의 세포에서 대사 및 생화학적 변화를 초래한다. 또한, 기계적인 축삭 압박은 역행 및 선행 모두의 축삭 운반에 영향을 미친다. 신경 영양 인자의 기계적 축삭 압박 박탈 망막 신경절 세포(RGC)와 함께 대사 및 생화학적 변화는 녹내장의 진단학적 특징으로, 이는 RGC 자가사멸 및 시신경 원반 오목(optic disc cupping)에서 절정이다.
녹내장 치료의 목표는 녹내장으로 인한 시력 손실이 돌이킬 수 없기 때문에, 시력 손실을 예방하는 것이다. 현재 녹내장은 안약, 알약, 레이저 수술, 전통적인 수술 또는 이러한 방법의 조합으로 치료된다. 이러한 치료의 대부분은 시각 정보를 뇌로 전달하는 시신경을 손상시킬 수 있는 IOP를 낮추거나 제어하도록 설계된다. 그러나, IOP 통제는 기껏해야 불완전하고, 질병 진행을 제한하거나 역전시킬 수 있는 개선 요법의 요구는 아직 충족되지 않고 있다.
대상체에서 녹내장을 치료, 억제 또는 예방하는 것이 일반적인 목표이다.
이 목적 및 다른 목적은 본 명세서에 개시된 실시예에 의해 충족된다.
실시형태의 한 측면은 대상체에서 녹내장을 치료, 억제 또는 예방하는데 사용하기 위한 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
본 실시형태의 또 다른 측면은 대상체에서 고안압증(ocular hypertension)을 치료, 억제 또는 예방하는데 사용하기 위한 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
본 실시형태의 추가 측면은 녹내장 및/또는 고안압증을 앓고 있는 대상체에서 망막 신경절 세포의 손실 및 망막 신경 섬유층의 감소를 억제하는데 사용하기 위한 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
본 실시형태의 또 다른 측면은 녹내장을 앓고 있는 대상체체의 안압 감소에 사용하기 위한 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
본 실시형태의 추가 측면은 대상체에서 녹내장의 치료, 억제 또는 예방용 의약 제조용; 대상체에서 고안압증의 치료, 억제 또는 예방용; 녹내장을 앓고 있는 대상체의 안압 감소용; 또는 녹내장 및/또는 고안압증을 앓고 있는 대상체에서 망막 신경절 세포의 손실 및 망막 신경 섬유층의 감소용으로 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 사용에 관한 것이다.
본 실시형태의 또 다른 측면은 녹내장의 치료, 억제 또는 예방 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체를 녹내장을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 실시형태의 또 다른 측면은 고안압증의 치료, 억제 또는 예방 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체를 고안압증을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 실시형태의 또 다른 측면은 망막 신경절 세포의 상실 및 망막 신경 섬유층의 감소를 억제하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체를 녹내장 및/또는 고안압증을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 실시형태의 또 다른 측면은 녹내장을 앓고있는 대상체체의 안압을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체를 녹내장을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 실시형태의 덱스트란 설페이트는 녹내장을 앓고 있는 대상체에서 정상 IOP의 신속하고 재현가능한 회복을 야기한다. 건강한 대상체의 정상 범위까지의 IOP 감소는 망막에서의 RGCs의 보존 및 망막 신경 섬유층(RNFL)의 보존과 관련이 있다. IOP의 정상적인 수준으로의 회복은 덱스트란 설페이트로 처리된 대상체의 관점에서 라미닌 및 피브로넥틴의 현저한 감소된 수준에 의해 입증된 바와 같이, 형성된 TM 반흔 요소의 용해로 인한 것으로 제안된다.
추가의 목적 및 장점과 함께, 실시형태들은 첨부 도면과 함께 취해진 다음의 설명을 참조함으로써, 가장 잘 이해될 수 있다, 이때:
도 1은 일차 개방각 녹내장(POAG)을 앓고 있는 대상체에서 실시형태에 따라 염수 대조군 또는 덱스트란 설페이트로 처리하여, 대상체에서 안압(IOP)의 변화를 도시한다.
도 2는 POAG를 앓고 있는 대상체에서 실시형태에 따라 염수 대조군 또는 덱스트란 설페이트로 처리하여, 대상체에서 망막 신경절 세포(RGC) 수의 변화를 도시한다.
도 3은 POAG를 앓고 있는 대상체에서 실시형태에 따라 염수 대조군 또는 덱스트란 설페이트로 처리하여, 대상체에서 망막 신경 섬유층(RNFL) 두께의 변화를 도시한다.
도 4는 POAG를 앓고 있는 대상체에서 실시형태에 따라 염수 대조군 또는 덱스트란 설페이트로 처리하여, 대상체에서 홍채각막 각의 전방 세그먼트(anterior segment)를 도시한다.
도 5는 POAG를 앓고 있는 대상체에서 실시형태에 따라 염수 대조군 또는 덱스트란 설페이트로 처리하여, 대상체의 관점에서 라미닌 면역반응성의 변화를 도시한다.
도 6은 POAG를 앓고 있는 대상체에서 실시형태에 따라 염수 대조군 또는 덱스트란 설페이트로 처리하여, 대상체의 관점에서 피브로넥틴 면역반응성의 변화를 도시한다.
도 7은 POAG를 앓고 있는 대상체에서 실시형태에 따라 염수 대조군 또는 덱스트란 설페이트로 처리하여, 대상체의 체중 차이를 도시한다.
도 8은 POAG를 앓고 있는 대상체에서 실시형태에 따라 염수 대조군 또는 덱스트란 설페이트로 처리하여, 대상체의 대표적인 플루오레세인 혈관촬영 영상이다.
도 9는 아이소렉틴 B4(isolectin B4) 착색을 이용하여, 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization)을 도시한다. 대조군(도 9a) 및 처리군(도 9b)의 혈관신생의 대표 영상이다. (도 9c): 막대 그림은 평균 신생 혈관 영역을 보여준다.
도 10은 콜라겐 IV 착색을 이용한 맥락막 혈관신생을 도시한다. 대조군 (도 10a) 및 처리군 (도 10b)의 혈관신생의 대표 영상이다. (도 10c): 막대 그림은 평균 신생 혈관 영역을 보여준다.
도 11은 RNFL의 빛간섭단층촬영 (OCT) 분석 결과를 도시한다.
본 실시형태는 일반적으로 녹내장의 예방, 치료 또는 억제에 관한 것으로, 특히 녹내장의 예방, 치료 또는 억제에 있어서 덱스트란 설페이트의 사용에 관한 것이다.
덱스트란 설페이트 치료는 녹내장, 특히 일차 개방각 녹내장(POAG)을 앓고 있는 대상체의 녹내장성 눈에서 정상 안압(IOP)의 빠르고, 재현가능한 회복을 유도하였다. 정상적인 IOP 수준의 회복은 덱스트란 설페이트 처리된 대상체의 눈에서 RGC 수의 유지, 그리고 망막 신경 섬유층(RNFL) 두께의 보존에 의해 입증된 바와 같이, 망막에서의 망막 신경절 세포(RGC)의 보존과 관련이 있었다. 덱스트란 설페이트 치료는 덱스트란 설페이트 처리된 대상체의 관점에서 라미닌 및 피브로넥틴의 수준이 상당히 낮았기 때문에, 형성된 섬유주대(TM) 반흔 요소의 용해를 또한 결과하였다.
관찰의 임상적 결과는 다음과 같다. 현재 녹내장 환자는 안구 액 생성을 제한하거나, 또는 안구 액 유출을 증가시킴으로써, IOP를 낮추는 일일 점안약으로 치료받는다. 이러한 치료법은 순응도가 낮으며, 결과적으로 IOP의 제어가 불완전하고, 이는 환자 대부분에서 점진적인 시력 상실을 초래한다. 시력 손실을 유발하는 안구 병리를 예방하고, 역전시키는 치료는 IOP 제어를 크게 개선시켜, 매우 가치가 있을 것이다.
녹내장 치료에 유용한 후보 약물은 눈에 혈관 신생 또는 신생 혈관 생성을 유도해서는 안된다. 그렇지 않으면, 눈에서의 이러한 병리학적 혈관 신생은 심각한 시각 장애를 야기할 수 있다. 본원에 제시된 실험 데이터는 덱스트란 설페이트가 치료 대상체의 눈에 항-혈관 신생 또는 전-혈관 신생 효과를 갖지 않았음을 나타낸다. 따라서, 덱스트란 설페이트는 눈에서 병리학적 혈관 신생의 위험없이, 안구 징후에 안전하게 사용될 수 있다.
실시형태의 덱스트란 설페이트는 이로써 녹내장의 예방, 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
따라서, 실시형태의 한 측면은 대상체에서 녹내장을 치료, 억제 또는 예방하는데 사용하기 위한 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
녹내장은 안구 질환의 그룹으로, 시력 손상과 관련하여 시신경 및 망막에 손상을 초래한다. 녹내장의 가장 일반적인 유형은 개방각 녹내장이며, 다소 덜 흔한 유형은 폐쇄-각 녹내장과 정상-장력 녹내장(normal-tension glaucoma)이다. 개방각 녹내장은 시간이 지남에 따라 천천히 발생하며, 통증이 없다. 측면 시력이 감소하기 시작한 후, 중앙 시력 손실이 발생하고, 치료하지 않으면 실명을 초래할 수 있다. 폐쇄-각 녹내장은 점진적으로 또는 갑자기 나타날 수 있다. 갑작스런 현시는 심한 눈의 통증, 시야가 흐려짐, 중간 정도-확장된 동공, 눈의 발적 및 메스꺼움이 포함될 수 있다. 녹내장으로 인한 시력 상실은 일단 발생하면, 영구적이다.
조기 치료를 받으면, 약물 치료, 레이저 치료 또는 수술로 녹내장 질환의 진행을 늦추거나 멈출 수 있다. 녹내장 관리의 최근 목표는 녹내장 손상과 신경 손상을 피하고, 부작용을 최소화하면서, 환자의 시야와 전체 삶의 질을 유지하는 것이다. 이를 위해서는 적절한 진단 기술과 후속-검사 및 개별 환자에 대한 신중한 치료 선택이 필요하다. 안압은 녹내장의 주요 위험 인자 중 하나일 뿐이지만, 다양한 제약 및/또는 수술 기술을 통해 이를 낮추는 것이 현재 녹내장 치료의 주된 대상체가다.
안압은 약물, 보통 안약로 낮출 수 있다. 녹내장을 치료하기 위해 여러 부류의 약물이 사용되며, 각 부류에 여러 가지 약물이 있다. 이 약들은 각각 국소 및 전신 부작용을 가질 수 있다. 약물 치료 프로토콜에 집착하는 것은 복잡하고, 비용이 많이 들 수 있다. 녹내장 환자의 시력 상실의 주요 원인은 약물 및 추적-방문에 대한 순응도가 낮기 때문이다.
녹내장을 치료하기 위해 레이저 및 기존 수술이 모두 수행된다. 수술과 레이저 치료로는 녹내장을 완치할 수 없기 때문에, 이들은 일반적으로 일시적인 해결이다.
따라서, 대상체에서 녹내장을 치료, 억제 또는 예방하는데 사용될 수 있는 약제를 제공할 필요성이 오랫동안 있었다.
실시형태들에 따르면, IOP 증가, 즉 녹내장으로 인한 안구 고혈압을 앓고 있는 대상체에게 투여 될 때, 덱스트란 설페이트, 또는 약제학적으로 허용 가능한 염은 IOP의 감소를 유도한다. 실제로, IOP는 덱스트란 설페이트 투여 후 정상화되며, 즉 건강한 대상체의 정상 IOP 범위로 감소된다. 따라서, 실시형태에 따르면, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 녹내장의 가장 해로운 요소, 즉 비정상적으로 증가된 IOP와 싸우고, 이를 치료할 수 있다.
더욱이, 실시형태에 따르면, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 투여는 RGCs에 신경보호 효과를 제공한다. 더욱 상세하게, 치료를 받은 대상체의 눈에서 RGC 수의 유지 및 RNFL 두께의 보존으로 볼 수 있는 것과 같이, 덱스트란 설페이트 투여는 손상 및 세포 사멸로부터 RGCs를 보호하였다.
RGC는 눈의 망막의 내부 표면 근처에 위치한 뉴런 유형으로써, 일반적으로 신경절 세포층으로 표시된다. RGCs는 망막으로부터 상-형성 및 비-상 형성 시각 정보를 시상, 시상 하부 및 중간뇌(mesencephalon) 또는 중뇌(midbrain)의 여러 영역으로 활성 전위의 형태로 집합적으로 전송한다. RGCs는 크기, 연결 및 시각 자극에 대한 반응의 측면에서 상당히 다양하지만, 이들 모두 뇌로 연장되는 긴 축색 돌기를 갖는 특정된 성질을 공유한다. 이러한 축삭은 시신경, 시각 교차(optic chiasm), 및 시삭(optic tract)을 형성한다.
때때로 신경 섬유층 또는 망막신경섬유층(stratum opticum)으로 지칭되는 RNFL은 시신경의 섬유의 확장에 의해 형성된다. RNFL은 민감한 구조이며, 높은 IOP와 같은 일부 프로세스는 이의 자가사멸을 자극할 수 있다.
실시형태의 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 신경보호 효과는 RGCs의 손상 및 자가 사멸을 효과적으로 방지하고, 이로써 RNFL를 보존한다.
전술한 바와 같이, TM 세포성 및 TM 수축의 이상과 같은 TM 기능장애는 녹내장을 앓고 있는 대상체에서 볼 수 있는 높은 IOP의 기저 원인일 수 있다. 실시형태의 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 녹내장 대상체에서 형성된 TM 반흔(scarring)을 분산시키고, 약화시킨다. 이는 다시 TM을 통한 AqH 유출을 정상화시킨다.
실시형태의 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 항-반흔 효과는 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 의해 유도되는 몇몇 기전의 결과라고 제안된다. 따라서, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)를 유도하며, 이는 세포외 매트릭스(ECM) 단백질을 분해시키는 효소로써, 메탈로프로테이나제의 조직 억제제(TIMP)의 활성을 억제한다. 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 TGF-β및 간세포 성장 인자(HGF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 종양 괴사 인자(TNF) 등과 같은 다양한 성장 인자를 차단하는 데코린과 같은 천연 항-반흔 분자를 추가로 유도한다. 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 또한 TGF-β활성에 대한 억제 효과를 가지며, 과도한 수준의 TGF-β의 존재 하에서도 섬유증을 억제한다. 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 면역 세포 흡착 및 세포 응집을 추가로 억제한다. 반흔은 염증성 사이토킨, 특히 TGF-β에 의해 구동되고, TGF-β-활성화된 단백질 키나제 1(TAK-1)의 수준을 억제한다. 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 TGF-β및 반흔 및 섬유증을 촉진하는 다른 사이토킨을 차단하며, 이는 병행 항-반흔 분자다. 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 이들에 의해 유도된 이들 메카니즘과 함께, TM 반흔을 분산시키고, 약화시킴으로써, 녹내장 눈에 긍정적인 효과를 갖는다.
종래 기술의 항-녹내장 의약은 일반적으로 녹내장을 치료 또는 완치하거나 또는 녹내장의 근본 원인을 퇴치하기보다는, 오히려 안구 액 생성을 제한하거나 또는 안구 액 유출을 증가시킴으로써, 녹내장의 증상, 예컨대 IOP를 낮추는 것과 같이, 증상을 완화시킨다. 그러나, 이러한 약제를 사용한 치료는 전형적으로 낮은 순응도 및 IOP의 불완전한 제어를 가지므로, 대부분의 대상체에서 점진적인 시력 손실을 초래한다. 이것은 IOP를 감소시키고, 정상화시킬 뿐만 아니라 또한 RGCs 및 RNFL에 대한 신경 보호 효과를 제공하고, 형성된 TM 반흔 요소를 용해시켜 녹내장의 실제 억제 및 치료를 가능하게 하는 본 실시형태의 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과 명백한 대조를 이룬다.
덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 눈에 병리학적 혈관 신생을 유발하지 않으면서, 녹내장의 치료, 억제 또는 예방한다. 따라서, 녹내장 치료, 억제 또는 예방에 사용되는 약제는 눈에 혈관 신생 또는 신생 혈관 생성을 유발하지 않는 것이 중요한데, 그렇지 않으면 심각한 시각 장애를 유발할 수 있다. 본원에서 제시되는 실험 데이터는 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 눈에 항-혈관 신생 또는 전-혈관 신생 효과를 갖지 않아서 안구 증상에 적용하기에 적합하다는 것을 나타낸다.
개방각 녹내장은 가장 흔한 녹내장의 형태로 모든 녹내장 환자의 90% 이상을 차지한다. 배출 관이 막히면 눈의 압력이 증가하게 된다. 개방각은 홍채가 각막과 만나는 각도가 넓고 개방되어 있음을 의미한다. 개방각 녹내장은 또한 당업계에서 일차 녹내장, 일차 개방각 녹내장(POAG) 또는 만성 녹내장으로 지칭된다.
특정 실시형태에서, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 대상체에게서 POAG와 같은 개방각 녹내장의 치료, 억제 또는 예방에 사용하기 위한 것이다.
덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 안구 고혈압 범위를 정상 IOP 범위로 IOP를 효과적으로 감소시킨다.
따라서, 본 실시형태의 또 다른 측면은 대상체에서 고안압증(ocular hypertension)을 치료, 억제 또는 예방하는데 사용하기 위한 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 고안압증을 앓고 있는 대상체에서 안압을 감소시키는데 이용된다.
그런 이유로, 본 실시형태의 또 다른 측면은 녹내장을 앓고 있는 대상체, 바람직하게는 POAG와 같은 개방각 녹내장을 앓고 있는 대상체의 안압 감소에 사용하기 위한 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
인간에서, 정상적인 IOP 범위는 전형적으로 10 mmHg 내지 20 mmHg이고, 평균 값은 약 15.5 mmHg이고, 약 2.75 mmHg의 변동이 있다. 안구 고혈압(OHT)은 정상보다 높아서, 즉 인간의 경우 전형적으로 20 mmHg보다 높은 IOP로 정의된다.
따라서, 실시형태에서, 안압을 감소시키는 것은 안압을 감소 시키거나 또는 안압을 10mmHg 내지 최대 20mmHg의 정상 IOP 범위 내에 있도록, 예를 들어 12.75mmHg 내지 최대 18.25mmHg에 있도록 복원시키는 것을 포함한다.
한 실시형태에서, 대상체는 녹내장, 바람직하게는 POAG와 같은 개방각 녹내장에 의해 야기되는 고안압증을 앓고 있다.
녹내장, 특히 개방각 녹내장 및 POAG는 고안압증의 주요 원인이지만, 고안압증의 다른 가능한 원인, 예를 들어 고혈압; 스트레스; 과량의 염, 수소화 오일, 알코올 및 설탕을 포함한 식단; 눈 외상; 흡연; 당뇨병; 그리고 심장병을 비롯한 다른 원인이 있다. 또한 일부 의약은 특정 개인에게 고안압증을 유발하는 부작용이 있다. 예를 들어, 천식 및 기타 증상을 치료하는 데 사용되는 스테로이드 약물은 고안합의 위험을 증가시키는 것으로 나타났다. 눈으로부터 수성 생산과 배수 균형에 영향을 줄 수 있는 다양한 안구 외상으로 인해 안구 고혈압이 발생할 수 있다. 고안압증은 또한 야행성 상승된 IOP, IOP 스파이킹(spiking), 거짓비늘 증후군(pseudoexfoliation syndrome), 거짓비늘 증후군, 색소 분산 증후군(pigment dispersion syndrome) 및 각막환(corneal arcus)과 같은 다른 눈 상태와 관련된다.
덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 RGC의 손상을 방지하거나, 또는 최소한 손상 및 사망을 감소시키고, RNFL 완전성 및 두께를 보존하기 위한 신경 보호 효과를 제공한다.
따라서, 본 실시형태의 추가 측면은 녹내장, 바람직하게는 개방각 녹내장, 이를 테면 POAG, 및/또는 고안압증을 앓고 있는 대상체에서 망막 신경절 세포의 손실 및 망막 신경 섬유층의 감소를 억제하는데 사용하기 위한 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
증가된 IOP 및 RGCs의 사망은 직간접적으로 중간뉴런(interneurons) 및 광수용체와 같은 다른 망막 뉴런에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, RGC의 사망은 위축(atrophy)을 유발하여, 이는 다시 시냅스 손실 및 다른 망막 뉴런의 사망을 유발할 수 있다.
따라서, IOP를 정상화하고, RGCs의 손상 및 사망을 감소시키는 것은 당뇨병성 망막병증 및 광수용체의 손실과 관련된 다양한 유전적 상태와 같은 다른 망막 상태를 치료, 예방 또는 억제하는데 유용 할 것이다.
덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 IOP를 낮추고, 동시에 망막 뉴런을 손상 및 사망으로부터 직접 보호함으로써, 녹내장 및 관련된 망막 상태의 치료, 예방 또는 억제를 위한 독특한 작용제이다.
한 실시형태에서, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 대상체에게 전신 투여하기 위해 제형화된다. 한 실시형태에서, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 전신 투여의 예로서 비경구 투여용으로 제형 화된다.
비경구 투여 경로의 예는 정맥내(i.v.) 투여, 동맥-내 투여, 근육-내 투여, 뇌내 투여, 뇌실내 투여, 경막내 투여 및 피하(s.c.) 투여를 포함한다.
한 실시형태에서, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 대상체에게 바람직하게는 정맥내(i.v.) 또는 피하내(s.c.) 투여용으로 제형화된다. 따라서, i.v. 및 s.c. 투여는 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 전신 투여의 바람직한 예가 된다. 특정 실시형태에서, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 대상체에게 s.c. 투여용으로 제형화된다.
한 실시형태에서, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 수성 주사 용액, 바람직하게는 수성 i.v. 또는 s.c. 주사 용액으로 제형화된다. 따라서, 실시형태의 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 바람직하게는 선택된 용매 또는 부형제와 함께 수성 주사 용액으로 제형화된다. 상기 용매는 유리하게는 수성 용매 및 특히 완충 용액이다. 이러한 완충액의 비-제한적인 예는 시트르산 완충제, 예를 들어 시트르산 일수화물(CAM) 완충제 또는 포스페이트 완충액이다. 예를 들면, 실시형태의 덱스트란 설페이트는 0.9% NaCl 식염수와 같은 식염수에 용해되고, 이어서 75mM CAM으로 임의선택적으로 완충되고, 수산화 나트륨을 사용하여 pH를 약 5.9로 조절할 수 있다. 수성 주사 용액, 이를 테면 염수, 즉, NaCl(aq)을 비롯한 비-완충된 용액 또한 가능하다. 더욱이, 완충 용액이 필요한 경우, CAM 및 포스페이트 완충액 이외의 완충계가 사용될 수 있다.
실시형태들은 주사로 제한되지 않으며, 대안적으로 안내, 유리체내, 섬모체띠경유(transzonular), 비강, 볼(buccal), 피부, 기관(tracheal), 기관지 또는 국소 투여를 포함하는 다른 투여 경로가 사용될 수 있다. 이어서, 활성 화합물인 덱스트란 설페이트는 특정 투여 경로에 기초하여 선택된 적합한 부형제, 용매 또는 담체와 함께 제형 화된다.
안내(intraocular) 투여는 대상체의 안구에 들어가는 투여를 지칭한다. 유리체내(intravitreal) 투여는 대상체의 눈을 통해, 바람직하게는 눈의 내부 공동으로 직접 투여하는 것을 지칭한다. 섬모체띠경유(transzonular) 투여는 섬모체띠(ciliary zonule)를 통한 투여를 의미하며, 이때 섬모체는 섬모체와 눈의 렌즈를 연결하는 일련의 섬유이다.
담체(carrier)는 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 전달 효율 및/또는 유효성을 개선하기 위한 운반체로서 작용하는 물질을 의미한다.
부형제는 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과 조합하여 제형화된 약리학적 불활성 물질을 지칭하며, 예를 들어, 증량제, 충전제, 희석제 및 약물 흡수 또는 용해를 용이하게 하거나 또는 다른 약동학적 고려를 위해 사용되는 제품이 포함된다.
덱스트란 설페이트의 약제학적으로 허용 가능한 염은 본원에 개시된 바와 같은 효과를 가지며, 투여 용량(들)에서 이의 수용자에게 해롭지 않은 덱스트란 설페이트의 염을 지칭한다.
덱스트란 설페이트는 바람직하게는 소위 저분자량 덱스트란 설페이트이다.
하기에서, 덱스트란 설페이트의 (평균) 분자량 및 황 함량에 대한 언급은 덱스트란 설페이트의 임의의 약제학적으로 허용 가능한 염에 또한 적용된다. 그런 이유로, 덱스트란 설페이트의 약제학적으로 허용 가능한 염은 바람직하게는 하기 실시형태에서 논의된 바와 같이 평균 분자량 및 황 함량을 갖는다.
덱스트란 설페이트는 설페이트화된 다당류, 특히 설페이트화된 글루칸, 즉 많은 글루코스 분자로 만들어진 다당류이다. 본원에 정의된 평균 분자량은 개별 설페이트화된 다당류가 이 평균 분자량과는 다른 분자량을 가질 수 있지만, 그러나 평균 분자량은 설페이트화된 다당류의 평균 분자량을 나타낸다는 것을 의미한다. 이것은 또한 덱스트란 설페이트 샘플에 대한 이 평균 분자량 주변에 분자량의 자연 분포가 있을 것이라는 것을 암시한다.
덱스트란 설페이트의 평균 분자량(Mw)은 겔 배제/침투 크로마토그래피, 광 산란 또는 점도와 같은 간접적인 방법을 사용하여 전형적으로 측정된다. 이러한 간접적인 방법을 사용하여 평균 분자량을 결정하는 것은 칼럼 및 용리액 선택, 유속, 눈금측정(calibration) 절차 등 여러 가지 요인에 따라 달라진다.
평균 분자량(Mw):
Figure pct00001
수치보다는 분자 크기에 민감한 방법, 예를 들어, 광 산란 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 방법이 전형적이다. 정규 분포가 추정되는 경우, Mw의 각면에서 동일한 중량, 즉, Mw 미만의 분자량을 갖는 샘플에서 덱스트란 설페이트 분자의 총 중량은 Mw 이상의 분자량을 갖는 샘플에서 덱스트란 설페이트 분자의 총 중량과 동일하다.
한 실시형태에서, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 바람직하게는 40,000 Da이거나 또는 그 이하, 보다 바람직하게는 20,000 Da이거나 또는 그 이하, 특히 10,000 Da이거나 또는 그 이하의 평균 분자량을 갖는다.
10,000 Da를 초과하는 평균 분자량의 덱스트란 설페이트는 일반적으로 낮은 평균 분자량을 갖는 덱스트란 설페이트에 비해, 독성에 대하여 더 낮은 효과 프로파일을 갖는다. 이는 바람직한 범위 내의 평균 분자량을 갖는 덱스트란 설페이트 분자와 비교하여, 더 큰 덱스트란 설페이트 분자(> 10,000 Da)의 경우 대상체에게 안전하게 투여될 수 있는 덱스트란 설페이트의 최대 용량은 더 낮다는 것을 의미한다. 결과적으로, 이러한 큰 덱스트란 설페이트 분자는 임상 용도에서 덱스트란 설페이트가 생체 내에서 대상체에게 투여될 때 덜 적합하다.
한 실시형태에서, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 2 000 내지 10,000 Da 범위의 평균 분자량을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 상기 평균 분자량은 2 500 내지 10,000 Da 범위 안에 있다. 특별히 바람직한 실시형태에서, 상기 평균 분자량은 3 000 내지 10,000 Da 안에 있다.
선택적이지만, 바람직한 실시형태에서, 덱스트란 설페이트 분자의 40% 미만은 3 000 Da 미만, 바람직하게는 35% 미만, 예를 들어, 덱스트란 설페이트 분자의 30% 미만 또는 25% 미만의 분자량은 3 000 Da 미만의 분자량을 갖는다. 또한, 또는 대안으로, 덱스트란 설페이트 분자의 20% 미만은 10,000 Da 초과 분자량을 갖는데, 바람직하게는 덱스트란 설페이트 분자의 15% 미만, 이를 테면, 10% 미만 또는 5% 미만은 10,000 Da 초과 분자량을 갖는다. 따라서, 특정 실시형태에서, 덱스트란 설페이트는 평균 분자량 주위에 실질적으로 좁은 분자량 분포를 갖는다.
특정 실시형태에서, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 평균 분자량은 3 500 내지 9 500 Da의 범위, 이를 테면 3 500 내지 8 000 Da 범위 안에 있다.
또 다른 특정 실시형태에서, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 평균 분자량은 4 500 내지 7 500 Da 범위 안에 있다.
추가 특정 실시형태에서, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 평균 분자량은 4 500 내지 5 500 Da의 범위 안에 있다.
따라서, 현재 바람직한 실시형태에서, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 평균 분자량은 바람직하게는 대략적으로 5 000 Da 또는 최소한 실질적으로 5 000 Da에 근접하며, 이를 테면 5 000 ± 500 Da, 예를 들면 5 000 ± 400 Da, 바람직하게는 5 000 ± 300 Da 또는 5 000 ± 200 Da, 이를 테면 5 000 ± 100 Da이다. 그런 이유로, 실시형태에서, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 평균 분자량은 4.5 kDa, 4.6 kDa, 4.7 kDa, 4.8 kDa, 4.9 kDa, 5.0 kDa, 5.1 kDa, 5.2 kDa, 5.3 kDa, 5.4 kDa 또는 5.5 kDa이다.
특정 실시형태에서, 상기에서 제시된 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 평균 분자량은 평균 Mw이며, 바람직하게는 겔 배제/침투 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 광 산란 또는 점도-기반 방법에 의해 측정된다.
특정 실시형태에서, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 평균적으로 약 5 포도당 단위 또는 이보다 약간 위의 포다당 단위로 구성되며, 포도당 단위당 최소한 2.0, 이를 테면 최소한 2.5의 평균 설페이트 수를 갖는다.
덱스트란 설페이트는 덱스트란의 폴리음이온성 유도체이며, 황을 함유한다. 실시형태의 덱스트란 설페이트의 평균 황 함량은 바람직하게는 글루코실 잔기 당 약 또는 최소한 2개의 설페이트기에 상응하는 15 내지 20%, 더욱 바람직하게는 대략 17%이다. 특정 실시형태에서, 덱스트란 설페이트의 황 함량은 바람직하게는 상응하는 덱스트란 분자의 가능한 최대 황 함량과 같거나 또는 최소한 이에 근접한다.
특정 실시형태에서, 실시형태의 덱스트란 설페이트는 1850 내지 3500 Da의 간격 내에서 핵 자기 공명(NMR) 분광법에 의해 측정된 수 평균 분자량(Mn)을 갖는다.
수 평균 분자량(Mn):
Figure pct00002
전형적으로 말단 기 분석에 의해 유도되며, 가령, NMR 분광법 또는 크로마토그래피. 정규 분포가 추정되는 경우, 덱스트란 설페이트 분자의 동일 수는 Mn의 각면에서 찾을 수 있는데, 가령, Mn 미만의 분자량을 갖는 샘플에서 덱스트란 설페이트 분자의 수는 Mn 이상의 분자량을 갖는 샘플에서 덱스트란 설페이트 분자의 수와 동일하다.
바람직한 실시형태에서, 실시형태의 덱스트란 설페이트는 1850 내지 2500 Da 간격, 바람직하게는 1850 내지 2300 Da 간격, 더욱 바람직하게는 1850 내지 2000 Da 간격 내에서 NMR 분광법에 의해 측정된 Mn을 갖는다.
특정 실시형태에서, 실시형태의 덱스트란 설페이트는 2.5 내지 3.0의 간격, 바람직하게는 2.5 내지 2.8의 간격, 보다 바람직하게는 2.6 내지 2.7의 간격 내에서 포도당 단위당 평균 설페이트 수를 갖는다.
특정 실시형태에서, 실시형태의 덱스트란 설페이트는 4.0과 6.0의 간격, 바람직하게는 4.5 내지 5.5의 간격, 더욱 바람직하게는 5.0 내지 5.2의 간격, 예를 들어 약 5.1과 같은 평균 포도당 단위 수를 갖는다.
또 다른 특정 실시형태에서, 실시형태의 덱스트란 설페이트는 평균 5.1의 포도당 단위와, 2.6 내지 2.7의 글루코스 단위당 평균 설페이트 수를 가지며, 이는 NMR 분광법에 의해 측정된 전형적으로 1850 내지 2000 Da의 간격 내에서 수 평균 분자량(Mn)을 결과한다.
본 실시형태에 이용될 수 있는 덱스트란 설페이트, 또는 이의 약학적으로 염은 WO 2016/076780에서 기술된다.
실시형태에 따른 덱스트란 설페이트는 덱스트란 설페이트의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 제공될 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용 가능한 염은 가령, 덱스트란 설페이트의 나트륨 또는 칼슘염을 포함한다.
특정 실시형태에서, Na+ 반대 이온을 포함하는 덱스트란 설페이트의 나트륨 염은 NMR 분광법에 의해 측정될 때, 2000 내지 2500 Da 간격, 바람직하게는 2100 내지 2300 Da 간격 내의 Mn을 갖는다.
실시형태의 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 적절한 투여량 범위는 대상체의 크기 및 체중, 치료받는 대상체의 상태 및 다른 고려 사항에 따라 달라질 수 있다. 특히, 인간 대상체의 경우, 가능한 투여 용량 범위는 1 μg/kg 내지 150 mg/kg 체중, 바람직하게는 10 μg/kg 내지 100 mg/kg 체중 일 수 있다.
바람직한 실시형태들에서, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 대상체체의 체중기반 0.05 내지 50 mg/kg, 바람직하게는 체중기반 0.05 또 0.1 내지 40 mg/kg의 범위의 용량, 보다 바람직하게는 대상체 체중기반 0.05 또는 0.1 내지 30 mg/kg, 또는 0.1 내지 25 mg/kg 또는 0.1 내지 15 mg/kg 또는 0.1 내지 10 mg/kg으로 투여되도록 제형화된다.
실시형태의 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 투여는 바람직하게는 대상체에서 녹내장, 고안압증 및/또는 RGCs 및 RNFL의 손상을 야기할 수 있는 사건 또는 상태의 발생 후 가능한 빨리 개시되는 것이 바람직하다.
덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 투여는 반드시 녹내장의 치료로 제한될 필요는 없지만, 대안 적으로 또는 추가로 예방용으로 사용될 수 있다. 환언하면, 실시형태의 덱스트란 설페이트는 녹내장 발병 위험, 고안압증 및/또는 RGCs 및 RNFL 손상이 발생될 위험이 증가된 대상체에게 투여될 수 있다.
본원에서 이용된 녹내장, 고안압증의 억제 및/또는 RGCs의 상실 및 RNFL의 감소는 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이 치료 또는 완치가 반드시 100%일 필요는 없지만, 상태의 증상 및 영향을 줄인다는 것을 의미한다. 예를 들면, 고안압증의 억제는 IOP의 감소, 이를 테면 20mmHg이거나 또는 그 이하로의 정상 IOP 범위로의 감소를 수반한다. RGCs의 손실을 억제하는 것은 건강한 대상체에서 보이는 임의의 정상적인 RGC 손실을 초과하는 임의의 RGC 손실을 방지하는 것을 포함하여, 달리 손상되거나 손실될 수 있는 RGC의 수를 감소시키는 것을 포함한다. 상응하게, RNFL의 감소의 억제는 건강한 대상체에서 보여지는 임의의 정상적인 RNFL 감소 이상으로 RNFL의 감소를 방지하는 것을 포함하여, RNFL 두께의 감소를 중지시키거나 또는 최소한 감소시키는 것을 포함한다. 녹내장의 억제는 녹내장에 의해 야기되는 증상 및 상태, 예컨대 IOP 감소, RGC 손실 감소, RNFL 감소의 감소 및/또는 TM 반흔 요소의 용해를 포함한다.
실시형태들의 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 단일 투여 시점, 예를 들어 단일 주사 또는 볼루스(bolus) 주사 형태로 투여될 수 있다. 이 볼루스 투여용량(dose)은 환자에게 매우 신속하게 주사될 수 있지만, 그러나 덱스트란 설페이트 용액이 환자에게 몇 분에 걸쳐, 이를 테면, 5분 내지 10분 동안 또는 그 이상 동안 주입되도록 시간의 경과에 따라 주입되는 것이 유익하다.
대안으로, 실시형태의 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 치료 기간 동안 다수, 즉, 최소 2회에 투여될 수 있다. 따라서, 실시형태의 덱스트란 설페이트는 설명을 위한 예로서, 하루에 한 번 또는 여러 번, 주당 한 번 또는 여러 번, 한 달에 한 번 또는 여러 번 투여 될 수 있다.
특정 실시형태에서, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 1주 또는 다수의 연속 주간 동안 다수의 투여, 이를 테면 최소한 2-5의 연속 주간 동안 2-14회, 바람직하게는 2-7회 투여용으로 제형화된다. 특정 실시형태에서, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 여러 날 동안, 이를 테면 다수의 연속 일, 예를 들어 2-14일 동안 하루에 한번 또는 두번 투여되도록 제형화된다.
한 실시형태에서, 대상체는 포유 동물 대상체, 바람직하게는 영장류, 보다 바람직하게는 인간 대상체가다. 비록 실시형태들은 특히 인간 대상체의 녹내장을 치료, 억제 또는 예방하는 것에 관한 것이지만, 이들 실시형태는 또한 수의학 응용에 사용될 수 있다. 동물 대상체의 비-제한적 예는 영장류, 고양이, 개, 돼지, 말, 마우스, 래트를 포함한다.
본 실시형태의 다른 측면은 대상체에서 녹내장의 치료, 억제 또는 예방용 의약 제조용; 대상체에서 고안압증의 치료, 억제 또는 예방용; 녹내장을 앓고 있는 대상체의 안압 감소용; 또는 녹내장, 바람직하게는 개방각 녹내장, 및/또는 고안압증을 앓고 있는 대상체에서 RGCs의 손실 및 RNFL의 감소용으로 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 사용에 관한 것이다.
본 실시형태의 또 다른 측면은 녹내장의 치료, 억제 또는 예방 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 덱스트란 설페이트, 또한 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체를 녹내장, 바람직하게는 개방각 녹내장을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
본 실시형태의 또 다른 측면은 고안압증의 치료, 억제 또는 예방 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체를 고안압증을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 실시형태의 또 다른 측면은 망막 신경절 세포의 상실 및 망막 신경 섬유층의 감소를 억제하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 덱스트란 설페이트, 또한 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체, 녹내장, 바람직하게는 개방각 녹내장 및/또는 고안압증을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
본 실시형태의 또 다른 측면은 녹내장을 앓고있는 대상체체의 안압을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체를 녹내장을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
실시예들
실시예 1 - 녹내장 눈에 대하여 덱스트란 설페이트의 효과
결과
안압(IOP)
28일의 전체 기간에 걸쳐 염증성 사이토킨 TGF-β의 주 2회 전안방내(intracameral) 주사에 의해 IOP가 증가를 유도하였다. 이로 인해 IOP의 연합된 상승과 함께 14일까지 관련 섬유주대(TM) 배수 문의 반흔이 유도되었다. 피하내 덱스트란 설페이트/염의 일일 치료는 14일차에 개시되었다.
피하 염수 주사를 받는 동물에서 IOP 상승이 진행되면서, 두 그룹 모두 14 일 시점에에 IOP가 증가되었다. 그러나, 7 일의 덱스트란 설페이트 처리 후, 상승된 IOP가 감소하기 시작하였고, 24 일 시점에 대조군과 비교하여, 덱스트란 설페이트 그룹은 유의적으로 더 낮았고(P <0.001) 및 표준화된 IOP가 있었다. 28 일차 실험 종료 시, IOP는 대조군보다 현저히 낮았다(P> 0.001)(도 1).
망막 신경절 세포(RGC) 수
덱스트란 설페이트 치료는 28 일째 망막에 존재하는 RGC 수의 감소를 유의적으로 막았고(P>0.001)(도 2), 이는 덱스트란 설페이트의 신경 보호 효과를 시사한다. 이러한 신경 보호 효과는 낮아진 IOP로 인한 직접적 또는 간접적 효과를 통한 것일 수 있다.
망막 신경 섬유층(RNFL)의 광결맞음단층촬영(OCT) 분석
RNFL은 RGC에 속하는 축삭을 포함하고, RGC 세포체의 상실과 동시에 상실된다. RNFL은 염수 처리(도 3 및 11)와 비교하여, 덱스트란 설페이트 처리 후에 보존되었고, 이는 덱스트란 설페이트의 신경 보호 효과를 시사한다. 이러한 신경 보호 효과는 낮아진 IOP로 인한 직접적 또는 간접적 효과를 통한 것일 수 있다.
각의 전방 세그먼트 영상화
염수와 덱스트란 설페이트 처리된 눈의 모두에서 홍채각막 각은 '개방(open)'으로 유지되어, IOP 증가는 각 폐쇄에 의한 것이 아님을 보여준다(도 4 참고).
섬유주대(TM) 반흔
덱스트란 설페이트 치료는 각에서 면역 반응성 라미닌(도 5) 및 피브로넥틴(도 6)의 현저한 감소(P <0.001 라미닌; P <0.01 피브로넥틴) 수준에 의해 입증되는 바와 같이, TM 반흔을 상당히 약화시켰다.
체중
덱스트란 설페이트 처리군의 래트들이 더 활동적이었다. 두 그룹에서 체중을 측정할 때, 덱스트란 설페이트-처리 동물이 염수 처리 동물보다 처리 기간에 걸쳐 체중 증가가 더 적지만, 작지만 유의적이지 않은 차이가 있었다(도 7).
결론
덱스트란 설페이트 치료는 녹내장 성 눈에서 정상적인 IOP의 신속하고 재현 가능한 회복을 초래했다. 정상적인 IOP 수준의 회복은 덱스트란 설페이트 처리된 래트의 눈에서 RGC 수의 유지, 그리고 RNFL 두께의 보존에 의해 입증된 바와 같이, 망막에서의 RGC의 보존과 관련이 있었다. IOP의 감소는 아마도 라미닌 및 피브로넥틴의 수준이 덱스트란 설페이트 처리된 래트의 각도에서 현저히 낮았기 때문에 형성된 TM 반흔 성분의 용해에 기인한 것으로 보인다.
관찰의 임상적 결과는 다음과 같다. 현재 녹내장 환자는 안구 액 생성을 제한하거나, 또는 안구 액 유출을 증가시킴으로써, IOP를 낮추는 일일 점안약으로 치료받는다. 이러한 치료법은 순응도가 낮으며, 결과적으로 IOP의 제어가 불완전하고, 이는 환자 대부분에서 점진적인 시력 상실을 초래한다. 시력 손실을 유발하는 안구 병리를 역전시키는 치료는 IOP 제어를 크게 개선시켜, 매우 가치가 있을 것이다. 실시형태에 따른 덱스트란 설페이트는 정상화된 IOP, RGCs 및 RNFL의 보존 및 TM 반흔 요소의 용해를 초래하는 이러한 치료를 가능하게 한다.
재료 및 방법
연구 기획
녹내장은 성체 수컷 Sprague Dawley 래트에서 형질전환 성장 인자-β(TGF-β)의 매주 2 회 전안방내(IC) 주사를 반복하여 안압(IOP)을 증가시킴으로써 유도되었다. IOP가 지속적으로 증가하면(2 주 후) 망막 신경절 세포가 사멸된다(30-40%). 덱스트란 설페이트(Tikomed AB, Sweden, WO 2016/076780)를 실험 시작으로부터 15mg/kg를 매일 피하 주사로 투여하였고, 대조군과 비교하여 RGC 보호를 평가하였다.
그룹 1 n = 12마리 래트; 0 주차와 28 일차 사이의 24개 눈 IOP + IC TGF-β(매주 2 회 28 일) + 14 일차부터 28 일차까지 덱스트란 설페이트의 매일 피하 투여.
그룹 2 n = 8마리 래트; 0 주차와 28 일차 사이의 16개 눈 IOP + IC TGF-β(매주 2 회 28 일) + 14 일차부터 28 일차까지 비히클(염수)의 매일 피하 투여.
그룹 3 n = 8마리 래트; 8개의 눈 IOP + 온전한(손상되지 않은 눈) 및 28일 동안 매일 8개의 눈 IOP + IC 포스페이트-완충된 염수(PBS).
측정된 종점
· 0 일차부터 28 일차까지 연구를 통해 매주 2 회 IOP;
· 28 일 시점에 뇌-특이적 호메오박스(homeobox)/POU 도메인 단백질 3A(Brn3a)에 대해 면역반응성인 RGC를 카운팅하기 위한 면역조직화학(RGC 생존);
· 그룹 1 및 2에서 28 일 시점에 섬유주에서 반흔을 평가하기 위한 라미닌 및 피브로넥틴에 대한 면역조직화학;
· RGC 축삭을 포함하는 망막 신경 섬유층의 각도 및 두께를 검사하기 위한 28 일차의 전방 세그먼트 및 OCT 영상화; 그리고
· 28일차의 체중
동물 및 수술
16마리의 8 내지 10 주령 수컷 175-200g의 Sprague Dawley 래트(Charles River, 영국 켄트 소재), 우리 안에서 12시간의 명/암 사이클 하에서 음식 및 물에 자유롭게 접근하고, 실험에 사용하였다. Biomedical Services Unit, University of Birmingham에서 1986년 동물 법(영국)에 명시된 본사 지침과 Ophthalmic and Vision Research에서 동물 사용에 대한 ARVO 성명서에 따라 수술을 수행했다. 모든 안과 수술 절차 및 IOP 측정은 1.5 L/분의 유속으로 2-5% 이소플루오란/95% O2(National Vet Supplies, 영국 스토크 소재)를 사용하여 흡입 마취 하에 완료되었다. 모든 래트의 수술 후 안후생이 면밀히 모니터링되었다.
0 일차에, 28일 동안 활성 인간 재조합 TGF-β1(5 ng/μl; Peprotech, 영국 런던 소재)로 자체-제작된 일회용 멸균 유리 마이크로 피펫(Harvard Apparatus, 영국 켄트 소재)을 사용하여 생성된 터널을 통하여 1 주일에 2 회(매주 2 회), 3.5 μl IC 주입(매주 월요일과 목요일)을 반복하여 가능하게 하는 15 ° 일회용 블레이드를 사용하여 각막을 통해 양안의 전방 챔버로 하나의 자가-밀봉 절개가 이루어졌다.
IOP 측정
iCare Tonolab 리바운드 안압계(Icare, Helsinki, Finland)를 사용하여 생물학적 주기(circadian) 변동으로 판독 값을 혼동하지 않도록, 각 실험 기간 동안 오전 9시에서 11시 사이에 격주로 IOP를 기록하였다. 5% 아이소플루란으로 마취 유도 직후, 각 측정 시점에서 중심 각막으로부터 안압계로 6 회 리바운드 측정을 수행하여, 전체 평균 IOP 측정(mmHg)을 제공하고, 모든 그래픽 데이터 포인트는 정확한 측정을 위해 순차적으로 취한 3회 판독 값의 평균 ± SEM(각 6회 리바운드의)을 나타낸다.
OCT 및 전방 세그먼트 영상화
광결맞음단층촬영(Optical coherence tomography)은 RNFL이 RGC 밀도의 대리 척도인 RNFL의 망막 두께의 생체내 측정을 가능하게 한다. Spectralis HRA3 공 초점 스캐닝 레이저 검안경(Heidelberg Engineering)을 사용하여 흡입 마취 하에 28 일차에 모든 래트에 대해 OCT 망막 신경 섬유층 분석을 수행하였다. 각도 상의 전방 세그먼트 영상은 시신경 헤드 주위의 망막의 OCT 영상과 함께 얻었다. 내장-소프트웨어를 사용하여 이미지를 분할하고 RNFL 두께를 정량화했다.
면역 조직 화학(IHC)을 위한 조직 준비
CO2 농도를 증가시키면서 래트를 이에 노출시키고 사망하게 하고, 100ml 포스페이트-완충 염수(PBS)로 심혈관류한 후, pH 7.4에서 PBS 중 100 ml 4% 파라폼알데하이드(PFA)로 추가 관류하여 혈액을 씻어내었다. IHC를 위하여 절개된 눈은 4℃에서 4% PFA/PBS에 2시간 동안 침지시켜 고정시킨 후, 농도를 증가시킨 수크로스 용액(10%, 20% 및 30% 수크로스를 갖는 PBS; 모두 Sigma(영국 풀(Poole) 소재)로부터 구입함)에 4℃에서 24시간 동안 침지시켜 동결 보호하였고, 그 다음 박리-형 몰드 용기(Agar Scientific, 영국 에식스 소재)에서 최적의 절단 온도 매립 매질(Thermo Shandon, 영국 런콘 소재)에 매립하였다. 최적의 절단 온도 매립 매질에 담긴 눈은 -80℃에서 보관하기 전, 분쇄된 드라이아이스에서 빠르게 얼린 후, 그 다음 Bright 저온유지장치 박편절단기(Bright, 영국 헌팅던 소재)를 이용하여 -22℃에서 15㎛의 두께로 시신경 머리를 통하여 방시상면(parasagittal plane)에서 절개되었다. 절단면은 양으로 하전된 유리 슬라이드(Superfrost plus; Fisher Scientific, 미국 피츠버그 소재)에 장착하고, 2시간 동안 37℃에서 건조시키고, -20℃에서 보관하였다.
면역조직화학
동결된 절단면을 30분 동안 해동시킨 후, PBS에서 3×5분 세척하고, 이어서 0.1% 트리톤 X-100(Sigma)으로 20 분 투과시켰다. 절단면은 PBS에서 0.5% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.3% 트윈-20(모두 Sigma로부터)에서 30분 동안 차단시켰고, 1차 항체(표 1)에서 하룻밤 동안 항온처리후, PBS에서 3×5분 동안 세척하고, 2차 항체(표 1)로 실온(RT; 20 내지 25℃)에서 1시간 동안 항온처리되었다. 이어서, 절단면을 PBS에서 3×5분 동안 세척하고, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)(Vector Laboratories)을 함유하는 Vectorshield 장착 매체에 탑재하였다. 2차 항체 단독으로 배양된 대조군 조직 절단면은 모두 음성으로 염색되었다(제시되지 않음).
Figure pct00003
면역조직화학의 정량화
면역형광 염색 후, 절단면을 Zeiss Axioplan 2 epi-형광 현미경(Carl Zeiss Ltd)에서 관찰하고, Zeiss AxioCam HRc를 사용하여 각 항체에 대해 동일한 노출 시간을 사용하여 영상을 캡처했다. IHC는 앞서 기술된 방법에 따라 정량화되었다[1]. 간단히 말해서, TM 섬유증의 정량화에 사용된 관심 영역은 TM 내의 모든 눈/치료에 대해 동일한 규정된 크기의 사분면으로 특정되었고, ECM 증착은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 산출된 표준화된 배경 임계 값 이상의 TM 및% 면역 형광 픽셀의 정의된 사분면 내에서 정량화되었다(National Institutes of Health, 미국 소재). 각각의 항체에 대해, TM 영역의 밝기 임계 수준은 손상되지 않은 눈 절단면을 사용하여 설정되었고, 픽셀 강도의 테스트 그룹 분석을 위한 기준 레벨을 정의하였다. 평가자에 의한 정량화 동안 처리 그룹을 모르게 하기 위해 이미지에 무작위 숫자를 할당했다.
망막 섹션에서 RGC의 정량화를 위해, RPBMS+/DAPI+ RGC를 시신경의 어느 한 측면에서 신경절 세포 층으로부터 250㎛ 선형 부분으로부터 15㎛ 두께의 망막의 방시상(parasagittal) 섹션에서 계수하였다. 대조군 및 치료군에서 각각의 눈으로부터의 4개의 망막 섹션을 정량화하였다. 평가자에 의한 정량화 동안 처리 그룹을 모르게 하기 위해 이미지에 무작위 숫자를 할당했다.
통계
모든 통계 분석은 SPSS 20(IBM, 미국 소재)을 사용하여 수행되었다. 처리를 비교하기 위해, 가장 적절한 통계 분석을 결정하기 위해 정규 분포 테스트를 수행했다. 통계적 유의성은 p < 0.05에서 결정되었다. IOP 데이터, TM 섬유증 및 RGC 생존을 > 2 그룹 비교 ± SEM에 대해 스튜던트 t 검정 또는 일-원 분산 분석을 사용하여 유의미한 차이에 대해 시험하였고, 텍스트로 나타내거나 평균 ± SEM으로 그래픽으로 표시하였다.
실시예 2 - 혈관신생 노화-관련 황반 변성(nAMD)의 마우스 모델에서 덱스트란 설페이트의 혈관 효과 조사
눈의 병리학적 혈관 생성은 심각한 시각 장애를 유발할 수 있다. 따라서, 혈관신생 형성을 유도하거나 또는 신생 혈관 병리를 향상시키는 약물은 금한다.
마우스 레이저-유발된 맥락막 혈관 형성(CNV) 모델은 신생 혈관 노화-관련 황반 변성(AMD) 연구를 위한 중요한 주류 모델이었다. 이 절차는 망막 색소 상피(RPE)와 Bruch 막에 표적화된 레이저 손상을 투여함으로써, 혈관 신생을 유도하여 혈관신생 AMD에서 관찰되는 특징적인 병리를 모델링한다. 인간이 아닌 영장류에서 처음 개발된 레이저-유도된 CNV 모델은 다른 많은 종으로 이전 구현되었으며, 가장 최근종이 마우스이다. 이 모델은 분자 기전, 유전자 조작의 효과 및 약물 치료 효과와 같은 안구 신생 혈관 생물학의 여러 측면 연구용으로 적용될 수 있다.
결과
안저 플루오레세인 혈관촬영에서 맥락막 신생혈과의 시각화
망막 혈관은 안저 플루오레세인 혈관촬영에서 명확하게 시각화되었다. 맥락막 혈관 신생은 과형광(hyperfluorescence)의 패치로 나타났다. 도 8은 각 마우스의 대표적인 플루오레세인 혈관촬영 영상을 나타낸다. 상이한 눈들에서 CNV의 크기에 차이가 있었다. 때때로, 두 개의 CNVs는 집중적 플루오레세인 누출과 함께 합쳐졌으며, 이들은 정량 분석에서 제외되었다. 안저 플루오레세인 혈관촬영 영상의 육안 검사에서는 두 그룹 사이의 CNV의 크기에 유의적인 차이를 보이지 않았다.
CNV 분석
각 그룹에서 72개의 레이저 번 스팟(laser burn spot)이 수행되었다. 망막하 출혈 또는 중증 염증으로 인해 2개의 레이저 반점이 합쳐졌거나, 또는 과다-크기의(> 100000 ㎛2) CNVs는 최종 데이터 분석에서 제외되었다. 표 2는 최종 데이터 분석에 포함된 CNVs의 수를 요약한 것이다.
Figure pct00004
이소렉틴 B4를 이용한 혈관신생 정량화
아이소렉틴 B4(크리포니아 심플리씨폴리아(Griffonia simplicifolia) 렉틴 I-아이소렉틴 B4)는 내피 세포에서 발현되기 때문에, 망막 혈관에 대한 마커로서 사용되어왔다. 또한, 활성화된 미세아교세포 및 망막에 침투하는 대식세포에서 발현된다. 테스트 화합물 처리 군에서 평균 아이소렉틴 B4 양성 면적은 43972 ± 2302㎛2, 염수 대조군에서 42432 ± 2015㎛2였다(도 9). 렉틴 B4+ 병변에서 두 그룹간에 통계적 차이는 없었다.
콜라겐 IV를 이용한 새로운 혈관 영역의 정량화
콜라겐 IV은 혈관 매트릭스의 판층(laminar layer)을 형성한다. 따라서, 새로운 혈관을 보여주기 위해 이것이 사용되었다. 덱스트란 설페이트 처리 군에서, 새로운 혈관의 면적의 평균은 비히클(염수) 처리 대조군에서 58215 ± 2293㎛2와 비교하여, 54681 ± 2378 ㎛2였다(도 10). 두 그룹간에 통계적으로 유의 한 차이는 없었다.
결론
이 결과는 덱스트란 설페이트가 하루에 0.6 mg/ml의 용량에서 레이저-유도된 CNV에 대한 항-혈관 형성 또는 전-혈관 형성 효과를 갖지 않음을 나타낸다. 이는 덱스트란 설페이트가 안구 적응증에 적용될 수 있음을 나타낸다.
재료 및 방법
마우스
Biological Service Unit, Queen 's University Belfast에서 24마리의 10-12-주령의 C57BL/6J 마우스를 구입했다. 모든 마우스는 물 및 보통 식이(chow diet)에 자유롭게 접근하고, 12-시간 명/암 주기에 노출시켰다. 이 연구에서 동물의 사용에 관한 모든 절차는 안과 및 안과 연구에서 동물의 사용에 대한 Association for Research in Vision and Ophthalmology(ARVO) 성명서 및 동물의 규정(Scientific Procedures) 법 1986(UK)에 따라 수행되었다. 이 프로토콜은 Queen 's University Belfast의 동물 복지 및 윤리 위원회의 승인을 받았다.
테스트 화합물
테스트 화합물 덱스트란 설페이트(Tikomed AB, Sweden, WO 2016/076780)은 6 mg/ml의 농도로 제공되었다. 멸균 식염수(Aqupharm에서 구입)를 사용하여 이 화합물을 작업 농도(0.6mg/ml)로 희석시켰다.
CNV 유도
75 mg/kg 케타민 및 7.5 mg/kg 자일라진의 복강 내 주사로 마우스를 마취시켰다. 동공을 1% 아트로핀 및 2.5% 페닐에프린으로 확장시켰다(Bausch & Lomb). CNV를 유도하기 위해, Bruch 막 맥락막의 파열은 100 ㎛의 스팟 크디, 250 mW 전력 및 100 msec 지속 시간으로 HGM Elite 532 Green Laser(Litechnica Ltd, 영국 미들젝스 소재)를 사용한 레이저 광응고에 의해 달성되었다. 레이저 스폿은 망막 혈관과 광학 디스크로부터 2 내지 3개의 디스크-직경으로부터 떨어져 위치되었다. 레이저 적용 부위에 기포가 형성되면 Bruch 막이 성공적으로 파열되었음을 나타낸다. 이 연구에는 기포가 생성된 레이저 번(burn)만 포함되었다. 또한, CNV 유도 동안 심한 망막하 출혈을 나타내는 레이저 번은 연구에서 제외되었다. 3개의 레이저 번이 각 망막에 적용되었다.
약물 투여
CNV 유도 직후, 모든 마우스에 500μl의 덱스트란 설페이트 또는 염수를 피하 주사하였다. 레이저-CNV 유도 후, 9일 동안 매일 1회 주사를 반복하였다. 자세한 처리 방법은 표 3에 나와 있다.
Figure pct00005
형광 혈관촬영
CNV 유도-후 10 일 시점에, 각 군으로부터 3 마리의 마우스를 안저 플루오레세인 혈관촬영을 위해 무작위로 선택하였다. 75 mg/kg 케타민 및 7.5 mg/kg 자일라진의 복강 내 주사로 마우스를 마취시켰다. 동공을 1% 아트로핀 및 2.5% 페닐에프린으로 확장시켰다. 100μl의 1% 플루오레세인 나트륨을 복강 내 주사하였다. 안저 영상운 Micron IV 망막 이미징 현미경(Phoenix Research Labs)을 사용하여 캡처했다. 플루오레세인 혈관촬영 후 마우스를 희생시키고, 눈을 수집하였다.
샘플 수집
CNV 유도-후 10 일 시점에, 모든 마우스를 희생시키고, 눈을 조심스럽게 제거하였다. 모든 눈을 2% 파라폼알데하이드/PBS(Sigma-Aldrich, 영국 도싯 소재)에서 2시간 동안 실온에서 고정시킨 다음, 세척하고 4℃에서 PBS에 저장하였다. RPE-맥락막-공막 홀마운트(wholemount)는 기술된 프로토콜[2, 3]을 이용하여 준비하였다. 간략하게, 각막, 섬 모체, 홍채 및 수정체를 포함한 눈의 전방 세그먼트가 제거되었다. 아이 컵(eye cup)을 5 번 수직으로 자른 후, 망막 조직을 조심스럽게 제거했다. 결막 및 안구 근육을 포함한 여분의 안구 조직은 아이 컵(RPE/맥락막/공막을 함유)에서 조심스럽게 제거되었다. RPE/맥락막/공막 홀마운트는 그리포니아 심플리씨폴리아(Griffonia simplicifolia) 렉틴 I-아이소렉틴 B4 및 콜라겐 IV 면역착색을 위하여 추가 처리되었다.
RPE/맥락막/공막 홀마운트의 면역착색
잘 형성된 아이소렉틴 B4 및 콜라겐 IV 라벨링 기술을 사용하여 CNV를 탐지하였다. 아이소렉틴 B4는 침윤성 대식세포 및 혈관 내피 세포 둘 다를 라벨한다. 콜라겐 IV는 혈관의 기저판을 라벨한다. 두 마커 모두 CNV를 탐지하는 데 널리 사용되었다.
RPE/맥락막/공막 홀마운트를 0.5% 트리톤 X-100/PBS로 1시간 동안 실온에서 투과시켰다. 이어서, 샘플을 1시간 동안 0.5% 트리톤 X-100/PBS 중의 10% BSA로 차단하였고, 비오티닐화된 그리포니아 심플리씨폴리아(Griffonia simplicifolia) 렉틴 I-아이소렉틴 B4(GSL 이소 렉틴 B4, 1:50, Vector Laboratories Ltd, 영국 소재) 및 콜라겐 IV(1:50, BIO-RAD, 영국 소재))와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. PBS(10분×3)에서 철저하게 세척한 후, 샘플을 스트렙타비딘-플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC)(1:100, Vector laboratories, 영국 소재) 및 염소 항 토끼 AF594(1:100, Invitrogen, 영국 소재)와 함께 2시간 동안 배양하였다. 샘플을 Vectashield Mounting Medium(Vector Laboratories Ltd, 영국 소재)로 유리 슬라이드 상에 편평-장착하고, 형광 현미경에 의해 관찰하였다.
이미지 획득 및 분석
Lecia 형광 현미경을 사용하여, 상기 제조된 RPE-맥락막/공막 홀마운트 샘플로부터 이미지를 획득하였다. CNV의 전체 영역을 캡처할 수 있도록 10×대물 렌즈를 사용했다. 이미징 소프트웨어 ImageJ를 사용하여 영상을 분석하였다. CNV의 크기를 측정하기 위해, CNV의 경계를 수동으로 윤곽을 짓고, Image J 소프트웨어를 사용하여 크기는 자동으로 산출하였다.
통계 분석
모든 데이터(각 그룹에서 CNV의 크기)는 평균 ± SEM으로 표현되었다. 스튜던트 t 테스트를 사용하여 덱스트란 설페이트 그룹과 염수 대조군의 차이를 비교하였다.
연구 기획
이 연구에서는 24 마리의 C57BL/6J 마우스(10 내지 12 주령)를 사용했다. 마우스를 두 그룹으로 무작위 배정하였다(그룹당 12 마리 마우스)
· 그룹 1: CNV 유도 후 9일 동안 매일 하루 한번, 덱스트란 설페이트 치료(염수내 0.6 mg/ml의 덱스트란 설페이트 500 μl ), 피하내 주사,
· 그룹 2: 비히클 치료(500 μl 염수), 피하내 주사, CNV 유도 후 9일 동안 매일 하루 한번.
CNV 유도 후 10 일차에, 각 그룹으로부터 3 마리의 마우스를 안저 플루오레세인 혈관촬영을 위해 무작위로 선택하였다. CNV 유도 후 10 일에 모든 마우스를 희생시켰다. 면역 조직 화학 조사를 위해 눈을 수집하고 처리하였다.
실시예 3 - Schwann 세포에서 덱스트란 설페이트로 유도된 유전자 발현의 변화 분석
결과
Schwann 세포의 발현 분석
Schwann 세포에서 발현되지 않은 유전자는 데이터 분석 전에 제거되었다. log2 변환된 발현 값에 대해 '발현 아래' 레벨이 5로 설정되었다. 이것은 Schwann 세포 배양에서 분석할 15,842개의 독특한 프로브를 남겼다. 분석의 다음 단계에서, 세포에서 CM의 효과 및 덱스트란 설페이트에 의해 유도된 상대적인 변화를 확립하기 위해, 3 세트의 데이터(D0 대조군과 D2 대조군 샘플의 비교; D0 대조군과 D2 덱스트란 설페이트 처리된 샘플의 비교; D2 대조군과 D2 덱스트란 설페이트 처리된 샘플의 비교)는 분석하였다.
585개의 유전자는 D0 대조군과 D2 대조군 샘플을 비교할 때, Schwann 세포 배양에서 차등적으로 발현되었다. 이들 유전자에 의해 영향을 받은 분자 기능은 세포 운동(1.14E-07-2.49E-03); 세포 형태학(5.56E-07-2.36E-03); 세포 발달(7.3E-06-2.48E-03); 세포 성장 및 증식(7.3E-06-2.48E-03); 세포 어셈블리 및 조직화(1.23E-05-2.36E-03); 세포 기능 및 유지(1.23E-05-2.47E-03); 세포 사멸 및 생존(1.53E-05-2.51E-03); 지질 대사(8.14E-05-1.6E-03); 소분자 생화학(8.14E-05-1.6E-03); 분자 운반(1.18E-04-2.29E-03); 단백질 밀매(trafficking)(1.62E-04-1.6E-03); 탄수화물 대사(3.22E-04-1.78E-03); 유전자 발현(3.98E-04-2.2E-03); 세포 신호생성(4.39E-04-2.25E-03); 세포-세포 간 신호생성 및 상호작용(5.05E-04-2.48E-03); 세포 절충(7.69E-04-1.58E-03); 세포 주기(1.12E-03-1.8E-03); 아미노산 대사(1.6E-03-1.6E-03); 및 핵산 대사(1.6E-03-1.6E-03)에 관계한다.
상기 제시된 값은 이들 유전자와 상이한 경로와의 연관성의 통계적 유의성을 나타내는 p-값이다. 2개의 p 값은 관찰된 통계적 유의성의 하한 및 상한을 나타낸다(p < 0.05는 유의적임).
덱스트란 설페이트는 D0 대조군을 D2 덱스트란 설페이트 처리된 샘플과 비교할 때, 평가된 바와 같이 1244개의 유전자의 Schwann 세포 배양에서 차등 발현을 유도하였다. 이들 유전자에 의해 영향을 받은 분자 기능은 세포 형태학(1.43E-08-8.39E-04); 세포 운동(1.4E-07-9.6E-04); 해독-후 변형(3.93E-07-6.71E-05); 단백질 합성(3.93E-07-1.08E-04); 단백질 밀매(3.93E-07-1.26E-06); 세포 사멸 및 생존(2.13E-06-8.65E-04); 세포 어셈블리와 조직화(7.46E-06-8.24E-04); DNA 복제, 재조합 및 복구(7.46E-06-7.46E-06); 세포 기능 및 유지(9.53E-06-6.46E-04); 유전자 발현(1.27E-05-4.92E-04); 세포 발달(1.29E-05-9.06E-04); 세포 성장 및 증식(1.29E-05-9.06E-04); 세포-세포 간 신호생성 및 상호작용(1.97E-05-8.81E-04); 아미노산 대사(4.22E-05-8.24E-04); 소분자 생화학(4.22E-05-8.24E-04); 지질 대사(4.81E-05-3.64E-04); 분자 운반(3.64E-04-3.64E-04); 그리고 세포 주기(4.53E-04-4.86E-04)와 관련된다.
덱스트란 설페이트는 D2 대조군을 D2 덱스트란 설페이트 처리된 샘플과 비교할 때, 평가된 바와 같이 700개의 유전자의 Schwann 세포 배양에서 차등 발현을 유도하였다. 이들 유전자에 의해 영향을 받는 분자 기능은 세포 형태학(1.49E-07-5.62E-03); 세포 어셈블리 및 조직화(1.49E-07-5.95E-03); 세포 운동(7.24E-07-6.06E-03); 세포 사멸 및 생존(9.41E-06-5.95E-03); 아미노산 대사(2.56E-05-3.7E-03); 해독-후 변형(2.56E-05-1.05E-03); 소분자 생화학(2.56E-05-3.7E-03); 세포-세포간 신호생성 및 상호작용(5.05E-05-5.76E-03); 유전자 발현(7.18E-05-4.94E-03); 세포 주기(1.06E-04-5.95E-03); 세포 발달(1.06E-04-5.95E-03); 세포 기능 및 유지(1.96E-04-5.95E-03); 세포 성장 및 증식(2.35E-04-5.95E-03); DNA 복제, 재조합 및 복구(2.75E-04-5.95E-03); 세포 신호생성(5.92E-04-2.54E-03); 세포 절충(6.26E-04-6.26E-04); 지질 대사(6.26E-04-1.85E-03); 분자 운반(6.26E-04-5.95E-03); 단백질 합성(1.05E-03-1.93E-03); 치료제에 대한 세포 반응(1.85E-03-1.85E-03); 단백질 밀매(2.66E-03-5.95E-03); 그리고 RNA 해독-후 변형(4.32E-03-4.32E-03)에 관계한다.
기계적 분자 네트워크 모델은 이러한 변화의 기능적 결과를 평가할 수 있게 하는 덱스트란 설페이트에 의해 차등적으로 조절된 분자의 효과를 시뮬레이션한다. 가상(in silico) 모델에서 덱스트란 설페이트는 신경 세포 사멸; 자가사멸; 그리고 단백질의 합성을 억제하고, 혈관신생; 세포 이동; 세포 생존능력; 세포 생존; 세포 운동; 세포의 증식; 세포의 분화; 세포 항상성(homeostasis); 세포 주기 진행; 세포 형질전환; 그리고 RNA의 발현을 활성화시킨다.
표 4는 배양된 Schwann 세포에서 유전자 발현 변화의 결과를 요약한 것이다.
Figure pct00006
이틀 동안 대조군 배양에서 발현이 변경된 21개의 유전자는 동일한 이틀 동안 덱스트란 설페이트 처리된 배양에서 전혀 변화를 나타내지 않았다. 대조군 배양에서 발현이 증가된 1개의 유전자는 동일한 2일 동안 덱스트란 설페이트 처리된 배양에서 하향 조절되었다. 대조군 배양 물에서 하향 조절된 13개의 유전자는 이틀 동안 덱스트란 설페이트 처리된 배양 물에서 상향 조절되었다. 122개의 유전자는 배양 배지에서 성장 인자에 의해 상당히 하향 조절되었고, 이러한 하향 조절은 덱스트란 설페이트 처리된 배양에서 더욱 강했다. 대조군 배양물에서 441개의 유전자가 상향 조절되었고, 덱스트란 설페이트의 첨가는 이러한 상향 조절을 상당히 강하게 만들었다.
세포 흡착에서 덱스트란 설페이트의 효과
덱스트란 설페이트의 현저한 표현형 효과 중 하나는 세포 부착에 대한 영향이었다.
유전자 발현의 분석에서 이것이 메탈로펩티다제(매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)로도 지칭됨)를 포함하는 세포 흡착을 조절하는 효소의 발현에 대한 덱스트란 설페이트의 효과에 기인한다는 것을 나타낸다, 표 5 참조.
Schwann 세포(17개 분자, 표 5 참조)에서의 세포 운동 및 부착을 조절하는 경로에 대한 이들 분자의 집합 효과는 세포 이동이 활성화되는 동안 세포 부착이 억제되도록 하는 것이었다.
Figure pct00007
이 발견은 세포 흡착 및 부착 관련 분자에 영향을 미치는 모든 분자 상호 작용의 재평가 및 Schwann 세포에서의 세포 부착에 대한 그들의 영향의 재평가를 얻었다. 217개의 부착-관련 분자(197개의 유전자 및 20개의 약물)의 전체 목록은 다음과 같다:
ACE2, ACP1, ADAM15, ADGRB1, ADGRE2, ADIPOQ, AG490, AMBN, ANGPT1, ANTXR1, ARAP3, ARMS2, 바티마스타트(batimastat), BCAM, BCAP31, BCAR1, 벤질옥시카르보닐-Leu-Leu-Leu-알데하이드, BMP2, BMP4, BTC, C1QBP, Ca2+, CA9, CADM1, CALR, 칼리쿨린 A, 카스파제(caspase), CBL, CD209, CD36, CD44, CD46, CDH13, 세리바스타틴(cerivastatin), 클로람페니콜, 콘드로이틴 설페이트, CLEC4M, 콜치신(colchicine), 콜라겐 유형 I, 콜라겐(들), COMP, CRK, CRP, CSF1, CSF2RB, CTGF, 쿠르쿠민(curcumin), CXCL12, 환형 AMP, DAB2, DAG1, DCN, DDR1, 데스페리엑소켈린(desferriexochelin) 772SM, DOCK2, DSG2, DSG4, 두라파티테(durapatite), Efna, EFNA1, EFNB, EFNB1, EGF, EGFR, EGR1, ELN, ENG, EP300, Eph 수용체, EPHA8, EPHB1, 에피티피바티드(eptifibatide), 에틸렌디아민테트라아세트산, ETS1, F11R, F3, FBLN5, FBN1, Fc 수용체, FCN2, FERMT2, FES, FGF2, FGFR1, 피브린(Fibrin), FN1, 초점의 흡착 키나제, FSH, FUT3, FUT6, FUT7, FYN, HACD1, 헤파린, 히스톤 h3, 히스톤 h4, HRAS, HSPG2, HTN1, 히알루론산, 히드로코르티손, 과산화수소, ICAM1, ICAM2, IGF1R, IgG, Igg3, IL1, IL1B, IL6, ILK, 인테그린, 인테그린 알파 4 베타 1, 인테그린α, IPO9, ITGA1, ITGA2, ITGA3, ITGA5, ITGA6, ITGB1, ITGB2, ITGB3, ITGB5, JAK2, Jnk, KP-SD-1, LAMC1, 라미닌, 라미닌1, 레보티록신(levothyroxine), LGALS3, LIF, 리포폴리사아카리드, LOX, LRP1, LRPAP1, MAD1L1, 만노즈, MAPK7, MBL2, MERTK, 메트로니다졸, MGAT5, MMP2, Mn2+, NCK, NEDD9, NRG1, 오카디아산, OLR1, P38 MAPK, PDGF BB, 포스파티딜이노시톨, PKM, 혈소판 활성화 인자, PLD1, PLG, PMP22, PODXL, POSTN, PRKCD, PTAFR, PTEN, PTGER2, PTK2, PTK2B, PTN, PTPN11, PTPRZ1, 피롤리돈 디티오카르바메이트, Rac, RALB, RANBP9, RHOA, RHOB, RPSA, SDC3, SELE, 셀렉틴, SELL, SEMA3A, 심바스타틴, SIRPA, SPARC, 스핑고신-1-포스페이트, SPI1, SPP1, SPRY2, SRC, STARD13, SWAP70, TEK, TFPI, TFPI2, TGFA, TGFB1, TGFBI, TGM2, THBS2, THY1, 갑상선 호르몬, TIMP2, 티로피반, TLN1, TLN2, TNF, TP63, 트레티노인(tretinoin), VAV1, VCAM1, VCAN, Vegf, VHL, VTN, VWF 및 WRR-086.
세포 부착을 조절하는 197개의 유전자 중에서, 17개의 분자가 Schwann 세포 배양에서 차등적으로 발현되어, 전체적으로 약간 증가된 부착을 초래하였다.
이 결과는 조직 섬유증의 신호 및 면역 세포의 흡착을 감소시킴으로써, 덱스트란 설페이트(실시예 1 참조)의 항-반흔 효과와 관련이 있다.
덱스트란 설페이트에 의해 영향을 받은 상류 조절 경로
Schwann 세포에서, 상류 조절기 분석은 덱스트란 설페이트가 표 6에 나타낸 바와 같이, 이 시스템에서 활성화를 증가시키거나 또는 시스템에서 억제를 감소시킴으로써, 몇몇 성장 인자의 효과를 조절한다는 것을 밝혀냈다.
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
덱스트란 설페이트는 데코린(decorin) 유전자를 상형조절한다
흥미롭게도, 유전자 발현 데이터는 덱스트란 설페이트가 데코 린이라고 불리는 천연 반흔 감소 분자의 생성을 활성화 시켰음을 보여주었고, 이는 섬유아세포에 의한 반흔 생성을 자극하는 성장 인자를 '해치움으로써(mopping up)', 반흔 생성을 더 차단한다.
데코린은 평균 90-140 kD 분자량의 당단백질이다. 이것은 작은-류신 풍부 프로테오글리칸(SLRP) 패밀리에 속하고, 콘드로이틴 설페이트 또는 더마탄 설페이트로 구성된 글루코사미노글리칸(GAG) 사슬을 갖는 류신 반복체를 함유하는 단백질 코어로 구성된다. 이것은 데코린 유형 I 콜라겐 결합 영역을 통해 유형 I 콜라겐 소 섬유에 결합한다.
데코린은 형질전환 성장 인자 베타 1/2(TGF-β1/2) 길항제로 작용하여, 반흔을 감소시킨다. 보고에 따르면, 급성 반흔에서 데코린의 우세한 효과는 TGF-β1/2의 중화에 의한 염증성 섬유증의 억제를 통한 항-섬유화인 것으로 나타났다. 데코린은 또한 콜라겐에 직접 결합하며, 그 기능 중 하나는 상처 치유 동안 콜라겐 조직에 영향을 미치는 것이다.
데코린은 뇌 병변, 수두증(hydrocephalus) 및 만성 척수 상처 모델에서 흉터를 억제하는 것으로 이미 설명되었다. 데코린은 또한 녹내장 모델에서 기존의 섬유주대 반흔의 섬유화를 유도한다.
덱스트란 설페이트는 1.242의 배수 변화로 데코린 발현의 증가를 유도하였다.
결론
Schwann 세포에서, 높은 영양분 함량과 포도당을 갖는 대조 배양물은 Schwann 세포의 활성화를 재현한다. 덱스트란 설페이트 처리된 배양물은 24시간의 아교세포 활성화 후, 첨가된 덱스트란 설페이트의 효과를 모방하였다.
Schwann 세포에서 나타나는 분자 효과는 자가사멸로부터 보호; 세포의 이동 및 운동 증가; 세포의 생존력 및 생존의 증가; 그리고 세포 분화의 유도에 있어서 덱스트란 설페이트의 역할을 뒷받침하는 결과로부터 명백하다.
덱스트란 설페이트는 Schwann 세포에서 세포 탈착 및 운동을 촉진시켰다. 세포 흡착에 대한 영향은 주로 메탈로프로테나제-유형 효소의 발현에 기인한 것이지만, 그러나 다른 흡착 분자의 조절 또한 이 효과에 기여했다.
이 발견은 또한 실시예 1에 나타낸 바와 같이, 덱스트란 설페이트의 항-반흔 효과를 설명할 것이다. 이 결과는 실시예 1에서 나타난 항-반흔 효과는 조직 재형성을 돕고, 손상된 조직에서 섬유성(반흔) 신호를 차단하는 덱스트란 설페이트 활성화 분해 효소에 의해 매개됨을 시사한다.
병리학적 반응으로 인한 반흔은 TGF-β에 의해 유발된다. TGF-β는 면역 세포의 흡착, 세포의 활성화, 세포 운동, 세포의 응집, 섬유증 및 TGF-β의 유도를 유발하는 171개 분자의 큰 상호 연결된 네트워크를 유도한다. 덱스트란 설페이트의 투여는 면역 세포의 접착, 세포의 활성화, 세포의 응집, 섬유증 및 TGF-β의 자가-활성화에서 TGF-β-유도된 효과를 완전히 폐지하였다. Schwann 세포에서 TGF-β에 의해 구동되는 분자 네트워크에 대한 덱스트란 설페이트의 이러한 불활성화 효과는 TGF-β가 활성화된 경우, 심지어 과도한 TGF-β의 존재 하에서도 나타난다.
덱스트란 설페이트에 의해 조절된 유전자의 상류 조절인자의 분석에서 덱스트란 설페이트가 헤파린의 효과와 유사한, 세포에 대한 기존 성장 인자의 효과를 향상시켰음이 드러났다. 가설은 덱스트란 설페이트가 성장 인자 분자에 결합하고, 그들의 수용체에 대한 결합을 촉진한다는 것이다.
덱스트란 설페이트의 항-반흔 작용은 녹내장을 비롯한, 섬유증식성(반흔 형성) 상태를 치료하기 위한 잠재적 용도를 나타낸다. 실험 결과는 섬유증식성(반흔) 상태의 발달을 예방하고, 그러한 섬유증식성(반흔) 상태에서 이미 형성된 섬유성 반흔을 분해하는 데있어서 덱스트란 설페이트의 역할을 뒷받침한다.
따라서, 항-반흔 효과를 갖는 덱스트란 설페이트는 조직 리모델링에 효과적일 수 있으며, 여기서 이미 형성된 반흔을 분해시킬 필요가 있다. 이러한 덱스트란 설페이트의 항-반흔 효과는 예를 들면, 세포 흡착의 억제, 세포 이동의 유도, 메탈로프로테아제 및 반흔 분해 효소의 유도, 그리고 데코린의 유도를 통한 TGF-β, 특히 TGF-β1의 억제를 비롯한, 덱스트란 설페이트의 이미 설명된 기전의 결과로 간주된다. 덱스트란 설페이트로 수득된 이 후자의 효과는 데코린의 유도를 통한 섬유증 및 반흔 형성을 예방하거나 또는 최소한 억제하는 것과 관련있다.
재료 및 방법
실험 기획
n=8×25 cm2 배양 플라스크를 설치한다. 처리 당일(씨딩 후 24시간) 2개의 플라스크를 수거하였다. 이는 0일차 시점을 나타낸다. 나머지 플라스크로부터, 3개의 플라스크를 대조군 배지로 처리하고, 3개의 플라스크를 덱스트란 설페이트를 함유하는 배양 배지(CM)로 처리하여 0.01 mg/ml의 최종 농도를 수득하였다. 처리된 플라스크로부터의 세포를 48시간 후에 수집하였다. 따라서, 수집된 데이터는 (a) 미처리 세포(0일차 대조군 및 2일차 대조군) 및 (b) 48시간 동안 덱스트란 설페이트로 처리된 세포(2일차 덱스트란 설페이트 처리)를 나타낸다.
모든 세포용 조직 배양 플레이트 코팅
Hank 균형잡힌 염 용액(HBSS)에 50 μg/ml 폴리-d-리신 용액을 플라스크 당 2 ml를 첨가하고, 37℃에서 밤새 배양함으로써 25 cm2 플라스크를 코팅하였다. 플라스크를 세포 배양 수로 세척하고, 어둠 속에서 30분 동안 공기-건조시켰다. 포스페이트 완충된 염수(PBS)에 25 μg/ml 라미닌 용액을 플라스크 당 1 ml를 첨가하고, 어두운 곳에서 37℃에서 2시간 동안 배양함으로써 플라스크를 코팅하였다. 상기 라미닌 플라스크를 세포로 도말하기 전, PBS로 3 회 세척하였다.
인간 Schwann 세포
10%의 태아 소 혈청(FBS)을 고-포도당 DMEM에 첨가하고, 37℃로 예열함으로써, Schwann 세포 성장 배지를 제조하였다. 세포를 37℃ 수조에서 2 분을 넘기지 않도록 해동시켰다.
12개의 바이알로부터 세포를 각각 10ml의 고-포도당 DMEM 배지를 함유하는 튜브로 부드럽게 옮기고, 400 상대적 원심 필드(RCF)에서 10분 동안 원심분리하였다. 펠릿을 배양 배지에 재현탁시켰다. 12개의 바이알로부터의 세포를 혼합하고, 이전에 코팅된 25 cm2 플라스크(n = 8)에 균등하게 분배하였다. 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 배양하였다. 덱스트란 설페이트 처리 전, 세포를 24시간 동안 침강시켰다.
약물 처리
덱스트란 설페이트(Tikomed AB, 스웨덴 소재, WO 2016/076780)를 20 mg/ml 의 원액 농도로 제공하고, 4℃에서 온도 모니터링된 냉장고에 보관하였다. 새로운 100X 덱스트란 설페이트 원액(1.0 mg/ml)은 멸균 DMEM-F12에서 준비하였다. 농축된 약물 원액을 멸균 여과하고, 각각의 배양 배지에 첨가하였다(19.6 ml CM 및 0.4 ml 덱스트란 설페이트 원액 용액). 대조군은 19.6 ml CM 및 0.4 ml의 DMEM-F12를 이용하여 만들었다. 덱스트란 설페이트 및 CM은 각 플라스크(각 5 ml)에 각 접시에서 덱스트란 설페이트 농도가 0.01 mg/ml이 되도록 추가하였고, 각 접시는 총 10 ml CM을 갖게 된다.
배양물 수거 및 세포 용해
CM을 깨끗하고 라벨링된 15 ml 팔콘 튜브에 흡입시켰다. 플라스크(배양 배지없이)를 -80℃ 냉동고에 30분 동안 두었다. 팔콘 튜브의 CM을 3000×g에서 5분 동안 회전시켰다. 상청액을 제거하고, 작은 펠릿을 실온(RT, 대략 22℃)에서 2.5 ml 트리졸:물(4:1) 용액에 재-현탁시켰다.
냉동 플라스크를 냉동고에서 하나씩 빼내어, 적절한 튜브로부터 트리졸-물을 이 플라스크로 옮겼다. 플라스크를 실온에서 5분 동안 방치한 후, 내용물을 15 ml 팔콘 튜브 내로 다시 흡입시켰다(플라스크의 바닥을 용액으로 완전히 세척한 후). 세포의 완전한 제거를 확인하기 위하여, 플라스크를 현미경으로 검사하였다. 15 ml 팔콘 튜브에서 수집된 용 해물을 -80℃ 냉동고에 넣었다.
RNA 추출
균질물(homogenate)을 함유하는 팔콘 튜브를 냉동고에서 빼내고, 핵 단백질 복합체가 완전하게 해리되도록 실온에서 5분 동안 보관하였다.
1ml 용해물 2분액을 각각의 샘플에서 빼내하고, 200 μl의 클로로포름을 각각에 첨가하고(세포 용해 단계 동안 사용된 1ml의 트리졸 시약 당 클로로포름 0.2ml), 튜브를 격렬하게 흔들었다. 샘플을 실온에서 2 내지 3분 동안 보관한 후, 4℃에서 15분 동안 12,000×g에서 원심분리하였다.
이 혼합물은 3개의 층, 즉 하부 적색 페놀-클로로포름 상, 중간상 그리고 무색의 상부 수성 상으로 분리되었다. RNA는 상부 수성 상에, DNA는 백색 중간(간기) 상에, 그리고 단백질은 분홍색 하부(유기) 상에 남아있었다. 수성상의 상부
Figure pct00011
을 새로운 깨끗한 에펜도르프 튜브로 옮겼다.
동일한 양의 100% 에탄올을 첨가하여. RNA를 수성상으로부터 침전시켰다. 침전된 RNA를 Spin Cartridge에 고정시키고, 2 회 세척하고, 그리고 건조시켰다. RNA를 50 μl 따뜻한 RNase-없는 물에서 용리시켰다. 정제된 RNA의 양 및 품질은 Nanodrop에 의해 측정되었다. 어레이 분석을 위해 Source Bioscience로 이전하기 전, RNA를 -80℃에 보관하였다.
발현 데이터 분석 계획
발현 데이터를 각 세포주에 대해 별도의 파일로 다운로드하였다. '수정된 백그라운드(Background corrected)'란 표현은 어레이(array)의 "gProcessedSignal" 데이터로써, 이는 관련 프로브의 실제 신호에서 추출된 배경 신호의 결과이다. 이것은 어레이 분석에서 가장 자주 사용되는 변수이다. 통계적 분석용 백그라운드 보정 신호를 모든 샘플에 대해 log2 변환시켰다. 샘플에서 잘못된 발견 속도를 줄이기 위해, '발현 수준'아래의 신호는 제거되었다. log2 변환된 발현 값에 대해 '발현 아래' 레벨이 5로 설정되었다.
통계 분석
각 어레이에서 대조군 프로브의 발현 패턴을 기반으로 결과의 변동성을 줄이기 위해, 분석 전에 모든 어레이에 대해 중앙값 센터링(Median Centering)을 수행하기로 결정했다. 데이터는 다음 알고리즘을 사용하여 분석되었다:
· D0 대조군과 D2 대조군 샘플의 비교 - 정상 배양에서 세포에서 나타나는 발현 변화
· D0 대조군과 D2 덱스트란 설페이트 처리군 샘플 비교 - 덱스트란 설페이트 처리된 배양에서 세포에서 나타나는 발현 변화
· D2 대조군과 D2 덱스트란 설페이트 처리군 샘플 비교 - 배양에서 덱스트란 설페이트에 의해 유도된 차등 발현
3개의 데이터 세트의 임의의 조합 사이에서 차별적으로 발현되지 않은 유전자를 스크리닝하기 위해, 예비 분석을 수행하였다. 발현 패턴을 찾기 위해, 단순한 비-엄격성 ANOVA(p < 0.05)를 수행하였다. 세 가지 데이터 세트에서 변경이 없는 프로브는 제거되었다. 남은 프로브 세트는 Volcano 플롯을 사용하여, 배수 변화 및 중요성에 대해 분석되었다. 프로브의 발현에서 20% 이상의 변화(FC ≥ 1.2 또는 FC ≤ 0.84)는 발현 패턴의 검출을 허용하기 위해, 첫 번째 경우에 중요한 것으로 간주되었다.
품질 매개변수
씨딩 밀도는 Schwann 세포에 대한 세포 원료로부터 검색된 세포 카운트로부터 계산되었다.
Array 서비스 제공 업체의 추가 품질 관리 결과에서 RNA는 고품질이며(분해되지 않음), 그 양은 Agilent의 Low input RNA 마이크로어레이의 매개 변수 내에 있었다.
원시(raw) 데이터의 분석에 따르면, 예상대로 어레이간에 유의적인 차이가 있었다. 그러나, 이러한 차이(모든 어레이에 포함된 동일한 대조군 샘플에서의 차이에 의해 반영됨)는 정규화 기술에 의해 쉽게 제거되었다. 어레이-어레이 변이를 제거하는 데이터의 선택된 중앙 센터링은 상이한 농도의 RNA를 나타내는 대조군 사이에서 예상되는 전체적인 차이에 영향을 미치지 않았다.
위에서 설명된 실시예들은 본 발명의 몇 가지 예시적인 예로서 이해되어야 한다. 당업자라면 본 발명의 범위를 벗어나지 않고, 실시형태에 다양한 수정, 조합 및 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 특히, 상이한 실시형태에서의 상이한 부분 용액은 기술적으로 가능한 다른 구성으로 결합될 수 있다. 그러나, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해 특정된다.
참고자료
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Claims (23)

  1. 녹내장의 치료, 억제 또는 예방에 사용하기 위한, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체에서 개방각 녹내장(open-angle glaucoma)의 치료, 억제 또는 예방에 사용하기 위한, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 대상체에서 일차 개방각 녹내장의 치료, 억제 또는 예방에 사용하기 위한, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  4. 녹내장을 앓고 있는 대상체의 안압을 감소시키는데 사용하기 위한, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  5. 청구항 4에 있어서, 안압을 10 mmHg 최대 20 mmHg 범위의 정상 안압 내로 감소시키는데 사용하기 위한, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  6. 대상체의 고안압증을 치료, 억제 또는 예방에 사용하기 위한, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 대상체는 녹내장으로 인한 고안압증을 앓고 있는, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  8. 녹내장, 바람직하게는 개방각 녹내장, 및/또는 고안압증을 앓고 있는 대상체에서 망막 신경절 세포의 상실 및 망막 신경 섬유층의 감소를 억제하는데 사용하기 위한, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  9. 청구항 4 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 개방각 녹내장을 앓고 있는, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 대상체는 일차 개방각 녹내장을 앓고 있는, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 상기 대상체에게 전신 투여용으로 제형화되는, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 상기 대상체에게 정맥내 또는 피하내 투여용으로 제형화되며, 바람직하게는 상기 대상체에게 피하내 투여용으로 제형화되는, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 10,000 Da 이하의 평균 분자량을 갖는, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  14. 청구항 16에 있어서, 상기 평균 분자량은 2 000 내지 10,000 Da의 범위 내, 바람직하게는 3 000 내지 10,000 Da의 범위 내, 그리고 더 바람직하게는 3 500 내지 9 500 Da의 범위 내인, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 평균 분자량은 4 500 내지 7 500 Da의 범위 내, 바람직하게는 4 500 내지 5 500 Da의 범위 내인, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 15 내지 20% 범위의 평균 황 함량을 갖는, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 약 17%의 평균 황 함량을 갖는, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  18. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 핵 자기 공명(NMR) 분광법으로 측정하였을 때, 1850 내지 3500 Da의 간격, 바람직하게는 1850 내지 2500 Da의 간격, 그리고 더 바람직하게는 1850 내지 2300 Da 간격내 수 평균 분자량(Mn)을 갖는, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은, NMR 분광법에 의해 측정하였을 때, 1850 내지 2000 Da의 간격 내 Mn을 갖는, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  20. 청구항 18 또는 19에 있어서, 상기 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 포도당 단위당 2.5 내지 3.0의 간격, 바람직하게는 2.5 내지 2.8 간격, 그리고 더 바람직하게는 2.6 내지 2.7 간격의 평균 설페이트 수를 갖는, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  21. 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 평균 5.1 포도당 단위와, 포도당 단위당 2.6 내지 2.7의 평균 설페이트 수를 갖는, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  22. 청구항 1 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 수성 주사 용액으로 제형화되는, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  23. 청구항 1 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 염은 덱스트란 설페이트의 나트륨염인, 덱스트란 설페이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
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