KR20200004980A - Ｂｒｃａ 유전자 변이를 검출하기 위한 프로브와 제조 및 검출 방법 - Google Patents

Ｂｒｃａ 유전자 변이를 검출하기 위한 프로브와 제조 및 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 BRCA 유전자 변이를 검출하기 위한 프로브와 제조 및 검출 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, NGS 기반 타겟 시퀀싱에 있어 적은 양의 DNA에서도 특정 영역을 효율적으로 캡쳐하고, 염기서열을 분석하는 방법을 제공함으로써 질환 또는 장애를 유발할 수 있는 유전자 변이를 정확하고 민감하며 높은 재현성으로 검출하는 효과가 있다.

Description

ＢＲＣＡ 유전자 변이를 검출하기 위한 프로브와 제조 및 검출 방법 {Probes for detecting BRCA gene mutations, method for producing the same and method for detecting breast cancer using thereof}
본 발명은 BRCA 유전자 변이를 검출하기 위한 프로브와 이들을 제조하는 방법 및 이를 이용한 유전자 변이 검출 방법 등에 관한 것이다.
수많은 질환 또는 장애가 유전자 변이와 밀접하게 연관되어 있음이 알려져 있다. 그러한 질환 또는 장애는 암, 전암 상태, 염증 질환, 면역 질환, 자가면역 질환 또는 장애, 심혈관 질환 또는 장애, 신경 질환 또는 장애, 감염 질환 또는 통증을 포함할 수 있다. 일례로, 암은 각 종양 별로 다양한 유전체 변이를 동반할 수 있으며, 암의 발생 및 진행에 유전자 변이가 큰 영향을 미칠 수 있다는 것에 대해 많은 연구가 보고되었다. 이에 따라 암을 비롯한 질환 또는 장애와 연관된 유전자 변이를 검출하는 방법은 큰 주목을 받고 있다. 이렇게 확인된 돌연변이 정보는 환자의 맞춤 항암제 선정에 많은 도움을 줄 수도 있다.
기존에 유전자 변이를 분석하기 위한 방법으로는 마이크로어레이(microarray)를 이용하여 유전자형을 확인하는 마이크로어레이 제노타이핑(genotyping) 방법이 많이 이용되었다. 마이크로어레이 또는 마이크로 칩(DNA chip)은 작은 슬라이드 칩 상에 수많은 합성 DNA 조각을 미세하게 집적시킨 것이다. 분석하고자 하는 환자의 검체의 DNA 조각을 형광으로 표지한 후 DNA 칩에 반응시키면 상보적인 서열로 이루어져 있는 올리고뉴클레이티드(프로브 역할)와 결합이 이루어지고, 이를 레이저 빛으로 스캔하여 분석한다. 마이크로어레이는 유전자의 돌연변이, 유전형 분석, 유전체 분석 등에서 활용되고 있으며, 보통, SNP(single nucleotide polymorphism), indel(insertion 또는 deletion), 재조합 (rearrangement) 등을 보는데 이용되고 있다. 하지만 이 방법은 미량 시료에 비특이적 혼성화가 일어나면 전체 신호(signal)에 변화를 가져오기 때문에 표적으로 하는 DNA가 아닌 다른 유사한 DNA와 혼성화가 이루어지는 교차 혼성화 (cross-hybridization)가 발생하였을 때 정확한 유전자 분석이 어려워진다. 또한 미세한 실험 조건이나 핸들링에 의해 야기될 수 있는 결과 차이로 인한 결과 해석의 모호함, 비교적 많은 DNA 양이 필요하다는 한계점이 존재한다.
또한 많이 사용되고 있는 유전자 검사 방법으로는 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하는 방법이 있다. 이는 보고자 하는 타겟 유전자 영역에 대하여 PCR을 통해 증폭하고, 증폭된 산물을 생어 시퀀싱(Sanger sequencing)으로 염기서열을 분석하여 변이를 검출하는 방법이다. 해당 방법은 염기서열을 분석하기 전에 보고자 하는 영역을 모두 증폭하는 과정을 포함하므로 적은 DNA 양으로도 분석이 가능하며 정확한 타겟 유전자를 분석할 수 있다는 이점이 존재하지만, 각 영역을 증폭하기 위한 프라이머 제작비용, 다소 높은 생어 시퀀싱 비용이 요구된다. 또한 편향 증폭 현상 (Amplification bias)로 인해 데이터 쏠림 현상이 발생할 수 있고 이는 단위 반복 변이 (Copy number variation)를 검출하는 것이 어려워지며, 넓은 타겟 영역을 분석하기에 효율적이지 못하였다.
이에 본 발명의 주 목적은 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 BRCA 1,2 유전자 변이를 검출하기 위한 프로브와 이들을 제조하는 방법 및 이를 이용한 유전자 변이 검출 방법을 제공하는데 있다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 연구를 계속하던 중, 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발하는 유전자를 중심으로 특정한 유전자를 선택하고, 해당 유전자를 구성하는 핵산(또는 그의 일부)을 프로브로서 사용함과 동시에 NGS 기반의 타겟 시퀀싱을 통해 적은 양의 DNA에서도 특정 영역을 효율적으로 캡쳐하고, 염기서열을 분석하는 방법을 제공함으로써 유전자 변이를 정확하고 민감하며 높은 재현성으로 검출 가능한 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 하기 (a), (b) 또는 (c)의 핵산 또는 그의 일부를 포함하는, 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출하기 위한 프로브를 제공한다:
(a) BRCA1 및 BRCA2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 구성하는 염기서열을 포함하는 핵산,
(b) 상기 (a)의 핵산에 대하여 상보적인 염기서열을 포함하는 핵산,
(c) 상기 (a)의 핵산, 또는 (b)의 핵산에 대하여 상보적인 염기서열을 포함하는 핵산과 혼성화하고 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출할 수 있는 핵산.
또한, 본 발명에서 상기 (a)의 핵산이 BRCA1 및 BRCA2의 각 유전자를 구성하는 염기서열을 포함하는 핵산일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 하기 (d), (e) 또는 (f)의 핵산을 포함하는, 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출하기 위한 프로브를 제공한다:
(d) 서열 번호 1 내지 111, 154 내지 366에 나타나는 염기서열 중 적어도 1종의 염기서열을 포함하는 핵산,
(e) 서열 번호 367 내지 385에 나타나는, 상기 (d)의 핵산에 대하여 상보적인 염기서열을 포함하는 핵산,
(f) 서열번호 112 내지 137, 138 내지 153에 나타나는, 상기 (d) 또는 (e)의 핵산의 염기서열에 대하여 70% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 포함하고, 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출할 수 있는 핵산.
또한, 본 발명에서 상기 (d)의 핵산이 서열 번호 1 내지 148, 190 내지 422에 나타나는 염기서열을 포함하는 핵산일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 하기 (i)의 핵산과 (ii)의 핵산으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는, 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출하기 위한 프로브를 제공한다:
(i) 서열번호 1 내지 148에 나타나는 염기서열을 포함하는 핵산,
(ii) 서열번호 190 내지 422에 나타나는 염기서열을 포함하는 핵산.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상술한 프로브를 제조하되, 상기 프로브는 단백질로 코딩되는 exon 부분의 DNA 시퀀스(coding sequence)를 포함하도록 시퀀스 디자인된 것인 프로브 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명에서 상기 프로브의 시퀀스 디자인은 타겟 영역의 모든 염기 및 타겟 영역 밖의 일부를 포함하도록 디자인되되, 2X 타일링 방법에 의한 디자인(2개 이상의 프로브가 60bp 정도씩 겹치도록 디자인을 지칭)과 타겟의 양 말단에서 시작하는 터미널 프로브의 추가 디자인을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 시퀀스는 GC fix 과정(G 또는 C가 4개 이상 연속될 때에 4번째 염기를 A 또는 T로 치환하여 프로브의 시퀀스를 조정한 것을 칭함)을 거쳐 조정된 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 프로브의 혼성화율(hybridization rate)을 측정하여 혼성화가 평균 혼성화율보다 낮은 부분에, 해당 프로브를 추가 삽입하여 재조정(re-balancing) 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서 상기 프로브의 혼성화율(hybridization rate)을 측정하여 혼성화가 평균 혼성화율보다 높은 부분에, 해당 프로브를 제외한 나머지 프로브를 추가 삽입하여 재조정(re-balancing) 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상술한 프로브를 포함하는, 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상술한 프로브와 시료 핵산을 접촉시켜, 상기 시료 핵산과 상기 프로브의 혼성화 산물을 얻는 단계; 상기 혼성화 산물 중의 상기 시료 핵산의 서열을 확인하는 단계; 및 상기 시료 핵산의 확인된 핵산 서열을 표준 핵산 서열과 비교하여 상기 시료 핵산의 변이를 확인하는 단계를 포함하는 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 상의 변이를 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명에서 상기 시료 핵산의 서열은 초병렬 시퀀싱에 의해 분석되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 초병렬 시퀀싱은 합성에 의한 시퀀싱, 이온 토렌트 시퀀싱, 파이로시퀀싱, 라이게이션에 의한 시퀀싱, 나노포어 시퀀싱, 및 단일-분자 실시간 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 따르면, 프로브와 유전자 간의 혼성화 방법을 이용한 NGS 기반의 타겟 시퀀싱 기술을 기반으로 하는 것으로, 기존의 마이크로어레이 방법이나 PCR 방법에 비해 많은 유전자의 보다 넓은 타겟 염기서열을 비교적 낮은 비용으로 정확하고 민감하며 높은 재현성으로 분석할 수 있다.
참고로, 기존 PCR 방법의 경우 유전적 변이를 확인하기 위해 먼저 타겟 유전자들을 개별적으로 증폭한 후 이를 각각 시퀀싱하므로 넓은 타겟 영역에 대하여 유전자 염기서열 분석을 하는 경우 비용과 생산성 면에서 효율성이 낮았다. 반면 본 발명의 프로브를 도입함으로써 타겟 유전자들의 개별적 증폭 과정 대신에 적은 양의 DNA로 염기서열 확인하고자 하는 부분을 타겟 영역의 길이에 구애받지 않고 동시 다발적으로, 정확하게 캡쳐하여 선별해내는 것이 가능하다.
또한, 마이크로어레이로 분석하는 경우에는 재현성 부족으로 인한 결과 해석의 모호함, 검출의 정확도가 높지 않다는 한계점이 있었다. 반면 본 발명에서 적용한 NGS는 유전자의 모든 염기에 대해 높은 신뢰성으로 확인할 수 있으며, 타겟 유전자의 모든 영역에 대하여 균일하게 염기서열을 확인하기 때문에 정확하게 데이터를 분석할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 프로브 디자인 시 타겟하는 모든 유전자에 대하여 효율적으로 캡쳐하도록 디자인 하였으나, 일부 분리가 잘 되지 않은 유전자 영역들에 대해서는 리밸런싱 과정을 진행함으로써 캡쳐 프로브의 구성을 조정하였다. 리밸런싱을 통해 최적화를 수행한 패널은 리밸런싱을 진행하지 않았을 때의 패널과 비교하였을 때, 상대적으로 적은 시퀀싱 데이터 양으로도 전 타겟 영역들을 포함하며 균일성있는 데이터를 제공할 수 있다. 이는 절감된 비용으로 정확한 데이터를 분석할 수 있다는 이점과 연결될 수 있다.
도 1은 본 발명의 프로브 디자인의 모식도를 나타낸다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 사용하는 용어 '유전자'는 달리 특정하지 않는 한, 유전정보를 결정하는 구조 단위를 의미하는 것으로, 단백질의 아미노산 서열 또는 기능 RNA (tRNA, rRNA 등)의 염기 배열을 결정하는 정보를 가지는 구조 유전자, 및/또는 구조 유전자의 발현을 제어하는 조절 유전자 (예를 들면, 프로모터, 억제자(repressor), 작동유전자(operator) 등)를 포함한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 '유전자'는 달리 특정하지 않는 한, 유전자의 산물을 생성하기 위해 전사되는 핵산 서열을 포함하는 단일가닥 쪽을 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명에서 사용하는 용어 "표적 유전자"는 달리 특정하지 않는 한, 현재 알려진 및 장래 확인될 어떠한 유전자일 수 있으며, 구체적으로는 질환 또는 장애와 관련된 유전자일 수 있고, 더 구체적으로는 암, 전암 상태, 염증성 질환, 면역 질환, 자가면역 질환 또는 장애, 심혈관 질환 또는 장애, 신경성 질환 또는 장애, 감염성 질환 또는 통증과 관련된 유전자, 보다 더 구체적으로는 유방암, 난소암, 췌장암, 전립선 암과 관련된 유전자일 수 있다.
본 발명의 표적 유전자에 특이적으로 혼성화하는 프로브의 핵산은 표적 유전자 서열의 변이를 검출하기 위한 것일 수 있다. 이러한 변이가 전술된 각종 질환 또는 장애를 유발할 수 있기 때문이다.
상기 '변이'는 표준 유전체 DNA에 대하여 변이를 갖는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 변이는 표준 유전체 DNA에 대하여 유전자의 카피 수의 변이 또는 뉴클레오티드 서열의 변이를 포함할 수 있다. 상기 유전자의 카피수의 변이는 예를 들면 복제수변이(CNV)일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 서열의 변이는 표준 유전체 DNA에 대하여 하나 이상의 뉴클레오티드 서열의 치환, 삽입, 결실, 또는 전좌를 포함할 수 있다. 상기 하나 이상의 뉴클레오티드 서열의 치환은 예를 들면 단일 뉴클레오티드 변이(SNV)일 수 있다.
용어 '단일 뉴클레오티드 변이 (Single Nucleotide Variation: SNV)'는 단일 뉴클레오티드 다형성(Single Nucleotide Polymorphism)이 하나의 종 내 다수의 집단에서 나타나는 단일염기의 차이를 말하는 것에 비해, 하나의 서열 또는 종 내 소수의 집단에서 나타나는 단일염기의 차이를 의미하는 것으로, 예를 들면 시퀀싱 데이터에서 나타나는 표준염기서열과의 차이를 의미할 수 있다.
용어 '삽입-결실 변이(Indel)'는 유전자의 핵산 개수를 변화시킬 수 있는 염기 서열이 삽입 또는 결실된 것을 의미한다.
용어 '복제수 변이(Copy Number Variation: CNV)'는 특정 염색체의 상대적으로 큰 영역이 결손되거나 증폭되어 반복적으로 나타나는 유전체 DNA의 변이를 의미하는 것으로, 예를 들면 1kB 이상의 DNA 조각이 중첩되어 존재하거나 일부가 결실되는 변이일 수 있다.
용어 '전좌(translocation)'는 염색체의 일부분에 절단이 일어나, 그 단편이 동일 염색체의 다른 부분 또는 다른 염색체에 결합하여 염색체의 형태를 바꾸는 현상을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 “프로브”란 일반적으로 검체 중의 표적으로 하는 유전자의 핵산(mRNA)을 혼성화에 의해 포착하고, 당해 표적 핵산을 검출하기 위해 사용되는 것을 지칭한다. 상기 프로브는 통상 핵산 프로브인데, 본 발명에서 프로브를 구성하는 핵산은 일반적으로 DNA, RNA, PNA 등을 사용할 수 있고, 특히 한정하는 것은 아니나 DNA가 바람직하다. 본 발명에서 사용하는 용어 “프로브”는 달리 특정하지 않는 한 특정 물질, 부위, 상태 등을 특이적으로 검출하는 물질을 의미한다.
상기 프로브를 구성하는 핵산은 DNA, RNA, 펩티드 핵산(Peptide Nucleic Acid: PNA), 잠금 핵산(Locked Nucleic Acid: LNA), 지프 핵산(Zip Nucleic Acid: ZNA), 가교 핵산(Bridged Nucleic Acid: BNA) 및 유사체로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 프로브를 구성하는 핵산은 구체적으로 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 RNA일 수 있다. 상기 프로브를 구성하는 핵산이 RNA일 경우, 시료 핵산과의 결합 강도가 다른 강도보다 우수하여 혼성화 시간이 단축되고, 높은 검출 민감도의 효과를 갖는다.
상기 프로브를 구성하는 핵산은 본 분야에서 공지된 임의의 방법, 예를 들면 자동 DNA 합성기 (예, 바이오서치, 어플라이드 바이오시스템TM 등으로 구입할 수 있는 것)를 사용하여 합성될 수 있다. 상기 프로브를 구성하는 핵산은 전사됨으로써 표적 유전자의 mRNA 또는 그의 cDNA에 특이적으로 혼성화하는 물질을 생성하는 것일 수 있다. 상기 전사는 인 비트로 전사일 수 있다. 또한이의 분리 또는 정제를 위한 모이어티(moiety)를 더 포함할 수 있다. 상기 모이어티는 비오틴, 아비딘, 및 스트렙타비딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한 상기 모이어티, 예를 들면 비오틴, 아비딘 또는 스트렙타비딘은 자성비드(magnetic bead)를 포함하거나, 또는 상기 모이어티에 특이적으로 결합하는 물질이 자성비드를 포함할 수 있다. 상기 분리 또는 정제는 모이어티에 특이적으로 결합하는 물질 또는 자기장에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명에서, 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출하기 위한 프로브(또는 프로브 세트)로는, 예를 들면, 하기 (a), (b) 또는 (c)의 핵산 또는 그의 일부를 포함하는 것을 들 수 있다:
(a) BRCA1 및 BRCA2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 구성하는 염기서열을 포함하는 핵산,
(b) 상기 (a)의 핵산에 대하여 상보적인 염기서열을 포함하는 핵산,
(c) 상기 (a)의 핵산, 또는 (b)의 핵산에 대하여 상보적인 염기서열을 포함하는 핵산과 혼성화하고 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출할 수 있는 핵산.
상기 (a)의 핵산은 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출하기 위한 유전자 중에서 선택된 BRCA1 및 BRCA2로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 염기서열을 포함하는 핵산이지만, 예를 들면 이하의 형태로 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 상기 (a)의 핵산이 BRCA1 및 BRCA2의 각 유전자를 구성하는 염기서열을 포함하는 핵산일 수 있다. 여기서, 암을 유발할 수 있는 유전자 변이는 전술된 바와 같이 표준 유전체 DNA에 대하여 하나 이상의 핵산 서열의 치환, 삽입, 결실, 또는 전좌를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 컨트롤이 되는 유전자의 염기서열을 포함하는 핵산(또는 그의 일부)도, 상기 (a)의 핵산과 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, positive control이 되는 유전자로는 cell line NA14094, NA14626, NA14638, NA14639, NA14622, NA14684, NA14623에 있는 BRCA 유전자 등을 들 수 있다.
또한, 상기 (b)의 핵산도, 상기 (a)의 핵산과 마찬가지로, 본 발명에 있어 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이 검출 등에 사용할 수 있다. 상기 (b)의 핵산에 대해서는, 상기 (a)의 핵산의 상보쇄 염기서열을 포함하는 것 이외에는 상술한 (a)의 핵산 관련 설명을 동일하게 적용할 수 있다.
또한, 상기 (c)의 핵산도, 상기 (a) 및 (b)의 핵산과 마찬가지로, 본 발명에 있어 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이 검출 등에 사용할 수 있다. 상기 (c)의 핵산에서 혼성화는 예를 들면, 상기 (a)의 핵산 또는 (b)의 핵산의 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 핵산의, 전부 또는 일부를 프로브로서 콜로니 혼성화법, 플라크 혼성화법 또는 서던 혼성화법 등을 사용하여 수행한 것을 지칭한다. 이러한 혼성화에 영향을 미치는 요소로는 온도, 프로브 농도, 프로브 길이, 반응 시간, 이온 강도, 염 농도 등 복수의 요소가 고려될 수 있다. 상기 혼성화는 적절한 온도에서 수행될 수 있다. 혼성화에 적절한 온도는 예를 들면, 40 내지 80℃, 50 내지 75 ℃, 60 내지 70℃, 또는 62 내지 67℃일 수 있으며, 구체적으로는 65℃일 수 있다. 이들 혼성화 온도는 이에 제한되지 않고, 조성물에 포함된 폴리뉴클레오티드의 서열 및 길이에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 혼성화 시간은 예를 들면, 1 시간 내지 24시간 (밤새) 동안일 수 있다.
또한, 염기서열의 상동성은 알고리즘 BLAST을 사용하여 결정할 수 있다. 관련 프로그램으로 BLASTN이나 BLASTX 등이 있다. BLASTN을 사용하여 염기서열을 해석하는 경우에는 파라미터는 score=100, word length=12로 한다. 또한 상기 (c)의 핵산에 있어서 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출한다는 기재는 상기 (a)에 있어 열거한 유전자(BRCA1 및 BRCA2)의 염기서열이나 그의 상보쇄 염기서열 중 어느 하나를 혼성화에 의해 포착할 수 있는 것을 의미한다.
상기 (a), (b) 및 (c)의 핵산은 당해 핵산의 전체 길이에 한정되지 않고, 그의 일부를 프로브로서 사용할 수도 있다. 상기 핵산의 일부란, 예를 들면 30 내지 5000 염기를 포함하는 핵산, 40 내지 1000 염기를 포함하는 핵산, 50 내지 500 염기를 포함하는 핵산, 나아가 60 염기 내지 200 염기를 포함하는 핵산 등을 들 수 있으나, 염기 길이에 대해 특별히 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출하기 위한 프로브(또는 프로브 세트)로는, 예를 들면, 이하의 (d), (e) 또는 (f)의 핵산을 포함하는 것도 들 수 있다:
(d) 서열 번호 1 내지 111, 154 내지 366에 나타나는 염기서열 중 적어도 1종의 염기서열을 포함하는 핵산,
(e) 서열 번호 367 내지 385에 나타나는, 상기 (d)의 핵산에 대하여 상보적인 염기서열을 포함하는 핵산,
(f) 서열번호 112 내지 137, 138 내지 153에 나타나는, 상기 (d) 또는 (e)의 핵산의 염기서열에 대하여 70% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 포함하고, 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출할 수 있는 핵산.
여기에 추가로 상기 (d), (e), 또는 (f)의 핵산의 염기서열에 있어 1 내지 수개의 염기가 부가, 결실 또는 치환된 염기서열을 포함하고, 또한 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출할 수 있는 핵산(이하 (g)의 핵산이라 칭함)을 포함할 수 있다.
상기 (d)의 핵산은, 서열 번호 1 내지 148, 190 내지 422에 나타나는 염기서열을 갖는 핵산이고, 상기 서열 번호에 나타나는 염기서열은 상기 (a)의 핵산에 있어서 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출하기 위한 유전자(BRCA1 및 BRCA2)의 염기서열의 일부에 해당하는 염기서열이다.
또한, 상기 (d)의 핵산으로는, 예를 들면 서열 번호 1 내지 148, 190 내지 422에 나타나는 각 염기서열을 포함하는 핵산을 모두 포함하는 형태도 바람직하게 들 수 있다.
본 발명에서 상기 컨트롤로서의 염기서열을 포함하는 핵산도, 상기 (d)의 핵산과 함께 사용할 수 있고, 마찬가지로 후술하는 (e), (f)의 핵산, 나아가 (g)의 핵산과 함께 사용할 수도 있다.
또한 상기 (e)의 핵산도, 상기 (d)의 핵산과 마찬가지로, 본 발명에서 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이 검출 등에 사용할 수 있다. 상기 (e)의 핵산에 대해서는, 상기 (d)의 핵산의 상보쇄 염기서열을 포함하는 것 이외에는, 상술한 (d)의 핵산에 관한 설명을 동일하게 적용할 수 있다.
또한, 상기 (f)의 핵산도, 상기 (d) 및 (e)의 핵산과 마찬가지로, 본 발명에서 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이 검출 등에 사용할 수 있다.
상기 (f)의 핵산은 상기 (d) 또는 (e)의 핵산의 염기서열에 대하여, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 최대 99% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 포함하는 핵산인 것이 바람직하다.
또한 상기 (f)의 핵산에 있어서, 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이 검출이란 전술한 (a) 관련 열거한 유전자(BRCA1 및 BRCA2)의 염기서열이나 그의 상보쇄 염기서열 중 어느 하나를 혼성화에 의해 포착할 수 있는 것을 의미한다.
또한, 상기 (g)의 핵산도, 상기 (d), (e) 및 (f)의 핵산과 마찬가지로, 본 발명에서 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이 검출 등에 사용할 수 있다.
상기 (g)의 핵산은 상기 (d), (e) 및 (f)의 핵산의 염기서열에 있어서 1 내지 수개(예를 들면, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 또는 1 내지 5개, 또는 1 내지 2개)의 염기가 부착, 결실 또는 치환된 염기서열이다. 예를 들면, 상기 (d), (e) 및 (f)의 핵산의 염기서열 말단에, 링커가 되는 염기(폴리T 등)를 개질한 것이나, 해당 염기서열의 일부에 다른 염기를 삽입하거나, 해당 염기서열의 일부 염기를 결실시키거나, 해당 염기서열의 일부 염기를 다른 염기로 치환한 것 등을 들 수 있다.
상기 (d), (e), (f) 및 (g)의 핵산은 상술한 (a), (b) 및 (c)의 핵산과 마찬가지로, 해당 핵산의 전체 길이에 한정되지 않고, 그의 일부를 프로브로서 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에서 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출하기 위한 프로브(또는 프로브 세트)로는, 예를 들면 상술한 (i)의 핵산 및/또는 (ii)의 핵산을 포함하는 것도 사용할 수 있다.
상기 프로브로서 사용할 수 있는 각종 핵산은 적절하게 개질된 것일 수 있다. 일예로, 말단 비닐화(아크릴로일화, 메타크릴로일화) 또는 말단 아미노화가 이루어진 것이나, 링커가 되는 염기(폴리T 등)로 수식된 것 등을 들 수 있다. 또한, 각종 핵산의 염기서열 일부에 다른 염기를 삽입하거나, 해당 염기서열의 일부 염기를 결실시키거나, 또는 별도의 염기로 치환하거나, 또는 염기 이외의 물질로 치환하여 사용할 수 있다. 여기서 염기 이외의 물질이란 예를 들면 색소(형광 색소, 인터칼레이터), 소광제, 염기 가교제 등을 들 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상술한 프로브를 제조하되, 상기 프로브는 단백질로 코딩되는 exon 부분의 DNA 시퀀스(coding sequence)를 포함하도록 시퀀스 디자인된 것인 프로브 제조방법을 제공한다.
상기 프로브의 시퀀스 디자인은 타겟 영역의 모든 염기 및 타겟 영역 밖의 일부를 포함하도록 디자인되되, 2X 타일링 방법에 의한 디자인과 타겟의 양 말단에서 시작하는 터미널 프로브의 추가 디자인을 포함하고 온-타겟 비(on-target ratio) 및 균일성(uniformity) 향상을 도모할 수 있다.
상기 타일링(tiling) 기법은 타겟 영역에 대하여 2이상의 프로브가 둘 이상의 타겟하도록 프로브의 길이에 따라 일정 부분이 다음 순서의 것과 겹치도록 프로브를 순차 디자인한 것을 지칭한다(도 1 참조). 이 경우 세트를 구성하는 프로브의 서열 각각은 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출할 수 있는 유전자의 일부 서열에 상보적인 서열을 포함하며, 프로브에 의해 타겟되지 않는 부분은 존재하지 않을 수 있다. 이는 해당 유전자 전체 핵산 서열이 세트를 구성하는 프로브(들)에 의해 커버될 수 있음을 의미하다. 여기서 용어 프로브(들)에 의한 커버는 프로브가 유전자의 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함하는 것을 의미한다.
상기 타일링 기법으로 제작된 프로브 세트의 경우, 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출하는 유전자의 핵산 서열 중 한 개의 핵산이 2 종 이상, 구체적으로는 3 종 이상의 프로브에 의해 커버될 수 있다.
또한, 이 경우, 프로브 세트를 구성하는 임의의 프로브와 순서상 이와 가장 인접한 다른 프로브는, 예를 들면 50 내지 150개, 60 내지 140개, 70 내지 120개, 70 내지 110개, 70 내지 100개, 70 내지 90개, 70 내지 80개의 동일한 서열을 가질 수 있다.
본 발명에서 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출하는 유전자의 핵산핵산 서열 중 한 개의 핵산이 n종의 프로브에 의해 커버될 때 n x 타일링 기법으로 제조된 것이라 할 수 있다. 용어 '타일링 정도(tiling depth)'는 상기 타일링 기법으로 제조된, 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출하는 유전자의 임의의 타겟 영역을 커버하는 프로브 종류의 개수라 할 수 있다. 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출하는 유전자의 타겟 영역을 커버하는 프로브의 종이 증가할수록 타일링 정도는 높아지고, 이와 반대로 커버하는 프로브의 종이 감소할수록 타일링 정도는 낮아진다고 할 수 있다.
상기 시퀀스는 GC fix 과정을 거쳐 조정된 것일 수 있다. 여기서 사용하는 용어 “GC fix 과정”은 달리 특정하지 않는 한 G 또는 C가 4개 이상 연속될 때에 4번째 염기를 A 또는 T로 치환하여 프로브의 시퀀스를 조정한 것을 지칭한다. 상기 GC fix 과정은 폴리뉴클레오티드가 표적 유전자와 결합하는 위치에 높은 GC ratio를 지니거나 특정 서열이 반복적으로 나타날 때 캡쳐 효율이 낮아질 수 있으므로 이를 보완하기 위하여 폴리핵산 서열을 조정하는 방식의 일종으로, 효율적인 캡쳐가 이루어지는 효과를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 프로브의 혼성화율(hybridization rate)을 측정하여 혼성화가 평균 혼성화율보다 낮은 부분에, 해당 프로브를 추가 삽입하여 재조정(re-balancing) 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서 상기 프로브의 혼성화율(hybridization rate)을 측정하여 혼성화가 평균 혼성화율보다 높은 부분에, 해당 프로브를 제외한 나머지 프로브를추가 삽입하여 재조정(re-balancing) 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다. 상기 프로브의 추가 삽입은 normalized depth를 구한 다음 normalized depth가 상대적으로 높은 영역에 대해서는 tiling depth를 낮춰주거나 해당 프로브의 개수를 줄여주어 수행할 수 있다. 이때 normalized depth가 높고 낮은 구간의 프로브 수에 따른 비율은 “수배에서 수십배”까지 차이가 날 수 있으며 이는 절대적인 수치로 정해진 것이 아니고 상대적인 비율을 고려하여 조정한 것이다. 일례로, 상기 프로브의 추가 삽입은 n배 (여기서 n은 1~5의 정수임)로 추가 삽입하여 재조정(re-balancing)하는 것일 수 있다.
이러한 평균 혼성화율과의 대비는 실제 상황에서 실현하기 전에 소규모로 시험 작동해보는 예비 실험(pilot test)을 통해 수행되는 것으로, 당해 분야에 알려진 프로브의 캡쳐 효율을 분석하는 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들면, 상기 제작된 프로브 세트와 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출하는 유전자를 접촉하여 혼성화시킨 후 이 혼성화 산물을 분리하여 시퀀싱함으로써 각 프로브의 캡쳐 효율을 확인할 수 있다.
본 발명에서 '캡쳐 효율'은 표적 유전자의 서열, 예를 들면 타겟 영역에 GC 비율이 높거나 특정 서열이 반복적으로 나타날 경우, 혹은 이차 구조(secondary structure) 등 여러 요인에 따라 달라질 수 있으므로 상대적일 수 있다. 당업자라면 상기 요인들을 참조하여 목적한 수준의 캡쳐 효율을 특정할 수 있다. 상기 캡쳐 효율은 프로브 세트들의 캡쳐 효율에 대한 평균값이 것이 바람직하다.
상기 예비 실험을 통해 확인된 캡쳐 효율이 목적한 수준보다 낮은 경우에는 해당 프로브를 더욱 투입하여 개수를 증가시킬 수 있다. 또는 상기 프로브에 의해 커버되는 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출하는 유전자의 타겟 영역에 대한 타일링 정도를 증가시킬 수 있다. 예를 들어 해당 프로브가 2 x 타일링 기법으로 제작된 것이라면 3 x 타일링 기법으로 제작하는 것일 수 있고, 타일링 기법에 의해 제작되지 않았다면 타일링 기법을 도입하는 것일 수 있다.
반대로, 캡쳐 효율이 목적한 수준보다 높은 경우에는 해당 프로브의 개수를 감소시킬 수 있다. 또는 상기 프로브에 의해 커버되는 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암 등을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출하는 유전자의 타겟 영역에 대한 타일링 정도를 감소시킬 수 있다. 타일링 정도를 감소시킨다는 것은, 예를 들어 해당 프로브가 3 x 타일링 기법으로 제작된 것이라면 2 x 타일링 기법으로 제작하거나, 타일링 기법을 도입하지 않는 것일 수 있다.
이러한 재조정 단계를 거침으로써, 본 발명의 세트를 구성하는 프로브들은 모두 동일한 개수가 아닌 서로 다른 개수로 세트에 포함될 수 있다. 마찬가지로 프로브들은 모두 동일한 타일링 기법이 아닌 서로 다른 타일링 기법으로 제작되어 세트에 포함될 수 있다.
캡쳐 효율이 목적한 수준에 이를 때까지 프로브 세트의 조성을 2회 이상 재조정할 수 있다. 이러한 재조정 단계를 통해 타겟 영역에 대한 커버리지, 데이터 균일성, 데이터 쏠림 현상을 개선할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상술한 프로브를 포함하는, 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 상기 프로브가 시료의 핵산과 혼성화하는데 요구되는 알려진 물질을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 시료내 핵산의 혼성화에 필요한 시약, 버퍼, 보조인자, 및/또는 기질을 더 포함할 수 있다. 또한 상기 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합효소보조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 또한, 상기 키트는 표적 핵산을 증폭하기 위하여 사용하기 위한 설명서를 더 포함할 수 있으며, 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다. 본 발명에서 상기 프로브는 프로브 세트를 포함하는 형태의 패널로 이용될 수 있다.
상기 프로브 세트는 길이가 120bp이고, 인접한 서열번호를 갖는 2개의 프로브를 구성하는 핵산들 간에 60bp의 염기가 겹치도록 제작된 것이다(예를 들면 서열번호 1의 3' 말단의 60개의 염기와 서열번호 2의 5' 말단의 60개의 염기가 서로 동일함). 또한 상기 프로브 세트는 해당 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출하는 유전자의 CDS(coding DNA sequence)를 커버할 수 있도록 제작된 것이다. 또한, 상기 프로브(또는 프로브 세트)는, 캡쳐 효율을 높이기 위해 타겟 영역에 GC 비율이 높거나 특정 서열이 반복적으로 나타날 경우, 프로브를 구성하는 핵산의 서열을 조정하여 제작된 것일 수 있다.
상기된 바와 같이 제작된 프로브 세트는 캡쳐 효율을 확인하는 예비 실험을 실시하여, 캡쳐 효율이 목적한 수준보다 낮은 경우에는 이의 개수 또는 이의 타겟 영역에 대한 타일링 정도를 증가시키고, 캡쳐 효율이 목적한 수준보다 높은 경우에는 이의 개수 또는 이의 타겟 영역에 대한 타일링 정도를 감소시키는, 재조정 단계를 거쳐서 제조된 것일 수 있다.
상기 프로브를 구성하는 핵산은 구체적으로 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 RNA일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 전술한 방식으로 제조된 프로브와 시료 핵산을 접촉시켜, 상기 시료 핵산과 상기 프로브의 혼성화 산물을 얻는 단계; 상기 혼성화 산물 중의 상기 시료 핵산의 서열을 확인하는 단계; 및 상기 시료 핵산의 확인된 핵산 서열을 표준 핵산 서열과 비교하여 상기 시료 핵산의 변이를 확인하는 단계를 포함하는 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 상의 변이를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 프로브는 표적 유전자의 일부 서열과 특이적으로 혼성화할 수 있다. 상기 프로브의 일부 서열이 '타겟 영역' 이라 할 수 있다. 타겟 영역은 일예로 엑손 또는 엑손의 일부일 수 있다. 본 발명의 프로브는 타겟 영역에 상보적인 서열을 갖도록 제작되어, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 해당 타겟 영역과 어닐링 또는 혼성화될 수 있다. 본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
상기 시료 핵산은 생물학적 시료로부터 분리된 DNA 또는 RNA일 수 있다. 예를 들면, 상기 생물학적 시료는 혈액, 타액, 뇨, 분변, 조직, 세포 및 생검물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 시료는 보관된 생물학적 시료 또는 그로부터 분리된 핵산을 포함하는 것일 수 있다. 상기 보관은 알려진 방법에 의하여 보관된 것일 수 있다. 상기 핵산은 냉동 보관 또는 포르말린 고정된 파라핀 임베드된 조직을 상온에서 보관한 조직으로부터 유래된 것일 수 있다. 생물학적 시료로부터 핵산을 분리하는 방법은 잘 알려져 있다. 상기 시료는 환자의 세포, 조직, 기관, 체액으로부터 분리한 것일 수 있으며, 이 경우, 상기 시료는 통상적인 방법, 예를 들면, 관련 의학 기법에서 당업자에 의해 잘 공지된 방법을 이용하는 생검에 의해 수득될 수 있다.
상기 검출 방법에서, 상기 혼성화는 알려진 방법에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 핵산의 혼성화에 적절한 것으로 알려진 버퍼 중에서 상기 폴리뉴클레오티드와 시료 핵산을 인큐베이션함으로써 수행될 수 있다. 혼성화는 적절한 온도에서 수행될 수 있다. 혼성화에 적절한 온도는 예를 들면, 40 내지 80℃, 50 내지 75 ℃, 60 내지 70℃, 또는 62 내지 67℃일 수 있으며, 구체적으로는 65℃일 수 있다. 또한 혼성화 온도는 이에 제한되지 않고, 조성물에 포함된 폴리뉴클레오티드의 서열 및 길이에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 혼성화 시간은 예를 들면, 1 시간 내지 24시간 (밤새) 동안일 수 있다.
상기 핵산 서열의 확인은 예를 들면 시퀀싱(sequencing) 방법을 통해 확인할 수 있으며, 구체적으로는 차세대 염기서열분석법에 의해 확인할 수 있다. 용어 차세대 염기서열 분석법(next generation sequencing: NGS)은 전장유전체를 무수히 많은 조각을 분해하여 각 조각을 초병렬적으로 읽어낸 뒤 전산 기술을 이용하여 조합함으로써 방대한 유전체 정보를 빠르게 해독하는 방법이다. 차세대 염기서열 분석법에 의해 짧은 시간 내에 분석대상이 되는 시료에 대해 대량의 염기서열 데이터를 생성할 수 있다.
상기 초병렬 시퀀싱은 현재 차세대 염기서열 분석법으로 알려진 방법 및 장래 개발될 수 있는 방법을 포함한다. 상기 초병렬 시퀀싱은 합성에 의한 시퀀싱(sequencing by synthesis), 이온 토렌트(Ion-Torrent) 시퀀싱, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 라이게이션에 의한 시퀀싱, 나노포어 시퀀싱 및 단일-분자 실시간 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 프로브는 상기 타겟 영역과 특이적으로 혼성화될 수 있는 핵산 서열을 갖는, 예를 들면 75 내지 200개, 80 내지 200개, 90 내지 200개, 100 내지 200개, 100 내지 180개, 100 내지 160개, 100 내지 140개, 100 내지 120개의 크기의 핵산일 수 있다. 75개 이하의 크기를 가질 경우 타겟 영역에 대한 캡쳐 정확도가 낮으며, 200개 이상의 크기를 가질 경우 합성비용이 증가하는 단점을 갖는다.
본 발명의 프로브 세트는 타겟 시퀀싱(targeted sequencing)을 위한 타겟 캡쳐(target capture)에서 프로브로 이용될 수 있다. '타겟 시퀀싱'이란 전체 게놈 DNA가 아닌 게놈의 특정 영역(targeted region)만을 포획하여 분석하는 것으로, 다양한 유전자의 변이를 확인하는 대표적인 방법이다. 용어 '타겟 캡쳐'란, 시퀀싱 하기 전 특정 유전자 또는 기타 관심 부위를 DNA 라이브러리로부터 분리 및/또는 그 빈도를 증가시키기 위한 방법으로, 관심 부위는 시퀀싱을 위해 유지하고 나머지 물질을 제거한다.
상기 검출 방법은 확인된 시료 핵산의 염기서열을 표준 염기서열과 비교하는 단계를 포함한다. 용어 표준 핵산 서열(reference nucleotide sequence)은 변이 확인을 위해 참조가 되는, 변이를 포함하지 않는 인간 유전자 서열을 의미할 수 있다. 예를 들면 표준 염기서열로서 미국 국립보건원 산하 생물공학정보연구소(NCBI)의 데이터베이스에 게시된 인간 유전자 염기서열, 구체적으로, NCBI37.1 또는 UCSC hg19(GRCh37)를 이용할 수 있다. 상기 시료 핵산의 염기서열과 표준 염기서열 간의 비교는 공지된 다양한 서열 비교 분석 프로그램, 예를 들면 Maq, Bowtie, SOAP, GSNAP 등을 이용하여 수행할 수 있다.
상기 검출 방법은 시료 핵산의 변이를 확인하는 단계를 포함한다. 상기 변이 확인은 공지된 변이 검출 프로그램, 예를 들면 GATK, SAMtool, MoDIL, SeqSeq, PeMer, VariationHunter, Pindel, BreakDancer 및 Mutek등을 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 암과 관련된 유전자의 선정
유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암과 관련된 유전자로, BRCA1, BRCA2를 선정하였다.
실시예 2: 선정된 유전자에 대한 프로브 제작
1.1 코딩 서열 확인
앞서 선정된 유전자들을 타겟으로 하여 해당 코딩 서열, 즉 단백질로써 코딩되는 엑손으로 구성된 부분에 대한 DNA 서열을 포함하도록 디자인하였다. 이때 UCSC genome browser를 이용해 모든 유전자의 전사체(transcript)를 모두 포함할 수 있도록 프로브를 구성하도록 하였다.
2.2. 프로브 서열 디자인
유전자 별로 재조합된 서열의 CDS 시작지점을 기준으로 하여 레퍼런스 게놈 상에서 upstream 쪽으로 일정 영역(30-60bp) 확장하여 intergenic 영역에서 프로브 시작 지점을 설정하였다. 이로부터 프로브의 길이에 따라 일정 부분이 다음 순서의 것과 겹치도록 프로브를 순차적으로 디자인 진행하였다. 이때 이웃하는 프로브간에 60bp 정도씩 겹치도록 하는 2x tiling 기법으로 디자인함으로써 모든 영역에 대하여 효율적으로 캡쳐되도록 하였다. 프로브의 on-target ratio 및 uniformity 향상을 위하여 양 말단에서 시작하는 terminal 프로브를 추가로 디자인해주었다.
프로브가 타겟 유전자와 결합하는 위치에 높은 GC ratio를 지니거나 특정 서열이 반복적으로 나타날 때 캡쳐 효율이 낮아질 수 있으므로 이를 보완하기 위하여 프로브 서열을 조정하는 방법(G 또는 C가 4개 이상 연속될 때에 4번째 염기를 A 또는 T로 치환하는 GC fix 과정)을 적용하여 효율적인 캡쳐가 되도록 하였다.
도 1은 프로브 디자인의 모식도를 나타낸다.
2.3. re-balancing 과정
상기된 바와 같이 디자인된 프로브를 이용하여 타겟티드 시퀀싱 pilot test를 진행하여 캡쳐 결과를 확인한 후 캡쳐가 잘 되지 않은 부분은 프로브를 보충하며, 캡쳐가 많이 된 부분은 프로브 수를 감소시킴으로써 프로브 구성을 조정하는 re-balancing을 진행하였다. Normalized depth가 상대적으로 낮은 영역에 대해서는 동일한 프로브를 depth 수치에 따라 추가로 n배 삽입할 수 있으며, 타일링 심도(tiling depth)를 높여주었다.
또한, 캡쳐가 되지 않는 영역에 대해서는 타겟 서열에 GC가 높거나 특정 서열이 반복되어 캡쳐되지 않았다고 판단하여 주변부로 프로브를 추가로 디자인함으로써 캡쳐의 효율을 올려주었다. Normalized depth가 상대적으로 높은 영역에 대해서는 tiling depth를 낮춰주거나, 해당 프로브의 개수를 줄여주었다.
이때 normalized depth가 높고 낮은 구간의 프로브 수에 따른 비율은 수배에서 수십 배까지 차이가 날 수 있으며 이는 절대적인 수치로 정해진 것이 아니고 상대적인 비율을 고려하여 조정하였다.
유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암과 관련된 유전자로 선정된 2개 유전자에 대한 프로브 제작 결과, 각 유전자에 대한 프로브 서열은 표 1에 기재된 바와 같다.
프로브
세트
번호		 유전자명 프로브 서열번호 프로브
세트
번호		 유전자명 프로브 서열번호
1 BRCA1 1 내지 111 4 BRCA2 154 내지 366
2 BRCA1_3UTR 112 내지 137 5 BRCA2_Promoter 367 내지 385
3 BRCA1_5UTR 138 내지 153
실시예 3 : 프로브의 캡쳐 효율 분석
2가지 타겟 유전자를 포함하는 human reference genome 3가지 샘플 S1, S2, S3을 구성한 후 앞서 제작된 프로브 세트를 이용하여 타겟 캡쳐를 진행한 후 시퀀싱 데이터를 분석해본 실험 결과를 표 2에 나타내었다.이에 따르면, rebalancing을 진행하기 전 표적 유전자 부분에 대하여 약 27%이상의 on-target 비율을 보임으로써 해당 프로브를 이용한 타겟 캡쳐에서 표적 유전자 부분에 대한 높은 enrich효율을 확인할 수 있으며, 표적 유전자에 대한 높은 depth를 확보할 수 있었음. Re-balancing을 진행한 이후에는 그 전에 비하여 평균 sequencing depth가 낮음에도 불구하고 (아래 Mean depth over target region 수치 참고) 표적 타겟 유전자들에 대해서 50배 또는 100배 이상의 시퀀싱 depth를 갖는 영역의 비율이 (50x~ over target ratio 및 100x~ over target ratio 수치 참고) 증가하는 것을 관찰할 수 있었으며 on-target 비율도 평균 37%정도로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해 re-balancing의 효과는 프로브가 표적 유전자 전 영역에 걸쳐 고른 분포로, 정확하게 혼성화가 이루어지는 것이며 이로써 표적 유전자에 대한 변이를 정확하게 검출할 수 있다는 가능성을 보여주었다.
Figure pat00001
<110> CELEMICS Inc. <120> Probes for detecting BRCA gene mutations, method for producing the same and method for detecting breast cancer using thereof <130> SDP2018-1022 <160> 385 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 1 ttccagttca gcctgcgagg aagacaggtg atccgaatcc taagaatgca aaagatgggc 60 cgggtgtggt ggctcatgcc tgtaatccca gcgctttggg aggccgaggc aggcagatca 120 120 <210> 2 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 2 cgggtgtggt ggctcatgcc tgtaatccca gcgctttggg aggccgaggc aggcagatca 60 cctgaggtcg ggaggttgag accagactga ccaacaacgg agaaaccccg tctctactta 120 120 <210> 3 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 cctgaggtcg ggaggttgag accagactga ccaacaacgg agaaaccccg tctctactta 60 aaaatgcaaa gttagccgtg cgtggtggcc catgcctgta ttcccagcta ctcgggaggc 120 120 <210> 4 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 4 aaaatgcaaa gttagccgtg cgtggtggcc catgcctgta 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cctaccattc tgatgaggta 60 tataatgatt caggatatct ctcaaaaaat aaacttgatt ctggtattga gccagtattg 120 120 <210> 120 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 120 tataatgatt caggatatct ctcaaaaaat aaacttgatt ctggtattga gccagtattg 60 aagaatgttg aagatcaaaa aaacactagt ttttccaaag taatatccaa tgtaaaagat 120 120 <210> 121 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 121 aagaatgttg aagatcaaaa aaacactagt ttttccaaag taatatccaa tgtaaaagat 60 gcaaatgcat acccacaaac tgtaaatgaa gatatttgcg ttgaggaact tgtgactagc 120 120 <210> 122 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 122 gcaaatgcat acccacaaac tgtaaatgaa gatatttgcg ttgaggaact tgtgactagc 60 tcttcaccct gcaaaaataa aaatgcagcc attaaattgt ccatatctaa tagtaataat 120 120 <210> 123 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 123 tcttcaccct gcaaaaataa aaatgcagcc attaaattgt ccatatctaa tagtaataat 60 tttgaggtag ggccacctgc atttaggata gccagtggta aaatcgtttg tgtttcacat 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gatatgatac ggaaattgat agaagcagaa gatcggctat aaaaaagata atggaaaggg 60 atgacacagc tgcaaaaaca cttgttctct gtgtttctga cataatttca ttgagcgcaa 120 120 <210> 173 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 173 atgacacagc tgcaaaaaca cttgttctct gtgtttctga cataatttca ttgagcgcaa 60 atatatctga aacttctagc aataaaacta gtagtgcaga tacccaaaaa gtggccatta 120 120 <210> 174 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 174 atatatctga aacttctagc aataaaacta gtagtgcaga tacccaaaaa gtggccatta 60 ttgaacttac agatgggtgg tatgctgtta aggcccagtt agatcctccc ctcttagctg 120 120 <210> 175 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 175 ttgaacttac agatgggtgg tatgctgtta aggcccagtt agatcctccc ctcttagctg 60 tcttaaagaa tggcagactg acagttggtc agaagattat tcttcatgga gcagaactgg 120 120 <210> 176 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 176 tcttaaagaa tggcagactg acagttggtc agaagattat tcttcatgga gcagaactgg 60 tgggctctcc tgatgcctgt 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Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 181 tgttgatgta attattcaaa gagcataccc tatacaggta tgatgtattc ttgaaactta 60 ccatatattt ctttcttttg atacaattaa tttgtttgtt tgtttgagat ggagtttcgg 120 120 <210> 182 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 182 atacaattaa cttgaatgtt atatatgtga cttttttggt gtgtgtaaca cattattaca 60 gtggatggag aagacatcat ctggattata catatttcgc aatgaaagag aggaagaaaa 120 120 <210> 183 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 183 gtggatggag aagacatcat ctggattata catatttcgc aatgaaagag aggaagaaaa 60 ggaagcagca aaatatgtgg aggcccaaca aaagagacta gaagccttat tcactaaaat 120 120 <210> 184 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 184 ggaagcagca aaatatgtgg aggcccaaca aaagagacta gaagccttat tcactaaaat 60 tcaggaggaa tttgaagaac atgaaggtaa aattagttat atggtacaca ttgttatttc 120 120 <210> 185 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 185 ttagttttag ttgcttttga atttacagtt tagtgaatta 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acctccacct cccgggctga agtgattctc ctgccttagc 120 120 <210> 243 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 243 tatgatcttg gctcactgca acctccacct cccgggctga agtgattctc ctgccttagc 60 cacctgagta gctgggatta caggtgtcca ccaccatgac cggctaattt ctgtattttt 120 120 <210> 244 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 244 cacctgagta gctgggatta caggtgtcca ccaccatgac cggctaattt ctgtattttt 60 agtagagatg gggtttcacc atgttggcca ggctggtttc gaactcctga cctccagtga 120 120 <210> 245 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 245 agtagagatg gggtttcacc atgttggcca ggctggtttc gaactcctga cctccagtga 60 tctgcccacc ttggcctccc aaagtgctgg gattacaggc gtgagccacc atgcccaggt 120 120 <210> 246 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 246 tctgcccacc ttggcctccc aaagtgctgg gattacaggc gtgagccacc atgcccaggt 60 ttcaagtttc cttttcattt ctaatacctg cctcagaatt tcctccccaa tgttccactc 120 120 <210> 247 <211> 120 <212> DNA <213> 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cttccaagcc cgttcctctt 60 tcttcatcat ctgaaaccaa ttccttgtca ctcagaccaa ctccctggct ttcagactga 120 120 <210> 296 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 296 tcttcatcat ctgaaaccaa ttccttgtca ctcagaccaa ctccctggct ttcagactga 60 tgcctcattt gtttggaaga accaatcaag aaaggatcct gggtgtttgt atttgcagtc 120 120 <210> 297 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 297 tgcctcattt gtttggaaga accaatcaag aaaggatcct gggtgtttgt atttgcagtc 60 aagtcttcca attcactgca ctgtgaagaa aacaagctag cagaacattt tgtttcctca 120 120 <210> 298 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 298 aagtcttcca attcactgca ctgtgaagaa aacaagctag cagaacattt tgtttcctca 60 ctaaggtgat gttcctgaga tgcctttgcc aatattacct ggttactgca gtcatttaag 120 120 <210> 299 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 299 ctaaggtgat gttcctgaga tgcctttgcc aatattacct ggttactgca gtcatttaag 60 ctattcttca atgataataa attctcctct gtgttcttag acagacactc ggtagcaacg 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Claims (14)

  1. 하기 (a), (b) 또는 (c)의 핵산 또는 그의 일부를 포함하는, 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출하기 위한 프로브:
    (a) BRCA1 및 BRCA2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 구성하는 염기서열을 포함하는 핵산,
    (b) 상기 (a)의 핵산에 대하여 상보적인 염기서열을 포함하는 핵산,
    (c) 상기 (a)의 핵산, 또는 (b)의 핵산에 대하여 상보적인 염기서열을 포함하는 핵산과 혼성화하고 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출할 수 있는 핵산.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 (a)의 핵산이 BRCA1 및 BRCA2의 각 유전자를 구성하는 염기서열을 포함하는 핵산인 프로브.
  3. 하기 (d), (e) 또는 (f)의 핵산을 포함하는, 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출하기 위한 프로브:
    (d) 서열 번호 1 내지 111, 154 내지 366에 나타나는 염기서열 중 적어도 1종의 염기서열을 포함하는 핵산,
    (e) 서열 번호 367 내지 385에 나타나는, 상기 (d)의 핵산에 대하여 상보적인 염기서열을 포함하는 핵산,
    (f) 서열번호 112 내지 137, 138 내지 153에 나타나는, 상기 (d) 또는 (e)의 핵산의 염기서열에 대하여 70% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 포함하고, 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출할 수 있는 핵산.
  4. 제3 항에 있어서,
    상기 (d)의 핵산이 서열 번호 1 내지 148, 190 내지 422에 나타나는 염기서열을 포함하는 핵산인 프로브.
  5. 하기 (i)의 핵산과 (ii)의 핵산으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는, 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출하기 위한 프로브:
    (i) 서열번호 1 내지 148에 나타나는 염기서열을 포함하는 핵산,
    (ii) 서열번호 190 내지 422에 나타나는 염기서열을 포함하는 핵산.
  6. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 기재된 프로브를 제조하되, 상기 프로브는 단백질로 코딩되는 exon 부분의 DNA 시퀀스(coding sequence)를 포함하도록 시퀀스 디자인된 것인 프로브 제조방법.
  7. 제6 항에 있어서,
    상기 프로브의 시퀀스 디자인은 타겟 영역의 모든 염기 및 타겟 영역 밖의 일부를 포함하도록 디자인되되, 2X 타일링 방법에 의한 디자인과 타겟의 양 말단에서 시작하는 터미널 프로브의 추가 디자인을 포함하는 것인 프로브 제조방법.
  8. 제6 항에 있어서,
    상기 시퀀스는 GC fix 과정을 거쳐 조정된 것인 프로브 제조방법.
  9. 제6 항에 있어서,
    상기 프로브의 혼성화율(hybridization rate)을 측정하여 혼성화가 평균 혼성화율보다 낮은 부분에, 해당 프로브를 추가 삽입하여 재조정(re-balancing) 단계를 더 포함하는 것인 프로브의 제조방법.
  10. 제6 항에 있어서,
    상기 프로브의 혼성화율(hybridization rate)을 측정하여 혼성화가 평균 혼성화율보다 높은 부분에, 해당 프로브를 제외한 나머지 프로브를 추가 삽입하여 재조정(re-balancing) 단계를 더 포함하는 것인 프로브의 제조방법.
  11. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 기재된 프로브를 포함하는, 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 변이를 검출하기 위한 키트.
  12. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 기재된 프로브와 시료 핵산을 접촉시켜, 상기 시료 핵산과 상기 프로브의 혼성화 산물을 얻는 단계;
    상기 혼성화 산물 중의 상기 시료 핵산의 서열을 확인하는 단계; 및
    상기 시료 핵산의 확인된 핵산 서열을 표준 핵산 서열과 비교하여 상기 시료 핵산의 변이를 확인하는 단계를 포함하는 유방암, 난소암, 전립선암, 또는 췌장암을 유발할 수 있는 유전자 상의 변이를 검출하는 방법.
  13. 제12 항에 있어서,
    상기 시료 핵산의 서열은 초병렬 시퀀싱에 의해 분석되는 것인 방법.
  14. 제13 항에 있어서,
    상기 초병렬 시퀀싱은 합성에 의한 시퀀싱, 이온 토렌트 시퀀싱, 파이로시퀀싱, 라이게이션에 의한 시퀀싱, 나노포어 시퀀싱, 및 단일-분자 실시간 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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