KR20190140907A - 그랜자임 b 억제제 조성물 및 피부의 수포발생 및/또는 피부의 박리를 예방 및/또는 치료하는 방법 - Google Patents

Abstract

대상체의 피부의 수포발생 및/또는 박리를 치료 및/또는 예방하기 위한, 그랜자임 B 억제제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 사용하는 방법이 제공된다. 대상체의 수포발생되거나 박리된 피부 영역의 치유를 개선하기 위해, 상기 조성물을 사용하는 방법도 제공된다. 상기 조성물은, 경구 투여, 비강 투여, 국소 투여, 각질하 투여, 표피내 투여, 표피하 투여용 또는 주사에 의한 투여용으로 제형화될 수 있다.

Description

그랜자임 B 억제제 조성물 및 피부의 수포발생 및/또는 피부의 박리를 예방 및/또는 치료하는 방법

피부는 표피와 진피의 두 개의 주요 층으로 구성된다. 수포는 진피 내부 또는 진피 아래의 체액의 축적물이다. 박리는 피부 상층(표피)의 손상 및 손실을 나타낸다. 피부 박리 및/또는 수포발생(blistering)은, 피부를 자극하거나 손상시키는 환경적 요인, 예를 들어, 극한 온도(뜨거운 또는 차가움), 감염, 마찰, 태양, 바람, 열, 건조 및 과도한 습도, 반복적인 자극, 화학 물질, 알러젠 또는 약물, 및 자가 면역 및 유전적 장애를 포함하는 병리학적 병태에 의해 발생될 수 있다.

수포발생은 많은 피부과 병태의 특징이며, 다양한 정도의 중증도로 나타날 수 있지만, 일반적으로는 표피의 상이한 층들에서의 세포 부착에 대한 세포의 붕괴 또는 표피의 진피로부터의 분리로 인한 피부 표면으로부터의 미란 또는 체액으로 채워진 상승을 특징으로 한다. 피부가 체액/전해질 보유 조절, 온도 조절 및 감염 예방에 있어 장벽으로 작용하는 중요한 역할로 인해, 수포발생의 크기 및 중증도에 따라 이러한 기능이 손상될 수 있고 잠재적으로 치명적일 수 있다(Wong et al., Australas J. Dermatol. 40:131-134, 1999).

병인에 따라, 이러한 피부병들은 일반적으로 4가지 주요 그룹으로 분류된다: a) 항체-매개됨, b) 피부 유해 약물 반응, c) 선천성 병태, 및 d) 외부 상해(insult), 예를 들어, 화상, 마찰, 일광, 곤충 물림, 감염 및 화학 무기로 인한 수포발생. 자가 면역 피부 수포발생 질환과 관련하여, 자가-항체는 피부의 구조적 분자 또는 접착성 분자에 대해, 특정한 자가-항원의 위치에 그리고 수포 형성 수준에 따라 생성되며, 이들 질환은 표피내 및 표피하 수포발생 질환으로 추가로 분류된다. 천포창(표피내 수포발생)는, 세포-세포 부착(극세포 분리)의 상실 및 상피 접착 단백질, 예를 들어 데스모글레인, 카데린 및/또는 다른 데스모좀 단백질에 대한 특이적인 항체의 존재를 특징으로 하는 상피간 수포발생을 특징으로 한다. 표피하 수포발생 피부병, 예를 들어, 수포성 유사천포창, 포진피부염 및 표피 박리 수포에서, 표피-상피 접합부(DEJ)의 성분을 표적으로 하는 자가-항체는, 이러한 기저막의 파괴에 이어 표피의 분리를 유발한다(Baum et al., Autoimmun . Rev. 13:482-489, 2014).

박리 피부 증후군(탈락성 피부, 가족성 연속 피부 박리, 박탈 비늘증으로도 나타냄)은, 각질층(피부의 가장 바깥층)의 표피하로부터의 분리로 인해, 통증이 없고 지속적이며 자발적인 피부 박리(박탈(exfoliation))을 특징으로 하는 희귀 유전성 피부 장애 그룹을 나타낸다. 박리 피부 증후군은, 수포발생 및/또는 홍반(피부 발적) 및/또는 가려움증(소양증)을 나타낼 수도 있다. 박리 피부 증후군의 증상은 출생시 관찰되거나 유아기에 나타날 수 있다. 2가지 형태의 박리 피부 증후군이 인지되어 있다: (1) 전체 외피를 포함하는 전신 형태; 및 (2) 사지, 및 대부분 손과 발만을 포함하는 말단 형태. 말단 형태에서, 환자는 일반적으로 출생시에 또는 유아기 동안 손과 발에 수포와 미란이 발생하는데, 이는 수포발생 피부 장애인 표피 박리성 단순 수포를 연상시킨다.

수포발생 피부 장애는 피부 및/또는 점막의 수포발생 및 미란을 포함하는 희귀 피부 질환 그룹이다. 수포발생 피부 질환의 유형은 다음을 포함한다: (1) 자가면역 수포발생 질환, 예를 들어, 수포성 유사천포창, 약물-유발 천포창, 풍토성 천포창, 홍반천포창, 증식천포창, 보통천포창, 낙엽천포창, 부신생물 천포창, 점막 유사천포창, 수포성 표피 박리증, 선상 IgA 질환, 수포성 루푸스, 포진피부염 및 (2) 유전성 수포발생 질환, 예를 들어, 단순 수포성 표피 박리증, 접합부 수포성 표피 박리증, 이영양성 수포성 표피 박리증, 및 후천성 수포성 표피 박리증을 포함하는 수포성 표피 박리증(EB). 피부가 화장품, 세제, 용매 또는 다른 화학 물질, 예를 들어 페루 발삼, 황산니켈 또는 우루시올(독성 참나무, 독성 옻나무, 독성 아이비)과 접촉되는 경우 종종 피부가 수포발생된다. 수포는, 곤충 물림, 곤충의 추출물 또는 찔림으로 인한 알러지 반응으로 인해서도 발생된다. 화학전 제제(즉, 블리스터제) 또는 발포제도, 피부와 접촉될 때마다(예를 들어, 머스타드 가스) 대형의 고통스러운 수포를 유발할 수 있다. 칸타리딘과 같은 발포제를 방출하는 여러 종류의 딱정벌레와 접촉한 후에도 수포발생이 일어날 수 있다. 이러한 수포발생은 수포발생 딱정벌레 피부염 또는 페데러스 피부염과 관련이 있다.

진피-표피 접합부(DEJ)는, 표피와 진피 사이의 특수한 기저막으로서, 피부의 완전성 및 기능을 위한 중요한 목적을 제공한다. 진피-표피 접합부(DEJ)는 표피의 기저층과 진피의 유두상층 사이에 단단한 고정(anchorage)을 제공하면서, 이들 두 층 사이의 세포 교환 및 분자 교환 동안의 선택적 필터로서 작용한다. 또한, DEJ와 표피의 기저층과의 상호 작용은, 기저 각질 세포의 극성을 결정하여, 딸 세포가 상부층을 향해 이동하는 동안 기저 각질 세포에 부착된 증식 세포를 유지시킨다.

구조적으로, DEJ는 4개의 구역으로 나뉠 수 있다: 1) 기저 표피 세포막, 2) 투명판(lamina lucida), 3) 치밀판(lamina densa) 및 4) 원섬유성 구역(유두상 진피). 첫 번째 층은 기저 각질 세포막 및 헤미데스모좀(hemidesmosome)이라는 이의 특수한 접합 구조로 표현되는데, 헤미데스모좀은 각질 세포 세포 골격을 막횡단 단백질인 α6/β4 및 α3/β1 인테그린, 및 콜라겐 XVII을 통해 투명판에 연결한다. 투명판에서, 이러한 단백질들은 케라틴 세포 골격을, 주로 라미닌-5로 구성되는 고정 필라멘트에 연결시킨다. 이러한 고정 필라멘트들은 차례로, 니도겐 및 페를레칸을 통해 치밀판의 주요 성분인 콜라겐 IV에 결합한다. DEJ의 마지막 접합부는 치밀층의 성분들과 원섬유성 구역의 고정 원섬유들 사이의 결합으로 나타난다. Burgeson and Christiano, Curr . Opin . Biol . 9:651-658, 1997; Aumailley and Rousselle Matrix Biol. 18(1):19-28, 1999.

고정 원섬유는, DEJ의 구조적 완전성을 위한 비-원섬유성 콜라겐 수단인 콜라겐 VII로 거의 독점적으로 구성된다. 유전자 COL7A1에 의해 암호화되는 콜라겐 VII은 3개의 α1 쇄들의 동종 삼량체이고, C-말단 비-콜라겐성 도메인 2(NC-2) 및 N-말단 비-콜라겐성 도메인 1(NC)에 의해 측면에 위치된 하나의 중앙 콜라겐성 도메인으로 구성된다. N-말단 비-콜라겐성 도메인 1은 접착 단백질에 대해 높은 상동성을 갖는 다수의 하위 도메인을 포함한다: 1개의 연골 매트릭스 단백질 유사 도메인(CMP), 9개의 피브로넥틴 유사 도메인(FNIII) 및 1개의 폰-빌레브란트-인자-A(von-Willebrand-factor-A) 유사 도메인(vWFA2)(Leineweber et al., Febs Lett . 585:1748-1752, 2011). 이들 도메인 중에서, FNIII 영역은 몇몇 ECM 성분들과의 상호 작용에 대하여 중요하다. NC1 영역의 재조합 버전을 사용한 연구는, FNIII 도메인과, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 라미닌-5 및 피브로넥틴의 강한 결합 친화도를 밝혀냈다. Chen et al., J. Biol. Chem. 272:14516-14522, 1997; Chen et al., J. Invest. Dermatol . 112:177-183, 1999. 상기 영역이, 라미닌-5 및 콜라겐 IV에 대한 FNIII 결합을 통해 유두상 진피를 치밀판에 고정시킨다.

진피와 표피 사이의 첫 번째 부착 지점으로서의 역할로 인해, 콜라겐 VII의 모든 구조적 변형 또는 기능적 손상은 이의 결과인 표피 박리 및 수포발생으로 DEJ를 파괴시킨다. 콜라겐 VII의 돌연변이 또는 콜라겐 VII에 대한 자가 항체의 생성은, 이영양성 표피 박리 수포 및 후천성 표피 박리 수포 각각의 주요 원인이다. 이러한 병태는 광범위한 표피 분리 및 수포 형성을 특징으로 한다. Has, Curr . Top. Membr . 76:117-170, 2015.

FNIII-2 도메인에서의 잔기 D390 이후의 콜라겐 VII의 그랜자임 B(GzmB)-매개 절단이 본원 명세서에 나타내어진다. 또한, 특정한 GzmB 억제제 화합물 A 및 화합물 20에 의한 이러한 절단의 억제(Willoughby et al., Bioorg . Med . Chem . Lett ., 12:2197-2200, 2002)도 본원 명세서에서 입증된다. 이러한 관찰은 원섬유성 구역/치밀판 연결의 붕괴에서 그리고 따라서 표피의 분리에서의 GzmB를 포함한다. 이러한 GzmB-매개 DEJ 붕괴는, 자가 면역/유전 장애 동안뿐만 아니라, 화상, 벌레 물림 및 방사선의 결과로서의 피부의 수포발생 염증성 사건(event) 동안에도 발생할 수 있다.

또한, 주요 콜라겐 및 라미닌 결합 단백질인 α6/β4 인테그린은 본원 명세서에서 GzmB에 대한 기질로 확인되었다. 상기 인테그린의 중요성에 대한 증거는, 동물 모델 및 심각하고 종종 치명적인 인간 수포발생 질환 둘 다로부터 기인한다. 동형 접합 β4 널 마우스는 출생 직후 사망하여, 표피의 광범위한 분리를 나타낸다. 이러한 β4 결핍-유도 DEJ 붕괴는 각질 세포의 기저 표면에서 헤미데스모좀의 형성 장애의 결과로서, 상기 인테그린이 전적으로 접착 역할을 하지는 않지만, 헤미데스모좀의 어셈블리(assembly)에 대해서도 중요하다는 것을 시사한다(van der Neut et al., Nat. Genet. 13:366-369, 1996).

인간에서, α6/β4와 관련된 인테그린 복합체의 돌연변이 및 결핍, 및 α6/β4에 대한 자가 항체의 생성은, 광범위한 점액성 수포발생 및 피부외 병발을 특징으로 하는 잠재적으로 치명적인 표현형을 유발할 수 있다. 여러 연구는, 유문관 폐쇄증(JEB-PA)을 갖는 접합성 표피 박리성 수포, 접합성 표피 박리성 중증 수포, 및 비-치명성 접합성 표피 박리성 수포의 영향을 받는 환자에서, α6/β4, 인테그린을 코딩하는 유전자의 돌연변이(Pulkkinen et al., Hum. Mol . Genet. 6:669-674, 1997; Ruzzi et al., J. Clin. Invest. 99:2826-2831, 1997; Vidal et al., Nat. Genet. 10:229-234, 1995) 또는 서브 유닛들 중 하나의 단백질 수준에서의 β4의 부재(Niessen et al., J. Cell Sci . 109:1695-1706, 1996)를 확인했다. 필립스(Phillips) 등은, β4의 특정한 에피토프에 대한 하나의 항체가 상기 환자들의 피부 섹션에서 DEJ 수준에서의 면역 반응성을 나타냈지만, 상이한 에피토프에 대한 다른 항체는 그렇지 않은 것으로 보고했다(Histopathology 24:571-576, 1994). 이들은 아직 확인되지 않은 프로테아제에 의한 원위치(in situ) 단백질 분해성 절단이 면역 반응성의 상실을 담당할 것으로 추측했다.

유사천포창은 피부 발진, 및 다리, 팔 및 복부의 수포발생을 특징으로 하는 자가 면역 질환군(family)이다. 경구 유사천포창 및 흉터성 유사천포창 환자에서 α6 및 β4 서브-유닛 둘 다에 대한 자가 항체가 검출되었다(Sami et al., Clin. Exp. Immunol. 129:533-540, 2002; Leverkus et al., Br. J. Dermatol. 145:998-1004, 2001). α6/β4 인테그린 및 콜라겐 VII의 돌연변이는 수포발생 피부 질환과 관련이 있다. 이러한 돌연변이는 이들 단백질의 구조를 변경시켜, DEJ를 GzmB 절단에 대하여 취약하게 하고/취약하게 하거나, 상기 단백질 분해 활성은 자가 면역 병태를 야기하거나 악화시킬 수 있는 자가 항원을 생성할 수 있다.

수포발생 및 박리 치료제의 발전에도 불구하고, 피부 박리 및/또는 수포발생을 예방 및/또는 치료하는데 사용하기 위한 새로운 치료제 및 개선된 제형에 대한 요구가 존재한다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시키고 추가의 관련된 이점들을 제공하고자 한다.

본 발명은, 수포발생 및 피부 박리를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 상기 조성물은 GzmB 억제제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

일 양태에서, 본 발명은, 피부 박리 및/또는 수포발생을 예방하는데 효과적인 GzmB 억제제 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은, 4-(((2S,3S)-1-((2-((S)-5-(((2H-테트라졸-5-일)메틸)카바모일)-3-사이클로헥실-2-옥소이미다졸리딘-1-일)-2-옥소에틸)아미노)-3-메틸-1-옥소펜탄-2-일)아미노)-4-옥소부탄산(화합물 A의 양태) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 약제학적으로 허용되는 담체와의 조합을 포함하는, 피부 박리 및/또는 수포발생을 위한 제형을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 피부 박리 및/또는 수포발생의 치료 방법이 제공된다. 상기 방법에서, GzmB 억제제 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 조성물이, 상기 조성물을 필요로 하는 대상체에게 투여된다.

추가의 양태에서, 본 발명은 피부 박리 및/또는 수포발생의 예방 방법을 제공한다. 상기 방법에서, GzmB 억제제 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 조성물이 손상된 피부에 투여된다.

본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명은 GzmB 억제제를 피하 또는 피내 전달하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법에서, GzmB 억제제 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 조성물이 피부에 투여된다.

상기 방법에서, 조성물은, GzmB 억제제 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하는 겔 또는 용액으로서 제형화될 수 있다. 겔은 경구 또는 국소 투여될 수 있고, 용액은 국소 또는 주사에 의해 투여될 수 있다.

또 다른 양태에서, 약제학적으로 허용되는 담체와 조합된 GamB 억제제 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은, 정맥 내, 근육 내, 비강 내, 경구, 경막 내 또는 점막 등으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 정제, 캡슐제, 겔 또는 용액 형태일 수 있다.

본 발명의 상기 양태들 및 다수의 수반되는 이점들은, 첨부 도면과 관련하여 다음의 상세한 설명을 참조하여 보다 잘 이해됨에 따라, 보다 쉽게 이해될 것이다.
도 1은, 새로운 인간 피부에 대한 GzmB(200nM)의 첨가 및 DEJ의 분리를 도시한다. 정상 피부 및 비히클-처리된 피부가 처음 두 패널에 도시된다. 화살표는 GzmB-처리된 피부에서의 진피로부터의 표피의 분리를 나타낸다. 복부 전체 두께의 피부를 선택적 성형 수술로부터 얻어, 절제 직후에 사용했다. 소형 단편(0.2x0.4mm)을 10% 포르말린에 즉시 고정시킨 반면(본래(native) 피부), 다른 단편은 200nM GzmB을 포함하는 300μL의 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 200nM GzmB를 포함하지 않는 300μL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 배치했다. 이후, 샘플을 37℃에서 24시간 동안 수욕에서 항온배양했다. 항온배양 후, 상기 피부를 표준 방법을 사용하여 10% 포르말린에서 고정시키고, 파라핀 포매하고(embedded), 절단하고(5μm), 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색했다.
도 2는, 새로운 인간 피부에 대한 GzmB(100nM)의 첨가 및 DEJ의 분리를 도시한다. 정상 피부 및 비히클-처리된 피부가 처음 두 패널에 도시된다. 화살표는 진피로부터의 표피의 분리를 나타낸다. 복부 전체 두께의 피부를 선택적 성형 수술로부터 얻어 즉시 사용했다. 소형 단편(0.2x0.4mm)을 GzmB을 포함하는 300μL의 PBS 또는 GzmB를 포함하지 않는 300μL의 PBS에 배치했다. 이후, 샘플을 37℃에서 24시간 동안 수욕에서 항온배양했다. 항온배양 후, 상기 피부를 표준 방법을 사용하여 10% 포르말린에서 고정시키고, 파라핀 포매하고, 절단하고(5μm), H&E으로 염색했다.
도 3은, GzmB가 콜라겐 VII를 절단하는 것을 입증한다. GzmB 억제제(세르핀 A3N, 화합물 20, 화합물 A)의 첨가는 GzmB-매개 콜라겐 VII의 절단을 예방했다. 단편을 나타내는 밴드가 표지된다. GzmB 절단 검정을 40μL의 PBS에서 실시했다. 간략하게는, 콜라겐 VII(500ng)을 200mM의 GzmB와 함께 37℃에서 24시간 동안 항온배양했다. 억제를 위해, 콜라겐 VII의 첨가 전에, GzmB를 37℃에서 1시간 동안 화합물 20, 세르핀 A3N 및 화합물 A와 함께 항온배양했다. 24시간 후, 모든 샘플을 10% SDS-PAGE에 로딩하고, PVDF 막에 블롯팅하고, 콜라겐 VII(토끼 항-콜라겐 VII, Abcam plc)에 특이적인 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 항온배양한 후, 2차 표지된 항-토끼 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 항온배양했다.
도 4는, 콜라겐 VII 구조의 그래픽 예시이다. GzmB는 FNIII 도메인 2의 잔기 D390 이후를 절단한다. FN-유사 도메인은 세포외 매트릭스와의 콜라겐 VII 상호 작용을 담당한다. GzmB에 대한 콜라겐 VII 내의 절단 자리는, 클라이펠트(Kleifeld) 등에 의해 이전에 설명된 방법(Nat. Biotechnol . 28:281-288. doi: 10.1038/nbt.1611, 2010)을 사용하는 TAILS 분석을 사용하여 측정했다. 간단하게는, 콜라겐 VII를 200nM의 GzmB와 함께 37℃에서 24시간 동안 항온배양했다. N-말단은 차등적으로 표지되고, 변성되고, 차단되었다. 이후, 샘플들을 트립신과 함께 항온배양하여 트립신 펩티드를 생성한 후, 아민-반응성 중합체 HPG-ALD를 표지된 펩티드로 음성 풍부화하여, GzmB-절단 자리를 확인했다.
도 5는 콜라겐 VII의 면역 염색(immunostaining)을 도시한다. 화살표는 콜라겐 VII 염색을 나타낸다. GzmB 피부 절단 검정 및 파라핀 포매를 도 1 및 2에 대해 설명된 바와 같이 실시했다. 이어서, 5μm 섹션들을 탈파라핀화하고, 카렌자임 I: 트립신 키트(BioCare Medical)를 사용하여 15분 동안 트립신으로 효소 항원 복구(antigen retrieval)했다. 이후, 슬라이드를, 1시간 동안 트리스 완충 식염수(TBS) 중 10% 염소(goat) 혈청으로 차단하고, 토끼 항-콜라겐 VII 항체(Abcam plc)와 함께 4℃에서 밤새 항온배양했다. 이후, 모든 슬라이드를 2차 바이오티닐화 항체와 함께 항온배양하고, 제조사의 지침에 따라 DAB 염색을 실시했다.
도 6은, α6β4의 GzmB 절단을 도시한다. GzmB 억제제(화합물 20, 세르핀 A3N 및 화합물 A)를 사용했다. GzmB 절단 검정을 40μL의 PBS에서 실시했다. 간단하게는, α6β4(500ng)를 200nM의 GzmB와 함께 37℃에서 24시간 동안 항온배양했다. 억제를 위해, GzmB를 화합물 20, 세르핀 A3N 및 화합물 A와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온배양한 후, α6β4 인테그린을 첨가했다. 24시간 후, 모든 샘플을 10% 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하고, 1.5시간 동안 전기 영동에 의해 분리했다. 이어서, 쿠마시 염색으로 염색하여, 밴드를 시각화했다.
도 7은, GzmB가, TJ 단백질, JAM-A, AJ 단백질, E-카드헤린 및 데스모좀, Dsg-1 및 Dsg-3을 포함하는 세포-세포 접착 단백질을 절단하는 것을 입증한다. 각각의 단백질을 2시간 동안 GzmB와 함께 항온배양한 후, SDS-PAGE를 통해 분리하여 절단 단편들을 확인했다. 5개의 단백질 모두는, 단백질 단독 또는 GzmB+화합물 20 억제제에 비해 GzmB와 함께 배양되는 경우, 전체 단백질의 감소 및 단편화의 증가를 보였다. E-카드헤린 및 Dsg-1은, 100nM GzmB를 사용하여 전체 단백질의 거의 완전한 손실을 보인 반면, JAM-A, ZO-1 및 Dsg-3은 GzmB 처리 후에도 전체 단백질이 여전히 검출가능했기 때문에 보다 적은 절단을 보였다.
도 8a 내지 8c는, GzmB 억제제인 화합물 A가 수포발생을 예방한다는 증거를 제공한다. 수포발생을 유도하기 위해, 스틸 막대를 6초 동안 100℃로 가열하여 마우스를 화상 손상에 노출시켰다. 2개의 독립적인 실험을 실시했다: 도 8a에서, 화합물 A를 30일 동안 매일 첨가했다. 상기 도면은 식염수-처리된 피부에서 수포를 형성하는, 표피의 진피로부터의 분리를 도시한다. 화합물 A-치료된 피부에서의 수포발생이 예방된다. 도 8b에서, PBS(3.6mg/mL) 중의 화합물 A를 피하 주사로 매일 투여하고, 화합물 A를 겔(3.6mg/mL)로 국소 도포에 의해 매일 투여했다. 제형들 둘 다에서의 화합물 A는 식염수-단독 처리(피하 주사로 매일 투여)와 비교하여 수포발생을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 도 8c에서, 국소 도포를 통해 매일 투여되는 겔(3.6mg/mL)로서의 화합물 A는, 겔 단독(국소 도포에 의해 매일 투여됨)에 비해 수포발생을 감소시켰다.
도 9는, 본 발명의 제형 및 방법에서 유용한 대표적인 화합물을 제조하기 위한 대표적인 합성 경로(P1로부터 출발하는 P5-P4-P3-P2-P1)의 개략도이다.
도 10은, 본 발명의 제형 및 방법에서 유용한 대표적인 화합물을 제조하기 위한 또 다른 대표적인 합성 경로(P5로부터 출발하는 P5-P4-P3-P2-P1)의 개략도이다.
도 11은, 본 발명의 제형 및 방법에서 유용한 대표적인 화합물을 제조하기 위한 추가의 대표적인 합성 경로(P1 또는 P5 이외의 성분으로부터 출발하는 P5-P4-P3-P2-P1)의 개략도이다.
도 12a 및 12b는, GzmB 수준이 표피하 DEJ의 수포발생 질환의 상승을 입증한다. 도 12a는, 상단 열에, 건강한 피부, 수포성 유사천포창(BP), 포진피부염(DH), 및 후천성 수포성 표피 박리증(EBA)의 H&E 염색의 대표적인 이미지를 도시한다. 하단 열에는, 건강한 피부, 수포성 유사천포창(BP), 포진피부염(DH), 및 후천성 수포성 표피 박리증(EBA) 생검의 GzmB 면역 염색이 도시된다. 풍부한 GzmB가, 특히 표피 분리 영역(회색 화살표 머리)에서의 병든 피부의 진피-표피 접합부 수준에서 관찰된다. 점선은 표피와 진피 사이의 분리를 나타낸다. 스케일 바는 200μm를 나타낸다. 도 12b는, 상단 열에, 수포성 유사천포창(BP), 포진피부염(DH), 및 후천성 수포성 표피 박리증(EBA)의 H&E 염색의 대표적인 이미지를 도시한다. 하단 열에는, 동일한 조직 섹션에 대한 GzmB 염색이 제공된다. 모든 병태에서, 연구된 GzmB는 호중구(회색 원)와 함께 공-국소화된다. 스케일 바는 40μm를 나타낸다.
도 13a 내지 13c는, α6 인테그린이 GzmB의 기질이고, 표피하 수포발생 동안 감소되는 것을 입증한다. 도 13a는, 억제제 세르핀 A3N(SA3N) 및 화합물 20(Com20)을 포함하는 α6 인테그린(α6 int) 서브 유닛 및 억제제 세르핀 A3N(SA3N) 및 화합물 20(Com20)을 포함하지 않는 α6 인테그린(α6 int) 서브 유닛의 GzmB-매개 절단의 4 내지 20% SDS-PAGE 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 흑색 화살표는 절단 단편들을 나타내고, *는 전장 단백질을 나타낸다. 200nM의 농도에서, GzmB는 절단 밴드들을 생성하고, 이러한 절단은 GzmB 억제제에 의해 예방된다. 도 13b는, α6 인테그린에 대한 세포외 도메인 개략도를 도시한다. GzmB 매개 절단 자리가, β-프로펠러 영역에서 리간드-결합 도메인 내에 있는 ATOM(회색 화살표)에 의해 단백질체학적으로 확인되었다. GzmB, 그랜자임 B; TM, 막횡단 나선. 도 13c는, 건강한 피부, 수포성 유사천포창(BP), 포진피부염(DH), 및 후천성 수포성 표피 박리증(EBA) 생검의 α6 인테그린 면역 염색을 나타낸다. 회색 화살표 머리는 진피-표피 접착 영역에서의 온전한 α6 인테그린을 나타내고, 흑색 화살표 머리는 약한 염색 또는 염색의 부재를 나타낸다. 점선은 표피와 진피 사이의 분리를 나타낸다. 스케일 바는 200μm를 나타낸다.
도 14a 내지 14c는, GzmB에 의한 β4 인테그린 절단 및 건강한 피부 대 표피하 수포발생 병태를 나타낸다. 도 14a는, 억제제 세르핀 A3N(SA3N) 및 화합물 20(Com20)을 포함하는 β4 인테그린(β4 int) 서브 유닛 및 억제제 세르핀 A3N(SA3N) 및 화합물 20(Com20)을 포함하지 않는 β4 인테그린(β4 int) 서브 유닛의 GzmB-매개 절단의 4 내지 20% SDS-PAGE 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 흑색 화살표는 절단 단편들을 나타내고, *는 전장 단백질을 나타낸다. 200nM의 농도에서, GzmB는 절단 밴드들을 생성하고, 이러한 절단은 GzmB 억제제들 둘 다에 의해 예방된다. 도 14b는, β4 인테그린에 대한 세포외 도메인 개략도를 도시한다. ATOM에 의해 단백질체학적으로 확인된 GzmB 매개 절단 자리(회색 화살표)가, 특이성-결정 루프에서의 리간드-결합 도메인에 속한다. GzmB(그랜자임 B); PSI(플렉신-세마포린-인테그린); VWFA(폰 빌레브란트 인자 A); CRR(시스테인-풍부 영역); TM(막관통 나선); FNIII(피브로넥틴-유사 III 도메인). 도 14c는, 건강한 피부, 수포성 유사천포창(BP), 포진피부염(DH), 및 후천성 수포성 표피 박리증(EBA) 생검의 β4 인테그린 면역 염색을 도시한다. 회색 화살표 머리는 진피-표피 접착 영역에서의 온전한 β4 인테그린을 나타내고, 흑색 화살표 머리는 약한 염색 또는 염색의 부재를 나타낸다. 점선은 표피와 진피 사이의 분리를 나타낸다. β4 인테그린은 접착에 대하여 결정적인 것으로 보인다: 수포성 유사천포창 샘플에서, 우측 하단 모서리의 진피 피부판(flap)이 표피에 부착되어 강한 β4 염색을 나타내고, 상기 영역은 희미한 β4 인테그린 염색을 갖는 분리된 표피에 의해 양태에 존재한다. 스케일 바는 200μm를 나타낸다.
도 15a 내지 15c는, GzmB-매개 콜라겐 VII 절단 및 건강한 피부 대 표피하 수포발생의 조직 평가를 도시한다. 도 15a는, 억제제 세르핀 A3N(SA3N) 및 화합물 20(Com20)을 포함하는 콜라겐 VII(coll VII) 및 억제제 세르핀 A3N(SA3N) 및 화합물 20(Com20)을 포함하지 않는 콜라겐 VII(coll VII)의 GzmB-매개 절단의 10% SDS-PAGE 웨스턴 블롯을 도시한다. 흑색 화살표는 절단 단편들을 나타내고, *는 전장 단백질을 나타낸다. GzmB는 절단 밴드들을 생성하고, 이러한 절단은 Com20의 첨가에 의해 감소되고 S3AN에 의해 상실된다. 도 15b는, 콜라겐 VII에 대한 세포외 도메인 개략도를 도시한다. ATOM에 의해 단백질체학적으로 확인된 GzmB 매개 절단 자리(회색 화살표)는 폰 빌레브란트 인자 A 및 피브로넥틴 유형 III-2 도메인에 속하며, 이들은 다른 진피-표피 접합 성분, 예를 들어, 라미닌 및 콜라겐 IV; Coll VII, 콜라겐 VII; GzmB, 그랜자임 B; 비-콜라겐 영역인 NC; CMP, 연골 매트릭스 단백질; VWFA, 폰 빌레브란트 인자 A; 피브로넥틴-유사 III 도메인인 FNIII; VWFA2, 폰 빌레브란트 인자 A 2; Pi, 단백질 억제제에 대한 콜라겐 VII의 부착을 매개한다. 도 15c는, 건강한 피부, 수포성 유사천포창(BP), 포진피부염(DH), 및 후천성 수포성 표피 박리증(EBA) 생검의 콜라겐 VII 면역 염색을 도시한다. 콜라겐 VII f라이닝(lining)은 건강한 피부에서는 손상되지 않았지만(회색 화살표 머리), 병에 걸린 샘플(검은 화살표 머리)에서는 약한 면역 반응성이 관찰되거나 면역 반응성이 부재했다. 점선은 표피와 진피 사이의 분리를 나타낸다. 스케일 바는 200μm를 나타낸다.
도 16a 및 16b는, 콜라겐 XVII가 GzmB에 의해 절단되고, 수포발생 피부 생검에서 표피 분리 영역에 존재하지 않는 것을 도시한다. 도 16a는, 억제제 세르핀 A3N(SA3N) 및 화합물 20(Com20)을 포함하는 콜라겐 XVII(coll XVII) 및 억제제 세르핀 A3N(SA3N) 및 화합물 20(Com20)을 포함하지 않는 콜라겐 XVII(coll XVII)의 GzmB-매개 절단의 8% SDS-PAGE 웨스턴 블롯을 도시한다. 흑색 화살표는 절단 단편들을 나타내고, *는 전장 단백질을 나타낸다. GzmB는 절단 밴드를 생성하고, 이러한 절단은 Com20 또는 S3AN의 첨가에 의해 상실된다. 도 16b는, 건강한 피부, 수포성 유사천포창(BP), 포진피부염(DH), 및 후천성 수포성 표피 박리증(EBA) 생검의 콜라겐 XVII 면역 염색을 도시한다. 콜라겐 XVII 라이닝은, 건강한 피부에서는 손상되지 않았지만(회색 화살표 머리), 병에 걸린 샘플(검은 화살표 머리)에서는 약한 면역 반응성이 관찰되거나 면역 반응성이 부재했다. 점선은 표피와 진피 사이의 분리를 나타낸다. 스케일 바는 200μm를 나타낸다.
도 17은, GzmB가 DEJ 분리를 유도하는 것을 입증한다. 건강한 피부의 H&E 염색을, PBS, 200nM GzmB 또는 100μM 화합물 20(Com20)으로 예비 불활성화된 200nM GzmB에서 37℃에서 12시간 동안 항온배양했다. 표피와 진피 사이의 틈(cleft)(흑색 화살표 머리)을 GzmB-처리된 샘플에서 관찰했지만, PBS 대조군 및 GzmB가 Com20에 의해 억제된 샘플에는 부재했다. 스케일 바는 200μm를 나타낸다.
도 18a 내지 18i는, 다양한 위치에서의 α4 인테그린의 그랜자임 B 절단 자리로부터의 네오 N-말단 펩티드를 확인하는, 부연설명된 MS/MS 스펙트럼을 제공한다. 도 18a는, Asp110↓Asn101에서의 절단 자리를 나타내고; 도 18b는 Asp166↓Met167에서의 절단을 나타내고; 도 18c는 Asp199↓Phe200에서의 절단 자리를 나타내고; 도 18d는 Asp302↓Ser303에서의 절단 자리를 나타내고; 도 18e는 Asp311↓Glu312에서의 절단 자리를 나타내고; 도 18f는 Asp358↓Val359에서 절단 자리를 나타내고; 도 18g는 Asp482↓Arg483에서의 절단 자리를 나타내고; 도 18h는 Asp488↓Val489에서의 절단을 나타내고; 도 18i는 Glu856↓Gln857에서의 절단 자리를 나타낸다.
도 19a 내지 19g는, 다양한 위치에서의 β4 인테그린의 그랜자임 B 절단 자리로부터의 네오 N-말단 펩티드를 확인하는, 부연설명된 MS/MS 스펙트럼을 제공한다. 도 19a는 Glu223↓Arg224에서의 절단 자리를 나타내고; 도 19b는 Asp237↓Ala238에서의 절단 자리를 나타내고; 도 19c는 Asp272↓Gly273에서의 절단 자리를 나타내고; 도 19d는 Asp351↓Ser352에서의 절단 자리를 나타내고; 도 19e는 Asp442↓Gly443에서의 절단 자리를 나타내고; 도 19f는 Asp447↓Ala448에서의 절단 자리를 나타내고; 도 19g는 Asp611↓Ala612에서의 절단 자리를 나타낸다.
도 20은, 200nM 그랜자임 B가 포함되지 않은 콜라겐 I 및 200nM 그랜자임 B가 포함된 콜라겐 I의 7.5% SDS-PAGE 쿠마시 염색을 도시한다. 흑색 화살표는 130kDa에서 검출된 전장 단백질을 나타내고, 다른 밴드들은 콜라겐 I 스플라이스 변이체 및 이소형을 나타낸다. 그랜자임 B의 첨가는 절단 밴드들의 출현을 초래하지 않는다. Coll I, 콜라겐 I(CollI); 그랜자임 B(GzmB).
도 21a 내지 21d는, 다양한 위치에서의 콜라겐 VII의 그랜자임 B 절단 자리로부터의 네오 N-말단 펩티드를 확인하는, 부연설명된 MS/MS 스펙트럼을 도시한다. 도 21a는 Asp193↓Phe194에서의 절단 자리를 나타내고, 도 21b는 Glu332↓Leu333에서의 절단 자리를 나타내고, 도 21c는 Asp390↓Tyr391에서의 절단 자리를 나타내고, 도 21d는 Asp414↓Ala415에서의 절단 자리를 나타낸다.
도 22a 내지 도 22c는, 화합물 A가 그랜자임 B에 의해 α6β4 인테그린, 니도겐-2 및 콜라겐 VII의 절단을 예방할 수 있는 것을 보여준다. 도 22a는, 그랜자임 B 억제제 화합물 A를 포함하는 α6β4 인테그린 및 그랜자임 B 억제제 화합물 A를 포함하지 않는 α6β4 인테그린의 GzmB-매개 절단의 쿠마시 염색을 도시한다. 재조합 인간 인테그린 α6/β4(α6 aa 24-878, β4 aa 28-710)를 200nM 정제된 인간 GzmB에서 37℃에서 24시간 동안 항온배양했다. 억제 연구를 위해, 반응에 기질을 첨가하기 전에, GzmB를 100μM의 화합물 A의 존재하에 37℃에서 1시간 동안 항온배양했다. 24시간의 항온배양 후, 단백질을 변성시키고, 4 내지 20% SDS-PAGE 겔(α6/β4의 경우)에서 분리했다. 표준 쿠마시 염색을 사용하여 절단을 나타냈다(도 22a). 도 22b는, 억제제 화합물 A를 포함하는 니도겐-2 및 억제제 화합물 A를 포함하지 않는 니도겐-2의 GzmB-매개 절단의 웨스턴 블롯을 도시한다. 흑색 화살표는 절단 단편들을 나타내고, *는 전장 단백질을 나타낸다. 200nM의 농도에서, GzmB는 절단 밴드들을 생성하고, 이러한 절단은 화합물 A에 의해 예방된다. 단리된 니도겐-2(아미노산 잔기 31-1375; 500ng)를 200nM의 정제된 인간 GzmB에서 37℃에서 24시간 동안 항온배양했다. 억제 연구를 위해, 반응에 기질을 첨가하기 전에, GzmB를 100μM의 화합물 A의 존재하에 37℃에서 1시간 동안 항온배양했다. 24시간의 항온배양 후, 니도겐-2 단백질을 변성시키고, 7.5% SDS-PAGE 겔에서 분리했다. 항-니도겐-2 항체(R&D Systems)에 의해 절단을 검출했다. 도 22c는, 억제제 화합물 A를 포함하는 콜라겐 VII 및 억제제 화합물 A를 포함하지 않는 콜라겐 VII의 GzmB-매개 절단의 웨스턴 블롯을 도시한다. 흑색 화살표는 절단 단편들을 나타내고, *는 전장 단백질을 나타낸다. 200nM의 농도에서, GzmB는 절단 밴드들을 생성하고, 이러한 절단은 화합물 A에 의해 예방된다. 단리된 콜라겐 VII(아미노산 잔기 199-482; 500ng)을 200nM의 정제된 인간 GzmB에서 37℃에서 24시간 동안 항온배양했다. 억제 연구를 위해, 반응에 기질을 첨가하기 전에, GzmB를 100μM의 화합물 A의 존재하에 37℃에서 1시간 동안 항온배양했다. 24시간의 항온배양 후, 콜라겐 VII을 변성시키고, 10% SDS-PAGE 겔에서 분리했다. 항-콜라겐 VII 항체(ABCAM, 온타리오주 토론토 소재)에 의해 절단을 검출했다.

본 발명은, 피부 박리 및/또는 수포발생의 치료 및/또는 예방을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 상기 조성물은 GzmB 억제제 화합물을 포함하는 제형을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에서, 조성물은 경구, 국소 또는 전신, 피하, 피내 또는 정맥 주사 등에 의해 투여된다.

피부는 표피와 진피의 두 개의 주요 층으로 구성된다. 수포는 진피 내부 또는 진피 아래의 체액의 축적물이다. 진단은 세포간 파열 위치에 따른다(Clarke et al., Color Atlas of Differential Diagnosis in Dermatopathology, P. Medical Lts., Ch 4, 2014). 일반적으로, 수포는 세 가지 유형으로 분류될 수 있다: 1) 각질하(매우 얇은 지붕, 쉽게 파열됨. 예를 들어, 농가진, 땀띠, 포도알균성 열상 피부 증후군); 2) 표피내(즉, 표피 내부에서, 얇은 지붕이 파열되어 삭박된(denuded) 표면을 남김. 예를 들어, 천포창, 수두, 단순 헤르페스, 급성 습진), 및 3) 표피하(즉, 표피 아래, 긴장된 지붕이 손상되지 않은 상태로 남아 있음. 예를 들어, 수포성 유사천포창, 포진피부염, 다형홍반 SJS/TEN, 마찰 수포). 수포발생은, 마찰, 극한 온도, 화학 물질 노출, 가스 노출, 접촉 피부염, 독소, 감염, 분쇄/핀칭, 자가 면역 및/또는 의학적 병태에 의해 발생될 수 있다.

박리는 피부 상층(표피)의 손상 및 손실을 나타낸다. 피부 박리 및/또는 수포발생은, 피부를 자극하거나 손상시키는 환경적 요인, 예를 들어, 극한 온도(뜨거운 또는 차가움), 감염, 마찰, 태양, 바람, 열, 건조 및 과도한 습도, 반복적인 자극, 화학 물질, 알러젠 또는 약물, 및 자가 면역 및 유전적 장애를 포함하는 병리학적 병태에 의해 발생될 수 있다.

병인에 따라, 이러한 피부병들은 일반적으로 4가지 주요 그룹으로 분류된다: a) 항체-매개됨, b) 피부 유해 약물 반응, c) 선천성 병태, 및 d) 외부 상해, 예를 들어, 화상, 마찰, 일광, 곤충 물림, 감염 및 화학 무기로 인한 수포발생. 자가 면역 피부 수포발생 질환과 관련하여, 자가-항체는, 피부의 구조적 분자 또는 접착성 분자에 대해, 그리고 특정한 자가-항원의 위치 및 수포 형성 수준에 따라 생성되며, 이들 질환은 표피내 및 표피하 수포발생 질환으로 추가로 분류된다. 천포창(표피내 수포발생)은, 세포-세포 부착(극세포 분리)의 상실 및 상피 접착 단백질, 예를 들어 데스모글레인, 카데린 및/또는 다른 데스모좀 단백질에 대한 항체를 특징으로 하는 상피간 수포발생을 특징으로 한다. 표피하 수포발생 피부병, 예를 들어, 수포성 유사천포창, 포진피부염 및 표피 박리 수포에서, 표피-상피 접합부(DEJ)의 성분을 표적으로 하는 자가-항체는, 이러한 기저막의 파괴 및 이어지는 표피의 분리를 유발한다(Baum et al., Autoimmun. Rev. 13:482-489, 2014).

상기와 같이, 박리 피부 증후군(탈락성 피부, 가족성 연속 피부 박리, 박탈 비늘증으로도 나타냄)은, 각질층(피부의 가장 바깥층)의 표피하로부터의 분리로 인해, 통증이 없고 지속적이며 자발적인 피부 박리(박탈)를 특징으로 하는 희귀 유전성 피부 장애 그룹을 나타낸다. 박리 피부 증후군은, 수포발생 및/또는 홍반(피부 발적) 및/또는 가려움증(소양증)을 나타낼 수도 있다. 박리 피부 증후군의 증상은 출생시 관찰되거나 유아기에 나타날 수 있다. 2가지 형태의 박리 피부 증후군이 인지되어 있다: (1) 전체 외피를 포함하는 전신 형태; 및 (2) 사지, 및 대부분 손과 발만을 포함하는 말단 형태. 말단 형태에서, 환자는 일반적으로 출생시에 또는 유아기 동안 손과 발에 수포 및 미란이 발생하는데, 이는 수포발생 피부 장애인 표피 박리성 단순 수포를 연상시킨다.

수포발생 피부 장애는 피부 및/또는 점막의 수포발생 및 미란을 포함하는 희귀 피부 질환 그룹이다. 수포발생 피부 질환의 유형은 다음을 포함한다: (1) 자가면역 수포발생 질환 예를 들어, 수포성 유사천포창, 약물-유발 천포창, 풍토성 천포창, 홍반천포창, 증식천포창, 보통천포창, 낙엽천포창, 부신생물 천포창, 점막 유사천포창, 수포성 표피 박리증, 선상 IgA 질환, 수포성 루푸스, 포진피부염, 및 (2) 유전성 수포발생 질환, 예를 들어, 단순 수포성 표피 박리증, 접합부 수포성 표피 박리증, 이영양성 수포성 표피 박리증, 및 후천성 수포성 표피 박리증을 포함하는 수포성 표피 박리증(EB). 피부가 화장품, 세제, 용매 또는 다른 화학 물질, 예를 들어 페루 발삼, 황산니켈 또는 우루시올(독성 참나무, 독성 옻나무, 독성 아이비)과 접촉되는 경우 종종 피부가 수포발생된다. 수포는, 곤충 물림, 곤충의 추출물 또는 찔림으로 인한 알러지 반응으로 인해서도 발생된다. 화학전 제제(즉, 블리스터제) 또는 발포제도, 피부와 접촉될 때마다(예를 들어, 머스타드 가스) 대형의 고통스러운 수포를 유발할 수 있다. 칸타리딘과 같은 발포제를 방출하는 여러 종류의 딱정벌레와 접촉한 후에도 수포발생이 일어날 수 있다. 이러한 수포발생은 수포발생 딱정벌레 피부염 또는 페데러스 피부염과 관련이 있다.

진피-표피 접합부(DEJ)는, 표피와 진피 사이의 특수한 기저막으로서, 피부의 완전성 및 기능을 위한 중요한 목적을 제공한다. 진피-표피 접합부(DEJ)는 표피의 기저층과 진피의 유두상층 사이에 단단한 고정을 제공하면서, 이들 두 층 사이의 세포 교환 및 분자 교환 동안의 선택적 필터로서 작용한다. 또한, DEJ와 표피의 기저층과의 상호 작용은, 기저 각질 세포의 극성을 결정하여, 딸 세포가 상부층을 향해 이동하는 동안 기저 각질 세포에 부착된 증식 세포를 유지시킨다.

구조적으로, DEJ는 4개의 구역으로 나뉠 수 있다: 1) 기저 표피 세포막, 2) 투명판, 3) 치밀판 및 4) 원섬유성 구역(유두상 진피). 첫 번째 층은 기저 각질 세포막 및 헤미데스모좀이라는 특수한 접합 구조로 표현되는데, 헤미데스모좀은 각질 세포 세포 골격을 막횡단 단백질인 α6/β4 및 α3/β1 인테그린, 및 콜라겐 XVII을 통해 투명판에 연결한다. 투명판에서, 이러한 단백질들은 케라틴 세포 골격을, 주로 라미닌-5로 구성되는 고정 필라멘트에 연결시킨다. 이러한 고정 필라멘트들은 차례로, 니도겐 및 페를레칸을 통해 치밀판의 주요 성분인 콜라겐 IV에 결합한다. DEJ의 마지막 접합부는 치밀층의 성분들과 원섬유성 구역의 고정 원섬유들 사이의 결합으로 나타난다. Burgeson and Christiano, Curr . Opin . Biol . 9:651-658, 1997; Aumailley and Rousselle Matrix Biol . 18(1):19-28.

고정 원섬유는 DEJ의 구조적 완전성을 위한 비-원섬유성 콜라겐 수단인 콜라겐 VII로 거의 독점적으로 구성된다. 유전자 COL7A1에 의해 암호화되는 콜라겐 VII은 3개의 α1 쇄들의 동종 삼량체이고, C-말단 비-콜라겐성 도메인 2(NC-2) 및 N-말단 비-콜라겐성 도메인 1(NC)에 의해 양태에 위치된 하나의 중앙 콜라겐성 도메인으로 구성된다(도 4). N-말단 비-콜라겐성 도메인 1은 접착 단백질에 대해 높은 상동성을 갖는 다수의 하위 도메인을 포함한다: 1개의 연골 매트릭스 단백질 유사 도메인(CMP), 9개의 피브로넥틴 유사 도메인(FNIII) 및 1개의 폰-빌레브란트-인자-A 유사 도메인(vWFA2). Leineweber et al., Febs Lett. 585:1748-1752, 2011. 이들 도메인 중에서, FNIII 영역은 몇몇 ECM 성분들과의 상호 작용에 대하여 중요하다. NC1 영역의 재조합 버전을 사용한 연구는, FNIII 도메인과, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 라미닌-5 및 피브로넥틴의 강한 결합 친화도를 밝혀냈다. Chen et al., J. Biol. Chem. 272:14516-14522, 1997; Chen et al., J. Invest. Dermatol . 112:177-183, 1999. 상기 영역이, 라미닌-5 및 콜라겐 IV에 대한 FNIII 결합을 통해 유두상 진피를 치밀판에 고정시킨다.

진피와 표피 사이의 첫 번째 부착 지점으로서의 역할로 인해, 콜라겐 VII의 모든 구조적 변형 또는 기능적 손상은 이의 결과인 표피 박리 및 수포발생으로 DEJ를 파괴시킨다. 콜라겐 VII의 돌연변이 또는 콜라겐 VII에 대한 자가 항체의 생성은, 이영양성 표피 박리 수포 및 후천성 표피 박리 수포 각각의 주요 원인이다. 이러한 병태는 광범위한 표피 분리 및 수포 형성을 특징으로 한다. Has, Curr . Top. Membr . 76:117-170, 2015.

GzmB는 세포 독성 림프구(CTL) 및 자연 살해(NK) 세포의 과립에서 발견되는 친-세포자멸(pro-apoptotic) 세린 프로테아제이다. GzmB는 공극 형성 단백질인 퍼포린과 함께 표적 세포를 향해 방출되어, 세포질 내로의 퍼포린-의존적 내재화 및 후속적인 세포자멸 유도를 초래한다(예를 들어, 문헌[Medema et al., Eur . J. Immunol. 27:3492-3498, 1997] 참조). 그러나, GzmB는, 다른 유형의 면역 세포(예를 들어, 비만 세포, 대식 세포, 호중구 및 수지상 세포) 또는 비-면역 세포(각질 세포, 연골 세포)에 의해 발현되고 분비될 수도 있으며, 세포외 매트릭스 리모델링 활성을 갖는 것으로 나타났다(Hiebert et al., Trends Mol . Med . 18(12):732-741). 본 발명에서, 피부에서의 GzmB 축적은 수포발생에서 발생하는 것과 유사한 진피로부터의 표피의 분리를 촉진할 수 있는 것으로 나타났다. 또한, GzmB가 진피 표피 접합(DEJ)에서 주요 접합 단백질을 절단한다는 것이 입증되었다.

많은 피부 질환에서 상승된 GzmB가 관찰된다. 도 1 및 2에서, 인간 피부에 대한 GzmB의 첨가는 진피로부터 표피의 분리를 유도하는 것으로 나타났다.

본원에 기재된 놀라운 결과에 따라, 그리고 이론에 결부되지 않으면서, 피부에서의 GzmB의 억제는, 상기 언급된 원인들로 인한 박리 또는 수포발생이 발생하기 쉬운 피부의 박리 및/또는 수포발생을 예방할 수 있는 것으로 생각된다.

일 양태에서, 본 발명은, 피부 박리 또는 수포발생을 예방 및/또는 치료하기 위한 조성물을 제공한다. 상기 조성물은, GzmB 억제제 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 및 임의로 기타 블리스터제 및/또는 상처 치유 성분 또는 화합물을 포함하는 제형을 포함한다.

본 발명의 실시에서, 본 발명의 조성물은, 현저한 완전한 피부 침투 없이 각질층의 침투에 효과적인 특정 제형을 포함할 수 있다는 것이 유리하게 밝혀졌다. 본 발명의 제형은, 경피 전달보다는 GzmB 억제제 화합물의 피부내 전달에 대해 효과적이며, 일반적으로는 치료제의 전신 투여에 대해 바람직한 특성이다. 본 발명의 조성물은, SJS/TEN 또는 경구 천포창과 같은 특정한 병태를 각각 치료하기 위해, 정맥내 투여용 또는 경구 투여용으로 제형화될 수도 있다.

GzmB 억제제 화합물

본 발명의 제형 및 방법은, 화학식 I의 GzmB 억제제 화합물, 이의 입체 이성질체, 토토머 또는 약제학적으로 허용되는 염을 사용한다.

[화학식 I]

상기 화학식 I에서,

R₁은,

(a) 1,2,3-트리아졸릴, 및

(b) 1,2,3,4-테트라졸릴로부터 선택되는 헤테로아릴 그룹이고;

n은 1 또는 2이고;

R₂는, 수소, C₁-C₆ 알킬, 및 C₃-C₆ 사이클로알킬로부터 선택되고;

R₃은,

(a) 수소,

(b) 카복실산, 카복실레이트, 또는 카복실레이트 C₁-C₈ 에스테르 그룹(-CO₂H, -CO₂ ^-, -C(=O)OC₁-C₈)으로 임의로 치환된 C₁-C₄ 알킬, 알킬헤테로아릴 그룹으로 임의로 치환된 아미드로 임의로 치환된 C₁-C₄ 알킬, 또는 헤테로아릴 그룹으로 임의로 치환된 C₁-C₄ 알킬로부터 선택되고;

Z는,

(a)

, 및

(b)

의 그룹으로부터 선택되는 아실 그룹이다.

(상기 화학식들에서,

Y는, 수소, 헤테로사이클, -NH₂ 또는 C₁-C₄ 알킬이고;

R₄는,

(i) C₁-C₁₂ 알킬,

(ii) C₁-C₆ 알킬로 임의로 치환된 C₁-C₆ 헤테로알킬,

(iii) C₃-C₆ 사이클로알킬,

(iv) C₆-C₁₀ 아릴,

(v) 헤테로사이클릴,

(vi) C₃-C₁₀ 헤테로아릴,

(vii) 아르알킬, 및

(viii) 헤테로알킬아릴로부터 선택되고;

R₅는 헤테로아릴 또는 -C(=O)-R₁₀이고,

상기 화학식에서, R₁₀은,

(i) C₆-C₁₀ 아릴, C₁-C₁₀ 헤테로아릴, 아미노, 또는 카복실산으로 임의로 치환환된 C₁-C₁₂ 알킬,

(ii) C₁-C₆ 알킬 또는 카복실산으로 임의로 치환된 C₁-C₁₀ 헤테로알킬,

(iii) C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₆-C₁₀ 아릴, 임의로 치환된 C₃-C₁₀ 헤테로아릴, 아미노, 또는 카복실산으로 임의로 치환된 C₃-C₆ 사이클로알킬,

(iv) C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₆-C₁₀ 아릴, 임의로 치환된 C₃-C₁₀ 헤테로아릴, 아미노, 또는 카복실산으로 임의로 치환된 C₆-C₁₀ 아릴,

(v) 헤테로사이클릴,

(vi) C₃-C₁₀ 헤테로아릴,

(vii) 아르알킬, 및

(viii) 헤테로알킬아릴로부터 선택된다.

특정 양태에서, 본 발명의 제형 및 방법에서 유용한 화합물은, 화학식 I의 화합물, 이의 입체 이성질체, 토토머 또는 약제학적으로 허용되는 염을 포함하며,

상기 화학식 I에서,

R₁은,

(a) 1,2,3-트리아졸릴, 및

(b) 1,2,3,4-테트라졸릴로부터 선택되는 헤테로아릴 그룹이고;

n은 1이고;

R₂는, 수소, C₁-C₆ 알킬, 및 C₃-C₆ 사이클로알킬로부터 선택되고;

R₃은,

(a) 수소,

(b) 카복실산, 카복실레이트, 또는 카복실레이트 C₁-C₈ 에스테르 그룹(-CO₂H, -CO₂ ^-, -C(=O)OC₁-C₈)으로 임의로 치환된 C₁-C₄ 알킬, 알킬헤테로아릴 그룹으로 임의로 치환된 아미드로 임의로 치환된 C₁-C₄ 알킬, 또는 헤테로아릴 그룹으로 임의로 치환된 C₁-C₄ 알킬로부터 선택되고;

Z는,

(a)

, 및

(b)

의 그룹으로부터 선택되는 아실 그룹이고,

상기 화학식들에서, R₄, R₅, 및 Y는 상기 개시된 바와 같다.

추가의 양태에서, 본 발명의 제형 및 방법에서 유용한 화합물은, 화학식 I의 화합물, 이의 입체 이성질체, 토토머 또는 약제학적으로 허용되는 염을 포함하며,

상기 화학식 I에서,

R₁은, 테트라졸 또는 트리아졸이고; n은 1이고; R₂는, 수소, C₁-C₆ 알킬, 및 C₃-C₆ 사이클로알킬로부터 선택되고; R₃은, 수소; 카복실산 또는 카복실레이트 그룹으로 치환된 C₁-C₄ 알킬; 알킬헤테로아릴 그룹으로 임의로 치환된 아미드로 치환된 C₁-C₄ 알킬; 또는 헤테로아릴 그룹으로 치환된 C₁-C₄ 알킬로부터 선택되고;

Z는,

이고;

R₁은, 테트라졸 또는 트리아졸이고; n은 1이고; R₂는, 수소, C₁-C₆ 알킬, 및 C₃-C₆ 사이클로알킬로부터 선택되고; R₃은 독립적으로, 수소; 또는 카복실산 또는 카복실레이트 그룹으로 치환된 C₁-C₄ 알킬; 알킬헤테로아릴 그룹으로 임의로 치환된 아미드로 치환된 C₁-C₄ 알킬; 또는 헤테로아릴 그룹으로 치환된 C₁-C₄ 알킬로부터 선택되고;

Z는,

이고;

상기 화학식들에서,

R₄는,

(i) C₁-C₁₂ 알킬,

(ii) C₃-C₆ 사이클로알킬,

(iii) C₆-C₁₀ 아릴, 및

(iv) C₃-C₁₀ 헤테로아릴로부터 선택되고;

R₅는 -C(=O)-R₁₀이고, 여기서, R₁₀은,

(i) C₆-C₁₀ 아릴, C₁-C₁₀ 헤테로아릴, 아미노, 또는 카복실산으로 임의로 치환된 C₁-C₁₂ 알킬,

(ii) C₁-C₆ 알킬 또는 카복실산으로 임의로 치환된 C₁-C₁₀ 헤테로알킬,

(iii) C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₆-C₁₀ 아릴, 임의로 치환된 C₃-C₁₀ 헤테로아릴, 아미노, 또는 카복실산으로 임의로 치환된 C₃-C₆ 사이클로알킬,

(iv) C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₆-C₁₀ 아릴, 임의로 치환된 C₃-C₁₀ 헤테로아릴, 아미노, 또는 카복실산으로 임의로 치환된 C₆-C₁₀ 아릴,

(v) C₃-C₁₀ 헤테로아릴로부터 선택된다;

Y는, 수소, C₁-C₄ 알킬, 또는 -NH₂이다.

또 다른 양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에서 유용한 화합물은, 화학식 II의 화합물, 이의 입체 이성질체, 토토머 또는 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다.

[화학식 II]

상기 화학식 II에서,

R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₁₀은, 화학식 I에 대한 상기와 같다.

특정 양태에서, 카복실산 또는 카복실레이트 그룹으로 치환된 C₁-C₁₂ 알킬로 정의되는 경우의 R₁₀은,

-(CH₂)_n-CO₂H(여기서, n은 2, 3, 4, 5, 또는 6이다)이고;

임의로, 하나 이상의 단일 메틸렌 탄소가 플루오로, 하이드록시, 아미노, C₁-C₃ 알킬(예를 들어, 메틸), 또는 C₆-C₁₀ 아릴 그룹으로 치환되고;

임의로, 하나 이상의 단일 메틸렌 탄소가 2개의 플루오로(예를 들어, 디플루오로, 퍼플루오로) 또는 C₁-C₃ 알킬(예를 들어, 젬-디메틸) 그룹으로 치환되고;

임의로, 하나 이상의 단일 메틸렌 탄소가, 이들이 부착되는 탄소와 함께 3, 4, 5, 또는 6원 카보사이클릭 환(예를 들어, 스피로 그룹, 예를 들어, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 및 사이클로헥실)을 형성하는 2개의 알킬 그룹으로 치환되고;

임의로, 여기서 불포화 탄소-탄소 결합(예를 들어, -CH=CH-와 같은 알케닐)으로부터 인접한 탄소 원자 또는 벤젠 환(예를 들어, 1,2-, 1,3- 및 1,4-페닐렌)을 형성하거나; 또는

카복실산 또는 카복실레이트 그룹으로 치환된 C₃-C₆ 사이클로알킬로 정의되는 경우의 R₁₀은,

(여기서, n은 1, 2, 3, 또는 4이고; 임의로, n=3 또는 4인 경우, 불포화 탄소-탄소 결합으로부터의 탄소 원자들이 인접한다(예를 들어, 사이클로펜테닐 또는 사이클로헥세닐).

특정 양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에서 유용한 화합물은, 화학식 II의 화합물, 이의 입체 이성질체, 토토머 또는 약제학적으로 허용되는 염을 포함하며,

상기 화학식 II에서,

R₁은 테트라졸 또는 트리아졸이고;

R₂는, 수소, C₁-C₆ 알킬, 및 C₃-C₆ 사이클로알킬로부터 선택되고;

R₃은, 수소; 카복실산, 카복실레이트, 또는 카복실레이트 에스테르 그룹으로 임의로 치환된 C₁-C₄ 알킬; 또는 아미드로 임의로 치환된 C₁-C₄ 알킬이고, 상기 아미드는 알킬헤테로아릴 그룹으로 임의로 치환될 수 있고;

R₄는, C₁-C₁₂ 알킬, C₃-C₆ 사이클로알킬, C₆-C₁₀ 아릴, C₃-C₁₀ 헤테로아릴, 또는 헤테로사이클릴이고;

R₁₀은, C₆-C₁₀ 아릴, C₁-C₁₀ 헤테로아릴, 아미노, 또는 카복실산으로 임의로 치환된 C₁-C₁₂ 알킬이다.

추가의 양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에서 유용한 화합물은, 화학식 II의 화합물, 이의 입체 이성질체, 토토머 또는 약제학적으로 허용되는 염을 포함하며,

상기 화학식 II에서,

R₁은, 테트라졸 또는 트리아졸이고;

R₂는, 수소, C₁-C₆ 알킬, 및 C₃-C₆ 사이클로알킬로부터 선택되고;

R₃은, 수소; 카복실산, 카복실레이트, 또는 카복실레이트 에스테르 그룹으로 임의로 치환된 C₁-C₄ 알킬로부터 선택되고;

R₄는, C₁-C₈ 알킬 또는 C₃-C₆ 사이클로알킬이고;

R₁₀은,

(a) C₆-C₁₀ 아릴(예를 들어, 페닐) 또는 C₁-C₁₀ 헤테로아릴(예를 들어, 트리아졸릴 또는 테트라졸릴)로 임의로 치환된 C₁-C₃ 알킬;

(b) -(CH₂)_n-CO₂H(여기서, n은, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다);

(c)

(여기서, n은, 1, 2, 3, 또는 4이다)로부터 선택된다.

일 양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에서 유용한 화합물은, 화학식 II의 화합물, 이의 입체 이성질체, 토토머 또는 약제학적으로 허용되는 염을 포함하며,

상기 화학식 II에서,

R₁은 테트라졸이고;

R₂는, 수소, C₁-C₆ 알킬(예를 들어, 메틸), 및 C₃-C₆ 사이클로알킬(예를 들어, 사이클로헥실)로부터 선택되고;

R₃은, 수소; 또는 카복실산, 카복실레이트, 또는 카복실레이트 에스테르 그룹(예를 들어, 카복실산, 카복실레이트, 또는 카복실레이트 에스테르 그룹으로 치환된 C₂ 알킬)으로 임의로 치환된 C₁-C₄ 알킬이고;

R₄는, C₁-C₈ 알킬(예를 들어, C₄ 알킬)이고;

R₁₀은, -(CH₂)_n-CO₂H(여기서, n은, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다(예를 들어, -(CH₂)_n-CO₂H(여기서, n은 2이다)).

화학식 II의 대표적인 화합물은 C₁-C₅를 포함한다.

추가의 양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에서 유용한 화합물은, 화학식 III의 화합물, 이의 입체 이성질체, 토토머 또는 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다.

[화학식 III]

상기 화학식 III에서,

R₁, R₂, R₃, R₄, 및 Y는 화학식 I에 대하여 상기 정의된 바와 같다.

특정 양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에서 유용한 화합물은, 화학식 III의 화합물, 이의 입체 이성질체, 토토머 또는 약제학적으로 허용되는 염을 포함하며,

상기 화학식 III에서,

R₁은 테트라졸 또는 트리아졸이고;

R₂는, 수소, C₁-C₆ 알킬, 및 C₃-C₆ 사이클로알킬로부터 선택되고;

R₃은, 수소; 카복실산, 카복실레이트, 또는 카복실레이트 에스테르 그룹으로 임의로 치환된 C₁-C₄ 알킬; 또는 아미드로 임의로 치환된 C₁-C₄ 알킬이고, 상기 아미드는 알킬헤테로아릴 그룹으로 임의로 치환될 수 있고;

R₄는, C₁-C₁₂ 알킬, C₃-C₆ 사이클로알킬, C₆-C₁₀ 아릴, C₃-C₁₀ 헤테로아릴, 또는 헤테로사이클릴이고;

Y는, 수소, C₁-C₄ 알킬, 또는 -NH₂이다.

추가의 양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에서 유용한 화합물은, 화학식 III의 화합물, 이의 입체 이성질체, 토토머 또는 약제학적으로 허용되는 염을 포함하며,

상기 화학식 III에서,

R₁은 테트라졸 또는 트리아졸이고;

R₂는, 수소, C₁-C₆ 알킬, 및 C₃-C₆ 사이클로알킬로부터 선택되고;

R₃은, 카복실산, 카복실레이트, 또는 카복실레이트 에스테르 그룹으로 임의로 치환된 C₁-C₄ 알킬이고;

R₄는,

(i) C₁-C₈ 알킬(예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필),

(ii) C₃-C₆ 사이클로알킬(즉, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실),

(iii) C₆-C₁₀ 아릴(예를 들어, 페닐),

(iv) C₃-C₁₀ 헤테로아릴(예를 들어, 티오페닐), 및

(v) 헤테로사이클릴(예를 들어, 모폴리닐)로부터 선택되고;

Y는 수소이다.

화학식 III의 대표적인 화합물은 C₆을 포함한다.

화학식 I, II 또는 III의 화합물에 대한 대표적인 치환체 R₃은 다음을 포함한다:

화학식 I, II 또는 III의 화합물에 대한 대표적인 치환체 R₄는 다음을 포함한다:

화학식 I, II 또는 III의 화합물에 대한 대표적인 치환체 R₅는 다음을 포함한다:

억제제 화합물 각각은 비대칭 탄소 중심을 함유하고, 입체 이성질체(즉, 부분 입체 이성질체 및 거울상 이성질체와 같은 광학 이성질체)를 발생시킨다. 본 발명은 이러한 부분 입체 이성질체 및 이의 라세미 및 분리된 거울상 이성질체적으로 순수한 형태를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 특정한 위치 배열(configuration)에서, 절대 입체 화학이 도시되지 않은 경우, 특정한 그룹의 상대적인 입체 화학은 "시스" 또는 "트랜스"로 묘사될 수 있는 것 또한 이해될 것이다.

본원에 기재된 화합물 중 일부는 올레핀성 이중 결합을 함유하며, 달리 명시되지 않는 한, E 및 Z 기하 이성질체 둘 다를 포함하고자 한다.

특정 화합물은 하나 이상의 토토머 형태(예를 들어, pH 환경에 따른 산 또는 염기성 형태)로 존재할 수 있다. 화합물은 이의 토토머 형태(즉, 토토머)를 포함하는 것으로 이해될 것이다.

화합물이 염기성인 경우, 염은, 무기 및 유기 산을 포함하는 약제학적으로 허용되는 비-독성 산으로부터 제조될 수 있다. 이러한 산의 예는, 아세트산, 벤젠설폰산, 벤조산, 캄포설폰산, 시트르산, 에탄설폰산, 푸마르산, 글루콘산, 글루탐산, 브롬화수소산, 염산, 이세티온산, 락트산, 말레산, 말산, 만델산, 메탄설폰산, 뮤크산, 질산, 파모산, 판토텐산, 인산, 석신산, 황산, 타르타르산, 및 p-톨루엔설폰산을 포함한다.

별도의 표시가 없는 한, 다음의 정의이다.

본원 명세서에서 사용되는 용어 "알킬"은, 모(parent) 알칸, 알켄 또는 알킨의 단일 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자를 제거함으로써 유도되는, 포화되거나 포화되지 않은 분지형, 직쇄 또는 사이클릭 1가 탄화수소 그룹을 나타낸다. 대표적인 알킬 그룹은, 메틸; 에틸 예를 들어, 에타닐, 에테닐, 에티닐; 프로필 예를 들어, 프로판-1-일, 프로판-2-일, 사이클로프로판-1-일, 프로프-1-엔-1-일, 프로프-1-엔-2-일, 프로프-2-엔-1-일(알릴), 사이클로프로프-1-엔-1-일; 사이클로프로프-2-엔-1-일, 프로프-1-인-1-일, 및 프로프-2-인-1-일; 부틸 예를 들어, 부탄-1-일, 부탄-2-일, 2-메틸-프로판-1-일, 2-메틸-프로판-2-일, 사이클로부탄-1-일, 부트-1-엔-1-일, 부트-1-엔-2-일, 2-메틸-프로프-1-엔-1-일, 부트-2-엔-1-일, 부트-2-엔-2-일, 부타-1,3-디엔-1-일, 부타-1,3-디엔-2-일, 사이클로부트-1-엔-1-일, 사이클로부트-1-엔-3-일, 사이클로부타-1,3-디엔-1-일, 부트-1-인-1-일, 부트-1-인-3-일, 및 부트-3-인-1-일 등을 포함한다. 특정 수준의 포화를 의도하는 경우, 표현 "알카닐", "알케닐" 및 "알키닐"이 사용된다. 알킬 그룹은 사이클로알킬 그룹을 포함한다. 용어 "사이클로알킬"은, 표시된 수의 탄소 원자를 갖는 모노사이클릭, 바이사이클릭 및 트리사이클릭 알킬 그룹을 나타낸다. 대표적인 사이클로알킬 그룹은, 사이클로프로필, 사이클로펜틸, 사이클로헵틸, 아다만틸, 사이클로도데실메틸 및 2-에틸-1-바이사이클로[4.4.0]데실 그룹을 포함한다. 알킬 그룹은 치환되지 않거나 또는 하기 기재된 바와 같이 치환될 수 있다.

"알카닐"은 포화된 분지형, 직쇄 또는 사이클릭 알킬 그룹을 나타낸다. 대표적인 알카닐 그룹은, 메타닐; 에타닐; 프로파닐 예를 들어, 프로판-1-일, 프로판-2-일(이소프로필), 및 사이클로프로판-1-일; 부타닐 예를 들어, 부탄-1-일, 부탄-2-일(sec-부틸), 2-메틸-프로판-1-일(이소부틸), 2-메틸-프로판-2-일(t-부틸), 및 사이클로부탄-1-일 등을 포함한다. 알카닐 그룹은 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 대표적인 알카닐 그룹 치환체는,

―R₁₄, ―OR₁₄, ―SR₁₄, ―NR₁₄(R₁₅),

―X, ―CX₃, ―CN, ―NO₂,

―C(=O)R₁₄, ―C(=O)OR₁₄, ―C(=O)NR₁₄(R₁₅), ―C(=O)SR₁₄,

―C(=NR₁₄)R₁₄, ―C(=NR₁₄)OR₁₄, ―C(=NR₁₄)NR₁₄(R₁₅), ―C(=NR₁₄)SR₁₄,

―C(=S)R₁₄, ―C(=S)OR₁₄, ―C(=S)NR₁₄(R₁₅), ―C(=S)SR₁₄,

―NR₁₄c(=O)NR₁₄(R₁₅), ―NR₁₄(=NR₁₄)NR₁₄(R₁₅), ―NR₁₄c(=S)NR₁₄(R₁₅),

―S(=O)₂R₁₄, ―S(=O)₂OR₁₄, ―S(=O)₂NR₁₄(R₁₅),

―OC(=O)R₁₄, ―OC(=O)OR₁₄, ―OC(=O)NR₁₄(R₁₅), ―OC(=O)SR₁₄,

―OS(=O)₂OR₁₄, ―OS(=O)₂NR₁₄(R₁₅), 및

―OP(=O)₂(OR₁₄)를 포함하며,

여기서, 각각의 X는 독립적으로 할로겐이고; R₁₄ 및 R₁₅는 독립적으로, 상기 정의된 바와 같이, 수소, C₁-C₆ 알킬, C₆-C₁₄ 아릴, 아릴알킬, C₃-C₁₀ 헤테로아릴, 및 헤테로아릴알킬이다.

특정 양태에서, 단일 탄소 원자 상의 2개의 수소 원자는 =O, =NR₁₂, 또는 =S로 대체될 수 있다.

"알케닐"은, 모 알켄의 단일 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자의 제거에 의해 유도되는, 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 포화되지 않은 분지형, 직쇄, 사이클릭 알킬 그룹 또는 이들의 조합을 나타낸다. 상기 그룹은 이중 결합(들)에 대한 시스 또는 트랜스 위치 배열일 수 있다. 대표적인 알케닐 그룹은, 에테닐; 프로페닐 예를 들어, 프로프-1-엔-1-일, 프로프-1-엔-2-일, 프로프-2-엔-1-일 (알릴), 프로프-2-엔-2-일, 및 사이클로프로프-1-엔-1-일; 사이클로프로프-2-엔-1-일; 부테닐 예를 들어, 부트-1-엔-1-일, 부트-1-엔-2-일, 2-메틸-프로프-1-엔-1-일, 부트-2-엔-1-일, 부트-2-엔-1-일, 부트-2-엔-2-일, 부타-1,3-디엔-1-일, 부타-1,3-디엔-2-일, 사이클로부트-1-엔-1-일, 사이클로부트-1-엔-3-일, 및 사이클로부타-1,3-디엔-1-일 등을 포함한다. 알케닐 그룹은 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 대표적인 알케닐 그룹 치환체는,

―R₁₄,

―X, ―CX₃, ―CN,

―C(=O)R₁₄, ―C(=O)OR₁₄, ―C(=O)NR₁₄(R₁₅), ―C(=O)SR₁₄,

―C(=NR₁₄)R₁₄, ―C(=NR₁₄)OR₁₄, ―C(=NR₁₄)NR₁₄(R₁₅), ―C(=NR₁₄)SR₁₄,

―C(=S)R₁₄, ―C(=S)OR₁₄, ―C(=S)NR₁₄(R₁₅), ―C(=S)SR₁₄를 포함하며,

여기서, 각각의 X는 독립적으로, 할로겐이고; R₁₄ 및 R₁₅ 는 독립적으로, 상기 정의된 바와 같이, 수소, C₁-C₆ 알킬, C₆-C₁₄ 아릴, 아릴알킬, C₃-C₁₀ 헤테로아릴, 및 헤테로아릴알킬이다.

"알키닐"은 모 알킨의 단일 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자의 제거에 의해 유도되는, 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 포화되지 않은 분지형, 직쇄 또는 사이클릭 알킬 그룹을 나타낸다. 대표적인 알키닐 그룹은, 에티닐; 프로피닐 예를 들어, 프로프-1-인-1-일 및 프로프-2-인-1-일; 부티닐 예를 들어, 부트-1-인-1-일, 부트-1-인-3-일, 및 부트-3-인-1-일 등을 포함한다. 알키닐 그룹은 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 대표적인 알키닐 그룹 치환체는 알케닐 그룹에 대해 상기 기재된 것들을 포함한다.

용어 "할로알킬"은, 할로겐 원자로 대체된 하나 이상의 수소 원자를 갖는, 상기 정의된 바와 같은 알킬 그룹을 나타낸다. 대표적인 할로알킬 그룹은, 할로메틸 그룹 예를 들어, 클로로메틸, 플루오로메틸, 및 트리플루오로메틸 그룹; 및 할로에틸 그룹 예를 들어, 클로로에틸, 플루오로에틸, 및 퍼플루오로에틸 그룹을 포함한다. 용어 "헤테로알킬"은, 나타낸 수의 탄소 원자를 갖고, 하나 이상의 탄소 원자가 O, N 또는 S로부터 선택된 헤테로 원자로 대체된 알킬 그룹을 나타낸다. 특정 수준의 포화가 의도되는 경우, 표현 "헤테로알칸일", "헤테로알케닐" 및 "헤테로알키닐"이 사용된다. 대표적인 헤테로알킬 그룹은, 에테르, 아민, 및 티오에테르 그룹을 포함한다. 헤테로알킬 그룹은, 헤테로사이클릴 그룹을 포함한다. 용어 "헤테로사이클릴"은, O, S 및 N으로부터 선택되는 1 내지 4개의 헤테로 원자를 함유하는 5 내지 10원 비방향족 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 환을 나타낸다. 대표적인 헤테로사이클릴 그룹은, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로퓨라닐, 및 모폴리닐 그룹을 포함한다. 헤테로알킬 그룹은 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 대표적인 헤테로알킬 치환체는,

―R₁₄, ―OR₁₄, ―SR₁₄, ―NR₁₄(R₁₅),

―X, ―CX₃, ―CN, ―NO₂,

―C(=O)R₁₄, ―C(=O)OR₁₄, ―C(=O)NR₁₄(R₁₅), ―C(=O)SR₁₄,

―C(=NR₁₄)R₁₄, ―C(=NR₁₄)OR₁₄, ―C(=NR₁₄)NR₁₄(R₁₅), ―C(=NR₁₄)SR₁₄,

―C(=S)R₁₄, ―C(=S)OR₁₄, ―C(=S)NR₁₄(R₁₅), ―C(=S)SR₁₄,

―NR₁₄c(=O)NR₁₄(R₁₅), ―NR₁₄(=NR₁₄)NR₁₄(R₁₅), ―NR₁₄c(=S)NR₁₄(R₁₅),

―S(=O)₂R₁₄, ―S(=O)₂OR₁₄, ―S(=O)₂NR₁₄(R₁₅),

―OC(=O)R₁₄, ―OC(=O)OR₁₄, ―OC(=O)NR₁₄(R₁₅), ―OC(=O)SR₁₄,

―OS(=O)₂OR₁₄, ―OS(=O)₂NR₁₄(R₁₅), 및

―OP(=O)₂(OR₁₄)를 포함하며,

여기서, 각각의 X는 독립적으로, 할로겐이고; R₁₄ 및 R₁₅는 독립적으로, 상기 정의된 바와 같이, 수소, C₁-C₆ 알킬, C₆-C₁₄ 아릴, 아릴알킬, C₃-C₁₀ 헤테로아릴, 및 헤테로아릴알킬이다.

특정 양태에서, 단일 탄소 원자 상의 2개의 수소 원자는, =O, =NR₁₂, 또는 =S로 대체될 수 있다.

용어 "알콕시"는, 산소 원자에 결합된 본원에 기재된 바와 같은 알킬 그룹을 나타낸다. 대표적인 C₁-C₃ 알콕시 그룹은, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 및 이소프로폭시 그룹을 포함한다.

용어 "알킬아미노"는, 질소 원자에 결합된 본원에 기재된 바와 같은 알킬 그룹을 나타낸다. 용어 "알킬아미노"는 모노알킬아미노 및 디알킬아미노 그룹을 포함한다. 대표적인 C₁-C₆ 알킬아미노 그룹은, 메틸아미노, 디메틸아미노, 에틸아미노, 메틸에틸아미노, 디에틸아미노, 프로필아미노, 및 이소프로필아미노 그룹을 포함한다.

용어 "알킬티오"는, 황 원자에 결합된 본원에 기재된 바와 같은 알킬 그룹을 나타낸다. 대표적인 C₁-C₆ 알킬티오 그룹은, 메틸티오, 프로필티오, 및 이소프로필티오 그룹을 포함한다.

용어 "아릴"은, 모 방향족 환 시스템의 단일 탄소 원자로부터 1개의 수소 원자를 제거함으로써 유도되는, 1가 방향족 탄화수소 그룹을 나타낸다. 적절한 아릴 그룹은, 아세안트릴렌, 아세나프틸렌, 아세페난트릴렌, 안트라센, 아줄렌, 벤젠, 크리센, 코로넨, 플루오란텐, 플루오렌, 헥사센, 헥사펜, 헥살렌, as-인다센, s-인다센, 인단, 인덴, 나프탈렌, 옥타센, 옥타펜, 옥탈렌, 오발렌, 펜타-2,4-디엔, 펜타센, 펜타렌, 펜타펜, 페릴렌, 페날렌, 페난트렌, 피센, 플레이아덴, 피렌, 피란트렌, 루비센, 트리페닐렌, 트리나프탈렌 등으로부터 유도되는 그룹을 포함한다. 특정 양태에서, 아릴 그룹은 C₅-C₁₄ 아릴 그룹이다. 다른 양태에서, 아릴 그룹은 C₅-C₁₀ 아릴 그룹이다. 특정된 탄소 원자의 수는, 방향족 환 시스템 중의 탄소 원자의 수를 나타낸다. 대표적인 아릴 그룹은, 페닐, 나프틸 및 사이클로펜타디에닐이다. 아릴 그룹은 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 대표적인 아릴 그룹 치환체는,

―R₁₄, ―OR₁₄, ―SR₁₄, ―NR₁₄(R₁₅),

―X, ―CX₃, ―CN, ―NO₂,

―C(=O)R₁₄, ―C(=O)OR₁₄, ―C(=O)NR₁₄(R₁₅), ―C(=O)SR₁₄,

―C(=NR₁₄)R₁₄, ―C(=NR₁₄)OR₁₄, ―C(=NR₁₄)NR₁₄(R₁₅), ―C(=NR₁₄)SR₁₄,

―C(=S)R₁₄, ―C(=S)OR₁₄, ―C(=S)NR₁₄(R₁₅), ―C(=S)SR₁₄,

―NR₁₄c(=O)NR₁₄(R₁₅), ―NR₁₄(=NR₁₅)NR₁₄(R₁₅), ―NR₁₄c(=S)NR₁₄(R₁₅),

―S(=O)₂R₁₄, ―S(=O)₂OR₁₄, ―S(=O)₂NR₁₄(R₁₅),

―OC(=O)R₁₄, ―OC(=O)OR₁₄, ―OC(=O)NR₁₄(R₁₅), ―OC(=O)SR₁₄,

―OS(=O)₂OR₁₄, ―OS(=O)₂NR₁₄(R₁₅), 및

―OP(=O)₂(OR₁₄)을 포함하며,

여기서, 각각의 X는 독립적으로, 할로겐이고; R₁₄ 및 R₁₅는 독립적으로, 상기 정의된 바와 같은 수소, C₁-C₆ 알킬, C₆-C₁₄ 아릴, 아릴알킬, C₃-C₁₀ 헤테로아릴, 및 헤테로아릴알킬이다.

용어 "아르알킬"은, 알킬 그룹 수소 원자들 중 하나에 대해, 본원 명세서에서 정의된 바와 같으며 임의로 치환된 아릴 그룹을 갖는 본원 명세서에서 정의된 알킬 그룹을 나타낸다. 적절한 아르알킬 그룹은, 벤질, 2-페닐에탄-1-일, 2-페닐에텐-1-일, 나프틸메틸, 2-나프틸에탄-1-일, 2-나프틸에텐-1-일, 나프토벤질, 2-나프토페닐에탄-1-일 등을 포함한다. 특정한 알킬 모이어티(moiety)가 의도되는 경우, 용어 아르알카닐, 아르알케닐, 및 아르알키닐이 사용된다. 특정 양태에서, 아르알킬 그룹은 C₆-C₂₀ 아르알킬 그룹(예를 들어, 아르알킬 그룹의 알카닐, 알케닐, 또는 알키닐 모이어티는 C₁-C₆ 그룹이고, 아릴 모이어티는 C₅-C₁₄ 그룹임)이다. 다른 양태에서, 아르알킬 그룹은 C₆-C₁₃ 아르알킬 그룹(예를 들어, 아르알킬 그룹의 알카닐, 알케닐, 또는 알키닐 모이어티는 C₁-C₃ 그룹이고, 아릴 모이어티는 C₅-C₁₀ 아릴 그룹임)이다. 특정 양태에서, 아르알킬 그룹은 벤질 그룹이다.

용어 "헤테로아릴"은, 모 헤테로방향족 환 시스템의 단일 원자로부터 1개의 수소 원자의 제거에 의해 유도되는 1가 헤테로방향족 그룹을 나타내며, 상기 모 헤테로방향족 환 시스템은 모노사이클릭 환 또는 융합된 환(즉, 인접한 원자 쌍을 공유하는 환)일 수 있다. "헤테로방향족" 그룹은, O, S 및 N으로부터 선택되는 1 내지 4개의 헤테로 원자를 함유하는 5원 내지 14원 방향족 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 환이다. 대표적인 5 또는 6원 방향족 모노사이클릭 환 그룹은, 피리딘, 피리미딘, 피리다진, 푸란, 티오펜, 티아졸, 옥사졸, 및 이소옥사졸을 포함한다. 대표적인 9 또는 10원 방향족 바이사이클릭 환 그룹은, 벤조푸란, 벤조티오펜, 인돌, 피라노피롤, 벤조피란, 퀴놀린, 벤조사이클로헥실, 및 나프티리딘을 포함한다. 적절한 헤테로아릴 그룹은, 아크리딘, 아르신돌, 카바졸, β-카볼린, 크로만, 크로멘, 신놀린, 푸란, 이미다졸, 인다졸, 인돌, 인돌린, 인돌리진, 이소벤조푸란, 이소크로멘, 이소인돌, 이소인돌린, 이소퀴놀린, 이소티아졸, 이속사졸, 나프티리딘, 옥사디아졸, 옥사졸, 페리미딘, 페난트리딘, 페난트롤린, 페나진, 프탈라진, 프테리딘, 퓨린, 피란, 피라진, 피라졸, 피리다진, 피리딘, 피리미딘, 피롤, 피롤리진, 퀴나졸린, 퀴놀린, 퀴놀리진, 퀴녹살린, 테트라졸, 티아디아졸, 티아졸, 티오펜, 트리아졸, 크산탄 등으로부터 유도되는 그룹을 포함한다. 특정 양태에서, 헤테로아릴 그룹은 5 내지 14원 헤테로아릴 그룹이다. 다른 양태에서, 헤테로아릴 그룹은 5 내지 10원 헤테로아릴 그룹이다. 바람직한 헤테로아릴 그룹은, 티오펜, 피롤, 벤조티오펜, 벤조푸란, 인돌, 피리딘, 퀴놀린, 이미다졸, 옥사졸, 및 피라진으로부터 유도된 것이다. 헤테로아릴 그룹은 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 대표적인 헤테로아릴 그룹 치환체는, 아릴 그룹에 대해 상기 개시된 것들을 포함한다.

용어 "헤테로아릴알킬"은, 알킬 그룹 수소 원자들 중 하나에 대해 치환된 본원 명세서에서 정의된 바와 같고 임의로 치환된 헤테로아릴 그룹을 갖는 본원에 정의된 바와 같은 알킬 그룹을 나타낸다. 특정 알킬 모이어티가 의도되는 경우, 용어 헤테로아릴알카닐, 헤테로아릴알케닐 또는 헤테로아릴알키닐이 사용된다. 특정 양태에서, 헤테로아릴알킬 그룹은 6 내지 20원 헤테로아릴알킬(예를 들어, 헤테로아릴알킬의 알카닐, 알케닐 또는 알키닐 모이어티는 C₁-C₆ 그룹이고, 헤테로아릴 모이어티는 5 내지 14원 헤테로아릴 그룹임)이다. 다른 양태에서, 헤테로아릴알킬 그룹은 6 내지 13원 헤테로아릴알킬(예를 들어, 알카닐, 알케닐 또는 알키닐 모이어티는 C₁-C₃ 그룹이고, 헤테로아릴 모이어티는 5-10원 헤테로아릴 그룹임)이다.

용어 "아실" 그룹은 -C(=O)―R' 그룹을 나타내고, 여기서, R'는, 상기 정의된 바와 같이 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 아릴, 및 임의로 치환된 헤테로아릴로부터 선택된다.

용어 "할로겐" 또는 "할로"는, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도 그룹을 나타낸다.

용어 "치환되는"은, 하나 이상의 수소 원자가 동일하거나 상이한 치환체(들)로 각각 독립적으로 대체되는 그룹을 나타낸다.

용어 "약제학적으로 허용되는 염"는, 무기 염기 및 유기 염기를 포함하는 약제학적으로 허용되는 염기로부터 제조되는 염을 나타낸다. 무기 염기로부터 유도되는 대표적인 염은, 알루미늄, 암모늄, 칼슘, 구리, 제2철, 제1철, 리튬, 마그네슘, 망간 염(manganic salt), 망간, 암모늄, 칼륨, 나트륨, 및 아연 염을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 유기 염기로부터 유도되는 대표적인 염은, 1급, 2급 및 3급 아민의 염, 자연 발생 치환 아민, 사이클릭 아민, 및 염기선 이온 교환 수지를 포함하는 치환된 아민, 예를 들어, 아르기닌, 베타인, 카페인, 콜린, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 디에틸아민, 2-디에틸아미노에탄올, 2-디메틸아미노에탄올, 에탄올아민, 에틸렌디아민, N-에틸모르폴린, N-에틸피페리딘, 글루카민, 글루코사민, 히스티딘, 하이드라바민, 이소프로필아민, 리신, 메틸글루카민, 모르폴린, 피페라진, 피페리딘, 폴리아민 수지, 프로카인, 퓨린, 테오브로민, 트리에틸아민, 트리메틸아민, 트리프로필아민 및 트리메타민을 포함한다.

대표적인 화합물 및 관련된 중간체는 상업적으로 입수가능한 출발 물질로부터 또는 통상적인 합성 방법에 의해 제조된 출발 물질로부터 제조되었다. 대표적인 화합물은 하기 개시되고 도 8 내지 10에 예시된 방법 A 내지 C에 따라 제조되었다. 본 발명의 화합물의 제조에 유용한 특정 중간체(I-1 내지 I-4)의 제조는 WO 2017/132771(이의 전문이 본원에 인용에 의해 포함됨)에 기재되어있다.

도 9 내지 11은, 본 발명의 대표적인 화합물 P5-P4-P3-P2-P1을 제조하기 위한 대표적인 합성 경로의 개략도를 제공한다. 본원 명세서에서 사용되는 "P5-P4-P3-P2-P1"은 5가지 성분인 P1, P2, P3, P4 및 P5로부터 제조된 본 발명의 화합물을 나타낸다. 본 발명의 화합물의 제조에 유용한 성분의 보호된 버전은, 예를 들어, "PG-P2", "PG-P2-P1", "PG-P3" 및 "PG-P3-P2-P1"로 나타내며, "PG"는, 예를 들어 P1을 P2에 또는 P3을 P1-P2에 커플링시키는 보호 그룹을 나타내고, 예를 들어, P1-P2 또는 P1-P2-P3를 제공하기 위해 최종적으로 제거되는 보호 그룹을 나타낸다.

도 9는, P5로부터 출발하는 본 발명의 대표적인 화합물 P5-P4-P3-P2-P1을 제조하기 위한 또 다른 대표적인 합성 경로의 개략도이다. 이 경로에서, 화합물 P5-P4-P3-P2-P1은 탈보호 단계 및 기타 화학적 개질에 의해 적절히 분리된, 순차적인 커플링 단계들에 의해 P5로부터 출발하여 단계적인 방식으로 제조된다. 도 9에 도시된 바와 같이, P5는 PG-P4와 커플링되어 P5-P4-PG를 제공하고, 이후, 탈보호되어 P5-P4를 제공하고, 다음 성분인 P3-PG와의 커플링을 위해 준비된다. 공정은 후속적인 PG-P2와 P5-P4-P3의 커플링, PG-P1과 P5-P4-P3-P2의 커플링으로 계속되어, 최종적으로 P5-P4-P3-P2-P1을 제공한다.

도 10은, P1으로부터 출발하는 본 발명의 대표적인 화합물 P5-P4-P3-P2-P1을 제조하기 위한 대표적인 합성 경로의 개략도이다. 이 경로에서, 화합물 P5-P4-P3-P2-P1은 탈보호 단계 및 기타 화학적 개질에 의해 적절히 분리된, 순차적인 커플링 단계들에 의해 P1로부터 출발하여 단계적인 방식으로 제조된다. 도 10에 도시된 바와 같이, P1은 PG-P2와 커플링되어 PG-P2-P1을 제공하고, 이후, 탈보호되어 P2-P1을 제공하고, 다음 성분인 PG-P3과의 커플링을 위해 준비된다. 공정은 후속적인 PG-P4와 P3-P2-P1의 커플링, PG-P5와 P4-P3-P2-P1의 커플링으로 계속되어, 최종적으로 P5-P4-P3-P2-P1을 제공한다.

도 11은, P1 또는 P5 이외의 성분으로부터 출발하는 본 발명의 대표적인 화합물 P5-P4-P3-P2-P1을 제조하기 위한 추가의 대표적인 합성 경로의 개략도이다. 이 경로에서, 화합물 P5-P4-P3-P2-P1은 탈보호 단계 및 기타 화학적 개질에 의해 적절히 분리된, 순차적인 커플링 단계들에 의해 P2로부터 출발하여 단계적인 방식으로 제조된다. 도 11에 도시된 바와 같이, P5-P4-P3-P2-P1에 대한 다중 경로가 존재한다. 이하에 기재된 실시예 C1 내지 C6을 이러한 방법으로 제조했다.

대표적인 화합물의 제조 및 이들의 특성확인이 WO 2017/132771(이의 전문이 본원에 인용에 의해 포함됨)의 실시예 C1 내지 C6에 기재되어 있다. 대표적인 화합물의 구조가 표 1에 제시되어 있다.

[표 1]

표 1에 확인되어 있는 화합물은 GzmB 억제 활성을 나타냈다. 특정 양태에서, 선택된 화합물은 IC₅₀<50,000nM을 나타냈다. 다른 양태에서, 선택된 화합물은 IC₅₀<10,000nM을 나타냈다. 추가의 양태에서, 선택된 화합물은 IC₅₀<1,000nM을 나타냈다. 다른 추가의 양태에서, 선택된 화합물은 IC₅₀<100nM을 나타냈다. 특정 양태에서, 선택된 화합물은, 10 내지 100nM, 바람직하게는 1 내지 10nM, 보다 바람직하게는 0.1 내지 1nM, 보다 더 바람직하게는 0.01 내지 0.1nM의 IC₅₀을 나타냈다.

어떠한 화합물도, 50μM의 농도에서 평가된 임의의 카스파제의 유의한 억제능을 나타내지 않았다. 특정 양태에서, 화합물은 50μM에서 50% 미만의 억제를 나타냈다. 다른 양태에서, 화합물은 50μM에서 50% 초과의 억제를 나타냈지만, 25μM에서 10% 미만의 억제를 나타냈다. 결과는 선택된 화합물이 카스파제를 유의하게 억제하지 않으면서 GzmB를 선택적으로 억제함을 입증한다.

조성물

상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 GzmB 억제제를 포함한다. 이러한 조성물에서 유용한 대표적인 GzmB 억제제 화합물은 4-(((2S,3S)-1-((2-((S)-5-(((2H-테트라졸-5-일)메틸)카바모일)-3-사이클로헥실-2-옥소이미다졸리딘-1-일)-2-옥소에틸)아미노)-3-메틸-1-옥소펜탄-2-일)아미노)-4-옥소부탄산(본원 명세서에서 화합물 A로 나타냄), 및 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.

특정 양태에서, GzmB 억제제(예를 들어, 화합물 A, 화합물 20 또는 세르핀 A3N 등)는, 제형의 약 0.25 내지 약 25.0mg/mL의 양으로 상기 제형 중에 존재한다. 특정 양태에서, GzmB 억제제는, 제형의 약 3.0 내지 약 15mg/mL의 양으로 존재한다. 다른 양태에서, GzmB 억제제는 제형의 약 10.0 내지 약 15.0mg/mL의 양으로 존재한다. 일 양태에서, GzmB 억제제는 제형의 약 10.0mg/mL로 존재한다.

본 발명의 제형의 pH는, 예를 들어, 트리에탄올 아민과 같은 염기로 조정하여 원하는 대로 용이하게 변경될 수 있다. 특정 양태에서, 제형의 pH는 약 4.0 내지 약 7.4이다. 다른 양태에서, 제형의 pH는 약 4.0 내지 약 6.5이다. 예를 들어, 피부에 대한 국소 도포용과 같은 다른 양태에서, 제형의 pH는 약 6.0이다.

특정 양태에서, 본 발명의 제형은 유기 성분도 포함하는 수성 제형이다. 상기 수성 제형은 완충되어 약 4 내지 5, 4 내지 7, 및 5 내지 7을 포함하여 약 4 내지 약 7의 pH를 갖는다. 특정 양태에서, pH는 약 4.0 내지 약 6.5이다. 다른 양태에서, pH는 약 6.0이다. 적합한 완충제는 국소 투여되거나 주사에 의해 투여되는 약제학적 조성물 및 미용 조성물에 유용한 것들을 포함한다. 대표적인 완충제는 아세테이트 및 포스페이트 완충제를 포함한다.

제형의 pH가 증가되는 경우, GzmB 억제제 피부 투과성이 감소되는 것으로 이미 측정되었다.

GzmB 억제제 화합물 이외에, 본 발명의 제형은 하나 이상의 침투 향상제를 포함할 수 있다. 적합한 침투 향상제는, 프로필렌 글리콜(PG), 우레아, Tween 80, 디메틸 이소소르바이드(DMI), Transcutol, N-메틸-2-피롤리돈(MNP) 등을 포함할 수 있다. 침투 향상제의 양은 원하는 제형의 특성을 달성하는 양에 이를 수 있다.

대표적인 침투 향상제는 프로필렌 글리콜(PG)이다. 제형에 존재하는 프로필렌 글리콜의 양은, 상기 제형의 총 중량을 기준으로 하여, 약 5 내지 80wt%의 범위일 수 있다. 특정 양태에서, 프로필렌 글리콜은, 제형의 총 중량을 기준으로 하여, 약 15 내지 약 25wt%의 양으로 존재한다. 다른 양태에서, 프로필렌 글리콜은, 제형의 총 중량을 기준으로 하여, 약 20wt%의 양으로 존재한다. 특정한 국소 도포용으로, 프로필렌 글리콜은 최대 약 80% w/w의 양으로 사용될 수 있다.

프로필렌 글리콜 이외의 적합한 폴리올이 제형에 사용될 수 있는 것이 이해될 것이다. 프로필렌 글리콜 또는 다른 적합한 폴리올은, 하이드로겔 제형으로 제공되어 겔의 빠른 건조를 방지한다. 글리세린과 같은 다른 폴리올과 비교하여, 프로필렌 글리콜은 침투 향상제의 이점 및 보다 우수한 용매 또는 공-용매의 이점을 제공한다.

본 발명의 대표적인 제형은 GzmB 억제제(0.5 내지 15mg/mL), 침투 향상제(프로필렌 글리콜, 15 내지 25wt%), 및 pH 5에서의 수성 아세테이트 완충제를 포함한다.

특정 양태에서, 제형은 하나 이상의 점도 향상제 또는 겔화제를 추가로 포함한다. 적합한 점도 향상제는, 카보폴, 카보머, 카복시메틸 셀룰로오스(CMC), 전분, 식물성 검, 설탕 등을 포함한다.

대표적인 점도 향상제는, 가교결합된 폴리아크릴레이트 중합체, 예를 들어, 펜타에리스리톨의 에테르와 가교결합된 폴리아크릴레이트 중합체(예를 들어, 카보폴® 940 또는 980)를 포함할 수 있다. 점도 향상제는 일반적으로, 제형의 총 중량을 기준으로 하여, 약 0.1 내지 약 5.0wt%(예를 들어, 제형의 총 중량을 기준으로 하여 0.5wt%)의 양으로 제형에 존재한다. 카보폴® 940 또는 980이 사용되는 경우, 약 0.5% w/w 미만으로 함유하는 제형은 겔이 아닌 로션이며, pH가 약 5 미만인 경우, 제형은 점성이 아니다.

pH 민감성인 카보폴® 940 또는 980을 포함하는 제형의 경우, pH는 약 5 내지 약 6이며, 겔로서의 제형을 수득한다. 제형의 최종 pH는, 약제학적으로 허용되는 염기(예를 들어, 수산화나트륨, 트리에틸아민 또는 트리에탄올아민 등)로서 적합한 염기를 사용하여 원하는 pH 범위를 달성하도록 조정될 수 있다. 특정 양태에서, 제형의 pH는 트리에탄올아민으로 조정된다.

겔 제형에서 GzmB 억제제의 더 높은 농도는, 증가된 점도 향상제(예를 들어, 카보폴® 940 또는 980)의 농도로 달성되는 것으로 관찰되었다. 특정 양태에서, 점도 향상제(예를 들어, 카보폴® 940 또는 980)의 농도는, 제형(예를 들어, 약 10mg/mL GzmB 억제제를 포함하는 겔 제형)의 약 0.5 내지 2wt%이다. 예를 들어, 20mg/mL GzmB 억제제를 포함하는 겔 제형의 경우, 점도 향상제(예를 들어, 카보폴® 940 또는 980)의 농도는 상기 제형의 약 5wt% 이하이다.

본 발명의 대표적인 제형은, GzmB 억제제(0.5 내지 15mg/mL), 침투 향상제(프로필렌 글리콜, 15 내지 25wt%), 점도 향상제(카보폴® 940 또는 980, 0.5 내지 5wt%), 및 pH 5의 수성 아세테이트 완충제(트리에탄올아민으로 pH 6.0으로 적정)를 포함한다.

특정 양태에서, 제형은 하나 이상의 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 보존제는, 벤조산, EDTA, 염화벤즈알코늄, 파라벤 등을 포함한다.

대표적인 파라벤은, 메틸 파라벤 및 프로필 파라벤(예를 들어, 제형의 총 중량을 기준으로 하여, 약 0.2wt%의 메틸 파라벤 및 약 0.02wt%의 프로필 파라벤)을 포함한다.

일 양태에서, 국소 투여용 제형은, 프로필렌 글리콜(20% w/w)을 함유하는 비히클 중 0.35% w/v의 농도의 GzmB 억제제(예를 들어, 화합물 A, 화합물 20 또는 세르핀 A3n), 카보폴® 940 또는 980(0.5% w/v), 메틸 파라벤(0.2% w/w), 프로필 파라벤(0.02% w/w), 및 아세테이트 완충액 pH 5(QS)를 포함하는, 트리에틸아민으로 5 내지 6의 최종 제형 pH로 조정된 겔이다.

또 다른 양태에서, 국소 투여용 제형은, 프로필렌 글리콜(20% w/w)을 함유하는 비히클 중 10mg/mL의 농도의 GzmB 억제제(예를 들어, 화합물 A, 화합물 20 또는 세르핀 A3n), 카보폴® 940 또는 980(0.5 내지 2.0% w/v), 메틸 파라벤(0.2% w/w), 프로필 파라벤(0.02% w/w) 및 아세테이트 완충액 pH 5(QS)를 포함하는, 트리에탄올아민으로 6의 최종 제형 pH로 조정된 겔이다.

일 양태에서, 제형은, 약제학적으로 허용되는 주사 비히클(예를 들어, PBS) 중 0.25 내지 25mg/mL의 농도의 GzmB 억제제를 포함하는 주사용 제형이다.

본 발명의 제형은, 국소 투여, 세척, 표피 투여, 표피하 투여, 표피내 투여, 진피 투여, 진피하 투여, 경피 투여, 피하 투여, 각질하 투여, 주사에 의한 제제의 투여 방식, 또는 선택된 치료에 대해 적합한 임의의 다른 방식에 대해 허용되는 하나 이상의 담체를 추가로 포함할 수 있다. 국소 투여는, 외부 신체 표면(예를 들어, 피부), 및 내부 신체 표면(예를 들어, 점막)으로의 투여를 포함한다. 적합한 담체는, 이러한 투여 방식에 사용하기 위해 당업계에 공지된 것들이다.

적합한 조성물은, 당업계에 공지된 수단, 및 당업자에 의해 결정된 이의 투여 방식 및 용량에 의해 제형화될 수 있다. 예를 들어, 화합물 A와 같은 GzmB 억제제는, 멸균수 또는 식염수 또는 비-수용성 화합물의 투여에 사용되는 약제학적으로 허용되는 비히클에 용해될 수 있다. 국소적으로 또는 국부적으로(locally) 화합물을 투여하기 위해 사용될 수 있는 연고, 페이스트, 겔, 하이드로겔, 폼, 크림, 파우더, 로션, 오일, 반-고체, 비누, 약용 비누, 샴푸, 약용 샴푸, 스프레이, 필름 또는 용액을 포함하는 많은 적합한 제형들이 공지되어 있다.

다른 양태에서, 적합한 조성물은, 과립, 분말, 정제, 코팅된 정제, (마이크로)캡슐제, 좌제, 시럽, 에멀젼, 현탁액 또는 상기 조성물의 연장 방출(protracted release)을 가진 제제를 포함하는 약제학적 조성물일 수 있으며, 이의 제제 부형제 및 첨가제 및/또는 보조제, 예를 들어, 붕해제, 결합제, 코팅제, 팽윤제, 윤활제, 향료, 감미료 또는 가용화제가 통상적으로 사용된다. 약제학적 조성물은 다양한 약물 전달 시스템으로 사용하기에 적합하다. 약물 전달 방법에 대한 간단한 검토는, 문헌[Langer, Science 249, 1527-1533 (1990) and Langer and Tirrell, Nature 428, 487-492 (2004)을 참조. 또한, 본원에 기재된 조성물은 데포(depot) 제제, 시한-방출, 지연 방출 또는 지속 방출 전달 시스템으로 제형화될 수 있다.

투여 방식은, 경구 투여, 설하 투여, 비강내 투여, 기관내 투여, 흡입, 안구 투여, 상기 개시된 바와 같은 국소 투여, 경피 투여, 진피내 투여, 표피내 투여, 표피하 투여, 피하 투여, 각질하 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 흉골내 투여, 또는 점막투과를 통한 투여를 포함하는 임의의 의학적으로 허용되는 방식일 수 있다. 또한, 투여 방식은 체외 장치 및/또는 조직-투과 전자기 장치를 통할 수 있다.

선택되는 특정 방식은, 선택되는 특정 화합물, 원하는 결과, 치료되는 특정 병태 및 치료 효능에 필요한 투여량에 따라 달라질 것이다. 일반적으로 말해서, 본원에 개시된 방법은, 의학적으로 허용되는 임의의 투여 방식, 예를 들어 임상적으로 허용되지 않는 부작용을 유발하지 않으면서 효과적인 수준의 반응 교대를 생성하는 임의의 방식을 사용하여 실시될 수 있다.

조성물은 장애 및 투여 방식에 따라 상이한 용기, 비히클 또는 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 조성물은, 경구 적용을 위해, 설하 정제, 검, 구강 세정제, 치약, 사탕, 겔, 필름 등으로 투여될 수 있으며, 국소 적용을 위해, 로션, 연고, 겔, 크림, 스프레이, 티슈, 면봉, 와이프 등으로 투여될 수 있다.

조성물은, 주사에 의해, 예를 들어, 정맥내, 피하, 각막하, 근육내, 복강내, 흉골내, 표피내 또는 표피하 경로를 통한 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 주사용 제형은, 보존제가 추가된 단위 투여 형태, 예를 들어 앰풀 또는 다회-투여 용기로 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 가질 수 있으며, 현탁제, 안정제 및/또는 분산제와 같은 제형화제(formulatory agent)를 함유할 수 있다. 경구 투여를 위해, 조성물은, 상기 조성물을, 당업계에 널리 공지된 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들어 설하 정제, 액상 제형 또는 경구 겔과 조합하여 용이하게 제형화될 수 있다.

흡입에 의한 투여를 위해, 조성물은, 적합한 추진제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스를 사용하여, 가압 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 외형 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투여량 단위는 계량도입된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한, 예를 들어 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는, 조성물의 분말 혼합물 및 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 베이스를 함유하여 제형화될 수 있다. 치료제의 흡입을 위한 의료 장치가 당업계에 공지되어 있다. 일부 양태에서, 의료 장치는 흡입기이다. 다른 양태에서, 의료 장치는 계량도입된 용량의 흡입기이다.

제제 및 약제학적 제형에 대해 당업자에게 공지된 많은 기술이 문헌[Remington: the Science & Practice of Pharmacy by Alfonso Gennaro, 20th ed., Williams&Wilkins, (2000)]에 기재되어 있다.

제형은, 부형제, 폴리알킬렌 글리콜, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 식물 유래 오일, 또는 수소화 나프탈렌을 추가로 포함할 수 있다. 부형제는 생체적합성일 수 있고, 예를 들어, 생분해성 락타이드 중합체, 락타이드/글리콜라이드 공중합체 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형 또는 본원에 개시된 특정 방법에서 사용하기 위한 제형은, 적절한 경우 하나 이상의 다른 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 본원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 따라 또는 본원에 개시된 특정 방법에서 사용하기 위한 GzmB 억제제 및 이의 약제학적 조성물, 예를 들어 화합물 A는, 임플란트 또는 상처 드레싱과 같은 의학적 장치 또는 기구에 의해 투여될 수 있다. 또한, 이러한 화합물 또는 조성물을 함유하고 방출하고자 하는 임플란트가 고안될 수 있다. 일정 시간 기간에 걸쳐 화합물을 방출하도록 구성된 중합체 물질로 제조된 임플란트가 예가 될 수 있다.

특정 양태에서, 본 발명의 제형은, 기재된 성분들을 "포함하고", 다른 성분들을 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 본 발명의 제형은 기재된 성분들로 "본질적으로 구성되고", 제형의 특징적인 성질에 실질적으로 영향을 미치지 않는 다른 성분들을 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 본 발명의 제형은, 기재된 성분들로 "구성되고", 다른 성분을 포함하지 않는다.

또 다른 양태에서, 본 발명은, 수포 또는 피부 박리 증상의 치료 및/또는 완화, 수포발생되고/수포발생되거나 박리되는 피부의 치유, 수포발생 및/또는 박리되는 피부, GzmB 억제제의 피막하, 표피내, 표피하, 피하 및/또는 전신 전달에 의한 수포발생 및/또는 피부 박리의 감소 또는 예방 방법을 제공한다.

특정 양태에서, 방법은 치료학적 유효량의 GzmB 억제제 또는 GzmB 억제제를 포함하는 제형을, 상기 억제제 또는 제형을 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함한다. 대표적인 투여 경로는 일반적으로, 국소 투여, 경구 투여 및 주사에 의한 투여를 포함한다. 보다 구체적인 투여 경로가 본원에 열거된다.

"치료학적 유효량"은, 피부의 수포발생 및/또는 박리의 감소, 또는 감소된 GzmB 활성 수준과 같은 원하는 치료 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량의, 그리고 원하는 치료 결과를 달성하기 위해 필요한 시간 기간 동안의 유효량을 나타낸다. 치료학적 유효량의 화합물은, 대상체의 질환 병태, 연령, 성별 및 체중, 및 대상체에서 원하는 반응을 유도하는 화합물의 능력과 같은 요인들에 따라 다양해질 수 있다. 투여 요법은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 치료학적 유효량은, GzmB 억제제의 임의의 독성 또는 유해 효과가 치료학적으로 이로운 효과보다 더 우세한 양이다.

투여량 값은 완화될 병태의 중증도에 따라 다양해질 수 있는 것에 유의해야 한다. 임의의 특정한 대상체에 대해, 특정한 투여량의 요법은, 개인적 요구 및 조성물의 투여를 관리하거나 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라,시간의 흐름에 따라 조정될 수 있다. 본원에 제시된 투여량 범위는 단지 예시일 뿐이며, 의료 전문가가 선택할 수 있는 투여량 범위를 제한하지는 않는다. 조성물 중 활성 화합물의 양은, 대상체의 질환 병태, 연령, 성별 및 체중과 같은 인자들에 따라 다양해질 수 있다. 투여 요법은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할 용량이 시간의 흐름에 따라 투여될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 긴급성이 나타내는 바와 같이 비례하여 감소되거나 증가될 수 있다.

방법에서, GzmB 억제제의 투여는, 부위(예를 들어, 수포 및/또는 피부 박리 영역)에 대한 국부 투여(예를 들어, 상기 부위로의 투여), 피하, 진피내, 피하, 표피내, 표피하, 및/또는 국소 투여일 수 있다. 또한, GzmB 억제제는 예를 들어, 경구, 복강내 또는 정맥내로 전신 투여될 수 있다.

용어 "대상체" 또는 "환자"는 포유 동물 유기체를 포함하고자 한다. 대상체 또는 환자의 예는, 인간 및 비인간 포유 동물, 예를 들어 비인간 영장류, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 마우스, 토끼, 래트 및 유전자 삽입 비인간 동물을 포함한다. 본 발명의 특정 양태에서, 대상체는 인간이다.

용어 "투여하는"은, GzmB 억제제 또는 GzmB 억제제를 포함하는 약제학적 조성물을, 대상체의 시스템 내로 또는 대상체 내의 또는 대상체 상의 특정 영역으로 전달하는 임의의 방법을 포함한다.

본원 명세서에서 사용되는 용어 "도포하는"은, 화합물의 스프레딩(spreading), (적어도 부분적으로의) 커버링(covering) 또는 레이어링(layering)을 포함하는 GzmB 억제제의 투여를 나타낸다.

본원 명세서에서 사용되는 용어 "치료하는" 또는 "치료"는, 감지가능하거나 감지가능하지 않은, 불가능한 하나 이상의 증상의 완화 또는 개선, 장애의 정도의 감소, 장애의 안정된(즉, 악화되지 않음) 병태, 장애의 완화 또는 경감(palliation)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 유리하거나 바람직한 결과를 나타낸다. "치료"는, 치료의 부재하에 예상되는 생존에 비해 연장되는 생존을 의미할 수도 있다.

하기 실시예들은 본 발명을 제한하는 것이 아닌, 예시하기 위해 제공된다.

실시예

일반적인 방법

본 발명의 대표적인 화합물을, WO 2017/132771(이의 전문이 본원에 인용에 의해 포함됨)의 도 8 내지 20에 개시되고 예시된 바와 같은 방법 A 내지 C에 따라 제조했다. 화합물의 완전한 제조방법은 WO 2017/132771에서 확인된다.

하기 합성 중간체의 일반적인 방법 및 제조에서, 시약 수준 및 상대량 또는 시약/중간체는, 합성될 특정 화합물에 따라 예상되는 결과에 큰 변화 없이 최대 50%로 위 또는 아래로 변경될 수 있는 것이 이해될 것이다.

실시예 1

GzmB 에 의한 표피의 진피로부터 분리

본 실시예에서, 본 발명자들은, GzmB로 처리한 후 전체 두께의 피부에서 표피가 진피로부터 분리될 것임을 입증한다. 복부 전체 두께의 피부를 선택적 성형 수술로부터 얻어, 절제 및 운반 직후에 사용했다. 소형 단편(0.2x0.4mm)을 10% 포르말린에 즉시 고정시킨 반면(본래 피부), 다른 단편을 200nM GzmB를 포함하는 300μL의 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 200nM GzmB를 포함하지 않는 300μL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 배치했다. 이후, 피부 샘플을 37℃에서 24시간 동안 수욕에서 항온배양했다. 항온배양 후, 상기 피부를 표준 방법을 사용하여 10% 포르말린에서 고정시키고, 파라핀 포매하고, 절단하고(5μm), 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색했다. 도 1은, 새로운 인간 피부에 대한 GzmB(200nM)의 첨가가 DEJ의 분리를 유도하는 것을 보여준다. 정상 피부 및 비히클-처리된 피부가 처음 두 패널에 도시된다. 화살표는 GmzB-처리된 피부에서의 진피로부터 표피의 분리를 나타낸다.

또 다른 실험에서, 복부 전체 두께의 소형 단편(0.2x0.4mm)을 GzmB를 포함하는 300μL의 PBS 또는 GzmB를 포함하지 않는 300μL의 PBS에 배치했다. 이후, 샘플을 37℃에서 24시간 동안 수욕에서 항온배양했다. 항온배양 후, 상기 피부를 표준 방법을 사용하여 10% 포르말린에서 고정시키고, 파라핀 포매하고, 절단하고(5μm), H&E으로 염색했다. 도 2는, 새로운 인간 피부에 대한 GzmB(200nM)의 첨가가 DEJ의 분리를 유도하는 것을 보여준다. 정상 피부 및 비히클-처리된 피부가 처음 두 패널에 도시된다. 화살표는 GmzB-처리된 피부에서의 진피로부터 표피의 분리를 나타낸다.

실시예 2

콜라겐 VII에서의 GzmB 절단 및 GzmB 억제제를 사용하는 억제

GzmB 절단 검정을 40μL의 PBS에서 실시다. 간략하게는, 콜라겐 VII(500ng)을 200mM의 GzmB와 함께 37℃에서 24시간 동안 항온배양했다. 억제를 위해, 콜라겐 VII의 첨가 전에, GzmB를 37℃에서 1시간 동안 화합물 20, 세르핀 A3N 및 화합물 A와 함께 항온배양했다. 24시간 후, 모든 샘플을 10% SDS-PAGE에 로딩하고, PVDF 막에 블롯팅하고, 콜라겐 VII(토끼 항-콜라겐 VII, Abcam plc)에 특이적인 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 항온배양한 후, 2차 표지된 항-토끼 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 항온배양했다. 도 3은, GzmB가 콜라겐 VII를 절단하고, GzmB 억제제(SA3N, 화합물 20, 화합물 A)의 첨가가 GzmB-매개 콜라겐 VII의 절단을 예방하는 것을 보여준다.

GzmB에 대한 콜라겐 VII 내의 절단 자리는, 클라이펠트 등에 의해 이전에 설명된 방법(Nat. Biotechnol . 28:281-288. doi: 10.1038/nbt.1611, 2010)을 사용하는 TAILS 분석을 사용하여 측정했다. 간단하게는, 콜라겐 VII를 200nM의 GzmB와 함께 37℃에서 24시간 동안 항온배양했다. N-말단은 차등적으로 표지되고, 변성되고, 차단되었다. 이후, 샘플들을 트립신과 함께 항온배양하여 트립신 펩티드를 생성한 후, 아민-반응성 중합체 HPG-ALD를 표지된 펩티드로 음성 풍부화하여, GzmB-절단 자리를 확인했다.

실시예 3

전체 두께 피부의 DEJ 에서의 콜라겐 VII 확인

GzmB 피부 절단 검정 및 파라핀 포매를 도 1 및 2에 대해 설명된 바와 같이 실시했다. 후속적으로, 5μm 섹션들을 탈파라핀화하고, 카렌자임 I: 트립신 키트(BioCare Medical)를 사용하여 15분 동안 트립신으로 효소 항원 복구했다. 이후, 슬라이드를, 1시간 동안 트리스 완충 식염수(TBS) 중 10% 염소 혈청으로 차단하고, 토끼 항-콜라겐 VII 항체(Abcam plc)와 함께 4℃에서 밤새 항온배양했다. 이후, 모든 슬라이드를 2차 바이오티닐화 항체와 함께 항온배양하고, 제조사의 지침에 따라 DAB 염색을 실시했다. 도 5는 콜라겐 VII의 면역 염색을 도시한다. 화살표는 콜라겐 VII 염색을 나타낸다.

실시예 4

GzmB 억제제를 사용하는 α6β4의 GzmB 절단 및 억제

본 실시예에서, GzmB가, 세포외 매트릭스의 고정에 관여하는 주요 단백질인 인테그린 α6β4를 절단할 수 있는 것을 입증했다. 또한, 수포발생 및 피부 박리가 관찰되는 피부 병태에서 α6β4 인테그린 단백질의 변화가 관찰된다.

GzmB 절단 검정을 40μL의 PBS에서 실시했다. 간단하게는, α6β4(500ng)를 200nM의 GzmB와 함께 37℃에서 24시간 동안 항온배양했다. 억제를 위해, GzmB를 화합물 20, 세르핀 A3N 및 화합물 A와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온배양한 후, α6β4 인테그린을 첨가했다. 24시간 후, 모든 샘플을 10% 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하고, 1.5시간 동안 전기 영동에 의해 분리했다. 이어서, 쿠마시 염색으로 염색하여, 밴드를 시각화했다(도 6).

실시예 5

본 실시예에서, 세포간 접합 단백질인 ZO-1, JAM-A, E-카드헤린(E-cad) 및 데스모좀, Dsg-1 및 Dsg-3의 생화학적 절단 검정을 실시했다.

기질들을 2시간 동안 GzmB와 함께 항온배양한 후, SDS-PAGE를 통해 분리하여 절단 단편들을 확인했다. 단백질을 SDS PAGE 겔에서 작동시키고, 웨스턴 블롯팅(JAM-A, E-cad) 또는 쿠마시 염색(ZO-1, Dsg-1, Dsg-3)에 의해 분석했다. 5개의 단백질 모두는, 단백질 단독 또는 GzmB+화합물 20(C20) 억제제에 비해 GzmB와 함께 항온배양되는 경우, 전체 단백질의 감소 및 단편화의 증가를 보였다(도 7). E-카드헤린 및 Dsg-1은, 100nM GzmB로 전체 단백질의 거의 완전한 손실을 보인 반면, JAM-A, ZO-1 및 Dsg-3은 GzmB 처리 후에도 전체 단백질이 여전히 검출가능했기 때문에 적은 절단을 보였다.

실시예 6

GzmB 억제제 투여 후의 수포발생 억제

본 실시예에서, 당뇨병 마우스 모델을 사용하여, 일반적으로 피부 수포발생을 유발하는 사건의 투여 전에 또는 상기 사건 후이지만 수포 형성 전에, 피부를 GzmB 억제제로 전처리함으로써 수포발생을 예방할 수 있는 것을 나타냈다. 본 실시예에서, 수포발생을 유도하기 위해, 스틸 막대를 6초 동안 100℃로 가열하여 마우스를 화상 손상에 노출시켰다.

2개의 독립적인 실험을 실시했다. 실험 1은 30일 3-암(arm) 연구였다. 암 1은, 마우스를, 피하 주사에 의해 PBS 중 화합물 A(3.6mg/mL)로 매일 처리하는 것으로 구성했다. 암 2에서, 화합물 A(3.6mg/mL)를 겔로 매일 국소 도포하여 마우스에 투여했다. 암 3에서, 마우스를, 대조군으로서 피하 주사 식염수에 의해 매일 투여했다.

실험 2는 25일 2-암 연구였다. 암 1은, 겔 중 화합물 A(3.6mg/mL)를 국소 도포를 통해 매일 투여하는 것으로 구성했다. 암 2는, 대조군으로서 국소 도포를 통해 비히클 겔을 매일 투여하는 것으로 구성했다.

도 8a는, 식염수-처리된 피부에서 수포를 형성하는 진피로부터 표피의 분리를 도시한다. 화합물 A-처리된 피부에서의 수포발생이 예방된다. 도 8b에서, PBS(3.6mg/mL) 중 화합물 A 및 겔로서의 화합물 A(3.6mg/mL)가 식염수-단독 치료와 비교하여 수포발생을 감소시키는 것으로 확인했다. 따라서, 도 8c는, 겔(3.6mg/mL)로서의 화합물 A가, 단독으로 사용되는 경우의 겔에 비해 수포발생을 감소시키는 것을 보여준다. 따라서, 도 8a 내지 8c는 GzmB 억제제(화합물 A)가 수포발생을 예방할 수 있다는 증거를 제공한다.

GzmB 억제제 제형

화합물 A를 포함하는 GzmB 억제제 조성물을, 겔의 용적을 기준으로 하여, 3.6mg/mL의 화합물 A로 겔로 제형화했다.

베이스 비히클 제조 절차

베이스 비히클은, 아세테이트 완충액(10mM, pH 5) 중 20%의 프로필렌 글리콜(PG), 0.2%의 메틸 파라벤, 0.02%의 프로필 파라벤을 포함했다. 20%의 PG를 아세테이트 완충액(10mM, pH 5)과 혼합하여 베이스 비히클을 제조했다. 과량의 메틸 파라벤 및 프로필 파라벤(0.2% 메틸 파라벤/0.02% 프로필 파라벤)을 상기 용액에 첨가하고, 실온에서 밤새(>8시간) 교반했다. 상기 용액의 pH를 1M HCl로 pH 5로 조정했다. 최종 혼합물을 0.45μm 필터를 통해 여과했다.

겔 제형을 제조하기 위한 절차:

전임상 실험실 규모(비-멸균)의 경우, 화합물 A를 비히클(20% PG, 0.2% 메틸 파라벤, 0.02% 프로필 파라벤, 아세테이트 완충액(10mM, pH 5), 상기 기재된 바와 같이 제조됨)에 첨가하여, 13mg/mL 제형을 제조하고, 1시간 동안 초음파 처리했다. 1% 카보폴 940 NF를 상기 제형에 첨가하고, 카보폴을 완전히 수화시키기 위해 상기 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반했다. 24시간 후, 트리에탄올아민을 사용하여 pH를 pH 6.0±0.2로 조정했다. 최종 제형은 무색 투명 겔이다. 상기 제형은, 냉장 저장 조건(2 내지 8℃)에서 최대 1개월까지 UPLC-UV에 의한 90% 이상의 화합물 A 회수율로, 물리적으로 그리고 화학적으로 안정하다.

제형은 멸균될 수 있다. 예를 들어, 수화된 카보폴 혼합물은 오토 클레이브 공정을 통해 멸균될 수 있고, 화합물 A 용액은 0.22μm 여과를 통해 여과될 수 있고, 조합 공정은 멸균된 환경에서 실시될 수 있다.

실시예 7

병에 걸린 피부에 대한 면역 조직 화학 및 조직학

수포성 유사천포창, 포진피부염, 및 후천성 수포성 표피 박리증(EBA)의 영향을 받은 환자로부터의 파라핀-포매 피부 샘플을, 시각화를 위해 3,3'-디아미노벤지딘을 사용하여, GzmB(ABCAM, 캐나다 온타리오주 토론토 소재) 및 콜라겐 VII(ABCAM, 캐나다 온타리오주 토론토 소재), 및 α6(ABCAM) 및 β4(ABCAM) 인테그린, 및 Novared^®를 통해 시각화된 콜라겐 XVII(독일 프라이부르크 소재 대학 의학 센터 프라이부르크의 클라우스-베르너 프란츠커(Claus-Werner Franzke) 박사의 관대한 선물)을, 면역 조직 화학적 분석을 위해 시각화했다. 선택적 복부 성형술을 받은 환자로부터 얻은 건강한 피부를 대조군으로 사용했다. 세포 침윤 및 조직 구조를 관찰하기 위해, 확립된 방법을 사용하여 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색도 실시했다. H&E 슬라이드를 탈염색하고 GzmB에 대해 동일한 섹션을 탐침하여, GzmB-생성 면역 세포를 검출했다. 모든 슬라이드는 Aperio CS2 슬라이드 스캐너(온타리오주 콘코드 소재 Leica)를 사용하여 스캔했다.

상이한 천포창 아형을 갖는 환자들로부터의 인간 피부 수포의 생체외 섹션도 검사하여, GzmB가 병변 내 또는 병변 주변의 표피에 존재하는지를 확인했다. 포르말린 고정되고 파라핀 포매된 천포창 수포 조직을, 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 및 GzmB에 대한 면역 염색에 의해 분석했다. 건강한 피부와 비교하여, 표피 내에 확산된 GzmB 염색이 있었고, 극세포 분리 자리는 포진성 천포창, 낙엽천포창, 및 증식천포창에서 확인됐다. GzmB 수준의 최대 증가는 수포 및 수포 유체 내에서, 특히 IgA 천포창, 헤일리-헤일리 질환 및 제한된 구강 보통천포창에서 확인되었다. 그러나, 보통천포창 및 부신생물 천포창는 낮은 GzmB의 농도를 보인 반면, 진피 내에서의 GzmB 축적의 증거는 여전히 남아있었다.

DEJ 단백질 절단 검정

재조합 인간 인테그린 α6/β4(α6 aa 24-878, β4 aa 28-710, 미네소타주 미네아폴리스 소재 R&D Systems), 콜라겐 VII(199-482 a.a., 캘리포니아주 샌 디에고 소재 MyBiosource), 콜라겐 XVII(a.a. 490-1497, 클라우스-베르너 프란츠커 박사의 관대한 선물), 및 콜라겐 I(콜로라도주 리틀턴 소재 Novus Biologicals)을 200nM 정제된 인간 GzmB(워싱턴주 베인브리지 아일랜드 소재 EmeraldBio)에서 37℃에서 24시간 동안 항온배양했다. 억제 연구를 위해, 반응에 기질을 첨가하기 전에, GzmB를, 600nM 세르핀 A3N(캐나다 앨버타주 에드먼튼소재 앨버타 대학교 크리스 알. 블래클리(Chris R. Bleackley) 박사로부터의 관대한 선물) 또는 100μM의 소형 분자 억제제 화합물 20(브리티시컬럼비아주 밴쿠버 소재 약물 연구 개발 센터의 호의)의 존재하에 37℃에서 1시간 동안 항온배양했다. 24시간의 항온배양 후, 단백질을 변성시키고, 4 내지 20%(α6/β4의 경우), 10%(콜라겐 VII의 경우), 8 내지 10%(콜라겐 XVII의 경우), 또는 7.5%(콜라겐 I의 경우) SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분리했다. 절단을, 항-인간 인테그린 α6 서브-유닛(ABCAM), 항-인간 인테그린 β4 서브-유닛(미네소타주 미네아폴리스 소재 R&D Systems), 항 콜라겐 VII(ABCAM) 및 항-인간 콜라겐 XVII(클라우스-베르너 프란츠커 박사의 선물)을 사용하는 웨스틴 블롯에 의해 검출하고, Li-Cor Odissey® FC(네브라스카주 링컨 소재 Li-Cor)를 사용하여 이미지화했다. 쿠마시 염색을 제조자 지시에 따라 콜라겐 I 절단을 평가를 위해 사용했다.

LC-MS/MS 분석

GzmB 절단 자리를, 앞서 기재된 바와 같이 ATOMS에 의해 확인했다(Doucet and Overall, Meth . Enzymol . 501:275-293, 2011; Doucet and Overall, Mol . Cell Proteomics 10:M110.003533, 2011). 간단하게는, GzmB-소화된 기질 또는 대조군 기질을 변성시키고, 시스테인을 디티오스레이톨로 환원시키고, 요오도아세트아미드로 알킬화시켰다. 1차 아민 그룹을 포름알데히드 및 나트륨 시아노보로하이드라이드로 디메틸화시킨 후, 아세톤 침전시켰다. 펠렛을 1μg/mL MS-등급 트립신(메사추세츠주 월섬 소재 Thermo Fisher Scientific)으로 소화 완충액에 재용해시키고, StageTips™를 사용하여 탈염시켰다(Rappsilber et al., Nat. Protoc . 2:1896-1906, 2007). 샘플을 ReproSilPur™ 120 C18-AQ 1.9μm 입자(마이슈(Maisch) 박사) 컬럼 상의 Impact II™ Q-TOF(메사추세츠주 빌레리카 소재 Bruker)에서 분석하고, easy-n LC ™ 시스템(Thermo Fisher Scientific)에 의해 전달된 물 중 아세토니트릴(0.1% v/v 포름산)의 구배에 의해 용해시켜, 상위 18개 피크의 데이터-의존적 전구체를 선택했다. DataAnalysis 4.3(Bruker)을 사용하여 스펙트럼을 추출하고, 효소 특이성으로서 반특이적 ArgC를, 고정된 개질로서 카바미도메틸화(C) 및 디메틸화(K)를, 그리고 다양한 개질로서 탈아미드화(N, Q), 디메틸화(N-term), 피로글루타민화(Q) 및 산화(M)를 사용하여, Uniprot 인간 단백질체 데이터베이스(2016-02-24 다운로드함; 70,472개 서열)를 검색했다. 잠재적 GzmB 절단 자리를, 펩티드 기대 값<0.01에서 확인되는 확인된 서열에서, 산성 잔기 N-말단을 갖는 반-특이적인 N-말단 디메틸화 펩티드로 확인했다.

피부 절단 검정

선택적 성형 수술을 받은 환자로부터 얻은 새로운 건강한 치부를 실험실로 운반하고,

1mmx4mm 스트립으로 절단했다. 지방 조직 층을 제거하여 진피 및 표피 스트립을 얻었다. 이후, 피부 스트립들을, 300μL의, PBS에서, 200nM GzmB에서 또는 100μM의 화합물 20과 함께 37℃에서 1시간 항온배양을 통해 미리 불활성화된 200nM GzmB에서 37℃에서 12시간 동안 항온배양했다. 항온배양 후, 샘플들을 10% 완충 포르말린으로 밤새 고정시키고, 파라핀 포매하고, 확립된 방법을 사용하여 H&E 염색을 위해 섹션화했다. GzmB가 조직 깊숙이 침투하지 않았을 수 있으므로, 샘플의 가장 바깥쪽 부분을 염색에 사용했다.

결과

GzmB 는 수포성 유사천포창 , 포진피부염 , 및 EBA 에서 DEJ 수준에서 축적된다

수포성 유사천포창, 포진피부염, 및 EBA로부터의 환자 피부 샘플의 면역 조직 화학은, GJmB가 DEJ에 축적된 것을 나타냈다. 구체적으로는, 수포성 유사천포창의 H&E 염색은, 주로 호산구 및 호중구로 구성되는 치밀한 염증성 침윤물을 포함하는 표피하 수포발생을 나타냈다(도 12a 및 12b). 수포 내 및 분리된 표피층 바로 아래 둘 다에서, 호산구가 아닌 대부분의 호중구에서 DEJ 수준에서 강력한 GzmB 염색이 관찰되었다(도 12b). 포진피부염은, 진피 유두의 끝 부분에서 대부분의 호중구와 약간의 호산구로 구성되는 병리학적 표피-아래 틈 및 유두상 농양을 특징으로 한다(도 12a 및 12b). 이러한 유두상 농양은 GzmB에 대해 심하게 염색되었으며, 이는 GzmB의 분비에서의 호중구 및 림프구 병발을 시사한다(12b). DEJ에 인접한 상부 유두상 진피에서 GzmB의 존재가 주로 관찰되었지만, 상피층 내에 포매된 양성 세포도 검출될 수 있다. EBA 피부는, 분리된 표피와 진피 사이의 간극 공간에서 주로 호중구 및 림프구로 구성된 풍부한 면역 침윤물을 갖는 표피 박리를 나타냈다(도 12a 및 12b). BP 및 DH에서 관찰된 것과 유사하게, GzmB는 주로 호중구에서 발견되었다(도 11b).

GzmB 는 시험관내에서 α6 및 β4 인테그린을 이들의 기능을 위해 중추적인 도메인에서 절단한다

GzmB의 존재가 병에 걸린 피부의 DEJ 수준에서 확인되면, 본 발명자들은, GzmB가, DEJ 기능에 있어 중요한 기저막의 중요한 성분인 α6/β4 인테그린, 콜라겐 VII 및 콜라겐 XVII의 절단을 매개함을 확인했다. α6 및 β4 인테그린 서브 유닛 둘 다는 GzmB에 의해 절단되었고(도 13a 및 14a), 전장 α6 인테그린은 ~20, 25 및 37kDa의 단편들을 포함하여 150kDa에서 검출된 반면, 전장 β4(100kDa)의 절단은 ~65kDa의 명백한 단편 및 50kDa의 보다 약한 밴드를 얻었다. 이들 DEJ 성분들의 절단이 실제로 GzmB에 의해 매개되는 것을 확인하기 위해, GzmB-특이적 경쟁 억제제인 화합물 20 및 비가역적 세린 프로테아제 억제제인 세르핀 A3N을 절단 검정에 포함시켰다. 두 억제제 모두는 100μM 및 600nM에서 각각 α6 및 β4 인테그린 서브 유닛의 절단을 예방했다(도 13a 및 도 14a). 또한, α6 및 β4 인테그린의 GzmB 매개 절단이 DEJ 기능을 손상시킬 수 있는지를 평가하기 위해, ATOMS에 의한 질량 분석법을 사용하여 이들 단백질 상의 절단 자리를 확인했다. 본 발명자들은, 이들 단백질 영역이 GzmB에 노출될 가능성이 높기 때문에 α6 및 β4 인테그린의 세포외 도메인에 중점을 두었다. α6 인테그린은, 세포외 β-프로펠러 도메인 내의 FG-GAP 반복체 2, 3, 4, 5 및 7의 Asp100, Asp166, Asp199, Asp302, Asp311, Asp358, Asp482 및 Asp488에서 GzmB에 의해 절단됐고(도 13b 및 도 18a 내지 18i), Glu856에서의 절단 자리도 검출되었다. β4 인테그린 서브유닛의 절단은, Glu223, Asp237 및 Asp272에서의 폰 빌레브란트 인자 A 도메인, 및 Asp611에서의 시스테인 풍부 영역 1, 및 Asp351, Asp442 및 Asp447에서 상기 두 도메인 사이의 링커 영역 내에 있었다(도 13b 및 도 19a 내지 19g).

GzmB 는 리간드 결합 영역에서 콜라겐 VII를 절단한다

웨스턴 블롯을 사용하여, GzmB에 의한 콜라겐 VII 도메인 a.a 199-482의 절단을 평가했다. 상기 단편은 비-콜라겐성 영역 1(NC1)의 일부이며, 이는 ECM의 다른 단백질과의 콜라겐 VII 상호 작용에 대하여 중추적이다(Chen et al., J. Biol. Chem . 272:14516-14522, 1997; Chen et al., J. Invest. Dermatol . 112:177-183,1999). 처리되지 않은 콜라겐 VII 단편이 ~30kDa에서 검출되었으며, GzmB에 의한 콜라겐 VII의 절단은 ~20 및 25kDa에 밴드를 생성했다(도 15b). 한편, 인체에서 가장 흔한 콜라겐인 콜라겐 I은 GzmB에 의해 절단되지 않았다(도 20). 세르핀 A3N을 사용하는 콜라겐 VII 절단의 억제는 ~20 및 25kDa 밴드 둘 다의 출현을 방지하는 반면, 화합물 20 억제는 불완전하고, 절단 밴드는 여전히 ~25kDa에서 검출할 수 있었다(도 15b). 절단 위치에 대해서는, 본 발명자들이 시험한 콜라겐 VII의 NC1 단편이, 폰 빌레브란트 인자 A 도메인에서 Asp193에서, 피브로넥틴-유사 도메인 III-2에서 Glu332 및 Asp390에서, 그리고 피브로넥틴-유사 도메인 III-3 내에서 Asp414에서 GzmB에 의해 절단되었다(도 15b 및 도 21a 내지 21c).

콜라겐 XVII 은 GzmB 절단을 위한 기질이다

헤미데스모좀의 중요한 성분으로서, 콜라겐 XVII은 표피 부착에 관여하는 세포내 구조적 요소와 세포외 구조적 요소를 브릿징(bridging)하는 데 중요한 역할을 한다(Franzke et al., J. Biol . Chem. 280:4005-4008, 2005). GzmB를 사용하는 콜라겐 XVII NC16 외도메인(ectodomain)(a.a 490-1497)의 처리는, 상기 영역의 절단 및 ~100kDa(전장 단백질 ~130kDa)에서의 절단 밴드의 출현을 야기한다. 화합물 20 및 세르핀 A3N 둘 다에 의한 GzmB의 예비-항온배양은, NC16 절단을 방지했다(도 16a). 1 또는 2μg의 단백질을 사용하여 콜라겐 XVII에서의 ATOMS를 시도했다. 콜라겐 XVII의 GzmB-소화된 형태 및 GzmB-소화되지 않은 형태를 각각 중질 디메틸화(¹³cD₂O 포름알데하이드) 및 경질 디메틸화(¹²CH₂O 포름알데하이드) 태그를 통해 비교했다.

DEJ 에서 라이닝된 α6/β4 인테그린 , 콜라겐 VII 및 콜라겐 XVII 은 병든 피부에서 파괴된다

α6 및 β4 인테그린 서브 유닛 및 콜라겐 VII가 GzmB에 대한 기질인 것을 나타내는 웨스턴 블롯 및 ATOMS 분석에 따라, 본 발명자들은 수포성 유사천포창, 포진피부염, 및 EBA 피부 샘플에서의 이들의 완전성을 평가하고자했다. 정상 피부의 α6 인테그린에 대한 염색은, 진피에서 혈관 주위에 그리고 DEJ에서 연속적인 선으로 주로 국소화되었다. 병에 걸린 피부 샘플을 조사했을 때, α6 인테그린 국소화의 패턴이 모든 병태에서 유사하여 전체 섹션에 걸쳐 산란된 염색을 나타냈으며, 이는 단백질 단편화를 나타내는 것일 수 있다(도 13c). DEJ에서, 표피 박리 영역 및 표피가 진피에 계속 부착되어 있는 섹션 둘 다에서, 염색이 부재하거나, 약하거나, 또는 조직화되지 않았다(disorganized)(도 13c). 인테그린 β4의 경우, 강력하고 매우 국소화된 염색은, 건강한 피부, 및 표피가 진피에 고정되어 있는 영역에서의 수포성 유사천포창 및 포진피부염에서의 DEJ를 나타냈다(도 14c). 그러나, 인테그린 β4 염색은 연구된 모든 병태에서 표피 분리 영역에서 완전히 부재하거나 희미했다(도 14c).

무니(Mooney) 등(J. Cutan . Pathol . 18:417-422, 1991)은, 원반형 홍반루푸스 환자의 DEJ에서 절단된 콜라겐 VII을 이전에 보여주었다. 정상 피부는 표피와 진피 사이의 경계면에서 라이닝된 콜라겐 VII에 대해 연속적이고 강한 염색을 나타낸(도 15c) 반면, 수포성 유사천포창 및 포진피부염에서의 콜라겐 VII 염색은 약하거나 부재했다. NC1에서의 콜라겐 VII의 절단으로 인한 DEJ의 원섬유성 구역 위의 치밀판으로부터의 분리와 일관되게, 질환 둘 다에서의 약한 염색이 수포 또는 유두상 농양의 피부측에 국소화되었다(도 15c). 포진피부염에서, 콜라겐 VII 염색은, 짧은 염색된 섹션들이 표피에 대해 평행하지 않고 수직인 고유한 패턴을 나타냈다. EBA 샘플의 콜라겐 VII 염색은 간헐적인 패턴을 나타냈고, DEJ 세그먼트들은 보다 더 강한 염색을 갖는 영역과 교대로 약한 염색을 나타냈다(도 15c).

최종적으로, 모든 병태에 대한 콜라겐 XVII 염색 패턴은, 다른 기질에서 관찰된 것과 유사했다. 깨끗하고 연속적인 염색 라인은 건강한 피부에서 관찰된 반면, 병에 걸린 피부에서는, DEJ 완전성이 감소된 영역에서 약한 염색이 관찰되었고, 표피가 분리된 피부 섹션에는 거의 부재했다(그림 16b).

GzmB 와 함께하는 항온배양은 건강한 인간 피부에서의 표피의 분리를 야기하고, 화합물 20에 의해 억제된다

GzmB가 수포성 유사천포창, 포진피부염, 및 EBA의 DEJ에서 풍부하고 주요 접합 단백질을 절단할 수 있기 때문에, GzmB 단백질 분해의 새로-단리된 인간 피부에서 DEJ 완전성에 대한 직접적인 영향을 평가했다. 표피 및 진피를 포함하는 건강한 피부의 ~1mmx4mm 스트립을 GzmB의 200nM 용액에서 37℃에서 12시간 동안 침지 및 항온배양했다. 항온배양 후, H&E 염색은, PBS 대조군에는 거의 부재했던 GzmB-처리된 샘플에서의 표피와 진피 사이의 틈의 출현을 나타냈다(도 17). GzmB-특이적 억제제 화합물 20을 사용한 GzmB의 불활성화는, DEJ 틈의 형성을 방지하여, PBS 대조군과 유사한 조직 모폴로지를 나타냈다(도 17).

토의

세포외 GzmB는, ECM 절단으로 인한 조절 이상 및/또는 만성 염증 및 손상된 조직 복구와 관련된 병태에서, 병원성의 퍼포린-비의존적 역할을 수행한다는 것이 오늘날 문헌에서 널리 인정되고 있다(Boivin et al., PloS ONE 7:e33163, 2012; Hiebert et al., Cell Death Differ. 20:1404-1414, 2013; Parkinson et al., Aging Cell 14:67-77, 2014; Shen et al., Am. J. Pathol . 186:87-200, 2016). 본 연구에서, 웨스턴 블롯 및 ATOMS는 DEJ의 주요 성분인 α6/β4 인테그린 및 콜라겐 VII이 이들의 고정 기능을 위한 주요 영역에서 GzmB에 의해 절단되는 것을 처음으로 보여주기 위해 사용했다. 또한, 수포성 유사천포창, 포진피부염 및 EBA의 병에 걸린 인간 피부 생검에서, 표피하 수포는, 새롭게 발견된 GzmB 기질 α6/β4 인테그린, 콜라겐 VII 및 콜라겐 XVII의 분해를 수반하여 DEJ에서 높은 수준의 GzmB를 나타낸다는 것도 입증했다. GzmB 활성의 병리학적 관련성을 지지하면서, 본 발명자들은 생리학적으로 적절한 농도의 GzmB에 노출된 건강한 인간 피부에서 표피의 진피로부터의 부분적 분리를 보고했으며, 이러한 분리는 GzmB-특이적 억제제에 의해 방지될 수 있는 것을 보여주었다. 이러한 데이터는, 상이한 자가 면역 표피하 수포발생 병인에서의 GzmB에 대한 일반적인 세포외 역할을 제안한다.

α6/β4 인테그린의 중요성에 대한 증거는, 동물 모델로부터(van der Neut et al., Nat. Genet. 13:366-369, 1996) 그리고 심각하고 종종 치명적인 인간 수포발생 질환으로부터 기인한다. α6/β4, 및 항-α6/β4 인테그린 자가 항체의 생산을 포함하는 인테그린 복합체의 돌연변이 및 결핍(Leverkus et al., Br. J. Dermatol. 145:998-1004, 2001; Kiss et al., Ann. NY Acad . Sci . 1051:104-110, 2005)은, 광범위한 점막-피부 수포발생을 특징으로 하는 치명적인 표현형에 기여한다. 여러 연구는, 수포성 표피 박리증의 수많은 하위 유형에서의, α6/β4 인테그린을 코딩하는 유전자의 돌연변이(Ruzzi et al., J. Clin . Invest. 99:2826-2831, 1997; Pulkkinen et al., Am. J. Hum. Genet. 63:1376-1387, 1998; Jonkman et al., J. Invest. Dermatol . 119:1275-1281, 2002) 또는 이들의 서브 유닛들 중 하나의 단백질 수준에서의 부재(Niessen et al., J. Cell Sci . 109(Pt 7)1695-1706, 1996) Pt 7) 1695-1706, 1996)를 확인했다. 특히, 필립스 등은, 아직 확인되지 않은 프로테아제에 의한 에피토프의 제자리 단백질 분해 절단이, 접합부 수포성 표피 박리증 환자의 β4 서브 유닛 면역 반응성 상실을 담당할 수 있다고 추측했다(Phillips et al., Histopathology 24:571-576, 1994). 상기 연구에서, 본 발명자들은, GzmB가, 이의 리간드-결합 세포외 도메인의 여러 자리에서, α6 및 β4 인테그린 서브 유닛 둘 다를 절단하는 것을 보여주며(Tuckwell and Humphries, FEBS Lett. 400:297-303, 1997; Oxvig and Springer, Proc . Nat'l . Acad , Sci . USA 95:4870-4875, 1998; Tsuruta et al., J. Biol . Chem . 278:38707-38714, 2003; Pawar et al., Exp . Cell Res. 313:1080-1089, 2007), 이는 분자의 접착 특성을 손상시킬 수 있다. 이러한 세포외 영역의 중요성은, 치명적인 접합부 수포성 표피 박리증에서 설명된 대부분의 미스센스 돌연변이 및 아미노산 결실이 이의 세포외 도메인에 위치하기 때문에(Pulkkinen et al., AJPA 152:935-941, 1998; Pulkkinen et al., AJPA 152:157-166, 1998; Pulkkinen et al., Am. J. Hum. Genet. 63:1376-1387, 1998; Nakano et al., Pediatr . Res. 49:618-626, 2001), 인테그린 β4에 대해 특히 명백하며, 치명적이지 않은 형태와 관련된 미스센스 또는 스플라이스 돌연변이는 빈번하게 세포질 부분에 위치했다(Kambham et al., Am. J. Kidney Dis . 36:190-196, 2000; Nakano et al., Pediatr. Res. 49:618-626, 2001; Koster et al., J. Cell Sci . 116(Pt 1):387-399, 2003). 흥미롭게도, 나카노(Nakano) 등은, 치명적인 돌연변이 p.D131Y/p.G273D를 확인했고, 이는 인테그린 β4가 고도로 보존된 영역에 속할 때 인테그린 β4의 중요한 리간드 결합 자리를 폐지할 수 있다(Nakano et al., Pediatr . Res. 49:618-626, 2001). 본 발명자들이 확인한 GzmB 절단 자리들 중 하나가 Asp272에 있기 때문에, 이는, α6/β4 인테그린의 GzmB-매개 절단이 마찬가지로 상기 분자의 접착 특성에 심각하게 영향을 미칠 수 있는 것을 입증한다.

유두상 진피의 주요 성분으로서, DEJ의 완전성을 위한 기본 또 다른 단백질은 콜라겐 VII이다. 콜라겐 VII 도메인들 중에서, 피브로넥틴-유사 영역은 다수의 ECM 성분과의 상호 작용에 있어 중추적이다. NC1 영역의 재조합 버전을 사용한 연구는, 피브로넥틴 유사 도메인의 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 라미닌 332 및 피브로넥틴과의 강한 결합 친화성을 밝혀냈으며(Chen et al., J. Biol. Chem. 272:14516-14522, 1997; Chen et al., J. Invest. Dermatol. 112:177-183, 1999), 이는, 유두상 진피를 치밀판에 고정시킨다. 콜라겐 VII의 돌연변이 또는 이러한 영역에 대한자가-항체의 생성은 DEJ를 심각하게 파괴시켜, 각각 이영양성 수포성 표피 박리증 및 EBA를 야기한다(Dang and Murrell, Exp . Dermatol . 17:553-568, 2008; Kim and Kim, J. Eur . Acad . Sermatol . Venereol . 27:1204-1213, 2013). 이러한 병태들은 광범위한 표피 분리 및 수포 형성을 특징으로 한다. 피브로넥틴-유사 III-2 도메인에서의 콜라겐 VII의 GzmB-매개 절단은, 본 빌레브란트 인자 A 도메인에서와 마찬가지로 본원 명세서에서, GzmB 억제제 세르핀 A3N 및 화합물 20에 의한 이러한 절단의 억제를 나타낸다(Willoughby et al., Bioorg . Med . Chem . Lett . 12:2197-2200, 2002). 또한, 콜라겐 XVII의 GzmB-매개 절단이 관찰되었으며, 헤미데스모좀의 또 다른 중요한 성분인 α6/β4 인테그린과의 상호 작용은, 기저 각질 세포를 투명판에 고정시키는 단백질 복합체의 어셈블리에 있어 필요하다(Koster et al., J. Cell Sci. 116(Pt2):387-399, 2003). 종합하면, 이러한 관찰은, GzmB가 α6/β4 인테그린 및 콜라겐 XVII의 절단을 통한 기저 각질 세포/투명판 연결 및 콜라겐 VII의 절단을 통한 치밀판/원섬유성 구역의 접착을 방해할 수 있는 것을 보여준다.

DEJ에서의 GzmB 축적은, 예를 들어, SJS/TEN 및 전신 수포성 고정 약물 발진을 포함하는 다수의 계면 피부병에서 관찰된다(Cho et al., J. Am. Acad. Dermatol. 70:539-548, 2014). 그러나, 이러한 프로테아제에 대한 세포외 역할을 고려한 사람이 없었다. 오히려, GzmB는, 퍼포린-의존적 방식으로 CD8⁺ T-세포-매개 및 NK-매개 각질 세포 및 멜라닌 세포 사멸에 기여하는 것으로 제시되어 왔다. 본 발명자들의 결과는, 이러한 가설이 수포발생에서의 GzmB에 대한 병리학적인 역할을 설명하지 않는다는 것을 나타낸다. 대부분의 정상 피부에는 부재했지만, 이전 연구들과 일치하는, 자가 면역 표피하 수포발생 병태인 수포성 유사천포창 및 포진피부염의 DEJ에서 풍부한 GzmB가 관찰되었고(Hussein et al. J. Clin . Pathol . 60:62-71, 2007; Abreu Velez et al., Our Dermatol . Online 4:627-630, 2013), EBA에서 DEJ에서의 이러한 프로테아제의 축적을 처음으로 보여주었다. 항-DEJ 자가-항체-촉발 표피하 수포 형성은 염증성 세포에 침윤하여 분비된 프로테아제에 의해 매개되는 것으로 오랫동안 가정되어 왔다(Jordon et al., J. Invest. Dermatol. 85(Suppl):72s-78s, 1985). 실제로, DEJ에 대한 자가-항체-매개 면역 세포의 동원은, 프로테이나제의 국소적이고 집중적인 탈과립을 지시하기 때문에, 진피-표피 분리를 위한 필수 조건이다(Sitaru and Zillikens, Exp . Dermatol . 14:861-875, 2005). 이러한 메카니즘을 확인하면, 수포성 유사천포창(Mihai et al., J. Cell Mol. Med . 11:1117-1128, 2007), EBA(Sitaru et al., AJPA 161:301-311, 2002), 및 임신 유사천포창(Herrero-Gonzalez et al.. Eur . J. Immunol . 36:1039-1048, 2006) 환자의 혈청에 함유된 자가-항체는, DEJ로의 백혈구 동원을 촉진하여, 이의 분리를 초래한다. GzmB는, 자가 면역 병태들에서의 이러한 DEJ 분리에 대한 중요한 기여자가 될 수 있으며, 그 이유는 본 발명에 이르러 본원 명세서에서 확인된 DEJ 기질이, 이러한 질환들에서 수포발생이 발생하는 영역에 인접하여 분해되기 때문이다.

자가 면역 질환에서의 세포외 GzmB의 병리학적 역할은, 중요한 기질의 물리적 파괴로 제한되지 않을 수 있다. 증가하는 증거는, 항원성 GzmB-생성 펩티드 단편들이 몇몇 자가 면역 질환의 전파를 유지하는 피드-포워드 루프의 일부라는 것을 시사한다(문헌[Darrah and Rosen, Cell Death Differ. 17:624-632, 2010]에서 재검토됨). 연구들은, GzmB는 특정한 자가 면역 병태에서 자가 항원 생성에서 중요한 역할을 하는 것을 제안한다(Nagaraju et al., Arthritis Rheum. 44:2376-2386, 2001; Niland et al., J. Immunol . 184:4025-4032, 2010; Darrah et al., J. Proteome Res. 16:355-365, 2017). 본원 명세서에서, GzmB는, 특정한 유사천포창 질환, 수포성 유사천포창, 및 EBA를 갖는 환자 각각의 혈청에 존재하는 자가 항체에 의해 인식되는 에피토프 영역에서, α6/β4 인테그린, 콜라겐 XVII 및 콜라겐 VII을 절단하는 것으로 입증되었다. 경구 유사천포창에서, 확인된 자가-에피토프들 중 하나는 α6 인테그린의 펩티드 a.a. 292-305이다(Rashid et al., J. Immunol. 176:1968-1977, 2006). 시험관내에서, 본 발명자들은, GzmB가 잔기 Asp199 및 Asp302에서 α6 인테그린을 절단하는 것을 보여주었고, 따라서 GzmB는 생체내에서 이러한 항원 단편을 잠재적으로 생성하여, 지속적인 면역 반응의 주기를 확립하고, 항원 단편을 추가로 생성할 수 있다.

상기 언급한 바와 같이, 콜라겐 XVII의 NC16 영역의 GzmB-매개 절단도 관찰되었다. 콜라겐 XVII 자가-항체의 생성은 수포성 유사천포창를 초래하는 반면(Zimina et al., J. Invest. Dermatol. 128:2736-2739, 2008; Nishie, J. Dermatol. Sci. 73:179-186, 2014), 상기 단백질의 NC16 엑토도메인에서의 돌연변이는 특정 형태의 접합부 수포성 표피 박리증과 관련되어 있다(McGrath et al., AJPA 148:1787-1796, 1996; Schumann et al., Am. J. Hum. Genet. 60:1344-1353, 1997). 콜라겐 XVII의 NC16 영역의 특정 GzmB 절단 자리가 ATOMS를 통해 확인되지 않았지만, 이러한 도메인은 수포성 유사천포창의 면역 우세 영역이며, 이의 재조합 형태는 상기 병태의 영향을 받는 환자의 약 85%에서 특정한 자가 항체를 검출하는 데 사용된다(Giudice et al., J. Immunol . 151:5742-5750, 1993; Murakami et al., J. Dermatol . Sci . 13:112-117, 1996).

마지막으로, 몇몇 그룹은 EBA에서, T 세포 및 B 세포가 콜라겐 VII의 NC1 도메인의 동일한 영역을 표적으로 한다는 것을 입증했다(Jones et al., J. Invest. Dermatol. 104:231-235, 1995; Mueller et al., Clin. Immunol. 135:99-107, 2010). 특히, 라피에르(Lapiere) 등은, 콜라겐 VII의 상이한 단편들을 19명의 EBA 환자로부터의 혈청과 함께 항온배양하고, 16개의 혈청이 피브로넥틴-유사 III 도메인 1 내지 4로 구성된 융합 단백질과 강하게 반응한 것을 관찰했다(Lapiere et al., J. Clin. Invest. 92:1831-1839, 1993). 콜라겐 VII의 NC1 도메인은, Fc-의존성 호중구 활성화 및 진피-표피 분리 유도도 매개한다(Sitaru et al., AJPA 161:301-311, 2002).

요약하면, 본 발명의 연구는, GzmB 세포외 단백질 분해가, 자가 면역 수포발생 피부 병태에서 DEJ 손상을 통해, 각질하, 표피내 및 표피하 수포발생에 직접 기여한다는 것을 처음으로 보여준다. GzmB의 억제는, 자가 면역 수포발생을 포함하여, 각질하, 표피내 및 표피하 수포발생의 치료 및 예방을 위한 신규한 치료학적 접근법을 나타낸다.

본 발명의 바람직한 양태가 예시되고 설명되었지만, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경이 이루어질 수 있는 것이 이해될 것이다.

Claims (21)

1. 피부의 수포발생 및/또는 박리를 치료 및/또는 예방하기 위한 조성물로서, 상기 조성물이, 화학식 I의 화합물, 이의 입체 이성질체, 토토머 또는 약제학적으로 허용되는 염 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 조성물.
   [화학식 I]
   

   

   
   상기 화학식 I에서,
   R₁은,
   (a) 1,2,3-트리아졸릴, 및
   (b) 1,2,3,4-테트라졸릴로부터 선택되는 헤테로아릴 그룹이고;
   n은 1 또는 2이고;
   R₂는, 수소, C1-C6 알킬, 및 C3-C6 사이클로알킬로부터 선택되고;
   R₃은,
   (a) 수소,
   (b) 카복실산, 카복실레이트, 또는 카복실레이트 C₁-C₈ 에스테르 그룹(-CO₂H, -CO₂ ^-, -C(=O)OC₁-C₈)으로 임의로 치환된 C₁-C₄ 알킬, 알킬헤테로아릴 그룹으로 임의로 치환된 아미드로 임의로 치환된 C₁-C₄ 알킬, 또는 헤테로아릴 그룹으로 임의로 치환된 C₁-C₄ 알킬로부터 선택되고;
   Z는,
   (a)

   

   , 및
   (b)

   

   의 그룹으로부터 선택되는 아실 그룹이고,
   상기 화학식들에서,
   Y는, 수소, 헤테로사이클, -NH₂ 또는 C₁-C₄ 알킬이고;
   R₄는,
   (i) C₁-C₁₂ 알킬,
   (ii) C₁-C₆ 알킬로 임의로 치환된 C₁-C₆ 헤테로알킬,
   (iii) C₃-C₆ 사이클로알킬,
   (iv) C₆-C₁₀ 아릴,
   (v) 헤테로사이클릴,
   (vi) C₃-C₁₀ 헤테로아릴,
   (vii) 아르알킬, 및
   (viii) 헤테로알킬아릴로부터 선택되고;
   R₅는 헤테로아릴 또는 -C(=O)-R₁₀이고, 여기서, R₁₀은,
   (i) C₆-C₁₀ 아릴, C₁-C₁₀ 헤테로아릴, 아미노, 또는 카복실산으로 임의로 치환된 C₁-C₁₂ 알킬,
   (ii) C₁-C₆ 알킬 또는 카복실산으로 임의로 치환된 C₁-C₁₀ 헤테로알킬,
   (iii) C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₆-C₁₀ 아릴, 임의로 치환된 C₃-C₁₀ 헤테로아릴, 아미노, 또는 카복실산으로 임의로 치환된 C₃-C₆ 사이클로알킬,
   (iv) C₁-C₆ 알킬, 임의로 치환된 C₆-C₁₀ 아릴, 임의로 치환된 C₃-C₁₀ 헤테로아릴, 아미노, 또는 카복실산으로 임의로 치환된 C₆-C₁₀ 아릴,
   (v) 헤테로사이클릴,
   (vi) C₃-C₁₀ 헤테로아릴,
   (vii) 아르알킬, 및
   (viii) 헤테로알킬아릴로부터 선택된다.
2. 제1항에 있어서, 상기 화합물이, C1, C2, C3, C4, C5, C6, 및 이들의 입체 이성질체, 토토머, 또는 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 4-(((2S,3S)-1-((2-((S)-5-(((2H-테트라졸-5-일)메틸)카바모일)-3-사이클로헥실-2-옥소이미다졸리딘-1-일)-2-옥소에틸)아미노)-3-메틸-1-옥소펜탄-2-일)아미노)-4-옥소부탄산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 경구 투여, 비강 투여, 국소 투여, 각질하 투여, 표피내 투여, 표피하 투여용으로 또는 주사에 의한 투여용으로 제형화되는, 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 국소 제형이 피부 투과 향상제를 추가로 포함하는, 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 피부 투과 향상제가 프로필렌 글리콜인, 조성물.
7. 제5항에 있어서, 상기 국소 제형이 점도 향상제를 추가로 포함하는, 조성물.
8. 제7항에 있어서, 상기 점도 향상제가 가교결합된 폴리아크릴레이트 중합체인, 조성물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 국소 제형의 pH가 약 4 내지 약 7.4인, 조성물.
10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 국소 제형의 pH가 약 6.0인, 조성물.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 국소 제형이, 약 0.5 내지 약 20mg/mL의 화학식 I의 화합물을 포함하는 겔 형태인, 조성물.
12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 국소 제형이, 약 10mg/mL의 화학식 I의 화합물을 포함하는 겔 형태인, 조성물.
13. 대상체의 피부의 수포발생 및/또는 박리를 치료 및/또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법이, 피부의 수포발생 및/또는 박리의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게, 치료학적 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 투여함을 포함하는, 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 조성물이, 경구 투여, 비강 투여, 국소 투여, 각질하 투여, 표피내 투여, 또는 표피하 투여용으로 제형화되는, 방법.
15. 제13항에 있어서, 상기 조성물이 주사에 의한 투여용으로 제형화되는, 방법.
16. 대상체의 수포발생되고/수포발생되거나 박리된 피부를 치유하는 방법으로서, 상기 방법이, 수포발생되고/수포발생되거나 박리된 피부의 치유를 필요로 하는 대상체에게, 치료학적 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 투여함을 포함하는, 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 조성물이 경구 투여, 비강 투여, 국소 투여, 각질하 투여, 표피내 투여, 또는 표피하 투여용으로 제형화되는, 방법.
18. 제16항에 있어서, 상기 조성물이 주사에 의한 투여용으로 제형화되는, 방법.
19. 대상체의 피부의 수포발생 및/또는 박리를 감소 및/또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법이, 피부의 수포발생 및/또는 박리의 감소 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게, 치료학적 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 투여함을 포함하는, 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 조성물이, 경구 투여, 비강 투여, 국소 투여, 각질하 투여, 표피내 투여, 또는 표피하 투여용으로 제형화되는, 방법.
21. 제19항에 있어서, 상기 조성물이 주사에 의한 투여용으로 제형화되는, 방법.

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