KR20190140778A - 브로모페놀 화합물을 포함하는 지방세포분화 억제용 조성물 - Google Patents
브로모페놀 화합물을 포함하는 지방세포분화 억제용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 브로모페놀(bromophenol) 화합물을 유효성분으로 포함하는 지방세포분화 억제용 조성물, 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 비만의 개선 또는 예방용 건강기능식품용 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 감마(peroxisome proliferator-activated receptor-γ; PPARγ) 활성을 억제함으로써 AMP-활성 단백질 인산화효소를 활성화하여 결론적으로는 항비만 효과를 나타낼 수 있다.
Description
본 발명은 브로모페놀(bromophenol) 화합물을 포함하는 지방세포분화 억제용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 모로우붉은실로부터 분리한 브로모페놀 화합물인 5-Bromo-3,4-dihydroxybenzaldehyde 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하고 AMP-활성 단백질 인산화효소(AMP-activated protein kinase, AMPK)의 활성화를 통한 지방세포 분화 억제용 조성물, 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 또는 비만의 개선 또는 예방용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
비만은 전세계적으로 점점 증가하는 추세이며 단순히 외모 상의 문제뿐만 아니라 이와 관련된 여러 성인병의 주요한 원인으로 작용하여 심각한 문제로 대두되고 있다. 기존의 비만치료제들은 심각한 부작용 및 장기 사용에 대한 안전성이 확보되지 않아 현재 다양한 천연물 유래 항비만 치료제를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.
비만과 깊은 관련이 있는 지방조직은 인체 에너지 항상성 유지에 필수적인 역할을 수행한다. 비만은 대부분 에너지 불균형에 의해 발생하며, 지방세포의 크기 및 숫자의 증가가 생체 내 지방 축적의 직접적인 원인으로 알려져 있다. 따라서 비만 치료제 개발에 있어 지방세포는 가장 중요한 타겟 중 하나이다.
지방세포 분화과정에는 퍼옥시좀 증식체 활성화수용체 감마(peroxisome proliferator-activated receptor-γ; PPARγ), Ccaat 증폭체 결합 단백질 (CCAAT/enhancer-binding proteins α; C/EBPα), 스테롤 조절요소 결합 단백질 1 (sterol regulatory element-binding protein 1; SREBP 1)이라 불리는 지방세포 특이 전사 인자가 중추적인 역할을 담당하고 있다. 이들 주요 전사인자의 조절을 통하여 지방세포로의 분화를 억제하여 지방축적을 감소시킬 수 있다. 따라서, 최근 지방세포로의 분화 억제를 통하여 지방세포생성 및 지방축적을 감소하는 물질을 탐색하는 연구가 각광 받고 있다.
모로우붉은실(Polysiphonia morrowii)은 붉은색을 띄는 홍조류로서 가느다란 실 모양으로 기는 줄기에서 여러 개의 중심 줄기가 나와 다발을 이루는 식물체로 알려져 있다. 모로우붉은실 유래 브로모페놀 화합물은 항염증 활성, 항산화 활성, 항균활성 등 다양한 생물학적 활성을 나타내는 것으로 보고된 바 있다. 그러나 5-Bromo-3,4-dihydroxybenzaldehyde(BD)의 항비만 활성에 관한 연구는 미미한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 모로우붉은실 유래의 브로모페놀 화합물 일종인 5-Bromo-3,4-dihydroxybenzaldehyde(BD)를 포함하는 조성물의 경우, 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 감마(peroxisome proliferator-activated receptor-γ; PPARγ) 활성을 억제함으로써 AMP-활성 단백질 인산화효소를 활성화하여 결론적으로는 항비만 효과를 나타낼 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 감마(peroxisome proliferator-activated receptor-γ; PPARγ) 활성을 억제함으로써 AMP-활성 단백질 인산화효소를 활성화하여, 결론적으로는 항비만 효과를 나타낼 수 있는 지방세포 분화 억제용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 상기 지방세포 분화 억제용 조성물을 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 상기 지방세포 분화 억제용 조성물을 포함하는 비만의 개선 또는 예방용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 브로모페놀(bromophenol) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 AMP-활성 단백질 인산화효소(AMP-activated protein kinase, AMPK)의 활성화를 위한 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
본 발명의 지방세포 분화 억제용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 감마(peroxisome proliferator-activated receptor-γ; PPARγ) 활성을 억제함으로써 AMP-활성 단백질 인산화효소를 활성화하는 것을 특징으로 한다.
퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체는 세포 분화, 성장 및 대사 조절에 매우 중요한 기능을 담당하고 있으며, PPARα, PPARγ, PPARβ/δ로 분류되는 3개의 동형(isoform)이 존재한다. 그 중, 상기 퍼옥시좀 증식체 활성화수용체 감마(peroxisome proliferator-activated receptor-γ; PPARγ)는 주로 지방조직에서 발현되는 전사인자로서 지방분화뿐만 아니라, 지질 대사, 지방산 및 혈당을 조절하는 대표적인 조절 인자로 잘 알려져 있다. 특히, PPARγ는 지방조직의 “형성”과 “축적”에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있기 때문에 PPARγ의 발현을 조절할 경우, 비만을 예방, 개선 및 치료에 효과적일 것이다.
본 발명의 지방세포 분화 억제용 조성물에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 브로모페놀(bromophenol) 화합물은 모로우붉은실(Polysiphonia morrowii)로부터 분리된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 브로모페놀 화합물인 5-Bromo-3,4-dihydroxybenzaldehyde(BD)은 모로우붉은실을 분쇄하거나 절단한 것을 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 30 내지 100% 에탄올 기타 용매에 가용한 추출물을 포함한다.
바람직한 추출 방법의 한 예로 모로우붉은실을 농도 0 ~ 95% 에탄올을 이용하여 실온에서 3회 이상 추출하여 얻어지는 여과액을 진공 조건에서 증발시켜 용매를 제거하고 추출물을 수득하였다. 상기 수득 방법으로 얻어진 모로우붉은실의 추출물을 물에 녹이고 클로로포름으로 분획한 후, 상기 클로로포롬 분획물을 클로로포름-수성메탄올 혼합물(30:1:1)을 단계 용리액으로 하여 실리카 칼럼 크로마토그래피를 수행하여, 활성 분획을 분리함으로써 본 발명의 브로모페놀 화합물인 5-Bromo-3,4-dihydroxybenzaldehyde(BD)를 수득할 수 있다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 브로모페놀(bromophenol) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
본 발명의 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 조성물은 지방전구세포인 3T3-L1의 지방세포로의 분화를 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 조성물은 PPARγ, C/EBPα 및 SREBP 1로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실험예에 따르면, 본 발명에 따른 브로모페놀(bromophenol) 화합물을 지방세포에 농도 별로 처리한 결과, 처리 농도가 증가함에 따라 지방세포를 분화시키는 인자인 PPARγ, C/EBPα 및 SREBP 1의 단백질 발현량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는, 본 발명에 따른 브로모페놀(bromophenol) 화합물인 5-Bromo-3,4-dihydroxybenzaldehyde(BD)가 상기 인자의 발현을 감소시켜 지방세포 분화를 억제함으로써 항비만 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다(도 5 참조).
본 발명의 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 조성물은 AMP-활성 단백질 인산화효소(AMP-activated protein kinase, AMPK) 및 ACC의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실험예에 따르면, 본 발명에 따른 브로모페놀(bromophenol) 화합물을 지방세포에 농도 별로 처리한 결과, 농도가 증가함에 따라 지방산 합성을 억제하는 인자인 AMPK 및 ACC의 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는, 본 발명에 따른 브로모페놀(bromophenol) 화합물인 5-Bromo-3,4-dihydroxybenzaldehyde(BD)가 상기 인자 AMPK 및 ACC의 발현을 증가시켜 지방산 및 콜레스테롤 합성을 억제하고, 지방산 산화를 촉진함으로써 항비만 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다(도 6 참조).
본 발명의 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 조성물은 화학식 1의 화합물 0.1 내지 80mg/kg을 포함하는 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 상기 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 조성물은 1일 0.01 내지 3,000㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.1 내지 80㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 외용투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고 수회 나누어 투여할 수도 있다. 그러나 상기 투여량은 예시하기 위한 일예에 불과하며 상기 범위에 한정되지 않는다.
본 발명의 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 약학적 조성물은 정제, 캡슐제, 용액, 시럽제, 현탁제, 주사제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 제형으로 제제화된 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 상기 산제 및 정제는 활성 성분을 약 5 내지 약 95% 포함할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 하기 화학식 1로 표시되는 브로모페놀(bromophenol) 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비만의 개선 또는 예방용 건강기능식품 조성물을 제공하는데 있다.
[화학식 1]
본 발명의 비만의 개선 또는 예방용 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료로 구성되는 군으로부터 선택된 하나이상의 제형으로 제조된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물에서 5-Bromo-3,4-dihydroxybenzaldehyde(BD) 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 첨가할 수 있는 식품으로는 각종 식품류, 예를 들어 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
이때 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 일반적으로 본 발명의 식품 조성물의 경우 전체 식품 중량의 0.0001 내지 10 중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물의 경우 100㎖을 기준으로 0.0001 내지 10 중량%를 가할 수 있다.
본 발명에서 정의되는 식품보조첨가제는 당업계에서 통상적으로 사용되는 식품첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함하는 것으로, 건강기능식품 조성물에 포함될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 브로모페놀 화합물인 5-Bromo-3,4-dihydroxybenzaldehyde(BD)을 포함하는 조성물은 지방세포를 분화하는 인자인 PPARγ, C/EBPα 및 SREBP 1의 발현을 억제하여, 지방산 합성을 억제하는 AMPK 및 ACC을 활성화시킴으로써 지방세포 분화를 억제할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 브로모페놀 화합물인 5-Bromo-3,4-dihydroxybenzaldehyde(BD)을 포함하는 조성물은 지방세포 분화 억제를 통한 항비만을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물로 이용할 수 있을 뿐만 아니라 항비만을 개선하기 위한 건강기능식품 조성물로서 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 브로모페놀 화합물의 화학 구조식을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실험예에 따른 본 발명에서 분리한 브로모페놀 화합물의 세포독성을 확인한 결과를 나타낸다(A: 24시간, B: 48시간).
도 3은 본 발명의 일 실험예에 따른 지방축적 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실험예에 따른 중성지방 함량을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 지방세포 분화에 관여하는 인자의 단백질 발현량을 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 지방생성을 억제하는 인자의 단백질 발현량을 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실험예에 따른 본 발명에서 분리한 브로모페놀 화합물의 세포독성을 확인한 결과를 나타낸다(A: 24시간, B: 48시간).
도 3은 본 발명의 일 실험예에 따른 지방축적 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실험예에 따른 중성지방 함량을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 지방세포 분화에 관여하는 인자의 단백질 발현량을 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 지방생성을 억제하는 인자의 단백질 발현량을 확인한 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 모로우붉은실로 추출물로부터의 브로모페놀 화합물의 분리
한국 제주도 해안에서 홍조류인 모로우붉은실(Polysiphonia morrowii)을 채취하여 준비하였다.
샘플들은 수돗물로 3회 세척하여 표면의 염분, 착생식물 및 모래 등을 제거하고, 신선한 물로 주의 깊게 세척(rinse)하였으며, -20℃의 의료용 냉동고에서 보관하였다. 냉동된 샘플들은 추출을 수행하기 전에 감압 하에 동결건조(lyophilize) 및 균질화(homogenize)를 실시하였다. 상기 분말화된 모로우붉은실(500g)을 80% 수성 메탄올(2L) 용액으로 3회 추출하고 여과하였다. 여과액을 진공 조건에서 증발시켜 80% 수성메탄올 추출물을 수득하였다.
상기 수득한 수성메탄올 추출물을 증류수에 용해하고 클로로포름으로 분획하였다. 상기 클로로포름 분획물을 클로로포름-수성메탄올 혼합물(30:1-1:1)을 단계 용리액으로 하여 실리카 칼럼 크로마토그래피를 수행하여, 활성 분획을 분리하였다.
실리카 겔 크로마토그래피로부터 수득한 결합된 활성 분획은 100% 메탄올을 이용하여 Sephadex LH-20 칼럼으로 분별하고, 최종적으로 고성능액체크로마토그래피를 이용하여 본 발명의 브로모페놀 화합물인 5-Bromo-3,4-dihydroxybenzaldehyde(BD)를 수득하였다.
모로우붉은실로부터 브로모페놀 화합물을 분리 및 브로모페놀 화합물을 분석한 결과, 도 1과 같이 본 발명엥서 분리한 브로모페놀 화합물은 5-Bromo-3,4-dihydroxybenzaldehyde임을 확인하였다.
준비예: 세포의 준비(배양 및 분화)
ATCC(American Type Culture Collection; Rockville, MD, USA)로부터 분양 받은 지방 분화 억제 지방전구세포인 3T3-L1를 1% PS 및 10% BCS가 포함된 DMEM 배지를 이용하여 37°C 및 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.
분화를 유도하기 위하여, 상기와 같이 배양 2일 후에 융합된 전지방세포를 MDI 분화 배양액(1% PS, 10% FBS, 0.5 mM IBMX, 0.25 μM 덱사메타손 및 5 μg/ml 인슐린을 포함하는 DMEM)에서 2일 동안 배양하였다. 상기 2일 동안 배양된 세포는 다시 1% PS, 10% FBS 및 5 μg/mL 인슐린이 포함된 DMEM 배양액에서 추가적으로 2일 동안 배양하였다. 그 후에, 세포는 1% PS 및 10% FBS를 포함하는 새로운 DMEM 배양액에서 정치 시켰으며, 배양액은 2일에 한번씩 갈아주었다.
또한, 정제된 화합물의 전지방세포에서 지방세포의 분화에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 세포를 화합물이 존재하는 MDI 배양액에서 배양하였다. 분화는 비장세포 마커의 발현율 및 지방 입자의 생성률을 측정하여 확인하였으며, 상기 측정은 배양 한지 8일째 되는 날 수행하였다.
상기 배양 및 분화된 세포는 다음의 실험에서 이용하였다.
실험예 1: MTT 분석을 이용한 세포 독성 평가
3T3-L1를 24 웰 플레이트(well plate)에 전배양 한 다음, 실시예 1에서 분리한 브로모페놀 화합물(5-Bromo-3,4-dihydroxybenzaldehyde)을 37℃에서 24시간(A) 및 48시간(B) 동안 처리 하였다. 그 다음, MTT stock solution(50㎕; 2mg/ml in PBS)을 각 웰에 추가하고 4시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 후 모든 웰에서 배양된 배양액을 제거하였으며, 세포에 생성된 포르마잔은 300㎕ DMSO를 첨가하여 용해시켰다.
흡광도는 ELISA reader를 사용하여 540nm에서 측정하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 그 결과, 도 2에서 확인할 수 있듯이 본 발명에 따른 브로모페놀 화합물인 5-Bromo-3,4-dihydroxybenzaldehyde는 24시간(A) 및 48시간(B) 모두에서 세포독성을 나타내지 않았다.
실험예 2: Oil Red O 염색을 이용한 지질 축적의 확인
6 웰 플레이트(well plate)에 배양된 세포 및 지방세포 분화를 8일 동안 유도하였으며, 8일 째에 종래에 이용되는 방법에 따라(Ramirez-Zacarias et al., 1992) Oil Red O로 염색하였다.
간략하게 서술하면, 세포를 PBS로 세척한 다음 10% 포르말린 버퍼로 고정시키고, Oil Red O 용액(0.7 g in 200 mL of isopropanol)으로 1시간 동안 실온에서 염색하였다. 1 시간 후에 Oil Red O 염색 용액을 제거하였다. 염색된 지질 입자의 이미지는 광학 현미경으로 촬영하였다. 마지막으로, 세포에 남아있는 염색 시약은 이소프로판올(isopropanol)로 녹여서 분리한 다음, 그 양을 520nm 흡광도로 측정하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
그 결과, 도 3에서 확인할 수 있듯이 본 발명에 따른 브로모페놀 화합물인 5-Bromo-3,4-dihydroxybenzaldehyde은 지방축적을 억제시키는 것을 확인할 수 있다.
실험예 3: 중성지방 함량 측정
세포의 중성지방 함량은 통상의 triglyceride colorimetric assay kit(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 키트의 사용 설명서에 따라 확인하였다.
구체적으로, 배양된 세포는 PBS로 두 번 세척하고, 균질화 용액을 넣어 스크래퍼를 이용하여 세포를 모두 모은 후, 초음파 분쇄기를 이용하여 균질화하였다. 남은 세포 용해물은 300xg로 4℃에서 5분 동안 원심분리하여 지방층을 제거하였다. 그 다음, 남은 상층액을 이용하여 중성지방 및 단백질의 함량을 측정하였다.
중성지방은 calibration standard로서 소혈청알부민을 이용하여 각각의 단백질 농도를 표준화하였다. 결과는 밀리그램 단위의 중성지방 총 양을 세포 단백질 당량(밀리그램 단위)으로 나타내었다(도 4).
그 결과, 도 4에서 확인할 수 있듯이 본 발명에 따른 브로모페놀 화합물인 5-Bromo-3,4-dihydroxybenzaldehyde은 중성지방 함량을 감소시키는 것을 확인할 수 있다.
실험예 4: 웨스턴 블롯팅 분석
본 발명에 따른 브로모페놀 화합물인 5-Bromo-3,4-dihydroxybenzaldehyde가 지방세포 분화와 관련된 전사 인자(PPARγ, C/EBPα, SREBP 1) 및, 지방생성을 억제하는 인자(AMPK, ACC)의 단백질 발현량을 측정하고자 웨스턴 블롯팅을 진행하였다.
구체적으로, 본 발명에 따른 브로모페놀 화합물인 5-Bromo-3,4-dihydroxybenzaldehyde를 0㎛, 25㎛, 50㎛, 100㎛ 의 농도별로 처리한 세포를 용해 버퍼(20 mM Tris, 5 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 1% NP-40, 10 mg/mL 아프로티닌(aprotinin), 10 mg/mL 류펩틴(leupeptin) 및 1 mM PMSF)로 60분 동안 용해시킨 후, 12,000 rpm으로 8℃에서 15분 동안 원심분리 하였다. 단백질 농도는 BCATM protein assay kit를 이용하여 확인하였다. 단백질 50ug이 포함되어 있는 세포용해물을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 전기영동하고 니트로셀룰로즈 막(nitrocellulose membrane)에 블롯팅하였다. 그 다음, 상기 막을 5% non-fat dry milk-TBST(25 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 2.65 mM KCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4)로 2시간 동안 블록킹(blocking)하였다.
이후, 상기 막을 대상 1차 항체들 (1:1000 dilution)과 4℃ 에서 하룻밤 동안 혼성화하였다. 상기 혼성화시킨 막을 TBST로 세척한 막을 2시간 동안 실온에서 2차 항체(1:3000 dilution)들과 혼성화하였다. 항체 반응이 끝난 막에 화학 발광 검출 시약(ECL)을 처리하고, 엑스레이 필름(X-ray film)에 감광시켜 현상하였으며, 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.
그 결과, 도 5에서 확인할 수 있듯이 본 발명에 따른 브로모페놀 화합물인 5-Bromo-3,4-dihydroxybenzaldehyde은 지방세포 분화와 관련된 전사 인자인 PPARγ, C/EBPα 및 SREBP 1의 발현이 감소한 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 6에서 확인할 수 있듯이 본 발명에 따른 브로모페놀 화합물인 5-Bromo-3,4-dihydroxybenzaldehyde은 지방생성을 억제하는 인자인 AMPK 및 ACC의 발현이 증가한 것을 확인할 수 있다.
Claims (11)
- 하기 화학식 1로 표시되는 브로모페놀(bromophenol) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는,
AMP-활성 단백질 인산화효소(AMP-activated protein kinase, AMPK)의 활성화를 통한 지방세포분화 억제용 조성물.
[화학식 1]
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 감마(peroxisome proliferator-activated receptor-γ; PPARγ) 활성을 억제함으로써 AMP-활성 단백질 인산화효소를 활성화하는 것인,
AMP-활성 단백질 인산화효소(AMP-activated protein kinase, AMPK)의 활성화를 통한 지방세포 분화 억제용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 브로모페놀(bromophenol) 화합물은 모로우붉은실(Polysiphonia morrowii)로부터 분리된 것인,
AMP-활성 단백질 인산화효소(AMP-activated protein kinase, AMPK)의 활성화를 통한 지방세포 분화 억제용 조성물.
- 하기 화학식 1로 표시되는 브로모페놀(bromophenol) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는,
비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]
- 제4항에 있어서,
상기 조성물은 지방전구세포인 3T3-L1의 지방세포로의 분화를 억제하는 것인,
비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 조성물은 PPARγ, C/EBPα 및 SREBP 1로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현을 억제하는 것인,
비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 조성물은 AMP-활성 단백질 인산화효소(AMP-activated protein kinase, AMPK) 및 ACC의 발현을 증가시키는 것인,
비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 조성물은 화학식 1의 화합물 0.1 내지 80mg/kg을 포함하는 것인,
비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 정제, 캡슐제, 용액, 시럽제, 현탁제, 주사제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 제형으로 제제화된 것인,
비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 하기 화학식 1로 표시되는 브로모페놀(bromophenol) 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는,
비만의 개선 또는 예방용 건강기능식품 조성물.
[화학식 1]
- 제10항에 있어서,
상기 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료로 구성되는 군으로부터 선택된 하나이상의 제형으로 제조된 것인,
비만의 개선 또는 예방용 건강기능식품 조성물.
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