KR20190128692A - 면역요법을 강화시키기 위한 베타-카테닌 발현의 감소 - Google Patents

면역요법을 강화시키기 위한 베타-카테닌 발현의 감소 Download PDF

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KR20190128692A
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샨티 가네쉬
마크 아브람스
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다이서나 파마수이티컬, 인크.
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Abstract

본 명세서에서 면역요법에 반응성이 아닌 암을 포함하는, 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 일 양상에서, 치료 방법은 대상체에게 치료적 유효량의 β-카테닌 저해제 및 치료적 유효량의 면역치료제를 투여하는 단계를 포함한다. 다른 양상은 암을 치료하는 데 사용하기 위한 β-카테닌 저해제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이되, 조성물은 면역치료제와 병용하여 투여된다. 또 다른 양상은 β-카테닌 저해제, 예컨대 β-카테닌 핵산 저해제 분자를 이용하여 암에 대한 면역요법의 치료적 효과를 강력하게 하는 방법에 관한 것이다.

Description

면역요법을 강화시키기 위한 베타-카테닌 발현의 감소
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 3월 28일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/477,783호의 유익을 주장하며, 이의 출원일에 의존하고, 이 기초출원의 전체 개시내용은 본 명세서에 참고로 편입된다.
서열목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되고 본 명세서에 전체가 참고로 편입된 서열목록을 함유한다. 2018년 3월 23일자로 생성된 상기 ASCII 복제물은 파일명이 0243_0007-PCT_SL.txt이고, 용량이 2 킬로바이트이다.
면역계는 T 세포 활성화를 제어하기 위해 그리고 면역계가 건강한 세포를 표적화하고 자가면역을 유도하는 것을 방지하기 위해 관문으로서 면역 세포의 표면 상에서 소정의 분자를 사용한다. 소정의 암세포는 면역계를 피하기 위해 이들 면역관문 분자의 이점을 취할 수 있다. 최근에, 면역관문 분자, 예컨대 세포독성 T-림프구-연관 단백질-4(CTLA-4) 및 세포예정사 수용체 1(PD-1)을 차단하기 위한 면역치료적 전략은 소정의 암에 대한 성공을 나타내었다. 항-CTLA-4 단클론성 항체(이필리무맙)는 2011년에 진행된 흑색종을 갖는 환자의 치료용으로 승인되었다. 항-PD-1 단클론성 항체(니볼루맙)는 단독으로 또는 이필리무맙과 병용하여, 2014년에 소정의 진행된 암을 갖는 환자의 치료용으로 승인되었다. CTLA-4, PD-1 및 PD-L1과 같은 면역관문 분자를 차단하는 항체는 T 세포 활성화에 대한 브레이크를 방출하고 강한 항-종양 면역 반응을 촉진시키는 것으로 나타난다. 그러나, 환자의 하위집단만이 이런 면역요법에 반응한다.
적어도 소정의 예에서, 면역요법에 반응하는 종양은 침윤성 T 세포와 함께 기존의 T 세포 염증 표현형, 종양 미세환경에 T 세포를 보충하는 광범위한 케모카인 프로파일, 및 고수준의 IFN 감마 분비(또한 뜨거운 종양(hot tumor) 또는 염증 종양으로 불림)를 가진다(Gajewski et al., Nat Immunol., 2013, 14(10):1014-22; Ji et al., Cancer Immunol Immunother, 2012, 61:1019-31). 대조적으로, 면역요법에 반응하지 않는 소정의 종양은 T 세포 염증 표현형을 갖지 않는 것으로 나타났다(또한 차가운 종양 또는 비염증 종양으로서 알려짐). 이하 참조.
면역요법에 반응성인 비-염증 종양을 만드는 선택사항을 비롯한 새로운 암 치료 선택사항을 개발할 당업계의 필요가 남아있다.
전형적으로, 면역요법에 반응성이 아닌 암은 종양 미세환경에서 침윤성 CD8+ T 세포가 거의 또는 전혀 없는 비-T 세포 염증 표현형(또한 차가운 종양 또는 비-염증 종양으로서 알려짐)을 특징으로 한다. 본 출원은 β-카테닌 발현의 감소가 차가운 종양 또는 비-염증 종양을 뜨거운 종양 또는 염증 종양으로 전환시키고, 심지어 활성화된 Wnt/β-카테닌 경로를 갖지 않는 종양에서조차 면역요법의 효과를 강화시킬 수 있다는 것을 개시한다. 다시 말해서, β-카테닌 저해제를 면역요법과 병용함으로써, 면역요법에 정상적으로 반응하지 않는 차가운 종양 또는 비-염증 종양을 치료할 수 있다. 전형적으로, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 짧은 간섭 RNA(siRNA), 통상적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 마이크로RNA(miRNA), 리보자임 및 앱타머를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 β-카테닌 발현을 감소시키는 데 사용된다. 그러나, β-카테닌 발현을 감소시키는 임의의 β-카테닌 저해제 또는 Wnt/β-카테닌 경로 저해제는 소분자, 펩타이드, 및 β-카테닌 또는 Wnt/β-카테닌 경로의 성분을 표적화하는 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 이 병용 요법 접근은 활성화된 Wnt/β-카테닌 경로가 있는 그리고 없는 암을 포함하는 광범위의 다양한 암에 걸쳐 생체내에서 강력하게, 그리고 다수의 예에서 상승적으로 종양 성장을 저해하는 것으로 나타났다.
일 양상은 대상체에게 치료적 유효량의 β-카테닌 저해제 및 치료적 유효량의 면역치료제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 소정의 실시형태에서, 암은 비-Wnt 활성화된 암이다. 다른 실시형태에서, 암은 Wnt 활성화된 암이다. 소정의 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
소정의 실시형태에서, 면역치료제는 저해 면역관문 분자의 길항제 또는 공자극 관문 분자의 작용제이다. 소정의 실시형태에서, 면역치료제는 저해 관문의 길항제이고, 저해 관문은 PD-1 또는 PD-L1이다. 소정의 실시형태에서, 저해 면역관문 분자의 길항제 또는 공자극 관문 분자의 작용제는 단클론성 항체이다. 소정의 실시형태에서, 단클론성 항체는 항-CTLA-4 단클론성 항체, 항-PD-1 단클론성 항체, 항-PD-L1 단클론성 항체, 또는 항-CTLA-4 단클론성 항체와 항-PD-1 단클론성 항체의 조합물이다.
소정의 실시형태에서, 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법은 인간 대상체에 하기를 투여하는 단계를 포함한다:
치료적 유효량의 β-카테닌 핵산 저해제 분자로서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 센스 가닥과 안티센스 가닥 및 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 18 내지 34개의 염기쌍의 상보성 영역을 포함하는 이중 가닥 RNAi 저해제 분자이되, 센스 가닥은 길이가 18 내지 36개의 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥은 길이가 18 내지 38개의 뉴클레오타이드이고 3' 말단에 1 내지 5개의 단일 가닥 뉴클레오타이드를 포함하는, 상기 핵산 저해제 분자; 및
치료적 유효량의 면역치료제로서, 상기 면역치료제는 항-CTLA-4 단클론성 항체, 항-PD-1 단클론성 항체, 항-PD-L1 단클론성 항체, 또는 항-CTLA-4 단클론성 항체와 항-PD-1 단클론성 항체의 조합물을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 길이가 25 내지 35개의 뉴클레오타이드이며, 안티센스 가닥은 길이가 26 내지 38개의 뉴클레오타이드이다.
소정의 실시형태에서, 암은 비-Wnt 활성화된 암이다. 다른 실시형태에서, 암은 Wnt 활성화된 암이다.
소정의 실시형태에서, 대상체는 투여하는 단계 전에 비-Wnt 활성화된 암을 갖는 것으로 동정되었다.
소정의 실시형태에서, 상기 방법은 투여하는 단계 전에, 대상체가 비-Wnt 활성화된 암을 갖는지의 여부를 결정하기 위해 대상체로부터의 종양 샘플을 분석하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 양상은 암을 갖는 대상체에게 암에 대한 면역치료제의 치료 효과를 강화시키기에 충분한 양으로 β-카테닌 핵산 저해제 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 암에 대한 면역치료제의 치료 효과를 강화시키는 방법에 관한 것이다. 소정의 실시형태에서, 암은 비-Wnt 활성화된 암이다. 다른 실시형태에서, 암은 Wnt 활성화된 암이다.
소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자를 투여하기 전에, 암은 면역요법에 내성이 있는 비-T 세포 염증 표현형과 관련되되, β-카테닌 핵산 저해제 분자를 투여하는 단계는 비-T 세포 염증 표현형을 면역치료제에 반응성인 T-세포 염증 표현형으로 전환시킨다.
다른 양상은 암을 치료하는 데 사용하기 위한 β-카테닌 저해제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이되, 조성물은 면역치료제와 병용하여 투여된다.
일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 암을 치료하는 데 사용하기 위한 β-카테닌 핵산 저해제 분자를 포함하되, 조성물은 면역치료제와 병용하여 투여되고, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 센스 가닥과 안티센스 가닥 및 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 18 내지 34개 염기쌍의 상보성 영역을 포함하는 이중가닥 RNAi 저해제 분자이며, 센스 가닥은 길이가 19 내지 36개의 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥은 길이가 19 내지 38개의 뉴클레오타이드이고 3' 말단에 1 내지 5개의 단일 가닥 뉴클레오타이드를 포함하며, 그리고 면역치료제는 항-CTLA-4 단클론성 항체, 항-PD-1 단클론성 항체, 항-PD-L1 단클론성 항체, 또는 항-CTLA-4 단클론성 항체와 항-PD-1 단클론성 항체의 조합물이다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 길이가 25 내지 34개의 뉴클레오타이드이며, 안티센스 가닥은 길이가 26 내지 38개의 뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 암은 비-Wnt 활성화된 암이다. 다른 실시형태에서, 암은 Wnt 활성화된 암이다.
방법 또는 조성물의 소정의 실시형태에서, 면역치료제가 β-카테닌 핵산 저해제 분자와 병용하여 투여되지 않을 때, 비-Wnt 활성화된 암은 면역치료제에 의한 치료에 내성이 있다.
방법 또는 조성물의 소정의 실시형태에서, 비-Wnt 활성화된 암은 흑색종, 신경모세포종, 또는 신세포암이다.
방법 또는 조성물의 소정의 실시형태에서, β-카테닌 저해제는 siRNA, 통상적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, miRNA, 리보자임 및 앱타머를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 β-카테닌 핵산 저해제 분자이다. 방법 또는 조성물의 소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 상보성 영역을 형성하는 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함하는 이중가닥 RNAi 저해제 분자이되, 선택적으로 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 상보성 영역은 약 15 내지 45개의 염기쌍이다.
방법 또는 조성물의 소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 센스 가닥 가닥과 안티센스 가닥 및 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 약 15 내지 45, 18 내지 26 또는 19 내지 21개의 염기쌍의 상보성 영역을 포함하는 이중가닥 RNAi 저해제 분자이다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 15 내지 66개의 뉴클레오타이드이며, 안티센스 가닥은 15 내지 66개의 뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드가 25 내지 40개의 뉴클레오타이드 또는 19 내지 25개의 뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 안티센스 가닥은 25 내지 40개의 뉴클레오타이드 또는 19 내지 25개의 뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 19 내지 25개의 뉴클레오타이드이며, 안티센스 가닥은 19 내지 25개의 뉴클레오타이드이다.
방법 또는 조성물의 소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 테트라루프를 함유한다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 34 내지 40개의 뉴클레오타이드이고, 줄기 및 테트라루프를 함유하며, 안티센스 가닥은 18 내지 24개의 뉴클레오타이드이되, 센스 가닥과 안티센스 가닥은 18 내지 24개의 염기쌍의 이중가닥 영역을 형성한다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 34 내지 36개의 뉴클레오타이드이고, 줄기 및 테트라루프를 함유하며, 안티센스 가닥은 18 내지 24개의 뉴클레오타이드이되, 센스 가닥과 안티센스 가닥은 18 내지 24개의 염기쌍의 이중가닥 영역을 형성한다.
방법 또는 조성물의 소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 센스 가닥과 안티센스 가닥 및 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 18 내지 36개의 염기쌍의 상보성 영역을 포함하는 이중가닥 RNAi 저해제 분자이되, 센스 가닥은 길이가 25 내지 34개의 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥은 길이가 26 내지 38개의 뉴클레오타이드이고 3' 말단에 1 내지 5개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 길이가 18 내지 34개의 뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 이중가닥 RNAi 저해제 분자의 안티센스 가닥은 그의 5' 말단에 1 내지 10개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 추가로 포함한다.
방법 또는 조성물의 소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 센스 가닥과 안티센스 가닥 및 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 20 내지 30, 21 내지 26, 19 내지 24 또는 19 내지 21 염기쌍의 상보성 영역을 포함하는 이중가닥 RNAi 저해제 분자이다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 21개의 뉴클레오타이드를 가지며, 3' 말단에 2개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 포함하고, 안티센스 가닥은 21개의 뉴클레오타이드이고 3' 단부에 2개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 가지며, 센스 가닥과 안티센스 가닥은 19개의 염기쌍의 이중가닥 영역을 형성한다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 21개의 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥은 23개의 뉴클레오타이드이고 3' 단부에 2개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 가지며, 센스 가닥과 안티센스 가닥은 21개의 염기쌍의 이중가닥 영역을 형성하고, 센스 가닥의 3' 단부와 안티센스 가닥의 5' 단부는 평활 말단을 형성한다.
방법 또는 조성물의 소정의 실시형태에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 상보성 영역은 21 내지 26개의 염기쌍이되, 센스 가닥은 길이가 21 내지 26개의 뉴클레오타이드이고, 그리고 안티센스 가닥은 길이가 23 내지 38개의 뉴클레오타이드이고 3' 말단에 1 내지 2개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 안티센스 가닥은 그의 5' 말단에 1 내지 10개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 추가로 포함한다.
방법 또는 조성물의 소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 센스 가닥과 안티센스 가닥 및 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 26개의 염기쌍의 상보성 영역을 포함하는 이중가닥 RNAi 저해제 분자이되, 센스 가닥은 길이가 26개의 뉴클레오타이드이며 그리고 안티센스 가닥은 길이가 38개의 뉴클레오타이드이고 3' 말단에 2개의 뉴클레오타이드의 단일 가닥 돌출부 및 5' 말단에 10개의 뉴클레오타이드의 단일 가닥 돌출부를 포함한다.
이중가닥 RNAi 저해제 분자의 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 서열번호 1의 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다. 이중가닥 RNA 저해제 분자의 소정의 실시형태에서, 안티센스 가닥은 서열번호 2의 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다.
방법 또는 조성물의 소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드이다. 방법 또는 조성물의 소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 인간 β-카테닌 유전자 세그먼트의 역 상보체를 포함하고 길이가 12 내지 30, 12 내지 25, 12 내지 22, 14 내지 20 또는 18 내지 22개의 뉴클레오타이드인 5'에서 3' 방향의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 통상적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 통상적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 길이가 16 내지 18 또는 18 내지 20개의 뉴클레오타이드이다.
방법 또는 조성물의 소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 지질 나노입자로 제형화된다. 소정의 실시형태에서, 지질 나노입자는 양이온성 지질 및 페길화된(pegylated) 지질을 포함한다.
방법 또는 조성물의 소정의 실시형태에서, 면역치료제는 저해 면역관문 분자의 길항제 또는 공자극 관문 분자의 작용제이다. 소정의 실시형태에서, 면역치료제는 저해 관문의 길항제이고, 저해 관문은 PD-1 또는 PD-L1이다. 소정의 실시형태에서, 저해 면역관문 분자의 길항제 또는 공자극 관문 분자의 작용제는 단클론성 항체이다. 소정의 실시형태에서, 단클론성 항체는 항-CTLA-4 단클론성 항체, 항-PD-1 단클론성 항체, 항-PD-L1 단클론성 항체, 또는 항-CTLA-4 단클론성 항체와 항-PD-1 단클론성 항체의 조합물이다.
다른 실시형태에서, 면역치료제는 저해 면역관문 분자의 길항제이되, 저해 면역관문 분자는 PD-1, 예컨대 PD-L1 또는 PD-L2에 대한 리간드; CTLA4, 예컨대 CD80 또는 CD86에 대한 리간드; 또는 림프구 활성화 유전자 3(LAG3), 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR), T 세포막 단백질 3(TIM3), 갈렉틴 9(GAL9) 또는 아데노신 A2a 수용체(A2aR)이다. 소정의 실시형태에서, 면역치료제는 공자극 분자의 작용제이되, 공자극 분자는 CD28, 유도성 T 세포 공자극제(ICOS), CD137, OX40 또는 CD27이다. 다른 실시형태에서, 면역치료제는, 예를 들어, CD80, CD86, B7RP1, B7-H3, B7-H4, CD137L, OX40L 또는 CD70을 비롯한, 공자극 분자 리간드의 작용제이다.
본 명세서의 부분에 편입되고 이를 구성하는 수반하는 도면은 소정의 실시형태를 예시하며, 기재된 설명과 함께 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법의 소정의 원칙을 설명하는 역할을 한다.
도 1은 Wnt 신호전달 경로의 단순화된 다이어그램을 도시한 도면. 좌측은 Wnt 리간드가 그의 표면 수용체에 결합하지 않고, β-카테닌이 파괴 복합체에서 격리되고 유비퀴틴 및 분해에 대해 표적화되며, 표적 유전자가 억제되는 세포를 도시한다. 우측은 Wnt 리간드가 그의 표면 수용체에 결합한 후에, 파괴 복합체가 분해되고, 안정화된 β-카테닌이 방출되며, 핵으로 이동되고, 표적 유전자가 활성화된 세포를 도시한다.
도 2a는 β-카테닌이 4T1 세포주의 핵 및 자발적 MMTV-Wnt1 종양에서 국소화하는 면역조직화학(40x)을 나타내며, 이들 둘 다 활성화된 Wnt 경로를 갖지만, 비-Wnt 활성화된 세포주, Neuro2A, B16F10 및 Renca의 핵에서 국소화하지 않음을 나타내는 도면.
도 2b는 단일요법으로서 또는 B16F10, Neuro2A, Renca, 4T1, 및 MMTV-Wnt에 대한 면역요법과 병용한 조직/종양 유형, 모델 유형, 핵 β-카테닌 염색, 및 β-카테닌 저해의 효능을 요약하는 표를 도시한 도면.
도 3a는 실시예 3에 기재한 바와 같이 비-Wnt 활성화된, Neuro2A 종양으로 이식하고 PBS 또는 BCAT1으로 치료한 A/J 마우스에 대한 치료 스케줄을 도시한 도면.
도 3b는 활성화된 Wnt 경로를 갖지 않고, β-카테닌 mRNA 발현을 감소시키며, Wnt/β-카테닌 반응성 마커인 cMyc에 대해 영향을 갖지 않고, 그리고 면역 세포 마커(CD8), 케모카인(CCL4) 및 T 세포 침윤 및 활성화(PD-1, PD-L1)에 연루된 관문의 mRNA 발현을 향상시키는, Neuro2A 종양 세포가 이식된 마우스에서 BCAT1에 의한 단일 치료 주기를 도시한 도면.
도 4a 내지 도 4d는 BCAT1 및 관문 분자 저해제(항-PD-1/항-CTLA-4 항체)에 의한 병용 요법은 BCAT1 단독 또는 활성화된 Wnt 경로가 있는 종양, 예컨대 4T1(c)에서 그리고 심지어 활성화된 Wnt 경로가 없는 종양, 예컨대 Neuro2A(a), B16F10(b), 및 Renca(d)에서 위약 및 관문 분자 저해제의 조합에 비해 상당한 종양 성장 지연을 초래한다는 것을 보여주는 도면.
도 5는 BCAT1과 면역요법(IO)을 병용하는 것이 B16F10 종양 세포에서 CD8 세포독성 T 세포로부터의 퍼포린 및 그랜자임 B의 방출을 향상시킨다는 것을 면역조직화학에 의해 도시한 도면.
도 6a는 실시예 7에 기재한 바와 같이, PBS 또는 BCAT1로 치료한 자발적 MMTV-Wnt 종양을 갖는 마우스의 치료 스케줄을 도시한 도면.
도 6b 내지 도 6f는 자발적 MMTV-Wnt1 종양을 갖는 마우스에서 BCAT1에 의한 단일 치료 주기가 qPCR(b)에 의해 측정하여 β-카테닌(Ctnnb1) 및 c- Myc mRNA의 감소된 수준; 면역조직화학(IHC)에 의해 측정하여 감소된 β-카테닌 단백질 발현(c); IHC에 의해 측정하여 종양 미세환경에서 증가된 CD8 발현(d); 및 감소된 종양 성장을 야기하고(e); 그리고 위약으로 처음에 치료한 마우스에서 거대 종양이 BCAT1에 의한 치료에 반응한다(f)는 것을 도시한 도면.
도 7은 실시예 7에서 사용되는 병용 요법 치료 스케줄을 도시한 도면. 마우스를 주기 1에 따라 치료한 다음에 유지 용량 스케줄(주기 1 처리에 반응한 마우스에 대해) 또는 주기2에 따른 치료(주기 1 처리 후 거대 종양을 갖는 마우스에 대해)가 이어졌다.
도 8은 자발적 MMTV-Wnt1 종양을 갖는 마우스에서 주기 1 치료 스케줄에 따른 BCAT1 및 항-PD-1/CTLA-4에 의한 병용 요법은 치료한 4마리의 동물 중 3마리에서 완전한 종양 억제를 초래하였다는 것을 도시한 도면.
도 9a는 주기 1 치료 스케줄을 완료하고, BCAT1 및 항-PD-1/CTLA-4 항체의 이어지는 유지 용량을 받은 자발적 MMTV-Wnt1 종양을 갖는 마우스에 대한 병용요법 치료 스케줄을 도시한 도면.
도 9b는 주기 2 치료 스케줄에 따라 BCAT1 및 항-PD-1/CTLA-4 항체로 치료될 때 주기 1 치료의 완료 후 거대 종양을 갖는 4마리 마우스가 종양 성장의 강한 저해를 나타내었다는 것을 도시한 도면.
도 9c는 주기 1 치료 스케줄의 완료 후 완전한 종양 억제를 갖는 3마리 마우스가 BCAT1 및 항-PD-1/CTLA-4의 유지 용량으로 치료할 때에 무 종양으로 남아있었다는 것을 도시한 도면.
도 10은 센스(또는 패신저(passenger)) 가닥(서열번호 1) 및 안티센스(가이드) 가닥(서열번호 2)을 갖는 이중-가닥 β-카테닌 핵산 저해제 분자의 한 가지 비제한적 실시형태를 도시한 도면. 이 β-카테닌 핵산 저해제 분자는 본 명세서에서 BCAT1로서 지칭된다.
도 11은 β-카테닌 핵산 저해제 분자를 제형화하기 위해 사용될 수 있는 지질 나노입자(LNP)의 한 가지 비제한적 실시형태를 도시한 도면. LNP는 다음의 코어 지질을 포함한다: DL-048(양이온성 지질) 및 DSG-MPEG(페길화된 지질), 및 다음의 외피 지질: DL-103(양이온성 지질), DSPC, 콜레스테롤, 및 DSPE-MPEG(페길화된 지질).
도 12a는 실시예 3에 기재한 바와 같이 비-Wnt 활성화된, B16F10 종양으로 피하에 동종이식하고 위약 또는 BCAT1로 치료한 C57BL/6 마우스에 대한 치료 스케줄을 도시한 도면.
도 12b 내지 도 12d는 B16F10 종양이 이식된 C57BL/6 마우스에서 BCAT1에 의한 단일 치료 주기가 부분적으로 감소된 수준의 β-카테닌(Ctnnb1) mRNA 및 qPCR에 의해 측정하여 CCL4, CD8a 및 Itage(CD103) mRNA의 동시 증가(b); 유세포 분석에 의해 측정하여 종양 미세환경에서 증가된 CD3, CD8, CD103 및 PD-1 발현(c); 및 면역조직화학(IHC)에 의해 측정하여 감소된 수준의 β-카테닌 단백질 및 증가된 수준의 CD8 단백질(d)을 야기한다는 것을 도시한 도면.
도 13a 내지 도 13b는 B16F10 종양이 이식된 C57BL/6 마우스에서 BCAT1에 의한 단일 치료 주기가 CD8+ T 세포(PD-1, TIM-3 및 LAG-3) 상에서 발현된 3가지 상이한 T-세포 수용체 보조인자의 증가(a); 및 종양-연관 자연 살해(NK) 세포, 골수성 유래 억제 세포(MDSC), 또는 조절 T-세포(Treg)에 대한 치료-관련 효과가 최소 내지 없음(b)을 야기하는 종양 미세환경의 유세포분석에 의해 도시한 도면.
도 14a 내지 도 14b는 BCAT1에 의한 단일 치료 주기가 B16F10 종양이 이식된 마우스(a) 및 Neuro2A 종양이 이식된 마우스(b)에서 Cxcl10, Cxcl11 및 CD3 mRNA의 상향조절을 야기한다는 것을 도시한 도면.
도 15a 내지 도 15b는 BCAT1에 의한 단일 치료 주기가 Wnt 활성화된 4T1 종양을 이식한 마우스에서 Cxcl10, Cxcl11 및 CD3의 mRNA 발현을 증가시키고(a); 그리고 종양-연관 자연 살해(NK) 세포 또는 골수성 유래 억제 세포(MDSC)에 대해 효과가 최소 내지 전혀 없지만, 종양 미세환경에서 조절 T-세포(Treg)를 증가시킨다(b)는 것을 도시한 도면.
도 16a 내지 도 16c는 MMTTV-Wnt 종양을 보유하는 마우스에서 CD8 mRNA 발현을 상당히 향상시키는 BCAT1(qdx3의 3회 용량)(a), 및 고용량 LGK-974(qdx3의 3회 용량)(c)의 능력을 도시한 도면. 저용량 LGK-974(qdx1의 단일 용량)는 또한 해당 마우스에서 CD8 mRNA 발현을 향상시킨다(그러나 BCAT1 또는 고용량 LGK-974보다 더 적은 용량임)(b). Axin2 mRNA의 BCAT1-유도 감소가 24시간에 걸쳐 더 양호하게 지속되지만, BCAT1과 LGK-974는 둘 다 Axin2 mRNA 발현을 감소시킨다. LGK-974는 β-카테닌(Ctnnb1) mRNA 발현에 대한 효과가 없다.
도 17은 BCAT1이 APC 기능상실 돌연변이를 보유하는 인간 종양 이종이식에서 Ctnnb1과 Axin2 둘 다의 발현을 감소시키고 LGK-974가 고도로 과장된 용량 수준에서조차 이러한 종양에서 Axin2의 단지 약간의, 일시적 감소를 야기한다는 것을 도시한 도면.
도 18a 내지 도 18b는 비 Wnt-활성화된 B16F10 종양을 이식한 마우스에서, BCAT1 치료가 Ctnnb1 mRNA를 감소시키지만, Axin2 mRNA에 대한 효과가 없고(a), LGK-974가 Axin2 mRNA 발현을 감소시킬 수 없거나 또는 이런 비-Wnt 활성화된 종양에서 Cd8a mRNA 발현을 증가시킨다(b)는 것을 도시한 도면.
정의
본 개시내용을 더 용이하게 이해하기 위해, 소정의 용어를 이하에 처음 정의한다. 다음의 용어 및 다른 용어에 대한 추가적인 정의는 본 명세서에 제시될 수 있다. 이하에 제시된 용어의 정의가 참고로 편입된 출원 또는 특허와 불일치된다면, 본 명세서에 제시된 정의는 용어의 의미를 이해하는 데 사용되어야 한다.
본 명세서에 사용되고 청구범위에 첨부되는 바와 같이, 단수 형태는 달리 분명하게 표시되지 않는 한, 복수의 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 언급은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법 및/또는 유형의 단계들을 포함하고/하거나 본 개시내용 등을 읽을 때 당업자에게 명확하게 될 것이다.
투여하다 : 본 명세서에 사용되는 바와 같은, 대상체에 조성물을 "투여하는"은 대상체에 조성물을 제공하거나, 적용하거나 또는 가져오는 것을 의미한다. 투여는, 예를 들어, 국소, 경구, 피하, 근육내, 복강내, 정맥내, 척추 강내 및 피내를 포함하는 임의의 다수의 경로에 의해 수행될 수 있다.
항체 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 면역글로불린 또는 이의 항원-결합 도메인을 지칭한다. 상기 용어는 다클론성, 단클론성, 단일특이성, 다특이성, 비특이적, 인간화된, 인간, 단일쇄, 키메라, 합성, 재조합, 혼성체, 돌연변이, 접합 및 시험관내 생성 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 상기 항체는 불변 영역, 또는 이의 일부, 예컨대 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE를 포함하는 다양한 아이소타입의 중쇄 불변 영역이 사용될 수 있다. 예로서, 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다일 수 있다.
항원-결합 도메인 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "항원-결합 도메인"은 항체와 항원 사이의 특정 결합을 초래하는 아미노산을 포함하는 항체 분자의 부분을 지칭한다. 소정의 항원에 대해, 항원-결합 도메인은 항원의 부분에만 결합할 수 있다. 항체에 의해 특이적으로 인식되고 결합되는 항원의 부분은 "에피토프" 또는 "항원 결정소"로서 지칭된다. 항원-결합 도메인은 Fab(단편 항원-결합(Fragment antigen-binding)); F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 갖는 2가 단편; Fv 단편; 단일쇄 Fv 단편(scFv)(예를 들어, 문헌[Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)] 참조); 2개의 VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fd 단편; dAb(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), 및 항원-결합 기능을 보유하는 다른 항체 단편을 포함한다. Fab 단편은 불변 영역 사이의 이황화결합에 의해 공유 결합된 VH-CH1 및 VL-CL 도메인을 가진다. Fv 단편은 더 작으며, 비공유 결합된 VH 및 VL 도메인을 가진다. 비공유 결합된 도메인이 분리되는 경향을 극복하기 위해, scFv가 구성될 수 있다. scFv는 (1) VL의 N-말단에 VH의 C-말단을 연결하거나, 또는 (2) VH의 N-말단에 VL의 C-말단을 연결하는 가요성 폴리펩타이드를 함유한다. 15량체(Gly4Ser)3 펩타이드는 링커로서 사용될 수 있지만, 다른 링커는 당업계에 공지되어 있다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기법을 이용하여 얻어지며, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 기능에 대해 평가된다.
안티센스 가닥 : dsRNAi 저해제 분자는 2개의 올리고뉴클레오타이드 가닥(안티센스 가닥 및 센스 가닥)을 포함한다. 안티센스 가닥 또는 이의 영역은 표적 핵산의 대응하는 영역에 대해 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보성이다. 추가로, dsRNAi 저해제 분자의 안티센스 가닥 또는 이의 영역은 dsRNAi 저해제 분자의 센스 가닥 또는 이의 영역에 대해 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보성이다. 소정의 실시형태에서, 안티센스 가닥은 또한 표적 핵산 서열에 대해 비상동성인 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 비-상보성 뉴클레오타이드는 상보성 서열의 측면 중 하나에 있을 수 있거나 또는 상보성 서열의 측면 둘 다에 있을 수 있다. 소정의 실시형태에서, 안티센스 가닥 또는 이의 영역이 센스 가닥 또는 이의 영역에 대해 부분적으로 또는 실질적으로 상보성인 경우에, 비-상보성 뉴클레오타이드는 상보성의 하나 이상의 영역(예를 들어, 하나 이상의 미스매치) 사이에 위치될 수 있다. dsRNAi 저해제 분자의 안티센스 가닥은 또한 가이드 가닥으로서 지칭된다.
대략 : 관심 대상의 하나 이상의 값에 적용되는 본 명세서에서 사용되는 용어 "대략" 또는 "약"은 언급된 기준 값과 유사한 값을 지칭한다. 소정의 실시형태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 언급되거나 또는 문맥으로부터 달리 분명하지 않다면 언급된 기준 값의 방향 중 하나(초과 또는 미만)에서 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다(이러한 숫자가 가능한 숫자의 100%를 초과하는 경우를 제외).
β-카테닌: 본 명세서에서 사용되는, "β-카테닌"은 이러한 β-카테닌 단백질을 암호화하는 폴리펩타이드 또는 핵산 중 하나를 지칭한다. 폴리펩타이드를 지칭할 때, "β-카테닌"은 β-카테닌 유전자/전사체(CTNNB1)(젠뱅크 수탁 번호 NM_001904.3(인간 β-카테닌 전사체 변이체 1), NM_001098209.1(인간 β-카테닌 전사체 변이체 2), NM_001098210.1(인간 β-카테닌 전사체 변이체 3), 및 NM_007614.2 및 NM_007614.3(마우스 β-카테닌)의 폴리펩타이드 유전자 산물을 지칭한다.
BCAT1 : 본 명세서에서 사용되는 "BCAT1"은 β-카테닌 유전자를 표적화하고 서열번호 1로 이루어진 핵산 서열을 갖는 센스 가닥 및 서열번호 2로 이루어진 핵산 서열을 갖는 안티센스 가닥을 갖는 핵산 저해제 분자를 지칭한다.
상보성 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "상보성"은 2개의 뉴클레오타이드가 서로 염기쌍을 형성하는 두 뉴클레오타이드 사이의(예를 들어, 2개의 마주보는 핵산 상의 또는 단일 핵산 가닥의 마주보는 영역 상의) 구조적 관계를 지칭한다. 예를 들어, 마주보는 핵산의 피리미딘 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 하나의 핵산의 퓨린 뉴클레오타이드는 서로 수소 결합을 형성함으로써 함께 염기쌍을 이룰 수 있다. 일부 실시형태에서, 상보성 뉴클레오타이드는 왓슨-크릭 방식으로 또는 안정한 복합체의 형성을 허용하는 임의의 다른 방식으로 염기쌍을 이룰 수 있다. " 완전히 상보성 " 또는 100% 상보성은 제1 올리고뉴클레오타이드 가닥의 또는 제1 올리고뉴클레오타이드 가닥의 세그먼트의 각각의 뉴클레오타이드 단량체가 제2 올리고뉴클레오타이드 가닥의 또는 제2 올리고뉴클레오타이드 가닥의 세그먼트의 각각의 뉴클레오타이드 단량체와 염기쌍을 형성할 수 있는 상황을 지칭한다. 100% 미만의 상보성은 2개의 올리고뉴클레오타이드 가닥(또는 2개의 올리고뉴클레오타이드 가닥의 2개의 세그먼트)의 일부(모두는 아님) 뉴클레오타이드 단량체가 서로 염기쌍을 형성하는 상황을 지칭한다. " 실질적 상보성 "은 서로 90% 이상의 상보성을 나타내는 2개의 올리고뉴클레오타이드 가닥(또는 2개의 올리고뉴클레오타이드 가닥의 세그먼트)을 지칭한다. " 충분히 상보성" 은 표적 mRNA에 의해 암호화된 단백질 양이 감소되는, 표적 mRNA와 핵산 저해제 분자 사이의 상보성을 지칭한다.
상보성 가닥 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "상보성 가닥"은 다른 가닥에 대해 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보성인 이중가닥 핵산 저해제 분자의 가닥을 지칭한다.
통상적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "통상적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 다음의 메커니즘 중 하나에 의해 표적화된 유전자 발현을 저해하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다: (1) 입체 장애, 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어, 유전자의 전사, 프레-mRNA의 스플라이싱 및 mRNA의 번역을 직접적으로 방해함으로써 유전자 발현 및/또는 암호화된 단백질의 생성에 연루된 사건의 서열에서 일부 단계를 방해함; (2) RNase H에 의해 표적화된 유전자의 RNA 전사체의 효소 분해의 유도; (3) RNase L에 의해 표적화된 유전자의 RNA 전사체의 효소 분해 유도; (4) RNase P에 의해 표적화된 유전자의 RNA 전사체의 효소 분해 유도: (5) 이중가닥 RNase에 의해 표적화된 유전자의 RNA 전사체의 효소 분해 유도; 및 (6) 동일한 안티센스 올리고에서 조합된 입체 장애 및 효소 분해 활성의 유도. 통상적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 RNAi 저해제 분자와 같은 RNAi 작용 메커니즘을 갖지 않는다. RNAi 저해제 분자는 안티센스 가닥이 Ago2 단백질을 의도된 표적(들)으로 보내도록 RNAi 안티센스 가닥과 조합되는 Ago2에 대한 필요 및 Ago2가 표적의 침묵에 필요한 경우를 포함하는 몇몇 방법에서 통상적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 구별될 수 있다.
데옥시리보뉴클레오타이드 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "데옥시리보뉴클레오타이드"는 당 모이어티의 2'-위치에서 수소기를 갖는 천연 뉴클레오타이드(본 명세서에서 정의되는 바와 같음) 또는 변형된 뉴클레오타이드(본 명세서에서 정의되는 바와 같음)를 지칭한다.
이중가닥 : 핵산(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드)에 관해 본 명세서에서 사용되는 용어 "이중가닥"은 뉴클레오타이드의 2개의 역평행 서열의 상보적 염기쌍을 통해 형성된 구조를 지칭한다.
부형제 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "부형제"는, 예를 들어, 요망되는 일관성 또는 안정화 효과를 제공하거나 또는 기여하도록 조성물에 포함될 수 있는 비치료제를 지칭한다.
뉴클레오타이드간 연결기 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "뉴클레오타이드간 연결기" 또는 "뉴클레오타이드간 결합"은 두 뉴클레오타이드 모이어티를 공유적으로 연결할 수 있는 화학기를 지칭한다. 전형적으로, 화학기는 포스포 또는 포스파이트기를 함유하는 인-함유 연결기이다. 포스포 연결기는 포스포다이에스터 결합, 포스포로다이티오에이트 결합, 포스포로티오에이트 결합, 포스포트라이에스터 결합, 티오노알킬포스포네이트 결합, 티오알킬포스포트라이에스터 결합, 포스포르아미다이트 결합, 포스포네이트 결합 및/또는 보라노포스페이트 결합을 포함하는 것을 의미한다. 다수의 인-함유 결합은, 예를 들어, 미국 특허 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,196호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,306호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 제5,194,599호; 제5,565,555호; 제5,527,899호; 제5,721,218호; 제5,672,697호 및 제5,625,050호에 개시된 바와 같이, 당업계에 잘 공지되어 있다. 다른 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 인 원자를 함유하지 않는 하나 이상의 뉴클레오타이드간 연결기, 이러한 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오타이드간 결합, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오타이드간 결합, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 복소환식 뉴클레오타이드간 결합(실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 폼아세틸 및 티오폼아세틸 골격; 메틸렌 폼아세틸 및 티오폼아세틸 골격; 리보아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아마이드 골격; 및 아마이드 골격을 갖는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음)을 함유한다. 비-인 함유 결합은, 예를 들어, 미국 특허 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,264,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,610,289호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 제5,792,608호; 제5,646,269호 및 제5,677,439호에 개시된 바와 같이 당업계에 잘 공지되어 있다.
면역관문 분자 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "면역관문 분자"는 면역계가 외래 병원균에 반응할 때 자기-관용의 유지(또는 자가면역의 방지) 및 숙주 세포 및 조직의 보호를 위해 정상 생리적 조건하에 중요한 면역 세포, 예컨대 T 세포 상의 분자를 지칭한다. 소정의 면역관문 분자는 항원에 대한 T 세포 반응에 연루된 신호를 증폭시키는 공자극 분자인 반면, 소정의 면역관문 분자는 항원에 대한 T 세포 반응에 수반된 신호를 감소시키는 저해 분자(예를 들어, CTLA-4 또는 PD-1)이다.
루프 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "루프"는 상보성 영역 사이의 단일 가닥 뉴클레오타이드 영역이 이중가닥 형성 또는 왓슨-크릭 염기쌍으로부터 제외되는 방법으로 특정 단일 가닥 뉴클레오타이드 영역에 측접하는 상보성 영역이 혼성화하는 핵산의 단일 가닥에 의해 형성된 구조를 지칭한다. 루프는 임의의 길이의 단일 가닥 뉴클레오타이드 영역이다. 루프의 예는 헤어핀 및 테트라루프로서 이러한 구조에 존재하는 짝지어지지 않은 뉴클레오타이드를 포함한다.
변형된 뉴클레오사이드 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "변형된 뉴클레오사이드"는 변형된 또는 보편적 핵염기 또는 변형된 당 중 하나 이상을 함유하는 뉴클레오사이드를 지칭한다. 변형된 또는 보편적 핵염기(또한 본 명세서에서 염기 유사체로서 지칭됨)는 일반적으로 뉴클레오사이드 당 모이어티의 1'-위치에 위치되고, 1'위치에서 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티민 및 유라실 이외의 핵염기를 지칭한다. 소정의 실시형태에서, 변형된 또는 보편적 핵염기는 질소성 염기이다. 소정의 실시형태에서, 변형된 핵염기는 질소 원자를 함유하지 않는다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제20080274462호 참조. 소정의 실시형태에서, 변형된 뉴클레오타이드는 핵염기(비염기성)를 함유하지 않는다. 변형된 당(또한 본 명세서에서 당 유사체를 지칭함)은, 예를 들어, 변형이 당의 2'-, 3'-, 4'- 또는 5'-탄소 위치에서 일어나는 경우, 변형된 데옥시리보스 또는 리보스 모이어티를 포함한다. 변형된 당은 또한 잠금 핵산("locked nucleic acid: LNA")(예를 들어, 문헌[Koshkin et al. (1998), Tetrahedron, 54,3607-3630] 참조) 브리지 핵산(bridged nucleic acid: "BNA")(예를 들어, 미국 특허 제7,427,672호 및 문헌[Mitsuoka et al. (2009), Nucleic Acids Res., 37(4):1225-38] 참조); 및 비잠금 핵산("unlocked nucleic acid: UNA")(예를 들어, 문헌[Snead et al. (2013), Molecular Therapy - Nucleic Acids, 2,e103(doi: 10.1038/mtna.2013.36] 참조))에 존재하는 것과 같은 비천연의 대안의 탄소 구조를 포함할 수 있다. 본 개시내용과 관련하여 적합한 변형된 또는 보편적 핵염기 또는 변형된 당은 본 명세서에 기재되어 있다.
변형된 뉴클레오타이드 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "변형된 뉴클레오타이드"는 변형된 또는 보편적 핵염기, 변형된 당, 또는 변형된 인산염 기 중 하나 이상을 함유하는 뉴클레오타이드를 지칭한다. 변형된 또는 보편적 핵염기(또한 본 명세서에서 염기 유사체로서 지칭됨)는 일반적으로 뉴클레오사이드 당 모이어티의 1'-위치에 위치되고, 1'위치에서 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티민 및 유라실 이외의 핵염기를 지칭한다. 소정의 실시형태에서, 변형된 또는 보편적 핵염기는 질소성 염기이다. 소정의 실시형태에서, 변형된 핵염기는 질소 원자를 함유하지 않는다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제20080274462호 참조. 소정의 실시형태에서, 변형된 뉴클레오타이드는 핵염기(비염기성)를 함유하지 않는다. 변형된 당(또한 본 명세서에서 당 유사체를 지칭함)은, 예를 들어, 변형이 당의 2'-, 3'-, 4'- 또는 5'-탄소 위치에서 일어나는 경우, 변형된 데옥시리보스 또는 리보스 모이어티를 포함한다. 변형된 당은 또한 잠금 핵산("LNA")(예를 들어, 문헌[Koshkin et al. (1998), Tetrahedron, 54,3607-3630] 참조) 브리지 핵산("BNA")(예를 들어, 미국 특허 제7,427,672호 및 문헌[Mitsuoka et al. (2009), Nucleic Acids Res., 37(4):1225-38] 참조); 및 비잠금 핵산("UNA")(예를 들어, 문헌[Snead et al. (2013), Molecular Therapy - Nucleic Acids, 2,e103(doi: 10.1038/mtna.2013.36] 참조))에 존재하는 것과 같은 비천연의 대안의 탄소 구조를 포함할 수 있다. 변형된 인산염기는 천연 뉴클레오타이드에서 생기지 않고, 인 원자를 포함하는 인산염 모방체 및 인산염을 포함하지 않는 음이온성 인산염 모방체(예를 들어, 아세트산염)를 비롯한 본 명세서에 기재된 바와 같은 비천연 유래 인산염 모방체를 포함하는 인산염기의 변형을 지칭한다. 변형된 인산염기는 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 인-함유 뉴클레오타이드간 연결기와 비-인 함유 연결기를 둘 다 포함하는 비천연 유래 뉴클레오타이드간 연결기를 포함한다. 본 개시내용과 관련하여 적합한 변형된 또는 보편적 핵염기, 변형된 당 또는 변형된 인산염은 본 명세서에 기재되어 있다.
네이키드 올리고뉴클레오타이드 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "네이키드 올리고뉴클레오타이드"는 보호 지질 나노입자 또는 다른 보호 제형에서 제형화되지 않고 따라서 생체내로 투여될 때 혈액 및 엔도솜/라이소좀 구획에 노출되는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다.
천연 뉴클레오사이드 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "천연 뉴클레오사이드"는 당(예를 들어, 데옥시리보스 또는 리보스 또는 이들의 유사체)과의 N-글리코사이드 결합에서의 복소환식 질소성 염기를 지칭한다. 천연 복소환식 질소성 염기는 아데닌, 구아닌, 사이토신, 유라실 및 티민을 포함한다.
천연 뉴클레오타이드 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "천연 뉴클레오타이드"는 인산염기에 연결된 당(예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스 또는 이들의 유사체)과의 N-글리코사이드 결합에서의 복소환식 질소성 염기를 지칭한다. 천연 복소환식 질소성 염기는 아데닌, 구아닌, 사이토신, 유라실 및 티민을 포함한다.
비-T 세포 염증 표현형 : 본 명세서에서 사용되는 "비-T 세포 염증 표현형"은 종양 미세환경에서 침윤성 CD8+ T 세포의 축적이 거의 내지 전혀 없는 것으로 증명되는 바와 같이, 종양에 대한 기존의 T 세포 반응이 없는 종양 미세환경을 지칭한다. 전형적으로, 비-T 세포 염증 표현형은 또한 종양 미세환경에서 CD8+ T 세포의 보충 및 축적을 촉진시키지 않는 제한된 케모카인 프로파일 및/또는 I형 IFN 유전자 서명이 최소이거나 또는 부재인 것을 특징으로 한다.
비-Wnt 활성화된 질환 또는 장애 : 본 명세서에서 사용되는 "비-Wnt 활성화된" 질환 또는 장애는 Wnt/β-카테닌 경로의 활성화와 관련되지 않은 질환 또는 장애를 지칭한다. "비-Wnt 활성화된" 질환 또는 장애는 소정의 결장직장, 데스모이드, 자궁내막, 위, 간세포, 간모세포종, 신장(윌름 종양), 수모세포종, 흑색종, 신경모세포종, 난소(자궁내막모양), 췌장, 모기질세포종, 전립선, 신장, 갑상선(악성) 및 자궁(자궁내막) 암을 비롯한, 소정의 암 및/또는 증식성 질환, 병태 또는 장애를 포함한다. 일 실시형태에서, "비-Wnt 활성화된" 질환 또는 장애는 결장직장암, 간세포 암종 또는 흑색종이다. 일 실시형태에서, "비-Wnt 활성화된" 질환 또는 장애는 신경모세포종, 신세포암 또는 흑색종이다. 상기 열거한 암 및/또는 증식성 질환을 포함하는 질환 또는 장애는 이하에 제공되는 Wnt 활성화된 질환 또는 장애의 정의와 일치되는 질환 또는 장애의 비-Wnt 활성화된 아형 및 Wnt 활성화된 아형을 둘 다 포함하는 것으로 이해된다.
핵산 저해제 분자 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산 저해제 분자"는 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 올리고뉴클레오타이드 분자를 지칭하되, 올리고뉴클레오타이드 분자는 표적 유전자 mRNA에서 서열을 특이적으로 표적화하는 영역을 함유한다. 전형적으로, 핵산 저해제 분자의 표적화 영역은 구체화된 표적 유전자에 핵산 저해제 분자의 효과가 향하도록 표적 유전자 mRNA 상의 서열에 대해 충분히 상보성인 서열을 포함한다. 핵산 저해제 분자는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 및/또는 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
뉴클레오사이드 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "뉴클레오사이드"는 천연 뉴클레오사이드 또는 변형된 뉴클레오사이드를 지칭한다.
뉴클레오타이드 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "뉴클레오타이드"는 천연 뉴클레오타이드 또는 변형된 뉴클레오타이드를 지칭한다.
돌출부 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "돌출부"는 이중-가닥 핵산 저해제 분자의 가닥 중 하나의 단부 중 하나에서 말단의 비-염기 쌍 뉴클레오타이드(들)를 지칭한다. 소정의 실시형태에서, 돌출부는 제1 가닥 또는 영역이 이중가닥을 형성하는 상보성 가닥의 말단을 지나서 연장되는 하나의 가닥 또는 영역으로부터 초래된다. 염기쌍의 수소 결합을 통해 이중가닥을 형성할 수 있는 2개의 올리고뉴클레오타이드 영역 중 하나 또는 둘 다는 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 영역에 의해 공유되는 상보성의 3'- 및/또는 5'-단부를 지나서 연장되는 5'- 및/또는 3'-단부를 가질 수 있다. 이중가닥의 3' 및/또는 5' 단부를 지나서 연장되는 단일-가닥 영역은 돌출부로서 지칭된다.
약제학적 조성물 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적 조성물"은 약학적 유효량의 β-카테닌 핵산 저해제 분자 또는 면역치료제, 예컨대 항체(예를 들어, 항-CTLA-4, 항-PD-1, 또는 항-PD-L1 항체 중 하나 이상을 포함) 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는, "약학적 유효량", "치료적 유효량" 또는 "유효량"은 의도된 약학적, 치료적 또는 예방적 결과를 생산하는 데 효과적인 β-카테닌 핵산 저해제 분자 또는 면역치료제, 예컨대 항체(예를 들어, 항-CTLA-4, 항-PD-1, 또는 항-PD-L1 항체 중 하나 이상을 포함)의 양을 지칭한다.
약제학적으로 허용 가능한 부형제 : 어구 "약제학적으로 허용 가능한 부형제"는 부형제가 합리적인 유해/유익비에 비례하는 과도한 유해 부작용(예컨대, 독성, 자극 및 알레르기 반응) 없이 인간 및/또는 동물에 의한 사용에 적합한 것임을 의미한다.
인산염 모방체 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "인산염 모방체"는 인산염기의 정전기적 그리고 입체적 특성을 모방하는 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단 단부에서의 화학적 모이어티를 지칭한다. 올리고뉴클레오타이드의 5'-단부에 부착될 수 있는 다수의 인산염 모방체가 개발되었다(예를 들어, 미국 특허 제8,927,513호; 문헌[Prakash et al. Nucleic Acids Res., 2015,43(6):2993-3011] 참조). 전형적으로, 이들 5'-인산염 모방체는 포스파타제-내성 결합을 함유한다. 적합한 인산염 모방체는 본 명세서에 전문이 참고로 편입된 국제 특허 출원 공개 WO 2018/045317에 기재된 바와 같이 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 4'-옥시메틸포스포네이트, 4'-티오메틸포스포네이트, 또는 4'-아미노메틸포스포네이트의 5'-말단 뉴클레오타이드의 당 모이어티(예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스 또는 이의 유사체)의 4'-탄소에 결합된 5'-포스포네이트, 예컨대 5'-메틸렌포스포네이트(5'-MP) 및 5'-(E)-비닐포스포네이트(5'-VP) 및 4'-포스페이트 유사체를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 4'옥시메틸포스포네이트는 화학식 -O-CH2-PO(OH)2 또는 -O-CH2-PO(OR)2로 나타내며, 여기서 R은 H, CH3, 알킬기 또는 보호기로부터 독립적으로 선택된다. 소정의 실시형태에서, 알킬기는 CH2CH3이다. 더 전형적으로, R은 H, CH3 또는 CH2CH3으로부터 독립적으로 선택된다. 다른 변형은 올리고뉴클레오타이드의 5'-단부에 대해 발생되었다(예를 들어, WO 2011/133871 참조).
강력하게 하다 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "강력하게 하다" 또는 "강력하게 하는"은 다른 치료제(예를 들어, 저해 면역관문 분자, 예컨대 CTLA-4 또는 PD-1의 길항제, 또는 공자극 관문 분자의 작용제)의 치료적 효과를 증가시키거나 또는 향상시키는 하나의 치료제(예를 들어, β-카테닌 핵산 저해제 분자)의 능력을 지칭한다.
감소시키다 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "감소시키다(reduce)" 또는 "감소시키다(reduces)"는 당업계에서 일반적으로 허용되는 그의 의미를 지칭한다. 예시적인 핵산 저해제 분자(예를 들어, β-카테닌 RNAi 저해제 분자)를 참고로 하여, 상기 용어는 일반적으로 핵산 저해제 분자의 부재하에 관찰된 것 미만의 유전자 발현의 감소, 또는 RNA 분자 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 소단위를 암호화하는 동등한 RNA 분자의 수준, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 소단위의 활성을 지칭한다.
내성 : 면역요법에 관해 사용되는 용어 "내성" 또는 "저항성"은 면역요법에 대해 의학적으로 상당한 반응을 나타내지 않는 암 및/또는 증식성 질환, 병태 또는 장애를 지칭한다. 본 명세서에 개시된 바와 같은, 면역요법에 대한 내성은 β-카테닌 발현을 감소시킴으로써 반전될 수 있다.
리보뉴클레오타이드 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "리보뉴클레오타이드"는 당 모이어티의 2'-위치에서 하이드록실기를 갖는 천연 또는 변형된 뉴클레오타이드를 지칭한다.
RNAi 저해제 분자 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "저해제 분자"는 (a) 센스 가닥(패신저) 및 안티센스 가닥(가이드)를 갖는 이중가닥 핵산 저해제 분자("dsRNAi 저해제 분자")(여기서, 안티센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 부분은 표적 mRNA의 절단에서 아르고나우트 2(Argonaute 2: Ago2)에 의해 사용됨) 또는 (b) 단일 안티센스 가닥을 갖는 단일 가닥 핵산 저해제 분자("ssRNAi 저해제 분자")(여기서, 안티센스 가닥(또는 안티센스 가닥의 부분)은 표적 mRNA의 절단에서 Ago2 엔도뉴클레아제에 의해 사용됨) 중 하나를 지칭한다.
센스 가닥 : dsRNAi 저해제 분자는 2개의 올리고뉴클레오타이드 가닥(안티센스 가닥 및 센스 가닥)을 포함한다. 센스 가닥 또는 이의 영역은 dsRNAi 저해제 분자 또는 이의 영역의 안티센스 가닥에 대해 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보성이다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 또한 안티센스 가닥에 대해 비상보성인 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 비-상보성 뉴클레오타이드는 상보성 서열의 측면 중 하나에 있을 수 있거나 또는 상보성 서열의 측면 둘 다에 있을 수 있다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥 또는 이의 영역이 안티센스 가닥 또는 이의 영역에 대해 부분적으로 또는 실질적으로 상보성인 경우에, 비-상보성 뉴클레오타이드는 상보성의 하나 이상의 영역(예를 들어, 하나 이상의 미스매치) 사이에 위치될 수 있다. 센스 가닥은 또한 패신저 가닥으로 불린다.
대상체 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체"는 마우스, 토끼 및 인간을 포함하는 임의의 포유류를 의미한다. 일 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 용어 "개체" 또는 "환자"는 "대상체"와 상호 호환적인 것으로 의도된다.
T 세포-염증 종양 표현형 : 본 명세서에서 사용되는 "T 세포 염증 표현형"은 종양 미세환경에서 침윤성 CD8+ T 세포의 축적에 의해 증명되는 바와 같이, 종양에 대한 기존의 T 세포 반응이 있는 종양 미세환경을 지칭한다. 전형적으로, T 세포-염증 표현형은 또한 종양 미세환경에 CD8+ T 세포를 보충할 수 있는 광범위 케모카인 프로파일(CXCL9 및/또는 CXCL10을 포함) 및/또는 I형 IFN 유전자 서명을 특징으로 한다.
테트라루프 : 본 명세서에서 사용되는 용어 "테트라루프"는 인접한 왓슨-크릭 혼성화 뉴클레오타이드의 안정성에 기여하는 안정한 2차 구조를 형성하는 루프(단일 가닥 영역)를 지칭한다. 이론으로 제한되는 일 없이, 테트라루프는 스태킹(stacking) 상호작용에 의해 인접한 왓슨-크릭 염기쌍을 안정화시킬 수 있다. 추가로, 테트라루프 내 뉴클레오타이드 사이의 상호작용은 비-왓슨-크릭 염기쌍, 스태킹 상호작용, 수소 결합, 및 접촉 상호작용을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(Cheong et al., Nature, 1990,346(6285):680-2; Heus and Pardi, Science, 1991,253(5016):191-4). 테트라루프는 무작위 염기로 이루어진 단순 모델 루프 서열로부터 예상되는 것보다 더 높은 인접한 이중가닥의 융점(Tm) 증가를 부여한다. 예를 들어, 테트라루프는 길이가 적어도 2개의 염기쌍의 이중가닥을 포함하는 헤어핀에 대해 10mM NaHPO4 중에서 적어도 50℃, 적어도 55℃., 적어도 56℃, 적어도 58℃, 적어도 60℃, 적어도 65℃ 또는 적어도 75℃의 융점을 부여할 수 있다. 테트라루프는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 및 이들의 조합을 함유할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 테트라루프는 4개의 뉴클레오타이드로 이루어진다. 소정의 실시형태에서, 테트라루프는 5개의 뉴클레오타이드로 이루어진다.
RNA 테트라루프의 예는 테트라루프의 UNCG 패밀리(예를 들어, UUCG), 테트라루프의 GNRA 패밀리(예를 들어, GAAA) 및 CUUG 테트라루프를 포함한다. (Woese et al., PNAS, 1990,87(21):8467-71; Antao et al., Nucleic Acids Res., 1991,19(21):5901-5). DNA 테트라루프의 예는 테트라루프의 d(GNNA) 패밀리(예를 들어, d(GTTA), 테트라루프의 d(GNRA)) 패밀리, 테트라루프의 d(GNAB) 패밀리, 테트라루프의 d(CNNG) 패밀리 및 테트라푸프의 d(TNCG) 패밀리(예를 들어, d(TTCG))를 포함한다. (Nakano et al. Biochemistry, 2002,41(48):14281-14292. Shinji et al., Nippon Kagakkai Koen Yokoshu, 2000,78(2):731).
치료적 유효량 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "치료적 유효량" 또는 "약학적 유효량"은 치료 중인 대상체의 질환 또는 병태 증상을 예방하거나, 완화하거나 또는 개선시키는 데 효과적인 화합물 또는 화합물 등의 양을 의미한다.
Wnt 활성화된 질환 또는 장애 : 본 명세서에서 사용되는 "Wnt 활성화된" 질환 또는 장애는 활성화된 Wnt/β-카테닌 경로와 관련된 질환 또는 장애를 지칭한다. "Wnt-연관" 질환 또는 장애는 결장직장, 데스모이드, 자궁내막, 위, 간세포, 간모세포종, 신장(윌름 종양), 수모세포종, 흑색종, 난소(자궁내막모양), 췌장, 모기질세포종, 전립선, 갑상선 (악성) 및 자궁(자궁내막) 암을 비롯한 암 및/또는 증식성 질환, 병태 또는 장애를 포함한다. 일 실시형태에서, "Wnt 활성화된" 질환 또는 장애는 결장직장암, 간세포 암종 또는 흑색종이다. 상기 열거한 암 및/또는 증식성 질환을 비롯한 질환 또는 장애는 상기 제공된 비-Wnt 활성화된 질환 또는 장애의 정의와 일치되는, 질환 또는 장애의 Wnt 활성화된 형태와 질환 또는 장애의 비-Wnt 활성화된 형태를 둘 다 포함할 수 있다는 것이 이해된다.
Wnt/β-카테닌 경로 : 본 명세서에서 사용되는 "Wnt/β-카테닌 경로"는 β-카테닌을 수반하는 하류의 신호전달 경로를 개시하는, Wnt 리간드, 수용체 및 공수용체의 조합을 통해 매개되는 세포에서 분자 신호전달 경로를 지칭한다(예를 들어, 도 1 참조). Wnt 신호전달의 부재하에, β-카테닌은 세포의 세포질 내 유비퀴틴화를 통한 분해를 위해 표적화된다. Wnt 리간드 및 Wnt 신호전달의 존재하에, β-카테닌은 안정화되고 세포핵으로 이동되는데, 여기서 이는 전사 인자, 예컨대 T 세포 전사 인자(T cell transcription factor: TCF) 및 림프구 향상 전사 인자(lymphoid enhanced transcription factor: LEF)와 상호작용하고, 유전자 전사를 활성화시킬 수 있다. Wnt/β-카테닌 경로의 탈조절 및 활성화는 β-카테닌 유전자 또는 선종성 용종증(adenomatous polyposis coli: APC)을 암호화하는 유전자의 돌연변이에 의해 가장 흔히 야기되는데, 이는 β-카테닌 기능을 음성 조절하지만, 또한 Wnt/β-카테닌 경로, 예컨대 Axin, LEF 및 ICAT의 다른 성분을 암호화하는 유전자 내 돌연변이에 의해 야기될 수 있다.
상세한 설명
본 출원은 면역요법(예를 들어, 면역관문 분자의 차단)에 반응성이 아닌 암을 비롯한 암을 치료하기 위한 신규한 방법 및 조성물을 제공한다. 전형적으로, 면역요법에 반응성이 아닌 암은 종양 미세환경에서 침윤성 CD8+ T 세포가 거의 또는 전혀 없는 비-T 세포 염증 표현형(또한 차가운 종양 또는 비-염증 종양으로서 알려짐)을 특징으로 한다. β-카테닌 발현의 감소는 차가운 종양 또는 비-염증 종양을 뜨거운 종양 또는 염증 종양으로 전환시키고, 심지어 활성화된 Wnt/β-카테닌 경로를 갖지 않는 종양에서조차 면역요법의 효과를 강화시킬 수 있다. 다시 말해서, β-카테닌 저해제를 면역요법과 병용함으로써, 면역요법에 정상적으로 반응하지 않는 차가운 종양 또는 비-염증 종양을 치료할 수 있다. 전형적으로 β-카테닌 핵산 저해제 분자는 β-카테닌 발현을 감소시키는 데 사용된다. 그러나, β-카테닌 발현을 감소시키는 임의의 β-카테닌 저해제 또는 Wnt/β-카테닌 경로 저해제는 소분자, 펩타이드, 및 β-카테닌 또는 Wnt/β-카테닌 경로의 성분을 표적화하는 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 이 병용요법 접근은 활성화된 Wnt/β-카테닌 경로가 있는 그리고 없는 암을 포함하는 광범위의 다양한 암에 걸쳐 생체내에서 강력하게 종양 성장을 저해하는 것으로 나타났다.
Wnt/β-카테닌 경로
상기 논의한 바와 같이, Wnt/β-카테닌 경로는 β-카테닌 종양유전자를 수반하는 하류의 신호전달 경로를 개시하는 Wnt 리간드, 수용체 및 공수용체의 조합을 통해 매개된다(예를 들어, 도 1 참조). Wnt 신호전달의 부재하에, β-카테닌은 세포의 세포질 내 유비퀴틴화를 통한 분해를 위해 표적화된다. Wnt 리간드 및 Wnt 신호전달의 존재하에, β-카테닌은 안정화되고 세포핵으로 이동되는데, 여기서 이는 전사 인자, 예컨대 T 세포 전사 인자(TCF) 및 림프구 향상 전사 인자(LEF)와 상호작용하고, 유전자 전사를 활성화시킬 수 있다.
β-카테닌은 세포에서 Wnt 신호전달의 중요한 매개체이다. β-카테닌은 혈장막을 포함하는 다중 세포 위치에서 몇몇 세포 기능에 도움이 되며, β-카테닌은 세포간 접착 복합체, β-카테닌 수준이 조절되는 세포질, 및 β-카테닌이 전사 조절 및 염색질 상호작용에 연루되는 핵의 안정화에 기여한다.
β-카테닌의 돌연변이(인간에서 CTNNB1 유전자에 의해 암호화됨)는 결장직장, 데스모이드, 자궁내막, 위, 간세포, 간모세포종, 신장(윌름 종양), 수모세포종, 흑색종, 난소(자궁내막모양), 췌장, 모기질세포종, 전립선, 갑상선(악성) 및 자궁(자궁내막) 암과 구체적으로 연관되었다(Polakis P. Genes Dev. 14: 1837-51; Samowitz et al. Cancer Res. 59: 1442-4; Iwao et al. Cancer Res. 58: 1021-6; Mirabelli-Primdahl et al. Cancer Res. 59: 3346-51; Shitoh et al. J Clin Path. 52: 695-6; Tejpar et al. Oncogene 18: 6615-20; Kitaeva et al. Cancer Res. 57: 4478-81; Sparks et al. Cancer Res. 58: 1130-4; Miyaki et al. Cancer Res. 59: 4506-9; Park et al. Cancer Res. 59: 4257-60; Huang et al. Am J Pathol. 155: 1795-801; Nhieu et al. Am J Pathol. 155: 703-10; Legoix et al. Oncogene 18: 4044-6; Jeng et al. Cancer Lett. 152: 45-51; Koch et al. Cancer Res. 59: 269-73; Wei et al. Oncogene 19: 498-504; Koesters et al. Cancer Res. 59: 3880-2; Maiti et al. Cancer Res. 60: 6288-92; Zurawel et al. Cancer Res. 58: 896-9; Gamallo et al. Am J Pathol. 155: 527-36; Palacios and Gamallo Cancer Res. 58: 1344-7; Wright et al. Int J Cancer 82: 625-9; Gerdes et al. Digestion 60: 544-8; Chan et al. Nat Genet. 21: 410-3; Voeller et al. Cancer Res. 58: 2520-3; Garcia-Rostan et al. Cancer Res. 59: 1811-5; Fukuchi et al. Cancer Res. 58: 3526-8).
β-카테닌/Wnt 경로는 결장직장암의 80% 이상에서 지속적으로 활성화된다. 결장직장암의 발생에서 β-카테닌의 역할은 APC(결장의 선종성 용종증) 유전자의 발현 산물, 종양 억제자에 의해 조절되는 것으로 나타났다(Korinek et al., Science, 1997, 275:1784-1787; Morin et al., Science, 1997, 275:1787-1790). APC 단백질은 전사 인자 복합체를 형성하는 TCF/LEF와 함께 β-카테닌에 정상적으로 결합한다. Morin 등(Morin et al., Science, 1997, 275:1787-1790)은 결장암에서 APC 단백질이 β-카테닌 및 Tcf-4에 의해 매개되는 전사 활성화를 하향 조절한다는 것을 보고한다. 그들의 결과는 β-카테닌의 조절이 APC의 종양 억제 효과와 관련되고 이 조절이 APC 또는 β-카테닌 중 하나의 돌연변이에 의해 회피될 수 있다는 것을 나타내었다.
β-카테닌/Wnt 경로는 또한 간세포 암종(HCC) 환자의 50% 이상에서 지속적으로 활성화된다. 활성화된 Wnt 신호전달 및 핵 β-카테닌은 질환의 재발 및 불량한 예후와 상관관계가 있다(Takigawa et al. 2008, Curr Drug Targets November; 9 (11):1013-24).
β-카테닌 유전자의 돌연변이는 β-카테닌의 N-말단 부분의 결실을 야기하는 절단 또는 β-카테닌의 인산화를 매개하고 프로테아좀에 의한 그의 분해를 표적화하는 세포질의 파괴 복합체, 예컨대 GSK3α/β또는 CKIα의 성분에 의해 표적화된 세린 및 트레오닌 잔기에 영향을 미치는 점 돌연변이를 포함한다. 이들 돌연변이체 β-카테닌 단백질은 인산화가 어려우며 따라서 프로테아좀 분해를 벗어난다. 결과적으로, β-카테닌은 영향 받은 세포 내에 축적된다. 안정화된 그리고 핵-국소화된 β-카테닌은 결장암의 거의 모든 사례의 특징이다. (Clevers, H., 2006, Cell 127:469-480). Morin 등은 인산화 부위가 변성된 β-카테닌의 돌연변이가 β-카테닌의 APC-매개 하향 조절에 민감하지 않은 세포를 제공한다는 것과 이 붕괴된 메커니즘이 결장직장 종양형성에 중요하다는 것을 입증하였다. (Morin et al., 1997, Science 275:1787-1790).
본 명세서에 개시된 방법 미치 조성물의 소정의 실시형태에서, 암은 활성화된 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로를 가진다. 다른 실시형태에서, 암은 활성화된 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로를 갖지 않는다.
핵산 저해제 분자
소정의 실시형태에서, β-카테닌 발현은 핵산 저해제 분자를 이용하여 감소된다. 다양한 올리고뉴클레오타이드 구조는 단일가닥 및 이중가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 저해제 분자로서 사용되었다.
소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자는 센스(또는 패신저) 가닥 및 안티센스(또는 가이드) 가닥을 포함하는 이중-가닥 RNAi 저해제 분자이다. 다양한 이중가닥 RNAi 저해제 분자 구조는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, RNAi 저해제 분자에 대한 초기 작업은 각각의 가닥이 1 내지 5개의 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 3'-돌출부를 갖는 19 내지 25개의 뉴클레오타이드의 크기를 갖는 이중-가닥 핵산 분자에 중점을 둔다(예를 들어, 미국 특허 제8,372,968호 참조). 후속적으로, 활성 RNAi 저해제 분자에 대해 다이서(Dicer) 효소에 의해 생체내에서 가공된 더 긴 이중-가닥 RNAi 저해제 분자가 개발되었다(예를 들어, 미국 특허 제8,883,996호 참조). 이후의 작업은 가닥 중 하나가 열역학적으로-안정한 테트라루프 구조를 포함하는 구조를 포함하는, 분자의 이중-가닥 표적화 영역을 지나서 적어도 하나의 가닥 중 적어도 하나의 단부가 연장되는 연장된 이중-가닥 핵산 저해제 분자를 개발하였다(예를 들어, 이들 이중-가닥 핵산 저해제 분자의 이들의 개시내용을 참고로 편입된 미국 특허 제8,513,207호, 미국 특허 제8,927,705호, WO 2010/033225 및 WO 2016/100401 참조). 해당 구조는 단일-가닥 연장(분자의 측면 중 하나 또는 둘 다에서) 그리고 이중-가닥 연장을 포함한다.
일부 실시형태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 15 내지 66, 25 내지 40, 또는 19 내지 25개의 뉴클레오타이드의 범위이다. 일부 실시형태에서, 센스 가닥은 30개 미만의 뉴클레오타이드, 예컨대 19 내지 24개의 뉴클레오타이드, 예컨대 21개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 안티센스 가닥은 30개 미만의 뉴클레오타이드, 예컨대 19 내지 24개의 뉴클레오타이드, 예컨대 21, 22 또는 23개의 뉴클레오타이드이다. 전형적으로, 이중가닥 구조는 길이가 15 내지 50, 예컨대 15 내지 30, 예컨대 18 내지 26, 더 전형적으로 19 내지 23, 그리고 소정의 예에서 19 내지 21개의 염기쌍이다.
일부 실시형태에서, dsRNAi 저해제 분자는 추가로 하나 이상의 단일-가닥 뉴클레오타이드 돌출부(들)를 포함할 수 있다. 전형적으로, dsRNAi 저해제 분자는 1 내지 10, 1 내지 4 또는 1 내지 2개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 가진다. 단일가닥 돌출부는 전형적으로 센스 가닥의 3' 단부 및/또는 안티센스 가닥의 3' 단부에 위치된다. 소정의 실시형태에서, 1 내지 10, 1 내지 4 또는 1 내지 2개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부는 안티센스 가닥의 5' 단부에 위치된다. 소정의 실시형태에서, 1 내지 10, 1 내지 4 또는 1 내지 2개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부는 센스 가닥의 5' 단부에 위치된다. 소정의 실시형태에서, 1 내지 2개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부는 안티센스 가닥의 3' 단부에 위치된다. 소정의 실시형태에서, dsRNA 저해제 분자는 전형적으로 분자의 우측편, 즉, 센스가닥의 3' 단부 및 안티센스 가닥의 5' 단부에 평활말단을 가진다.
소정의 실시형태에서, dsRNAi 저해제 분자는 길이가 21개의 뉴클레오타이드인 가이드 가닥 및 길이가 21개의 뉴클레오타이드인 패신저 가닥을 가지며, 여기서 분자의 우측 상에 2개의 뉴클레오타이드 3'패신저 가닥 돌출부(패신저 가닥의 3'-단부/가이드 가닥의 5'-단부) 및 분자의 좌측 상에 2개의 뉴클레오타이드 3'-가이드 가닥 돌출부(패신저 가닥의 5'-단부/가이드 가닥의 3'-단부)가 있다. 이러한 분자에서, 19개의 염기쌍 이중가닥 영역이 있다.
소정의 실시형태에서, dsRNAi 저해제 분자는 길이가 23개의 뉴클레오타이드인 가이드 가닥 및 길이가 21개의 뉴클레오타이드인 패신저 가닥을 가지며, 여기서 분자의 우측 상에 평활말단(패신저 가닥의 3'-단부/가이드 가닥의 5'-단부) 및 분자의 좌측 상에 2개의 뉴클레오타이드 3'-가이드 가닥 돌출부(패신저 가닥의 5'-단부/가이드 가닥의 3'-단부)가 있다. 이러한 분자에서, 21개의 염기쌍 이중가닥 영역이 있다.
일부 실시형태에서, dsRNAi 저해제 분자는 줄기 및 루프를 포함한다. 전형적으로, dsRNAi 저해제 분자의 패신저 가닥의 3'-말단의 영역 또는 5'-말단의 영역은 단일가닥 줄기 및 루프 구조를 형성한다.
일부 실시형태에서, dsRNAi 저해제 분자는 줄기 및 테트라루프를 함유한다. 소정의 실시형태에서, dsRNAi 저해제 분자는 가이드 가닥 및 패신저 가닥을 포함하되, 패신저 가닥은 줄기 및 테트라루프를 함유하고, 길이가 20 내지 66개의 뉴클레오타이드의 범위에 있다. 전형적으로, 가이드 및 패신저 가닥은 별개의 가닥인데, 각각은 인접한 올리고뉴클레오타이드를 형성하지 않는 5' 및 3' 단부(때때로 "틈이난(nicked)" 구조로서 지칭됨)를 가진다.
소정의 해당 실시형태에서, 가이드 가닥은 길이가 15 내지 40개의 뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 줄기 및 테트라루프를 함유하는 패신저 가닥의 연장된 부분은 가닥의 3'-단부 상에 있다. 소정의 다른 실시형태에서, 줄기 및 테트라루프를 함유하는 패신저 가닥의 연장된 부분은 가닥의 5'-단부 상에 있다.
소정의 실시형태에서, 줄기 및 테트라루프를 함유하는 dsRNAi 저해제 분자의 패신저 가닥은 길이가 34 내지 40개의 뉴클레오타이드이고, dsRNAi 저해제 분자의 가이드 가닥은 20 내지 24개의 뉴클레오타이드를 함유하되, 패신저 가닥과 가이드 가닥은 18 내지 24개의 염기쌍의 이중가닥 영역을 형성한다.
소정의 실시형태에서, dsRNAi 저해제 분자는 (a) 줄기 및 테트라루프를 함유하고 길이가 36개의 뉴클레오타이드인 패신저 가닥으로서, 5'-단부로부터 패신저 가닥의 처음 20개 뉴클레오타이드가 가이드 가닥에 대해 상보성이고, 패신저 가닥의 다음의 16개의 뉴클레오타이드는 줄기 및 테트라루프를 형성하는, 상기 패신저 가닥, 및 (b) 길이가 22개의 뉴클레오타이드이고 3' 단부에 2개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 갖는 가이드 가닥을 포함하되, 상기 가이드 가닥과 패신저 가닥은 인접한 올리고뉴클레오타이드를 형성하지 않는 별개의 가닥이다.
소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자는 단일-가닥 핵산 저해제 분자이다. 단일가닥 핵산 저해제 분자는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 최근의 노력은 ssRNAi 저해제 분자의 입증된 활성을 가진다(예를 들어, 문헌[Matsui et al., Molecular Therapy, 2016,24(5):946-55] 참조). 그리고, 안티센스 분자는 특정 표적 유전자의 발현을 감소시키기 위해 수십년 동안 사용되어왔다(Pelechano and Steinmetz, Nature Review Genetics, 2013,14:880-93). 이들 구조의 통상적인 테마에 대한 다수의 변형이 다수의 표적에 대해 개발되었다. 단일가닥 핵산 저해제 분자는, 예를 들어, 통상적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 마이크로RNA, 리보자임, 앱타머 및 ssRNAi 저해제 분자를 포함하며, 이들 모두는 당업계에 공지되어 있다.
소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자는 14 내지 50, 16 내지 30 또는 15 내지 25개의 뉴클레오타이드를 갖는 ssRNAi 저해제 분자이다. 다른 실시형태에서, ssRNAi 저해제 분자는 18 내지 22 또는 20 내지 22개의 뉴클레오타이드를 가진다. 소정의 실시형태에서, ssRNAi 저해제 분자는 20개의 뉴클레오타이드를 가진다. 다른 실시형태에서, ssRNAi 저해제 분자는 22개의 뉴클레오타이드를 가진다. 소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자는 외인성 RNAi 저해제 분자 또는 천연 miRNA를 저해하는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드이다.
소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자는 8 내지 80, 12 내지 50, 12 내지 30 또는 12 내지 22개의 뉴클레오타이드를 갖는 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 16 내지 20, 16 내지 18, 18 내지 22 또는 18 내지 20개의 뉴클레오타이드를 가진다.
변형
전형적으로, 핵산 저해제 분자의 다중 뉴클레오타이드 소단위는 분자의 다양한 특징, 예컨대 뉴클레아제에 대한 내성 또는 저하된 면역원성을 개선시키도록 변형된다. 예를 들어, 문헌[Bramsen et al. (2009), Nucleic Acids Res., 37, 2867-2881] 참조. 다수의 뉴클레오타이드 변형은 특히 핵산 저해제 분자에 대해 올리고뉴클레오타이드 분야에서 사용되었다. 이러한 변형은 당 모이어티, 포스포에스터 결합 및 핵염기를 포함하는 뉴클레오타이드의 임의의 부분에 대해 이루어질 수 있다. 핵산 저해제 분자의 소정의 실시형태에서, 1개 내지 모든 뉴클레오타이드는, 예를 들어, 당업계에 공지되고 본 명세서에 기재된 2'-탄소 변형을 이용하여 당 모이어티의 2'-탄소에서 변형된다. 2'-탄소 변형의 전형적인 예는 2'-F, 2'-O-메틸 ("2'-OMe" 또는 "2'-OCH3"), 2'-O-메톡시에틸("2'-MOE" 또는 "2'-OCH2CH2OCH3")을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 변형은 또한 본 명세서에 기재되는 바와 같은 뉴클레오타이드의 당 모이어티의 다른 부분, 예컨대 5'-탄소에서 생길 수 있다.
소정의 실시형태에서, 잠금 핵산("LNA")(예를 들어, 문헌[Koshkin et al. (1998), Tetrahedron, 54,3607-3630] 참조), 브리지된 핵산(bridged nucleic acid: "BNA"(예를 들어, 미국 특허 제7,427,672호 및 문헌[Mitsuoka et al. (2009), Nucleic Acids Res., 37(4):1225-38] 참조); 및 비잠금 핵산("UNA")(예를 들어, 문헌[Snead et al. (2013), Molecular Therapy - Nucleic Acids, 2,e103(doi: 10.1038/mtna.2013.36)] 참조)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 당 모이어티의 고리 구조가 변형된다.
변형된 핵염기는 당업계에 공지되고 본 명세서에 기재된 바와 같이 1'위치에서 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티민 및 유라실 이외의 핵염기를 포함한다. 변형된 핵염기의 전형적인 예는 5'-메틸사이토신이다.
RNA 및 DNA의 천연 유래 뉴클레오타이드간 결합은 3'에서 5'으로의 포스포다이에스터 결합이다. 변형된 포스포에스터 결합은 당업계에 공지되고 본 명세서에 기재된 바와 같이 인 원자를 함유하는 뉴클레오타이드간 결합 및 인 원자를 함유하지 않는 뉴클레오타이드간 결합을 포함하는 비천연 유래 뉴클레오타이드간 연결기를 포함한다. 전형적으로, 핵산 저해제 분자는 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 인-함유 뉴클레오타이드간 연결기를 함유한다. 다른 실시형태에서, 핵산 저해제 분자의 뉴클레오타이드간 연결기 중 하나 이상은 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인 함유 결합이다. 소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자는 하나 이상의 인-함유 뉴클레오타이드간 연결기 및 하나 이상의 비-인 함유 뉴클레오타이드간 연결기를 함유한다.
핵산 저해제 분자의 5'-단부는 천연 치환체, 예컨대 하이드록실 또는 인산염기를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 하이드록실기는 핵산 저해제 분자의 5'-말단 단부에 부착된다. 소정의 실시형태에서, 인산염기는 핵산 저해제 분자의 5'-말단 단부에 부착된다. 전형적으로, 인산염은 올리고뉴클레오타이드 합성 전에 단량체에 첨가된다. 다른 실시형태에서, 5'-인산화는 핵산 저해제 분자가, 예를 들어, 사이토졸 Clp1 키나제에 의해 사이토졸에 도입된 후에 자연적으로 수행된다. 일부 실시형태에서, 5'-말단의 인산염은 인산염기, 예컨대 5'-모노포스페이트[(HO)2(O)P-O-5'], 5'-다이포스페이트[(HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'] 또는 5'-트라이포스페이트[(HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-0-5']이다.
핵산 저해제 분자의 5'-단부는 또한 변형될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 핵산 저해제 분자의 5'-단부는 포스포르아미데이트[(HO)2(O)P-NH-5', (HO)(NH2)(O)P-O-5']에 부착된다. 소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자의 5'-말단 단부는 인산염 모방체에 부착된다. 적합한 인산염 모방체는 5'-포스포네이트, 예컨대 5'-메틸렌포스포네이트(5'-MP), 5'-(E)-비닐포스포네이트(5'-VP)를 포함한다. Lima et al., Cell, 2012, 150-883-94; WO2014/130607. 다른 적합한 인산염 모방체는 본 명세서에 전문이 참고로 편입된 국제 특허 출원 공개 WO 2018/045317에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단의 뉴클레오타이드의 당 모이어티(예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스 또는 이들의 유사체)의 4'-탄소에 결합된 4-인산염 유사체를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 핵산 저해제 분자의 5'-말단은 옥시메틸포스포네이트에 부착되며, 여기서 옥시메틸기의 산소 원자는 당 모이어티 또는 이의 유사체의 4'-탄소에 결합된다. 다른 실시형태에서, 인산염 유사체는 티오메틸포스포네이트 또는 아미노메틸포스포네이트이며, 여기서 티오메틸기의 황 원자 또는 아미노메틸기의 질소 원자는 당 모이어티 또는 이의 유사체의 4'-탄소에 결합된다.
소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자는 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함한다. 전형적으로, 핵산 저해제 분자는 5개 미만의 데옥시리보뉴클레오타이드를 함유한다. 소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자는 하나 이상의 리보뉴클레오타이드를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자의 모든 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드이다.
소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자의 1 또는 2개의 뉴클레오타이드는 글루타티온-민감성 모이어티에 의해 가역적으로 변형된다. 전형적으로, 글루타티온-민감 모이어티는 당 모이어티의 2'-탄소에서 위치되고 설폰일기를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 글루타티온-민감 모이어티는, 예를 들어, 본 명세서에 전문이 참고로 편입된 국제 특허 출원 공개 WO 2018/045317에 기재된 바와 같은 포스포르아미다이트 올리고뉴클레오타이드 합성 방법에 적합하다. 소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자의 2개 초과의 뉴클레오타이드는 글루타티온-민감성 모이어티에 의해 가역적으로 변형된다. 소정의 실시형태에서, 대부분의 뉴클레오타이드는 글루타티온-민감 모이어티에 의해 가역적으로 변형된다. 소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오타이드는 글루타티온-민감성 모이어티에 의해 가역적으로 변형된다.
적어도 하나의 글루타티온-민감 모이어티는 전형적으로 단일-가닥 핵산 저해제 분자의 5'- 또는 3'-말단의 뉴클레오타이드 또는 이중-가닥 핵산 저해제 분자의 패신저 가닥 또는 가이드 가닥의 5'- 또는 3'-말단의 뉴클레오타이드에 위치된다. 그러나, 적어도 하나의 글루타티온-민감 모이어티는 핵산 저해제 분자에서 관심 대상의 임의의 뉴클레오타이드에 위치될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자는 완전히 변형되되, 완전히 변형된 핵산 저해제 분자의 모든 뉴클레오타이드는 변형된다. 소정의 실시형태에서, 완전히 변형된 핵산 저해제 분자는 가역적 변형을 함유하지 않는다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 핵산 저해제 분자의 단일가닥 핵산 저해제 분자 또는 가이드 가닥 또는 패신저 가닥 중 적어도 하나, 예컨대 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오타이드는 변형된다.
소정의 실시형태에서, 완전히 변형된 핵산 저해제 분자는 하나 이상의 가역적, 글루타티온-민감성 모이어티로 변형된다. 소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드는 변형된다. 소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자의 절반 초과의 뉴클레오타이드는 가역적 변형이 아닌 화학적 변형에 의해 변형된다. 소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자의 절반 미만의 뉴클레오타이드는 가역적 변형이 아닌 화학적 변형에 의해 변형된다. 변형은 핵산 저해제 분자 상의 기에서 일어날 수 있거나 또는 상이한 변형된 뉴클레오타이드가 배치될 수 있다.
핵산 저해제 분자의 소정의 실시형태에서, 1개 내지 모든 뉴클레오타이드는 2'-탄소에서 변형된다. 소정의 실시형태에서, 핵산 저해제 분자(또는 이의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥)는 2'-F, 2'-O-Me, 및/또는 2'-MOE에 의해 부분적으로 또는 완전히 변형된다. 핵산 저해제 분자의 소정의 실시형태에서, 1개 내지 모든 인 원자는 변형되며, 1개 내지 모든 뉴클레오타이드는 2'-탄소에서 변형된다.
β-카테닌 핵산 저해제
본 명세서에 개시된 바와 같이, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 소정의 질환 또는 장애, 예컨대 비-Wnt 활성화된 암을 치료하기 위해 면역요법과 병용될 수 있다. 본 발명자들은 이들 조합이 각각의 제제의 개개 투여에 비해 상승 효과를 생산할 수 있다는 것을 나타내었다. 예를 들어, 실시예 4 참조.
β-카테닌 핵산 저해제 분자는, 예를 들어, 미국 가출원 특허 제62/573,999호; 미국 특허 출원 공개 제2015/0291954호 및 제2015/0291956호 및 미국 특허 제6,066,500호; 제8,198,427호; 제8,835,623호; 또는 제9,243,244호에 개시된 바와 같이 공지되어 있으며, 이들 모두는 이들 β-카테닌 핵산 저해제 분자의 그들의 개시내용에 대해 참고로 편입된다. 소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 미국 특허 제9,243,244호에 개시된 분자이다. 소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 미국 가출원 특허 제62/573,999호에 개시된 분자이다.
소정의 실시형태에서, 본 발명의 β-카테닌 핵산 저해제 분자는 dsRNAi 저해제 분자이며, 여기서 분자의 이중-가닥 영역은 길이가 15 내지 40개의 뉴클레오타이드이다. 소정의 해당 실시형태에서, 이중-가닥 영역은 길이가 19 내지 30, 19 내지 23 또는 19 내지 21개의 뉴클레오타이드이다. 소정의 해당 실시형태에서, 이중-가닥 영역은 길이가 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개의 뉴클레오타이드이다.
소정의 실시형태에서, 본 발명의 β-카테닌 핵산 저해제 분자는 dsRNAi 저해제 분자이며, 여기서 센스 가닥은 길이가 18 내지 66개의 뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 길이가 18 내지 25개의 뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 길이가 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 뉴클레오타이드이다. 소정의 해당 실시형태에서, 센스 가닥은 길이가 25 내지 45개의 뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 길이가 30 내지 40개의 뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 길이가 36, 37, 38, 39 또는 40개의 뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 길이가 25 내지 30개의 뉴클레오타이드이다. 소정의 해당 실시형태에서, 센스 가닥은 길이가 25, 26 또는 27개의 뉴클레오타이드이다.
소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 dsRNAi 저해제 분자이며, 여기서 안티센스 가닥은 길이가 18 내지 66개의 뉴클레오타이드이다. 전형적으로, 안티센스 가닥은 표적 유전자에 핵산 저해제 분자의 효과가 향하도록 표적 유전자 mRNA에서 서열에 대해 충분히 상보성인 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 안티센스 가닥은 표적 유전자 mRNA에 함유된 서열과 완전히 상보성인 서열을 포함하며, 완전히 상보성인 서열은 18 내지 40개의 뉴클레오타이드 길이이다. 소정의 해당 실시형태에서, 안티센스 가닥은 길이가 20 내지 50개의 뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 안티센스 가닥은 길이가 20 내지 30개의 뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 안티센스 가닥은 길이가 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28개의 뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 안티센스 가닥은 길이가 35 내지 40개의 뉴클레오타이드이다. 소정의 해당 실시형태에서, 안티센스 가닥은 길이가 36, 37, 38 또는 39개의 뉴클레오타이드이다.
소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 센스 가닥과 안티센스 가닥 및 18 내지 34개의 염기쌍의 이중가닥 영역을 포함하는 dsRNAi 저해제 분자이되, 센스 가닥은 길이가 25 내지 34개의 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥은 길이가 26 내지 38개의 뉴클레오타이드이고 3' 말단에 1 내지 5개의 단일-가닥 뉴클레오타이드를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 26개의 뉴클레오타이드이며, 안티센스 가닥은 38개의 뉴클레오타이드이고 3' 말단에 2개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부 및 5' 말단에 10개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 가지며, 센스 가닥과 안티센스 가닥은 26개의 염기쌍의 이중가닥 영역을 형성한다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 25개의 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥은 27개의 뉴클레오타이드이고 3' 말단에 2개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 가지며, 센스 가닥과 안티센스 가닥은 25개의 염기쌍의 이중가닥 영역을 형성한다.
소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 센스 가닥과 안티센스 가닥 및 19 내지 21개의 염기쌍의 이중가닥 영역을 포함하는 dsRNAi 저해제 분자이되, 센스 가닥은 길이가 19 내지 21개의 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥은 길이가 21 내지 23개의 뉴클레오타이드고 3' 말단에 1 내지 2개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 21개의 뉴클레오타이드이고 3' 말단에 2개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 가지고, 안티센스 가닥은 21개의 뉴클레오타이드이고 3' 말단에 2개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 가지며, 센스 가닥과 안티센스 가닥은 19개의 염기쌍의 이중가닥 영역을 형성한다. 소정의 실시형태에서, 센스 가닥은 21개의 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥은 23개의 뉴클레오타이드이고 3' 단부에 2개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 가지며, 센스 가닥과 안티센스 가닥은 21개의 염기쌍의 이중가닥 영역을 형성하고, 센스 가닥의 3' 단부와 안티센스 가닥의 5' 단부는 평활 말단을 형성한다.
일부 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 줄기 및 테트라루프를 포함하는 dsRNAi 저해제 분자이다. 소정의 실시형태에서, dsRNAi 저해제 분자의 센스 가닥은 줄기 및 테트라루프를 함유하고, 길이가 34 내지 40 또는 34 내지 36개의 뉴클레오타이드이며, dsRNAi 저해제 분자의 안티센스 가닥은 20 내지 24개의 뉴클레오타이드를 함유하되, 센스 가닥과 안티센스 가닥은 18 내지 24개의 염기쌍의 이중가닥 영역을 형성한다.
소정의 실시형태에서, dsRNAi 저해제 분자는 (a) 줄기 및 테트라루프를 함유하고 길이가 36개의 뉴클레오타이드인 센스 가닥으로서, 5'-단부로부터 센스 가닥의 처음 20개 뉴클레오타이드가 안티센스 가닥에 대해 상보성이고, 패신저 가닥의 다음의 16개의 뉴클레오타이드는 줄기 및 테트라루프를 형성하는, 상기 센스 가닥, 및 (b) 길이가 22개의 뉴클레오타이드이고, 3' 단부에 2개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 갖는 안티센스 가닥을 포함하되, 상기 안티센스 및 센스 가닥은 인접한 올리고뉴클레오타이드를 형성하지 않는 별개의 가닥이다.
소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 표적 핵산(예를 들어, β-카테닌)의 세그먼터의 역상보체를 포함하는 5'에서 3' 방향으로 서열을 갖는 통상적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 12 내지 30, 12 내지 25, 12 내지 22, 14 내지 20, 16 내지 20 또는 18 내지 22개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 16 내지 18개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 18 내지 20개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 8 내지 80 또는 12 내지 50개의 뉴클레오타이드를 가진다. 소정의 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 부분은 표적 핵산(예를 들어, β-카테닌) 또는 이의 특정 일부에 대해 완전히 상보성이다. 소정의 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 일부는 표적 핵산(예를 들어, β-카테닌)의 적어도 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 인접한 뉴클레오타이드에 대해 상보성이다. 소정의 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산(예를 들어, β-카테닌) 또는 이의 일부에 대해 단지 5, 4, 3, 2 또는 1개의 비-상보성 뉴클레오타이드를 함유한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 길이를 감소시키고/시키거나 활성을 제거하는 일 없이 미스매치를 도입할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 발명의 β-카테닌 핵산 저해제 분자는 ssRNAi 저해제 분자이다.
소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자의 안티센스 가닥은 서열번호 2의 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자의 안티센스 가닥은 서열번호 2의 서열로 이루어진다. 소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 dsRNAi 저해제 분자이고, 센스 가닥은 서열번호 1의 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 dsRNAi 저해제 분자이고, 센스 가닥은 서열번호 1의 서열로 이루어진다. 소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 dsRNAi 저해제 분자이고, 센스 가닥은 서열번호 1의 서열을 포함하며, 안티센스 가닥은 서열번호 2의 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 dsRNAi 저해제 분자이고, 센스 가닥은 서열번호 1의 서열로 이루어지며, 안티센스 가닥은 서열번호 2의 서열로 이루어진다.
β-카테닌 RNA의 수준 또는 활성은 당업계에 현재 공지되거나 이후에 개발되는 적합한 방법에 의해 결정될 수 있다. 표적 RNA 및/또는 표적 유전자의 "발현"을 측정하기 위해 사용되는 방법은 표적 유전자 및 그의 암호화된 RNA의 특성에 의존할 수 있다는 것이 인식될 수 있다. 예를 들어, 표적 β-카테닌 RNA 서열이 단백질을 암호화하는 경우, 용어 "발현"은 β-카테닌 유전자(게놈 또는 외인성 유래 중 하나)로부터 유래된 단백질 또는 β-카테닌 RNA/전사체를 지칭할 수 있다. 이러한 예에서, 표적 β-카테닌 RNA의 발현은 직접적으로 β-카테닌 RNA/전사체의 양을 측정함으로써 또는 β-카테닌 단백질의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다. 단백질은 단백질 분석에서, 예컨대 염색 또는 면역블롯팅에 의해 또는, 단백질이 측정될 수 있는 반응을 촉매한다면 반응 속도를 측정함으로써 측정될 수 있다. 모든 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 사용될 수 있다. 표적 β-카테닌 RNA 수준이 측정되는 경우, RNA 수준을 검출하기 위한 당업계에 인식된 방법이 사용될 수 있다(예를 들어, RT-PCR, 노던 블롯팅 등). β-카테닌 RNA를 표적화함에 있어서, 대상체에서, 조직, 세포에서, 시험관내 또는 생체내에서, 또는 세포 추출물에서 β-카테닌 RNA 또는 단백질 수준을 감소시키는 데 핵산 저해제 분자의 효능 측정은 또한 예를 들어, WO/2017/160983으로서 공개된 국제 특허 출원 PCT/US2017/022510에 개시된 바와 같이 β-카테닌-연관 표현형(예를 들어, 질환 또는 장애, 예를 들어, 암 또는 종양 형성, 성장, 전이, 확산 등)의 감소 정도를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 상기 측정은 세포, 세포 추출물, 조직, 조직 추출물 또는 다른 적합한 공급원 물질에 대해 이루어질 수 있다.
면역요법
본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 β-카테닌 저해제 및 면역요법(또는 면역치료제)와의 병용 요법에 관한 것이다. β-카테닌 저해제를 투여하는 것은 면역요법에 민감한 면역요법에 반응하지 않는 종양을 제공한다.
면역요법은 면역 반응을 향상시키는 방법을 지칭한다. 전형적으로, 본 명세서에 개시된 방법에서, 항-종양 면역 반응은 향상된다. 소정의 실시형태에서, 면역요법은 종양 또는 암에 대해 T 세포 반응을 향상시키는 방법을 지칭한다.
소정의 실시형태에서, 면역요법 또는 면역치료제는 면역관문 분자를 표적화한다. 소정의 종양은 면역관문 경로를 선임함으로써 면역계를 피할 수 있다. 따라서, 면역관문 표적화는 면역계를 피하는 종양의 능력을 계산하고 소정의 암에 대해 항-종양 면역을 활성화시키기 위한 효과적인 접근으로서 나타났다(Pardoll, Nature Reviews Cancer, 2012, 12:252-264).
소정의 실시형태에서, 면역관문 분자는 항원에 대한 T 세포 반응에 연루된 신호를 감소시키는 저해 분자이다. 예를 들어, CTLA4는 T 세포 상에서 발현되고, 항원 제시 세포 상에서 CD80(B7.1이라고도 함) 또는 CD86(B7.2라고도 함)을 결합시킴으로써 T 세포 활성화를 하향조절하는 데 어떤 역할을 한다. PD-1은 T 세포 상에서 발현되는 다른 저해 면역관문 분자이다. PD-1은 면역 반응 동안 말초 조직에서 T 세포의 활성을 제한한다. 추가로, PD-1에 대한 리간드(PD-L1 또는 PD-L2)는 다수의 상이한 종양 표면 상에서 통상적으로 상향조절되어, 종양 미세환경에서 항-종양 면역 반응의 하향조절을 야기한다. 소정의 실시형태에서, 저해 면역관문 분자는 CTLA4 또는 PD-1이다. 다른 실시형태에서, 저해 면역관문 분자는 PD-1에 대한 리간드, 예컨대 PD-L1 또는 PD-L2이다. 다른 실시형태에서, 저해 면역관문 분자는 CTLA4에 대한 리간드, 예컨대 CD80 또는 CD86이다. 다른 실시형태에서, 저해 면역관문 분자는 림프구 활성화 유전자 3(LAG3), 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR), T 세포막 단백질 3(TIM3), 갈렉틴 9(GAL9), 또는 아데노신 A2a 수용체(A2aR)이다.
이들 저해 면역관문 분자를 표적화하는 길항제는 소정의 암에 대해 항원-특이적 T 세포 반응을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 소정의 실시형태에서, 면역요법 또는 면역치료제는 저해 면역관문 분자의 길항제이다. 소정의 실시형태에서, 저해 면역관문 분자는 PD-1이다. 소정의 실시형태에서, 저해 면역관문 분자는 PD-L1이다. 소정의 실시형태에서, 저해 면역관문 분자의 길항제는 항체이고, 바람직하게는 단클론성 항체이다. 소정의 실시형태에서, 항체 또는 단클론성 항체는 항-CTLA4, 항-PD-1, 항-PD-L1, 또는 항-PD-L2 항체이다. 소정의 실시형태에서, 항체는 단클론성 항-PD-1 항체이다. 소정의 실시형태에서, 항체는 단클론성 항-PD-L1 항체이다. 소정의 실시형태에서, 단클론성 항체는 항-CTLA4 항체와 항-PD-1 항체, 항-CTLA4 항체와 항-PD-L1 항체, 또는 항-PD-L1 항체와 항-PD-1 항체의 조합물이다. 소정의 실시형태에서, 항-PD-1 항체는 펨브롤리주맙(키트루다(Keytruda)(등록상표)) 또는 니볼루맙(옵디보(Opdivo)(등록상표)) 중 하나 이상이다. 소정의 실시형태에서, 항-CTLA4 항체는 이필리무맙(여보이(Yervoy)(등록상표))이다. 소정의 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙(테쎈트릭(Tecentriq)(등록상표)), 아벨루맙(바벤시오(Bavencio)(등록상표)) 또는 두르발루맙(임핀지(Imfinzi)(등록상표)) 중 하나 이상이다.
소정의 실시형태에서, 면역요법 또는 면역치료제는 CD80, CD86, LAG3, KIR, TIM3, GAL9 또는 A2aR에 대한 길항제(예를 들어, 항체)이다. 다른 실시형태에서, 길항제는 저해 면역관문 분자의 가용성 형태, 예컨대 저해 면역관문 분자의 세포외 도메인 및 항체의 Fc 도메인을 포함하는 가용성 융합 단백질이다. 소정의 실시형태에서, 가용성 융합 단백질은 CTLA4, PD-1, PD-L1 또는 PD-L2의 세포외 도메인을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 가용성 융합 단백질은 CD80, CD86, LAG3, KIR, TIM3, GAL9 또는 A2aR의 세포외 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 가용성 융합 단백질은 PD-L2 또는 LAG3의 세포외 도메인을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 면역관문 분자는 항원에 대한 T 세포 반응에 연루된 신호를 증폭시키는 공자극 분자이다. 예를 들어, CD28은 T 세포 상에서 발현된 공자극 수용체이다. T 세포가 그의 T 세포 수용체를 통해 항원에 결합할 때, CD28은 T 세포 수용체 신호전달을 증폭시키고 T 세포 활성화를 촉진시키기 위해 항원-제시 세포 상에서 CD80(B7.1이라고도 함) 또는 CD86(B7.2라고도 함)에 결합한다. CD28은 CTLA4와 동일한 리간드(CD80 및 CD86)에 결합하기 때문에, CTLA4는 CD28에 의해 매개되는 공자극 신호전달에 대응하거나 또는 조절할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 면역관문 분자는 CD28, 유도성 T 세포 공자극제(ICOS), CD137, OX40 또는 CD27로부터 선택된 공자극 분자이다. 다른 실시형태에서, 면역관문 분자는, 예를 들어, CD80, CD86, B7RP1, B7-H3, B7-H4, CD137L, OX40L 또는 CD70을 포함하는, 공자극 분자의 리간드이다.
이들 공자극 관문 분자를 표적화하는 작용제는 소정의 암에 대해 항원-특이적 T 세포 반응을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 소정의 실시형태에서, 면역요법 또는 면역치료제는 공자극 관문 분자의 작용제이다. 소정의 실시형태에서, 공자극 관문 분자의 작용제는 작용제 항체이고, 바람직하게는 단클론성 항체이다. 소정의 실시형태에서, 작용제 항체 또는 단클론성 항체는 항-CD28 항체이다. 다른 실시형태에서, 작용제 항체 또는 단클론성 항체는 항-ICOS, 항-CD137, 항-OX40, 또는 항-CD27 항체이다. 다른 실시형태에서, 작용제 항체 또는 단클론성 항체는 항-CD80, 항-CD86, 항-B7RP1, 항-B7-H3, 항-B7-H4, 항-CD137L, 항-OX40L 또는 항-CD70 항체이다.
약제학적 조성물
본 개시내용은 치료적 유효량의 β-카테닌 핵산 저해제 분자 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 전형적으로, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 IDO 저해제 또는 면역치료제와 동일한 약제학적 조성물에 포함되지 않는다. 그러나, 소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물은 치료적 유효량의 면역치료제, 예컨대 저해 면역관문 분자의 길항제(예를 들어, 항-CTLA-4, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체 중 하나 이상) 또는 공자극 관문 분자의 작용제를 추가로 포함한다.
이들 약제학적 조성물은 통상적인 멸균 기법에 의해 멸균될 수 있거나, 또는 멸균 여과될 수 있다. 얻어진 수용액은 있는 그대로 사용되도록 패키징되거나 또는 동결건조될 수 있고, 동결건조 제제는 투여 전에 멸균 수성 부형제와 합쳐진다. 제제의 pH는 전형적으로 3 내지 11, 더 바람직하게는 5 내지 9 또는 6 내지 8, 및 가장 바람직하게는 7 내지 8, 예컨대 7 내지 7.5일 것이다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은 치료적 용도를 위해 적용된다. 따라서, 본 개시내용의 일 양상은 상기 대상체에게 본 개시내용의 치료적 유효량의 약제학적 조성물을 투여함으로써 질환 또는 병태를 앓고 있는 인간을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있는 약제학적 조성물을 제공한다. 전형적으로, 질환 또는 병태는 본 명세서에 기재된 바와 같은 암이다.
소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 치료가 필요한 대상체의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료적 유효량의 약제학적 조성물의 용도를 특징으로 한다. 전형적으로, 대상체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 암을 가진다.
약제학적으로 허용 가능한 부형제
전형적으로, 본 개시내용에서 유용한 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 통상적이다. 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)]은 1종 이상의 치료적 조성물의 약제학적 전달에 적합한 조성물 및 제형을 기재한다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 그의 유도체, 예컨대 카복시메틸셀룰로스나트륨, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 맥아; 젤라틴; 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌약 왁스; 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 미치 대두유; 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (등장 식염수; 링거 용액); 에틸 알코올; pH 완충 용액; 폴리올, 예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등; 및 약제학적 제형에서 사용되는 다른 비독성의 적합한 물질을 포함한다.
투약 형태
약제학적 조성물은 임의의 의도된 투여경로에 대해 통상적인 부형제로 제형화될 수 있다.
전형적으로, β-카테닌 핵산 저해제 분자를 함유하는 본 개시내용의 약제학적 조성물은 비경구 투여용으로, 예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내 또는 경막외 주사에 의해 액체 형태로 제형화된다. 전형적으로, 면역치료제, 예컨대 저해 면역관문 분자의 길항제(예를 들어, 항-CTLA-4, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체 중 하나 이상) 또는 공자극 관문 분자의 작용제를 함유하는 약제학적 조성물은 비경구 투여용으로, 예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내 또는 경막외 주사에 의해 액체 형태로 제형화된다.
비경구 투여에 적합한 투약 형태는 전형적으로, 예로서, 멸균 수용액, 식염수, 저분자량 알코올, 예컨대 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 젤라틴, 지방산 에스터, 예컨대 에틸 올레이트 등을 포함하는 비경구 투여를 위한 1종 이상의 적합한 비히클을 포함한다. 비경구 제형은 당, 알코올, 항산화제, 완충제, 정균제, 의도된 수용자의 혈액과 등장성인 제형을 제공하는 용질 또는 현탁제 또는 증점제를 함유할 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 액체 제형은 동결건조되고, 멸균 주사 용액에 의한 재구성 시 이후의 사용을 위해 저장될 수 있다.
약제학적 조성물은 또한 국소 또는 경피 투여, 직장 또는 질 투여, 안구 투여, 비강 투여, 협측 투여 또는 설하 투여를 포함하는 다른 투여 경로를 위해 제형화될 수 있다.
전달 제제
β-카테닌 핵산 저해제 분자는, 예를 들어, 리포좀 및 지질, 예컨대 미국 특허 제6,815,432호, 제6,586,410호, 제6,858,225호, 제7,811,602호, 제7,244,448호 및 제8,158,601호에 개시된 것; 중합체 물질, 예컨대 미국 특허 제6,835,393호, 제7,374,778호, 제7,737,108호, 제7,718,193호, 제8,137,695호 및 미국 특허 출원 공개 제2011/0143434호, 제2011/0129921호, 제2011/0123636호, 제2011/0143435호, 제2011/0142951호, 제2012/0021514호, 제2011/0281934호, 제2011/0286957호 및 제2008/0152661호에 개시된 것; 캡시드, 캡소이드 또는 섭취, 분포 또는 흡수를 돕기 위한 수용체 표적화된 분자를 포함하는, 다른 분자, 분자 구조 또는 화합물의 혼합물과 혼합되거나, 캡슐화되거나, 접합되거나, 또는 다르게는 연관될 수 있다.
소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 지질 나노입자(LNP)에서 제형화된다. 지질-핵산 나노입자는 전형적으로 지질을 핵산과 혼합할 때 자발적으로 형성되어 복합체를 형성한다. 목적으로 하는 입자 크기 분포에 따라서, 얻어진 나노입자 혼합물은, 예를 들어, 압출성형기(thermobarrel extruder), 예컨대 LIPEX(등록상표) 압출기(노던 리피즈 인코포레이티드(Northern Lipids, Inc))를 이용하여 폴리카보네이트 막(예를 들어, 100㎚ 컷오프)을 통해 선택적으로 압출될 수 있다. 치료 용도를 위한 지질 나노입자를 제조하기 위해, 나노입자 및/또는 교환 완충제를 형성하는 데 사용되는 용매(예를 들어, 에탄올)를 제거하는 것이 바람직할 수 있으며 이는, 예를 들어, 투석 또는 접선 유동 여과에 의해 수행될 수 있다. 핵산 간섭 분자를 함유하는 지질 나노입자의 제조 방법은, 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 제2015/0374842호 및 제2014/0107178호에 개시된 바와 같이, 당업계에 공지되어 있다.
소정의 실시형태에서, LNP는 양이온성 리포좀 및 페길화된 지질을 포함하는 코어 지질 성분을 포함한다. LNP는 추가로 하나 이상의 외피 지질, 예컨대 양이온성 지질, 구조적 또는 중성 지질, 스테롤, 페길화된 지질, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
LNP에서 사용하기 위한 양이온성 지질은, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 제2015/0374842호 및 제2014/0107178호에 논의된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, 양이온성 지질은 생리적 pH에서 순 양전하를 갖는 지질이다. 소정의 실시형태에서, 양이온성 리포좀은 DODMA, DOTMA, DL-048 또는 DL-103이다. 소정의 실시형태에서, 구조적 지질은 DSPC, DPPC 또는 DOPC이다. 소정의 실시형태에서, 스테롤은 콜레스테롤이다. 소정의 실시형태에서, 페길화된 지질은 DMPE-PEG, DSPE-PEG, DSG-PEG, DMPE-PEG2K, DSPE-PEG2K, DSG-PEG2K 또는 DSG-MPEG이다. 일 실시형태에서, 양이온성 지질은 DL-048이고, 페길화된 지질은 DSG-MPEG이고, 하나 이상의 외피 지질은 DL-103, DSPC, 콜레스테롤 및 DSPE-MPEG이다. 예를 들어, β-카테닌 핵산 저해제 분자를 제형화하기 위해 사용될 수 있는 LNP의 한 가지 비제한적 실시형태를 나타내는 도 11을 참조한다.
소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 관심 대상의 조직에 올리고뉴클레오타이드의 전달을 지시하는 리간드에 공유적으로 접합된다. 다수의 이러한 리간드가 연구되었다. 예를 들어, 문헌[Winkler, Ther. Deliv. 4(7): 791-809 (2013)] 참조. 예를 들어, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 간에 올리고뉴클레오타이드의 흡수를 지시하는 하나 이상의 당 리간드 모이어티(예를 들어, N-아세틸갈락토사민(GalNAc))에 접합될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,994,517호; 미국 특허 제5,574,142호; WO 2016/100401을 참조한다. 전형적으로, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 3 또는 4개의 당 모이어티(예를 들어, GalNAc)에 접합된다. 사용될 수 있는 다른 리간드는 만노스-6-포스페이트, 콜레스테롤, 엽산, 트랜스페린 및 갈락토스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(다른 구체적인 예시적 리간드에 대해, 예를 들어, WO 2012/089352 참조). 전형적으로, 올리고뉴클레오타이드는 리간드에 접합될 때, 올리고뉴클레오타이드는 네이키드 올리고뉴클레오타이드로서 투여되되, 올리고뉴클레오타이드는 LNP 또는 다른 보호 코팅에서 제형화되지 않는다. 소정의 실시형태에서, 네이키드 올리고뉴클레오타이드 내의 각각의 뉴클레오타이드는 당 모이어티의 2'-위치에서, 전형적으로 2'-F, 2'-OMe 및/또는 2'-MOE로 변형된다.
투여/치료 방법
β-카테닌 핵산 저해제 분자 또는 면역치료제를 함유하는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 전형적으로 비경구로 투여된다. β-카테닌 핵산 저해제 분자를 함유하는 약제학적 조성물은 전형적으로 정맥내로 또는 피하로 투여된다. 면역치료제를 함유하는 약제학적 조성물은 전형적으로 정맥내로 투여된다. 그러나, 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 또한, 예를 들어, 협측, 설하, 직장, 질, 요도내, 국소, 안구내, 비강내 및/또는 관절내를 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 투여될 수 있는데, 이런 투여는 정제, 캡슐, 과립, 수성 현탁액, 겔, 스프레이, 좌약, 살브(salve), 연고 등을 포함할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 Wnt 활성화된 질환 또는 장애, 예컨대 암과 관련된 증상의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 비-Wnt 활성화된 질환 또는 장애, 예컨대 암과 관련된 증상의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다.
일 실시형태는 대상체에게 치료적 유효량의 β-카테닌 핵산 저해제 분자 및 치료적 유효량의 면역치료제를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 ssRNAi 저해제 분자 또는 dsRNAi 저해제 분자를 포함하는 RNAi 저해제 분자이다. 일부 실시형태에서, 면역치료제는 저해 면역관문 분자의 길항제 또는 공자극 관문 분자의 작용제로서이다. 소정의 실시형태에서, 저해 면역관문 분자의 길항제는 항-CTLA-4, 항-PD-1, 항-PD-L1 항체 또는 이들의 조합물이다.
이러한 암의 비제한적 예는 담관암, 방광암, 이행세포암종, 요로상피세포암종, 뇌암, 신경교종, 성상세포종, 유방 암종, 화생암종, 자궁경부암, 경부 편평 세포 암종, 직장암, 결장직장 암종, 결장암, 유전성 비용종성 결장직장암, 결장직장 선암종, 위장관 기질 종양(GIST), 자궁내막 암종, 자궁내막 기질 육종, 식도암, 식도 편평 세포 암종, 식도 선암종, 안구 흑색종, 포도막 흑색종, 담낭암종, 담낭 선암종, 신세포 암종, 투명 세포 신세포 암종, 이행세포암종, 요로상피세포암종, 윌름 종양, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성(CLL), 만성 골수성(CML), 만성 골수단핵구성(CMML), 간암, 간암종, 간세포암, 간세포 암종, 담관암종, 간모세포종, 폐암, 비소세포 폐암(NSCLC), 중피종, B-세포 림프종, 비호지킨 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 외투 세포 림프종, T 세포 림프종, 비호지킨 림프종, 전구 T-림프아구성 림프종/백혈병, 말초 T 세포 림프종, 다발성 골수종, 비인두암종(NPC), 신경모세포종, 구인두암, 구강 편평 세포 암종, 골육종, 난소 암종, 췌장암, 췌관 선암종, 가유두상 신생물, 샘꽈리세포암종을 포함한다. 전립선암, 전립선 선암종, 피부암, 흑색종, 악성 흑색종, 피부 흑색종, 소장 암종, 위암, 위암종, 위장 기질 종양(GIST), 자궁암 또는 자궁 육종. 소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 간암, 간 암종, 간세포암, 간세포 암종, 담관암종 및 간모세포종을 치료하는 방법을 특징으로 한다. 치료 방법의 소정의 실시형태에서, 암은 결장직장암, 간세포 암종 또는 흑색종이다. 치료 방법의 소정의 실시형태에서, 암은 흑색종, 신경모세포종 또는 신세포암이다.
치료 방법의 소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자의 투여 전에, 암은 면역요법, 예컨대 저해 면역관문 분자의 길항제(예를 들어, 항-CTLA-4, 항-PD-1, 또는 항-PD-L1 항체 중 하나 이상) 또는 공자극 관문 분자의 작용제, 예컨대 항-CD28 항체에 대해 반응성이 아니다.
일부 실시형태에서, 암은 활성화된 Wnt/β-카테닌 경로와 관련된다. 다른 실시형태에서, 암은 비-Wnt 활성화된 암이다. 소정의 실시형태에서, 대상체는 β-카테닌 핵산 저해제 분자를 투여하기 전에 비-Wnt 활성화된 암을 갖는 것으로 동정되었다. 대상체는 당업자에게 이용 가능한 임의의 방법을 이용하여 비-Wnt 활성화된 암을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 전형적으로, 그러나, 대상체로부터의 샘플은 대상체가 비-Wnt 활성화된 암을 갖는지의 여부를 결정하기 위해 분석된다. 소정의 실시형태에서, 샘플은 조직, 세포, 혈액 또는 소변을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 샘플은 활성화된 Wnt/β-카테닌 경로, 비활성 Wnt/β-카테닌 경로 및/또는 비-T 세포 염증 표현형과 관련된 하나 이상의 바이오마커에 대해 분석된다. 임의의 적합한 검정 또는 기법을 이용하여 핵산(예를 들어, mRNA), 단백질 및 펩타이드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 적절한 바이오마커가 분석될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 바이오마커는 활성화된 Wnt/β-카테닌 경로와 관련된 유전자 돌연변이, 예컨대 β-카테닌 또는 APC 또는 Wnt/β-카테닌 경로에 연루된 하나 이상의 다른 성분, 예컨대, Axin, LEF 및 ICAT를 암호화하는 유전자의 돌연변이이다.
소정의 실시형태에서, 비-Wnt 활성화된 암은 면역요법에 내성이 있지만, 면역요법에 대한 내성은 β-카테닌 핵산 저해제 분자와 병용하여 면역요법을 투여함으로써 반전될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 암에 대한 면역요법의 치료 효과를 강력하게 하기에 또는 다르게는 암을 면역요법에 민감하게 만들기에 충분한 양으로 암을 갖는 대상체에게 β-카테닌 핵산 저해제 분자를 투여하는 단계를 포함하는 암에 대한 생체내 면역 반응을 강력하게 하는 방법을 제공한다. 전형적으로, β-카테닌 핵산 저해제 분자를 투여하기 전에, 암은 면역요법에 내성이 있는 비-T 세포 염증 표현형과 연관되며, 암이 면역요법에 대해 반응성이 되도록 β-카테닌 핵산 저해제 분자를 투여하는 것은 비-T 세포 염증 표현형을 T 세포-염증 표현형으로 전환시킨다. 소정의 실시형태에서, 대상체는 β-카테닌 핵산 저해제 분자 및 면역요법에 의한 치료 후 종양 퇴행을 경험한다. 소정의 실시형태에서, 면역요법에 내성이 있는 암은 Wnt 활성화된 암이다. 다른 실시형태에서, 면역요법에 내성이 있는 암은 비-Wnt 활성화된 암이다. 전형적으로, 대상체는 β-카테닌 핵산 저해제 분자 투여의 개시 후에 면역치료제를 취하기 시작한다. 다른 실시형태에서, 대상체는 β-카테닌 핵산 저해제 분자 투여의 개시 시 이미 면역치료제를 취할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 거의 동시에 면역치료제와 β-카테닌 핵산 저해제 분자 둘 다의 투여를 시작할 수 있다.
투약 및 스케줄
전형적으로, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 면역치료제와 별개로 그리고 상이한 스케줄로 투여된다. 예를 들어, 단일 제제로서 사용될 때, 이필리무맙(항-CTLA-4 항체)은 총 4회 용량에 대해 3주마다 3㎎/㎏의 권장 용량으로 90분에 걸쳐 정맥내로 투여된다. 유사하게, 단일 제제로서 사용될 때, 니볼루맙(항-PD-1 항체)은 2주마다 60분에 걸쳐 240㎎(또는 3㎎/㎏)의 권장 용량으로 정맥내로 투여된다. 니볼루맙이 이필리무맙과 병용하여 투여될 때, 니볼루맙의 권장 용량은 60분에 걸쳐 정맥내로 1㎎/㎏이 투여된 후에, 동일한 날에 총 4회 용량에 대해 3주마다 3㎎/㎏의 권장 용량으로 이필리무맙이 투여되고, 이어서, 2주마다 240㎎의 권장 용량으로 니볼루맙이 투여된다. 펨브롤리주맙이 단일 제제로서 사용될 때, 전형적으로 질환 진행, 허용되지 않는 독성, 또는 질환 진행 없이 24개월까지 3주마다 200㎎의 권장 용량으로 30분에 걸쳐 정맥내로 투여된다.
소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 면역치료제 전에 투여된다. 소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 면역치료제 후에 투여된다. 소정의 실시형태에서, 환자는 β-카테닌 핵산 저해제 분자에 의한 치료를 시작하기 전에 치료제로 이미 처리되었다. β-카테닌 핵산 저해제 분자 또는 면역치료제의 치료적 유효량은 투여 경로 및 환자의 신체 특징, 예컨대 대상체의 크기 및 체중, 질환 진행 또는 침투 정도, 대상체의 연령, 건강상태 및 성별에 의존할 수 있고, 필요하다면 이들 및 다른 인자에 따라 조절될 수 있다.
전형적으로, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 비경구로(예컨대 정맥내, 근육내 또는 피하 투여를 통해) 투여된다. 소정의 실시형태에서, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 20마이크로그램 내지 10밀리그램/킬로그램 수용자의 체중/일, 100마이크로그램 내지 5밀리그램/킬로그램, 0.25밀리그램 내지 2.0밀리그램/킬로그램, 또는 0.5 내지 2.0밀리그램/킬로그램의 투약량으로 투여된다. 전형적으로, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 약 0.25 내지 2.0밀리그램/킬로그램 수용자의 체중/일의 투약량으로 투여된다.
β-카테닌 핵산 저해제 분자는 매일 또는 간헐적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, β-카테닌 핵산 저해제 분자 또는 면역치료제의 간헐적 투여는 1 내지 6일/주, 1 내지 6일/개월, 1주에 1회, 2주에 1회, 1개월에 1회, 2개월에 1회, 1년에 1회 또는 2회, 또는 매년, 매달, 매주 또는 매일 다회로 분할되어 투여될 수 있다. 전형적으로, β-카테닌 핵산 저해제 분자는 매주 또는 2주마다 투여된다. 일부 실시형태에서, 간헐적 투약은 1주까지, 1개월까지, 2개월까지, 3개월까지 또는 6개월 이상까지 동안 초기 β-카테닌 핵산 저해제 분자 또는 면역치료제 투여 다음에 나머지 기간에 투여 없음의 주기의 투여를 의미할 수 있거나 또는 격일, 격주, 격월 또는 격년으로의 투여를 의미할 수 있다.
β-카테닌 핵산 저해제 분자는 전형적으로 면역치료제와 별개로, 그리고 상이한 스케줄로 투여된다.
β-카테닌 핵산 저해제 분자 또는 면역치료제의 치료적 유효량은 투여 경로 및 환자의 신체 특징, 예컨대 대상체의 크기 및 체중, 질환 진행 또는 침투 정도, 대상체의 연령, 건강상태 및 성별에 의존할 수 있고, 필요하다면 이들 및 다른 인자에 따라 조절될 수 있다.
실시예
실시예 1: BCAT1 작제물
β-카테닌 유전자를 표적화하는 핵산 저해제 분자를 작제하였다("BCAT1"). BCAT1은 26개의 염기쌍으로 이루어진 이중가닥 영역을 형성하는 26개의 염기쌍 패신저 가닥 및 38 염기쌍 가이드 가닥을 가진다. 도 10. 가이드 가닥의 5' 단부는 10-염기쌍, 단일가닥 돌출부로 이루어지고, 가이드 가닥의 3'-단부는 2-염기쌍 단일-가닥, 돌출부로 이루어진다. 도 10.
BCAT1 작제물은 EnCore 지질 나노입자(LNP)에서 제형화되었다. LNP 제형화된 BCAT1은 피하, 동소이식, 파종성 및 전이성 이종이식 종양, 환자-유래 이종이식(patient-derived xenograft: PDX), 및 유전자 조작된 모델(genetically engineered model: GEM)을 포함하는 다중 종양 유형에 핵산 페이로드를 효과적으로 전달하는 것으로 나타났다(이하의 표 I 참조).
[표 I]
Figure pct00001
Figure pct00002
실시예 2: 종양 연구
6 내지 8주령의 면역적격 마우스(C57BL/6 또는 A/J 또는 Balb/C)를 우측 어깨 아래에 1x106개의 B16F10, 2x106개의 Neuro2A, 1x106개의 Renca 또는 2x106개의 4T1 세포로 피하에 주사하였다. 종양 용적을 2 내지 3일마다 측정하여 종양 성장을 모니터링하였다. 종양이 약 100㎣에 도달되었을 때 투약을 개시하였다. 종양 성장 저해 연구에 대해, 동물을 무작위화하고, 상이한 코호트에 배정하고 나서, 투약 주기를 실시하였다. BCAT1 또는 위약(CTNNB1 dsRNAi 저해제 분자가 스크램블된 LNP)을 10㎖/㎏의 총 용적에서 측부 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 제공하였다. 면역요법 치료(항-PD-1 및 항-CTLA-4 항체)를 10㎖/㎏ 용적으로 복강내로 제공하였다.
마우스 세포주 B16F10, Neuro2A, Renca 및 4T1 세포를 ATCC(버지니아주 매너서스에 소재)로부터 얻고 나서, 10% FBS로 보충한 RPMI/DMEM 배지에서 성장시켰다. B16F10은 Wnt 활성화가 없는 뮤린 흑색종 세포주이다. Neuro2A는 Wnt 활성화가 없는 뮤린 신경모세포종 세포주이다. Renca는 Wnt 활성화가 없는 뮤린 신세포암 세포주이다. 4T1은 활성화된 Wnt 경로를 갖는 뮤린 유방 세포주이다. MMTV-Wnt 유선 종양은 출생시로부터 3 내지 6개월 내의 Wnt 경로 활성화를 갖는 마우스에서 자발적으로 성장하였다. β-카테닌의 핵 염색은 활성화된 Wnt/β-카테닌 경로의 특징이다(Kawakami et al., 2013, Frontiers in Oncology, 3(136):1-7; Segditsas and Tomlinson, 2006, Oncogene, 25:7531-37; Clevers, H., 2006, Cell 127:469-480). B16F10, Neuro2A 및 Renca 세포는 면역조직화학에 의해 측정하여 β-카테닌의 핵 국소화를 갖지 않는 반면, 4T1 세포주 및 자발적 MMTV-Wnt 종양은 둘 다 β-카테닌의 핵 국소화를 나타내었다. 도 2a 내지 도 2b.
실시예 3: β-카테닌의 저해는 Wnt 활성화 없이 종양 내 T 세포 침윤을 향상시킨다
Neuro2A
Ctnnb1 mRNA의 특정 약학적 저해가 면역 세포 하위집단에 영향을 미치는지의 여부를 연구하기 위해, Neuro2A 종양 세포를 A/J 마우스에서 피하로 이식하였다. 상기 언급한 바와 같이, Neuro2A는 Wnt 활성화가 없는 뮤린 신경모세포종 세포주이다. 평균 종양 크기가 100㎣인 Neuro2A 종양 세포 이식 6일 후에, 종양이 있는 A/J 마우스를 2개 그룹(n=5)으로 분류하고, 도 3a에 나타낸 바와 같이 2일 동안 5㎎/㎏(qdx2, 5㎎/㎏)으로 PBS 또는 BCAT1 중 하나로 치료하였다.
최종 투약 후 24시간에, 종양을 수집하고 나서, Wnt/β-카테닌 반응성 마커(cMyc), 면역 세포 마커(CD8 및 CD3), 케모카인(CCL4) 및 면역관문(PD-1 및 PD-L1)의 mRNA 수준에 대해 qPCR에 의해 분석하였다. BCAT1로 치료한 마우스로부터의 종양에서, cMyc의 mRNA 수준의 변화가 없었다. 도 3b. cMyc는 활성 Wnt/β-카테닌 경로를 갖는 종양에서 상향조절되는 것으로 알려져 있고(Scholer-Dahirel et al., 2011, PNAS, 108(41): 17135-40) 따라서, Wnt/β-카테닌 마커로서 작용하는 β-카테닌 표적 유전자이다. β-카테닌 유전자(Ctnnb1)의 발현 수준은 BCAT로 치료한 마우스로부터의 종양에서의 대조군 수준에 비해 약 50 내지 60% 감소되었지만(도 3b), cMyc 발현 수준의 변화는 없었다. Neuro2A 세포가 활성 Wnt/β-카테닌 경로를 가진다면, β-카테닌 발현이 하향조절될 때 이들 종양에서 cMyc 발현이 하향조절되는 것을 예상할 것이다. 그것은 본 명세서에서 나타내지 않는다. 추가로, β-카테닌의 핵 국소화는 Neuro2A 세포에서 관찰되지 않았으며(도 2a 내지 도 2b), β-카테닌의 BCAT1-매개 감소는 종양 성장의 임의의 감소와 관련되지 않았다(도 4a). 변화되지 않은 수준의 cMyc 발현과 조합하여, 이들 결과는 Neuro2A 세포가 활성화된 Wnt 경로를 갖지 않는다는 것을 나타낸다. 따라서, 이들 종양에서 β-카테닌의 BCAT1-매개 감소는 종양 성장에서 임의의 감소와 관련되는 것으로 예상되지 않는다.
BCAT1-치료 종양은 분석한 면역 세포 마커, 종양 세포 마커 및 관문 분자의 수준이 상당히 증가되었다. 더 구체적으로, BCAT1 치료 후에 CD8, CCL4, PD-1 및 PD-L1 수준의 상당한 증가가 있었다. 도 3b. Neuro2A 종양 모델로부터의 이들 데이터는 β-카테닌의 저해가 중요한 T 세포 마커(CD8), 케모카인(CCL4) 및 관문 분자(PD-1 및 PD-L1)의 발현을 증가시키고, β-카테닌 발현의 저해가, 활성화된 Wnt/β-카테닌 경로가 없는 종양에서조차, 비-T 세포 염증 표현형을 T 세포 염증 표현형으로 전환시킬 수 있다는 것을 예상치 못하게 시사한다는 것을 확인한다.
B16F10
상기 주목한 바와 같이, B16F10은 비-Wnt 활성화된 종양이다. B16F10 종양은 또한 면역관문 요법에 대해 난치성인 것으로 알려져 있다. 따라서, Ctnnb1 mRNA의 특정 약학적 저해가 뮤린 흑색종의 모델에서 면역 세포 하위집단 및 적절한 신호전달 중간체에 어떻게 영향을 미치는지를 추가로 연구하기 위해 B16F10 종양을 사용하였다. B16F10 종양을 면역적격 C57BL/6 마우스에 피하로 동종이식하였다. 종양이 250㎣의 용적에 도달된 후에, 별개의 비히클 대조군과 함께 BCAT1 또는 위약(화학물질 및 제형과 매칭된 스크램블된 DsiRNA)을 도 12a에 나타낸 투약 요법에 따라 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 투여하였다(n=5 내지 6마리/코호트).
치료 후 약력학적 종점 분석을 위해 종양을 절개하였다. 종양으로부터 단리된 총 RNA를 이용하는 정량적 PCR(qPCR) 측정은 BCAT1이 Ctnnb1 mRNA에서 부분적 감소 및 Ccl4 mRNA에서 동시 증가를 야기하였다는 것을 나타낸다(도 12b). β-카테닌은 부분적으로 Ccl4의 전사 억제에 의해 면역 회피를 야기하는 것으로 이전에 나타났기 때문에, Ccl4 억제의 경감은 CD103을 암호화하는 수지상 세포 mRNA 마커 Itage, 및 세포독성 T-세포 mRNA 마커 Cd8a의 강한 증가와 관련된다(도 12b). 이어서, 추출된 B16F10 종양으로부터 준비한 단일-세포 현탁액에 대한 표면 마커를 측정하기 위해 유세포 분석을 수행하였다(도 12c). 위약은 종양 면역 구획에 대해 유의한 효과가 없었지만, BCAT1 치료는 총 T-세포(CD3), 세포독성 T-세포(CD8), 항원-제시 수지상 세포(CD103) 및 PD-1 T-세포 관문에서 고도로 유의한 증가를 야기하였다(도 12c).
추가적인 유세포 분석은 CD8+ T-세포 내에서 관문인 것으로 알려진 3가지 상이한 T-세포 수용체(TCR) 보조인자의 치료-관련 증가를 나타내었다: PD-1, TIM-3 및 LAG-3(도 13a). 종양 T-세포 함량의 강한 증가와 대조적으로, 면역요법에 대한 반응을 조절하는 것으로 알려진 다른 중요한 하위집단인 종양-연관 자연 살해(NK) 세포에 대해 치료-관련 효과는 관찰되지 않았다(도 13b). 유사하게, 치료 후에 면역억제적 골수성 유래 억제 세포(MDSC) 및 조절 T-세포(Treg)의 변화는 최소이고 가변적이었다(도 13b). 이들 데이터는 세포독성 T-세포의 보충이 β-카테닌 저해에 의해 매개되는 면역조절의 우세한 메커니즘이라는 것을 시사한다.
최종적으로, β-카테닌 및 CD8 단백질에 대한 면역조직화학(IHC)을 포말린-고정, 파라핀-포매(FFPE) B16F10 종양 조직 상에서 수행하였고, BCAT1 치료 효과의 추가적인 확인을 제공하였다(도 12d). BCAT1 요법(상대적 강도의 대략 60% 감소) 후에 β-카테닌 단백질의 상실은 종양 절편 전체적으로 동종이고, B16F10 종양의 세포막과 사이토졸 둘 다에서 관찰된다. 천연 상태에서, B16F10 종양은 CD8에 대해 음성인데, 이는 그들의 면역적으로 "차가운" 상태와 일치된다. BCAT1 치료의 2회 라운드 후에, 종양 전체적으로 CD8 염색이 관찰되었다(도 12d). 종합적으로, qPCR, 유세포분석 및 IHC 데이터는 비-Wnt 활성화된 B16F10 종양에서 Ctnnb1 발현의 저해가 종양 -관련 APC 및 T 림프구 집단을 증가시켰다는 것을 입증하는데, 이들 둘 다 면역요법에 대한 반응에 대해 긍정적인 예측값을 갖는 것으로 알려져 있다. BCAT1-치료 종양은 분석한 면역 세포 마커, 종양 세포 마커 및 관문 분자의 수준이 상당히 증가되었다. 더 구체적으로, BCAT1 치료 후에 CD8, CCL4, CD103 및 PD-1 수준의 상당한 증가가 있었다.
실시예 4: β-카테닌의 저해는 비 Wnt 활성화된 종양에서 NF-κB-반응성 유전자인 Cxcl10 및 Cxcl11의 발현을 향상시킨다
정상상태 핵 β-카테닌이 종양 내 기능을 조절하는 그의 면역에 필요하지 않다는 관찰을 고려하여, 간접적, 비정규 메커니즘에 대한 가능한 역할을 연구하였다. β-카테닌은 NF-κB 전사 복합체와 간접적으로 상호작용하고 격리를 통해 그의 전사 활성을 저해하는 것으로 알려져 있으며, 이 사건에서 간, 유방 및 결장직장 종양의 서브세트에서 면역억제에 기여할 수 있다(Deng et al; 2002, Cancer cell, 2(4):323-34; Du et al; 2009, Cancer Res, 69(9): 3764-71; Moreau et al; 2011, Int J Cancer, 128(6):1280-92.). 케모카인 CXCL10 및 CXCL11은 NF-κB 신호전달에 대해 고도로 반응성인 것으로 알려져 있다(Huang et al; 2015, FASEB J, 29(1): 227-38).
Neuro2A 및 B16F10 종양을 보유하는 마우스를 각각 도 3a 및 도 12a에 제시한 스케줄에 따라 BCAT1로 치료하였다. 전신 BCAT1 요법은 B16F10과 Neuro2A 공통유전자 종양 둘 다에서 Cxcl10, Cxcl11 및 CD3을 암호화하는 대응하는 mRNA의 상향조절을 야기하였다(도 14a 내지 도 14b). 임의의 이론에 의해 구속되는 것을 의도하는 일 없이, 비 Wnt-활성화 상황에서 β-카테닌의 약학적 저해는 부분적으로 NF-κB 활성/신호전달을 회복시킴으로써 염증 유전자의 β-카테닌 억제를 반전시키는 것이 가능하다. 흥미롭게도, NF-κB는 또한 ATF3 전사 리프레서와 혼선되는 것으로 알려져 있는데, 이는 비-Wnt 활성화된 종양 내용에서조차 CCL4에 대한 β-카테닌의 효과를 가능하게 설명한다.
실시예 5: β-카테닌 저해와 면역요법을 병용하는 것은 Wnt 활성화가 있는 그리고 이것이 없는 종양의 성장을 저해한다
BCAT1 및 면역관문 저해제(항-PD-1 및 항-CTLA4 항체)에 의한 병용 요법은 Wnt 활성화가 있는(4T1) 그리고 활성화가 없는(B16F10, Neuro2A 및 Renca) 종양에서 평가하였다. 항-PD-1 항체 및 항-CTLA4 항체(99% 순도)를 각각 6.66 및 5.4㎎/㎖ 농도로 PBS 중에서 제공하였다. 이 용액을 PBS 중에서 추가로 희석시키고, 상기 기재한 바와 같이 복강내로 투여하였다. BCAT1 또는 위약(CTNNB1 dsRNAi 저해제 분자가 스크램블된 LNP)을 상기 기재한 바와 같이 정맥내로 제공하였다.
B16F10 세포를 C57BL/6 마우스에 이식하고 나서, 이식 5일 후에(평균 종양 크기가 100㎣임) 마우스를 4개 그룹으로 분류하였다(n=5). 투약 스케줄을 도 4b에 요약한다. 그룹 1 및 3은 2회 용량의 위약을 받은 반면, 그룹 2 및 4는 이식 후 5 및 6일에 3㎎/㎏(qdx2)으로 BCAT1의 2회 용량을 받았다. 위약 또는 BCAT1의 마지막 투약 후 24시간에, 그룹 3 및 4는 7일 및 9일에 5㎎/㎏으로 복강내로 항-PD-1/CTLA-4 항체의 조합물을 받았다. 이어서, 이 조합물 투약 주기를 제11일에 시작하고 제15일까지 지속하여 반복하였다. 치료 기간의 과정에 걸쳐 종양 크기를 측정함으로써 종양 성장을 모니터링하였다.
위약 또는 BCAT1 단독(단일요법)을 받은 마우스의 그룹은 종양 성장의 임의의 감소를 입증하지 않았다. B16F10 종양에서 β-카테닌의 저해는 종양 성장을 감소시키는 것으로 예상되지 않았는데, 이들 종양 세포는 활성화된 Wnt 경로를 갖지 않기 때문이다. 위약 전처리의 조합물 다음에 항-PD1 및 항-CTLA4 항체의 조합물을 받은 마우스는 부분적 반응을 나타내었다. 도 4b. 항-PD-1/CTLA-4 항체에 의한 치료 전에 BCAT1의 투여는 상승 효과를 초래하였는데, 이는 거의 완전한 종양 성장 저해를 입증한다. 도 4b. 이들 결과는 놀랍게도 비-Wnt 활성화된 종양에서 β-카테닌 저해가 면역요법에 대한 이들 종양의 민감도를 강하게 증가시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
Neuro2A 종양(N2A, 뮤린 신경모세포종)에서 병용 치료를 또한 평가하였다. A/J 마우스에 Neuro2A 종양 세포를 이식하고 나서, 이식 6일 후에(평균 종양 크기가 100㎣임) 마우스를 4개 그룹으로 분류하였다(n=5). 투약 스케줄을 도 4a에 요약한다. 그룹 1 및 2는 2회 용량의 위약을 받았고, 그룹 3 및 4는 이식 후 6 및 7일에 3㎎/㎏(qdx2)으로 BCAT1의 2회 용량을 받았다. 마지막 투약 후 24시간에, 그룹 3 및 4는 8일 및 9일에 5㎎/㎏으로 복강내로 항-PD-1/CTLA-4 항체의 조합물을 받았다. 이어서, 이 조합물 투약 주기를 제11일에 시작하고 제14일까지 지속하여 반복하였다. 치료 기간의 과정에 걸쳐 종양 크기를 측정함으로써 종양 성장을 모니터링하였다.
BCAT1 단독(단일요법) 또는 항-PD-1/CTLA-4 항체 단독을 받은 마우스는 종양 성장의 임의의 상당한 감소를 입증하지 않았는데, 이는 Neuro2A 종양 세포가 면역요법에 내성이 있고, 비-활성화된 Wnt 경로와 일치되었다는 것을 확인한다. 도 4a. 반면에, 항-PD-1/CTLA-4 항체를 받기 전에 BCAT1로 치료한 마우스는 상당한 종양 성장 저해를 입증하였다. 도 4a. 병용 요법은 상승적 결과를 생성하였는데, 종양 감소는 제제 단독의 합보다 훨씬 더 컸다. 이들 결과는 놀랍게도 두 번째, 비-Wnt 활성 종양의 β-카테닌 저해가 면역요법에 대해 이들 종양의 민감도를 강하게 증가시켰다는 것을 나타낸다.
또한 다른 비-Wnt 활성 종양인 Renca(뮤린 신장 선암종)에서 병용 치료를 평가하였다. Balb/C 마우스에 Renca 세포를 이식하였고, 이식 6일 후에(평균 종양 크기가 100㎣임), 마우스를 도 4d에 나타낸 바와 같이 위약과 항-PD-1/CTLA-4 항체의 조합물 또는 BCAT1과 항-PD-1/CTLA-4 항체의 조합물로 치료하였다. 제6일 및 제7일에 마우스에 3㎎/㎏(qdx2)으로 위약 또는 BCAT1의 2회 용량을 투여하였다. 마지막 투약 후 24시간에, 마우스에 제8일 및 제10일에 5㎎/㎏으로 복강내로 항-PD-1/CTLA-4 항체를 투여하였다. 이어서, 이 조합물 투약 주기를 제12일에 시작하고 제16일까지 지속하여 반복하였다. 치료 기간의 과정에 걸쳐 종양 크기를 측정함으로써 종양 성장을 모니터링하였다.
이 모델에서, BCAT1 및 항-PD-1/CTLA-4 항체에 의한 병용 요법을 받는 마우스는 항-PD-1/CTLA-4 항체만을 받은 마우스에 비해 상당한 종양 성장 감소를 나타내었고, 비-Wnt 활성화된 종양에서 β-카테닌의 저해가 놀랍게도 면역요법에 대한 해당 종양의 민감성을 향상시킨다는 것을 다시 한번 입증한다. 도 4d.
최종적으로, 병용 요법은 4T1 종양 세포(뮤린 유방)인 Wnt 활성화된 세포주에서 평가하였다. Balb/C 마우스에 4T1 종양 세포를 이식하였고, 이식 4일 후에, 마우스를 4마리 그룹으로 무작위화하고 나서, 도 4c에 나타낸 바와 같이 위약/BCAT1 또는 항-PD-1/CTLA-4 항체로 치료하였다. 제4일 및 제5일에 마우스에 3㎎/㎏(qdx2)으로 위약 또는 BCAT1의 2회 용량을 투여하였다. 마지막 투약 후 24시간에, 마우스에 제6일 및 제8일에 5㎎/㎏으로 복강내로 항-PD-1/CTLA-4 항체를 투여하였다. 이어서, 이 조합물 투약 주기를 제10일에 시작하고 제14일까지 지속하여 반복하였다. 치료 기간의 과정에 걸쳐 종양 크기를 측정함으로써 종양 성장을 모니터링하였다.
4T1 종양은 Wnt 활성이기 때문에, BCAT1 단독으로 마우스를 치료하는 것은 종양 성장 저해를 야기하였다. 도 4c. 그러나, BCAT1을 항-PD-1/CTLA-4 항체를 조합하는 것은 제제 단독 중 하나에 비해 상당한 종양 성장을 야기하였다. 도 4c. 이들 결과는 Wnt 활성화된 종양에서 β-카테닌 저해를 저해하는 것이 면역요법에 대한 해당 종양의 민감도를 향상시킨다는 것을 입증한다. 흥미롭게도, Wnt-활성화된 4T1 종양으로부터의 유세포분석 데이터는 비-Wnt 활성화된 종양인 B16F10에 의해 관찰되는 바와 같이 BCAT1 치료가 CD8+ T-세포 내의 관문인 것으로 알려진 TCR 보조인자(PD-1, TIM-3 및 LAG-3)를 증가시킨다는 것을 나타낸다(도 15a). 유사하게, DCR-BCAT 치료 시 TREG의 증가가 있었지만, 종양-연관 NK 세포 또는 면역억제 MDSC에 대해 치료-관련 효과는 관찰되지 않았다(도 15b).
실시예 6: β- 카테닌 저해 및 면역요법의 병용 후 세포독성 T 세포 마커의 발현
B16F10 종양 모델에서 병용에서 병용 요법의 완료 후, 종양을 수집하였고, 표적 세포(예를 들어, 종양 세포)의 표면 상의 항원 인식 시 CD8+ 세포독성 T 세포에 의해 방출되는 그랜자임 B 및 퍼포린의 발현 수준을 측정하기 위해 면역조직화학에 의해 분석하였다. 방출 후, 그랜자임 B 및 퍼포린은 종양 세포에 의해 흡수된다. 퍼포린 분자는 엔도솜 기공 형성을 촉진시켜, 그랜자임 B가 사이토졸에 유입되도록 허용한다. 일단 종양 세포의 사이토졸에서, 그랜자임 B는 부위-특이적 프로테아제 활성을 통해 전-세포자멸사 Bcl-2 패밀리 구성원 및 카스파제를 활성화시키고, 세포자멸사를 매개한다. 퍼포린-매개 기공은 전자 현미경에 의해 시각화될 수 있다. 소정의 예에서, 기공은 현미경 없이 시각화되기에 충분히 크다.
BCAT1 및 항-PD-1/CTLA4 항체의 조합물로 치료한 마우스로부터의 BF16F10 종양은 BCAT1 단독 또는 위약 및 항-PD-1/CTLA4 항체 중 하나로 치료한 마우스로부터의 종양에 비해 고수준의 그랜자임 B와 퍼포린을 둘 다 발현시켰다. 도 5. 위약 단독으로 치료한 마우스로부터의 종양은 극도로 저수준의 그랜자임 또는 퍼포린 발현을 갖는데, 이는 병용 요법을 받는 마우스에서 관찰한 종양 성장의 상당한 감소가 종양 미세환경의 대량 T 세포 침윤과 관련된다는 것을 시사한다. 종양을 또한 세포독성 T 세포로부터의 퍼포린 방출로부터 초래된 기공 형성에 대해 분석하였다. 기공 형성은 1) 위약 및 항-PD-1/CTLA4 항체 또는 2) BCAT1 및 항-PD-1/CTLA4 항체 중 하나로 치료한 종양에서 관찰되었지만, BCAT1 및 항-PD-1/CTLA4 항체로 치료한 마우스에서 더 확연하였다(데이터 미제시).
실시예 7: β- 카테닌 저해와 면역요법의 병용은 작은 그리고 거대한 MMTV -Wnt1 종양에서 종양 성장을 감소시킨다
β-카테닌 저해가 T 세포 침윤을 향상시키고 자발적 종양에서 면역요법의 효과를 강력하게 하는지를 알기 위해, MMTV-Wnt1 모델을 이용하였다. 이 모델에서, MMTV-LTR에 의한 Wnt1의 유선 특이적 과발현은 활성화된 Wnt/β-카테닌 신호전달에 의한 자발적 유방 종양을 야기한다.
초기에, 제90일에(출생시로부터 3개월), 마우스를 BCAT1로 5㎎/㎏(qdx3)으로 치료하였다. 최종 주사 후 24시간에, 종양 β-카테닌 및 cMyc mRNA 수준을 qPCR에 의해 결정하였다. 비-Wnt 활성화된 종양과 달리, β-카테닌 mRNA 수준의 감소는 예상한 바와 같이 이들 Wnt 활성화된 종양의 cMyc mRNA 수준 감소를 야기하였다. 도 6. β-카테닌 단백질 수준을 면역조직화학에 의해 측정하였고, 또한 예상한 바와 같이 BCAT1로 치료한 종양에서 감소되었다. 도 6c. PBS로 치료한 대조군 종양은 Wnt 활성화된 종양의 특징인 β-카테닌의 핵 국소화를 나타내는데, 이는 단일 주기의 BCAT1 치료에 의해 반전되어, β-카테닌 단백질의 거의 완전한 고갈을 야기하였다. 도 6c.
추가로, β-카테닌 저해가 CD8 T 세포 침윤에 영향을 미치는지의 여부를 알아보기 위해, CD8 발현은 동일한 종양에서 면역조직화학에 의해 측정하였다. 도 6d. CD8+ T 세포 침윤물은 각각의 종양 절편의 다중 영역에서 뚜렷하였지만, 모든 동물의 종양에서 동일한 패턴을 확인하였다. 도 6c 및 도 6d에 나타낸 바와 같이, β-카테닌 단백질의 거의 완전한 고갈은 더 고수준의 CD8 T 세포와 상관관계가 있는데, 이는 β-카테닌 저해가 이들 자발적으로 성장된 종양에서 T 세포 침윤을 증가시킨다는 것을 시사한다.
마우스의 하나의 그룹(n=4)을 BCAT1로 그리고 다른 그룹(n=3)을 위약(qdx3, 3㎎/㎏)으로 치료함으로써 이들 자발적 종양에서 BCAT1 단일요법의 효능을 평가하였다. 단일 주기의 BCAT1 치료는 위약으로 치료한 마우스에 비해 완전한 종양 성장을 야기하였다. 도 6e. 제9일까지, 위약으로 치료한 종양은 상당히 크게 성장하였다. 이어서, 이들 거대 종양을 제9일에 시작해서 단일 주기의 BCAT1(qdx3, 3㎎/㎏)로 치료하였다. 도 6f에 나타낸 바와 같이, 심지어 이들 거대 종양은 BCAT1에 반응하였으며, 이들 거대 종양에서 β-카테닌 저해는 종양 성장을 저해한다는 것을 시사한다.
β-카테닌 저해를 면역요법과 병용하는 것이 이들 자발적 종양에서 항-종양에서 항-종양 효능을 추가로 개선시키는지를 알아보기 위해, 평균 종양 크기가 약 500 내지 600㎣인 마우스를 이용하여 다른 연구를 수행하였다. 이들 자발적 종양이 상이한 시기에 성장하기 때문에, 상이한 시간에 연구를 위해 평균 종양 크기가 약 500 내지 600㎣인 마우스를 선발하였다. 제1일 및 제2일에 마우스의 2개 그룹은 위약(n=2 및 n=3)을 받았고, 마우스의 다른 2개 그룹(n=3 및 n=5)은 3㎎/㎏(qdx2)에 BCAT1을 받았다. BCAT1 또는 위약으로 치료 후에, 각각의 치료로부터의 그룹 중 하나(n=2 및 n=5)는 제3일 및 제4일에 각각의 항체에 대해 5㎎/㎏으로(qdx2) 항-PD-1/CTLA-4 항체를 받았다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 48시간 후에, 모두 4개의 그룹에 동일한 치료 스케줄을 실시하고 나서, 종양 성장을 제13일까지 모니터링하였다.
위약을 받은 마우스는 상당한 종양 성장을 가졌지만, 위약 및 항-PD-1/CTLA-4 항체를 받은 마우스는 위약 단독에 비해 종양 성장의 약간의 감소를 나타내었다. 도 8. 도 8에 나타낸 바와 같이, BCAT1 단독을 받은 마우스는 종양 성장을 감소시킴에 있어서 보통의 효능을 입증하였지만, BCAT1과 항-PD-1/CTLA-4 항체 둘 다로 치료한 마우스는 종양 성장의 강한 저해를 입증하였다. 현저하게, BCAT1과 면역요법의 병용으로 치료한 5마리의 마우스 중 3마리에서, 종양은 완전히 퇴행되었다. 당해 그룹에서 남아있는 동물은 임의의 다른 그룹에 비해 상당하게 반응하였지만, 수행하지 않았을 뿐만 아니라, 병용 요법을 받은 다른 3마리 마우스는 자발적 종양 성장 상황에서 예상되고 또한 임상 상황에서 존재할 수 있는 이질성을 반영할 가능성이 있다.
당해 거대 종양이 병용 요법에 반응하는 방법을 알아보기 위해 제1 치료 주기 후 거대 종양을 갖는 4마리 마우스(도 9a)에 더 고용량에서 BCAT1 및 면역요법에 의한 두 번째 치료 주기를 실시하였다. 이들 마우스는 제13일에 시작해서 10㎎/㎏으로 BCAT1으로 치료한 후에, 제14일 및 제15일에 각각의 항체에 대한 항-PD-1/CTLA-4 항체로 10㎎/㎏으로(qdx2) 치료하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 치료 스케줄을 제17일 및 제21일에 시작해서 2회 더 반복하였고, 24일까지 종양 성장을 모니터링하였다. 병용 치료 후에 모두 4마리의 마우스에서 종양이 반응하고 퇴행하였는데(도 9b), 이는 추정적으로 종양 부위에서 T-세포의 침윤을 향상시킴으로써, BCAT1에 의해 매개된 β-카테닌의 저해는 관문 저해제에 대해 이들 더 거대한 종양을 민감하게 든다는 것을 나타낸다.
제1 치료 주기 후 완전한 퇴행을 갖는 3마리의 마우스(도 9a 참조)에 제16일에 시작해서 유지 용량을 실시하였다. 마우스를 제16일 및 제17일에 BCAT1로 3㎎/㎎(qdx2)으로 치료한 후에, 제18일 및 제19일에 각각의 항체에 대한 항-PD-1/CTLA-4 항체로 5㎎/㎏으로(qdx2) 치료하였다. 도 7. 도 9a 및 도 9c에 나타낸 바와 같이, 마우스에 제26일에 시작해서 동일한 치료 스케줄을 실시하였고, 제31일까지 종양 성장을 모니터링하였다. 도 9a에 나타낸 바와 같이 유지 용량을 받은 마우스는 연구 과정 내내 무 종양으로 남아있었다. 이들 마우스에서 종양 퇴행의 역학을 또한 도 9c에 나타내며, 이는 도 9a의 BCAT1 + 항-PD-1/CTLA-4 데이터의 형태를 확대한 것이다.
실시예 8: 간접적 Wnt 경로 표적화는 차가운 비-Wnt 활성화된 종양을 뜨거운 종양으로 전환시키는 데 충분하지 않다
BCAT1은 전사후 mRNA 침묵을 통해 간접적으로 β-카테닌을 표적화하지만, 몇몇 임상 단계 Wnt 경로 조절자는 간접적 β-카테닌 저해를 통해 항종양 효능을 촉진시키는 그들의 능력에 대해 평가한다((Zhan et al; 2017, Oncogene, 36(11):1461-73; Schatoff et al; 2017, Curr Colorectal Cancer Rep, 13(2):101-10; Novellasdemunt et al; 2015, Am J Physiol Cell Physiol, 309(8): C511-21 및 Zhang et al; 2015, Am J Cancer Res, 5(8): 2344-60). 한 가지 이러한 임상시험 중인 약물(거의 틀림없이 가장 임상적으로 진행됨), 즉, LGK-974는 Wnt 리간드의 분비에 필요한 효소인 PORCN 아세틸트랜스퍼라제의 저해제이다(Liu et al; 2013, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 110(50): 20224-9). 면역관문 저해의 증강제로서 평가를 위해 항-PD-(L)1과 병용하여 포함하는 LGK-974는 다중 임상 시험 중이다.
T-세포 침윤을 촉진시킴으로써 LGK-974 및 BCAT1이 차가운 종양을 뜨거운 종양으로 전환시키는 능력을 비교하였다. 이 비교를 수행하기 위해, 2가지의 적절한 종양 유형을 보유하는 마우스를 사용하였다: Wnt 리간드의 과발현에 의해 유도되고 따라서 LGK-974(MMTV-Wnt1 모델)에 반응성인 것으로 예측되는 Wnt-활성 종양, 및 비-Wnt 활성화된 종양(B16F10). 이 분석은 종양 T-세포 함량을 모니터링하기 위한 인간에서의 Wnt 서명과 핵 β-카테닌 및 Cd8a mRNA와 그의 우수한 상관관계에 기인하여 Wnt 활성에 대한 대용물로서 Axin2 mRNA를 이용하였다.
MMTV-Wnt1 종양에서, Wnt 효과기 Axin2는 효능이 있는 것으로 이전에 보고된 용량 수준에서 BCAT1과 LGK-974 둘 다에 의해 억제된다(도 16a). 그러나, LGK-974에 대한 약력학적 반응은 추정적으로 그의 약물동태학적 특성에 기인하여 앞서 나타낸 바와 같이 매우 일시적이며(Liu et al; 2013, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 110(50): 20224-9); Axin2 mRNA는 치료 후 24시간까지 기준으로 복귀된다(도 16a 내지 도 16b). LGK-974 투약 빈도를 증가시키는 것은 가변적 결과를 유도하지만, Axin2 저해의 지속기간에 일부 개선을 제공하는 것으로 나타난다(도 16c). 예측 가능하게, LGK-974는 Ctnnb1 mRNA 또는 β-카테닌 단백질을 간접적으로 표적화하지 않기 때문에 BCAT1 단독은 Ctnnb1 mRNA 수준에 간접적으로 영향을 미친다(도 16a 내지 도 16c). 중요하게는, 각각 BCAT1 및 LGK-974에 의한 직접적 저해와 간접적 저해 후에 Cd8a mRNA 상승이 관찰된다. T-세포 상승은 가변적인 것으로 나타나지만, LGK-974 치료 24시간 후에 지속되었는데, 이는 심지어 Wnt 활성의 일시적 둔화가 이 메커니즘에 충분하다는 것을 시사한다(도 16a 내지 도 16c). 그러나, 단일 투여에 비해 LGK-974의 반복 투여 후에 동물들 간의 T-세포 반응은 훨씬 더 강하고 지속적이다(도 16b 내지 도 16c). 이들 데이터는 이러한 유전적 병변이 인간에서 상대적으로 비통상적이긴 하지만, 직접적 또는 간접적 약학적 개입에 의한 β-카테닌의 억제가 Wnt 리간드 결합에 의해 유도되는 종양에서 그의 면역 회피 기능을 극복하는 데 충분하다는 것을 시사한다(Zhan et al; 2017, Oncogene, 36(11):1461-73).
LGK-974의 한 가지 제한은, Wnt 리간드 분비의 저해제로서, 그것이 일반적으로 대다수의 Wnt-활성화 종양에 대해 비효과적인 것으로 예상된다는 것이다. 이는 이 범주에서 대부분의 종양이 하류의 유전적 병변, 예컨대 APC에 의해 유도되는데, 이는 결장직장 종양에서 발견되는 훨씬 통상적인 돌연변이이기 때문이다. 사실, BCAT1은 APC 기능 상실 돌연변이를 보유하는 인간 종양 이종이식에서 CTNNB1(67%)과 AXIN2(58%) 둘 다의 발현을 감소시키지만, LGK-974는 3㎎/㎏의 9일 용량의 고도로 과장된 용량 수준에서조차 이러한 종양에서 AXIN2의 약간의 일시적 감소(19%)만을 야기하였다(도 17). 이들 데이터는 β-카테닌 발현을 간접적으로 저해하는 광범위 가능성을 추가로 강조한다.
비 Wnt-활성화된 B16F10 종양에서, 예측한 바와 같이 정상 상태 핵 β-카테닌의 결여를 고려하여 BCAT1 치료는 Ctnnb1 mRNA의 유사한 감소 그러나 Axin2 mRNA에 대해 효과 없음을 입증하였다(도 18a). 간접적인 전사 효과 결여에도 불구하고, BCAT1에 의한 β-카테닌의 직접적 저해는 B16F10 종양에서 Cd8a mRNA 발현을 향상시켰다. 대조적으로, LGK-974는 Cd8a mRNA의 증가를 촉진시킬 수 없었는데, 이는 β-카테닌 기능이 조절이상이 아닌 경우와 관련하여 Wnt 리간드 분비 수준의 경로 변화가 면역 조절을 촉진시키지 않는다는 것을 나타낸다(도 18b). 이들 강한 차이는 다양한 유전적 유래의 종양에 걸쳐 면역요법을 강력하게 하는데 본 명세서에 기재된 β-카테닌 핵산 저해제 분자와 같은 간접적 β-카테닌 저해제의 광범위 적용가능성은 LGK-974와 같은 간접적 Wnt 경로 조절제로 연장되지 않는다는 것을 시사한다.
SEQUENCE LISTING <110> DICERNA PHARMACEUTICALS, INC. <120> REDUCING BETA-CATENIN EXPRESSION TO POTENTIATE IMMUNOTHERAPY <130> 0243.0007-PCT <140> <141> <150> 62/477,783 <151> 2017-03-28 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 agaauacaaa ugauguagaa acagcc 26 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2 uagcuaucgt ggcuguuucu acaucauuug uauucugc 38 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

Claims (49)

  1. 대상체에서의 암 치료 방법으로서, 상기 대상체에게,
    치료적 유효량의 β-카테닌 핵산 저해제 분자; 및
    치료적 유효량의 면역치료제
    를 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법.
  2. 암을 치료하기 위한 용도를 위해 β-카테닌 핵산 저해제 분자를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 조성물은 면역치료제와 병용하여 투여되는, 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 암 치료 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 비-Wnt 활성화된 암인, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 Wnt 활성화된 암인, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 β-카테닌 핵산 저해제 분자는 이중가닥 RNAi 저해제 분자인, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 β-카테닌 핵산 저해제 분자는 센스 가닥과 안티센스 가닥 및 상기 센스 가닥과 상기 안티센스 가닥 사이의 약 15 내지 45개의 염기쌍의 상보성 영역을 포함하는 이중가닥 RNAi 저해제 분자인, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    a) 상기 센스 가닥은 15 내지 45, 18 내지 26 또는 19 내지 21개의 뉴클레오타이드이고, 상기 안티센스 가닥은 15 내지 45, 18 내지 26 또는 19 내지 21개의 뉴클레오타이드이거나;
    b) 상기 센스 가닥은 15 내지 66개의 뉴클레오타이드이고, 상기 안티센스 가닥은 15 내지 66개의 뉴클레오타이드이거나;
    c) 상기 센스 가닥은 25 내지 40개의 뉴클레오타이드 또는 19 내지 25개의 뉴클레오타이드이거나;
    d) 상기 안티센스 가닥은 25 내지 40개의 뉴클레오타이드 또는 19 내지 25개의 뉴클레오타이드이거나;
    e) 상기 센스 가닥은 19 내지 25개의 뉴클레오타이드이고, 상기 안티센스 가닥은 19 내지 25개의 뉴클레오타이드이거나; 또는
    f) 상기 센스 가닥은 34 내지 40개의 뉴클레오타이드이고 줄기 및 테트라루프를 함유하며, 상기 안티센스 가닥은 18 내지 24개의 뉴클레오타이드이되, 상기 센스 가닥과 상기 안티센스 가닥은 18 내지 24개의 염기쌍의 이중가닥 영역을 형성하는, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 β-카테닌 핵산 저해제 분자는 센스 가닥과 안티센스 가닥 및 상기 센스 가닥과 상기 안티센스 가닥 사이의 18 내지 34개의 염기쌍의 상보성 영역을 포함하는 이중가닥 RNAi 저해제 분자이되, 상기 센스 가닥은 길이가 25 내지 36개의 뉴클레오타이드이고, 그리고 상기 안티센스 가닥은 길이가 26 내지 38개의 뉴클레오타이드이고 3' 말단에 1 내지 5개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 포함하는, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 이중가닥 RNAi 저해제 분자의 상기 안티센스 가닥은 5' 말단에 1 내지 10개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 더 포함하는, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 β-카테닌 핵산 저해제 분자는 센스 가닥과 안티센스 가닥 및 상기 센스 가닥과 상기 안티센스 가닥 사이의 20 내지 30, 21 내지 26, 19 내지 24 또는 19 내지 21개의 염기쌍의 상보성 영역을 포함하는 이중가닥 RNAi 저해제 분자인, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 β-카테닌 핵산 저해제 분자는 센스 가닥과 안티센스 가닥 및 상기 센스 가닥과 상기 안티센스 가닥 사이의 19개의 염기쌍의 상보성 영역을 포함하는 이중가닥 RNAi 저해제 분자이되, 상기 센스 가닥은 길이가 21개의 뉴클레오타이드이고 3' 말단에 2개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 포함하며, 그리고 상기 안티센스 가닥은 길이가 21개의 뉴클레오타이드이고 3' 말단에 2개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 포함하는, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 β-카테닌 핵산 저해제 분자는 센스 가닥과 안티센스 가닥 및 상기 센스 가닥과 상기 안티센스 가닥 사이의 21개의 염기쌍의 상보성 영역을 포함하는 이중가닥 RNAi 저해제 분자이되, 상기 센스 가닥은 길이가 21개의 뉴클레오타이드이고, 상기 안티센스 가닥은 길이가 23개의 뉴클레오타이드이고 3' 말단에 2개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 포함하며, 그리고 상기 센스가닥의 3' 단부와 상기 안티센스 가닥의 5' 단부는 평활말단을 형성하는, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 β-카테닌 핵산 저해제 분자는 센스 가닥과 안티센스 가닥 및 상기 센스 가닥과 상기 안티센스 가닥 사이의 26개의 염기쌍의 상보성 영역을 포함하는 이중가닥 RNAi 저해제 분자이되, 상기 센스 가닥은 길이가 26개의 뉴클레오타이드이며, 상기 안티센스 가닥은 길이가 38개의 뉴클레오타이드이고 3' 말단에 2개의 뉴클레오타이드의 단일 가닥 돌출부 및 5' 말단에 10개의 뉴클레오타이드의 단일 가닥 돌출부를 포함하는, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  15. 제7항에 있어서, 상기 센스 가닥은 서열번호 1을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  16. 제7항 또는 제15항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 2의 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 β-카테닌 핵산 저해제 분자는 테트라루프를 함유하는, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 β-카테닌 핵산 저해제 분자는 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함하는 dsRNAi 저해제 분자이되, 상기 센스 가닥은 줄기 및 상기 테트라루프를 함유하고 길이가 34 내지 40개의 뉴클레오타이드이며 그리고 상기 안티센스 가닥은 길이가 20 내지 24개의 뉴클레오타이드이고, 상기 센스 가닥과 상기 안티센스 가닥은 18 내지 24개의 염기쌍의 이중가닥 영역을 형성하는, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 센스 가닥은 길이가 36개의 뉴클레오타이드이되, 상기 5'-단부로부터의 상기 센스 가닥의 처음 20개의 뉴클레오타이드는 상기 안티센스 가닥에 대해 상보성이고 상기 센스가닥의 다음의 16개의 뉴클레오타이드는 줄기 및 테트라루프를 형성하고 그리고 상기 안티센스 가닥은 길이가 22개의 뉴클레오타이드이고 3' 단부에 2개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 갖고, 상기 안티센스 가닥과 상기 센스 가닥은 인접한 올리고뉴클레오타이드를 형성하지 않는 별개의 가닥인, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역치료제는 저해 면역관문 분자의 길항제 또는 공자극 관문 분자의 작용제인, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 면역치료제는 저해 관문의 길항제이고, 상기 저해 관문은 PD-1 또는 PD-L1인, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  22. 제20항에 있어서, 상기 저해 면역관문 분자의 상기 길항제 또는 상기 공자극 관문 분자의 상기 작용제는 단클론성 항체인, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 단클론성 항체는 항-CTLA-4 단클론성 항체, 항-PD-1 단클론성 항체, 항-PD-L1 단클론성 항체, 또는 항-CTLA-4 단클론성 항체와 항-PD-1 단클론성 항체의 조합물인, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  24. 인간 대상체에서의 암 치료 방법으로서, 상기 인간 대상체에게,
    치료적 유효량의 β-카테닌 핵산 저해제 분자로서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 및 상기 센스 가닥과 상기 안티센스 가닥 사이의 18 내지 34개의 염기쌍의 상보성 영역을 포함하는 이중 가닥 RNAi 저해제 분자이되, 상기 센스 가닥은 길이가 19 내지 36개의 뉴클레오타이드이고, 상기 안티센스 가닥은 길이가 18 내지 38개의 뉴클레오타이드이고 3' 말단에 1 내지 5개의 단일 가닥 뉴클레오타이드를 포함하는, 상기 치료적 유효량의 β-카테닌 핵산 저해제 분자; 및
    치료적 유효량의 면역치료제로서, 상기 면역치료제는 항-CTLA-4 단클론성 항체, 항-PD-1 단클론성 항체, 항-PD-L1 단클론성 항체, 또는 항-CTLA-4 단클론성 항체와 항-PD-1 단클론성 항체의 조합물을 포함하는, 상기 치료적 유효량의 면역 치료제
    를 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법.
  25. 약제학적 조성물로서, 암을 치료하는 데 사용하기 위한 β-카테닌 핵산 저해제 분자를 포함하되, 상기 조성물은 면역치료제와 병용하여 투여되고, 상기 β-카테닌 핵산 저해제 분자는 센스 가닥과 안티센스 가닥 및 상기 센스 가닥과 상기 안티센스 가닥 사이의 18 내지 34개 염기쌍의 상보성 영역을 포함하는 이중가닥 RNAi 저해제 분자이며, 상기 센스 가닥은 길이가 19 내지 36개의 뉴클레오타이드이고, 상기 안티센스 가닥은 길이가 18 내지 38개의 뉴클레오타이드이고 3' 말단에 1 내지 5개의 단일 가닥 뉴클레오타이드를 포함하며, 그리고 상기 면역치료제는 항-CTLA-4 단클론성 항체, 항-PD-1 단클론성 항체, 항-PD-L1 단클론성 항체, 또는 항-CTLA-4 단클론성 항체와 항-PD-1 단클론성 항체의 조합물인, 약제학적 조성물.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 암은 비-Wnt 활성화된 암인, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  27. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 암은 Wnt 활성화된 암인, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  28. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 센스 가닥과 상기 안티센스 가닥 사이의 상기 상보성 영역은 21 내지 26개의 염기쌍이되, 상기 센스 가닥은 길이가 21 내지 26개의 뉴클레오타이드이고, 상기 안티센스 가닥은 길이가 23 내지 38개의 뉴클레오타이드이고 3' 말단에 1 내지 2개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 포함하는, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 5' 말단에 1 내지 10개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 더 포함하는, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 β-카테닌 핵산 저해제 분자는 센스 가닥과 안티센스 가닥 및 상기 센스 가닥과 상기 안티센스 가닥 사이의 26개의 염기쌍의 상보성 영역을 포함하는 이중가닥 RNAi 저해제 분자이되, 상기 센스 가닥은 길이가 26개의 뉴클레오타이드이며, 상기 안티센스 가닥은 길이가 38개의 뉴클레오타이드이고 3' 말단에 2개의 뉴클레오타이드의 단일 가닥 돌출부 및 5' 말단에 10개의 뉴클레오타이드의 단일 가닥 돌출부를 포함하는, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  31. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥은 서열번호 1의 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 2의 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  32. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥은 34 내지 40개의 뉴클레오타이드이고 줄기 및 테트라루프를 함유하며, 그리고 상기 안티센스 가닥은 18 내지 24개의 뉴클레오타이드이되, 상기 센스 가닥과 상기 안티센스 가닥은 18 내지 24개의 염기쌍의 이중가닥 영역을 형성하는, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 센스 가닥은 길이가 36개의 뉴클레오타이드이되, 5'-단부로부터의 상기 센스 가닥의 처음 20개의 뉴클레오타이드는 상기 안티센스 가닥에 대해 상보성이고 상기 센스가닥의 다음의 16개의 뉴클레오타이드는 줄기 및 테트라루프를 형성하고 그리고 상기 안티센스 가닥은 길이가 22개의 뉴클레오타이드이고 3' 단부에 2개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 갖고, 상기 안티센스 가닥과 상기 센스 가닥은 인접한 올리고뉴클레오타이드를 형성하지 않는 별개의 가닥인, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  34. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥과 상기 안티센스 가닥 사이의 상기 상보성 영역은 19개의 염기쌍이되, 상기 센스 가닥은 길이가 21개의 뉴클레오타이드이고 3' 말단에 2개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 포함하고, 그리고 상기 안티센스 가닥은 길이가 21개의 뉴클레오타이드이고 3' 말단에 2개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 포함하는, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  35. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥과 상기 안티센스 가닥 사이의 상기 상보성 영역은 21개의 염기쌍이되, 상기 센스 가닥은 길이가 21개의 뉴클레오타이드이고, 상기 안티센스 가닥은 길이가 23개의 뉴클레오타이드이고 3' 말단에 2개의 뉴클레오타이드의 단일-가닥 돌출부를 포함하며, 그리고 상기 센스 가닥의 3' 단부와 상기 안티센스 가닥의 5' 단부는 평활말단을 형성하는, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 β-카테닌 핵산 저해제 분자는 지질 나노입자로 제형화되는, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 상기 지질 나노입자는 양이온성 지질 및 페길화된(pegylated) 지질을 포함하는, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 상기 투여하는 단계 전에 상기 비-Wnt 활성화된 암을 갖는 것으로 동정된, 암 치료 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여하는 단계 전에, 상기 대상체가 상기 비-Wnt 활성화된 암을 갖는지의 여부를 결정하기 위해 상기 대상체로부터의 종양 샘플을 분석하는 단계를 더 포함하는, 암 치료 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-Wnt 활성화된 암은 상기 면역치료제가 상기 β-카테닌 핵산 저해제 분자와 병용하여 투여되지 않을 때에 상기 면역치료제에 의한 치료에 내성이 있는, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-Wnt 활성화된 암은 흑색종, 신경모세포종 또는 신세포암인, 암 치료 방법 또는 약제학적 조성물.
  42. 암에 대한 면역치료제의 치료 효과를 강화시키는 방법으로서, 암을 갖는 대상체에게 상기 암에 대한 상기 면역치료제의 치료 효과를 강화시키기에 충분한 양으로 β-카테닌 핵산 저해제 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 암에 대한 면역치료제의 치료 효과를 강화시키는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 암은 Wnt 활성화된 암인, 암에 대한 면역치료제의 치료 효과를 강화시키는 방법.
  44. 제42항에 있어서, 상기 암은 비-Wnt 활성화된 암인, 암에 대한 면역치료제의 치료 효과를 강화시키는 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 β-카테닌 핵산 저해제 분자를 투여하기 전에, 상기 암은 면역요법에 내성이 있는 비-T 세포 염증 표현형과 관련되되, 상기 β-카테닌 핵산 저해제 분자를 투여하는 단계는 상기 비-T 세포 염증 표현형을 면역치료제에 반응성인 T-세포 염증 표현형으로 전환시키는, 암에 대한 면역치료제의 치료 효과를 강화시키는 방법.
  46. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역치료제는 저해 면역관문 분자의 길항제 또는 공자극 관문 분자의 작용제인, 암에 대한 면역치료제의 치료 효과를 강화시키는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 면역치료제는 저해 관문의 길항제이고, 상기 저해 관문은 PD-1 또는 PD-L1인, 방법 또는 조성물.
  48. 제46항에 있어서, 상기 저해 면역관문 분자의 상기 길항제 또는 상기 공자극 관문 분자의 상기 작용제는 단클론성 항체인, 암에 대한 면역치료제의 치료 효과를 강화시키는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 단클론성 항체는 항-CTLA-4 단클론성 항체, 항-PD-1 단클론성 항체, 항-PD-L1 단클론성 항체, 또는 항-CTLA-4 단클론성 항체와 항-PD-1 단클론성 항체의 조합물인, 암에 대한 면역치료제의 치료 효과를 강화시키는 방법.
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