KR20190118010A

KR20190118010A - 3,2''-다이하이드록시플라본을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 분화 및 증식 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR20190118010A
Application number: KR1020180041091A
Authority: KR
Inventors: 조쌍구; 김경석; 조성하
Original assignee: 장지연
Priority date: 2018-04-09
Filing date: 2018-04-09
Publication date: 2019-10-17
Also published as: KR102174560B1

Abstract

본 발명은 3,2'-다이하이드록시플라본(3,2'-dihydroxyflavone)을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 분화 촉진용 조성물에 관한 것으로서, 특히 인간 유래 유도 만능줄기세포에서 조혈줄기세포로의 분화를 촉진시키는 조성물에 관한 것이다.

Description

3,2'-다이하이드록시플라본에 의한 만능줄기세포의 증식 및 만능성, 조혈줄기세포 분화 효율 증가 효과{Effect of 3,2'-dihydroxyflavone on the proliferation and pluripotency of pluripotent stem cells and the efficiency of hematopoietic stem cell differentiation}

본 발명은 3,2'-다이하이드록시플라본(3,2'-dihydroxyflavone)을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 분화 촉진용 조성물 및 줄기세포의 증식 또는 만능성 촉진용 조성물에 관한 것이다.

만능줄기세포는 모든 세포로 분화할 수 있는 다능성 (pluripotency)을 유지하면서 무한히 증식하는 특성을 지니고 있다. 만능줄기세포는 자가증식을 하면서 인간의 몸을 구성하는 외배엽, 중배엽, 내배엽 등 다양한 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 이를 이용한 세포의 분화는 손상된 각종 장기의 기능을 근본적으로 재생 (regeneration) 가능하다. 줄기세포 연구는 1957년 골수 이식 성공으로 가능성이 제시 되었으며, 이후 1998년 미국 위스콘신대의 톰슨 (Thomson) 그룹이 인간 배아줄기세포를 확립하는데 성공하면서 만능줄기세포의 새로운 계기를 마련하였다. 그리고 2006년 일본 교토대의 야마나카 교수팀은 레트로바이러스 (retrovirus)를 이용하여 마우스의 체세포에 Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4 유전자를 도입하여 배아줄기세포와 유사한 리프로그래밍(reprogramming)된 세포를 생성하였으며, 이 세포를 유도만능줄기세포 (induced Pluripotent Stem cells) 라고 명명하였다. 이러한 유도만능줄기세포는 배아줄기세포 연구에 있어 가장 자주 거론된 문제점으로 따라다녔던 윤리논쟁을 피할 수 있었으며 줄기세포 연구에 큰 지각변동을 가져올 성과로 평가되었다. 이후 세계에서 줄기세포를 연구하는 많은 그룹들이 유도만능줄기세포에 관심을 갖고 연구를 시작한 이래로 지금까지 많은 기술들이 발전하였다. 하지만 확립된 만능줄기세포의 낮은 안정성 및 분화능 개선의 필요성은 여전히 연구 되어야할 대상이다. 이러한 문제점들을 해결하기 위해 small molecules을 첨가함으로써 만능줄기세포의 안정성 및 분화능을 증가시키는 기술의 개발이 필요하다.

식물유래 폴리페놀계 화합물인 플라보노이드는 여러 과일 및 채소에 널리 분포하고 있으며 인간의 식이에서 규칙적으로 소비된다. 그리고 diphenylpropane (C₆C₃C₆) 골격을 특징으로 하며 여러 종류의 산화적 스트레스토부터 보호하는 생리적인 이점이 플라보노이드에 있다고 알려져 있다. 본 발명에서는 폴리페놀 구조를 가진 여러 종류의 플라보노이드를 첨가하였을 때 인간 만능줄기세포의 유지 및 성장에 효율이 매우 우수할 뿐만 아니라 확립된 줄기세포의 조혈줄기세포로의 분화 성능이 우수함을 확인할 수 있었다. 사용된 플라보노이드는 식용으로 사용하는 식물로부터 유래된 물질로서 안정성이 검증된 물질이며, 본 발명은 인간 만능줄기세포가 일반적인 배양 조건 보다 더 나은 증식능 및 분화능을 가지도록 함으로써, 실제 인간 만능줄기세포의 응용성을 높이는데 중요한 역할을 할 수 있다.

한국공개특허 제10-2017-0044333호

본 발명의 목적은 3,2'-다이하이드록시플라본(3,2'-dihydroxyflavone)을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 분화 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 3,2'-다이하이드록시플라본(3,2'-dihydroxyflavone)을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 증식 또는 만능성 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 3,2'-다이하이드록시플라본(3,2'-dihydroxyflavone)을 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 분화를 촉진시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 3,2'-다이하이드록시플라본(3,2'-dihydroxyflavone)를 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 증식 또는 만능성 촉진 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 3,2'-다이하이드록시플라본(3,2'-dihydroxyflavone)을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 분화 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 줄기세포는 인간 유래 유도만능줄기세포인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분화는 조혈줄기세포로의 분화인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 3,2'-다이하이드록시플라본은 1 내지 20 μM의 농도인 것일 수 있고, 바람직하게는 5 내지 10 μM의 농도인 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 10μM의 농도인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 3,2'-다이하이드록시플라본(3,2'-dihydroxyflavone)을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 증식 또는 만능성 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 만능줄기세포는 인간 유래 유도만능줄기세포인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 3,2'-다이하이드록시플라본(3,2'-dihydroxyflavone)을 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 분화를 촉진시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 3,2'-다이하이드록시플라본(3,2'-dihydroxyflavone)를 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 증식 또는 만능성 촉진 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 3,2'-다이하이드록시플라본은 인간 유래 유도 만능줄기세포의 증식 및 만능성을 촉진시키는 효과가 있고, 인간 유래 유도 만능줄기세포에서 조혈줄기세포로의 분화를 촉진시키는 효과가 있어, 줄기세포에 의한 세포치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 플라보노이드(3-HF(3-hydroxyflavone), 3,2'-DHF(3,2'-dihydroxyflavone), 3,4'-DHF(3,4'-dihydroxyflavone))의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 플라보노이드를 처리한 만능줄기세포의 생존률을 나타낸 결과이다.
도 3은 플라보노이드를 처리한 만능줄기세포의 증식률을 비교한 결과이다.
도 4는 3,2'-DHF를 처리한 만능줄기세포의 콜로니 크기를 비교한 결과이다.
도 5는 3,2'-DHF를 처리한 만능줄기세포의 생존률을 비교한 결과이다.
도 6은 3,2'-DHF를 처리한 만능줄기세포의 증식률을 비교한 결과이다.
도 7은 만능줄기세포의 pluripotency marker를 확인한 결과이다.
도 8은 플라보노이드를 처리한 만능줄기세포의 항산화효과 mRNA 발현을 측정한 결과이다.
도 9는 3,2'-DHF를 처리한 만능줄기세포에서 FreSHtrace 를 이용하여 GSH의 레벨을 측정한 결과이다.
도 10은 3,2'-DHF를 처리한 만능줄기세포에서 분화 마커를 확인한 결과이다.
도 11은 조혈줄기세포로의 분화를 유도한 스케줄(위), 세포 형태(왼쪽아래 패널) 및 상대적인 세포수(오른쪽아래 패널)를 나타낸 결과이다.
도 12는 3,2'-DHF를 처리한 경우 조혈줄기세포의 분화 효율을 확인한 결과이다.
도 13은 3,2'-DHF를 처리한 만능줄기세포로부터 유도된 조혈줄기세포 positive 세포의 양을 비교한 결과이다.

본 발명에서의 용어, "줄기세포"는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성(totipotent)이 있는 자가-재생산능(self-renewal)을 갖는 세포를 의미하며, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포 및 성체줄기세포를 포함한다.

상기 용어, "배아 줄기세포"는 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것으로서, 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성(totipotent)이 있는 자가-재생산능(self-renewal)을 갖는 줄기세포를 의미한다.

상기 용어, "유도만능줄기세포(iPSC: induced pluripotent stem cells)"는 분화가 끝난 체세포 또는 제한된 분화능을 가지는 세포에 세포 분화 관련 유전자를 주입하여 리프로그래밍 과정을 통해 분화 이전의 세포 단계로 되돌린 만능성을 유도한 세포를 말한다. 유도만능줄기세포는 배아줄기세포와 거의 같은 특성을 가지고 있는데, 구체적으로 비슷한 세포모양을 보여주고, 유전자 및 단백질 발현 패턴이 유사하며, 생체 내외에서 다분화능을 가지는 특성을 가지고 있다. 인간 배아줄기세포와 같이 여성의 난자 등으로부터 획득하는 것이 아니라, 이미 분화가 끝난 체세포 등에서 유도된 것이기 때문에 인간 배아줄기세포와 같은 윤리적 문제점을 수반하지 않으며, 환자의 체세포에서 줄기세포로 전환할 수 있기 때문에 면역 거부 반응의 문제도 적다. 다만, 이러한 유용성에도 불구하고 역분화 효율이 낮아 충분한 수의 유도만능줄기세포를 얻을 수 없다는 단점이 있다.

상기 용어, "리프로그래밍(reprogramming)"이란 분화된 세포를 만능성(pluripotent)을 가지는 상태로 복원 또는 전환될 수 있는 프로세스를 의미한다. 본 발명에서 상기 리프로그래밍이란 0% 내지 100% 미만의 분화능을 가지는 분화된 세포들을 미분화 상태로 되돌리는 과정이라면 모두 이에 포함하며, 바람직하게는 0%의 분화능을 가지는 분화된 세포 또는 0% 초과 내지 100% 미만의 분화능을 가지는 일정부분 분화된 세포를 100% 분화능을 가지는 세포로 복원 또는 전환시키는 것을 모두 포함한다. 이러한 리프로그래밍은 리프로그래밍 유도인자(reprogramming factor)에 의하여 수행될 수 있다.

상기 용어, "리프로그래밍 유도인자"는 분화된 세포에 처리 또는 발현되는 경우 iPSC 특이적 유전자의 발현을 가져와 만능성을 가지는 유도만능줄기세포로 유도하는 물질을 의미한다. 상기 리프로그래밍 유도인자는 분화된 세포의 리프로그래밍을 유도하는 물질이면 본 발명에 제한없이 포함될 수 있으며, 그 예로 Oct3/4, sox-2, c-Myc 및 Klf-4 등을 들 수 있으나, 적용할 세포의 종류에 따라 선택할 수 있으며, 상기 예에 제한되는 것은 아니다.

상기 용어, "성체줄기세포"는 분화된 조직에서 발생하는 줄기세포로 자가 재생산이 가능하며 유래 조직의 모든 세포 타입으로 분화될 수 있는 미분화된 세포를 의미한다. 구체적으로 상기 성체줄기세포는 제대혈(탯줄혈액), 성인의 골수, 비장, 난소, 정소, 말초혈액, 양수, 뇌, 혈관, 골격근, 피부 또는 위장관의 상피, 각막, 치아의 치수, 망막, 간 또는 췌장으로부터 추출해 낼 수 있으며, 뼈와 간, 혈액 등 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포를 의미한다. 예를 들어, 척수는 조혈모세포(Hematopoietic stem cell, HSC) 및 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell)를 가지는 것으로 보고되고 있으며 뇌로부터 유래한 줄기세포인 신경줄기세포(Neural stem cell)는 뇌실하 영역(subventricular zone), 뇌실 영역(ventricular zone) 및 CNS(central nervous system)의 해마(hippocampus)로부터 분리된다고 알려져 있다. 일반적으로 성체 줄기세포는 증식이 어려우나 쉽게 분화되는 경향이 강한 것으로 알려져 있어, 여러 종류의 성체 줄기세포를 사용하여 실제 의학에서 필요로 하는 장기 재생을 할 수 있을 뿐 아니라 이식된 후 각 장기의 특성에 맞게 분화할 수 있는 특성을 지니고 있다.

본 발명에서의 용어, "조혈줄기세포" 또는 "조혈모세포"는 다양한 혈액 세포 및 면역체계를 형성하는 림프구의 모체세포로서, 예를 들어 B 세포, T 세포와 같은 임파구, 과립구, 혈소판 및 적혈구로 발달할 수 있는 줄기세포를 말한다. 골수이식에 필수적인 세포로, 정상인의 골수혈액에는 모든 혈액세포를 만들어낼 수 있는 능력을 지닌 세포(CD34 양성 세포)가 약 1% 존재하는데 이를 조혈모세포라고 한다. 제대혈(탯줄혈액) 및 비장을 비롯한 온 몸에서 발견되지만, 특히 골수에서 대량으로 생산되며, 똑같은 자신을 만들어낼 수 있는 자가 복제 기능도 가지고 있다. 말초혈액 조혈모세포는 골수에서 유래한 것으로, 혈류를 순환하는 조혈모세포로서 자가 복제 및 성숙된 세포로 분화하는 성질을 가지고 있다.

본 발명에서의 용어, 줄기세포의 "증식"은 줄기세포의 분화(differentiation)와는 구분되는 개념으로서, 줄기세포가 구체적인 세포로 분화되지 않고, 줄기세포의 특성을 그대로 유지한 채, 세포가 분열되어 세포의 전체 수가 증가되는 것을 의미한다.

본 발명에서의 용어, "분화"란 덜 특화된 세포가 특정한 세포로 발달하여 세포의 크기나 모양, 막전위, 대사활성, 신호에 대한 반응이 특정한 유형의 세포로 변화하는 현상을 의미한다. 상기 분화는 주로 다세포 생물이 단일 접합자(zygote)에서 복잡한 조직을 형성하는 과정 중에 일어나거나, 성인이 되었을 때 손상된 조직을 복구하는 경우 성체줄기세포가 특정한 세포로 분화하게 된다.

본 발명에서의 용어, "배지"는 인 비트로(in vitro)에서 세포의 성장 및 생존을 유지하는데 필요한 영양물질을 포함하는 조성물을 의미한다.

본 발명에서의 용어, "계대 배양"이란 세포를 건강한 상태로 지속적으로 장기간 배양하기 위해 주기적으로 세포의 일부를 새로운 배양용기에 옮긴 후 배양배지를 갈아주면서 세포의 대를 계속 이어서 배양하는 방법을 의미한다. 한정된 공간을 가진 배양용기 내에서 세포의 수가 늘어나면서 일정시간이 지나면 증식 영양분이 소비되거나 오염 물질이 쌓여 세포가 자연히 죽게 되므로, 건강한 세포의 수를 늘리기 위한 방법으로 사용되며, 통상적으로 한 차례 배지(배양용기)를 교체하는 것 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 1 계대(1 passage)라고 한다.

본 발명에서 사용된 플라보노이드는 3-하이드록시플라본(3-hydroxyflavone, 3-HF), 3,2'-다이하이드록시플라본(3,2'-dihydroxyflavone, 3,2'-DHF) 또는 3,4'-다이하이드록시플라본(3,4'-dihydroxyflavone, 3,4'-DHF)으로서, 각 구조는 하기 화학식과 같다.

[화학식]

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험 방법 및 재료

1.1. 세포 배양

인간 만능줄기세포주는 feeder free 조건에서 배양 하였으며, Matrigel (BD Biosciences)을 RT(room temperature)에서 1시간 코팅한 세포 배양 플레이트에 mTeSR1 (STEMCELL technologies) 배지 조건으로 배양하였다. 배양 후 5일 마다 계대 배양을 하였으며, Accutase (Life Technologies)를 37℃에서 5분 동안 세포에 처리한 후, Matrigel이 코팅된 플레이트에 10 μM의 Y-27632 (STEMCELL Technologies)를 세포 배양 배지에 첨가하였다.

1.2. Total RNA 분리 및 RT-PCR 분석

제조업체의 방법에 따라, Easy-Blue total RNA extraction kit (iNtRON Biotechnology, Republic of Korea)를 사용하여 Total RNA을 추출하였다. 전체 RNA의 농도는 Nanodrop (ND1000) 분광 광도계(Nanodrop Technologies Inc., Wilmington DE, USA)로 측정하였다. 2 ㎍의 총 RNA 및 M-MLV 역전사효소를 사용하여 cDNA을 합성하였고, PCR 반응이 끝난 후, 1 % 또는 1.5 % 아가로스 젤에서 분석하였다. qPCR은 SYBR Green 마스터 믹스를 사용하여 분석하였으며, mRNA 발현은 House keeping gene (GAPDH)을 기준 값으로 이용하여 계산하였다.

1.3. 웨스턴 블롯

세포 분해 완충액 [1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich), 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM NaCl, 10% glycerol (Amresco, Solon OH, USA), 50 mM sodium fluoride (Sigma-Aldrich), 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF; Sigma-Aldrich), 1 mM p-nitrophenyl phosphate (Sigma-Aldrich), and 1 mM sodiumorthovanadate (Sigma-Aldrich)]을 사용하여 용해물을 4℃에서 15분 동안 13,000 rpm으로 원심 분리 하였다. 단백질 상등액을 Bradford 단백질 시약으로 정량하였고, 단백질은 SDS-PAGE (10% 또는 12 %)를 진행하였다. 분리된 단백질은 니트로-셀률로오스 막으로 옮겨졌고, TBS(Tris-buffered saline) 용액에 녹여 있는 5% 탈지분유로 1 시간 정도 블러킹한 후, anti-OCT4, anti-SOX2, anti-NANOG 및 anti-ACTIN (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)의 1차 항체를 4℃에서 12 내지 18시간 동안 반응시켰다. 이후, HRP-tagged anti-mouse, anti-goat 또는 anti-rabbit의 2차 항체를 반응시켰으며, ECL kit(Amersham Bioscience, Piscataway NJ, USA)을 사용하여 단백질을 확인하였다.

1.4. 면역세포염색

1×10⁴ 세포를 준비하여 5% CO₂, 37℃에서 24 시간에 배양하였고, 상기 세포는 PBS로 씻고, 4% paraformaldehyde로 고정한 후 10 분 동안 0.2% Triton X-100로 침투시켰다. 고정된 세포들을 PBS에서 10% 정상 염소 혈청으로 1 시간동안 코딩하였다. 이후, 1차 항체는 PBS로 희석한 후 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. PBS로 세 번 세척 한 후, 세포들은 2차 항체로 1 시간 동안 반응시켰다. 세포의 핵은 TOPRO3 (10 μg의 / ㎖)로 추가로 10 내지 15 분 동안 염색하였다. 세포는 PBS로 세 번 세척한 후, 면역 형광 반응은 Leica TCS SP5 II laser scanning confocal microscope(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)로 모니터링하였다.

1.5. 조혈줄기세포분화

조혈줄기세포를 분화시키기 위하여, 5일 동안 만능줄기세포에서 EB로 형성되도록 하였다. 이후, 15% FBS가 들어간 IMDM 배지에 SCF (40ng/mL), FLT-3L (20ng/mL), IL-3 (10ng/mL), IL-6 (10ng/mL), BMP4 (20ng/mL)를 첨가하여 분화를 유도하였으며, 매일 절반의 배양 배지를 교체하고 총 21일간 분화를 진행하였다.

1.6. 유세포 분석

분화된 조혈줄기세포의 유세포 분석을 위해 세포 배양 플레이트에 있는 만능줄기세포유래 조혈줄기세포에 0.25% Trypsin을 3분간 처리하여 세포를 띄운 후 1,000rpm 에서 원심분리하였다. 이후, 상층액을 버리고, 1X PBS로 세척한 후 다시 원심분리하였다. 이후, Blocking Buffer (0.5% BSA, 2% FBS in PBS)를 30분 동안 얼음에서 반응시켰고, FACS Buffer (0.05% sodium azide, 0.5% BSA in PBS)가 들어간 각각의 1차 항체 (CD34, CD45)를 1시간 동안 얼음에서 반응시켰다. 세척 후, 2차 항체 (FITC, PE)를 30분 동안 얼음에서 반응시켰고, 세포들은 1X PBS로 두 차례 세척한 후, 1X PBS에 재부유하여 FACS Calibur로 분석하였다.

1.7. GSH 농도 측정

세포내 GSH 농도를 측정하기 위해서 96-well 플레이트 (White clear bottom, Corning)에 1×10⁴의 만능줄기세포를 seeding 하였다. 24시간 후에 DMSO와 플라보노이드를 24시간 동안 처리하였고, 이후 5 μM의 FreSHtracer 을 5% CO₂, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 각 well에 0.3125 mM의 디아마이드 (Diamide)를 처리하였고, Operetta 장비를 이용하여 형광세기 (F510: Ex 410-430nm, Em 460-540nm / F580: Ex 490-510nm, Em 560-630nm)에 따른 세포내 티올의 양을 실시간으로 측정하였다. FreSHtracer는 티올과 결합된 상태에서는 510nm에서 최대방출 파장을 나타내며, 결합되지 않은 상태에서는 580 nm에서 최대 방출파장을 나타내므로, GSH의 농도는 그 형광비를 계산하여 나타내었다.

실시예 2. 인간 유도만능줄기세포에서의 콜로니 형성에 대한 플라보노이드 처리 효과

인간 유도만능줄기세포에 여러 종류의 플라보노이드(3-HF, 3,2'-DHF, 3,4'-DHF)를 처리하여 그 효과를 조사하였다(도 1). 각 플로보노이드는 1, 5, 10 20 μM의 농도로 처리되었다.

그 결과, 3-HF, 3,4'-DHF를 처리한 만능줄기세포에서는 세포를 dissociation한 후 계대 배양했을 때, 플레이트에 부착된 세포의 수가 비슷하거나 높은 농도의 플라보노이드에서는 생존률이 낮아졌음을 확인하였다(도 2). 그러나, 3,2'-DHF를 처리한 만능줄기세포에서는 10μM의 농도까지 농도의존적으로 세포의 생존률이 증가하였다. 특히, 10 μM의 3,2'-DHF를 처리한 세포에서는 처리하지 않은 경우에 비해 2.5배 정도의 세포 생존률이 향상되었음을 확인하였다(도 2).

만능줄기세포의 생존률 뿐만 아니라, 증식률도 3,2'-DHF를 처리한 세포에서 증가함을 확인하였다. 특히, 10 μM의 3,2'-DHF를 처리한 인간 만능줄기세포에서의 증식률은 72시간 동안 배양된 경우 세포수가 두배 이상 증가하였다(도 3). 그러나, 3-HF 및 3,4'-DHF를 처리한 만능줄기세포에서는 결과적으로 유의하지 않았다. 또한, 3,2'-DHF를 처리한 만능줄기세포에서는 control 그룹보다 콜로니 크기가 컸음을 확인하였다(도 4).

실시예 3. 인간 만능줄기세포의 생존률 및 증식률 비교

3,2'-DHF에 대한 만능줄기세포의 생존률 및 증식률에 대한 효과를 확인하여기 위하여, 기존에 만능줄기세포의 생존률 및 증식률에 효과가 있다고 알려진 물질인 Y-27632 와 doxycycline를 이용하여 비교하는 실험을 진행하였다. 인간 만능줄기세포에 Doxycycline, 3,2'-DHF 및 Y-27632를 Matrigel이 코팅된 플레이트에 각각 처리하였다.

그 결과, Doxycycline (1μg / ml) 이 처리된 인간 만능줄기세포는 3,2'-DHF 및 Y-27632와 비교하여 통계적으로 유의하지 않았으며, 3,2'-DHF와 Y-27632가 처리된 경우 세포의 생존률이 증가되었음을 확인하였다(도 5). 특히, 3,2'-DHF 및 Y-27632이 함께 처리된 경우 인간 만능줄기세포의 생존률은 Y-27632을 단독으로 처리하였을 때보다 세포 생존률이 유의하게 증가 하는 것을 AP (Alkaline phosphatase) 양성 콜로니를 통해 확인하였다(도 6). 또한, 만능줄기세포의 증식률에서도 3,2'-DHF 및 Y-27632를 함께 처리한 세포에서 5배 이상의 높은 증식률을 보였다(도 6). 따라서, 3,2'-DHF은 Y-27632와 다른 메커니즘을 통해 인간 만능줄기세포의 생존률 및 증식률을 향상시키고 알 수 있었다.

실시예 4. 3,2'-DHF에 의한 인간 만능줄기세포의 만능성 (pluripotency) 향상 효과

본 발명자들은 3,2'-DHF를 처리한 인간 만능줄기세포에서 줄기세포 마커인 NANOG, OCT4 및 SOX2의 유전자 발현수준 및 단백질 발현수준을 비교하는 실험을 수행하였다.

Realtime PCR 분석 결과, NANOG 유전자의 발현수준의 경우 3,2'-DHF 및 Y-27632에서 배양된 인간 만능줄기세포에서 Control 및 Doxycycine를 처리한 것에 비하여 발현이 높게 나타났음을 확인하였다(도 7). 또한, OCT4 유전자의 발현수준에서도 유사한 결과가 나왔으며, SOX2 유전자의 발현 수준의 경우 Y-27632를 처리한 그룹보다 3,2'-DHF를 처리한 그룹에서 발현이 더 높게 나타났음을 확인하였다(도 7). 더욱이, 3,2'-DHF 및 Y-27632를 함께 처리한 그룹에서 유전자의 발현수준이 더 높았다. 면역형광법(Immunofluorescence) 분석 결과에서도 NANOG, OCT4 및 SOX2의 단백질 발현수준은 Control 및 Doxycycline를 처리한 것이 비하여 3,2'-DHF 및 Y-27632에서 더 높았음을 확인하였다(도 7).

따라서, 상기 특이적인 마커 발현 양상 결과에 의하여 3,2'-DHF가 인간 만능줄기세포의 자가재생 능력 및 만능성에서 중요한 역할을 할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 5. 3,2'-DHF에 의한 만능줄기세포의 항산화 조절

유도만능줄기세포의 만능성은 세포의 산화 및 항산화에 의해서도 영향을 미칠 수 있으므로, 본 발명자들은 플로보노이드 종류의 하나인 3,2'-DHF가 어떠한 항산화 효소를 조절하는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다.

Control 그룹, 3-HF, 3,2'-DHF 및 3,4'-DHF를 각각 10 μM씩 처리한 만능줄기세포에서 항산화효소의 mRNA 레벨을 확인하였다. 그 결과, 3,2'-DHF가 control에 비해서 여러 항산화효소의 mRNA 레벨을 증가시키는 것을 확인하였다. GPX(Glutathione peroxidase)는 세포내의 활성산소인 H₂O₂를 H₂O로 변환한 후 배출시킴으로써 효과적으로 H₂O₂를 제거하는 효소로 알려져 있는데, 3,2'-DHF를 처리한 만능줄기세포 그룹에서 GSR(glutathione-disulfide reductase), GPX1(Glutathione peroxidase 1)이 control에 비해서 2배 이상 증가하였으며, GPX2(Glutathione peroxidase 2)에서는 6배 이상 증가하는 것을 확인하였다(도 8). 또한, GPX3, GPX4, GPX7 의 mRNA가 4배 이상 증가하는 것을 확인함으로써 3,2'-DHF가 활성산소로부터 세포를 보호하고 있음을 확인하였다(도 8).

자연계에 널리 분포하며 생체내의 산화환원반응에 중요한 역할을 하는 GSH(Glutathione)는 세포를 손상을 입히거나 파괴시키는 활성산소로부터 세포를 보호하는 강력한 항산화제이며, 만능줄기세포의 만능성조절인자인 OCT4의 발현을 조절하는 것으로 보고 되고 있다. 본 발명자들은 실시간 GSH 레벨 측정 방법인 FreSHtracer를 이용하여 만능줄기세포에서의 GSH를 측정하였다. 티올(Thiol) 산화제인 디아마이드(diamide)를 처리한 만능줄기세포의 GSH 레벨이 시간이 지나면서 떨어지는 것을 보였는데, 10 μM의 3,2'-DHF를 처리한 만능줄기세포 그룹에서는 control 그룹보다 GSH 레벨이 높은 것을 확인하고(도 9), 이는 3,2'-DHF가 디아마이드에 의한 세포 산화를 막는 것을 알 수 있었다.

실시예 6. 만능줄기세포에서의 조혈줄기세포 분화

본 발명자들은 3,2'-DHF를 처리한 경우 만능줄기세포의 분화능에 영향을 주는지 확인하는 실험을 수행하였다. Control 그룹과 3,2'-DHF를 처리한 만능줄기세포를 이용하여 총 6일간 EB를 형성하도록 하였다. 이후, 내배엽 마커인 AFP, SOX17, 외배엽 마커인 PAX6, Nestin, 중배엽 마커인 HAND1, Brachyury를 발현을 qPCR로 확인하였다. 그 결과, 각 3 germ 분화 유전자의 발현 마커 중 중배엽 마커인 HAND1, Brachyury의 발현이 3,2'-DHF를 처리한 그룹에서 증가하는 것을 확인하였다(도 10).

또한, 플로보노이드를 처리한 만능줄기세포를 이용하여 조혈줄기세포로의 분화를 총 21일 동안 진행하였다. 처음 5일 동안은 EB를 형성하였으며, 5일 이후, IMDM 배지에 SCF, FLT3L, IL-3, IL-6, BMP4를 첨가하여 분화를 유도하였다. 분화가 진행되는 동안 세포의 형태는 크게 변하지 않았으며, EB를 형성한 후 3일째부터 분화 완료된 후 25일째에까지의 총 세포수를 측정하였을 때 3,2'-DHF를 처리하여 분화를 유도한 경우 세포수가 Control 그룹에 비해 증가하였음을 확인하였다(도 11).

조혈줄기세포로 분화를 유도한 세포는 FACS를 이용하여 조혈줄기세포 마커인 CD34, CD45의 cell population을 측정하였다. CD34⁺ 세포는 control에서 62.0%, 3,2'-DHF에서 66.2%의 cell population을 보였다. 또한, CD45⁺ 세포는 control에서 80.9%, 3,2'-DHF에서 84.1%의 cell population을 보였으며, CD34⁺CD45⁺는 control에서 51.7%, 3,2'-DHF에서 56.3%의 cell population을 나타내었다(도 12). 따라서, 3,2'-DHF가 처리된 경우 조혈줄기세포로의 분화를 촉진할 수 있음을 확인하였다.

또한, 3,2'-DHF를 처리한 경우 더 많은 수의 조혈줄기세포를 획득할 수 있었는데, 특히, Control 그룹보다 2배 이상의 조혈줄기세포 positive 세포의 양을 획득할 수 있음을 확인하였다(도 13).

결과적으로, 도 11에서처럼 3,2‘-DHF를 처리하여 조혈줄기세포로 분화를 진행하였을 경우 더 많은 수의 조혈줄기세포를 획득할 수 있었는데, 특히, Control 그룹보다 2배 이상의 조혈줄기세포 positive 세포의 양을 획득할 수 있음을 확인하였다(도 13).

Claims

3,2'-다이하이드록시플라본(3,2'-dihydroxyflavone)을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 분화 촉진용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 줄기세포는 인간 유래 유도만능줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 분화는 조혈줄기세포로의 분화인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 3,2'-다이하이드록시플라본은 1 내지 20 μM의 농도인 것을 특징으로 하는 조성물.
3,2'-다이하이드록시플라본(3,2'-dihydroxyflavone)을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 증식 또는 만능성 촉진용 조성물.
제 5 항에 있어서,
상기 만능줄기세포는 인간 유래 유도만능줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5 항에 있어서,
상기 3,2'-다이하이드록시플라본은 1 내지 20 μM의 농도인 것을 특징으로 하는 조성물.
3,2'-다이하이드록시플라본(3,2'-dihydroxyflavone)을 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 분화를 촉진시키는 방법.
제 8 항에 있어서,
상기 줄기세포는 인간 유래 유도 만능줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서,
상기 분화는 조혈줄기세포로의 분화인 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서,
상기 3,2'-다이하이드록시플라본은 1 내지 20 μM의 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
3,2'-다이하이드록시플라본(3,2'-dihydroxyflavone)를 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 증식 또는 만능성 촉진 방법.
제 12 항에 있어서,
상기 만능줄기세포는 인간 유래 유도 만능줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서,
상기 3,2'-다이하이드록시플라본은 1 내지 20 μM의 농도인 것을 특징으로 하는 방법.