KR20190114273A

KR20190114273A - 노루오줌을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20190114273A
Application number: KR1020180036724A
Authority: KR
Inventors: 이만휘; 전보라; 김태환; 이승은; 이정훈
Original assignee: 경북대학교 산학협력단; 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2018-03-29
Publication date: 2019-10-10
Also published as: KR102186561B1

Abstract

본 발명은 노루오줌 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 노루오줌 추출물은 콜라겐으로 유도된 혈소판의 활성 및 혈전 형성을 효과적으로 억제하므로 혈전 및 혈소판 응집으로 인한 다양한 혈전성 질환을 예방 및 치료하는데 유용하게 이용할 수 있을 것이다.

Description

노루오줌을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 조성물{Pharmaceutical composition comprising extraction of Astilbe chinensis as an effective components for prevention and treatment of thrombosis}

본 발명은 노루오줌 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

심혈관계질환은 심장질환과 혈관질환을 포함하는 매우 광범한 질환으로서 심근경색, 고혈압, 심부전, 부정맥, 심근증 및 동맥경화 진행에 의한 허혈성 심장질환 등이 주요 심장질환이며 혈관질환은 뇌졸중과 말초혈관질환 등을 말한다. 세계보건기구 (WHO)의 통계에 따르면 심혈관계 질환이 세계적인 사망률 29.2%로서 1위를 차지하고 있다.

이러한 심혈관계 질환은 혈중 콜레스테롤 증가, 지질조성의 변화에 따른 혈액성분의 변화와 과도한 정신적 긴장 상태가 가장 큰 원인으로, 혈액과 밀접한 관계가 있다. 정상적인 상태에서 혈액은 혈관 내에서 응집작용이 일어나지 않지만, 출혈이 발생할 경우 신체 방어 작용의 하나로 혈액응고가 일어나게 된다. 하지만 혈액성분의 변화에 의해 혈관이 손상되거나 동맥경화에 의해 혈관의 내경이 좁아져 혈류가 원활치 못할 경우 만들어지는 혈전(thrombus)이 혈류를 통해 심장에 혈액을 공급하는 관상동맥이나 미세한 뇌혈관을 막게 되어 뇌 또는 심혈관계질환이 발병하게 된다. 또한 병의 진행 상태로 보아 재발의 위험성이 높기 때문에 평생치료를 요하는 경우가 대부분이다.

현재 심혈관 질환(Cardiovascular diseases, CVD)은 선진국에서 이환율(mortality)과 사망률의 주요 원인이다. 여러 가지 위험 요소가 있지만 주요 원인이되는 혈소판은 CVD에서 중심 역할을 하며 혈소판 응집은 뇌졸중 및 심장 마비로 이어질 수 있는 혈관의 협착을 유발하는 죽상 경화성 플라크의 발달 및 진행에 핵심적인 요소이다. 활성 혈소판은 혈전증 및 아테롬(atheroma) 생성의 중요한 중개자 역할을 한다.

또한, 혈관 내 혈전증은 다양한 심혈관 질환(CVD)을 유발하는 요인이다. 다른 측면에서, 혈소판 기능의 약리학적 억제는 혈전증 발생을 크게 감소시켰으며, 심혈관 질환 치료에 임상적으로 승인된 많은 약물을 사용하고 있으나, 이러한 항혈소판 약물은 심각한 합병증을 가지며 일부 환자에서는 효과가 없으므로 CVD의 치료 및 예방에 효과적이고 안전한 방법을 개발해야 할 필요가 있다.

항응고제뿐만 아니라 항혈전제로 식물 추출물과 같은 천연물에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있으나, 혈소판 활성화 및 혈전 형성을 억제하는 천연물질에 대해서는 보고된 바가 없다.

(0001) 대한민국 등록특허 KR 10-1691855

이에 본 발명자들은 혈전증 예방 및 치료할 수 있는 천연물질을 연구하던 중에 노루오줌이 혈소판의 활성 및 혈전 형성을 억제하는 것을 확인하였으므로 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 노루오줌 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 노루오줌 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 노루오줌 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 노루오줌 추출물은 물, C1 내지 C2 저급 알코올, 주정 또는 이들의 혼합물로 추출하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 노루오줌 추출물은 혈소판 활성 억제 및 혈전 형성을 억제하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 노루오줌 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 노루오줌 추출물은 콜라겐으로 유도된 혈소판의 활성 및 혈전 형성을 효과적으로 억제하므로 혈전 및 혈소판 응집으로 인한 다양한 혈전성 질환을 예방 및 치료하는데 유용하게 이용할 수 있을 것이다.

도 1은 노루오줌 추출물의 용량(0, 25, 50, 100 μg/ml)에 따른 콜라겐으로 유도된 혈소판의 응집을 억제능을 확인한 그래프이다.
도 2는 노루오줌 추출물이 콜라겐으로 유도된 혈소판의 응집을 억제능을 확인한 그래프이다:
(A) 세척한 혈소판을 1 mM CaCl₂ 존재하에 노루오줌 추출물 또는 부형제(vehicle)로 2분간 전처리하고 콜라겐으로 5분간 자극하여 노루오줌 추출물의 농도(0, 25, 50, 100 μg/ml) 처리하여 혈소판 응집 억제능 확인함
(B) 혈소판 응집 반응 후 전자 현미경으로 찍은 이미지, (a) 부형제(vehicle), (b) 콜라겐 2.5 μg/ml, (c) 노루오줌 추출물 25 μg/ml + 콜라겐 2.5 μg/ml, (d) 노루오줌 추출물 50 μg/ml + 콜라겐 2.5 μg/ml, (e) 노루오줌 추출물 100 μg/ml + 콜라겐 2.5 μg ml로 처리, 그래프는 적어도 네 번의 독립적 인 실험의 평균 ± SEM을 나타냄, *** 대조군에 비해 p <0.001.
도 3은 노루오줌 추출물의 콜라겐 자극에 대한 칼슘이온의 상승에 억제를 확인한 그래프이다:
세척된 혈소판에 칼슘 형광단 (5 μM, Fura-2/AM)을 1시간 동안 로딩하였고, 결과는 최소 4회의 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 나타냄, *** 대조군에 비해 p <0.001.
도 4는 노루오줌 추출물의 ATP 방출 효과를 나타낸 그래프이다: 결과는 최소 4 회의 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 나타냄, *** 대조군에 비해 p <0.001.
도 5는 노루오줌 추출물이 콜라겐 유발 혈소판에서 인테그린 α_IIbβ₃에 결합하는 피브리노겐 억제 효과를 나타낸 그래프이다:
(A) 부형제(vehicle), (b) 콜라겐 2.5㎍/ml 처리, (c) 노루오줌 추출물 25 μg/ml + 콜라겐 2.5 μg/ml, (d) 노루오줌 추출물 50 μg/ml + 콜라겐 2.5 μg/ml, (e) 노루오줌 추출물 100 μg/ml + 콜라겐 2.5 μg/ml로 처리,
(B) 노루오줌 추출물의 농도(0, 25, 50, 100 μg/ml)에 따른 인테그린 α_IIbβ₃에 결합하는 피브리노겐의 억제 효과, ** 대조군에 비해 p <0.01 및 *** p <0.001.
도 6은 노루오줌 추출물의 농도(0, 25, 50, 100 μg/ml)에 따라 콜라겐 자극 혈소판에서 MAPK와 MEK 인산화를 약화시키는 것을 확인한 사진과 그래프이다: * 작용제 - 처리된 그룹과 비교하여 p <0.05 및 ** p <0.01.
도 7은 노루오줌 추출물의 농도(0, 25, 50, 100 μg/ml)에 따라 콜라겐 자극 혈소판에서 PI3K/Akt 인산화를 약화시키는 것을 확인한 사진과 그래프이다: * 작용제 - 처리된 그룹과 비교하여 p <0.05 및 ** p <0.01.
도 8은 노루오줌 추출물이 GPVI 신호 전달 경로에서 콜라겐 자극 PLCγ2 활성화를 약화시키는 것을 확인한 사진이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 발명자들은 혈전증의 예방 또는 치료할 수 있는 천연물을 연구하던 중에 노루오줌 추출물이 혈소판 활성 억제 및 혈전 형성을 억제하는데 효과가 우수한 것을 확인함으로써 상기 추출물을 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품으로 활용하고자 하였다.

따라서, 본 발명은 노루오줌(Astilbe chinensis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 "노루오줌(Astilbe chinensis)"은 우리나라 각처의 산에서 자라는 다년생 초본으로, 생육환경은 산지의 숲 아래나 습기와 물기가 많은 곳에서 자라며, 키는 60㎝ 내외이고, 잎은 넓은 타원형으로 끝이 길게 뾰족하며, 잎 가장자리가 깊게 패어 들고 톱니가 있으며 잎의 길이는 2~8㎝이다. 꽃은 연한 분홍색으로 길이가 25~30㎝ 정도이다. 열매는 9~10월에 달리며 갈색으로 변한 열매 안은 미세한 종자들이 많이 들어있다. 이 품종은 뿌리를 캐어 들면 오줌 냄새와 비슷한 냄새가 난다고 하여 붙여진 이름이고, 외국에서는 많은 품종들이 육종되어 “아스틸베(Astilbe)”라 하여 절화식물로 이용된다. 관상용으로 쓰이며 어린순은 식용, 뿌리를 포함한 전초와 꽃은 약용으로 이용된다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 발명의 용어 "약학적으로 허용 가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 생리식염수, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 프로필렌글리콜 및 리퀴드 파라핀으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용 가능하다. 상기 성분들은 상기 유효성분인 노루오줌 추출물에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이사용 될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 그 투여 용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수회 투여할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 조성물은 노루오줌 추출물의 양을 기준으로 1일 0.5 내지 5000 mg/kg으로, 바람직하게는 50 내지 500 mg/kg으로, 더욱 바람직하게는 50 mg/kg으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.

또한, 본 발명은 노루오줌(Astilbe chinensis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품은 노루오줌 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 노루오줌 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강기능음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 g당 일반적으로 약 0.01 내지 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 내지 0.03 g 이다.

상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염,알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 2 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해서 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 재료 및 방법

<1-1> 화학 물질 및 시약

콜라겐은 Chrono-log (Haverown, PA, USA)에서 구입하였다. Fura-2/AM은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Fibrinogen Alexa Fluor 488 접합체는 Molecular Probes (미국 오레곤, Eugene)에서 구입하고 ATP 분석 키트는 Biomedical Research Service Center (Buffalo, NY, USA)에서 구입하였다. Syn, Fyn, Lyn, Syk, phospholipase Cγ2 (PLCγ2), phospho-p44/42 (phospho-ERK), p44/42(ERK), MEK, phospho-MEK, 스트레스-활성화 단백질 키나아제 (SAPK)/c- JNK, phospho-SAPK/JNK, phospho-PI3K, PI3K, phospho-Akt 및 Akt는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 획득하였다. 정제수(Ultrapure water)는 J. T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA)에서 입수하였다.

<1-2> 실험 동물

수컷 Sprague-Dawley(SD) 랫트 (240∼260 g)를 Orient Co. (Seoul, Korea)에서 구입하여 일주일 동안 사육장에서 12/12 h light/dark cycle, 온도 23 ± 2℃ 및 습도 50 ± 10%에서 키웠다. 모든 동물 관련 연구는 IACUC 가이드라인에 따라 수행되었으며 프로토콜은 경북대학교의 동물실험 윤리위원회의 승인을 받았습니다.

<1-3> 혈소판 준비

심장을 통해 래트로부터 혈액을 채취하고 항응고제인 anticoagulant acid citrate dextrose(ACD) 용액이 담긴 튜브로 옮겼다. 혈액을 170 × g에서 7분 동안 원심 분리하여 혈소판이 많은 혈장(PRP)을 얻었다. PRP를 350 x g에서 7분간 원심 분리하여 세척된 혈소판을 분리하였다. Tyrode의 완충액(137 mM NaCl, 12 mM NaHCO₃, 5.5 mM 포도당, 2 mM KCl, 1 mM MgCl₂ 및 NaHPO₄, pH 7.4)을 사용하여 혈소판 농도를 3 x 10⁸ cell/mL로 조정하고 혈소판 응집 분석에 사용하였다. 모든 준비 절차는 실온 (23 ± 2℃)에서 수행하였다.

<1-4> 혈소판 응집 분석 및 스캐닝 전자 현미경 분석

혈소판 응집은 이전 기술(Endale, M., et al., Br J Pharmacol, 2012. 167(1): p. 109-27.)과 같이 표준 기술, 광전송 집계 측정법 (Chrono-log, Havertown, PA, USA)을 사용하여 수행되었다. 간단히 말해, 세척된 혈소판을 1 mM 염화칼슘 (CaCl₂)의 존재하에 노루오줌 추출물 또는 부형제(vehicle) 중 다양한 농도로 37℃에서 2분간 예비 배양한 후, 작용제 콜라겐 혼합물을 연속적으로 교반하면서 5분 동안 추가로 배양하였다.

경북대학교 공동실험실습관에서 전자현미경(Field Emission Scanning Electron Microscope, SU8220, Hitachi)를 사용하여 응집 초미세 사진을 평가하였다. 간단히, 혈소판 응집 분석 후, 혈소판 혼합물을 0.5 % paraformaldehyde(제 1 고정액) 및 osmium tetroxide (제 2 고정액)를 사용하여 고정시키고, 다양한 농도의 에탄올로 탈수시킨 다음, 동결 건조하고 스캔하였다.

<1-5> 세포 내 칼슘 이온 측정

[Ca² ⁺]_i 농도는 Fura-2/AM을 사용하여 이전에 기술 한 바와 같이 평가하였다. 혈소판을 37℃에서 1 시간 동안 5 μM Fura-2/AM로 미리 배양하였다. 배양 후, 혈소판을 세척하고 노루오줌 추출물로 37℃에서 1 mM CaCl₂의 존재하에 1 분간 처리한 후, 2 분 동안 작용제로 자극하였다. Fluorescence는 분광 형광 측정기 (F-2500, Hitachi, Japan)를 사용하여 기록하였고 [Ca² ⁺]_i는 Schaeffer and Blaustein의 방법을 사용하여 다음 식을 사용하여 계산하였다: [Ca² ⁺] _iin cytosol = 224nM × (F-F _min)/(Fmax-F). 여기에서 224nM은 Fura-2-Ca² ⁺ 복합체의 해리 상수이고, F _min과 Fmax는 각각 매우 낮은 Ca²⁺ 농도에서의 형광 강도 수준을 나타내었다.

<1-6> ATP 방출 분석

세척된 혈소판을 1 mM CaCl₂ 존재하에 노루오줌 추출물과 함께 37℃에서 2 분간 예비 배양하고 콜라겐으로 자극시켰다. 응집 반응을 종결시키고 혈소판 혼합물을 원심분리하였다. 획득된 상층 액은 ATP 분석 키트 (Biomedical Research Service Center)를 사용하여 luminometer (GloMax 20/20, Promega, Madison, WI, USA)로 ATP 분비를 측정하는데 사용하였다.

<1-7> 유세포 분석(Flow cytometry )

인테그린 α_IIbβ₃에 결합하는 피브리노겐은 유동 세포 계측법을 사용하여 정량화되었다. 세척된 혈소판을 노루오줌 추출물과 함께 0.1 mM CaCl₂의 존재하에 2분 동안 예비 배양 한 다음 5분 동안 콜라겐으로 자극시켰다. 자극된 혈소판을 실온 (23 ± 2℃)에서 5분 동안 fibrinogen Alexa Flour 488 접합체 (20 μg/mL)로 처리하고 4℃에서 30분 동안 0.5 % 파라 포름 알데히드로 고정시켰다. 배양 후, 혈소판을 인산 완충 식염수 (PBS)로 3회 세척하고 400 μL PBS에 현탁시켰다. Fluorescence는 FACS Calibre cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)로 기록하고 CellQuest 소프트웨어 (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA)를 사용하여 데이터를 분석하였다.

<1-8> 면역 침전

혈소판은 단백질 침전 분석을 위해 변형된 타이로드 (Tyrode) -HEPES 완충액에서 8 x 10⁸ 세포/mL로 현탁되었고, 혈소판 응집은 상기 기재된 바와 같이 수행되었다. 동량의 ice-cold NP 용해 완충액 (2 % [v/v] Nonidet P40, 50mM Tris, 20mM NaF, 25mM β- 글리세로 포스페이트, 120mM NaCl, 10mM EDTA, 1mM PMSF, 2 mM Na3VO4, 5 mg/mL 루피 펩틴, 5 mg/mL 아프로토닌, 1 mg/ml 펩 스타틴 A, 1 mM 벤즈 아미드, pH 7.5). 얻은 용해물은 4℃에서 1시간 동안 protein A-sepharose (PAS)로 제거하였다. 배양 후, PAS를 제거하고 용 해물을 회전식 진탕기에서 4℃에서 밤새 풀다운 항체로 처리하였다. 단백질/항체 복합체를 4℃에서 4시간 동안 PAS로 분리하고 용해 완충액으로 5회 세척하였다. 비드를 Laemmli 샘플 완충액 (2% sodium dodecyl sulfate (SDS), 1% β-mercaptoethanol, 0.008% bromophenol blue, 80mM Tris pH 6.8 및 1mM ethylenediaminetetraacetic acid [EDTA]에서 끓여서 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE). 분해된 단백질은 polyvinylidene difluoride (PVDF) 멤브레인으로 옮겨졌다. 멤브레인을 5% 우유로 차단하고 각각의 1 차 및 2 차 항체로 프로빙하고 향상된 화학 발광 (Advansta, CA, USA)을 사용하여 시각화하였다.

<1-9> 면역 블로팅

혼합물에 lysis buffer (PRO-PREP; iNtRON Biotechnology, Seoul, Korea)를 첨가하여 BCS 분석 (PRO-MEASURE; iNtRON Biotechnology, Seoul, Korea)을 이용하여 단백질 농도를 측정하여 혈소판 응집을 종결시켰다. 총 혈소판 단백질을 10% SDS-PAGE를 사용하여 분리하고 PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인을 5% 탈지유로 차단하고, 각 항체로 프로빙하고, 향상된 화학 발광 (Advansta, CA, USA)을 사용하여 시각화하였다.

<1-10> 통계 분석

데이터는 일방 분산 분석 (ANOVA)에 의해 분석되었고 Dunnett’s post hoc test를 통해 관찰된 차이 (SAS Institute Inc., 미국 노스 캐롤라이나 주 캐리)의 통계적 유의성을 측정했습니다. 모든 데이터는 평균 ± 표준 오차 (SEM)로 나타내었다. 0.05 이하의 p 값은 통계적으로 유의하다고 간주되었다.

<1-11> 노루오줌 추출물의 준비

노루오줌은 농진진흥청 (수원)에서 채집하였다. 노루오줌을 작은 조각으로 갈아서 100% 메탄올로 50℃에서 가속용매추출기 (Dionex, USA)로 추출한 다음, 회전증발농축기 (N-1000, Eyela, Japan)로 농축하였으며, 수율은 17.0%이였다.

< 실시예 2> 실험결과

<2-1> 노루오줌 추출물의 혈소판 응집 및 세포 내 칼슘 동원 분석 결과

상이한 작용제에 의한 스크리닝은 노루오줌 추출물이 콜라겐에 의해 유발된 혈소판 응집을 억제하였다(도 1). 혈소판 응집의 유의하고 용량 의존적인 억제는 부형제(vehicle) 대조군(도 2A)과 비교하여 노루오줌 추출물로 전처리 된 혈소판에서 관찰되었다(도 2A). 노루오줌 추출물은 혈소판 응집과 혈전 형성을 억제하였다(도 2B).

노루오줌 추출물 또는 부형제(vehicle)로 전처리 한 혈소판에서 칼슘 동원을 평가 한 결과, 노루오줌 추출물이 칼슘 동원을 억제하여 혈소판 응집을 억제하였으며, 노루오줌 추출물의 처리 용량에 따라 세포 내 칼슘 이동이 억제되는 것을 확인하였다(도 3).

<2-2> 노루오줌 추출물의 과립 분비 억제 분석 결과

혈소판은 자극시 혈소판 응집을 향상시키는 많은 인자를 분비하는 상이한 종류의 과립을 보유한다. 조밀한 과립에서 나오는 ATP 분비는 혈소판 응집을 일으키는 중요한 분비물 중 하나이다.

혈소판 응집이 종결된 후, ATP 측정기(luminometer)를 사용하여 노루오줌 출추출의 용량에 따라 처리한 콜라겐-유도 혈소판에서 ATP의 농도를 평가하였다.

그 결과, 노루오줌 추출물은 작용물질로 자극된 혈소판에서 ATP 방출을 처리 농도에 의존적으로 억제하였다(도 4).

<2-3> 노루오줌 추출물의 내부-외부 시그널 조절 분석 결과

입체 구조 변화는 피브리노겐 결합(fibrinogen binding)에 반응하여 인테그린(integrin) α_IIbβ₃의 구조에서 일어나며, 이는 신호 전달을 증가시키고 혈소판 응집에 관여하므로, 노루오줌 추출물의 용량에 따라 콜라겐 유도 혈소판에 대한 피브리노겐의 결합을 유동세포 계측법을 사용하여 측정하였다.

그 결과, 노루오줌 추출물은 피브리노겐과 인테그린 α_IIbβ₃ 상호 작용을 조절하고, 노루오줌 추출물의 처리 용량에 따라 피브리노겐과의 결합 친화성을 억제하였다(도 5).

<2-4> 노루오줌 추출물의 혈소판 응집 억제 분석 결과

MAP 인산화효소(Mitogen activated protein kinase, MAPK)는 ERK, JNK, p38^MAPK를 포함하고 있으며, 혈소판 활성화에 관여하며, 여러 가지 작용제에 의해 활성화되어 혈소판 응집에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 노루오줌 추출물은 용량 의존적으로 모든 MAPK 분자의 인산화를 유의하게 억제했다(도 6). MEK는 MAPKK 경로에서 ERK의 상류 분자이며 노루오줌 추출물은 단백질의 인산화를 용량 의존적으로 억제한다(도 6).

또한, PI3K/Akt 경로는 혈소판 응집에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 노루오줌 추출물로 전처리한 콜라겐 자극된 혈소판에서 이 경로의 활성화를 평가하여 노루오줌 추출물이 경로의 활성화에 유의한 억제 가능성을 확인하였으며, 노루오줌 추출물은 PI3K/Akt의 발현을 억제함으로써 혈소판 응집을 억제함을 확인하였다(도 7).

<2-5> 노루오줌 추출물의 GPVI 신호 전달 경로에 관여하는 단백질의 인산화 억제 분석 결과

단백질 P13K와 PLCγ2는 GPVI 신호 전달에서 중요한 역할을 하며, 과립 분비와 궁극적으로 혈소판 응집과 같은 하류 경로에 중요한 역할을 하므로, GPVI 경로에서 이들 단백질에 대한 노루오줌 추출물의 영향을 분석하였다.

그 결과, 노루오줌 추출물은 P13K와 PLCγ2 단백질의 인산화 수준과 상호작용을 차단하는 것을 확인하였다(도 8).

Claims

노루오줌(Astilbe chinensis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 노루오줌 추출물은 물, C1 내지 C2 저급 알코올, 주정 또는 이들의 혼합물로 추출하는 것인 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 노루오줌 추출물은 혈소판 활성 억제 및 혈전 형성을 억제하는 것인 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
노루오줌(Astilbe chinensis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.