KR20190106439A

KR20190106439A - 유산균 배양물 혼합액을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20190106439A
Application number: KR1020180027957A
Authority: KR
Inventors: 노윤화; 이동걸; 김미선; 김민지; 강승현; 박명삼; 이문영; 김효정
Original assignee: 한미약품 주식회사; 코스맥스 주식회사
Priority date: 2018-03-09
Filing date: 2018-03-09
Publication date: 2019-09-18
Also published as: WO2019172554A1; KR102026597B1

Abstract

본 발명은 유산균 배양물 혼합액을 함유하는 화장료 조성물, 이의 제조방법, 이의 피부 미백 용도, 이를 이용한 피부 미백 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 락토바실러스 람노서스 배양물, 락토바실러스 애시도필러스 배양물 및 비피도박테리움 애니말리스 배양물이 혼합된 유산균 배양물 혼합액을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

유산균 배양물 혼합액을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물{Cosmetic composition for skin whitening comprising a mixture of lactic acid bacteria culture}

사람의 피부색을 결정하는 요인은 다양하지만, 가장 중요한 요인은 멜라닌이라 할 수 있다. 멜라닌 색소를 생성하는 멜라닌 생성 세포의 수는 민족이나 피부색에 관계 없이 일정하지만, 멜라닌화의 정도, 멜라닌 소체의 크기, 수 및 분포상태, 및 각질형성 세포 내에서의 멜라닌 소체의 분해능 등의 차이에 따라 피부색이 결정될 수 있다.

멜라닌은 멜라닌 생성 세포 내의 L-타이로신(L-tyrosine)이 가수분해 반응으로 L-도파(L-dopa)로 변하고, 이어서 산화 반응으로 L-도파퀴논(L-dopaquinone)으로 변하는 일련의 산화-중합반응 거쳐 합성되며, 이렇게 생성된 멜라닌이 침착되면 피부의 색이 검게 변하게 된다. 최근 산업의 급격한 발달로 대기가 오염되고 오존층이 심하게 파괴됨에 따라, 멜라닌 색소 침착에 의해 피부가 검게 변하는 현상이 빈번하게 유발되고 있으며, 이를 예방하기 위한 다양한 기능성 화장품에 대한 소비자의 관심도 꾸준히 증가하는 추세이다.

이러한 멜라닌 생성에서 가장 중요한 작용을 하는 효소는 티로시나아제(tyrosinase)로, 일반적으로 티로시나아제의 발현이 증가하면 멜라닌 생성도 증가하게 된다. 이때, 세포 내에서의 티로시나아제의 발현은 작은 안구증 연관 전사 요소(Microphthalmia-associated transcription factor; 이하, MITF)가 M-BOX(티로시나아제의 프로모터)에 결합하여 전사인자로 작용함으로써 조절된다. 또한, MITF 전사인자는 티로시나아제 뿐만 아니라, 멜라닌 생합성에 관련된 일련의 효소, 예를 들면, 멜라노사이트(Melanocyte) 내 멜라노좀(Melanosome) 운반에 관여하는 RAB27A와 같은 효소들의 전사를 유도한다. 그러므로, 이러한 MITF 전사인자의 억제를 통하여 멜라닌 색소 침착에 의해 피부가 검게 변하는 현상을 억제할 수 있다.

한편, 프로바이오틱스(probiotics)란 항생 물질을 의미하는 안티바이오틱스(antibiotics)와는 대립되는 어원적 의미를 가지는 것으로, 장내의 미생물 균형에 도움을 주는 미생물 제제 또는 미생물 성분을 의미한다. 락토바실러스균과 비피더스균 등 유산균이라고 총칭하는 균종이 대표적이며, 이러한 프로바이오틱스는 락토바실러스 속이나 비피도박테리움 속 등의 장내 유용 미생물 수를 증가시킴으로써 유해 병원균 증식을 억제하고, 항생제 치료나 외부 환경 변화에 대한 장내 세균총의 항상성을 유지하게 하는 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

그러나, 아직까지 락토바실러스 람노서스(Lacotbacillus rhamnosus) 배양물, 락토바실러스 애시도필러스(Latobacillus acidophilus) 배양물 및 비피도박테리움 애니말리스(Bifidobacterium animalis) 배양물이 혼합된 유산균 배양물 혼합액의 피부 미백 효과에 대해서는 알려진 바 없다.

본 발명자들은 피부 미백 효과를 갖는 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 락토바실러스 람노서스 배양물, 락토바실러스 애시도필러스 배양물 및 비피도박테리움 애니말리스 배양물이 혼합된 유산균 배양물 혼합액의 경우, 멜라닌 생성, 이동 및 분비 억제 효과, 및 멜라닌의 합성에 관여하는 MITF 유전자 발현 감소 효과가 우수하여, 피부 미백 효과를 나타낼 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 유산균 배양물 혼합액을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 유산균 배양물 혼합액을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 유산균 배양물 혼합액의 피부 미백 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 유산균 배양물 혼합액을 이용한 피부 미백 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 피부 미백 효과를 갖는 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 락토바실러스 람노서스 배양물, 락토바실러스 애시도필러스 배양물 및 비피도박테리움 애니말리스 배양물이 혼합된 유산균 배양물 혼합액의 경우, 멜라닌 생성, 이동 및 분비 억제 효과, 및 멜라닌의 합성에 관여하는 MITF 유전자 발현 감소 효과가 우수하여, 피부 미백 효과를 나타낼 수 있음을 규명하였다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 양태는 유산균 배양물의 혼합액을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

상기 화장품 조성물은 상술한 본 발명의 유산균 배양물 혼합액의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및/또는 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 “화장품학적 유효량”은 상술한 본 발명의 조성물의 피부상태 개선 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

상기 유산균은 락토바실러스 람노서스(Lacotbacillus rhamnosus), 락토바실러스 애시도필러스(Latobacillus acidophilus) 및 비피도박테리움 애니말리스(Bifidobacterium animalis)로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상일 수 있으며, 예를 들어, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 애시도필러스 및 비피도박테리움 애니말리스인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

따라서, 상기 유산균 배양물의 혼합액은 락토바실러스 람노서스 배양물, 락토바실러스 애시도필러스 배양물 및 비피도박테리움 애니말리스 배양물로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상이 혼합된 것일 수 있으며, 예를 들어, 락토바실러스 람노서스 배양물, 락토바실러스 애시도필러스 배양물 및 비피도박테리움 애니말리스 배양물이 혼합된 것일 수 있다.

상기 유산균 배양물 혼합액은 락토바실러스 람노서스 배양물, 락토바실러스 애시도필러스 배양물 및 비피도박테리움 애니말리스 배양물이 1:0.2 내지 5:0.2 내지 5의 부피로 혼합된 것일 수 있으며, 예를 들어, 1:0.2 내지 4:0.2 내지 4, 1:0.2 내지 3:0.2 내지 3, 1:0.2 내지 2:0.2 내지 2, 1:0.2 내지 1.8:0.2 내지 1.8, 1:0.2 내지 1.6:0.2 내지 1.6, 1:0.2 내지 1.4:0.2 내지 1.4, 1:0.2 내지 1.2:0.2 내지 1.2, 1:0.4 내지 1.2:0.4 내지 1.2, 1:0.6 내지 1.2:0.6 내지 1.2, 1:0.8 내지 1.2:0.8 내지 1.2 또는 1:1:1의 부피로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물에 포함된 유산균 배양물 혼합액의 농도는 0.01 내지 11 v/v%인 것일 수 있으며, 예를 들어, 0.01 내지 10, 0.1 내지 10, 0.5 내지 10, 1 내지 10, 2 내지 10, 3 내지 10, 4 내지 10, 5 내지 10, 6 내지 10, 7 내지 10, 8 내지 10, 9 내지 10 또는 10 v/v%인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 유산균 배양물 혼합액은 멸균된 상태일 수 있다.

상기 유산균 배양물 혼합액을 함유하는 화장료 조성물은 피부 미백 용도인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장품의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장품의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 화장품의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 유산균 배양물 혼합액과 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예를 들어, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태는 하기의 단계를 포함하는 유산균 배양물 혼합액의 제조방법에 관한 것이다.

유산균 배양물을 2 종 이상 제조하는 단계; 및

상기 제조된 유산균 배양물을 혼합하는 단계.

상기 유산균은 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 애시도필러스 및 비피도박테리움 애니말리스로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상일 수 있으며, 예를 들어, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 애시도필러스 및 비피도박테리움 애니말리스인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 유산균 배양물을 2 종 이상 제조하는 단계는 하기의 단계를 포함할 수 있다.

유산균을 배지에서 배양하여 제1 배양물을 수득하는 단계;

상기 제1 배양물을 배지에서 배양하여 제2 배양물을 수득하는 단계;

상기 제2 배양물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; 및

상기 상등액을 멸균하여 유산균 배양물을 수득하는 단계.

상기 유산균은 동결 건조된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 배지는 MRS 브로스(MRS broth) 배지일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 배지는 액체 배지일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 액체 배지는 고압멸균(autoclave), 예를 들면, 121 ℃에서 15 분간 멸균을 실시한 후, 15 내지 30 ℃로, 예를 들어, 20 내지 30, 25 내지 30, 25 내지 28, 26 내지 28 또는 27 ℃로 냉각시켜 사용할 수 있다.

상기 배양은 혐기적으로 정치하여 배양한 것일 수 있다.

상기 배양 온도는 30 내지 40 ℃인 것일 수 있으며, 예를 들어, 31 내지 40, 32 내지 40, 33 내지 40, 34 내지 40, 35 내지 40, 36 내지 39, 36 내지 38, 36 내지 37 또는 37 ℃인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 제1 배양물을 수득하는 단계의 배양 시간은 36 시간인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 제2 배양물을 수득하는 단계의 배양 시간은 48 시간인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 원심분리의 압력은 4500 rpm인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 원심분리의 시간은 1 내지 1.5 시간 또는 1 시간인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다

상기 멸균은 상등액을 필터링하는 방법으로 수행될 수 있다.

상기 필터링은 0.1 내지 0.2 μm, 예를 들면 0.2 μm 직경의 필터로 필터링하는 것일 수 있다. 상기 직경 범위보다 작은 직경의 필터를 사용하는 경우 균체가 분리되지 않을 수 있고, 상기 직경 범위보다 큰 직경의 필터를 사용하는 경우 균체 외에 유효성분이 함께 분리될 수 있다.

상기 제조된 유산균 배양물을 혼합하는 단계는 2 종의 유산균 배양물을 1:0.2 내지 5의 부피, 예를 들어, 1:0.2 내지 4, 1:0.2 내지 3, 1:0.2 내지 2, 1:0.2 내지 1.8, 1:0.2 내지 1.6, 1:0.2 내지 1.4, 1:0.2 내지 1.2, 1:0.4 내지 1.2, 1:0.6 내지 1.2, 1:0.8 내지 1.2 또는 1:1의 부피로 혼합하는 것일 수 있고; 3 종의 유산균 배양물을 1:0.2 내지 5:0.2 내지 5의 부피, 예를 들어, 1:0.2 내지 4:0.2 내지 4, 1:0.2 내지 3:0.2 내지 3, 1:0.2 내지 2:0.2 내지 2, 1:0.2 내지 1.8:0.2 내지 1.8, 1:0.2 내지 1.6:0.2 내지 1.6, 1:0.2 내지 1.4:0.2 내지 1.4, 1:0.2 내지 1.2:0.2 내지 1.2, 1:0.4 내지 1.2:0.4 내지 1.2, 1:0.6 내지 1.2:0.6 내지 1.2, 1:0.8 내지 1.2:0.8 내지 1.2 또는 1:1:1의 부피로 혼합하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

따라서, 상기 유산균 배양물을 2 종 이상 혼합하는 단계는 락토바실러스 람노서스 배양물, 락토바실러스 애시도필러스 배양물 및 비피도박테리움 애니말리스 배양물을 1:0.2 내지 5:0.2 내지 5의 부피로 혼합하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 유산균 배양물 혼합액을 대상에게 접촉시키는 단계를 포함하는 피부 미백 방법에 관한 것이다.

상기 대상은 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등을 포함하는 포유류일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 접촉은 유산균 배양물 혼합액을 상기 대상의 신체 상의 부위 또는 그 부근에 직접 접촉하는 것을 의미하며, 예를 들면, 유산균 배양물 혼합액을 인간의 피부에 도포하는 것을 의미한다.

상기 유산균 배양물 혼합액의 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략한다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 유산균 배양물 혼합액을 포함하는 조성물의 피부 미백 용도에 관한 것이다.

상기 유산균 배양물 혼합액 및 피부 미백 용도의 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략한다.

본 발명은 유산균 배양물 혼합액을 함유하는 화장료 조성물, 이의 제조방법, 이의 피부 미백 용도, 이를 이용한 피부 미백 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 락토바실러스 람노서스 배양물, 락토바실러스 애시도필러스 배양물 및 비피도박테리움 애니말리스 배양물이 혼합된 유산균 배양물 혼합액을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로, 멜라닌 생성, 이동 및 분비 억제 효과가 우수하므로, 피부 미백용 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 배양물 혼합액의 세포 내 멜라닌 생합성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 배양물 혼합액의 세포 외 멜라닌 이동 및 분비 억제 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 배양물 혼합액의 MITF 유전자 발현 감소 효과를 나타내는 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

제조예 1. 유산균의 분리 배양

본 발명의 조성물을 제조하기 위한 유산균은 자체적으로 분리 배양하였다.

구체적으로, 쌀(이천 임금님쌀, 농협, 한국)과 누룩(산성누룩, 농협, 한국)을 함유한 발효물을 제작하고, 이로부터 락토바실러스 람노서스 및 락토바실러스 애시도필러스를 분리 배양하였다. 비피도박테리움 애니말리스는 생후 1 개월 미만 신생아의 분변으로부터 분리 배양하였다.

배양 후, 1) 배양된 종균의 균체를 탈지유(Skim milk)와 혼합하여 분산시키고, 건조하여 앰플 형태로 보관하거나, 2) 배양액에 30% 글리세린을 함유하여 -70 ℃로 동결하여 보관하였다.

상기 락토바실러스 람노서스의 염기서열은 서열번호 1에, 락토바실러스 애시도필러스의 염기서열은 서열번호 2에, 비피도박테리움 애니말리스는 서열번호 3에 각각 나타내었다. 상기 유산균은 모두 표준균과 유전적 염기서열 유사성이 99% 이상이지만 표현형질이 다소 다른 특징을 가지고 있다.

제조예 2. 개별 유산균의 배양물 제조

비피도박테리움 애니말리스(Bifidobacterium animalis), 락토바실러스 람노서스(Lacotbacillus rhamnosus) 및 락토바실러스 애시도필러스(Latobacillus acidophilus)의 배양물을 제조하였다.

구체적으로, 플라스크에 MRS 브로스(MRS broth, Bacto-Difco) 및 물을 혼합하여 55 g/L 농도의 액체 MRS 브로스 배지를 제조하였다. 제조된 액체 MRS 브로스 배지를 121 ℃에서 15 분간 멸균을 실시하고, 27 ℃까지 냉각하였다.

그 다음, 각각의 액체 MRS 브로스 배지 250 mL에 제조예 1의 비피도박테리움 애니말리스, 락토바실러스 람노서스 및 락토바실러스 애시도필러스를 100 μL씩 접종한 후, 37 ℃에서 36 시간 동안 혐기적으로 정치 배양하였다. 배양액 전체를 액체 MRS 브로스 배지 1 L에 다시 접종하고, 37 ℃에서 48 시간 동안 추가 배양하였다. 배양이 완료된 후, 각각의 배양액을 4500 rpm 에서 1 시간 동안 원심분리하여 균체를 제거하였다. 균체가 제거된 배양물은 0.2 μm 직경의 필터(Bottle filter kit, Bacto-Difco)로 필터링하여 멸균을 실시하였다.

비교예 1. 비피도박테리움 애니말리스 배양물 제조

제조예 2의 필터링이 완료된 비피도박테리움 애니말리스 배양물을 이하 실시되는 실험에 사용하였다.

비교예 2. 락토바실러스 애시도필러스 배양물 제조

제조예 2의 필터링이 완료된 락토바실러스 애시도필러스 배양물을 이하 실시되는 실험에 사용하였다

비교예 3. 락토바실러스 람노서스 배양물 제조

제조예 2의 필터링이 완료된 락토바실러스 람노서스 배양물을 이하 실시되는 실험에 사용하였다.

실시예. 유산균 배양물의 제조

상기 제조예의 필터링이 완료된 비피도박테리움 애니말리스 배양물, 락토바실러스 람노서스 배양물 및 락토바실러스 애시도필러스 배양물을 1:1:1의 부피비로 혼합하여, 유산균 배양물 혼합액을 제조하였다.

실험예 1. 멜라닌 생합성 억제 효과 확인

쥐의 색소 세포인 B16-F10(Murine Melanoma) 세포(ATCC)를 10 % FBS를 포함하는 DMEM(HYCLONE) 2 ml 에 현탁시켜 웰당 1×105 세포로 6-웰 플레이트에 접종한 후, 세포가 웰 바닥에 40~50 % 부착될 때까지, 5% CO2, 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다.

배양 후, α-MSH를 0.1 μM 농도로 처리하고 각 시료를 농도 별(0.1 v/v%, 1 v/v% 및 10 v/v%)로 첨가한 후, 37 ℃에서 72 시간 동안 배양하여 멜라닌 생성을 유도하였다. 추가 배양 후, 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline; PBS, WELGENE)로 세척하고, 트립신(trypsin, Gibco)으로 회수하였다.

그 다음, 혈구계(hematocytometer, MARIENFELD)로 계수하여, 각 처리 그룹별로 동일한 세포 수(1×106 세포/mL)를 모아 1000 rpm, 10 분간 원심분리하여 세포만 얻었다. 회수된 세포를 60 ℃에서 1 시간 건조시킨 후, 10 % DMSO가 포함된 1 M NaOH 용액(Sigma aldrich) 100 μL를 넣어 세포 내의 멜라닌을 포함하는 용액을 얻었다. 이 용액을 마이크로플레이트 리더(Microplate reader, victor3)로 490 nm에서 흡광도를 3 회 측정하여, 멜라닌 생성 저해율을 평가하였다. 평가식은 하기 계산식 1과 같으며, 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다. 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 알려진 알부틴(100 ppm, Sigma aldrich)을 양성 대조군으로 사용하였다.

[계산식]

Melanin contents(%)=(각 시료 처리군의 평균 흡광도)/(α-MSH 처리군의 평균 흡광도)×100(%)

α-MSH 0.1 μM
(+)	알부틴(%)	비교예 1(%)			비교예 2(%)			비교예 3(%)			실시예(%)
(+)	알부틴(%)	0.1	1	10	0.1	1	10	0.1	1	10	0.1	1	10
100	65	101	102	85	105	104	85	102	103	67	105	93	60

표 1 및 도 1에서 확인할 수 있듯이, 비교예 1 내지 3의 유산균 배양물의 경우 1 v/v% 농도 처리 시, 멜라닌 억제 효과를 보이지 않았으나, 10 v/v% 농도로 처리 시, 멜라닌 생성 억제 효과를 보였다. 반면, 실시예의 유산균 배양물 혼합액은 1 v/v% 농도 처리 시부터 멜라닌 억제 효과를 보이며, 특히 10 v/v% 농도로 처리 시에는 각 유산균 배양물에 비하여 7-25 % 더 우수한 멜라닌 생성 억제 효과를 보임을 확인하였다.

실험예 2. 멜라닌 분비 억제 효과 확인

배양 후, α-MSH를 0.1 μM 농도로 처리하고 각 시료를 농도 별(0.1 v/v%, 1 v/v% 및 10 v/v%)로 첨가한 후, 5% CO2, 37 ℃에서 72 시간 동안 배양하여 멜라닌 생성을 유도하였다. 상기 배양물을 회수한 후, 1000 rpm, 10 분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 이 상등액을 마이크로플레이트 리더(Microplate reader, victor3)로 490 nm에서 흡광도를 3 회 측정하여 멜라닌 분비 억제능을 평가하였다. 평가식은 하기 계산식 2와 같으며, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다. 실험예 1과 마찬가지로, 알부틴(100 ppm, Sigma aldrich)을 양성 대조군으로 사용하였다.

[계산식 2]

α-MSH 0.1 μM
(+)	알부틴(%)	비교예 1(%)			비교예 2(%)			비교예 3(%)			실시예(%)
(+)	알부틴(%)	0.1	1	10	0.1	1	10	0.1	1	10	0.1	1	10
100	53	106	106	76	123	122	79	109	92	44	111	87	39

표 2 및 도 2에서 확인할 수 있듯이, 특히 실시예의 유산균 배양물 배양액을 10 v/v% 농도로 처리 시, 비교예 1 내지 3의 유산균 배양물의 10 v/v% 농도로 처리 시에 비하여, 5-40 % 더 우수한 멜라닌 이동/분비 억제 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 3. 세포 내 MITF 유전자 발현 억제 효과 확인

쥐의 색소 세포인 B16-F10(Murine Melanoma) 세포(ATCC)를 10 % FBS를 포함하는 DMEM(HYCLONE) 2 ml 에 현탁시켜 웰당 5×105 세포로 6-웰 플레이트에 접종한 후, 세포가 웰 바닥에 80 % 이상 부착될 때까지, 5% CO2, 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다.

배양 후, α-MSH를 0.1 μM 농도로 처리하고 각 시료를 1 v/v% 농도로 첨가한 후, 5% CO2, 37 ℃에서 24 시간 추가로 배양하여 멜라닌 생성을 유도하였다. 추가 배양 후, 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline; PBS, WELGENE)로 세척하고, 1 mL 트리졸(Trizol, TAKARA)로 회수하였다. 그 다음, 트리졸의 1/5 비율에 해당하는 0.2 mL 클로로폼(Chloroform, SAMCHUN)을 넣어 교반하고, 4 ℃에서 14000 rpm, 15 분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 동 상층액에 0.5 mL 이소프로판올(isopropanol, DUKSAN)을 넣고 10 분간 반응시킨 후, 14000 rpm, 15 분간 원심분리하여 침전물을 얻었다.

상층액을 제거하고, 200 μL 100 % 에탄올(EtOH, DUKSAN)을 이용하여 2 회 세척하였다. 세척한 침전물을 상온에서 완전히 건조시킨 후, 다이에틸파이로카보네이트수(diethyl pyrocarbonate-water; DEPC-water, Ambion) 20-30 μL에 녹였다. DEPC-water에 녹인 RNA를 정량 후, 각 그룹 당 RNA 동량을 사용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 타겟으로 시아닌 염료인 SYBR GREEN master mix(Applied Biosystems)를 사용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였다. PCR을 통하여, 최종적으로 MITF의 유전자 발현 정도를 평가하여 표 3에 나타내었다. 실험예 1과 마찬가지로, 알부틴(100 ppm, Sigma aldrich)을 양성 대조군으로 사용하였다.

	α-MSH 0.1 μM
MITF /β-actin	(+)	알부틴	비교예 1	비교예 2	비교예 3	실시예
MITF /β-actin	1.713	1.097	1.880	2.035	1.409	1.106

표 3 및 도 3에서 확인할 수 있듯이, 실시예의 유산균 배양물 혼합액 처리시, 비교예 1 내지 3의 유산균 배양물에 비하여, 우수한 MITF 발현 억제 효과가 있음을 확인하였다

소결

상기 내용을 종합한 결과, 본 발명의 화장료 조성물은 유산균 배양물 혼합액을 사용함으로써, 각각의 균주를 적은 양으로 사용함에도 다량의 단독 균주 사용 시와 유사한 수준 이상의 미백 효능을 나타내므로, 피부 미백 용도로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

<110> COSMAX, INC. <120> Cosmetic composition for skin whitening comprising a mixture of lactic acid bacteria culture <130> PXKR18-003_PN180025 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1400 <212> DNA <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 1 gttctgatta ttgaagggtg cttgcatctt gatttaattt tgaacgagtg gcggacgggt 60 gagtaacacg tgggtaacct gcccttaagt gggggataac atttggaaac agatgctaat 120 accgcataaa tccaagaacc gcatggttct tggctgaaag atggcgtaag ctatcgcttt 180 tggatggacc cgcggcgtat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa ggcaatgata 240 cgtagccgaa ctgagaggtt gatcggccac attgggactg agacacggcc caaactccta 300 cgggaggcag cagtagggaa tcttccacaa tggacgcaag tctgatggag caacgccgcg 360 tgagtgaaga aggctttcgg gtcgtaaaac tctgttgttg gagaagaatg gtcggcagag 420 taactgttgt cggcgtgacg gtatccaacc agaaagccac ggctaactac gtgccagcag 480 ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttat ccggatttat tgggcgtaaa gcgagcgcag 540 gcggtttttt aagtctgatg tgaaagccct cggcttaacc gaggaagtgc atcgaaaact 600 gggaaacttg agtgcagaag aggacagtgg aactccatgt gtagcggtga aatgcgtaga 660 tatatggaag aacaccagtg gcgaaggcgg ctgtctggtc tgtaactgac gctgaggctc 720 gaaagcatgg gtagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccatgccgta aacgatgaat 780 gctaggtgtt ggagggtttc cgcccttcag tgccgcagct aacgcattaa gcattccgcc 840 tggggagtac gaccgcaagg ttgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt 900 ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcttttg 960 atcacctgag agatcaggtt tccccttcgg gggcaaaatg acaggtggtg catggttgtc 1020 gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttatgacta 1080 gttgccagca tttagttggg cactctagta agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg 1140 gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggat 1200 ggtacaacga gttgcgagac cgcgaggtca agctaatctc ttaaagccat tctcagttcg 1260 gactgtaggc tgcaactcgc ctacacgaag tcggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcac 1320 gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gagagtttgt 1380 aacacccgaa gccggtggcg 1400 <210> 2 <211> 1460 <212> DNA <213> Lactobacillus acidophilus <400> 2 ccccattgcg gcggctatac atgcagtcga gcgagctgaa ccaacagatt cacttcggtg 60 atgacgttgg gaacgcgagc ggcggatggg tgagtaacac gtggggaacc tgccccatag 120 tctgggatac cacttggaaa caggtgctaa taccggataa gaaagcagat cgcatgatca 180 gcttataaaa ggcggcgtaa gctgtcgcta tgggatggcc ccgcggtgca ttagctagtt 240 ggtagggtaa cggcctacca aggcaatgat gcatagccga gttgagagac tgatcggcca 300 cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca 360 atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgaggtgaa gaaggttttc ggatcgtaaa 420 gctctgttgt tggtgaagaa ggatagaggt agtaactggc ctttatttga cggtaatcaa 480 cccagaaagt cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt 540 tgtccggatt tattgggcgt aaagcgagcg caggcggaag aataagtctg atgtgaaagc 600 cctcggctta accgaggaac tgcatcggaa actgtttttc ttgagtgcag aagaggagag 660 tggaactcca tgtgtagcgg tggaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg 720 cggctctctg gtctgcaact gacgctgagg ctcgaaagca tgggtagcga acaggattag 780 ataccctggt agtccatgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttgggaggt ttccgcctct 840 cagtgctgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac 900 tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac 960 gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatctt agtgcaatcc gtagagatac ggagttccct 1020 tcggggacac taagacaggt ggtgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg 1080 ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgtc attagttgcc agcattaagt tgggcactct 1140 aatgagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc atcatgcccc 1200 ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagtaca acgaggagca agcctgcgaa 1260 ggcaagcgaa tctcttaaag ctgttctcag ttcggactgc agtctgcaac tcgactgcac 1320 gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcacgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct 1380 tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt ctgcaatgcc caaagccggt ggcctaacct 1440 tcggaaggag ccgtctaagc 1460 <210> 3 <211> 1384 <212> DNA <213> Bifidobacterium animalis <400> 3 ggctcttctc aggttagtgt gtaaggatgt ctttgagttg gctgctgtgg atgaggcatc 60 gttggatgta gctggtggtg ttggcgaagc ccatggcgtt gccgcgcagg gtctcgagcc 120 tgccgttgat ggcttcggtg ggtccgttgc ttgagcgggg gtggcggaag agggcgagga 180 tgtcgcgcat gcgtcttttg agcacgcggc cgagggaggc gagttcccgg cagcctttgt 240 agcgccccgg tccggtcagg tcgtcgatca gctcgcgcat catgcgttcg ccgcgtcgcc 300 tgtcgtcgca ccggtaggcg tgtatgaccc tttggtaggc gtcgtgggcg agcatgaggt 360 cgcggttggc ctggatggcg aacagggcca tgagtctggc acggccgcgt gcgccgaggt 420 attcgtcgct ggtcagcagg gcgcgcctgc agtcgtagag cctgtcgccc ttgacaccgc 480 gcctgccggt ggcgtcgcgt tgcaggcggc agcgcacctt ggtgacgcgg gcggcggcca 540 gttgcacgac gtggaacggg tcgatgacct cgaccgcgtg gggcacgacg gattcgacgg 600 cctgcttcca gccggcgaac gcgtccatgg cgaccacccc gacgcgtctt gtgaactcgc 660 cgccgcgcgc ctgcatccat tcgcgaagca cctgggcgga acggcccggc accatgtcca 720 gcagtcttgc cggcctgccg tcgcaacgcg gggtcaggtc gacgatcacg gtcacgtacc 780 ggtcgccgaa cgcgccgtgg cgccacacgt gctcgtccac gccgatcgcg cgcaccgagg 840 agaaccggtc ggcctgctcg agcaacagca tgccccgctc gcgcaccgcc cggtcgacca 900 ccgcccatgc cacatgaagc agcctggcgc acgccgagac cgtcatcgag tccaggcaca 960 cgcgccgcag cgcccacatc accgccggca cgctcaacac gcccctgccg gcgcccaccg 1020 cctcaagatc atcgctccac gagcgtgagc acggcacgca ctcgtagcgg cgcacgcgca 1080 ccagcagatg caccgcgtcg tcgccgtagg gcacatgcgc cagcgtgcgc agccacgacg 1140 aacgcaccct ggcatacgcg ccgcacgagg ggcaccagcg cgcgtcgtgc gagtccggct 1200 cgcacctgat ctgccttaac cccgggccgt ccggcctgcc aagacgccgc cacgagagca 1260 cacgaagacc catctcatcc aaaccaagga aacgttgggg gtcgaacacg ctaaactcgg 1320 gttcaggccg tgtttcctca ttcaatttct ctatcacaca agcaatgatg aagcacggcc 1380 ctta 1384

Claims

유산균 배양물 혼합액을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 유산균 배양물 혼합액은 락토바실러스 람노서스 배양물, 락토바실러스 애시도필러스 배양물 및 비피도박테리움 애니말리스 배양물로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 혼합물로 이루어진 것인, 피부 미백용 화장료 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 유산균 배양물 혼합액은 락토바실러스 람노서스 배양물, 락토바실러스 애시도필러스 배양물 및 비피도박테리움 애니말리스 배양물이 1:0.2 내지 5:0.2 내지 5의 부피로 혼합된 것인, 피부 미백용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 화장료 조성물에 포함된 유산균 배양물 혼합액의농도는 0.1 내지 10 v/v%인 것인, 피부 미백용 화장료 조성물.
하기의 단계를 포함하는 유산균 배양물 혼합액의 제조방법:
유산균 배양물을 2 종 이상 제조하는 단계; 및
상기 제조된 유산균 배양물을 혼합하는 단계.
제 5 항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 애시도필러스 및 비피도박테리움 애니말리스로 이루어진 군에서 선택된 것인, 제조방법.
제 5 항에 있어서, 상기 유산균 배양물을 2 종 이상 제조하는 단계는 하기의 단계를 포함하는 것인, 제조방법:
유산균을 배지에서 배양하여 제1 배양물을 수득하는 단계;
상기 제1 배양물을 배지에서 배양하여 제2 배양물을 수득하는 단계;
상기 제2 배양물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; 및
상기 상등액을 멸균하여 유산균 배양물을 수득하는 단계.
제 5 항에 있어서, 상기 유산균 배양물을 혼합하는 단계는 락토바실러스 람노서스 배양물, 락토바실러스 애시도필러스 배양물 및 비피도박테리움 애니말리스 배양물을 1:0.2 내지 5:0.2 내지 5의 부피로 혼합하는 것인, 제조방법.