KR20190098314A - 황칠나무 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 남성 갱년기 증후군 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

황칠나무 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 남성 갱년기 증후군 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 황칠나무 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 남성 갱년기 증후군 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 꽃송이 버섯 균주(Sparassis latifolia) CLM1(KACC93185P)를 이용하여 황칠나무 추출물을 발효시킨 황칠나무 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 남성 갱년기 증후군의 예방 또는 치료용 조성물은 체내 테스토스테론 레벨을 상승시킬 수 있다. 이를 통하여, 근력 감소 및 피로 등을 포함하는, 남성 갱년기로 인해 유발되는 증상을 완화시킬 수 있으므로, 남성 갱년기 장애, 남성 질환의 예방, 개선 및 치료를 목적으로 의료산업 및 식품산업 분야에서 이용될 수 있다.

Description

황칠나무 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 남성 갱년기 증후군 예방 및 치료용 조성물 {COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING ANDROPAUSE COMPRISING DENDROPANAX MORBIFERA LEV. FERMENTATED EXTRACT}
본 발명은 황칠나무 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 남성 갱년기 증후군 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 버섯 균주(Sparassis latifolia) CLM1(KACC93185P)를 이용하여 황칠나무 추출물을 발효시킨 황칠나무 발효 추출물을 유효성분을 포함하여 테스토스테론(testosterone)의 분비를 촉진시킴으로써 남성 갱년기 장애 개선, 남성 갱년기 질환을 예방 및 치료할 수 있는 약학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.
여성은 폐경기가 오며 여성 호르몬이 급격히 감소하여 여러 가시적인 변화가 일어나게 되는데, 이를 갱년기라 한다. 통상 갱년기란 용어는 여성에 한정되어 사용되었으나, 근래에는 남성에서도 노화에 따른 체내 남성 호르몬의 점진적 감소로 인한 내분비 변화로 남성 갱년기 증후군의 개념이 대두되고 있다. 실제 남성 갱년기의 증상은 전립선 선암종 치료를 위한 화학적 또는 외과적 거세로부터 발생하는 증상과 유사하다. 정식 용어로는 2004년 국제남성노화학회(International Society for the Study of the Aging Male)에서 결정된 용어인 '후기발현 남성 성선기능저하증(late-onset hypogonadism, LOH)', '가령성 테스토스테론결핍증후군(ageassociated testosterone deciency syndrome, TDS)'이 있다. 남성갱년기 장애(Andropause)는 연령의 증가와 관련된 임상적 및 생화학적 증후군으로 전형적인 증상 및 혈청 테스토스테론 수준의 결핍으로 정의되고 있으며, 여러 신체기관의 기능에 부정적인 영향을 초래할 수 있다. 동반되는 증상으로는 성욕 및 발기 기능의 저하, 밤 시간 동안의 우울, 인지 능력의 감소, 피로, 체중 및 근육량의 감소, 피부위축 등의 예를 들 수 있다.
치료를 위해서는 폐경기 여성에 에스트로겐 대체 요법을 사용하는 것과 유사한 방식으로 남성 호르몬 대체 요법의 사용 가능성이 주장되고 있다. 한 연구에 따르면, 남성 갱년기 환자들을 테스토스테론 운데카노에이트 40 X 2㎎/일로 치료하는 경우 상당한 개선 효과가 얻어지는 것으로 보고된 바 있다. 그러나, 남성 호르몬의 투여는 간, 지질 상태, 심혈관 및 전립선 질환 등에 역효과를 미칠 수 있다는 위험성 또한 보고되어 있다. 또한, 선종 및 선암종에 비추어, 남성 갱년기에 기인하는 증상들을 갖는 환자의 약 30%는 남성 호르몬 대체 요법을 받을 수 없는 것으로 알려져 있다. 따라서, 호르몬 대체 요법의 단점을 제공하지 않는, 노화에 의한, 또는 화학적이나 외과적인 거세에 의해 유발된 남성 갱년기 증후군의 예방 및 치료에 유용한 신규 치료제의 개발이 필요하다.
따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 천연물질을 포함하는 남성 갱년기 증후군의 예방 또는 개선을 위한 조성물을 제공하기 위한 것이다.
상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 꽃송이 버섯 균주(Sparassis latifolia) CLM1(KACC93185P)를 이용하여 황칠나무 추출물을 발효시킨 황칠나무 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 남성 갱년기 증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 꽃송이 버섯 균주(Sparassis latifolia) CLM1(KACC93185P)를 이용하여 황칠나무 추출물을 발효시킨 황칠나무 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 남성 갱년기 증후군의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "남성 갱년기 증후군"이란 남성 갱년기로 인해 유발되는 증후군, 남성 갱년기 장애 및 남성 갱년기로 인한 질환을 포함한다. 예를 들면, 호르몬 변화로 인한 기분변화, 수면장애, 체중 및 근육량의 감소, 근력 저하, 내장지방 증가, 성기능 장애, 인지능력 저하, 피로 및 우울증 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 남성 갱년기 증후군은 노화에 의해 유도되거나, 화학적 또는 외과적 거세에 의해 유도된 것일 수 있다.
본 발명에서 황칠나무(Dendropanax morbifera Lev.)는 우리나라의 남부 해안 지역과 제주도에서 자생하는 상록활엽교목으로 겨울에도 낙엽이 지지 않는 수종으로 수피에 상처를 주면 황색의 수지액이 나오는데 이것을 황칠(黃漆)이라고 한다. 황칠은 삼국시대부터 황제의 갑옷, 투구, 기타 금속 장신구의 황금색을 발하는 진귀한 도료로 이용되어 왔으며 고려시대에 쓰여진 고려사절요, 중국의 계림유사, 계림지, 해동역사에 황칠의 채취시기, 사용용도 등이 기록되어 있으며 그 이전인 백제의 특산품이었다는 것이 당나라 역사서인 책부원구, 통전에 남아있다. 이시진의 본초강목에는 황칠나무가 번열 제거, 안질 및 화상치료, 나병에 효과가 있으며 무해하다고 기록되어 있다.
황칠나무 잎, 뿌리, 종자 및 줄기의 추출물은 예로부터 간 기능개선, 심혈관계기능개선, 신경안정, 항암, 항당뇨, 항산화 및 경 조직개선 등의 약리작용을 나타내는 것으로 보고되었고, 주요 기능성 성분은 세스퀴테르펜류 화합물인 α-쿠베넨, β-엘레멘, β-구르주넨, 게르마크렌 D, 엘리센, β-큐베벤, β-셀린넨, γ-셀린넨, α-무로렌, γ-카디넨, δ-카디넨, 주니러 캠퍼 등과 같은 세스퀴테르펜류 화합물과 스테로이드인 β-시토스테롤과 폴리페놀류들이 보고되었다. 약용 식물의 대부분 유효 약재 성분은 폴리페놀 성분으로 분자량이 커서 세포내 흡수가 어렵다. 또한 식물 추출물은 그 자체가 가지고 있는 독성으로 인해 단순 추출물을 음용시 인체의 간에 해독효과를 나타낸다.
본 발명에서는 황칠나무의 잎, 뿌리, 종자 및 줄기 중 어느 부위를 사용해도 무방하다.
본 발명에 있어서, "황칠나무 추출물"은 황칠나무를 통상의 방법에 의하여 추출한 추출물로서, 황칠나무로부터 추출한 추출액뿐만 아니라 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다.
상기 황칠나무 추출물은 물 또는 유기 용매를 사용하여 추출할 수 있는데, 추출한 액은 액체 형태로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 상기 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매이며, 추출물의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 하나의 구체적 실시에서, 황칠나무 추출물은 열수 추출물로서 100 내지 120℃에서 추출한다.
상기 추출 방법은 제한되지 않고, 예를 들어, 냉침추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 황칠나무 추출물은 황칠나무에 10 내지 20배 부피의 물을 넣고 100 내지 120℃에서 5 내지 7시간 동안 추출한 열수 추출물이다.
본 발명의 황칠나무 추출물은 추출, 분획, 또는 정제(분리, 분획)의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획, 정제물, 그들의 희석액, 농축액, 또는 건조물일 수 있다.
본 발명에 있어서, "황칠나무 발효 추출물"은 상기 황칠나무 추출물을 꽃송이 버섯 균주(Sparassis latifolia) CLM1(KACC93185P)로 발효한 것을 말한다.
본 발명에서 사용하는 꽃송이 버섯 균사체는 본 발명자들에 의해 동정된 균주로서 대한민국 등록특허 제10-1594511호(등록일자 2016년 02월 05일)에 기술된 "고함량의 베타-글루칸을 함유하는 신규한 꽃송이 버섯 균주(Sparassis latifolia) CLM1"이다.
상기 발효는 꽃송이 버섯 균주(Sparassis latifolia) CLM1(KACC93185P)를 접종한 황칠나무 추출물을 25 내지 30℃에서 8 내지 12일 동안 발효시키는 것이다. 발효 온도가 25℃ 미만인 경우에는 발효가 충분히 일어나지 않거나 발효에 오랜 시간이 소요되므로 비효율적이고, 발효 온도가 30℃ 초과하는 경우 꽃송이 버섯 균주(Sparassis latifolia) CLM1(KACC93185P)의 활성이 저하될 수 있어 발효가 충분히 일어나지 않을 수 있으므로, 발효는 25 내지 30℃의 온도에서 하는 것이 바람직하다. 또한 발효 시간이 8일 미만인 경우에는 황칠나무 추출물의 발효가 충분히 일어나지 않아 제조된 황칠나무 발효 추출물이 변비의 개선, 예방 또는 치료 효과를 충분히 발휘할 수 없으며, 발효 시간이 12일을 초과하는 경우에는 그 이하의 시간 동안 발효하는 것과 발효 효율에 차이가 없어 비경제적이다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 황칠 추출물을 발효 시 한약재 추출물을 추가로 첨가할 수 있으며, 이의 예로서 오가피, 인삼, 백출, 당귀, 백작약, 천궁, 백복령, 감초, 숙지황, 황기, 육계 등을 2종 이상 첨가할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
본 발명의 황칠나무 발효 추출물은 상기 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 내지 50중량%의 함량, 바람직하게는 0.1 내지 50중량%의 함량, 보다 바람직하게는 1 내지 50중량%의 함량으로 함유될 수 있으며, 조성물이 개체에 투여되거나 개체가 섭취할 시 개체의 kg당 100 내지 300mg, 바람직하게는 150 내지 300mg이 투여 또는 섭취될 수 있도록 당업자에 의하여 적절히 조절될 수 있음은 물론이다. 다만, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
상기 개체는 인간을 포함한 원숭이, 쥐, 말, 소, 돼지 등의 포유동물이며, 바람직하게는 변비를 예방하거나 개선하거나 치료하고자 하는 동물이다.
하나의 구체적 실시에서, 본 발명의 황칠나무 발효 추출물은 은 체내 테스토스테론 분비를 증가시킬 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기와 같은 제조방법에 따라 제조된 황칠나무 발효 추출물을 포함함으로써, 테스토스테론의 분비 감소로 인해 유발되는 남성 갱년기 증후군의 예방, 개선 또는 치료에 이용될 수 있다.
본 발명에서 남성 갱년기 증후군은 남성 갱년기로 인해 유발되는 증후군, 남성 갱년기 장애 및 남성 갱년기로 인한 질환을 포함한다. 예를 들면, 호르몬 변화로 인한 기분변화, 수면장애, 체중 및 근육량의 감소, 근력 저하, 내장지방 증가, 성기능 장애, 인지능력 저하, 피로 및 우울증 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 남성 갱년기 증후군은 노화에 의해 유도되거나, 화학적 또는 외과적 거세에 의해 유도된 것일 수 있다.
본 발명의 하나의 구체적 용도로서, 본 발명의 조성물은 남성 갱년기 증후군을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약학적 조성물로 사용되는 경우, 유효성분으로서 황칠나무 발효 추출물 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물(예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름(예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
상기 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태 등의 요인에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001 내지 300㎎/kg 범위 내이다. 다만, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
본 발명의 다른 하나의 구체적 용도로서, 본 발명의 조성물은 남성 갱년기 증후군을 예방 또는 개선하기 위한 식품 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 사용되는 경우, 유효성분으로서 황칠나무 발효 추출물 이외에 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)] 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 본 발명의 황칠나무 발효 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 황칠나무추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 상술한 성분 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일쥬스, 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 황칠나무 발효 추출물은 독성이 없어 장기간 사용시에도 안심하고 사용할 수 있으므로, 약품이나 식품에 안전하게 사용할 수 있다.
본 발명에서는 황칠나무 추출물을 버섯 균사체를 이용 발효함으로서 해독과 소화 흡수율을 높이고 균사체가 발효중 생산하는 베타 글루칸 성분을 추가하여 면역력을 높이고 갱년기 호르몬 분비를 향상시켜 남성 갱년기 개선용 음료를 개발하는데 있다.
이와 같이, 본 발명의 일 측면에 따른 황칠나무 발효 추출물을 포함하는 조성물은 체내 테스토스테론 레벨을 상승시킬 수 있다. 이를 통하여, 근력 감소 및 피로 등을 포함하는, 남성 갱년기로 인해 유발되는 증상을 완화시킬 수 있으므로, 남성 갱년기 장애, 남성 질환의 예방, 개선 및 치료를 목적으로 의료산업 및 식품산업 분야에서 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 측면에 따른 황칠나무 발효 추출물을 포함하는 조성물은 정상세포의 세포사멸(apoptosis)을 유도하지 않아 인체에 대한 안전성이 우수하므로, 안전한 의약 또는 식품 첨가물로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 측면에 따른 황칠나무 발효 추출물을 포함하는 조성물은 천연 식물 유래 추출물을 포함함으로써, 기존 화학물질을 포함하는 조성물에 비해 독성 및 부작용으로 인한 문제를 저감시킬 수 있다.
도 1은 황칠나무 발효 추출물의 제작공정을 나타낸 것이다.
도 2는 꽃송이 버섯 균주(Sparassis latifolia) CLM1의 사진이다.
도 3은 배지에 따른 황칠나무 발효 추출물의 액체 배양 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 황칠나무 추출
황칠나무의 유효성분을 추출하기 위한 최적 추출법에 대한 연구를 실시하였다. 미생물 발효 및 식품으로 가공하기에 적합한 상태로 추출할 수 있는 열수추출을 진행하였으며, 성분의 분해 및 손실을 줄이면서 황칠나무의 고유성분을 고스란히 포함하는 추출법으로, 건조 황칠나무에 10-20배 부피의 물을 넣고 110℃에서 5-7시간 동안 추출하였다.
<실시예 2> 황칠나무 추출물 발효용 버섯균사체 종균 선별
황칠나무 발효에 적합한 최적 미생물을 선별하기 위하여, 황칠나무 추출물을 성분으로 하는 PDME 배지에서 생육이 우수한 종균을 선발하였다. 선발에 사용한 버섯 종균은 꽃송이버섯, 영지버섯, 말굽버섯, 표고버섯, 느타리버섯, 상황버섯 등으로 본 실험실에서 분리 동정 보관 중인 균사체들을 이용하였다. 10-20% 황칠나무 추출액에 2% 덱스트로스와 0.2% 감자전분, 0.1% 말트 익스트렉트(malt extract), 0.1% 효모추출액(yeast extract), 0.2% KH2HPO4, 0.005% MgSO4, 1.5% 한천(agar)을 첨가한 배지를 PDME+ 황칠나무 발효 추출물첨가배지, 황칠액 대신 증류수를 첨가한 배지를 PDME+증류수 발효액 배지로 하고, 이들을 121℃에서 20분간 멸균하여 사용 하였다. 실험 방법은 한천 배지상에 상기 버섯 균사체들을 0.5cm x 0.5cm 되게 잘라 올려 놓은 후 25℃에서 7-10 일간 배양하면서 생육 여부를 확인하였다. 실험한 버섯 균사체중 꽃송이 버섯 균사체가 가장 생육이 우수하였다. 꽃송이 버섯 균사체는 본 연구자들이 이미 생물자원센터에 기탁한 균으로(기탁번호 KACC93185P) "고함량의 베타-글루칸을 함유하는 신규한 꽃송이 버섯 균주(Sparassis latifolia) CLM1" 특허 등록 된 균이다(등록특허 10-1594511, 등록일자 2016년02월05일). 이전 실험 결과에 의하면 꽃송이 버섯 균주(Sparassis latifolia) CLM1은 4종의 분리된 꽃송이 버서 균주중 생육이 가장 빠르게 생육하고 균사체 배양 할 때 베타 글루칸 함량이 25-30% 수준으로 가장 우수한 균주였다. 도 2는 꽃송이 버섯 균주(Sparassis latifolia) CLM1의 사진이다.
<실시예 3> 황칠나무 발효 추출물 제조
상기 실시예 1에서 고압 추출기를 이용하여 추출한 황칠나무 추출물에 꽃송이 버섯 균주(Sparassis latifolia) CLM1를 접종하고, 25-30℃에서 10일(240시간) 동안 발효를 진행하였다. 실험용 시료는 위 추출물을 0.8um, 0.45um, 0.2um 주사 여과기를 이용하여 순차적으로 필터링하여, 포함된 이물질 및 미생물을 제거하여 사용하였다. 분석용 샘플은 감압농축기로 농축하여 동결건조시킨 후 분말화하여 사용하였다. 황칠 추출물 및 발효물의 에탄올 추출 샘플은 분별깔때기를 이용하여 분별하여 상층만 취하였다.
황칠나무 추출은 황칠나무 부피의 10-20배 중량의 정재수를 첨가한 후 105-127℃에서 2-7시간 추출하는 것이 가장 바람직하였다.
도 1은 황칠나무 발효 추출물의 제작공정을 나타낸 것이다. 황칠나무 추출물 발효법은 주로 유산균이나 효모를 이용하고 있으나 버섯 균사체를 이용하는 것은 보고되지 않았다.
본 발명에서 선택한 꽃송이 버섯의 자실체에는 베타 글루칸 함량이 46%(건물중 대비)로 지금 보고된 버섯 중 가장 높다.
황칠 추출물의 장점에 버섯의 장점을 더한 기능성 음료를 개발하기 위하여, 이에 황칠 추출물 발효에 가장 적합한 버섯 균주를 선별하기 위하여 본 연구실에서 분리 동정하여 보유중인 영지버섯, 말굽버섯, 꽃송이버섯, 상황버섯, 댕구알 버섯등의 균사체를 이용 예비 실험한 결과 꽃송이 버섯이 가장 우수하였다. 이전 실험 결과에 의하면 꽃송이 버섯 균주(Sparassis latifolia) CLM1 균주는 4종의 분리된 꽃송이 버섯 균주 중 생육이 가장 빠르게 생육하고 균사체 배양을 할 때 베타 글루칸 함량이 25-30%를 분비하는 가장 우수한 균주였다. 꽃송이 버섯 균주는 본 연구자들이 이미 생물자원센터에 기탁한 균으로(기탁번호 KACC93185P) "고함량의 베타-글루칸을 함유하는 신규한 꽃송이 버섯 균주(Sparassis latifolia) CLM1"로 특허 등록된 균이다(등록특허 10-1594511, 등록일자 2016년02월05일). 이 균주를 황칠 추출물 발효에 사용하였다. CLM1 균주는 황칠이 첨가된 배지에서도 7-10일에 전체 성장함을 알 수 있었다. 도 2는 꽃송이 버섯 균주(Sparassis latifolia) CLM1의 사진이다.
하기 표 1은 배지 종류와 배양기간에 따른 균사체의 길이를 나타낸 것이다.
배지조성 2 day 4 day 6 day 8 day 10 day
PDME+증류수 4 mm 20 mm 50 mm 70 mm 73 mm
PDME+황칠추출액 3.5 mm 18 mm 49 mm 68 mm 71 mm
액체 배양 후 증류수를 첨가한 배지에서는 색소(pigment) 생성이 적었으나, 황칠나무 발효 추출물을 첨가한 배지에서는 색소 변화가 크게 있음을 보여주고 이는 황칠 추출물을 발효로 할 때 다양한 색소가 생성을 알 수 있다. 도 3은 배지에 따른 황칠나무 발효 추출물의 액체 배양 결과를 나타낸 것이다. 여기에서, Spara A: PDME 배지에 증류수로 배양한 것이고, Spara B: PDME 배지에 황칠나무 추출물을 배양한 것이다.
<시험예 1>
(1) HPLC 분석을 통한 유기산 측정
발효 전후 황칠나무 추출물의 유기산 성분을 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하여 정량한 결과, 발효가 진행되면서 변화하는 유효 유기산의 증감을 확인할 수 있었으며, 특히 젖산 및 아세트산의 함량이 크게 증가함을 확인하였다. 유기산 분석은 컬럼은 Two Shim-pack SCR-102H(300X8.0 mm)/Shim-pack Guard Column SCR-102H(50X6.0 mm) 컬럼을 이용하였으며, 이동상 용매로는 4 mM p-톨루엔 설폰산을 사용하였다. 주입용량은 20 ㎕, 작동온도 40℃, 유속 0.7ml/min, 반응 용매로는 16 mM Bis-Tris 수용액(4 mM p-톨루엔 설폰산 및 100 μM EDTA 함유)를 이용하였으며, 열전도성 검출(Electroconductivity detection)을 통해 시트르산, 타타르산, 말산 등을 분석하였다.
(2) 글루칸(β-glucan) 함량 측정
황칠 추출물을 CLNM1 균으로 PDME 액체 배지에서 배양한 다음 동결 건조한 후 Megazyme mushroom 및 효모 베타-글루칸 키트(K-YBGL, Megazyme, Wicklow, Ireland)를 이용하여 β-글루칸 함량을 분석하였다. 황칠 추출물 발효에서 생성된 β-글루칸 함량은 증류수를 사용한 대조구 거의 유사하였다. 이는 황칠 추출물이 β-글루칸 생성에 영향이 없음을 시사한다.
(3) 황칠나무 발효 및 실험용 시료의 제조
상기 방법대로 고압 추출기를 이용하여 추출한 황칠나무 추출물에 꽃송이 버섯 균주(Sparassis latifolia) CLM1 균주를 접종하고, 25-30℃에서 10일 동안 배양하였다. 실험용 시료는 위 추출물을 0.8um, 0.45um, 0.2um 주사기 여과기 를 이용하여 순차적으로 필터링하여 사용하였다. 분석용 샘플은 감압농축기로 농축하여 동결건조 시킨 후 분말화하여 사용하였다. 황칠추출물 및 발효물의 에탄올 추출 샘플은 분별깔때기를 이용하여 분별하여 상층만 얻어내었다.
(4) 항산화 효과 분석
황칠나무 발효 추출물의 항산화 효과를 검증하기 위하여 ABST 라디칼 소거 및 DPPH 소거능 활성, 총 폴리페놀, 총 폴라보노이드 함량을 측정하였다. 발효 전ㅇ후의 황칠 시료는 동일한 열수추출물을 동결건조하여 -20℃ 냉동고에 보관하고 분주하여 사용하였다.
가) ABTS+ 라디칼 소거능 분석
ABTS+ 라디칼 소거활성은 Re R (Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Rice-Evans C. 1999. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic Biol Med. 1999 May;26(9-10):1231-7.)의 방법을 변형하여 측정하였다. 7mM ABTS 50ml (3.84g/L) 및 2.4mM 과황산 칼륨 50ml(0.648g/L)을 제조한 후 혼합하여 16시간동안 암실에 반응시켰다. 생성된 ABTS+를 흡광도가 1.5 미만이 되도록 희석하고, 희석된 ABTS+ 900ul과 1mg/ml로 희석한 시료를 100ul 첨가하고 실온에서 30분간 반응시킨 후 734nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 1mg/ml 아스코브산을 사용하고 실험은 총 3회 실시하여 평균값을 내었다.
나) DPPH 라디칼 소거능 분석
DPPH 라디칼 소거능 확인은 Blois의 방법(MARSDEN S. BLOIS. 1958. Antioxidant Determinations by the Use of a Stable Free Radical. Nature 26:1199-1200)에 준하여 측정하였다. 대조구로 아스코브산(Sigma, USA)를 사용하여 측정하였다. L-아스코브산을 증류수에 희석하여 1mg/ml 농도로 만들고 시료도 동일 농도로 만든 후, L-아스코브산을 농도별로 희석하여 준비하였다. 샘플과 시약들을 아래의 용량대로 혼합 후, 혼합된 시료를 빛이 들지 않는 실온에서 20분간 반응, 반응이 끝난 시료를 96well plate에서 517nm 파장에서 관찰하였다. DPPH 라디칼 소거능 확인실험에 사용된 샘플은 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.
용량 CON 1 2 3 4 5
ascorbic acid ul 0 20 40 60 80 100
D.W ul 100 80 60 40 20 0
0.01M DPPH ul 900
sample ul 각각 100ul
(5) 총 폴리페놀 함량 측정
총 폴리페놀의 함량을 측정하기 위하여 황칠나무 발효 추출물 0.1 mL에 7% Na2CO3 (Sodium carbonate, Sigma-Aldrich) 용액 2 mL을 혼합하고 3분 후 1 N의 Folin-Ciocalteu's phenol reagent (F9252, Sigma-Aldrich)를 0.1 mL 첨가하여 실온에서 30 분 동안 반응시킨 후 UV/가시 분광광도계로 750 nm에서 흡광도를 측정하여 서로 비교하였으며, 갈산(Sigma-Aldrich)을 표준물질로 하여 작성한 검량선에 대입하여 건조 시료 1 g에서 용출되는 총 폴리페놀의 함량을 갈산 기준으로 구하였다.
(6) 총 플라보노이드 함량 측정
총 플라보노이드 함량은 Moreno 방법을 이용하여 측정하였다(Moreno et al., 2000). 황칠나무 발효 추출물 0.5mL 농도의 시료액에 10% 질산 암모늄 0.1 mL과 1 M 아세트산 칼륨 0.1 mL 및 에탄올 4.3 mL를 차례로 가한 후 혼합하여 실온에서 40분간 방치하고 마아크로플레이트 리더를 이용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 쿼세틴(Sigma)을 표준물질로 사용하여 0∼100 ㎍/mL 농도범위에서 얻은 표준검량선으로부터 황칠나무 발효 추출물의 총 플라보노이드 함량을 측정하고 그 결과를 쿼세틴에 대한 상당량(quercetinequivalent (㎍/ml))으로 계산하였다(Kim, 2013; Pyo, 2009).
(7) 결과
액체 배양 후 균사체를 냉동 건조한 후 베타 글루칸 함량을 측정한 결과 증류수로 배양한 것이나 황칠나무 발효 추출물을 사용 배양한 것에 큰 차이 없이 건물 균사체에 약 29%가 함유 되어 있고 상등액에는 1% 미만이었다(표 3). 황칠나무 발효 추출물의 균사체 배양액의 항산화 능력을 비교한 결과 ABTS 라디칼 소거능(표 4)과 DPPH 라디칼 소거능(표 5)은 증류수로 발효한 것 보다 황칠 추출물로 발효한 것에서 높았다.
시료 건물 균사체 배양상등액
PDME+증류수 발효액 28.6 0.9
PDME+황칠 발효 추출물 28.3 0.7
시료 소거율(%)
PDME+증류수 발효액 0.68
PDME+황칠나무 발효 추출물 0.71
시료 소거율(%)
PDME+증류수 발효액 0.18
PDME+황칠나무 발효 추출물 0.24
균사체 배양액 중의 총 폴리페놀 함량은 황칠나무 발효 추출물에서 2.3 배 증가하였고 플라보노이드 함량은 2배 증가하였다. 이는 황칠나무 발효 추출물의 효과 때문인 것으로 사료된다(표 6 및 표 7).
시료 폴리페놀함량
PDME+증류수 발효액 300
PDME+황칠나무 발효 추출물 700
시료 플라보노이드함량
PDME+증류수 발효액 150
PDME+황칠나무 발효 추출물 300
<시험예 2> 세포 수준에서 황칠 균사체 발효액의 효과 측정
(1) 세포독성 확인
황칠 추출물 및 발효물에 대한 효과검증 이전에, 인체 유래 세포주인 HEK-293 세포에 대한 세포독성 확인을 위한 MTT assay를 실시하였다. HEK-293 세포에 250, 500, 1000ug/ml 농도로 황칠나무 발효 추출물을 처리하여 확인한 결과, 대조구와 비교하여 흡광도 값에서 큰 차이를 보이지 않았다. 이로써, 황칠나무 발효 추출물이 세포독성을 일으키지 않음을 확인할 수 있었다.
(2) 세포 수준에서 호르몬 분석
프로게스테론과 테스토스테론 분비량은 쥐의 정소(testis) 간질 조직의 세포(TM-3 cell)를 1x105cells/well로 분주하여 배양한 후, 5, 10, 25, 50, 100ug/mL 농도별로 황칠나무 추출물과 발효물을 처리하여, 24시간 동안 반응시켰다. 이후 각 각의 well에서 동량의 배지를 취하여 원심분리하여 상층을 96well plate로 옮기고, 지침에 따라 진행하여 분비량을 측정하였다.
가) 프로게스테론과 테스토스테론 정량
프로게스테론과 테스토스테론 호르몬의 측정은 ABcam의 프로게스테론 ELISA kit(ab108670)의 지침에 따라 진행하였다.
(3) 결과
황칠 추출물 발효액의 HEK-293 세포를 이용한 MTT assay 결과 세포에 독성이 없음을 확인할 수 있었다(표 8).
시료 control 250 500 1000
PDME+증류수 발효액 100 100 99.7 99
PDME+황칠나무 발효 추출물 100 100 99.5 99
황칠나무 발효추출물의 TM-3 cell에서 여성 호르몬인 프로게스테론 호르몬 농도를 측정한 결과 증류수에 의한 감소 효과 보다 약 1.8배 더 감소함을 보여 주었다. 이에 반해서 남성 호르몬인 테스토스테론은 약 40% 증가함을 보여 주었다.
프로게스테론은 여성호르몬으로 알려져 있지만, 남성에게도 소량 분비되며, 남성 갱년기에 남성호르몬의 분비가 줄면서 상대적으로 증가하는 호르몬으로 이 프로게스테론 분비 농도의 감소로 남성갱년기 개선에 효과가 있음을 확인하였다.
반면, 프로게스테론 호르몬과 상반되게 남성호르몬인 테스토스테론 호르몬 분비의 증가로, 황칠나무 발효 추출물이 남성갱년기 개선효과가 있음을 보여주는 것이다(표 9 및 표 10).
배지 종류 control 5ug/ml 10ug/ml 25ug/ml
PDME+증류수 발효액 0.52 0.34 0.31 0.41
PDME+ 황칠나무 발효 추출물 0.52 0.18 0.13 0.24
시료 control 5ug/ml 10ug/ml 25ug/ml
PDME+증류수 발효액 0.42 0.84 0.91 0.88
PDME+ 황칠나무 발효 추출물 0.42 1.3 1.5 1.4
<시험예 3> 동물 수준에서 황칠나무 발효액 효과 측정
(1) 성기능 개선 모델
약 8 주령의 SD rat을 실험동물로 사용하였으며, 발기부전 유도를 위해 시메티딘(cimetidine)을 실험동물의 체중 kg당 800 mg을 1일 1회 4주간 복강에 주사하고, 생리식염수 대신 25% 에탄올을 4주간 섭취시켜 발기부전 및 호르몬 분비 감퇴를 유도하였다. 시료투여는 체중 kg당 100mg을 에탄올 투여 2주차부터 1일 1회 3주간 경구 투여하였다. 시료 투여가 끝나면 에테르로 흡입마취하여 체중 및 생식장기(정소, 부정소, 정낭)를 부검하고 정자수 변화를 확인하고, 음경해면체를 적출하여 효소원 제조 및 아질산염 함량 및 글루타티온 함량, 과산화지질 함량을 측정하였다. 또한, 혈액채취 후 테스토스테론 및 프로게스테론 호르몬을 정량하였다.
가) 프로게스테론과 테스토스테론 함량 측정
프로게스테론과 테스토스테론 함량 측정은 ABcam의 프로게스테론 ELISA kit (ab108670)의 지침에 따라 진행하였다. 4주간 실험을 진행한 쥐의 혈액을 채취하여, 4℃, 14,000rpm에서 1분간 원심분리하여 상층액만을 취해 실험을 진행하였다.
나) 효소원 조제 및 아질산염, 과산화지질, 글루타티온 함량 측정
시료 투여가 끝난 SD rat의 음경해면체를 적출하여 생리식염수로 세척한 후, 음경해면체 조직 1g당 4배 량의 0.1M 인산칼륨 완충액(pH 7.4)을 가하고, 균질기를 이용하여 균질화시키고, 이를 아질산염, 과산화지질, 글루타티온 함량 측정을 위한 시료로 사용하였다.
아질산염 함량 측정은 그리에스 반응(Griess reaction)에 준하여 측정하였다. 측정한 OD값을 아질산나트륨으로 산출한 표준곡선에 대입하여 그 양을 정량하였다.
음경 발기에 미치는 영향을 확인하려면 음경해면체 평활근을 이완시켜 음경 발기에 직접 관여하는 NO를 측정해야 하지만, 체내에서 대사 속도가 너무 빨라 직접적인 정량이 불가능하기 때문에, 그 산화물인 아질산염 함량을 측정하여 추정할 수 있다.
과산화지질 함량은 Ohkawa 등의 방법에 준하여 측정하였다. 측정한 OD값을 MDA 표준곡선에 대입하여 그 양을 정량하였다. 음경 발기능은 음경세포의 기질적 손상에 의해서 저하될 수 있는데, 세포의 기질적 손상을 유발시키는 중요 인자 중의 하나가 과산화지질로서 세포독성인자이다. 과산화지질의 함량의 감소는 세포 손상을 억제하여 성기능 저하를 어느 정도 감소시킬 것이라고 예상할 수 있다.
글루타티온 함량은 Ellman의 방법에 준하여 측정하였다. 측정한 OD값을 GSH 표준곡선에 대입하여 그 양을 정량하였다. 체내 장기들은 외부에서 유입되거나 내부에서 생성되는 독성물질에 의해서 고유 기능이 손상될 수 있다. 생체 내에서 이루어지는 독성 물질에 대한 해독반응 중 글루타티온에 의한 해독작용이 있는데, 글루타티온의 함량을 측정함으로써, 그 해독작용을 추정할 수 있으며, 장기뿐만 아니라 성기의 정상 발기력에도 도움이 됨을 예상할 수 있다.
(2) 결과
발효물을 4 주간 투여한 쥐의 혈액을 채취하여, 4℃, 14,000rpm에서 1분간 원심 분리하여 상층액 만을 취해 실험을 진행하였다.
프로게스테론과 테스토스테론 농도를 정량한 결과, 정상군에 비해 시메티딘을 장기투여한 음성 대조군 쥐의 혈액에서 프로게스테론의 농도가 증가한 반면, 황칠나무 발효 추출물을 투여한 실험군 흰쥐의 혈액에서는 그 양이 약 30% 감소하였고, 테스토스테론 함량은 크게 약 30% 증가하였다. 프로게스테론 농도는 감소하고 테스토스테론 함량은 증가한다는 것은 남성갱년기 개선에 효과가 있을 것으로 사료된다(표 11 및 표 12).
배지 종류 normal CT CT/PDME+증류수발효액 CT/PDME+황칠나무 발효 추출물
농도(ng/ml) 3.082 3.373 2.362 2.122
배지 종류 normal CT CT/PDME+증류수발효액 CT/PDME+황칠나무 발효 추출물
농도(ng/ml) 1.628 1.51 1.920 2.201
음경 발기에 미치는 영향을 확인하려면 음경해면체 평활근을 이완시켜 음경 발기에 직접 관여하는 NO를 측정해야 하지만, 체내에서 대사 속도가 너무 빨라 직접적인 정량이 불가능하기 때문에, 그 산화물인 아질산염 함량을 측정하여 추정할 수 있다. 아질산염 함량의 증가는 발기능이 개선되었음을 보여주는 값으로, 시메티딘(cimetidine)을 투여한 음성 대조구와 비교하여, 황칠나무 발효 추출물을 투여한 실험구에서 조직 g당 아질산염의 함량이 크게 증가하였다(표 13).
배지 종류 normal CT CT/PDME+증류수발효액 CT/PDME+황칠나무 발효 추출물
농도(ng/ml) 0.658 0.352 0.434 0.515
과산화지질의 함량을 측정한 결과, 정상군에 비해 시메티딘을 장기투여한 음성대조군에서는 과산화지질의 함량이 증가한 반면, 황칠나무 발효 추출물을 투여한 실험군에서는 그 양이 감소하였다(표 14).
배지 종류 normal CT CT/PDME+증류수발효액 CT/PDME+황칠나무 발효 추출물
농도(ng/ml) 6.271 8.109 7.102 6.223
글루타티온의 함량을 측정한 결과 시메티딘을 장기 투여한 흰쥐에서 글루타티온의 함량이 감소하였으나, 황칠나무 발효 추출물을 투여한 쥐에서 다시 그 함량이 30% 증가하였다(표 15).
배지 종류 normal CT CT/PDME+증류수발효액 CT/PDME+황칠나무 발효 추출물
농도(ng/ml) 13.124 11.076 13.802 14.551

Claims (10)

  1. 꽃송이 버섯 균주(Sparassis latifolia) CLM1(KACC93185P)를 이용하여 황칠나무 추출물을 발효시킨 황칠나무 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 남성 갱년기 증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 황칠나무 발효 추출물은 황칠나무 추출물에 꽃송이 버섯 균주(Sparassis latifolia) CLM1(KACC93185P)를 접종한 다음 25 내지 30℃에서 8 내지 12일 동안 발효시켜 제조된 것임을 특징으로 하는 남성 갱년기 증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 황칠나무 발효 추출물 제조시 오가피, 인삼, 백출, 당귀, 백작약, 천궁, 백복령, 감초, 숙지황, 황기 및 육계로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 한약재를 추가로 첨가하여 발효시키는 것을 특징으로 하는 남성 갱년기 증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 황칠나무 추출물이 황칠나무에 10 내지 20배 부피의 물을 넣고 100 내지 120℃에서 5 내지 7시간 동안 추출한 열수 추출물인 것을 특징으로 하는 남성 갱년기 증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 남성 갱년기 증후군은 호르몬 변화로 인한 기분변화, 수면장애, 체중 및 근육량의 감소, 근력 저하, 내장지방 증가, 성기능 장애, 인지능력 저하, 피로 및 우울증으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 남성 갱년기 증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 꽃송이 버섯 균주(Sparassis latifolia) CLM1(KACC93185P)를 이용하여 황칠나무 추출물을 발효시킨 황칠나무 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 남성 갱년기 증후군의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 황칠나무 발효 추출물은 황칠나무 추출물에 꽃송이 버섯 균주(Sparassis latifolia) CLM1(KACC93185P)를 접종한 다음 25 내지 30℃에서 8 내지 12일 동안 발효시켜 제조된 것임을 특징으로 하는 남성 갱년기 증후군의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 황칠나무 발효 추출물 제조시 오가피, 인삼, 백출, 당귀, 백작약, 천궁, 백복령, 감초, 숙지황, 황기 및 육계로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 한약재를 추가로 첨가하여 발효시키는 것을 특징으로 하는 남성 갱년기 증후군의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  9. 제 6 항에 있어서,
    상기 황칠나무 추출물이 황칠나무에 10 내지 20배 부피의 물을 넣고 100 내지 120℃에서 5 내지 7시간 동안 추출한 열수 추출물인 것을 특징으로 하는 남성 갱년기 증후군의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  10. 제 6 항에 있어서,
    상기 남성 갱년기 증후군은 호르몬 변화로 인한 기분변화, 수면장애, 체중 및 근육량의 감소, 근력 저하, 내장지방 증가, 성기능 장애, 인지능력 저하, 피로 및 우울증으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 남성 갱년기 증후군의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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