KR20190088475A - 운동 뉴런 질병의 치료를 위한 강글리오사이드 대사 억제제 - Google Patents

운동 뉴런 질병의 치료를 위한 강글리오사이드 대사 억제제 Download PDF

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프레드릭 다리오스
지오반니 스테바닌
파니 모첼
줄리앙 브랑슈
맥심 부트리
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이씨엠 (엥스띠뛰 뒤 쎄르보 에 드 라 모엘 에삐니에르)
에꼴 프라티끄 데 오뜨 에뛰드
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아시스땅스 퍼블리끄-오삐또 드 빠리
소르본 유니베르시테
상뜨로 나쇼날 드 라 러쉐르쉐 샹띠피크
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Abstract

본 발명은 운동 뉴런 질병, 특히 유전성 강직성 대마비의 치료를 위한 강글리오사이드 대사 억제제에 관한 것이다.

Description

운동 뉴런 질병의 치료를 위한 강글리오사이드 대사 억제제
본 발명은 운동 뉴런 질병 분야, 특히 운동 뉴런 질병의 치료를 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 운동 뉴런 질병의 치료를 위한 강글리오사이드 대사 억제제에 관한 것이다.
유전성 강직성 대마비 (HSP)는 운동 뉴런 질병의 두 번째로 가장 빈번한 그룹을 구성하고, 복합 형태의 다른 뇌 변화와 가변적으로 연관된 피질척수로 신경 퇴행을 특징으로 한다. 이는 하지의 진행성 양측 약화, 강직 및 진동 감각 상실을 특징으로 한다. 이러한 증상은 대부분 피질척수로의 상부 운동 뉴런 축삭의 퇴행으로 인한 것이다.
SPG11 (강직성 대마비 11형)은 상 염색체 열성 HSP의 가장 흔한 형태이며, 사례의 14 내지 25% 및 복합 열성 형의 최대 70%를 차지한다. 주요 증상은 일반적으로 생후 첫 10년 동안 나타나며, 강직성 보행 장애, 인지 손상, 말초 신경병증, 소뇌 운동실조, 파킨슨증 및 망막 퇴화를 포함한다. 이는 SPG11 유전자의 돌연변이에 의해 발생한다. SPG11 유전자 (또한, 스파탁신 (spatacsin) 또는 KIAA1840으로 지칭됨)는 2,443-아미노산 단백질 이른바 스파탁신을 인코딩한다. SPG11 환자의 대다수의 돌연변이는 난센스 (nonsense) 또는 구조이동 돌연변이뿐만 아니라, 스파탁신 기능의 손실을 야기할 것으로 예상되는 유전자내 재배열이다.
SPG11 환자의 본격적 증상은 스파스티진을 인코딩하는 ZFYVE26/SPG15 유전자의 돌연변이를 갖는 SPG15 환자에서 관찰된 것과 구별되지 않는다. 스파탁신 및 스파스티진은 하위단위 중 하나인 AP5-Z1이 SPG48 환자에서 돌연변이된 유전자에 의해 인코딩되는 어댑터 단백질 복합체 AP5와 상호작용한다.
이 질병에 대한 치료법은 현재 이용 가능하지 않으며, 따라서, 추정적 치료 표적을 확인하기 위해서는 뉴런 사멸의 병리적 메커니즘 상류의 분자 특성화가 필요하다. 따라서, SPG11의 추정 치료법은 SPG48 및 SPG15를 포함한 다른 형태의 HSP뿐만 아니라, 동일한 경로에 유전자 돌연변이를 보유하는 진행성 근위축성 측삭 경화증 및 샤리코 마리 투스병 (Charcot Marie Tooth disease)과 같은 대립인자 장애를 대상으로 한다.
본 출원인은 Spg11-녹아웃 마우스 모델 (Spg11-knockout mouse model)을 생성하여, 질병의 초기 단계에서의 스파탁신 기능 상실의 결과를 조사하고, 뉴런 사멸 이전의 메커니즘을 조사하였다. 본 출원인은 인간에서 관찰된 증상과 일치하는 초기 운동 결핍을 관찰하였다.
놀랍게도, 본 출원인은 강글리오사이드 대사의 억제 (특히 글리코실세라마이드 합성효소의 억제 또는 GM3 합성효소의 하향조절)가 Spg11-녹아웃 뉴런을 사멸되는 것으로부터 보호한다는 것을 발견하였다. 글루코실세라마이드 합성효소의 억제제는 일반적으로, 표현형의 일부로서 뉴런 변화를 포함하는 중증의 다중 전신성 인간 유전적 장애이며, 단일 효소의 결핍에 의해 야기되는 리소좀 저장 질병 (LSD)의 치료에 사용된다. 지금까지 HSP와 같은 운동 뉴런 질병의 상당한 유전적 이종성에도 불구하고, 돌연변이된 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 기능은 세포막 수송, 더욱 특히 거대 분자 및 세포 소기관의 신경돌기 수송의 손상을 포함하여 소수의 세포 기능에 집중된다. 놀랍게도, SPG11의 기능 상실은, 효소 기능의 완전한 차단을 통해 리소좀에 특이적으로 축적되는 화합물이 부재하므로, 경미한 LSD형 표현형을 모방하는 진행성 리소좀 기능 이상을 초래한다는 것을 발견하였다.
더욱 놀랍게도, 본 출원인은 운동 결핍 증상이, 또한 뉴런 사멸 이전에 강글리오사이드 모노시알산 (GM)2 및 GM3 강글리오사이드를 포함한 지질의 리소좀 축적에 선행한다는 것을 관찰하였다.
본 발명의 하나의 목적은 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 필수적으로 이루어진 운동 뉴런 질병의 치료에 사용하기 위한 조성물이다.
일 실시형태에서, 상기 강글리오사이드 대사 억제제는 유기 소분자, 항체, 길항제, 억제제 지지체 (inhibitor scaffold), 앱타머 (aptamer), 리보자임, 펩타이드, 화학적 샤페론 (chemical chaperone), 리보핵산 간섭 (RNAi), 올리고뉴클레오타이드 안티센스, 소 간섭 RNA (siRNA), 안티센스 RNA (asRNA), 모르폴리노 (morpholino) 및 조작된 뉴클레아제를 포함하는 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 상기 강글리오사이드 대사 억제제는 글루코실세라마이드 합성효소의 억제제이며, 바람직하게는 이미노 당, D-트레오-1-페닐-2-데카노일아미노-3-모르폴리노-프로판올 (PDMP)의 유사체, 세라마이드 유사체, 카복사미드, 카바메이트, 글리코사이드 가수분해효소 샤페론을 포함하는 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 상기 글루코실세라마이드 합성효소의 억제제는 퀴누클리딘-3-일 (2-(4'-플루오로-[l,-바이페닐]-3-일)프로판-2-일)카바메이트 (GZ161), N-부틸데옥시노지리마이신 (NB-DNJ), N-[(1R,2R)-1-(2,3-디하이드로-1,4-벤조디옥신-6-일)-1-하이드록시-3-(1-피롤리디닐)-2-프로파닐]옥탄아미드, N-(5-아다만탄-1-일-메톡시펜틸) 데옥시노지리마이신 (AMP-DNJ); N-부틸-1-데옥시-노지리마이신 (KTB-DNJ); N-에틸-1-데옥시노지리마이신 (NE-DNJ); N-부틸데옥시만노직사마이신; N-5-카복실-1-데옥시노지라마이신; N-도세실-1-데옥시노지리마이신; 노지리마이신 바이술페이트; 노직시마이신-1-술폰산; N-(n-노닐)-1-데옥시노지리마이신; N-(7-옥사데실)-1-데옥시노지리마이신; N-(7-옥사-9,9,9,-트리플루오로노닐)-1-데옥시노지리마이신; (2R,3S,4R,5S)-2-(하이드록시메틸)-3,4,5-피페리딘트리올; N-부틸데옥시갈락토노지리마이신 (NB-DGJ); N-(n-노닐)데옥시노지리마이신; (3S,4S)-3-(하이드록시메틸)피롤리딘-3,4-디올 (이소LAB); 1,4-디데옥시-1,4-이미노-D-아라비니톨, (2S,3R,4S,5R)-3,4,5-트리하이드록시-6-옥소피페리딘-2-카복실산, D-글루카로-델타-락탐, 1,4-디데옥시-2-하이드록시메틸-1,4-이미노-D-트레이톨; (2S,3S,4R)-2,4-비스(하이드록시메틸)피롤리딘-3,4-디올, 이소DGDP, D-트레오-1-페닐-2-데카노일아미노-3-모르폴리노-프로판올 (PDMP); PDMP의 거울상이성질체, L-트레오-및 DL-에리트로-1-페닐-2-아미노-1,3-프로판디올, D-트레오 (R,R) 거울상이성질체; 1-페닐-2-팔미토일아미노-3-모르폴리노-1-프로판올; 1-페닐-2-팔미토일아미노-3-피롤리디노-1-프로판올 (P4), D-트레오-1-에틸렌디옥시페닐-2-팔미토일-3-피롤리디노-프로판올 (EtDO-P4); DL-트레오-1-페닐-2-팔미토일아미노-3-피롤리디노-1-프로판올 (DL-트레오-P4); 2-(2,3-디하이드로-1H-인덴-2-일)-N-((1R,2R)-1-(2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-일)-1-하이드록시-3-(피롤리딘-1-일)프로판-2-일)아세트아미드; N-((1R,2R)-1-(2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-일)-1-하이드록시-3-(피롤리딘-1-일)프로판-2-일)노난아미드; BML-119; IV-231B, (S)-퀴누클리딘-3-일 (2-(2-(4-플루오로페닐)티아졸-4-일)프로판-2-일)카바메이트 (S)-2-하이드록시숙시네이트 (GZ 452), 퀴누클리딘-3-일 (2-(4'-플루오로-[1,-바이페닐]-3-일)프로판-2-일)카바메이트, (1R,2R)-옥탄산[2-(2',3'-디하이드로-벤조[1,4]디옥신-6'-일)-2-하이드록시-1-피롤리딘-1-일메틸-에틸]-아미드-L-타르타르산, EXEL-0346, 이소파고민, 트랜스-4-(2-아미노-3,5-디브롬벤질아미노)-사이클로헥산올, 5-(4-클로로페닐)-6-에틸-2,4-피리미딘디아민, (3R,4R,5R)-5-(하이드록시메틸)-3,4-피페리딘디올, 암브록솔, 이미글루세라제,), α-호모갈락토노지리마이신, α-호모알로노지리마이신, β-1-C-부틸-DGJ, N-노닐-DNJ를 포함하는 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 상기 강글리오사이드 대사 억제제는 GM3 합성효소의 억제제이다. 일 실시형태에서, GM3 합성효소의 억제제는 바람직하게는 서열번호 3, 서열번호 4 및 이들의 기능 유지 변이체를 포함하는 군으로부터 선택되는 miRNA이다. 일 실시형태에서, GM3 합성효소의 억제제는 시티딘 모노포스포-N-아세틸뉴라민산의 탄소-연결 유사체이다.
또 다른 실시형태에서, 조성물은 경구, 국소, 경피, 근육내, 피하, 정맥내, 비경구, 비강내 투여에 의해 투여되어야 한다.
또 다른 실시형태에서, 운동 뉴런 질병은 (예를 들어, 말초 신경병증 발현 HSP와 같은) 유전성 강직성 대마비 (HSP), 유전성 강직성 대부전마비, 가족성 강직성 대마비, 프렌치 세틀먼트병 (French settlement disease), 또는 스트럼펠-로라인병 (Strumpell-Lorrain disease), 영아 발병 상행성 유전성 강직성 마비, MASA 증후군, 또한 이른바 CRASH 증후군 및 가레이스 메이슨 증후군 (Gareis-Mason syndrome), 운동 신경병증 발현 백내장, 짧은 신장 (short stature) 및 골격 이상, MAST 증후군, 알란-헌던-더들리 증후군 (Allan-Herndon-Dudley syndrome), 트로이어 증후군 (Troyer syndrome), 리슨 증후군 (Lison syndrome), 강직성 운동실조 (특히, 예를 들어, 강직성 운동실조 2형과 같은 유전성 강직성 운동실조), SPOAN 증후군, 말초 신경병증, 체린 증후군 (Kjellin syndrome), 유전성 운동 감각 신경병증 (HMSN)을 포함하는 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 운동 뉴런 질병은 바람직하게는 SPG11, SPG15, SPG48, SPG4 및 SPG7로부터 선택되는 HSP이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 필수적으로 이루어진 운동 뉴런 질병의 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 필수적으로 이루어진 운동 뉴런 질병의 치료에 사용하기 위한 약제(medicament)이다.
정의
본 발명에서, 다음 용어는 다음 의미를 갖는다:
- 수치 앞의 "약"은 상기 수치 값의 + 또는 -10%를 의미한다.
- "유전자 발현의 억제제"는 유전자의 발현을 억제하거나, 현저하게 감소시키는 생물학적 효과를 갖는 천연 또는 합성 화합물을 지칭한다. 결과적으로, 일 실시형태에서, "강글리오사이드 대사 경로의 효소 또는 효소의 보조인자의 발현의 억제제"는 강글리오사이드 대사 경로에 관여하는 효소 또는 그의 보조인자를 인코딩하는 유전자(들)의 발현을 억제하거나, 현저히 감소시키는 생물학적 효과를 갖는 천연 또는 합성 화합물을 지칭한다.
- "길항제"는 수용체의 "진성" 길항제 또는 역작용제를 나타내는 것으로서 구별없이 사용된다. "진성" 수용체 길항제는 수용체에 결합하고, 그 수용체의 생물학적 활성화를 차단하는 화합물이다. 일 실시형태에서, 진성 수용체 길항제는, 예를 들어 상기 수용체에 대한 작용제와 경쟁함으로써, 수용체 작용제의 작용을 방지한다. 역작용제는 작용제와 동일한 수용체에 결합하지만, 반대 효과를 발휘하는 화합물이다. 역작용제는 작용제의 부재하에 수용체 활성화의 항시적 수준을 저하시키는 능력을 갖는다.
- "강글리오사이드 대사 경로의 적어도 하나의 효소 또는 효소의 적어도 하나의 보조인자의 억제제 또는 길항제"는 기능성 강글리오사이드 대사 경로 (특히 기능성 효소, 그의 리간드 등)를 발현하는 환자 또는 세포에 투여하는 경우, 환자 또는 세포에서, 임의의 하류의 생물학적 효과를 포함하고, 달리는 강글리오사이드 대사 경로의 효소와 그의 천연 리간드의 결합으로부터 유발되는 강글리오사이드 대사 경로의 적어도 하나의 효소의 활성화와 관련된 생물학적 활성의 억제 또는 하향 조절을 초래하는 임의의 화학 물질을 포함한다. 이러한 억제제 또는 길항제는 강글리오사이드 대사 경로의 효소의 활성화 또는 강글리오사이드 대사 경로의 효소의 임의의 하류 생물학적 효과를 차단할 수 있는 임의의 제제를 포함한다. 예를 들어, 이러한 억제제 또는 길항제는 경쟁적 억제제일 수 있으며, 강글리오사이드 대사 경로의 효소의 리간드 결합 부위 또는 그의 일부분을 점유함으로써, 효소가 그의 천연 리간드에 접근할 수 없도록 함으로써, 그의 정상적인 생물학적 활성을 방지하거나, 감소시키는 작용을 한다. 이러한 억제제 또는 길항제의 다른 예는 제한 없이, 비경쟁적 억제제, 경쟁하지 않는 억제제 및 혼합 억제제를 포함한다. 비경쟁적 억제제는 이미 기질에 결합했는지와 상관없이, 표적 효소의 활성을 감소시키고, 효소와 동일한 정도로 결합하는 억제제를 지칭한다. 비경쟁적 억제제는 기질이 이미 결합했는지와 상관없이 표적 효소에 결합할 수 있으나, 한 가지 상태 또는 다른 상태에서 표적 효소와의 결합에 대해 더 높은 친화도를 갖는 경우, 이는 혼합 억제제로 일컬어진다. 경쟁하지 않는 억제제는 단지, 효소와 기질 사이에 형성된 복합체에만 결합하여, 통상적으로 2개 이상의 기질 또는 산물과의 반응시 작용하는 억제제를 지칭한다.
- "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 적어도 2개의 아미노산 및 50개 미만의 아미노산의 아미노산의 선형 중합체를 지칭한다. 펩타이드의 아미노산 잔기는 다음과 같이 약자로 표기된다: 페닐알라닌은 Phe 또는 F이고; 류신은 Leu 또는 L이고; 이소류신은 Ile 또는 I이고; 메티오닌은 Met 또는 M이고; 발린은 VaI 또는 V이고; 세린은 Ser 또는 S이고; 프롤린은 Pro 또는 P이고; 트레오닌은 Thr 또는 T이고; 알라닌은 Ala 또는 A이고; 티로신은 Tyr 또는 Y이고; 히스티딘은 His 또는 H이고; 글루타민은 Gln 또는 Q이고; 아스파라긴은 Asn 또는 N이고; 리신은 Lys 또는 K이고; 아스파르트산은 Asp 또는 D이고; 글루탐산은 GIu 또는 E이고; 시스테인은 Cys 또는 C이고; 트립토판은 Trp 또는 W이고; 아르기닌은 Arg 또는 R이고; 글리신은 GIy 또는 G이다. 20종의 통상적 아미노산, 비천연 아미노산 예컨대, 알파,알파-이중 치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산, 및 다른 비통상적 아미노산의 입체이성질체 (예를 들어, D-아미노산)가 또한 본 명세서에 제공된 기술의 화합물에 적합한 성분일 수 있다. 비통상적 아미노산의 예는 베타-알라닌, 1-나프틸알라닌, 2-나프틸알라닌, 3-피리딜알라닌, 4-하이드록시프롤린, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시리신, 노르-류신, 및 다른 유사한 아미노산 및 이미노산 (예를 들어, 4-하이드록시프롤린)을 포함한다.
- "약제학적으로 허용 가능한 부형제"는 동물, 바람직하게는 인간에게 투여하는 경우, 임의의 부작용, 알레르기성 반응 또는 다른 부적절한 반응을 유발하지 않는 부형제를 지칭한다. 이는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균제, 등장액 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 인간 투여의 경우, 제조물은, 예를 들어 FDA 기관 또는 EMA와 같은 규제 기관에서 요구하는 바와 같은 무균성, 발열성, 일반 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 한다.
- "유기 소분자"는 약제학 분야에서 일반적으로 사용되는 유기 분자와 유사한 크기의 분자를 지칭한다. 상기 용어에서 생물학적 거대분자 (예를 들어, 단백질, 핵산 등)는 배제된다. 바람직한 유기 소분자의 크기는 최대 약 5000 Da, 더욱 바람직하게는 최대 2000 Da, 및 가장 바람직하게는 최대 약 1000 Da의 범위이다.
- "대상체"는 포유류, 바람직하게는 인간을 지칭한다. 일 실시형태에서, 대상체는 의료 관리를 받기 위해 대기 중이거나, 의료 관리를 받는 중이거나, 의료 절차의 대상이었거나, 대상이거나, 대상일 것이거나, 질병의 발병 여부에 대해 모니터링되는 "환자", 즉 여성 또는 남성, 성인 또는 아동일 수 있다.
- "치료 유효량"은 표적에 유의한 부작용 또는 유해한 작용을 일으키지 않으면서, (1) 운동 뉴런 질병의 발병의 지연 또는 예방; (2) 운동 뉴런 질병의 하나 이상의 증상의 진행, 중증화 또는 악화의 지연 또는 중단; (3) 운동 뉴런 질병의 증상의 완화의 유도; (4) 운동 뉴런 질병의 중증도 또는 발병률의 감소; 또는 (5) 운동 뉴런 질병의 치료를 목적으로 하는 제제의 수준 또는 양을 지칭한다. 치료 유효량은 예방학적 또는 예방 작용을 위해 운동 뉴런 질병의 발병 이전에 투여될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 치료 유효량은 치료 작용을 위해, 운동 뉴런 질병의 발병 후 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 조성물의 치료 유효량은 운동 뉴런 질병의 적어도 하나의 증상을 감소시키는데 효과적인 양이다.
- "치료하는" 또는 "치료" 또는 "완화"는 치료학적 치료 및 예방학적 또는 예방적 조치 둘 모두를 지칭하며, 표적 병리적 상태 또는 장애를 예방하거나, 지연 (저감)시키는 것을 목적으로 한다. 치료가 필요한 자는 장애를 가질 소향이 있는 자 또는 장애를 예방해야 하는 자뿐만 아니라, 이미 장애가 있는 자를 포함한다. 본 발명의 조성물의 치료량이 제공된 후, 환자가 다음 중 하나 이상의 관찰 가능한 효과를 나타내는 경우, 이러한 대상체 또는 포유류는 표적 병리적 장애에 대해 성공적으로 "치료"된 것이다; (i) 신경 세포 사멸의 저하; (iii) 인지 손상 또는 피라미드성 징후의 완화 또는 저하; (iv) 특정 장애 또는 상태와 관련된 하나 이상의 증상의 일정 정도의 경감; (v) 병적 상태 및 사망률의 감소, 및 (vi) 삶의 질 문제의 개선. 장애의 성공적인 치료 및 개선을 평가하기 위한 상기 매개변수는 의사에게 자명한 통상적인 절차에 의해 용이하게 측정될 수 있다.
본 명세서의 출원인은 SPG11-/- 마우스 모델을 사용하여, SPG11이 리소좀 내의 지질 (특히 GM2, GM3, GD2 및 GD3) 축적과 관련된 인간 SPG11 병리의 주요 특징의 재현을 입증하였다. 이러한 지질의 축적은 SPG11 인간 환자 및 SPG11 장애의 제브라피쉬 모델에서 추가로 확인되었다. 따라서, 이러한 실험 결과는 이러한 질병을 치료하기 위해, 강글리오사이드 대사 억제제, 및 특히 강글리오사이드 합성의 억제제의 용도를 강력하게 뒷받침한다.
본 발명의 하나의 목적은 운동 뉴런 질병의 치료를 위하거나, 그의 치료에 사용하기 위한 조성물이며, 상기 조성물은 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 필수적으로 이루어진다.
강글리오사이드 대사는 세라마이드로부터의 강글리오사이드의 O-, a-, b-및 c-시리즈의 생합성과 관련된다. 이러한 대사는 시알릴 전이효소 및 글리코실 전이효소와 같은 효소의 상이한 경로 및 특히 순차적 활성을 포함한다.
일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제 (본 명세서에서 강글리오사이드 대사 경로의 억제제로서 지칭될 수 있음)는 따라서, 강글리오사이드 생합성의 억제제이다.
일 실시형태에서, 상기 억제제는 (i) 강글리오사이드 대사 경로의 적어도 하나의 효소 (또는 그의 적어도 하나의 보조인자)의 활성화, 및/또는 (ii) 강글리오사이드 대사 경로의 적어도 하나의 효소 (또는 그의 적어도 하나의 보조인자)의 단백질 발현을 억제한다. 일 실시형태에서, 상기 억제제는 본 명세서에 기재된 강글리오사이드 대사 경로의 적어도 하나의 효소 (또는 그의 적어도 하나의 보조인자)의 유전자 발현의 억제제 및/또는 하류 경로의 억제제이다.
강글리오사이드 대사 경로의 적어도 하나의 효소 (또는 그의 적어도 하나의 보조인자)의 활성 또는 단백질 발현의 억제제의 예는 제한 없이, 유기 소분자, 펩타이드, 억제제 지지체, 길항제, 항체, 앱타머, 및 화학적 샤페론을 포함한다.
일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 강글리오사이드 대사 경로의 적어도 하나의 효소 (또는 그의 적어도 하나의 보조인자)의 경쟁적 억제제이다.
또 다른 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 강글리오사이드 대사 경로의 적어도 하나의 효소 (또는 그의 적어도 하나의 보조인자)의 경쟁하지 않는 억제제이다.
또 다른 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 강글리오사이드 대사 경로의 적어도 하나의 효소 (또는 그의 적어도 하나의 보조인자)의 비경쟁적 억제제이다.
또 다른 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 강글리오사이드 대사 경로의 적어도 하나의 효소 (또는 그의 적어도 하나의 보조인자)의 혼합 억제제이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 억제제는 강글리오사이드 대사 경로의 적어도 하나의 효소 (또는 그의 적어도 하나의 보조인자)의 선택적 억제제이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "선택적 억제제"는 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 nM, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 μM 이하의 최대 억제 농도의 중간값 (IC50)을 갖는 화합물을 지칭한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 화합물의 IC50 값이 200 μM 이하인 경우, 이는 활성으로 간주된다. 예를 들어, IC50 값이 더 작은 화합물, 예를 들어 IC50이 10 nM인 화합물은 IC50 값이 더 큰 화합물, 예를 들어 IC50 값이 1 μM인 화합물보다 더 강한 것으로 간주된다.
화합물의 IC50을 측정하는 기법은 당업자에 널리 공지되어 있으며, 제한 없이, 기능적 길항제 분석, 경쟁 결합 분석, 세포-기반 cAMP 분석, 웨스턴 블롯 및 qRT-PCR을 포함한다.
예를 들어, IC50은 투여량 반응 곡선을 수립하기 위해, 다양한 농도의 본 발명의 억제제의 존재하에 측정할 수 있다. 이러한 투여량 반응 곡선으로부터 소정의 농도의 작용제에 대한 반응의 50%를 억제하는데 필요한 길항제의 농도를 나타내는 IC50 값을 추산할 수 있다. IC50 값은 투여량 반응 식에 투여량 반응 그래프를 적용함으로써, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. IC50 값은 쳉 (Cheng) 및 프루소프 (Prusoff)의 가정을 사용하여, 친화도 상수 (Ki)로 변환시킬 수 있다.
예를 들어, 글리코실세라마이드 합성효소, GM3 합성효소, 글리코실세라미다제 베타 (GBA)2 및 GBA1 또는 강글리오사이드 대사 경로로부터의 임의의 효소와 같은 강글리오사이드 대사 경로의 효소 (또는 그의 보조인자)의 활성을 측정하는 기법은 당업자에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 이러한 효소에 의해 촉매 작용되는 반응 동안 소요되는 UDP-글루코스의 양으로서, 글리코실세라마이드 합성효소의 활성을 측정할 수 있다. 특히, 또 다른 효소, 예를 들어, 일반적으로 UDP-글루코스 탈수소효소를 사용하여, UDP-글루코스로부터 NADA를 생성한 후, UDP-글루코스 탈수소효소에 의해 형성된 NADH 분자 및 디아포라제 (diaphorase) (즉 NADH 탈수소효소)에 의해, 산화 환원 지표자인 낮은 형광 레자주린 (resazurin)을 높은 형광 레조룸(resorufm)으로 정량적으로 변환한다. 글리코실세라마이드 합성효소에 의해 촉매 작용되는 반응은 UDP-글루코스로부터의 글루코스를 C6-세라마이드로 전달하여, 산물로서 UDP 및 글리코실세라마이드를 제공하고; 따라서, 상기 분석은 UDP-글루코스 기질의 소실을 측정한다.
일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 유기 소분자이다.
일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 펩타이드이다.
일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 억제제 지지체이다.
억제제 지지체는 효소 또는 그의 보조인자의 강한 선택적 억제에 유용한 중심 분자 지지체의 구조-기반 설계하에 선택한다. 억제제 지지체의 설계 기법은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 제한 없이, 도킹 방법 및 MM-GBSA 접근법과 조합된 형상 및 정전기력 유사성 탐색의 사용을 포함한다.
일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 화학적 샤페론이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "화학적 샤페론"은 단백질의 접힘성 및/또는 안정성을 증진시키는 기능을 하는 소분자 부류이다. 화학적 샤페론은 광범위하고, 다양한 그룹의 분자이며, 이는 다양한 메커니즘을 통해, 단백질 안정성 및 폴리펩타이드 조직화에 영향을 미칠 수 있다. 상이한 부류의 화학적 샤페론이 존재하며, 특히 삼투압 조절 물질, 소수성 화합물 및 약리학적 샤페론을 포함한다. 삼투압 조절 물질은 삼투압 또는 다른 형태의 작용력이 가해지는 시간 동안 세포 성분의 완전성을 유지하기 위해, 세포에 의해 합성되거나, 흡수되는 극성 소분자이다. 이에 대한 비 제한 예는 글리세롤, 트레할로스, 트리메틸아민 n-산화물 (TMAO), 및 글리신을 포함한다. 수성 환경에서 여전히 용해성인 소수성도를 변화시키는 소수성 화합물이 또한 화학적 샤페론으로 작용할 수 있다. 이러한 화합물은 접히지 않았거나, 부적절하게 접힌 단백질의 용매-노출 소수성 절편에 결합함으로써, 이를 응집되지 않도록 "보호하는" 작용을할 것으로 생각된다. 4-페닐부티레이트 (PBA)는 리소포스파티드산 및 다른 지질 및 표면활성제와 함께, 이러한 그룹의 화합물의 주요 예이다. 약리학적 샤페론은 단백질 리간드, 보조인자, 경쟁적 억제제, 및 특정 단백질에 특이적으로 결합하는 다른 소분자로 구성된다. 이러한 분자는 단지 특이적 단백질에 대해서만 활성이므로, 이는 약리학적 샤페론으로 지칭된다.
일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 길항제이다.
일 실시형태에서, 길항제는, 예를 들어 글리코실세라마이드 합성효소, GM 합성효소 (GM1, GM2, GM3 합성효소), GD 합성효소 (GD1a, GD1b, GD2, GD3 합성효소), GT 합성효소 (GT1a, GT1b, GT2, GT3 합성효소), Gb 합성효소 (Gb1, Gb2, Gb3 합성효소)와 같은 강글리오사이드 대사 경로의 적어도 하나의 효소 (또는 그의 적어도 하나의 보조인자)에 대해 유도되거나, 강글리오사이드 대사 경로의 적어도 하나의 효소의 리간드에 대한 항체로서, 상기 항체가 상기 효소에 대한 리간드의 결합을 손상시키는 방식의 항체로 구성될 수 있다.
강글리오사이드 대사 경로의 적어도 하나의 효소 (또는 그의 적어도 하나의 보조인자)에 대한 항체는 적절한 항원 또는 에피토프를, 예를 들어 특히, 돼지, 소, 말, 토끼, 염소, 양, 및 마우스로부터 선택된 숙주 동물에 투여함으로써 공지된 방법에 따라 획득할 수 있다. 당 업계에 공지된 다양한 아쥬반트 (adjuvant)를 사용하여, 항체 생성을 증진시킬 수 있다. 본 발명의 실시에 유용한 항체는 다클론일 수 있으나, 단일클론 항체가 바람직하다. 강글리오사이드 대사 경로의 효소 또는 강글리오사이드 대사 경로의 효소의 리간드 또는 보조인자에 대한 단일클론 항체는 배양시 연속 세포주에 의한 항체 분자의 생성을 제공하는 임의의 기법을 사용하여 제조 및 단리할 수 있다. 생성 및 단리 기법은, 다음에 제한되는 것은 아니나, 문헌 [Kohler and Milstein (1975)]에 의해 최초 기재된 하이브리도마 기법; 인간 B 세포 하이브리도마 기법 (문헌 [Cote et al., 1983]); 및 EBV-하이브리도마 기법 (문헌 [Cole et al. 1985])을 포함한다. 대안적으로, 단일 사슬 항체의 생성을 위해 기재된 기법 (예를 들어, 미국 특허 제 4,946,778호 참조)은 강글리오사이드 대사 경로의 효소에 대해 유도되거나, 강글리오사이드 대사 경로의 효소의 리간드에 대한 단일 사슬 항체를 생성시키는데 적용될 수 있다.
본 발명의 실시에 유용한 강글리오사이드 대사 경로의 적어도 하나의 효소 (또는 그의 적어도 하나의 보조인자)의 다른 길항제는 또한 강글리오사이드 대사 경로의 효소 (예를 들어, 글리코실세라마이드 합성효소)에 대한 항체의 단편, 또는 강글리오사이드 대사 경로의 효소의 리간드 또는 보조인자 (예를 들어, 글리코실세라마이드 합성효소 리간드)에 대한 항체의 단편을 포함한다. 항체 단편의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 무손상 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2 단편, 및 F(ab')2 단편의 이황화 결합의 환원에 의해, 생성될 수 있는 Fab 단편을 포함한다. 항체 단편의 다른 예는 제한 없이, Fv 및 특히 scFv를 포함한다. 대안적으로, Fab 및/또는 scFv 발현 라이브러리를 작제하여, 글리코실세라마이드 합성효소에 대한 적절한 특이성을 갖는 단편을 빨리 확인할 수 있다.
강글리오사이드 대사 경로의 적어도 하나의 효소 또는 그의 리간드 또는 보조인자에 대한 인간화 항체 (또는 그의 단편)가 또한 공지된 기법에 따라 제조될 수 있다. "인간화 항체"는 비 인간 면역글로불린으로부터 유래한 최소의 서열을 포함하는 비 인간 (예를 들어, 설치류) 키메라 항체의 형태이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용체의 초가변 영역 (CDR)으로부터의 잔기를 적절한 특이성, 친화도 및 용량을 갖는 마우스, 랫트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비 인간 종 (공여체 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체한 인간 면역글로불린 (수용체 항체)이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비 인간 잔기로 대체한다. 추가로, 인간화 항체는 수용체 항체 또는 공여체 항체에 존재하지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해, 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나 및 통상적으로 2개의 가변 도메인의 실질적 전부를 포함할 것이며, 초가변 루프의 전부 또는 실질적 전부는 비 인간 면역글로불린의 초가변 루프에 상응하고, FR의 전부 또는 실질적 전부는 인간 면역글로불린의 FR이다. 또한, 인간화 항체는 선택적으로, 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 통상적으로 인간 면역글로불린의 Fc의 적어도 일부를 포함할 것이다. 인간화 항체의 제조 방법은, 예를 들어, 윈터 (Winter) (미국 특허 제 5,225,539호) 및 보스 (Boss) (Celltech, 미국 특허 제 4,816,397호)에 의해, 기재되어 있다.
그 후, 상기에 기재된 바와 같은 강글리오사이드 대사 경로의 효소 (예를 들어, 글리코실세라마이드 합성효소) 또는 리간드 또는 그의 보조인자에 대한 항체의 생성 후에, 당업자는 강글리오사이드 대사 경로의 효소의 활성화를 차단하는 것을 용이하게 선택할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 길항제는 앱타머이다. 앱타머는 분자 인식의 관점에서 항체의 대체가 되는 부류의 분자이다. 앱타머는 높은 친화도 및 특이성을 갖는 실질적으로 임의의 부류의 표적 분자를 인식할 수 있는 능력을 갖는 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고펩타이드 서열이다. 이러한 리간드는 문헌 [Tuerk C. and Gold L., 1990]에 기재된 바와 같은 무작위 서열 라이브러리의 지수적 다량화 (SELEX)에 의한 리간드의 체계적 진행(Systematic Evolution of Ligand)을 통해 단리될 수 있다. 이러한 무작위 서열 라이브러리는 DNA의 조합 화학 합성에 의해 획득 가능하다. 이 라이브러리에서, 각 구성원은 화학적으로 변형된 고유한 서열의 직쇄 올리고머이다. 이러한 부류의 분자의 가능한 변형, 용도 및 이점은 문헌 [Jayasena S.D., 1999]에서 재검토되었다. 펩타이드 앱타머는 2개의 혼성체 방법에 의한 조합 라이브러리로부터 선택되는 E. 콜라이 티오레독신 A와 같은 플랫폼 단백질에 의해 디스플레이되는 구조적으로 제한된 항체 가변 영역으로 구성된다 (문헌 [Colas et al., 1996]).
그 후, 상기에 기재된 바와 같은 강글리오사이드 대사 경로의 적어도 하나의 효소 또는 리간드 또는 그의 보조인자에 대한 앱타머의 생성 후, 당업자는 효소 활성화를 차단하는 강글리오사이드 대사 경로의 것을 용이하게 선택할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명에 사용하기 위한 억제제는 강글리오사이드 대사 경로의 적어도 하나의 효소 (또는 그의 적어도 하나의 보조인자)의 유전자 발현의 억제제이다. 일 실시형태에서, 용어 "억제하다"는 기준 발현 수준과 비교하여, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 이하의 기준 발현 수준 이하의 수준과 같은 저하된 발현 수준을 지칭한다. 일 실시형태에서, 유전자 발현에 대한 그 영향을 시험한 화합물과 세포의 접촉 후, 유전자 발현의 억제를 측정하고, 기준 발현 수준은 상기 화합물과 접촉되지 않은 세포에서 측정된 발현 수준에 상응한다.
유전자 발현의 수준의 측정 방법은 당업자에 널리 공지되어 있으며, 제한 없이, 트랜스크립톰 (transcriptome) (유전자의 전사 수준과 관련된 실시형태) 및/또는 프로테옴 (proteome) (유전자의 번역 수준과 관련된 실시형태)을 측정하는 단계를 포함한다.
유전자 발현의 수준의 측정 방법은 제한 없이, 유전자 산물의 수준을 상기 유전자 산물의 전사 수준 또는 번역 수준 또는 분비/방출 수준에서 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 유전자 발현의 수준을 전사 수준 (즉, mRNA 수준)에서 평가한다.
유전자의 전사 수준을 평가하기 위한 시험관내 방법은 종래 기술에 널리 공지되어 있다. 이러한 방법의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 차세대 DNA 시퀀싱 (NGS) 또는 RNA-seq (또한 "전체 트랜스크립톰 샷건 시퀀싱 (Whole Transcriptome Shotgun Sequencing)"으로도 일컬어짐) 등과 같은 시퀀싱인 RT-PCR에 의해 획득된 앰플리콘의 혼성화를 포함하여, 예를 들어 마이크로어레이의 사용과 같은 RT-PCR, RT-qPCR, 노던 블롯, 혼성화 기법 및 이들의 조합을 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 유전자 발현의 수준을 번역 수준 (즉, 단백질 수준)에서 평가한다.
유전자의 번역 수준을 평가하기 위한 시험관내 방법은 종래 기술에 널리 공지되어 있다. 이러한 방법의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 면역조직화학법, 다중복합 방법 (Luminex), 웨스턴 블롯, 효소-연결 면역흡착제 분석 (ELISA), 샌드위치 ELISA, 형광 연결 면역흡착제 분석 (FLISA), 효소 면역분석 (EIA), 방사성면역분석 (RIA), 유동 세포계측 (FACS) 등을 포함한다.
강글리오사이드 대사 경로의 적어도 하나의 효소 (또는 그의 보조인자)의 유전자 발현의 억제제의 예는 제한 없이, RNAi, 올리고뉴클레오타이드 안티센스 (제한 없이, 안티센스 RNA 또는 DNA 분자 포함), 작은 억제 RNA (siRNA), 리보자임, 앱타머, 모르폴리노 및 조작된 뉴클레아제를 포함한다.
강글리오사이드 대사 경로의 적어도 하나의 효소 (또는 그의 보조인자)의 유전자 발현의 억제제의 다른 예는 제한 없이, 안티센스 RNA 또는 DNA 분자, 작은 억제 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로 RNA (miRNA), DNA 효소, 변형 또는 합성 DNA 또는 RNA 분해- 내성 폴리뉴클레오사이드 아미드화물, 펩타이드 핵산 (PNA), 잠긴 핵산 (LNA) 및 다른 핵염기-포함 중합체를 포함한다.
일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 경로의 적어도 하나의 효소 (또는 그의 보조인자)의 유전자 발현의 억제제는 miRNA이다. miRNA는 RNA-유도 침묵화 복합체 (RISC) 상에 로딩되고, 단백질 발현을 억제하는 mRNA에 대해 부분적으로 상보성인 표적과 상호작용하는 유전자-조절 RNA이다. miRNA는 일반적으로 단일 가닥이며, RISC에 로딩시, miRNA "가이드" 서열 (또한 시딩 영역으로서 지칭됨)은 표적 mRNA와 상호작용할 수 있는 RISC의 표면에 유지된다. miRNA 가이드 서열에 의해 인식되는 표적은 가장 통상적으로는 RNA의 3'-비번역 영역 (UTR)에 존재한다. 번역의 개시시에 mRNA가 원형 형태로 결합하여, 3'-UTR 및 5'-UTR을 근접시키므로, 결합에 의해, mRNA의 5' 캡상의 개시 복합체의 조립이 억제될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명에 사용하기 위한 강글리오사이드 대사 경로의 적어도 하나의 효소 (또는 그의 보조인자)의 유전자 발현의 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 작제물을 기반으로 한다. 안티센스 RNA 분자 및 안티센스 DNA 분자를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 강글리오사이드 대사 경로의 효소 (예를 들어, 강글리오사이드 합성효소) mRNA (또는 그의 보조인자)와 결합함으로써, 단백질 번역을 방지하거나, mRNA 분해를 증가시켜, 세포에서 강글리오사이드 대사 및 그에 따른 활성의 수준을 저하시킴으로써, 그의 번역을 직접적으로 차단하는 작용을 할 것이다. 예를 들어, 강글리오사이드 합성효소를 인코딩하는 mRNA 전사체 서열의 고유 영역에 상보성인 적어도 약 15개의 염기의 안티센스 올리고뉴클레오타이드가, 예를 들어 통상의 포스포디에스테르 기법에 의해 합성될 수 있으며, 예를 들어 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여될 수 있다. 서열이 공지된 유전자의 유전자 발현을 특이적으로 억제하기 위한 안티센스 기법을 사용하는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 제 6,566,135호; 제 6,566,131호; 제 6,365,354호; 제 6,410,323호; 제 6,107,091호; 제 6,046,321호 및 제 5,981,732호 참조).
작은 억제 RNA (siRNA)는 또한 본 발명에 사용하기 위한 강글리오사이드 대사 경로의 적어도 하나의 효소 (또는 그의 보조인자)의 유전자 발현의 억제제로서 기능할 수 있다.
강글리오사이드 대사 (또는 그의 보조인자)의 적어도 하나의 효소의 유전자 발현은 작은 이중 가닥 RNA (dsRNA), 또는 작은 이중 가닥 RNA의 생성을 유발하는 벡터 또는 작제물과 대상체 또는 세포의 접촉에 의해 감소할 수 있음으로 해서, 강글리오사이드 대사 경로의 효소 (예를 들어, 글리코실세라마이드 합성효소) 또는 그의 보조인자의 유전자 발현이 특이적으로 억제된다 (즉 RNA 간섭 또는 RNAi). 서열이 공지된 유전자에 대한 적절한 dsRNA 또는 dsRNA-인코딩 벡터의 선택 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌 [Tuschl, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et al. (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, TR. et al. (2002)]; 미국 특허 제　6,573,099호 및 제　6,506,559호; 및 국제 특허 공개 제 WO01/36646, WO　99/32619, 및 WO01/68836 참조).
리보자임은 또한 본 발명에 사용하기 위한 강글리오사이드 대사 경로의 적어도 하나의 효소 (또는 그의 보조인자)의 유전자 발현의 억제제로서 기능할 수 있다. 리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매 작용할 수 있는 효소적 RNA 분자이다. 리보자임 작용 메커니즘은 상보성 표적 RNA와 리보자임 분자의 서열 특이적 혼성화 후, 핵산 내부 분해에 의한 절단 (endonucleolytic cleavage)을 수반한다. 따라서, 강글리오사이드 합성효소 mRNA 서열의 핵산 내부 분해에 의한 절단을 특이적이고, 효과적으로 촉매 작용하는 조작된 헤어핀 (hairpin) 또는 해머해드 (hammerhead) 모티프 리보자임 분자가 본 발명의 범위 내에서 유용할 수 있다. 임의의 잠재적 RNA 표적 내의 특이적 리보자임 절단 부위는, 통상적으로 다음 서열, GUA, GUU, 및 GUC를 포함하는 리보자임 절단 부위에 대한 표적 분자를 조사함으로써, 초기에 확인된다. 확인된 경우, 절단 부위를 포함하는 표적 유전자의 영역에 해당하는 약 15 내지 20개의 리보뉴클레오타이드 사이의 짧은 RNA 서열은, 올리고뉴클레오타이드 서열을 부적합하게할 수 있는 2차 구조와 같은 예측되는 구조적 특징에 대해 평가될 수 있다. 또한, 예를 들어, 리보뉴클레아제 보호 분석을 사용하여, 상보성인 올리고뉴클레오타이드와의 혼성화에 대한 후보 표적의 접근 가능성을 시험함으로써, 그의 적합성을 또한 평가할 수 있다.
강글리오사이드 대사 경로의 적어도 하나의 효소 또는 효소의 보조인자 유전자 발현의 억제제로서 유용한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 리보자임은 둘 모두 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 이는, 예를 들어, 고체상 포스포아마다이트 화학적 합성과 같은 화학적 합성을 위한 기법을 포함한다. 대안적으로, RNA 분자를 인코딩하는 DNA 서열의 시험관내 또는 생체내 전사에 의해 안티센스 RNA 분자를 생성할 수 있다. 적합한 RNA 중합효소 프로모터, 예컨대, T7 또는 SP6 중합효소 프로모터를 혼입시키는 광범위한 벡터로 이러한 DNA 서열을 혼입시킬 수 있다. 세포내 안정성 및 반감기를 증가시키는 수단으로서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드에 대한 다양한 변형을 도입시킬 수 있다. 가능한 변형은 다음에 제한되는 것은 아니나, 올리고뉴클레오타이드 골격 내의 포스포디에스테라제 연결 이외에, 포스포로티오에이트 또는 2'-O-메틸의 사용 또는 분자의 5' 및/또는 3' 말단에의 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드의 측접 서열의 첨가를 포함한다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 siRNA 및 리보자임은 단독으로 또는 벡터와 결합하여 생체내에 전달될 수 있다. 그의 가장 광범위한 의미에서, "벡터"는 세포 및 바람직하게는 강글리오사이드 대사 경로의 적어도 하나의 효소를 발현하는 세포에의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 siRNA 또는 리보자임 핵산의 전달을 촉진할 수 있는 임의의 비히클이다. 바람직하게는, 벡터는 세포에 핵산을 수송하여, 벡터의 부재 하에 유발되는 분해 정도에 비해, 분해를 감소시킨다. 일반적으로 본 발명에 유용한 벡터는 다음에 제한되는 것은 아니나, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 siRNA 또는 리보자임 핵산 서열의 삽입 또는 혼입에 의해 조작된 플라스미드, 파지미드, 바이러스, 바이러스 또는 박테리아 공급원으로부터 유래한 다른 비히클을 포함한다. 바이러스 벡터는 바람직한 유형의 벡터이며, 다음에 제한되는 것은 아니나, 다음 바이러스로부터의 핵산 서열을 포함한다: 레트로바이러스, 예컨대 몰로니 쥣과동물 백혈병 바이러스, 하비 쥣과동물 육종 바이러스 (harvey murine sarcoma virus), 쥣과동물 유방 종양 바이러스 및 라우스 육종 바이러스 (rouse sarcoma virus); 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스; SV40-형 바이러스; 폴리오마 바이러스 (polyoma virus); 엡스테인-바르 바이러스 (Epstein-Barr virus); 파필로마 바이러스 (papilloma virus); 헤르페스 바이러스 (herpes virus); 백시니아 바이러스 (vaccinia virus); 폴리오 바이러스 (polio virus); 및 RNA 바이러스, 예컨대, 레트로바이러스. 당 업계에 공지되어 있으나, 언급되지 않은 다른 벡터를 용이하게 사용할 수 있다.
바람직한 바이러스 벡터는, 비 필수 유전자가 대상 유전자로 교체된 비 세포변성 진핵세포성 바이러스를 기반으로 한다. 비 세포 변성 바이러스는, 그 수명주기가 게놈 바이러스 RNA의 DNA로의 역전사와 숙주 세포 DNA로의 후속 프로바이러스 혼입을 수반하는 레트로바이러스 (예를 들어, 렌티바이러스)를 포함한다. 레트로바이러스는 인간 유전자 요법 시험을 위해 승인되었다. 가장 유용한 것은 복제 불능의 (즉, 목적 단백질의 합성을 유도할 수 있으나, 감염성 입자를 제조할 수 없는) 레트로바이러스이다. 이렇게 유전적으로 변형된 레트로바이러스 발현 벡터는 생체내 유전자의 고효율 형질도입에 일반적으로 유용하다. 복제 불능 레트로바이러스의 생성을 위한 표준 프로토콜 (플라스미드로의 외인성 유전 물질의 도입 단계, 플라스미드로 라이닝된 패키징 세포의 형질감염 단계, 패키징 세포주에 의한 재조합 레트로바이러스의 생성 단계, 조직 배양 배지로부터의 바이러스 입자의 수집 단계, 바이러스 입자에 의한 표적 세포의 감염 단계 포함)이 문헌 [Kriegler, Oxford University Press, USA 1993 and in Murry, vol 7 Humana Press 1991]에서 제공된다.
특정 용도에 바람직한 바이러스는 유전자 요법에서 인체용으로 이미 승인된 이중 가닥 DNA 바이러스인 아데노 바이러스 및 아데노 연관 바이러스이다. 아데노 연관 바이러스는 복제가 불능하고, 광범위한 세포 유형 및 종을 감염시킬 수 있도록 조작될 수 있다. 이는 추가로, 예를 들어, 열 및 지질 용매 안정성; 다양한 계통의 세포에서의 높은 형질도입 빈도, 및 중복감염 억제의 부재의 이점을 가짐으로써, 다회의 일련의 형질도입이 가능하다. 보고된 바에 따르면, 아데노 연관 바이러스는 부위 특이적 방식으로 인간의 세포 DNA에 혼입되어, 레트로 바이러스 감염의 특징인 삽입 유전자 발현의 가변성 및 삽입 돌연변이 유발 가능성을 최소화할 수 있다. 추가로, 야생형 아데노 연관 바이러스 감염이 선택적 압력의 부재 하에, 조직 배양에서 100회 초과의 계대배양 동안 이어지며, 이는 아데노 연관 바이러스 게놈 혼입이 상대적으로 안정한 사건임을 의미한다. 아데노 연관 바이러스는 또한 염색체외의 방식으로 기능할 수 있다.
다른 벡터는 플라스미드 벡터를 포함한다. 플라스미드 벡터는 당 업계에 광범위하게 기재되어 있으며, 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1989]을 참조한다. 지난 몇 년 동안, 플라스미드 벡터는 생체내에서 항원 인코딩 유전자를 세포에 전달하기 위한 DNA 백신으로 사용되어 왔다. 이는 많은 바이러스 벡터와 같은 안전성 문제가 없기 때문에, 특히 유리하다. 그러나, 숙주 세포에 적합한 프로모터를 갖는 이러한 플라스미드는 플라스미드 내에 작동 가능하게 인코딩된 유전자로부터 펩타이드를 발현할 수 있다. 통상적으로 사용되는 일부 플라스미드는 pBR322, pUC18, pUCl9, pRC/CMV, SV40, 및 pBlueScript를 포함한다. 다른 플라스미드는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 추가로, 플라스미드는 DNA의 특정 단편의 제거 및 첨가를 위해, 제한 효소 및 결찰 반응을 사용하여, 지정 설계할 수 있다. 플라스미드는 다양한 비경구, 점막 및 국소 경로에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, DNA 플라스미드는 근육내, 경피, 피하 또는 다른 경로로 주입될 수 있다. 이는 또한 비강내 스프레이, 점액제, 직장 좌약 및 경구 투여될 수 있다. 이는 또한 유전자 총을 사용하여 표피 또는 점막 표면에 투여될 수 있다. 플라스미드는 다음에 제한되는 것은 아니나, 리포솜, 덴드리머, 과립 및 미세캡슐화를 포함하는 또 다른 DNA 전달 시스템과 연계하거나, 금 입자 상에서 건조된 수용액 중에 제공될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 강글리오사이드 대사의 억제제는 모르폴리노 올리고머 및 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)으로도 일컬어지는 모르폴리노일 수 있다. 모르폴리노는 유전자 발현을 변형하기 위해, 분자 생물학에서 사용되는 올리고머 분자 (올리고로 일컬어짐)의 한 유형이다. 분자 구조는 메틸렌모르폴린 고리 및 포스포로디아미데이트 연결의 골격을 가지고 있다. 모르폴리노는 리보핵산 (RNA)의 염기쌍 형성 표면의 작은 (약 25개의 염기의) 특정 서열에 대한 다른 분자의 접근을 차단한다.
본 발명에 사용하기 위한 강글리오사이드 대사의 억제제는 게놈 편집에 사용되는 "분자 가위 또는 조작된 뉴클레아제일 수 있다. 게놈 편집 또는 조작된 뉴클레아제에 의한 게놈 편집 (GEEN)은 당업자에게 널리 공지된 "분자 가위" 또는 조작된 뉴클레아제를 사용하여, 유기체의 게놈에서 DNA를 삽입, 결실 또는 치환하는 일종의 유전공학이다. 이러한 뉴클레아제는 게놈 내의 목적 위치에 부위 특이적 이중 가닥 절단 (DSB)을 생성한다. 표적 돌연변이를 유발하는 것으로, 유도된 이중 가닥 절단은 비 상종 말단 결합 (NHEJ) 또는 상동성 재조합 (HR)을 통해 수선된다. 현재 메가뉴클레아제 (meganuclease), 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성형 이펙터 기반 뉴클레아제 (TALEN), CRISPR-Cas 시스템의 4가지 계열의 조작된 뉴클레아제가 사용된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 억제제는 모노-시알로강글리오사이드 (GM) 1a, GM1b, GM2, GM3 및/또는 GM4; 디-시알로강글리오사이드 (GD)1a, GD1b, GD1c, GD1α, GD2, GD3; 트리-시알로강글리오사이드 (GT)1a, GT1b, GT2, GT3; 쿼드리-시알로강글리오사이드 (GQ)1b, GQ1c, GQ2, GQ3; 펜타-시알로강글리오사이드 (GP)1c의 축적을 억제한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 억제제는 GM2, GM3, GD2 및/또는 GD3의 축적을 억제한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 억제제는 모노-시알로강글리오사이드 (GM) 1a, GM1b, GM2, GM3 및/또는 GM4; 디-시알로강글리오사이드 (GD)1a, GD1b, GD1c, GD1α, GD2, GD3; 트리-시알로강글리오사이드 (GT)1a, GT1b, GT2, GT3; 쿼드리-시알로강글리오사이드 (GQ)1b, GQ1c, GQ2, GQ3; 펜타-시알로강글리오사이드 (GP)1c의 응집을 억제한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 억제제는 GM2, GM3, GD2 및/또는 GD3의 응집을 억제한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 억제제는 GM2의 합성, 축적 및/또는 응집을 억제한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 억제제는 GM3의 합성, 축적 및/또는 응집을 억제한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 억제제는 GD2의 합성, 축적 및/또는 응집을 억제한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 억제제는 GD3의 합성, 축적 및/또는 응집을 억제한다.
일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 글리코실세라마이드 합성효소 또는 그의 보조인자를 억제한다.
또 다른 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 GM3 합성효소 또는 그의 보조인자를 억제한다.
또 다른 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 GM2 합성효소 또는 그의 보조인자를 억제한다.
또 다른 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 GD3 합성효소 또는 그의 보조인자를 억제한다.
또 다른 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 GD2 합성효소 또는 그의 보조인자를 억제한다.
또 다른 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 락토실세라마이드 합성효소 또는 그의 보조인자를 억제한다.
또 다른 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 β1,4-GalNAc 전이효소 또는 그의 보조인자를 억제한다.
또 다른 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 β-1,4-N-아세틸-갈락토스아미닐전이효소 또는 그의 보조인자를 억제한다.
또 다른 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 UDP-Gal:βGalNAc β-1,3-갈락티실전이효소 또는 그의 보조인자를 억제한다.
또 다른 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 시알릴전이효소 IV 또는 그의 보조인자를 억제한다.
또 다른 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 시알릴전이효소 VII 또는 그의 보조인자를 억제한다.
또 다른 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 Gb3 합성효소 또는 그의 보조인자를 억제한다.
또 다른 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 iGb3 합성효소 또는 그의 보조인자를 억제한다.
또 다른 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 Lc3 합성효소 또는 그의 보조인자를 억제한다.
또 다른 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 GT1c 합성효소 또는 그의 보조인자를 억제한다.
또 다른 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 GT2 합성효소 또는 그의 보조인자를 억제한다.
또 다른 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 GT3 합성효소 또는 그의 보조인자를 억제한다.
또 다른 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 GA1 합성효소 또는 그의 보조인자를 억제한다.
또 다른 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 GA2 합성효소 또는 그의 보조인자를 억제한다.
또 다른 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 GD1b 합성효소 또는 그의 보조인자를 억제한다.
또 다른 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 GM1a 합성효소 또는 그의 보조인자를 억제한다.
글리코실세라마이드 합성효소 억제제의 예는 제한 없이, 다음 군의 화합물을 포함한다: 이미노 당, D-트레오-1-페닐-2-데카노일아미노-3-모르폴리노-프로판올 (PDMP)의 유사체 또는 세라마이드 유사체, 카복사미드, 카바메이트, 펩타이드, 글리코사이드 가수분해효소, 및 효소 요법.
본 발명의 일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 이미노 당 화합물이다.
이미노 당 화합물의 예는 제한 없이, 다음 하위 군을 포함한다: 알킬-치환된 이미노 당 화합물, 아다만틸-치환된 이미노 당 화합물, 및 피롤리딘 유도체 이미노 당 화합물.
본 발명의 일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 알킬-치환된 이미노 당 화합물이다.
알킬-치환된 이미노 당 화합물의 예는 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함되는 특허 출원 WO2007140184, WO2011086347, EP0566556, WO2011095772, WO2015147639, 문헌 [Richards S et al. (J Med Chem. 2012 May 10;55(9):4322-35), Froehlich RF et al. Carbohydr Res. 2011 Sep 6; 346(12): 1592-1598]에 기재되어 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 아다만틸-치환된 이미노 당 화합물이다.
아다만틸-치환된 이미노 당 화합물의 예는 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함되는 특허 출원 WO2007140184, WO2005040118, WO2015147639에 기재되어 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 피롤리딘 유도체 이미노 당 화합물이다.
피롤리딘 유도체 이미노 당 화합물의 예는 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함되는 특허 출원 WO2007140184, WO2011086347, WO2011095772, WO2012117219, WO2013059119, 문헌 [Jenkinson et al. J. Org. Chem., 2013, 78 (15), pp 7380-7397]에 기재되어 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 본 명세서에 참조로 포함되는 특허 출원 미국 특허 6,610,703에 기재된 바와 같은 화합물로서, N-노닐-DNJ 또는 N-데실-DNJ로부터 선택된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 본 명세서에 참조로 포함되는 특허 출원 WO2007140184에 기재된 화합물이며, 바람직하게는 N-(N'-{4'-아지도-2'-니트로페닐)-6-아미노헥실)-데옥시노지리마이신, N-(N'-{2',4'-디니트로페닐)-6-아미노헥실)-데옥시노지리마이신 (NAP-DNJ), N-(N'-{2,4-디니트로페닐)-6-아미노헥실)-DNJ (NDP-DNJ), N-(알킬페닐)-DNJ 유도체, 및 N-부틸-DNJ (NB-DNJ)를 포함하는 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 본 명세서에 참조로 포함되는 특허 출원 WO2007140184에 기재된 바와 같은 화합물이며, 다음 화학식을 포함하는 군으로부터 선택된다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
여기서, R은 다음과 같다:
Figure pct00004
여기서, R'는 다음과 같다:
Figure pct00005
여기서, R1은 치환되거나, 치환되지 않은 알킬기이고;
R2는 치환되거나, 치환되지 않은 알킬기이고;
Q는 부재하거나, CH이고, 단, Q가 부재하는 경우, OW1이 또한 부재하고;
W1-4는 독립적으로 수소, 치환되거나, 치환되지 않은 알킬기, 치환되거나, 치환되지 않은 할로알킬기, 치환되거나, 치환되지 않은 알카노일기, 치환되거나, 치환되지 않은 아로일기, 또는 치환되거나, 치환되지 않은 할로알카노일기로부터 선택되고;
X1-5는 독립적으로 H, NO2, N3, 또는 NH2으로부터 선택되고;
Y는 부재하거나, 카보닐 이외의 치환되거나, 치환되지 않은 Q-알킬기이고;
Z는 결합 또는 NH로부터 선택되고;
단, Z가 결합인 경우, Y는 부재하고,
단, Z가 NH인 경우, Y는 카보닐 이외의 치환되거나, 치환되지 않은 Q-알킬기이며;
Z'는 결합 또는 NH이다.
피롤리딘 유도체의 추가의 예는 또한 본 명세서에 참조로 포함되는 WO2012117219에 기재되어 있으며, 제한 없이, 이소DAB (1,4-디데옥시-2-하이드록시메틸-1,4-이미노-D-트레이톨); 이소DMDP, 이소DGDP, 및 L-이소DMDP[(2S,3S,4R)-2,4-비스(하이드록시메틸)피롤리딘-3,4-디올]을 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 특허 출원 WO2011086347에 기재된 바와 같은 화합물이며, (3S, 4S)-3-(하이드록시메틸)피롤리딘-3,4-디올 (1,4-디데옥시-2-하이드록시메틸-1,4-이미노-L-트레이톨 (이소LAB) 및 다음 화학식을 갖는 화합물 또는 이들의 등배전자체, 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 유도체 (즉, 본 명세서의 상기에 개시된 화합물의 화학적 유도체화에 의해 획득된 (또는 획득할 수 있는) 화합물)를 포함한다:
Figure pct00006
여기서, R1은 H; 직쇄 또는 분지쇄의 치환되거나, 치환되지 않은 알킬, 알케닐, 알키닐 및 아르알킬로부터 선택되고, 선택적 치환은 독립적으로-OH; -F; -CI; -Br; -I; -NH2; 알킬아미노; 디알킬아미노; 직쇄 또는 분지쇄의 알킬, 알케닐, 알키닐 및 아르알킬; 아릴; 헤테로아릴; 직쇄 또는 분지쇄의 알콕시; 아릴옥시; 아르알콕시; -(알킬렌)옥시(알킬); -CN; -NO2; -COOH; -COO(알킬); -COO(아릴); -C(O)NH(알킬); -C(O)NH(아릴); 술포닐; 알킬술포닐; 아릴술포닐; 술파모일; 알킬술파모일; 알킬티오; 알킬술폰아미드; 아릴술폰아미드; -NHNH2; 및-NHOH로부터 선택되는 하나 이상의 기에 의한 것일 수 있다.
일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 본 명세서에 참조로 포함되는 특허 출원 WO2013059119에 기재된 바와 같은 글리코실세라마이드 합성효소를 억제하는 화합물이며, N-((1R,2R)-1-(2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-일)-1-하이드록시-3-(피롤리딘-1-일)프로판-2-일)신남아미드, N-((1R,2R)-1-(2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-일)-1-하이드록시-3-(피롤리딘-1-일)프로판-2-일)-2-페닐사이클로프로판카복사미드, 2-(2,3-디하이드로-1 H-인덴-2-일)-N-((1R,2R)-1-(2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-일)-1-하이드록시-3-(피롤리딘-1-일)프로판-2-일)아세트아미드, N-((1R,2R-1-(2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-일)-1-하이드록시-3-(피롤리딘-1-일)프로판-2-일)-2,3-디하이드로-1H-인덴-2-카복사미드, N-((1R,2R)-1-(2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-일)-1-하이드록시-3-(피롤리딘-1-일)프로판-2-일)-N-메틸-3-페닐프로판아미드, N-((1R,2R)-1-하이드록시-1-(2-메톡시페닐)-3-(피롤리딘-1-일)프로판-2-일)옥탄아미드, N-((1R,2R)-1-(3-(디메틸아미노)페닐)-1-하이드록시-3-(피롤리딘-1-일)프로판-2-일)옥탄아미드, N-((1R,2R)-1-(2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-일)-1-하이드록시-3-(피롤리딘-1-일)프로판-2-일)-3-(3-플루오로페닐)프로판아미드, N-((1R,2R)-1-(2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-일)-1-하이드록시-3-(피롤리딘-1-일)프로판-2-일)-3-(4-플루오로페닐)프로판아미드, N-((1R,2R)-1-(2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-일)-1-하이드록시-3-(피롤리딘-1-일)프로판-2-일)-3-페닐부탄아미드, N-((1R,2R)-1-(2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-일)-1-하이드록시-3-(피롤리딘-1-일)프로판-2-일)-3-(2-메톡시페닐)프로판아미드, N-((1R,2R)-1-(2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-일)-1-하이드록시-3-(피롤리딘-1-일)프로판-2-일)-2-(페닐아미노)아세트아미드, 2-(2,3-디하이드로-1H-인덴-2-일)-N-((1R,2R)-1-(2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-일)-1-하이드록시-3-(피롤리딘-1-일)프로판-2-일)아세트아미드 옥실레이트 일수화물, 및 N-((1R,2R)-1-(2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-일)-1-하이드록시-3-(피롤리딘-1-일)프로판-2-일)-2-페닐아세트아미도를 포함하는 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 특허 출원 WO2013059119에 기재되어 있으며, 다음 화학식을 갖는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염, 용매화물, 수화물 또는 전구약물이다:
Figure pct00007
여기서:
R1은 H 또는 C1-3알킬이고;
R2는 (i) -(CH2)1-3C6H5 (단, R1은 -C1-3알킬임);
(ii) -CH2-C(Ra 2)1,2-C6H5 (Ra는 독립적으로 H 또는 C1-3 알킬이며; 단, 적어도 하나의 Ra는 C1-3알킬임);
(iii) -(CH2)1,2NHC6H5;
(iv) -CH=CHC6H5;
(v)
Figure pct00008
,
((i) 내지 (v)에서, C6H5 기는 1 또는 2개의-할로 또는 -ORa로 선택적으로 치환됨) 또는
(vi)
Figure pct00009
이고,
융합된 고리 A는 포화되거나, 부분적으로 불포화되고, 탄소 원자 및 선택적으로 O, S 및 NRa로부터 선택되는 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 4- 내지 8-원 고리이고, 융합된 페닐 고리는 1 또는 2개의 치환기로 선택적으로 치환되고;
R3은
Figure pct00010
또는
Figure pct00011
이고,
융합된 고리 B는 포화되거나, 부분적으로 또는 완전히 불포화되고, 탄소 원자 및 O, S 및 NRa로부터 선택되는 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 5- 또는 6-원 고리이고, 페닐 고리는 1 또는 2개의 치환기로 선택적으로 치환된다.
특히, 강글리오사이드 대사 억제제는 본 명세서에 참조로 포함되는 특허 출원 WO2013059119에 기재되어 있으며, 다음 화학식을 갖는 화합물을 포함하는 군으로부터 선택된다:
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
.
피롤리딘 유도체 이미노 당 화합물의 예는 제한 없이, 하이드록실화된 피롤리딘 유도체 및 치환된 피롤리딘 유도체를 포함한다.
피롤리딘 유도체 이미노 당의 예는 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌 [Jenkinson et al. J.　Org.　Chem., 2013, 78 (15), pp 7380-7397]에 기재되어 있으며, 제한 없이, 1,4-디데옥시-2-하이드록시메틸-1,4-이미노-D-트레이톨 (이소DAB); (2S,3S,4R)-2,4-비스(하이드록시메틸)피롤리딘-3,4-디올 (이소DMDP), 이소DMDP, 및 이소DGDP의 거울상이성질체 쌍을 포함한다.
하이드록실화된 피롤리딘 유도체의 예는 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌 [Takayama S et al. (Bioorg Med Chem. 1999 Feb;7(2):401-9]에 기재되어 있으며, 제한 없이, 다음 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
.
치환된 피롤리딘 유도체의 예는 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌 [Saotome C et al. (Chem Biol. 2001 Nov;8(11):1061-70]에 기재되어 있으며, 제한 없이, 다음 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00036
여기서, X는 BuNH, (CH3)2NCH2CH2NH, CH3(CH2)9NH, HOCH2CH2NH, CH3O(CH2)3NH, PhCH2CH2NH 또는 다음 화학식을 갖는 화합물이다:
Figure pct00037
여기서, Y는 H, CH2NH2 또는 CONH2이다.
일 실시형태에서, 이미노 당 기로부터의 강글리오사이드 대사 억제제는 제한 없이, 데옥시노지리마이신 (DNJ)으로도 일컬어지는 1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨; 미글루스타트 (Miglustat), 자베스카 (Zavesca)™로도 일컬어지는 N-부틸데옥시노지리마이신 (NB-DNJ); N-하이드록시에틸-DNJ (미글리톨 (miglitol)); N-(5-아다만탄-1-일-메톡시펜틸) 데옥시노지리마이신 (AMP-DNJ)으로도 일컬어지는 미글루스타트의 아다만틸 유사체; N-부틸-1-데옥시-노지리마이신 (KTB-DNJ); N-에틸-1-데옥시노지리마이신 (NE-DNJ); N-부틸데옥시만노직사마이신; N-5-카복실-1-데옥시노지라마이신; N-도세실-1-데옥시노지리마이신; 노지리마이신 바이술페이트; 노직시마이신-1-술폰산; N-(n-노닐)-1-데옥시노지리마이신; N-(7-옥사데실)-1-데옥시노지리마이신; N-(7-옥사-9,9,9,-트리플루오로노닐)-1-데옥시노지리마이신; (2R,3S,4R,5S)-2-(하이드록시메틸)-3,4,5-피페리딘트리올 또한 이른바 1-데옥시 갈락토노지리마이신 (DGJ) 또는 미갈라스타트 (migalastat); N-부틸데옥시갈락토노지리마이신 (NB-DGJ); N-(n-노닐)데옥시노지리마이신; (3S, 4S)-3-(하이드록시메틸)피롤리딘-3,4-디올 (이소LAB); 1,4-디데옥시-1,4-이미노-D-아라비니톨, (2S,3R,4S,5R)-3,4,5-트리하이드록시-6-옥소피페리딘-2-카복실산 또는 D-글루카로-델타-락탐을 포함한다.
일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 미글루스타트이다.
데옥시노지리마이신 유도체의 합성 방법은, 예를 들어, 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제 5,622,972호; 제 5,200,523호; 제 5,043,273호; 제 4,994,572호; 제 4,246,345호; 제 4,266,025호; 제 4,405,714호; 및 제 4,806,650호 및 미국 특허 출원 공개 제 2007/0275998호에 개시되어 있다.
1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨의 유도체의 합성 방법은 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제 5,525,616호; 제 5,472,969호; 제 6,660,749호 및 제 6,465,488호에 기재되어 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 세라마이드 유사체이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 1-페닐-2-데카노일아미노-3-모르폴리노-프로판올 (PDMP) 유사체이다.
1-페닐-2-데카노일아미노-3-모르폴리노-프로판올 (PDMP)의 세라마이드 유사체 또는 유사체의 예는 제한 없이, D-트레오-1-페닐-2-데카노일아미노-3-모르폴리노-프로판올 (PDMP); PDMP의 거울상이성질체, L-트레오-및 DL-에리트로-1-페닐-2-아미노-1,3-프로판디올, D-트레오 (R,R) 거울상이성질체; 1-페닐-2-팔미토일아미노-3-모르폴리노-1-프로판올 (PPMP); 1-페닐-2-팔미토일아미노-3-피롤리디노-1-프로판올 (P4), D-트레오-1-에틸렌디옥시페닐-2-팔미토일-3-피롤리디노-프로판올 (EtDO-P4); DL-트레오-1-페닐-2-팔미토일아미노-3-피롤리디노-1-프로판올 (DL-트레오-P4); 2-(2,3-디하이드로-1H-인덴-2-일)-N-((1R,2R)-1-(2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-일)-1-하이드록시-3-(피롤리딘-1-일)프로판-2-일)아세트아미드; Genz-112638 및 엘리글루스타트 (eliglustat)의 동족체로도 일컬어지는 N-((1R,2R)-1-(2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-일)-1-하이드록시-3-(피롤리딘-1-일)프로판-2-일)옥탄아미드; N-((1R,2R)-1-(2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-일)-1-하이드록시-3-(피롤리딘-1-일)프로판-2-일)노난아미드 또한 이른바 Genz-123346; BML-119; 및 IV-231B를 포함한다.
일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 특허 출원 WO2011066352에 기재되어 있는 바와 같은 글리코실세라마이드 합성효소를 억제하는 화합물로서, 이는 특히 다음 화학식을 갖는 GENZ 112638 헤미타르트레이트의 비정질 및 결정질 형태를 포함한다:
Figure pct00038
.
세라마이드의 유사체의 다른 예는 또한 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌 [Carson et al. Tetrahedron Lett., 1994, 35, 2659-2662; Miura T et al. Bioorg Med Chem. 1998 Sep;6(9):1481-9]에 기재되어 있으며, 다음 화학식을 갖는 모르폴리노 유도체; 피롤리디노 유도체를 포함한다:
Figure pct00039
.
본 발명에서 고려되는 세라마이드 유사체 또는 PDMP의 유사체의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 제 6,916,802호에 기재되어 있는 것을 포함하며, 제한 없이, 다음 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00040
여기서:
R1은 페닐 기, 바람직하게는 치환된 페닐 기 예컨대, p-메톡시, 하이드록시, 디옥산 치환 예컨대, 메틸렌디옥시, 에틸렌디옥시, 및 트리메틸렌디옥시, 사이클로헥실 또는 다른 비사이클릭 기, t-부틸 또는 다른 분지쇄 지방족 기, 또는 바람직하게는 구조의 중심부 인근에 이중 결합을 갖는 7 내지 15개의 탄소 길이의 긴 알킬 또는 알케닐 사슬이다. 지방족 사슬은 피토스핑고신 (phytospingosine)에 해당하는 것으로, 2개의 비대칭 중심부 인근의 하이드록실 기를 가질 수 있다.
R2는 2 내지 18개의 탄소 길이의 지방산의 알킬 잔기이다. 지방산은 포화 또는 불포화된 것이거나, C-2 위치에서 작은 치환기 (예를 들어, 하이드록실 기)를 보유할 수 있다. R2 기 지방산은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18개의 탄소 길이일 수 있는 것으로 고려된다. 더 긴 지방산이 또한 유용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 구조의 R2는 5개의 탄소 또는 7개의 탄소 길이이다.
R3은 질소 원자가 중심부에 부착된 (즉, 3차 아민) 3차 아민, 바람직하게는 사이클릭 아민 예컨대, 피롤리딘, 아제티딘, 모르폴린 또는 피페리딘이다.
본 발명에서 고려되는 세라마이드 유사체 또는 PDMP의 유사체의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌 [Lee et al. JBC 1999 Vol. 274, No. 21:14662-14669; Shayman and Larsen J Lipid Res. 2014 Jul;55(7):1215-25]에 기재되어 있는 것을 포함하며, 제한 없이, N-(5-아다만탄-1―일-메톡시펜틸) 데옥시노지리마이신, D-트레오-1-에틸렌디옥시페닐-2-팔미토일-3-피롤리디노-프로판올 (EtDO-P4), 엘리글루스타트 타르트레이트 (서델가 (Cerdelga)™), -(2,3-디하이드로-1H-인덴-2-일)-N-((1R,2R)-1-(2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-일)-1-하이드록시-3-(피롤리딘-1-일)프로판-2-일)아세트아미드, 이소파고민, 1-데옥시갈락토노지리마이신 (미갈라스타트), 암브록솔, 피리메타민[2,4-디아미노 5-(4-클로로페닐)-6-에틸피리미딘]뿐만 아니라, 다음 화학식을 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00041
여기서, R은 다음으로부터 선택된다:
Figure pct00042
.
본 발명의 일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 제 6,051,598호에 기재되어 있으며, 1-페닐-2-팔미토일아미노-3-피롤리디노-1-프로판올; D-트레오-1-피롤리디노-1-데옥시세라마이드; (1R,2R)-1-페닐-2-아실아미노-3-사이클릭 아미노-1-프로판올; (2R,3R)-2-팔미토일-스핑고실 아민; 1-사이클릭 아미노-1-데옥시세라마이드; 및 1-사이클릭 아미노-2-헥사데카노일아미노-3-하이드록시-옥타데크-4,5-엔을 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 제 5,302,609호, 미국 특허 제 5,952,370호; 미국 특허 제 5,916,911호; 미국 특허 제 6,030,995호에 기재되어 있으며, 다음 화학식을 갖는 화합물 and 그의 기능성 동족체, 이성질체 및 약제학적으로 허용 가능한 염으로부터 선택된다:
Figure pct00043
여기서, R1은 5 내지 15개의 탄소를 갖는 방향족 구조, 지방족 사이클릭 구조, 분지쇄 지방족 구조 또는 직쇄 지방족 기이고;
R2는 9 내지 18개의 탄소를 갖는 지방족 사슬이고;
R3은 피롤리디노이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 제 6,569,889호, 미국 특허 제 6,255,336호에 기재되어 있으며, 4'-하이드록시-1-페닐-2-팔미토일아미노-3-피롤리디노-1-프로판올; 3',4'-에틸렌디옥시-1-페닐-2-팔미토일아미노-3-피롤리디노-1-프로판올; D-t-3',4'-에틸렌디옥시-1-페닐-2-팔미토일아미노-3-피롤리디노-1-프로판올; D-t-4-하이드록시-1-페닐-2-팔미토일아미노-3-피롤리디노-1-프로판올, 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 이들의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 약제학적으로 허용 가능한 산, 예를 들어 황산, 염산, 인산 등과 같은 무기산 또는 아세트산과 같은 유기산과 본 발명의 화합물의 염을 의미하는 것으로 의도된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 카복사미드 유도체이다.
일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 본 명세서에 참조로 포함되는 특허 출원 WO2010091104에 기재되어 있는 글리코실세라마이드 합성효소의 억제제로서, 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]-2-{[3-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}피리딘-3-카복사미드; N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]-2-{[3-(트리플루오로메틸)-페닐]옥시}피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로-2-메틸페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로-2-메틸페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]-메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸-1,4-디아제판-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸-1,4-디아제판-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]-메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-메틸페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]벤즈아미드; 2-[(4-메틸페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]벤즈아미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1S)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2-클로로-4-메틸페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2-클로로-4-메틸페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}-에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-메틸페닐)옥시]-N-[(1S)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-메틸페닐)옥시]-N-[(1S)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]-메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; N-[(1S)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]-2-{[3-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}피리딘-3-카복사미드;　N-[(1S)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]-2-{[3-(트리플루오로메틸)-페닐]옥시}피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-{(1R)-1-[(4-메틸피페라진-1-일)카보닐]-3-[(페닐메틸)옥시]프로필}피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-{(1R)-1-[(4-메틸피페라진-1-일)카보닐]-3-[(페닐메틸)옥시]-프로필}피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-[(1-메틸피페리딘-4-일)아미노]-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-[(1-메틸피페리딘-4-일)아미노]-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]-메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-{4-[3-(디메틸아미노)프로필]피페라진-1-일}-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-{4-[3-(디메틸아미노)프로필]피페라진-1-일}-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-{(1R)-1-[(4-메틸피페라진-1-일)카보닐]-4-페닐부틸}피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-{(1R)-1-[(4-메틸피페라진-1-일)카보닐]-4-페닐부틸}피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,4-디클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(3-메틸헥사하이드로피롤로[1,2-a]-피라진-2(lH)-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,4-디클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(3-메틸헥사하이드로피롤로[1,2-a]피라진-2(1H)-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-사이클로프로필피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-사이클로프로필피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸j피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1S)-2-(4-메틸-1,4-디아제판-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1S)-2-(4-메틸-1,4-디아제판-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-[(1R)-2-[3-(디메틸아미노)-아제티딘-1-일]-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-[(1R)-2-[3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일]-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,4-디클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(5,6-디하이드로[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피라진-7(8H)-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,4-디클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(5,6-디하이드로[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피라진-7(8H)-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,4-디클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-[3-(하이드록시메틸)헥사하이드로피롤로[1,2-a]피라진-2(1H)-일]-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,4-디클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-[3-(하이드록시메틸)헥사하이드로피롤로[1,2-a]피라진-2(1H)-일]-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,4-디클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(l,3-디하이드로-2H-피롤로[3,4-c]피리딘-2-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,4-디클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(l,3-디하이드로-2H-피롤로[3,4-c]피리딘-2-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(lR)-2-(4-메틸피페리딘-l-일)-2-옥소-l-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페리딘-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,4-디클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}-2-(1,5,6,7-테트라하이드로-4H-이미다조[4,5-b]피리딘-4-일)에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,4-디클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}-2-(1,5,6,7-테트라하이드로-4H-이미다조[4,5-b]피리딘-4-일)에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-[4-(2-플루오로에틸)피페라진-1-일]-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-[4-(2-플루오로에틸)피페라진-1-일]-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-에틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-에틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-[4-(2-하이드록시에틸)피페라진-l-일]-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-[4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일]-2-옥소-1-[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; N-[(1R)-2-(1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일아미노)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]-2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-피리딘-3-카복사미드; N-[(1R)-2-[(3S)-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일아미노]-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]-2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}피리딘-3-카복사미드; N-[(1R)-2-[(3R)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일아미노]-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]-2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}피리딘-3-카복사미드; N-[(lR)-2-[(3S)-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일아미노]-l-({[(3-메틸페닐)메틸]옥시}메틸)-2-옥소에틸]-2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-1-({[(3-메틸페닐)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2-클로로-4-플루오로페닐)옥시]-N-[(l1)-1-({[(4-메틸페닐)메틸]옥시}-메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2-클로로-4-플루오로페닐)옥시]-N-[(1R)-1-({[(4-메틸페닐)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-플루오로-2-메틸페닐)옥시]-N-[(1R)-l-({[(4-메틸페닐)메틸]-옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드: 2-[(4-플루오로-2-메틸페닐)옥시]-N-[(1R)-1-({[(4-메틸페닐)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로-2-메틸페닐)옥시]-N-[(1R)-1-({[(4-플루오로페닐)메틸]-옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로-2-메틸페닐)옥시]-N-[(1R)-1-({[(4-플루오로페닐)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2-클로로-4-플루오로페닐)옥시]-N-[(1R)-1-({[(4-플루오로페닐)메틸]-옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2-클로로-4-플루오로페닐)옥시]-N-[(lR)-l-({[(4-플루오로페닐)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-플루오로-2-메틸페닐)옥시]-N-[(1R)-1-({[(4-플루오로페닐)메틸]-옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드: 2-[(4-플루오로-2-메틸페닐)옥시]-N-[(1R)-1-({[(4-플루오로페닐)메틸]-옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; N-[(1R)-1-({[(2-클로로페닐)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]-2-[(4-클로로페닐)옥시]피리딘-3-카복사미드: N-[(1R)-1-({[(2-클로로페닐)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]-2-[(4-클로로페닐)옥시]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-1-{[(나프탈렌-2-일메틸)옥시]메틸}-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-1-{[(나프탈렌-2-일메틸)옥시]메틸}-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-1-[({[3-(메틸옥시)페닐]메틸}옥시)메틸]-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-1-[({[3-(메틸옥시)페닐]메틸}옥시)메틸]-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(lR)-l-({[(4-메틸페닐)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-1-({[(4-메틸페닐)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; N-[(1R)-1-({[(3-클로로페닐)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]-2-[(4-클로로페닐)옥시]피리딘-3-카복사미드; N-[(1R)-1-({[(3-클로로페닐)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]-2-[(4-클로로페닐)옥시]피리딘-3-카복사미드; N-[(1R)-1-({[(4-클로로페닐)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]-2-[(4-클로로페닐)옥시]피리딘-3-카복사미드; N-[(1R)-1-({[(4-클로로페닐)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]-2-[(4-클로로페닐)옥시]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-1-({[(2,4-디메틸페닐)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-1-({[(2,4-디메틸페닐)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-l-{[(피리딘-3-일메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(피리딘-3-일 메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-1-[({[4-(1-메틸에틸)페닐]메틸}옥시)-메틸]-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-1-[({[4-(1-메틸에틸)페닐]메틸}옥시)메틸]-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(lR)-l-({[(2-메틸페닐)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-1-({[(2-메틸페닐)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; N-[(1R)-1-({[(2-클로로피리딘-4-일)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]-2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}피리딘-3-카복사미드; N-[(1R)-1-({[(2-클로로피리딘-4-일)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]-2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-[(1R)-1-{[(2,3-디하이드로-l,4-벤조디옥신-6-일메틸)옥시]메틸}-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-[(1R)-1-({[(2-메틸-1,3-옥사졸-5-일)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-[(1R)-1-({[(2-메틸-1,3-옥사졸-5-일)메틸]-옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-{(1R)-1-{[(2,3-디하이드로-1,4-벤조디옥신-6-일메틸)옥시]메틸}-2-[3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일]-2-옥소에틸}피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-{(1R)-1-{[(2,3-디하이드로-1,4-벤조디옥신-6-일메틸)옥시]메틸}-2-[3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일]-2-옥소에틸}피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-[(1R)-2-[(3R)-3-(디메틸아미노)-피롤리딘-1-일]-l-({[(3-메틸페닐)메틸]옥시}메틸)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-[(lR)-2-[(3R)-3-(디메틸아미노)피롤리딘-1-일]-1-({[(3-메틸페닐)메틸]옥시 }메틸)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,4-디클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소-1-{[(피리딘-4-일메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,4-디클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(피리딘-4-일메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,4-디클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-1-({[(2,6-디클로로피리딘-4-일)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,4-디클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-1-({[(2,6-디클로로피리딘-4-일)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-[(lR)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소-l-{[(피리딘-4-일메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-[( 1 R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(피리딘-4-일메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; N-[(lR)-l-({[(2-브로모피리딘-4-일)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]-2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-{(1R)-l-{[(2,3-디하이드로-l,4-벤조디옥신-6-일메틸)옥시]메틸}-2-[3-(메틸아미노)아제티딘-l-일]-2-옥소에틸}피리딘-3-카복사미드; N-[(1 R)-2-(3-아미노아제티딘-1-일)-1-{[(2,3-디하이드로-1,4-벤조디옥신-6-일메틸)옥시]메틸}-2-옥소에틸]-2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}피리딘-3-카복사미드; 2,4-디클로로-N-알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[2-(디메틸아미노)에틸]-L-페닐알라닌아미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-브로모-2-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로-2-메톡시페닐)옥시]-N-[( 1 R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-브로모-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시 }-N-[( 1 R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,4-디클로로-6-메틸페닐)옥시]-N-[( 1 R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; N-[( 1 R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]-2-{[4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,4-디플루오로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,6-디클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2-클로로-6-메틸페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,4-디클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-5-(트리플루오로메틸)페닐]옥시 }-N-[( 1 R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]-2-(페닐옥시)피리딘-3-카복사미드; 2-[(3,4-디메틸페닐)옥시]-N-[( 1 R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,6-디플루오로페닐)옥시]-N-[( 1 R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]-2-(나프탈렌-l-일옥시)피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-플루오로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소-l-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-메틸페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-브로모페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(메틸옥시)페닐]옥시}-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소-l-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2-브로모-4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]-2-[(2,4,6-트리클로로페닐)옥시]피리딘-3-카복사미드; 2-{[3-(디메틸아미노)페닐]옥시}-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로-2-메틸페닐)옥시]-N-[(1R)-1-({[(3-메틸페닐)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-1-[(4-메틸피페라진-1-일)카보닐]-3-(페닐옥시)프로필]피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-[(1R)-1-({[(4-플루오로페닐)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,4-디클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-1-[(4-메틸피페라진-l-일)카보닐]-3-(페닐옥시)프로필]피리딘-3-카복사미드; N-[(1S)-1-({[(4-클로로페닐)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]-1-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판 카복사미드; 2-[(2,4-디클로로페닐)옥시]-5-플루오로-N-[(lR)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소-l-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-플루오로-2-메틸페닐)옥시]-N-[(lR)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2-클로로-4-플루오로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-6-메틸-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-5-플루오로-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,4-디클로로페닐)옥시]-N-[(lR)-2-[메틸(l-메틸피페리딘-4-일)아미노]-2-옥소-l-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-[(lR)-2-[메틸(l-메틸피페리딘-4-일)아미노]-2-옥소-l-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,4-디클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-[(l-메틸피페리딘-4-일)아미노]-2-옥소-l-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 5-브로모-2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-{[4-클로로-2-(페닐메틸)페닐]옥시}-N-[(lR)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소-l-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; N-[(3 S)-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-N'2'-{[1-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]-카보닐}-3-(2,3-디하이드로-1,4-벤조디옥신-6-일)-L-알라닌아미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-[(1R)-1-{[(2,2-디메틸프로필)옥시]메틸}-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로-2-메틸페닐)옥시]-N-[(1R)-1-{[(사이클로헥실메틸)옥시]메틸}-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; N-[( 1 R)-1-{[(사이클로헥실메틸)옥시]메틸}-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]-2-[(2,4-디클로로페닐)옥시]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2-클로로-4-플루오로페닐)옥시]-N-[(lR)-l-{[(사이클로헥실메틸)옥시]메틸}-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-[(lR)-l-({[(l-메틸사이클로프로필)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,4-디클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-1-({[(1-메틸사이클로프로필)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-{(1R)-1-({[(1-메틸사이클로프로필)메틸]옥시 }메틸)-2-[(1-메틸피페리딘-4-일)아미노]-2-옥소에틸}-피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[( 1 R)-1-({[( 1-메틸사이클로프로필)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; N-[( 1 R)-1-[(바이사이클로[2.2.1]헵트-2-일옥시)메틸]-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]-2-[(4-클로로페닐)옥시]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-1-[(사이클로헥실옥시)메틸]-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-1-{[(사이클로헥실메틸)옥시]메틸}-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소-l-{[(l-페닐에틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소-l-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]벤즈아미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[(페닐메틸)아미노]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-[(1R)-2-옥소-2-{(3R)-3-[(페닐메틸)아미노]피롤리딘-l-일}-l-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(4-클로로페닐)옥시]-N-[(1R)-2-[(3R)-3-(디메틸아미노)피롤리딘-1-일]-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-[(1R)-2-[(3R)-3-(디메틸아미노)피롤리딘-1-일]-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-[(1R)-2-[3-(메틸아미노)피롤리딘-1-일]-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-[(1R)-2-{3-[메틸(페닐메틸)아미노]피롤리딘-l-일}-2-옥소-l-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-[(lR)-2-옥소-2-{(3R)-3-[(2-페닐에틸)아미노]피롤리딘-1-일}-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-[(lR)-2-{(3R)-3-[(2-메틸프로필)아미노]피롤리딘-1-일}-2-옥소-l-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]-피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-[(lR)-2-[(3R)-3-(메틸아미노)피롤리딘-1-일]-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-[(lR)-2-[(3S)-3-(메틸아미노)피롤리딘-1-일]-2-옥소-1-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-[(1S)-2-[(3S)-3-(디메틸아니노)피롤리딘-1-일]-l-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-[(1S)-2-[(페닐메틸)옥시]-l-(피롤리딘-l-일메틸)에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-{[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]옥시}-N-[(1S)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-l-{　[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,4-디클로로페닐)옥시]-N-[(1S)-2-모르폴린-4-일-l-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,4-디클로로페닐)옥시]-N-[(1S)-2-[3-(디메틸아미노)피롤리딘-l-일]-l-{[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,4-디클로로페닐)옥시]-N-[(1S)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-1-{　[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,4-디클로로페닐)옥시]-N-[(lS)-2-[(3R)-3-(디메틸아미노)피롤리딘-l-일]-1-　{　[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; 2-[(2,4-디클로로페닐)옥시]-N-[(1S)-2-[(3 S)-3-(디메틸아미노)피롤리딘-1-일]-1-{　[(페닐메틸)옥시]메틸}에틸]피리딘-3-카복사미드; (R)-2-(tert-부톡시카보닐아미노)-3-((l-메틸사이클로프로필)메톡시)프로판산을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 본 명세서에 참조로 포함되는 특허 출원 WO2010091164에 기재되어 있는 글리코실세라마이드 합성효소의 억제제로서, l-(2,4-디클로로페닐)-N-[(2S)-3-(1H-인돌-3-일)-l-(4-메틸피페라진-l-일)-1-옥소프로판-2-일]사이클로프로판카복사미드; 1-(2,4-디클로로페닐)-N-[(1S)-2-[3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일]-1-(1H-인돌-3-일메틸)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[2-(디메틸아미노)-에틸]-L-트립토판아미드; 1-(2,4-디클로로페닐)-N-[(lS)-l-(lH-인돌-3-일메틸)-2-(4-메틸-1,4-디아제판-1-일)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; 1-(2,4-디클로로페닐)-N-[(1S)-1-(1H-인돌-3-일메틸)-2-옥소-2-피페라진-l-일에틸]사이클로프로판카복사미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-[(lS)-l-(lH-인돌-3-일메틸)-2-모르폴린-4-일-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-[(1S)-2-{4-[3-(디메틸아미노)프로필]피페라진-l-일}-l-(1H-인돌-S-일메틸]-l-옥소에틸l사이클로프로판카복사미드; N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-(l-메틸피페리딘-4-일)-L-트립토판아미드; N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[3-(디메틸아미노)-프로필]-L-트립토판아미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-L-트립토판아미드; l-(4-클로로페닐)-N-[(1S)-l-(lH-인돌-3-일메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; N-[(1S)-1-(1H-인돌-3-일메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]-1-[4-(메틸옥시)페닐]사이클로프로판카복사미드; N-[(1S)-1-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]-1-[4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로판카복사미드; N-[(1S)-1-[(2-클로로페닐)메틸]-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]-1-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; 1-(2,4-디클로로페닐)-N-[(1S)-1-{[4-(메틸옥시)페닐]메틸}-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; N-[(2S)-3-(3-클로로페닐)-1-(4-메틸피페라진-l-일)-l-옥소프로판-2-일]-1-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; 2-(2,4-디클로로페닐)-N-[(1S)-1-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]-2-메틸프로판아미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-[(1S)-l-[(3,4-디클로로페닐)메틸]-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-[(1S)-1-[(4-플루오로페닐)메틸]-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-[(1S)-1-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; 4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[2-(디메틸-아미노)에틸]-L-페닐알라닌아미드; 1-(2,4-디클로로페닐)-N-[(lS)-l-{[4-(에틸옥시)페닐]메틸}-2-(4-메틸-피페라진-l-일)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; 1-(2,4-디클로로페닐)-N-[(1S)-1-[(2,4-디메틸페닐)메틸]-2-(4-메틸-피페라진-l-일)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; 1-(2,4-디클로로페닐)-N-[(1S)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-l-(나프탈렌-2-일메틸)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; 1-(2,4-디클로로페닐)-N-[(1S)-1-[(4-메틸페닐)메틸]-2-(4-메틸-피페라진-l-일)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; N-[(1S)-l-[(4-브로모페닐)메틸]-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]-l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; 1-(3,4-디클로로페닐)-N-[(1S)-1-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; N-[(1S)-l-[(4-클로로페닐)메틸]-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]-l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-[(1S)-1-[(2-플루오로페닐)메틸]-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-[(1S)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소-l-{[4-(트리플루오로메틸)페닐]메틸}에틸]사이클로프로판카복사미드; 1-(2,4-디클로로페닐)-N-[2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소-l-(페닐메틸)-에틸]사이클로프로판-카복사미드; 1-(2,6-디클로로페닐)-N-[(lS)-l-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; 1-(2,4-디클로로페닐)-N-{(lS)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소-l-[(3,4,5-트리플루오로페닐)메틸]에틸}사이클로프로판카복사미드; 1-(2,4-디클로로페닐)-N-[(lS)-l-[(3,4-디플루오로페닐)메틸]-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; 1-(2,4-디클로로페닐)-N-[(lS)-l-[(4-하이드록시페닐)메틸]-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; N-[(lS)-l-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]-l-[3-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로판카복사미드; 1-(2-클로로페닐)-N-[(lS)-l-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-(4-메틸-피페라진-l-일)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; N-[(lS)-l-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]-l-(4-플루오로페닐)사이클로프로판카복사미드; N-[(1S)-1-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]-1-[2-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로판카복사미드; N-[(1S)-1-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]-l-(2,4-디플루오로페닐)사이클로프로판카복사미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-N~2~{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]-카보닐}-5-페닐-L-노르발린아미드; 4-브로모-N-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-L-페닐알라닐-N-[2-(디메틸아미노)에틸]-L-프롤린아미드; 2,4-디클로로-N-알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[2-(디메틸아미노)에틸]-L-페닐알라닌아미드; 2,4-디클로로-N알파-{[ 1-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-메틸-N-(1-메틸피롤리딘-3-일)-L-페닐알라닌아미드; 2,4-디클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-메틸-N-(l-메틸피페리딘-4-일)-L-페닐알라닌아미드; 1-(2,4-디클로로페닐)-N-{(1S)-1-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-[(3R)-3-(디메틸아미노)-피롤리딘-l-일]-2-옥소에틸}사이클로프로판카복사미드; 1-(2,4-디클로로페닐)-N-{(lS)-l-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-[(3S)-3-(디메틸아미노)-피롤리딘-1-일]-2-옥소에틸}사이클로프로판카복사미드; 2,4-디클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[2-(디메틸아미노)-l-메틸에틸]-L-페닐알라닌아미드; 2,4-디클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[l-(페닐메틸)-피페리딘-4-일]-L-페닐알라닌아미드; 1-(2,4-디클로로페닐)-N-[(lS)-l-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; 1-(2,4-디클로로페닐)-N-[(lR)-l-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; 1-(2,4-디클로로페닐)-N-[(lS)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소-l-(페닐메틸)에틸]-사이클로 프로판카복사미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-[(lS)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-l-(나프탈렌-l-일메틸)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-{(lS)-l-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-[(8aR)-헥사하이드로피롤로-[l,2-a]피라진-2(1H)-일]-2-옥소에틸}사이클로프로판카복사미드; N-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일-2,4-디클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]-카보닐}-L-페닐알라닌아미드; 2,4-디클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[2-(디에틸아미노)-에틸]-L-페닐알라닌아미드; 2,4-디클로로-N알파-{[ l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[2-(l-메틸피롤리딘-2-일)에틸]-L-페닐알라닌아미드; 2,4-디클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-(2-피페리딘-l-일에틸)-L-페닐알라닌아미드; 2,4-디클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[3-(디메틸아미노)-프로필]-L-페닐알라닌아미드; 2,4-디클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-(l-에틸피페리딘-3-일)-L-페닐알라닌아미드; 2,4-디클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[l-(페닐메틸)피롤리딘-3-일]-L-페닐알라닌아미드; N-[(lS)-l-[(4-아세틸페닐)메틸]-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]-l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-[(1S)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소-l-{[l-(페닐-메틸)-1H-이미다졸-5-일]메틸}에틸]사이클로프로판카복사미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-[(1 S)-1-[(2-메틸페닐)메틸]-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-[(1 S)-1-[(3-메틸페닐)메틸]-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-[(1 S)-1-[(3-플루오로페닐)메틸]-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; N-[(1S)-l-[(4-시아노페닐)메틸]-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]-l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-{(1S)-l-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-[4-(1-메틸에틸)-피페라진-l-일]-2-옥소에틸}사이클로프로판카복사미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-[(1S)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소-1-{[3-(트리플루오로메틸j페닐j메틸j에틸j사이클로프로판카복사미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-[(1S)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소-l-{[2-(트리플루오로메틸)-페닐]메틸}에틸]사이클로프로판카복사미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-[(1S)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소-l-(피리딘-2-일메틸)에틸]사이클로프로판카복사미드; N-[(1S)-l-(사이클로헥실메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]-l-(2,4-디클로로-페닐)사이클로프로판카복사미드; 3,4-디클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[2-(디메틸아미노)에틸]-L-페닐알라닌아미드; N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[2-(디메틸아미노)-에틸]-4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; 2,4-디클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[3-(디메틸아미노)-프로필]-N-메틸-L-페닐알라닌아미드; 2,4-디클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[3-(디메틸아미노)-2,2-디메틸프로필]-L-페닐알라닌아미드; 2,4-디클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[(l-메틸피페리딘-2-일)메틸]-L-페닐알라닌아미드; 2,4-디클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-(2-피롤리딘-l-일프로필)-L-페닐알라닌아미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-[(1S)-l-[(3,5-디클로로페닐)메틸]-2-(4-에틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-{(1S)-l-[(3,5-디클로로페닐)메틸]-2-[4-(2-하이드록시에틸)-피페라진-l-일]-2-옥소에틸}사이클로프로판카복사미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-{(1S)-l-[(3,5-디클로로페닐)메틸]-2-[4-(2-플루오로에틸)피페라진-l-일]-l-옥소에틸}사이클로프로판카복사미드; 4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[2-(디메틸아미노)-에틸]-N-메틸-L-페닐알라닌아미드; N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[2-(디메틸아미노)-에틸]-N-메틸-4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; N'2'-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[2-(디메틸아미노)에틸]-N-메틸-L-류신아미드; 2,4-디클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-메틸-N-[(3R)-l-메틸피롤리딘-3-일]-L-페닐알라닌아미드; 2,4-디클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-메틸-N-[l-(페닐메틸)피페리딘-4-일]-L-페닐알라닌아미드; N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-메틸-N-[l-(페닐메틸)-피페리딘-4-일]-4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-[(lS)-2-[3-(디메틸아미노)아제티딘-l-일]-2-옥소-l-{[4-(트리플루오로메틸)페닐]메틸}에틸]사이클로프로판카복사미드; N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[2-(디메틸아미노)에틸]-N-에틸-4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-메틸-N-[(3R)-l-메틸-피롤리딘-3-일]-4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-(2-피롤리딘-l-일에틸)-4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; N-[(1S)-l-({[(4-클로로페닐)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]-l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; N-[(1S)-l-({[(3-클로로페닐)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]-l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; N-[(1S)-l-({[(2-클로로페닐)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]-l-(3,5-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; l-(3,5-디클로로페닐)-N-[(1S)-l-({[(4-플루오로페닐)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; l-(3,5-디클로로페닐)-N-[(1S)-1-[({[2-(메틸옥시)페닐]메틸}옥시)메틸]-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-[(1R)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소-l-{[(페닐메틸j옥시j-메틸j에틸j사이클로프로판카복사미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-[(1S)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소-l-{[(페닐메틸)옥시]-메틸}에틸]사이클로프로판카복사미드; N-[(3 S)-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-N'2'-{[ l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]-카보닐}-3-(2,3-디하이드로-1,4-벤조디옥신-6-일)-L-알라닌아미드; N-[(3R)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-N'2'-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]-카보닐}-3-(2,3-디하이드로-l,4-벤조디옥신-6-일)-L-알라닌아미드; N'2'-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-3-(2,3-디하이드로-1,4-벤조디옥신-6-일)-N-[2-(디메틸아미노)에틸]-N-메틸-L-알라닌아미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]-카보닐}-3-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-0-메틸-3-(메틸옥시)-L-티로신아미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-이클로프로필]카보닐}-2-플루오로-L-페닐알라닌아미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-이클로프로필]카보닐}-2-플루오로-L-페닐알라닌아미드; N-[(1S)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-l-(2,3-디하이드로-l,4-벤조디옥신-6-일메틸)-2-옥소에틸]-l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로판카복사미드; 3-(2,3-디하이드로-l,4-벤조디옥신-6-일)-N-[2-(디메틸아미노)에틸]-N-메틸-N~2~[(l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로필)카보닐]-L-알라닌아미드; N-[(lS)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-l-(2,3-디하이드로-l,4-벤조디옥신-6-일메틸)-2-옥소에틸]-l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로판카복사미드; N-(아제티딘-3-일메틸)-4-브로모-N알파-[(l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로필)-카보닐]-L-페닐알라닌아미드; N-[(1S)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-l-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸]-l-[4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐]사이클로프로판카복사미드; N-[(1S)-2-(2,6-디아자스피로[3.3]헵트-2-일)-2-옥소-l-{[4-(트리플루오로메틸)페닐]-메틸}에틸]-l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; 4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[2-(메틸아미노)에틸]-L-페닐알라닌아미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-{(1S)-l-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-옥소-2-피페라진-l-일에틸}사이클로프로판카복사미드; 2,4-디클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-메틸-N-[2-(메틸아미노)에틸]-L-페닐알라닌아미드; 2-(2,4-디클로로페닐)-N-[(lS)-l-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-(4-메틸-피페라진-l-일)-2-옥소에틸]프로판아미드; N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-(피롤리딘-2-일메틸)-4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; N-[(lS)-2-(3-아미노아제티딘-l-일)-2-옥소-l-{[4-(트리플루오로메틸)페닐]메틸}-에틸]-l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; 4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-(l-메틸피페리딘-3-일)-L-페닐알라닌아미드; N-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일-4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]-카보닐}-L-페닐알라닌아미드; N-[(3R)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-L-페닐알라닌아미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-{(lS)-l-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-[(8aS)-헥사하이드로피롤로[l,2-a]피라진-2(1H)-일]-2-옥소에틸}사이클로프로판카복사미드; N-[(lS)-2-[(3R)-3-아미노피롤리딘-l-일]-2-옥소-l-{[4-(트리플루오로메틸)페닐]-메틸}에틸]-l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; N-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]-카보닐}-4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-(피롤리딘-3-일메틸)-4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; N-[(3R)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; N-[(3R)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-2,4-디클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-L-페닐알라닌아미드; N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[2-(디메틸아미노)-에틸]-L-페닐알라닌아미드; N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[2-(디메틸아미노)-에틸]-N-메틸-L-페닐알라닌아미드; N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[2-(메틸아미노)-에틸]-4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[2-(메틸아미노)-에틸]-4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; N-(2-아미노에틸)-2,4-디클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]-카보닐}-L-페닐알라닌아미드; N-{(1 S)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-1-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; 4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-(2-메틸-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일)-L-페닐알라닌아미드; 2,4-디클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-(8-메틸-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-3-일)-L-페닐알라닌아미드; N-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일-2,4-디클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-N-메틸-L-페닐알라닌아미드; N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[2-(디메틸아미노)-에틸]-베타-메틸페닐알라닌아미드; N-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]-카보닐}-2,4-비스(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; N-[(3R)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-L-페닐알라닌아미드; (베타S)-N-[(3R)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필j카보닐J-베타-메틸-L-페닐알라닌아미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-L-페닐알라닌아미드; N-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]-카보닐}-N-메틸-L-페닐알라닌아미드; N-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일-N알파-({l-[4-(메틸옥시)페닐]사이클로프로필}-카보닐)-4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; N-{(1 S)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-1-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-2,4-비스(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-L-페닐알라닌아미드; N-[(lS)-l-{[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일아미노]카보닐}-3-페닐프로필]-l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-l-(페닐메틸)-L-히스티딘아미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-N~2~-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]-카보닐}-3-(2,2-디플루오로-1,3-벤조디옥솔-5-일)-L-알라닌아미드; 4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[3-(lH-이미다졸-l-일)프로필]-L-페닐알라닌아미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; 4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[(lS,3S,4S)-l-옥시도-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-L-페닐알라닌아미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-2-플루오로페닐알라닌아미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-[(lS)-2-(6-메틸-2,6-디아자스피로[3.3]헵트-2-일)-2-옥소-l-{[4-(트리플루오로메틸)페닐]메틸}에틸]사이클로프로판카복사미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-N알파-({1-[4-(메틸옥시)페닐]-사이클로프로필}카보닐)-4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; N-[(3R)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-N알파-({l-[4-(메틸옥시)페닐]-사이클로프로필}카보닐)-4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; N-[(3R)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-브로모-N알파-({l-[4-(메틸옥시)페닐]-사이클로프로필}카보닐)-L-페닐알라닌아미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-브로모-N알파-({l-[4-(메틸옥시)페닐]-사이클로프로필j카보니O-L-페닐알라닌아미드; 4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-피리딘-4-일-L-페닐알라닌아미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-페닐-N알파-({l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐)-L-페닐알라닌아미드; N-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-4-일-4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-L-페닐알라닌아미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-3-사이클로헥실-N~2-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-L-알라닌아미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-N알파-({1-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)-페닐]사이클로프로필}카보닐)-4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-{(lS)-l-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-[3-(디메틸-아미노)-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일]-2-옥소에틸}사이클로프로판카복사미드; N-{(1S)-2-(4-아미노-4-메틸피페리딘-l-일)-l-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; N-[(3S)-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-N'2'-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]-카보닐}-N'2'-메틸-5-페닐-L-노르발린아미드; N'2'-{[1-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[2-(디메틸아미노)에틸]-N-메틸-5-페닐-L-노르발린아미드; 1-(2,4-디클로로페닐)-N-{(1S)-l-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-[(3R)-3-메틸피페라진-1-일]-2-옥소에틸}사이클로프로판카복사미드; N-[(3S)-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-브로모-N알파-[(l-{4-[(트리플루오로메틸)-옥시]페닐}사이클로프로필)카보닐]-L-페닐알라닌아미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-브로모-N알파-({l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로필}카보닐)-L-페닐알라닌아미드; (베타S)-N-[(3S)-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-베타-메틸페닐알라닌아미드; (베타S)-N-[(3S)-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-베타-메틸페닐알라닌아미드; N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[트랜스-4-페닐피롤리딘-3-일]-4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; N-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일-4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-D-페닐알라닌아미드; N-{(1 S)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-1-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로판카복사미드; N-[(3S)-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-5-(4-클로로페닐)-N~2~-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-L-노르발린아미드; N-{(1S)-2-[(3R)-3-아미노피페리딘-1-일]-1-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-옥소에틸}-1-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; N-{(1S)-2-(4-아미노-4-메틸피페리딘-1-일)-1-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸}-1-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; N-{(1S)-2-(4-아미노피페리딘-l-일)-1-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-옥소에틸}-1-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; 1-(2,4-디클로로페닐)-N-{(1S)-1-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-[(3S)-3-메틸피페라진-1-일]-2-옥소에틸}사이클로프로판카복사미드; 2,4-디클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[(2S)-피롤리딘-2-일메틸]-L-페닐알라닌아미드; 2,4-디클로로-N알파-{[ l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[(2R)-피롤리딘-2-일메틸]-L-페닐알라닌아미드; 2,4-디클로로-N알파-{[1-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[(3R)-피롤리딘-3-일메틸]-L-페닐알라닌아미드; 2,4-디클로로-N알파-{[1-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[(3 S)-피롤리딘-3-일메틸]-L-페닐알라닌아미드; N-{(1 S)-2-[(3S)-3-아미노피롤리딘-l-일]-1-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; N-{(1S)-2-[(3R)-3-아미노피롤리딘-1-일]-l-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-옥소에틸}-1-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; 2,4-디클로로-N알파-{[1-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[(3R)-피페리딘-3-일]-L-페닐알라닌아미드; N-{(1 S)-2-[(3S)-3-아미노피페리딘-l-일]-1-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-옥소에틸}-1-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; 4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[(3S)-피롤리딘-3-일]-L-페닐알라닌아미드; 4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[(3R)-피롤리딘-3-일]-L-페닐알라닌아미드; N-(3-아미노사이클로헥실)-2,4-디클로로-N알파-{[1-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-L-페닐알라닌아미드; N-[(1S)-1-(바이페닐-4-일메틸)-2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]-1-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; N-[(1S)-2-(4-아미노-4-메틸피페리딘-1-일)-1-(바이페닐-4-일메틸)-2-옥소에틸]-1-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; N-[(1S)-1-(바이페닐-4-일메틸)-N-[2-(디메틸아미노)에틸]-2-옥소에틸]-1-(2,4-디클로로 페닐)사이클로 프로판카복사미드; N-(2-아미노사이클로헥실)-2,4-디클로로-N알파-{[1-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-L-페닐알라닌아미드; N-[(lR,2R)-2-아미노사이클로헥실]-2,4-디클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-L-페닐알라닌아미드; N-[(1S,2S)-2-아미노사이클로헥실]-2,4-디클로로-N알파-{[1-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-L-페닐알라닌아미드; 2,4-디클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[(3S)-피페리딘-3-일]-L-페닐알라닌아미드; N-{(1S)-2-(4-아미노피페리딘-l-일)-1-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; 4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[(3R)-피페리딘-3-일]-L-페닐알라닌아미드; N-{(1 S)-1-[(4-브로모페닐)메틸]-2-[4-(메틸아미노)피페리딘-l-일]-2-옥소에틸}-l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; N-(2-아미노-2-메틸프로필)-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]-카보닐}-4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; N-[(1S)-2-[(3R)-3-(메틸아미노)피롤리딘-l-일]-2-옥소-l-{[4-(트리플루오로메틸)-페닐]-메틸}에틸]-1-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}-사이클로프로판카복사미드; N-{(1S)-1-[(4-브로모페닐)메틸]-2-[(3R)-3-(메틸아미노)피롤리딘-l-일]-2-옥소에틸}-l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로판카복사미드; N-(2-아미노-2-메틸프로필)-4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-L-페닐알라닌아미드; N-[(1S)-2-[(3S)-3-(메틸아미노)피롤리딘-l-일]-2-옥소-l-{[4-(트리플루오로메틸)-페닐]메틸}에틸]-l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로판카복사미드; N-{(1S)-1-[(4-브로모페닐)메틸]-2-[(3S)-3-(메틸아미노)피롤리딘-l-일]-2-옥소에틸}-l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로판카복사미드; N-[(I S)-2-(2,7-디아자스피로[4.4]논-2-일)-2-옥소-l-{[4-(트리플루오로메틸)페닐]-메틸}에틸]-l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; N-[(1S)-2-(2,8-디아자스피로[4.5]데크-8-일)-2-옥소-1-{[4-(트리플루오로메틸)페닐]-메틸}에틸]-l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; N-[(I S)-2-(l,7-디아자스피로[4.4]논-7-일)-2-옥소-l-{[4-(트리플루오로메틸)페닐]-메틸}에틸]-l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-브로모-N알파-{[l-(2-플루오로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-L-페닐알라닌아미드; 4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[(3S)-피페리딘-3-일]-L-페닐알라닌아미드; 4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-피페리딘-3-일-L-페닐알라닌아미드; 4-브로모-N알파-{[1-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-피페리딘-3-일-L-페닐알라닌아미드; N-{(lS)-l-[(4-브로모페닐)메틸]-2-[(3S)-3-(메틸아미노)피롤리딘-l-일]-2-옥소에틸}-l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로판카복사미드; N-{(1S)-1-[(4-브로모페닐)메틸]-2-[(3R)-3-(메틸아미노)피롤리딘-l-일]-2-옥소에틸}-l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로판카복사미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-브로모-N알파-[(l-{4-[(디플루오로메틸)-옥시]페닐}사이클로프로필)카보닐]-L-페닐알라닌아미드; 1-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]-N-[(l S)-2-[(3R)-3-(메틸아미노)-피롤리딘-l-일]-2-옥소-l-{[4-(트리플루오로메틸)페닐]메틸}에틸]사이클로프로판-카복사미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-N알파-[(l-{4-[(디플루오로메틸)옥시]-페닐}사이클로프로필)카보닐]-4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; 4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-피페리딘-4-일-L-페닐알라닌아미드; 4-브로모-N-[(3R)-피페리딘-3-일]-N알파-[(l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로필)카보닐]-L-페닐알라닌아미드; N-(2-아미노에틸)-4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]-카보닐}-L-페닐알라닌아미드; 4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-메틸-N-[2-(메틸아미노)에틸]-L-페닐알라닌아미드; N-(2-아미노에틸)-4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]-　카보닐}-N-메틸-L-페닐알라닌아미드;　4-브로모-N알파-({l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로필}-카보닐)-N-메틸-N-[2-(메틸아미노)에틸]-L-페닐알라닌아미드; 4-브로모-N-[2-(디메틸아미노)에틸]-N알파-{[l-(2-플루오로페닐)사이클로프로필]-카보닐}-N-메틸-L-페닐알라닌아미드; 4-브로모-N-메틸-N-[2-(메틸아미노)에틸]-N알파-[(l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}-사이클로프로필)카보닐]-L-페닐알라닌아미드; 4-브로모-N-[2-(디메틸아미노)에틸]-N-메틸-N알파-[(l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]-페닐}사이클로프로필)카보닐]-L-페닐알라닌아미드; N-{(1S)-2-(4-아미노-4-메틸피페리딘-l-일)-l-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로판카복사미드; N'2'-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-5-페닐-N-[(3R)-피페리딘-3-일]-L-노르발린아미드; 1-(2,4-디클로로페닐)-N-[(1S)-2-옥소-2-{3-[(페닐메틸)아미노]-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일}-l-{[4-(트리플루오로메틸)페닐]메틸}에틸]사이클로프로판-카복사미드; N-[(1S)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-2-옥소-l-{[4-(트리플루오로메틸)-페닐]메틸}에틸]-l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; 1-(2,4-디클로로페닐)-N-[(lS)-2-{3-[(2-메틸프로필)아미노]-8-아자바이사이클로-[3.2.1]옥트-8-일}-2-옥소-l-{[4-(트리플루오로메틸)페닐]메틸}-에틸]-사이클로프로판-카복사미드; 1-(2,4-디클로로페닐)-N-[(1S)-2-옥소-2-(3-피롤리딘-l-일-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-l-{[4-(트리플루오로메틸)페닐]메틸}에틸]사이클로프로판카복사미드; N-[(1S)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-2-옥소-l-{[4-(트리플루오로메틸)-페닐]메틸}에틸]-l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; 4-브로모-N-[2-(디메틸아미노)에틸]-N알파-({l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)-페닐]사이클로프로필}카보닐)-N-메틸-L-페닐알라닌아미드; N-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-3-일-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]-카보닐}-4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; 4-브로모-N알파-{[l-(3-플루오로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-피페리딘-4-일-L-페닐알라닌아미드; 4-브로모-N-피페리딘-4-일-N알파-{[l-(2,4,5-트리플루오로페닐)사이클로프로필]-카보닐}-L-페닐알라닌아미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-2-클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]-카보닐}-4-플루오로-L-페닐알라닌아미드; N-[(1S)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-2-옥소-l-{[4-(트리플루오로메틸)-페닐]메틸}에틸]-1-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로판-카복사미드; N-[(1S)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-2-옥소-l-{[4-(트리플루오로메틸)-페닐]메틸}에틸]-l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로판-카복사미드; N-[(1S)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-2-옥소-l-{[4-(트리플루오로메틸)-페닐]메틸}에틸]-l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; 4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-메틸-N-[(3R)-피페리딘-3-일]-L-페닐알라닌아미드; N-{(1 S)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-1-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; 4-브로모-N알파-{[1-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-메틸-N-피페리딘-4-일-L-페닐알라닌아미드; N-[(3R)-피페리딘-3-일]-l-(바이페닐-4-일메틸)-2-옥소에틸]-l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로판카복사미드; N-피페리딘-4-일-l-(바이페닐-4-일메틸)-2-옥소에틸]-l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로판 카복사미드; 2,4-디클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-피페리딘-4-일-L-페닐알라닌아미드; 2,4-디클로로-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-피페리딘-4-일-L-페닐알라닌아미드; N-(시스-4-아미노사이클로헥실)-4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-L-페닐알라닌아미드; N-(트랜스-4-아미노사이클로헥실)-4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-L-페닐알라닌아미드; 4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-(2-메틸피페리딘-4-일)-L-페닐알라닌아미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-브로모-N-알파-{[l-(2,3-디플루오로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-L-페닐알라닌아미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-브로모-N-알파-{[l-(2,6-디플루오로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-L-페닐알라닌아미드; 2,4-디클로로-N-[(3R)-피페리딘-3-일]-N알파-[(l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]-페닐}사이클로프로필)카보닐]-L-페닐알라닌아미드; N-{(1 S)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-1-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로판카복사미드; 2,4-디클로로-N-[(3S)-피롤리딘-3-일]-N알파-[(l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]-페닐}사이클로프로필)카보닐]-L-페닐알라닌아미드; N-[(3R)-피페리딘-3-일]-4-(트리플루오로메틸)-N알파-[(1-{4-[(트리플루오로메틸)-옥시]페닐}사이클로프로필)카보닐]-L-페닐알라닌아미드; N-[(1S)-2-[(3R)-3-아미노피페리딘-l-일]-2-옥소-l-{[4-(트리플루오로메틸)페닐]-메틸}에틸]-l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로판카복사미드; N-[(3 S)-피페리딘-3-일]-4-(트리플루오로메틸)-N알파-[(1-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]-페닐}사이클로프로필)카보닐]-L-페닐알라닌아미드; N-[(1S)-2-(4-아미노-4-메틸피페리딘-l-일)-2-옥소-l-{[4-(트리플루오로메틸)-페닐]메틸}에틸]-l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로판카복사미드; N-[(3S)-피롤리딘-3-일]-4-(트리플루오로메틸)-N알파-[(l-{4-[(트리플루오로메틸)-옥시]페닐}사이클로프로필)카보닐]-L-페닐알라닌아미드; 4-브로모-N-[(3S)-피롤리딘-3-일]-N알파-[(l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}-사이클로프로필)카보닐]-L-페닐알라닌아미드; N-[(3R)-피페리딘-3-일]-N알파-[(l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}-사이클로프로필)카보닐]-L-페닐알라닌아미드; N-[(1S)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-2-옥소-l-(페닐메틸)에틸]-l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로판카복사미드; N-[(3S)-피롤리딘-3-일]-N알파-[(l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}-사이클로프로필)카보닐]-L-페닐알라닌아미드; 3-사이클로헥실-N-[(3R)-피페리딘-3-일]-N~2―[(l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}-사이클로프로필)카보닐]-L-알라닌아미드; N-[(1S)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-l-(사이클로헥실메틸)-2-옥소에틸]-l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로판카복사미드; 3-사이클로헥실-N-[(3S)-피롤리딘-3-일]-N~2~[(l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}-사이클로프로필)카보닐]-L-알라닌아미드; N-피페리딘-4-일-N알파-[(1-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로필)-카보닐]-L-페닐알라닌아미드; N-피페리딘-4-일-4-(트리플루오로메틸)-N알파-[(l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]-페닐}사이클로프로필) 카보닐]-L-페닐알라닌아미드; 3-사이클로헥실-N-피페리딘-4-일-N'2'-[(l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}-사이클로프로필)카보닐]-L-알라닌아미드; 2,4-디클로로-N-피페리딘-4-일-N알파-[(l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}-사이클로프로필)카보닐]-L-페닐알라닌아미드; N-{(1S)-2-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-[4-(메틸아미노)피페리딘-l-일]-2-옥소에틸}-l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로판카복사미드; N-{(1S)-2-(4-아미노피페리딘-l-일)-l-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로판카복사미드; N-[(1S)-2-[4-(메틸아미노)피페리딘-l-일]-2-옥소-l-{[4-(트리플루오로메틸)페닐]-메틸}에틸]-l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로판카복사미드; N-[(lS)-2-(4-아미노피페리딘-l-일)-2-옥소-l-{[4-(트리플루오로메틸)페닐]메틸}-에틸]-l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로판카복사미드; N-{(lS)-l-[(4-브로모페닐)메틸]-2-[4-(메틸아미노)피페리딘-l-일]-2-옥소에틸}-l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로판카복사미드; N-{(1 S)-2-(4-아미노피페리딘-1-일)-1-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸}-1-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로판카복사미드; N-[(1S)-2-[4-(메틸아미노)피페리딘-l-일]-2-옥소-l-(페닐메틸)에틸]-l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로판카복사미드; N-[(lS)-2-(4-아미노피페리딘-l-일)-2-옥소-l-(페닐메틸)에틸]-l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로판카복사미드; N-{(lS)-l-(사이클로헥실메틸)-2-[4-(메틸아미노)피페리딘-l-일]-2-옥소에틸}-l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로판카복사미드; N-[(lS)-2-(4-아미노피페리딘-l-일)-l-(사이클로헥실메틸)-2-옥소에틸]-l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로판카복사미드; 4-브로모-N-피페리딘-4-일-N알파-[(l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}-사이클로프로필)-카보닐]-L-페닐알라닌아미드; N-{(lS)-2-(4-아미노-4-메틸피페리딘-l-일)-l-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-(2,3,4-트리플루오로페닐)사이클로프로판카복사미드; 4-브로모-N-[(3R)-피페리딘-3-일]-N알파-{[l-(2,3,4-트리플루오로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-L-페닐알라닌아미드; N-{(1 S)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-1-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-(2,3,4-트리플루오로페닐)사이클로프로판카복사미드; N-{(lS)-2-(4-아미노-4-메틸피페리딘-l-일)-l-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-(2,3-디플루오로페닐)사이클로프로판카복사미드; 4-브로모-N알파-{[l-(2,3-디플루오로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[(3R)-피페리딘-3-일]-L-페닐알라닌아미드; N-{(1 S)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-1-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-(2,3-디플루오로페닐)사이클로프로판카복사미드; N-{(lS)-2-(4-아미노-4-메틸피페리딘-l-일)-l-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-(4-플루오로페닐)사이클로프로판카복사미드; 4-브로모-N알파-{[l-(4-플루오로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[(3R)-피페리딘-3-일]-L-페닐알라닌아미드; N-{(1 S)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-1-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-(4-플루오로페닐)사이클로프로판카복사미드; 2,4-디클로로-N알파-({l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로필}-카보닐)-N-[(3R)-피페리딘-3-일]-L-페닐알라닌아미드; N-{(1 S)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-1-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로판카복사미드; 2,4-디클로로-N알파-({l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로필}-카보닐)-N-[(3S)-피롤리딘-3-일]-L-페닐알라닌아미드; N-[(lS)-2-(4-아미노-4-메틸피페리딘-l-일)-2-옥소-l-{[4-(트리플루오로메틸)-페닐]메틸}에틸]-l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로판카복사미드; N알파-({l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로필}카보닐)-N-[(3R)-피페리딘-3-일]-4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; N알파-({l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로필}카보닐)-N-[(3S)-피롤리딘-3-일]-4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; 4-브로모-N알파-({l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로필}-카보닐)-N-[(3R)-피페리딘-3-일]-L-페닐알라닌아미드; N-{(1 S)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-1-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로판카복사미드; 4-브로모-N알파-({l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로필}카보닐)-N-[(3S)-피롤리딘-3-일]-L-페닐알라닌아미드; N알파-({l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로필}카보닐)-N-[(3R)-피페리딘-3-일]-L-페닐알라닌아미드; N-[(1S)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-2-옥소-l-(페닐메틸)에틸]-1-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로판카복사미드; N알파-({ 1-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로필}카보닐)-N-[(3 S)-피롤리딘-3-일]-L-페닐알라닌아미드; 3-사이클로헥실-N'2'-({l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로필}-카보닐)-N-[(3R)-피페리딘-3-일]-L-알라닌아미드; N-[(1S)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-l-(사이클로헥실메틸)-2-옥소에틸]-l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로판카복사미드; 3-사이클로헥실-N'2'-({l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로필}-카보닐)-N-[(3S)-피롤리딘-3-일]-L-알라닌아미드; 2,4-디클로로-N알파-({l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로필}-카보닐)-N-피페리딘-4-일-L-페닐알라닌아미드; N알파-({l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로필}카보닐)-N-피페리딘-4-일-4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; 4-브로모-N알파-({l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로필}-카보닐)-N-피페리딘-4-일-L-페닐알라닌아미드; N알파-({l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로필}카보닐)-N-피페리딘-4-일-L-페닐알라닌아미드; 3-사이클로헥실-N'2'-({l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로필}-카보닐)-N-피페리딘-4-일-L-알라닌아미드; 1-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]-N-[(l S)-2-[4-(메틸아미노)피페리딘-l-일]-2-옥소-l-{[4-(트리플루오로메틸)페닐]메틸}에틸]사이클로프로판카복사미드; N-[(lS)-2-(4-아미노피페리딘-l-일)-2-옥소-l-{[4-(트리플루오로메틸)페닐]메틸}-에틸]-l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로판카복사미드; N-{(lS)-l-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-[4-(메틸아미노)피페리딘-l-일]-2-옥소에틸}-l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로판카복사미드; N-{(lS)-2-(4-아미노피페리딘-l-일)-l-[(2,4-디클로로페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로판카복사미드; N-{(1 S)-1-[(4-브로모페닐)메틸]-2-[4-(메틸아미노)피페리딘-l-일]-2-옥소에틸}-l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로판카복사미드; N-{(lS)-2-(4-아미노피페리딘-l-일)-l-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로판카복사미드; 1-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]-N-[(l S)-2-[4-(메틸아미노)피페리딘-l-일]-2-옥소-l-(페닐메틸)에틸]사이클로프로판카복사미드; N-[(1S)-2-(4-아미노피페리딘-l-일)-2-옥소-l-(페닐메틸)에틸]-1-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로판카복사미드; N-{(1S)-1-(사이클로헥실메틸)-2-[4-(메틸아미노)피페리딘-l-일]-2-옥소에틸}-l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로판카복사미드; N-[(1S)-2-(4-아미노피페리딘-l-일)-l-(사이클로헥실메틸)-2-옥소에틸]-l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로판카복사미드; N-{(1S)-2-(4-아미노-4-메틸피페리딘-l-일)-l-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-[2-플루오로-4-트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로판카복사미드; N-{(lS)-2-(4-아미노-4-메틸피페리딘-l-일)-l-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-(2,4-디플루오로페닐)사이클로프로판카복사미드; 4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디플루오로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[(3R)-피페리딘-3-일]-L-페닐알라닌아미드; N-{(1 S)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-1-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-(2,4-디플루오로페닐)사이클로프로판카복사미드; 4-브로모-N알파-({l-[4-플루오로-3-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로필}카보닐)-N-[(3R)-피페리딘-3-일]-L-페닐알라닌아미드; N-{(1 S)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-1-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-[4-플루오로-3-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로판카복사미드; N-{(1S)-2-(4-아미노-4-메틸피페리딘-l-일)-l-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-[4-플루오로-3-(트리플루오로메틸)페닐]사이클로프로판카복사미드; N-{(1S)-2-(4-아미노-4-메틸피페리딘-l-일)-l-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-(2-플루오로페닐)사이클로프로판카복사미드; 4-브로모-N알파-{[l-(2-플루오로페닐)사이클로프로필]카보닐}-N-[(3R)-피페리딘-3-일]-L-페닐알라닌아미드; N-{(1 S)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-1-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-(2-플루오로페닐)사이클로프로판카복사미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-브로모-N알파-{[l-(2,4,5-트리플루오로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-L-페닐알라닌아미드; N-{(lS)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-l-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-(2,4,5-트리플루오로페닐)사이클로프로판카복사미드; 4-브로모-N-[(3R)-피페리딘-3-일]-N알파-{[l-(2,4,5-트리플루오로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-L-페닐알라닌아미드; N-{(1R)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-l-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로판카복사미드; N-(아제티딘-3-일메틸)-4-브로모-N-메틸-N알파-[(l-{4-[(트리플루오로메틸)-옥시]페닐}사이클로프로필)카보닐]-L-페닐알라닌아미드; N-[(1S)-I-[(4-브로모페닐)메틸]-2-(2,5-디아자바이사이클로[2.2.1]헵트-2-일)-2-옥소에틸]-l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로판카복사미드; N-[(1S)-1-[(4-브로모페닐)메틸]-2-(2,5-디아자바이사이클로[2.2.1]헵트-2-일)-2-옥소에틸]-l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-브로모-N알파-{[l-(4-플루오로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-L-페닐알라닌아미드; N-[(lS)-l-[(4-브로모페닐)메틸]-2-{4-[(l-메틸에틸)아미노]피페리딘-l-일}-2-옥소에틸]-l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; N-(아제티딘-3-일메틸)-4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]-카보닐}-N-메틸-L-페닐알라닌아미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-브로모-N알파-{[l-(2,3,4-트리플루오로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-L-페닐알라닌아미드; N-[(3S)-1―아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-브로모-N알파-({1-4-플루오로-3-(트리플루오로메틸)-페닐]사이클로프로필}카보닐)-L-페닐알라닌아미드; N-(시스-4-아미노사이클로헥실)-4-브로모-N알파-({l-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)-페닐]사이클로프로필)카보닐]-L-페닐알라닌아미드; N-(시스-4-아미노사이클로헥실)-4-브로모-N알파-[(l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]-페닐]사이클로프로필}카보닐)-L-페닐알라닌아미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-브로모-N알파-({l-[4-플루오로-2-(트리플루오로메틸)페닐]이클로프로필}카보닐)-L-페닐알라닌아미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-브로모-N알파-{[l-(2,4-디플루오로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-L-페닐알라닌아미드; N-{(1 S)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-1-[(4-플루오로페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로판카복사미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-브로모-N알파-({l-[2-(트리플루오로메틸)-페닐]사이클로프로필}카보닐]-L-페닐알라닌아미드; 4-플루오로-N-[(3R)-피페리딘-3-일]-N알파-[(l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}-사이클로프로필)카보닐]-L-페닐알라닌아미드; N-{(lS)-2-(4-아미노피페리딘-l-일)-l-[(4-플루오로페닐)메틸]-2-옥소에틸}-l-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}사이클로프로판카복사미드; N-[(lS)-l-[(4-브로모페닐)메틸]-2-(4-하이드록시피페리딘-l-일)-2-옥소에틸]-l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로판카복사미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-(트리플루오로메틸)-N알파-[(l-{4-[(트리플루오로메틸)-옥시]페닐}사이클로프로필)카보닐]-L-페닐알라닌아미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-2,4-디클로로-N-알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-L-페닐알라닌아미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-4-브로모-N-알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]카보닐}-L-페닐알라닌아미드; N-[(3S)-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일]-N-알파-{[l-(2,4-디클로로페닐)-사이클로프로필]-카보닐}-4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌아미드; 4-브로모-N알파-[2-(2,4-디클로로페닐)-2-메틸프로파노일]-N-[(3R)-피페리딘-3-일]-L-페닐알라닌아미드; 4-브로모-N알파-(2-메틸-2-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}프로파노일)-N-[(3R)-피페리딘-3-일]-L-페닐알라닌아미드; N-{(1 S)-2-(3-아미노-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥트-8-일)-1-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸}-2-메틸-2-{4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}프로판아미드; N-{(lS)-2-(4-아미노-4-메틸피페리딘-l-일)-l-[(4-브로모페닐)메틸]-2-옥소에틸}-2-(2,4-디클로로페닐)-2-메틸프로판아미드; l-(2,4-디클로로페닐)-N-[(lS)-l-({[(l-메틸사이클로프로필)메틸]옥시}메틸)-2-(4-메틸피페라진-l-일)-2-옥소에틸]사이클로프로판카복사미드; N-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일-N'2'-{[l-(2,4-디클로로페닐)사이클로프로필]카보닐}-3-(l-메틸사이클로프로필)-L-알라닌아미드를 포함하는 군으로부터 선택된다.
카바메이트의 예는 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함되는 특허 출원 WO2012129084, WO2014043068에 기재되어 있다.
일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 본 명세서에 참조로 포함되는 특허 출원 WO2012129084에 기재되어 있으며, 1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일[2-(2,4'-디플루오로바이페닐-4-일)프로판-2-일]카바메이트; 1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일{2-[4-(l,3-벤조티아졸-6-일)페닐]프로판-2-일}카바메이트; l-아자바이사이클로[3.2.2]논-4-일{ 1-[5-(4-플루오로페닐)피리딘-2-일]사이클로프로필}카바메이트; 1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일{ 1-[3-(4-플루오로페녹시)페닐]사이클로프로필}카바메이트; 1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일{ l-[4-(1,3-벤조티아졸-5-일)페닐]사이클로프로필}카바메이트; l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일[1-(4'-플루오로-3'-메톡시바이페닐-4일)사이클로프로필]카바메이트; 1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일[3-(4'-플루오로바이페닐-4-일)옥세탄-3-일]카바메이트; 1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일{1-[6-(4-플루오로페녹시)피리딘-2-일]사이클로프로필}카바메이트; 1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일[3-(4'-플루오로바이페닐-4-일)펜탄-3-일]카바메이트; 1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일{2-[2-(4-플루오로페닐)-2H-인다졸-6-일]프로판-2-일}카바메이트; 1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일{2-[2-( 1 H-피롤-1-일)피리딘-4-일]프로판-2-일}카바메이트; 1-(3-에틸-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일)-3-[1-(4'-플루오로바이페닐-4-일)사이클로프로필]우레아; N-(1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일)-N'-[1-(4'-플루오로바이페닐-4일)사이클로프로필]에탄디아미드; 1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일 (1-{4[(4,4디플루오로사이클로헥실)옥시]페닐}사이클로프로필) 카바메이트; 1-(4-메틸-1-아자바이사이클로[3.2.2]논-4-일)-3-[1-(5-페닐피리딘-2-일)사이클로프로필]우레아; 1-[ 1-(4'-플루오로바이페닐-4-일)사이클로프로필]-1-메틸-3-(3-메틸-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일)우레아; 1-[1-(4'-플루오로바이페닐-4-일)사이클로프로필]-l-메틸-3-(3-메틸-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일)우레아; 1-{2-[4'-(2-메톡시에톡시)바이페닐-4-일]프로판-2-일}-3-(3-메틸-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일)우레아; 2-(1-아자바이사이클로[3.2.2]논-4-일)-N-[l-(5-페닐피리딘-2-일)사이클로프로필]아세트아미드; 3-(4'-플루오로바이페닐-4-일)-3-메틸-N-(4-메틸-1-아자바이사이클로[3.2.2]논-4-일)부탄아미드; N-[2-(바이페닐-4-일)프로판-2-일]-N'-(3-메틸-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일)황산 디아미드; N-[2-(4'-플루오로바이페닐-4-일)프로판-2-일]-N'-(3-메틸-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일)황산 디아미드; 1-(3-부틸-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일)-3-{2-[1-(4-플루오로페닐)-1H-피라졸-4-일]프로판-2-일}우레아; 1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일[4-(4-플루오로페닐)-2-메틸부트-3-인-2-일]카바메이트; 1-(3-부틸-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일)-3-[4-(4-플루오로페닐)-2-메틸부트-3-인-2-일)우레아; N-[1-(4'-플루오로바이페닐-4-일)사이클로프로필]-1,4-디아자바이사이클로[3.2.2]노난-4-카복사미드; 1-(2-(4'-플루오로-[1,1'-바이페닐]-4-일)프로판-2-일)-3-(3-메틸-1-아자바이사이클로[3.2.2]노난-3-일)우레아; 1-(2-(4'-플루오로-[1,1'-바이페닐]-4-일)프로판-2-일)-3-(4-메틸-1-아자바이사이클로[4.2.2]데칸-4-일)우레아; 1-(2-(4'-플루오로-[1,1'-바이페닐]-4-일)프로판-2-일)-3-(3-메틸-1-아자바이사이클로[4.2.2]데칸-3-일)우레아; 및 1-(2-(4'-플루오로-[1,1'-바이페닐]-4-일)프로판-2-일)-3-(5-메틸-l-아자바이사이클로[4.2.2]데칸-5-일)우레아를 포함하는 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 본 명세서에 참조로 포함되는 특허 출원 WO2012129084에 기재되어 있으며, 다음 화학식을 갖는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 전구약물이다:
Figure pct00044
여기서:
n은 1, 2 또는 3이고;
m은 0 또는 1이고;
p는 0 또는 1이고;
t는 0, 1 또는 2이고;
y는 1 또는 2이고;
z는 0, 1 또는 2이고;
E는 S, O, NH, NOH, NNO2, NCN, NR, NOR 또는 NSO2R이고;
m이 1인 경우, X1은 CR1이거나, m이 0인 경우, X1은 N이고;
X2는 O, -NH, -CH2-, SO2, NH-SO2; CH(C1-C6) 알킬 또는 -NR2이고;
X3은 O, -NH, -CH2-, CO, -CH(C1-C6) 알킬, SO2NH, -CO-NH- 또는 -NR3이고;
X4는 CR4R5, CH2CR4R5 또는 CH2-(C1-C6)알킬-CR4R5이고;
X5는 직접 결합, O, S, SO2, CR4R5; (C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬옥시, (C1-C6)알케닐, (C1-C6)알케닐옥시이고;
R은 (C6-C12)아릴, (C2-C9)헤테로아릴, (C1-C6)알킬, (C2-C9)헤테로아릴(C1-C6)알킬이고;
R1은 H, CN, (C1-C6)알킬카보닐, 또는 (C1-C6)알킬이고;
R2 및 R3은 각각 독립적으로, -H, 할로겐, (C1-C6)알킬, (C6-C12)아릴, (C2-C9)헤테로아릴, (C1-C6)알킬(C6-C12)아릴, 할로(C6-C12)아릴, 및 할로(C2-C9)헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬이거나, 선택적으로, X2가-NR2이고, X3이-NR3인 경우, R2 및 R3은 이들이 부착된 질소 원자와 함께, 할로겐, (C1-C6)알킬, (C6-C12)아릴, (C2-C9)헤테로아릴, (C1-C6)알킬(C6-C12)아릴, 할로(C6-C12)아릴, 및 할로(C2-C9)헤테로아릴로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환된 비 방향족 헤테로사이클릭 고리를 형성할 수 있고;
R4 및 R5는 독립적으로 H, (C1-C6)알킬로부터 선택되거나, 이들과 부착된 탄소와 함께, 스피로 (C3-C10)사이클로알킬 고리 또는 스피로 (C3-C10)사이클로알콕시 고리를 형성하고;
R6은-H, 할로겐, -CN, 1 내지 4개의 할로 또는 (C1-C6)알킬로 선택적으로 치환된 (C6-C12)아릴, (C6-C12)아릴옥시, (C1-C6)알킬옥시; (C1-C6)알킬이고;
A1은 할로, 1 내지 3개의 할로로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬; (C1-C6)알케닐, 아미노, (C1-C6)알킬아미노, (C1-C6) 디알킬아미노, (C1-C6)알콕시, 니트로, CN, -OH, 1 내지 3개의 할로로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬옥시; (C1-C6)알콕시카보닐, 및 (C1-C6) 알킬카보닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환된 (C2-C6)알키닐; (C6-C12)아릴, (C2-C9)헤테로아릴, (C2-C9)헤테로사이클로알킬 또는 벤조(C2-C9)헤테로사이클로알킬이고;
A2는 H, 할로, 1 내지 3개의 할로로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬; (C1-C6)알킬레닐, 아미노, (C1-C6) 알킬아미노, (C1-C6)디알킬아미노, (C1-C6)알콕시, O(C3-C6 사이클로알킬), (C3-C6) 사이클로알콕시, 니트로, CN, OH, 1 내지 3개의 할로로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬옥시; (C3-C6) 사이클로알킬, (C1-C6) 알콕시카보닐, (C1-C6) 알킬카보닐, (C1-C6) 할로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환된 (C6-C12)아릴, (C2-C9)헤테로아릴, (C2-C9)헤테로사이클로알킬 또는 벤조(C2-C9)헤테로사이클로알킬이고;
단, n + t + y + z의 합은 6을 초과하지 않고;
단, p가 0인 경우; X2는 NH-SO2이고, X3은 NH이고;
단, n은 1이고; t는 0이고; y는 1이고; z는 1이고; X2는 NH이고; E는 O이고; X3은 NH이고; A2는 H이고, X5는 직접 결합인 경우; A1은 치환되지 않은 페닐, 할로페닐 또는 이소프로페닐 페닐이 아니고;
단, n은 1이고; t는 0이고; y는 1이고; z는 1이고; X2는 O이고; E는 O이고; X3은 NH이고; A는 (C6-C12)아릴이고, X5는 직접 결합이고; A2는 H이고, R4는 H인 경우, 이어서, R5는 사이클로헥실이 아니고; 단, n은 1이고; t는 0이고; y는 1이고; z는 1이고; X는 NH이고; E는 O이고; X는 CH2이고; R4 및 R5는 둘 모두 수소이고; A2는 H이고, X5는 직접 결합인 경우; 이어서, A1은 치환되지 않은 페닐이 아니다.
특히, 강글리오사이드 대사 억제제는 본 명세서에 참조로 포함되는 특허 출원 WO2012129084에 기재되어 있으며, 다음 화학식을 갖는 화합물로부터 선택된다:
Figure pct00045
Figure pct00046
일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 본 명세서에 참조로 포함되는 특허 출원 WO2014043068에 기재되어 있으며, 1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일[2-(2,4'-디플루오로바이페닐-4-일)프로판-2-일]카바메이트; 1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일{2-[4-(1,3-벤조티아졸-6-일)페닐]프로판-2-일}카바메이트; 1-아자바이사이클로[3.2.2]논-4-일{ 1-[5-(4-플루오로페닐)피리딘-2-일]사이클로프로필}카바메이트; 1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일{1-[3-(4-플루오로페녹시)페닐]사이클로프로필}카바메이트; 1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일{1-[4-(1,3-벤조티아졸-5-일)페닐]사이클로프로필}카바메이트; 1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일[1-(4'-플루오로-3'-메톡시바이페닐-4일)사이클로프로필]카바메이트; 1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일[3-(4'-플루오로바이페닐-4-일)옥세탄-3-일]카바메이트; 1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일{ 1-[6-(4-플루오로페녹시)피리딘-2-일]사이클로프로필}카바메이트; 1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일[3-(4'-플루오로바이페닐-4-일)펜탄-3-일]카바메이트; 1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일{2-[2-(4-플루오로페닐)-2H-인다졸-6-일]프로판-2-일}카바메이트; 1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일{2-[2-(1H-피롤-1-일)피리딘-4-일]프로판-2-일}카바메이트; 1-(3-에틸-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일)-3-[1-(4'-플루오로바이페닐-4-일)사이클로프로필]우레아; N-(1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일)-N'-[ 1-(4'-플루오로바이페닐-4일)사이클로프로필]에탄디아미드; 1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일 (1-{4[(4,4디플루오로사이클로헥실)옥시]페닐}사이클로프로필) 카바메이트; 1-(4-메틸-1-아자바이사이클로[3.2.2]논-4-일)-3-[ 1-(5-페닐피리딘-2-일)사이클로프로필]우레아; 1-[ 1-(4'-플루오로바이페닐-4-일)사이클로프로필]-1-메틸-3-(3-메틸-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일)우레아; 1-[1-(4'-플루오로바이페닐-4-일)사이클로프로필]-1-메틸-3-(3-메틸-l-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일)우레아; 1-{2-[4'-(2-메톡시에톡시)바이페닐-4-일]프로판-2-일}-3-(3-메틸-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일)우레아; 2-(1-아자바이사이클로[3.2.2]논-4-일)-N-[1-(5-페닐피리딘-2-일)사이클로프로필]아세트아미드; 3-(4'-플루오로바이페닐-4-일)-3-메틸-N-(4-메틸-1-아자바이사이클로[3.2.2]논-4-일)부탄아미드; N-[2-(바이페닐-4-일)프로판-2-일]-N'-(3-메틸-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일)황산 디아미드; N-[2-(4'-플루오로바이페닐-4-일)프로판-2-일]-N'-(3-메틸-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일)황산 디아미드; 1-(3-부틸-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일)-3-{2-[1-(4-플루오로페닐)-1H-피라졸-4-일]프로판-2-일}우레아; 1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일[4-(4-플루오로페닐)-2-메틸부트-3-인-2-일]카바메이트; 1-(3-부틸-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥트-3-일)-3-[4-(4-플루오로페닐)-2-메틸부트-3-인-2-일]우레아; N-[l-(4'-플루오로바이페닐-4-일)사이클로프로필]-1,4-디아자바이사이클로[3.2.2]노난-4-카복사미드; 1-(2-(4'-플루오로-[1,1'-바이페닐]-4-일)프로판-2-일)-3-(3-메틸-1-아자바이사이클로[3.2.2]노난-3-일)우레아; 1-(2-(4'-플루오로-[1,-바이페닐]-4-일)프로판-2-일)-3-(4-메틸-1-아자바이사이클로[4.2.2]데칸-4-일)우레아; 1-(2-(4'-플루오로-[1,1'-바이페닐]-4-일)프로판-2-일)-3-(3-메틸-1-아자바이사이클로[4.2.2]데칸-3-일)우레아; 및 1-(2-(4'-플루오로-[1,1'-바이페닐]-4-일)프로판-2-일)-3-(5-메틸-1-아자바이사이클로[4.2.2]데칸-5-일)우레아를 포함하는 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 본 명세서에 참조로 포함되는 특허 출원 WO2014043068에 기재되어 있으며, 다음 화학식을 포함한다:
Figure pct00047
여기서:
n은 1, 2 또는 3이고;
m은 0 또는 1이고;
p는 0 또는 1이고;
t는 0, 1 또는 2이고;
y는 1 또는 2이고;
z는 0, 1 또는 2이고;
E는 S, O, NH, NOH, NNO2, NCN, NR, NOR 또는 NSO2R이고;
m이 1인 경우, X1은 CR1이거나, m이 0인 경우, X1은 N이고;
X2는 O, -NH, -CH2-, SO2, NH-SO2; CH(C1-C6) 알킬 또는 -NR2이고;
X3은 O, -NH, -CH2-, CO, -CH(C1-C6) 알킬, SO2NH, -CO-NH- 또는 -NR3이고;
X4는 CR4R5, CH2CR4R5 또는 CH2-(C1-C6)알킬-CR4R5이고;
X5는 직접 결합, O, S, SO2, CR4R5; (C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬옥시, (C1-C6)알케닐, (C1-C6)알케닐옥시이고;
R은 (C6-C12)아릴, (C2-C9)헤테로아릴, (C1-C6)알킬, (C2-C9)헤테로아릴(C1-C6)알킬이고;
R1은 H, CN, (C1-C6)알킬카보닐, 또는 (C1-C6)알킬이고;
R2 및 R3은 각각 독립적으로-H, 할로겐, (C1-C6)알킬, (C6-C12)아릴, (C2-C9)헤테로아릴, (C1-C6)알킬(C6-C12)아릴, 할로(C6-C12)아릴, 및 할로(C2-C9)헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬이거나, 선택적으로 X2가-NR2이고, X3이-NR3인 경우, R2 및 R3은 이들과 부착된 질소 원자와 함께, 할로겐, (C1-C6)알킬, (C6-C12)아릴, (C2-C9)헤테로아릴, (C1-C6)알킬(C6-C12)아릴, 할로(C6-C12)아릴, 및 할로(C2-C9)헤테로아릴로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환된 비 방향족 헤테로사이클릭 고리를 형성할 수 있고;
R4 및 R5는 독립적으로 H, (C1-C6)알킬로부터 선택되거나, 이들과 부착된 탄소와 함께, 스피로 (C3-C10)사이클로알킬 고리 또는 스피로 (C3-C10)사이클로알콕시 고리를 형성할 수 있고;
R6은 -H, 할로겐, -CN, 1 내지 4개의 할로 또는 (C1-C6)알킬로 선택적으로 치환된 (C6-C12)아릴, (C6-C12)아릴옥시, (C1-C6)알킬옥시; (C1-C6)알킬이고;
A1은 할로, 1 내지 3개의 할로로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬; (C1-C6)알케닐, 아미노, (C1-C6)알킬아미노, (C1-C6) 디알킬아미노, (C1-C6)알콕시, 니트로, CN, -OH, 1 내지 3개의 할로로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬옥시; (C1-C6)알콕시카보닐, 및 (C1-C6) 알킬카보닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환된 (C2-C6)알키닐; (C6-C12)아릴, (C2-C9)헤테로아릴, (C2-C9)헤테로사이클로알킬 또는 벤조(C2-C9)헤테로사이클로알킬이고;
A2는 H, 할로, 1 내지 3개의 할로로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬; (C1-C6)알킬레닐, 아미노, (C1-C6) 알킬아미노, (C1-C6)디알킬아미노, (C1-C6)알콕시, O(C3-C6 사이클로알킬), (C3-C6) 사이클로알콕시, 니트로, CN, OH, 1 내지 3개의 할로로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬옥시; (C3-C6) 사이클로알킬, (C1-C6) 알콕시카보닐, (C1-C6) 알킬카보닐, (C1-C6) 할로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환된 (C6-C12)아릴, (C2-C9)헤테로아릴, (C2-C9)헤테로사이클로알킬 또는 벤조(C2-C9)헤테로사이클로알킬이고;
단, n + t + y + z의 합은 6을 초과하지 않고;
단, p가 0인 경우; X2는 NH-SO2이고, X3은 NH이고;
단, n은 1이고; t는 0이고; y는 1이고; z는 1이고; X2는 NH이고; E는 O이고; X3은 NH이고; A2는 H이고, X5는 직접 결합인 경우; A1은 치환되지 않은 페닐, 할로페닐 또는 이소프로페닐 페닐이 아니고;
단, n은 1이고; t는 0이고; y는 1이고; z는 1이고; X2는 O이고; E는 O이고; X3은 NH이고; A는 (C6-C12)아릴이고, X5는 직접 결합이고; A2는 H이고, R4는 H인 경우, 이어서, R5는 사이클로헥실이 아니고; 단, n은 1이고; t는 0이고; y는 1이고; z는 1이고; X는 NH이고; E는 O이고; X는 CH2이고; R4 및 R5는 둘 모두 수소이고; A2는 H이고, X5는 직접 결합인 경우; 이어서, A1은 치환되지 않은 페닐이 아니다.
특히, 강글리오사이드 대사 억제제는 본 명세서에 참조로 포함되는 특허 출원 WO2014043068에 기재되어 있으며, 다음 화학식을 갖는 화합물로부터 선택된다:
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 특허 출원 WO2014043068에 기재되어 있으며, (S)-퀴누클리딘-3-일 (2-(2-(4-플루오로페닐)티아졸-4-일)프로판-2-일)카바메이트 (S)-2-하이드록시숙시네이트 (GZ 452), 퀴누클리딘-3-일 (2-(4'-플루오로-[l,-바이페닐]-3-일)프로판-2-일)카바메이트 (GZ 161) 및 (1R,2R)-옥탄산[2-(2',3'-디하이드로-벤조[1,4]디옥신-6'-일)-2-하이드록시-l-피롤리딘-l-일메틸-에틸]-아미드-L-타르타르산 (GZ 638)을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사의 억제제 지지체는 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌 [Richards S et al. (J Med Chem. 2012 May 10;55(9):4322-35)]에 기재되어 있으며, 다음 화학식을 갖는다:
Figure pct00059
EXEL-0346 (IC50이 2 nM임).
일 실시형태에서, 본 발명의 억제제는 강글리오사이드 대사를 억제하는 펩타이드이다. 이러한 펩타이드의 비 제한 예는 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌 [Koltun E et al. Bioorg Med Chem Lett. 2011 Nov 15;21(22):6773-7]에 기재되어 있으며, 다음 화학식을 갖는다:
Figure pct00060
여기서, R은 다음과 같다:
Figure pct00061
.
일 실시형태에서, 억제제는 화학적 샤페론 억제제 샤페론이다. 화학적 샤페론의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 이소파고민, 미글라스타트 (miglastat), 트랜스-4-(2-아미노-3,5-디브롬벤질아미노)-사이클로헥산올 또한 이른바 암브록솔, 및 5-(4-클로로페닐)-6-에틸-2,4-피리미딘디아민 또한 이른바 피리메타민 또는 다라프림 (Daraprim)을 포함한다.
일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 미국 특허 7,501,439에 기재된 바와 같은 화학적 샤페론이며, 다음 화학식을 갖는 (3R,4R,5R)-5-(하이드록시메틸)-3,4-피페리딘디올 또한 이른바 이소파고민 D-타르트레이트 (아페고스타트 (Afegostat))이다:
Figure pct00062
.
일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 유럽 특허 EP0240907에 기재된 바와 같은 화학적 샤페론이며, 다음 화학식을 갖는 암브록솔이다:
Figure pct00063
.
화학적 샤페론의 다른 예는 제한 없이, 1-데옥시갈락토노지리마이신 (DGJ), α-호모갈락토노지리마이신, α-호모알로노지리마이신, β-1-C-부틸-DGJ, NB-DGJ, 및 N-노닐-DNJ를 포함한다.
일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 5,236,838; 5,549,892; 및 6,451,600에 기재되어 있으며, 이미글루세라제 또한 이른바 세레자임 (Cerezyme)이다.
일 실시형태에서, 강글리오사이드 대사 억제제는 GM3 합성효소를 억제한다.
일 실시형태에서, GM3 합성효소의 억제제는 miRNA이다.
GM3 합성효소 억제제의 예는 제한 없이, ATGTACAGGAGCCAGACTCCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGGAGTCTCTCCTGTACAT (서열번호 3) 및/또는 ATAACAGAGCCATAGCCGTCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGACGGCTGGCTCTGTTAT (서열번호 4)를 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에서, GM3 합성효소 억제제는 서열번호 3의 적어도 20, 30, 40, 50 또는 55개의 뉴클레오타이드 (바람직하게는 인접 뉴클레오타이드)의 서열을 갖는 miRNA이다.
본 발명의 일 실시형태에서, GM3 합성효소 억제제는 서열번호 3의 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드, 예컨대, 서열번호 3의 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 또는 59개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하거나, 이로 이루어진 서열을 갖는 miRNA이다.
본 발명의 일 실시형태에서, GM3 합성효소 억제제는 서열번호 3의 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드, 예컨대, 서열번호 3의 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 또는 59개의 인접 뉴클레오타이드 및 3' 및/또는 5'의 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 추가의 뉴클레오타이드를 포함하거나, 이로 이루어진 서열을 갖는 miRNA이다.
일 실시형태에서, GM3 합성효소 억제제는 서열번호 3의 기능 유지 서열이고, 상기 기능 유지 서열은 서열번호 3과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 약 95% 초과, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖고, 서열번호 3과 같은 GM3 합성효소 발현의 억제능을 유지하는 9 내지 70, 12 내지 60, 또는 15 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함하거나, 이로 이루어진다.
일 실시형태에서, 서열번호 3의 기능 유지 서열은 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 또는 70개의 뉴클레오타이드를 포함하거나, 이로 이루어진다.
2개 이상의 뉴클레오타이드 서열 사이의 관계에서 사용되는 경우, 용어 "동일성" 또는 "동일한"은 2개 이상의 염기 서열 사이의 매치 수에 의해 측정되는 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 서열관련성의 정도를 지칭한다. "동일성"은 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램 (즉, "알고리즘")에 의해 처리된 갭 정렬 (존재하는 경우)을 갖는 2개 이상의 서열 중 더 작은 것 사이의 동일한 매치의 퍼센트를 측정한다. 관련 뉴클레오타이드 서열의 동일성은 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다. 이러한 방법은 다음에 제한되는 것은 아니나, 문헌 [Arthur M. Lesk, Computational Molecular Biology: Sources and Methods for Sequence Analysis (New-York: Oxford University Press, 1988); Douglas W. Smith, Biocomputing: Informatics and Genome Projects (New-York: Academic Press, 1993); Hugh G. Griffin and Annette M. Griffin, Computer Analysis of Sequence Data, Part 1 (New Jersey: Humana Press, 1994); Gunnar von Heinje, Sequence Analysis in Molecular Biology: Treasure Trove or Trivial Pursuit (Academic Press, 1987); Michael Gribskov and John Devereux, Sequence Analysis Primer (New York: M. Stockton Press, 1991); 및 Carillo et al., 1988. SIAM J. Appl. Math. 48(5):1073-1082]에 기재되어 있는 것을 포함한다. 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 시험되는 서열 사이의 매치율이 가장 크게 제공되도록 설계한다. 동일성을 결정하는 방법은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램에 기재되어 있다. 2개의 서열 사이의 동일성을 결정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 GAP (문헌 [Devereux et al., 1984. Nucl. Acid. Res. 12(1 Pt 1):387-395; Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI]), BLASTP, BLASTN, TBLASTN 및 FASTA (문헌 [Altschul et al., 1990. J. Mol. Biol. 215(3):403-410])를 포함한 GCG 프로그램 패키지를 포함한다. BLASTX 프로그램은 미국 국립생물공학정보센터 (NCBI) 및 다른 공급원 (BLAST 매뉴얼, 문헌 [Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., 1990. J. Mol. Biol. 215(3):403-410])으로부터 공개적으로 이용 가능하다. 또한, 널리 공지된 스미스 워터맨 알고리즘 (Smith Waterman algorithm)을 사용하여, 동일성을 측정할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 서열번호 3의 기능 유지 서열은 C-말단 및 N-말단의 다른 핵산 사이에 서열번호 3을 포함하는 서열일 수 있다. 상기 기능 유지 서열은 또한 서열번호 3의 단편일 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, GM3 합성효소 억제제는 서열번호 4의 적어도 20, 30, 40, 50 또는 55개의 뉴클레오타이드 (바람직하게는 인접 뉴클레오타이드)의 서열을 갖는 miRNA이다.
본 발명의 일 실시형태에서, GM3 합성효소 억제제는 서열번호 4의 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드, 예컨대, 서열번호 4의 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 또는 59개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하거나, 이로 이루어진 서열을 갖는 miRNA이다.
본 발명의 일 실시형태에서, GM3 합성효소 억제제는 서열번호 4의 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드, 예컨대, 서열번호 4의 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 또는 59개의 인접 뉴클레오타이드 및 3' 및/또는 5'의 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 추가의 뉴클레오타이드를 포함하거나, 이로 이루어진 서열을 갖는 miRNA이다.
일 실시형태에서, GM3 합성효소 억제제는 서열번호 4의 기능 유지 서열이고, 상기 기능 유지 서열은 서열번호 4와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 약 95% 초과, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖고, 서열번호 4와 같은 GM3 합성효소 발현의 억제능을 유지하는 9 내지 70, 12 내지 60, 또는 15 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함하거나, 이로 이루어진다.
일 실시형태에서, 서열번호 4의 기능 유지 서열은 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 또는 70개의 뉴클레오타이드를 포함하거나, 이로 이루어진다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 서열번호 4의 기능 유지 서열은 C-말단 및 N-말단의 다른 핵산 사이에 서열번호 4를 포함하는 서열일 수 있다. 상기 기능 유지 서열은 또한 서열번호 4의 단편일 수 있다.
GM3 합성효소 억제제의 다른 예는 제한 없이, 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌 [Hatanaka et al., Heterocycles 43:531-534 (1996)]에 기재되어 있는 바와 같은 시티딘 모노포스포-N-아세틸뉴라민산 (CMP-NANA)의 탄소-연결 유사체를 포함한다.
GM3 합성효소의 발현 또는 활성의 다른 억제제 또는 이러한 억제제의 생성 방법은 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함되는 특허 출원 US20090082303, WO2005108600, WO2011133918 또는 미국 특허 6,280,989에 기재되어 있고, 제한 없이, GM3 합성효소 전사를 차단하는 간섭 RNA를 포함하며, 다음 서열을 갖는다: GGGUUAUUCUGAACAUGUUTT (서열번호 7), GAAGACCCAGCTTGTTAATGTGTGCTGT CCATTAACAAGCTGGGTCTTCTTTTT (서열번호 8), GCCAATGATTTGTTCGTTAGTGT GCTGTCCTAACGAACAAATCATTGGCTTTTT (서열번호 9), ATCACTTCTCAGTTTCACAT (서열번호 10), GCTTTGAGCTCGGGTGTACC (서열번호 11), GGCCTTCTCATCTTGCTTTG (서열번호 12), TCTTTTAATAACAAGCTGGG (서열번호 13), GGATGTCTTTTAATAACAAG (서열번호 14), AACACAAGCAATGTACATTT (서열번호 15), TCCACACTCCAAACACAAGC (서열번호 16), TTACATGGTCAGGGTCCACA (서열번호 17), TCTGAGCTCTCTTTACATGG (서열번호 18), AAGACTTGCTGAGCATATTT (서열번호 19), ACATTCCTTCTGCAAGACTT (서열번호 20), GGCAAACTTGGGACGACATT (서열번호 21), TCTGCACAAAAGGGAGTAAG (서열번호 22), TTACTGGAGAACTTCCGGAA (서열번호 23), GGACTTTACTGGAGAACTTC (서열번호 24), AGTATTCCTCCGCTTCCAAT (서열번호 25), AATCCGTGCAGTATTCCTCC (서열번호 26), ACTGTTTAACCTTATCACAA (서열번호 27), TATCCCTCAACTGGTGCACT (서열번호 28), GTAGTTTTATTTCCAACATG (서열번호 29), AGTCATCCTTATAGTAGTTT (서열번호 30), TGAAATCAACACTCTTAAAT (서열번호 31), TTGAAGCCAGTTGAAATCAA (서열번호 32), TTTACCATTGCTTGAAGCCA (서열번호 33), CCCAGAATGGCAGGGTTTCC (서열번호 34), ACCTGCTTCCAAAAGAAGAG (서열번호 35), CTGCCACCTGCTTCCAAAAG (서열번호 36), TTTTTCTGCCACCTGCTTCC (서열번호 37), TTTGGCTGCAGTGGGATTTT (서열번호 38), TGGATTCAAAATCCTGAAAT (서열번호 39), TCTGAGTACTGAAGGATGTC (서열번호 40), GAGGCTCTGAGTACTGAAGG (서열번호 41), TGACTGAGGCTCTGAGTACT (서열번호 42), ATCTCGGCCCCAGAACCTTG (서열번호 43), TGCATGGTCTGAAAGTTCAT (서열번호 44), ACCAGCTTTAAGAGGAACTT (서열번호 45), TTTCACCACTCCCTCTTTGA (서열번호 46), TTTCTGTGTT CAAAATTCAC (서열번호 47), AGAGTTGCATTTTCAACTGA (서열번호 48), CTGTCAAAAACAGCTCTCAG (서열번호 49), TATCTGCAGG ATGGAGAAAT (서열번호 50), ACATGAGCTGCACTTCAAAG (서열번호　51), CCAATTCAATTCTTAAGTTT (서열번호 52), GTTACATACAATTCTCTTTG (서열번호 53), GCAGAAGTTTTACAAATTAA (서열번호 54), CAAAAGAGTGACCTCCCCTC (서열번호 55), CACCATCAAAAGAGTGACCT (서열번호 56), AATGAGGTTCAGGGCCACCA (서열번호 57), TCACACCAAGCAGCGCAGCA (서열번호 58), GGATCCTCCGTGGGTCACAC (서열번호 59), ATCCTGGGAGTGGATCCTCC (서열번호 60), GCTACGGAGCACGTCATCCT (서열번호 61), GCAGACCCAGTATCAGCAGC (서열번호 62), GCCGCTGCATCGCAGACCCA (서열번호 63), CCCTGGTTGGTTCTCGAGTC (서열번호 64), CCTCCAGGACAGCTTCCCTG (서열번호 65), TATGTCCCTCTCCGACCAGG (서열번호 66), TCACCTCAGACAGACACTGG (서열번호 67), AGGGTGTACTCTCCCATGAC (서열번호 68), GTGTTTCCCAAAACATTATT (서열번호 69), TTTATAATACTGGGAAGATT (서열번호 70), GGTATACACCGCCAGGTAGG (서열번호 71), ATCCATATAACAGGCACATG (서열번호 72), CTTCCTATCTCACCTGTTTC (서열번호 73), ACAGCAGGAAATTTGTTGGT (서열번호 74), GGTAGATGACTGAATCATGG (서열번호 75), GTGACATGGTAGATGGACAC (서열번호 76), GCTGCAGTAATGAAGGCGGG (서열번호 77), CGGTGTAGGTCTGCAGAGTC (서열번호 78), CAGTAGTCACCTTCTGACTG (서열번호 79), GCACTGAGTTCTAGAGGAGA (서열번호 80), ACCAAGAGCAGTGCACTGAG (서열번호 81), TGCCACTTACTGTAGCCAGC (서열번호 82), ACTGTTTAACCTATTTAAAT (서열번호 83), CACTTGGCATTGCTGTTTCT (서열번호 84), CCTTCAGGAGCTCTAAGATA (서열번호 85), AGCTCTCTTCTGACTGTGAC (서열번호 86), GCACTGAGTTCTTATCACAA (서열번호 87).
본 발명의 또 다른 목적은 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 필수적으로 이루어진 운동 뉴런 질병의 치료를 위한 (또는 치료에 사용하기 위한) 약제학적 조성물이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 명세서의 상기에 기재된 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 필수적으로 이루어진 운동 뉴런 질병의 치료를 위한 (또는 치료에 사용하기 위한) 약제이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 조성물, 약제학적 조성물 또는 약제와 관련하여, 용어 "필수적으로 이루어진"은 본 발명의 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제가 상기 조성물, 약제학적 조성물 또는 약제 내의 생물학적 활성을 갖는 단지 하나의 치료제 또는 제제인 것을 의미한다.
약제학적으로 허용 가능한 부형제의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 물, 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액 및 에탄올, 글루코스, 수크로스, 덱스트란, 만노스, 만니톨, 소르비톨, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 인산염, 아세트산염, 젤라틴, 콜라겐, 카보폴 (Carbopol)®, 식물성 오일 등의 용액을 포함한다. 예를 들어 BHA, BHT, 시트르산, 아스코르브산, 테트라사이클린 등과 같은 적합한 보존제, 안정화제, 항산화제, 항균제 및 완충제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용 가능한 부형제의 다른 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 이온 교환기, 알루미나, 스테아르산알루미늄, 레시틴, 혈청 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민, 완충 물질, 예를 들어 인산염, 글리신, 소르브산, 소르브산칼륨, 식물성 포화 지방산의 부분적 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대, 프로타민 황산염, 인산수소이나트륨, 인산 수소 칼륨, 염화나트륨, 아연염, 콜로이드성 실리카, 3규산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스계 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지를 포함한다.
추가로, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는, 예를 들어, 계면활성제 (예를 들어, 하이드록시프로필셀룰로스)와 같은 일부 부형제; 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜, 등), 이들의 적절한 혼합물 및 예를 들어, 땅콩유 및 참깨유와 같은 식물성 오일을 포함하는 예를 들어, 용매 및 분산 매질과 같은 적합한 담체; 예를 들어 당 또는 염화나트륨과 같은 등장화제; 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제; 예를 들어 모노스테아르산알루미늄 및 젤라틴과 같은 흡착 지연제; 예를 들어, 염화벤즈알코늄, 염화벤즈에토늄, 클로로부탄올, 티메로살 등과 같은 보존제; 예를 들어, 붕산, 중탄산나트륨 및 칼륨, 붕산나트륨 및 칼륨, 탄산나트륨 및 칼륨, 아세트산나트륨, 이인산나트륨 등과 같은 완충제; 예를 들어, 덱스트로스, 염화칼륨, 프로필렌 글리콜, 염화나트륨과 같은 강장제; 예를 들어 중아황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 티오 황산나트륨, 티오우레아 등과 같은 항산화제 및 안정화제; 예를 들어, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 282 및 티록사폴과 같은 비이온성 습윤제 또는 정화제; 예를 들어 덱스트란 40, 덱스트란 70, 젤라틴, 글리세린, 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록스메틸프로필셀룰로스, 라놀린, 메틸셀룰로스, 광유, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, 카복시메틸셀룰로스와 같은 점도 개질제; 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 운동 뉴런 질병의 치료를 위한 방법이며, 상기 방법은 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제, 또는 본 발명의 약제학적 조성물 또는 약제가 필요한 대상체에 이를 투여하는 단계를 포함한다 (또는 이러한 단계로 이루어지거나, 이로 필수적으로 이루어짐). 일 실시형태에서, 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제의 치료 유효량이 대상체에 투여된다.
본 발명의 또 다른 목적은 강글리오사이드 응집체 또는 강글리오사이드 축적을 저하시킬 필요가 있는 대상체에서 이를 위한 방법이며, 상기 방법은 치료 유효량의 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제, 또는 본 발명의 약제학적 조성물 또는 약제의 치료 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 필수적으로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 목적은 대상체에서 강글리오사이드 합성을 저하시키기 위한 방법이며, 상기 방법은 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제, 또는 본 발명의 약제학적 조성물 또는 약제가 필요한 대상체에 이를 투여하는 단계를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 필수적으로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 목적은 대상체에서 뉴런의 사멸을 저하시키기 위한 방법이며, 상기 방법은 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제, 또는 본 발명의 약제학적 조성물 또는 약제가 필요한 대상체에 이를 투여하는 단계를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 필수적으로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 목적은 대상체에서 자가용해소체 축적을 저하시키기 위한 방법이며, 상기 방법은 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제, 또는 본 발명의 약제학적 조성물 또는 약제가 필요한 대상체에 이를 투여하는 단계를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 필수적으로 이루어진다.
운동 뉴런 질병의 예는 제한 없이, 유전성 강직성 대마비 (HSP), 유전성 강직성 대부전마비, 가족성 강직성 대마비, 프렌치 세틀먼트병, 또는 스트럼펠-로라인병, 영아 발병 상행성 유전성 강직성 마비, MASA 증후군, 또한 이른바 CRASH 증후군 및 가레이스 메이슨 증후군, 운동 신경병증 발현 백내장, 짧은 신장 및 골격 이상, MAST 증후군, 알란-헌던-더들리 증후군, 트로이어 증후군, 리슨 증후군, 강직성 운동실조 2형, SPOAN 증후군, 말초 신경병증, 체린 증후군을 포함한다.
일 실시형태에서, 운동 뉴런 질병은 유전성 강직성 대마비 (HSP), 유전성 강직성 대부전마비, 가족성 강직성 대마비, 프렌치 세틀먼트병, 또는 스트럼펠-로라인병, 영아 발병 상행성 유전성 강직성 마비, MASA 증후군, 또한 이른바 CRASH 증후군 및 가레이스 메이슨 증후군, 운동 신경병증 발현 백내장, 짧은 신장 및 골격 이상, MAST 증후군, 알란-헌던-더들리 증후군, 트로이어 증후군, 리슨 증후군, 강직성 운동실조 (특히, 예를 들어, 강직성 운동실조 2형과 같은 유전성 강직성 운동실조), SPOAN 증후군, 유전성 운동 감각 신경병증 (HMSN), 말초 신경병증 (특히 말초 신경병증 발현 HSP) 및 체린 증후군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 운동 뉴런 질병은 ("강직성 대마비"의 경우) SPG 유전자의 돌연변이에 의해 야기된다. 일 실시형태에서, 운동 뉴런 질병은 SPG11, SPG4, SPG7, SPG15, SPG48, SPG8 및/또는 SPG31 유전자의 돌연변이에 의해 야기된다. 일 실시형태에서, 운동 뉴런 질병은 SPG11 및/또는 SPG4 및/또는 SPG7 유전자의 돌연변이에 의해 야기된다. 일 실시형태에서, 운동 뉴런 질병은 SPG11 유전자의 돌연변이에 의해 야기된다. 일 실시형태에서, 운동 뉴런 질병은 SPG4 유전자의 돌연변이에 의해 야기된다. 일 실시형태에서, 운동 뉴런 질병은 SPG7 유전자의 돌연변이에 의해 야기된다. 일 실시형태에서, 운동 뉴런 질병은 SPG26 및/또는 SPG46 유전자의 돌연변이로부터 야기되지 않는다. 일 실시형태에서, 운동 뉴런 질병은 SPG26 유전자의 돌연변이로부터 야기되지 않는다. 일 실시형태에서, 운동 뉴런 질병은 SPG46 유전자의 돌연변이로부터 야기되지 않는다.
일 실시형태에서, 운동 뉴런 질병은 HSP이다. 일 실시형태에서, 운동 뉴런 질병은 SPG26 및/또는 SPG46에 존재하지 않는다. 일 실시형태에서, 운동 뉴런 질병은 SPG11, SPG4, SPG7, SPG15, SPG48, SPG8 및 SPG31로부터 선택되는 HSP이다. 일 실시형태에서, 운동 뉴런 질병은 SPG11, SPG15, SPG48, SPG4 또는 SPG7이다. 일 실시형태에서, 운동 뉴런 질병은 SPG11, SPG15 또는 SPG48; 바람직하게는 SPG11이다. 일 실시형태에서, 운동 뉴런 질병은 SPG4이다. 일 실시형태에서, 운동 뉴런 질병은 SPG7이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 운동 뉴런 질병의 치유를 위한 것이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 예를 들어, 운동 뉴런 질병의 적어도 하나의 운동 또는 인지 증상과 같은 운동 뉴런 질병의 적어도 하나의 증상을 완화하기 위한 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 SPG11의 적어도 하나의 증상의 완화를 위한 것이다. SPG11의 증상의 예는, 다음에 제한되는 것은 아니나, 뇌 촬영시, 뇌실 주위 백색 물질의 이상 및/또는 뇌들보의 무발생증; 말초 유수신경섬유의 수의 저하; 외측 피질척수로의 퇴행; 뇌실확장증; 황반변성; 사시; 잠복기가 증가하고, 진폭이 감소된 시각 유발 전위; 바빈스키 징후 (Babinski sign); 무릎 클로누스 (knee clonus); 발목 클로누스; 비만; 뇌들보의 무형성증/형성저하증; 대뇌 피질 위축; 망막 퇴화 (체링 증후군); 추체외로 징후 예컨대, 파킨슨증; 발작; 신경돌기, 운동, 또는 운동감각 말초 신경병증; 안구의 불수의 운동 (안구진탕); 경련성 원활추종운동; 보행 장애; 구음장애; 운동실조; 경련성 원활추종운동; 운동 폴리신경병증; 무지구근 위축; 첨족 보행; 강직 (진행성 근육 긴장); 대마비 (하지의 최종 마비); 사지 무감각, 아린감, 또는 통증; 근육 운동에 사용되는 신경의 교란; 하지 과반사; 감소된 방광 제어; 근손실; 안구의 불수의 운동; 척추 만곡 이상 (척추측만증); 망치 발가락 (요족); 삼키기 곤란 (연하곤란); 음성 어려움 (구음장애); 의식저하; 지적 장애; 기억, 의사소통 또는 학습 장애를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 SPG11의 적어도 하나의 인지 증상의 완화를 위한 것이다. SPG11의 인지 증상의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나 의식저하; 지적 장애; 기억, 의사소통 또는 학습 장애를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 SPG11의 적어도 하나의 운동 증상의 완화를 위한 것이다. SPG11의 운동 증상의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나 경련성 원활추종운동; 운동 폴리신경병증; 무지구근 위축; 첨족 보행; 신경돌기, 운동, 또는 운동감각 말초 신경병증; 안구의 불수의 운동 (안구진탕); 경련성 원활추종운동; 보행 장애; 구음장애; 운동실조 (근육 제어 결핍); 강직 (진행성 근육 긴장); 대마비(하지의 최종 마비); 사지 무감각, 아린감, 또는 통증; 근육 운동에 사용되는 신경의 교란; 하지 과반사 반응; 근손실; 안구의 불수의 운동; 척추 만곡 이상 (척추측만증); 삼키기 곤란 (연하곤란); 및 음성 어려움 (구음장애)을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 SPG4의 적어도 하나의 증상의 완화를 위한 것이다. SPG4의 증상의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나 유전적 예상; 요통; 발작; 외측 피질척수로의 퇴행; 경증 충부 위축 및/또는 얇은 뇌들보; 바빈스키 징후; 발목의 진동 감지 능력 감소; 과반사 반응 (반사항진); 망치 발가락 (요족); 발목 경련; 운동실조 (근육 제어 결핍); 하지 근력 약화; 강직 (진행성 근육 긴장); 안구의 불수의 운동 (안구진탕); 요도계방광괄약근기능장애; 대마비; 공격적인 행동; 불안; 무감각증; 치매; 우울증; 탈억제; 지적 장애; 기억, 의사소통 또는 학습 장애; 및 낮과다졸림증을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 SPG4의 적어도 하나의 증상의 완화를 위한 것이다. SPG4의 인지 증상의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나 공격적인 행동; 불안; 무감각증; 치매; 우울증; 탈억제; 지적 장애; 기억, 의사소통 또는 학습 장애; 및 낮과다졸림증을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 SPG4의 적어도 하나의 운동 증상의 완화를 위한 것이다. SPG4의 운동 증상의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나 발목 경련; 운동실조 (근육 제어 결핍); 하지 근력 약화; 강직 (진행성 근육 긴장); 안구의 불수의 운동 (안구진탕); 요도계방광괄약근기능장애; 및 대마비를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 SPG7의 적어도 하나의 증상의 완화를 위한 것이다. SPG7의 증상의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나 외측 피질척수로의 퇴행; 대뇌 피질 위축; 소뇌 위축; 바빈스키 징후; 반사항진; 하지 진동 감각 손상; 시신경 위축; 망치 발가락 (요족); 척추 만곡 이상 (척추측만증); 구음장애; 연하곤란; 보행 운동실조; 하지 근력 약화; 하지 강직; 안구진탕; 강직성 보행; 강직성 대마비; 요도계방광괄약근기능장애; 주의력 결핍; 기억 장애; 및 언어 학습을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 SPG7의 적어도 하나의 인지 증상의 완화를 위한 것이다. SPG7의 인지 증상의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나 주의력 결핍; 기억 장애; 및 언어 학습을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 SPG7의 적어도 하나의 운동 증상의 완화를 위한 것이다. SPG7의 운동 증상의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나 구음장애; 연하곤란; 보행 운동실조; 하지 근력 약화; 하지 강직; 안구진탕; 강직성 보행; 강직성 대마비; 및 요도계방광괄약근기능장애를 포함한다.
일 실시형태에서, 대상체는 운동 뉴런 질병이 발병한 상태이고, 바람직하게는 상기 질병으로 진단된 상태이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 대상체는 운동 뉴런 질병, 바람직하게는 HSP의 발병 위험이 있다.
위험 인자의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 유전적 인자, 강직성 대마비 유전자 L1 세포 부착 분자 (L1CAM)/NCAM (염색체 Xq28), PLP1/MPLP, ATL1/아틀라스틴 (ATLASTIN)-1, SPAST/스파스틴 (SPASTIN), CYP7B1/OAH1, NIPA1/NIPA1, PGN/파라플레긴 (PARAPLEGIN), KIAA0196/스트룸펠린 (STRUMPELLIN), KIF5A/키네신 (KINESIN) HC5A, KIAA1840/스파탁신, RTN2/레티굴론 (RETICULON) 2, HSPD1/HSP60, ZFYVE26/스파스티진 (SPASTIZIN), BSCL2/세이핀 (SEIPIN), ERLIN2/SPFH2, SPG20/스파르틴 (SPARTIN), ACP33/마스파르딘 (MASPARDIN), SLC16A2/MCT8, B4GALNT1/B4GALNT1, DDHD1/PAPLA1; KIF1A/키네신3, REEP1/REEP1, ZFYVE27/프로트루딘 (PROTRUDIN), FA2H/FA2H, NTE/PNPLA6, SLC33A1/ACoA 담체, C19orf12/C19ORF12, GJC2/콘넥신 (CONNEXIN) 47, GBA2/GBA2, AP4B1/AP4B1, KIAA0415/AP5Z1, TECPR2/KIAA0329, AP4M1/AP4M1, AP4E1/AP4E1, AP4S1/AP4S1, VPS37A/VPS37A, DDHD2/DDHD2, C12orf65/C12ORF65, CYP2U1/CYP2U1, TFG/TFG, KIF1C/키네신 계열 구성원 1C, USP8/유비퀴틴-특이적 프로테아제 8, WDR48/WD 반복 도메인 48, ARL6IP1/ADP-리보실화 인자형 6 상호작용 단백질 1, ERLIN1/ER 지질 RAFT 결합 1, AMPD2/아데노신 1인산염 탈아미노효소2, ENTPD1/엑토뉴클레오사이드 3인산염 2인산가수분해효소, NT5C2/5'-뉴클레오타이드 분해 효소, 시토졸 II, ARSI/아릴술파타제 계열, 구성원 I, PGAP1/단백질 1에의 GPI 부착 후, FLRT1/피브로넥틴 류신 다함유 막관통 단백질 1, RAB3GAP2/단백질 하위단위 2 활성화 RAB3 GTPASE (무촉매), MARS/메티오닐-TRNA 합성효소, ZFR/아연 핑거 RNA-결합 단백질, REEP2/수용체 발현-강화 단백질 2, GAD1/글루탐산염 탈탄산효소 1, T-복합체 펩타이드-1을 포함하는 시토졸 샤페로닌 (CHAPERONIN)의 CCT5/ε 하위단위, OPA3/시신경 위축 3 단백질, BICD2/이미성 D 동족체 2, MAG/미엘린 결합 당단백질, LYST/리소좀 수송 조절인자, MT-ATP6/ATP 합성효소 6, AP5B1/DKFZp761E198, AP5M1/C14orf108, AP5S1/C20orf29, 염색체 15q 상의 돌연변이; 10q23.3-24.2, 14q24.1, 8, 7p22.1; 16q; 2q33.2; 3q27-q28; Xq11.2; 9q; 1q24-q32; 13q14; 6q23-q24.1; 10q22.1-q24.1; 1p31.1-p21.1; 14q12-q21; Xq24-q25; 12q23-q24; 8p21.1-q13.3; 4p16-p15; 11p14.1-p11.2; 10q24.3-q25.1; 11q13; Xq22를 포함한다.
일 실시형태에서, 위험 인자는 강직성 대마비 유전자 L1 세포 부착 분자 (L1CAM)/NCAM (염색체 Xq28), PLP1/MPLP, ATL1/아틀라스틴-1, SPAST/스파스틴, CYP7B1/OAH1, NIPA1/NIPA1, PGN/파라플레긴, KIAA0196/스트룸펠린, KIF5A/키네신 HC5A, KIAA1840/스파탁신, RTN2/레티굴론 2, HSPD1/HSP60, ZFYVE26/스파스티진, BSCL2/세이핀, ERLIN2/SPFH2, SPG20/스파르틴, ACP33/마스파르딘, SLC16A2/MCT8, DDHD1/PAPLA1; KIF1A/키네신3, REEP1/REEP1, ZFYVE27/프로트루딘, FA2H/FA2H, NTE/PNPLA6, SLC33A1/ACoA 담체, C19orf12/C19ORF12, GJC2/콘넥신 47, AP4B1/AP4B1, KIAA0415/AP5Z1, TECPR2/KIAA0329, AP4M1/AP4M1, AP4E1/AP4E1, AP4S1/AP4S1, VPS37A/VPS37A, DDHD2/DDHD2, C12orf65/C12ORF65, CYP2U1/CYP2U1, TFG/TFG, KIF1C/키네신 계열 구성원 1C, USP8/유비퀴틴-특이적 프로테아제 8, WDR48/WD 반복 도메인 48, ARL6IP1/ADP-리보실화 인자형 6 상호작용 단백질 1, ERLIN1/ER 지질 RAFT 결합 1, AMPD2/아데노신 1인산염 탈아미노효소2, ENTPD1/엑토뉴클레오사이드 3인산염 2인산가수분해효소, NT5C2/5'-뉴클레오타이드 분해 효소, 시토졸 II, ARSI/아릴술파타제 계열, 구성원 I, PGAP1/단백질 1에의 GPI 부착 후, FLRT1/피브로넥틴 류신 다함유 막관통 단백질 1, RAB3GAP2/단백질 하위단위 2 활성화 RAB3 GTPASE (무촉매), MARS/메티오닐-TRNA 합성효소, ZFR/아연 핑거 RNA-결합 단백질, REEP2/수용체 발현-강화 단백질 2, GAD1/글루탐산염 탈탄산효소 1, T-복합체 펩타이드-1을 포함하는 시토졸 샤페로닌의 CCT5/ε 하위단위, OPA3/시신경 위축 3 단백질, BICD2/이미성 D 동족체 2, MAG/미엘린 결합 당단백질, LYST/리소좀 수송 조절인자, MT-ATP6/ATP 합성효소 6, AP5B1/DKFZp761E198, AP5M1/C14orf108, AP5S1/C20orf29, 염색체 15q 상의 돌연변이; 10q23.3-24.2, 14q24.1, 8, 7p22.1; 16q; 2q33.2; 3q27-q28; Xq11.2; 9q; 1q24-q32; 13q14; 6q23-q24.1; 10q22.1-q24.1; 1p31.1-p21.1; 14q12-q21; Xq24-q25; 12q23-q24; 8p21.1-q13.3; 4p16-p15; 11p14.1-p11.2; 10q24.3-q25.1; 11q13; Xq22로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 운동 뉴런 질병은 SPG11이다. SPG11 병리학적 대립인자 변이체의 예는 제한 없이, c.118C>T; c.267G>A; c.268G>T; c.349G>T; c.359delT; c.398delG; c.408_428del21; c.442+1G>C; c.529_533delATATT; c.642delT; c.654_655delinsG; c.704_705delAT; c.733_734delAT; c.869+1G>A; c.1203delA; c.1235C>G; c.1282A>T; c.1457-2A>G; c.1471_1472delCT; c.1549_1550delCT; c.1550_1551delTT; c.1668delT; c.1679C>G; c.1697_1712del16insTACTCCCAT; c.1735+3_+6delAAGT; c.1837_18388insA; c.1845_1846delGT; c.1951C>T; c.2146C>T; c.2163_2164insT; c.2198T>G; c.2316+1G>A; c.2355_2356del2; c.2444G>T; c.2444+1G>C; c.2472insT; c.2608A>G; c.2697G>A; c.2716delC; c.2833A>G; c.2834+1G>T; c.2842_2843insG; c.2849_2850insT; c.3075_3076insA; c.3145_3146insCA; c.3291+1G>T; c.3602_3603delAT; c.3664_3665insT; c.3719_3720델타; c.3741_3742insA; c.4046T>A; c.4307_4308delAA; c.4461_4462delGT; c.4668T>A; c.4846C>T; c.5255delT; c.5399_5407delAGATinsTGGAGGAG; c.5410_5411delTG; c.5470C>T; c.5532_5533delCA; c.5623C>T; c.5703delT; c.5769delT; c.5798delC; c.5867-3237_6478-451del8323; c.5870C>G; c.5898+5493_6509-491del; c.5970C>G; c.5974C>T; c.5977C>T; c.5986_5987insT; c.5985delCTGT; c.5987_5990dupCTCT; c.5989_5992delCTGT; c.5992insT; c.6091C>T; c.6100C>T; c.6157G>A; c.6206-1G>C; c.6451delG; c.6477+4 A>G; c.6737_6740delTTGA; c.6739_6742delGAGT; c.6754+4insTG; g.96677_99386del2710; r.6755_7151del397; c.6790_6791insC; c.6832_6833delAG; c.6856C>T; c.6898_6899delCT; c.7000-3_-2insGGA; c.7023C>A; c.7029_7030insT; c.7088_7089insATTA; c.7101_7102insT; c.7151+4_7151+7delAGTA; c.7152-1G>C; c.7156_7157insAAAC를 포함한다.
일 실시형태에서, 운동 뉴런 질병은 SPG4이다. SPG4 병리학적 대립인자 변이체의 예는 제한 없이, c.334G>A, c.1157A>G, 1340-1344del, 1447A>G, 1617-1618+2del, 1853+1G>T, 1210C>G; 1233G>A; 1267T>G; 1283T>G; 1288A>G; 1401C>G; 1468G>A; 1504G>T; 1620C>T; 1788G>A; 1792C>T; 702C>T; 873A>T; 907C>A; 932C>G; 1416C>T; 1416C>T; 1809C>T; 578-579insA; 852del11; 882-883insA; 906delT; 1299delG; 1340del5; 1340del5; 1340del5; 1520delT; 1574delGG; 1634del22; 1684-1685insTT; 1685del4; 808-2a>g; 1129+2t>g; 1223+1g>t; 1299+1g>a; 1538+5g>a; 1538+3del4; 1661+1g>t; 1662-2a>t; 1812+1g>a; 1813-2a>g; 1813-2a>g; 1813-2a>g; 1853+1g>a를 포함한다.
일 실시형태에서, 운동 뉴런 질병은 SPG7이다. SPG7 병리학적 대립인자 변이체의 예는 제한 없이, 1A>T; 28G>A; 233T>A; 244-246delACA; 698T>C; 784del2; 850_-851 delTTinsC; 1045G>A; 1047insC; 1057_-1085del29; 1447-1778 del 331; 1450-1458del 9; 1519 C>T; 155211 G>T; 1616delC; 1636G>A; 1749G>C; 1715C>T; 1729G>A; 1742-1744del3; 1904C>T; 1948G>C; 2026T>C; 2075G>C; 2191G>A; 2216dupA; 2228 Ins A를 포함한다.
일 실시형태에서, 치료 대상체는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90세 초과이다.
일 실시형태에서, 본 명세서의 상기에 기재된 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제 또는 본 발명의 약제학적 조성물 또는 약제는 당업자에 의해 결정된 투여량에서 투여되고, 각각의 대상체에 개별적으로 적용되어야 한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 본 명세서의 상기에 기재된 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제, 본 발명의 약제학적 조성물, 약제는 치료 유효량으로 투여되어야 한다.
본 발명의 화합물, 본 발명의 조성물, 약제학적 조성물 및 약제의 총 1일 용량은 적절한 의학적 판단 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 것이라는 것이 이해될 것이다. 임의의 특정 환자에 특이적인 치료 유효량 수준은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 사용된 특정 화합물의 활성; 사용된 특정 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식단; 투여 시간, 투여 경로 및 사용된 특정 화합물의 배출 속도; 치료 기간; 사용된 특정 조성물과 함께 또는 동시에 사용되는 약물; 및 의학 분야에서 잘 알려진 유사 인자를 포함하는 다양한 인자에 따를 것이다. 예를 들어, 요구되는 치료 효과를 달성하기 위해, 요구되는 것보다 더 낮은 수준으로 화합물의 투여량을 개시하여, 요구되는 효과가 달성될 때까지 점차적으로 투여량을 증가시키는 것이 당 업계의 기술 범위 내에서 적절한 것이다. 그러나, 산물의 1일 투여량은 약 1 내지 약 10000 mg/성인/일, 바람직하게는 2 내지 약 2000, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 500 mg/성인/일의 광범위한 범위에서 다양할 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물은 치료 환자에게의 투여량의 증상 고려 조절을 위해, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 250, 500, 1000 및 2,000　mg의 활성 구성성분을 포함한다. 약제는 통상적으로 약 1 내지 약 10000　mg의 활성 원료, 바람직하게는 약 2 내지 약 2000, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 500 mg의 활성 구성성분을 포함할 수 있다. 약제의 유효량은 일반적으로 약 0.01 mg/kg 내지 약 100 mg/kg의 체중/일, 바람직하게는 약 0.02 mg/kg 내지 20 mg/kg의 체중/일, 더욱 바람직하게는 약 0.05 mg/kg 내지 5 mg/kg의 체중/일의 투여량 수준에서 공급될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서의 상기에 기재된 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제, 본 발명의 약제학적 조성물 또는 약제는 전신 또는 국소 투여되어야 한다.
일 실시형태에서, 본 명세서의 상기에 기재된 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제, 본 발명의 약제학적 조성물 또는 약제는 경구로, 주입, 국소, 비강에 의해, 흡입, 협측, 직장, 경기관지에 의해, 내시경, 경점막에 의해, 피하 투여, 또는 척추 주위 투여에 의해 투여되어야 한다.
일 실시형태에서, 본 명세서의 상기에 기재된 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제, 본 발명의 약제학적 조성물, 약제는 주입에 의해 투여되어야 하며, 바람직하게는 전신 주입되어야 한다. 전신 주입에 적합한 제형의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 액체 용액 또는 현탁액, 주입 전 액상 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태를 포함한다. 전신 주입의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 정맥내, 피하, 근육내, 경피, 및 복강내 주입, 또는 관류를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 주입시, 본 발명의 조성물, 약제학적 조성물 또는 약제는 멸균 상태이다. 멸균된 약제학적 조성물의 획득 방법은 다음에 제한되는 것은 아니나, GMP 합성 (GMP는 "우수 약제 제조 관리 기준 (Good manufacturing practice)"를 의미함)을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서의 상기에 기재된 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제, 본 발명의 약제학적 조성물, 약제는 경구 투여되어야 한다. 경구 투여에 적합한 제형의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 고체 형태, 액체 형태 및 겔을 포함한다. 경구 투여에 적합한 고체 형태의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 알약, 정제, 캡슐, 연질 젤라틴 캡슐, 경질 젤라틴 캡슐, 당의정, 압축 정제, 카세트, 웨이퍼 (wafer), 당-코팅 알약, 당 코팅 정제 또는 분산성/또는 붕해성 정제, 분말, 경구 투여 전의 액상 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태 및 발포성 정제를 포함한다. 경구 투여에 적합한 액체 형태의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 용액, 현탁액, 음료용 용액, 엘릭서 (elixir), 밀봉된 약병, 물약, 관주, 시럽 및 술을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서의 상기에 기재된 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제, 본 발명의 약제학적 조성물, 약제는 국소 투여되어야 한다. 국소 투여에 적합한 제형의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 스틱, 왁스, 크림, 로션, 연고, 밤 (balms), 겔, 마스크, 리브온 세정제 (leave-on wash) 및/또는 등을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서의 상기에 기재된 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제, 본 발명의 약제학적 조성물 또는 약제는 지속 방출 형태로 투여되어야 한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물, 약제학적 조성물 또는 약제는 제제의 방출을 제어하는 전달 시스템을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서의 상기에 기재된 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제, 본 발명의 약제학적 조성물 또는 약제는 국소 확산; 뇌척수액 (CSF)으로의 개선된 수송; 또는 CNS로의 직접 수송에 의해, 개선된 전달로 척추 주위 또는 비강내 투여되어야 한다
일 실시형태에서, 치료 유효량의 본 명세서의 상기에 기재된 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제, 본 발명의 약제학적 조성물 또는 약제의 치료 유효량은 적어도 1일 1회, 1일 2회, 적어도 1일 3회 또는 적어도 1일 4회 투여된다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서의 상기에 기재된 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제, 본 발명의 약제학적 조성물, 약제의 치료 유효량은 2일마다, 3일마다, 4일마다, 5일마다 또는 6일마다 투여된다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서의 상기에 기재된 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제, 본 발명의 약제학적 조성물, 약제의 치료 유효량은 1주 2회, 1주마다, 2주마다 또는 1개월에 1회 투여된다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서의 상기에 기재된 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제 또는 본 발명의 약제학적 조성물, 본 발명의 약제의 치료 유효량은 적어도 2; 3; 4; 5; 6개월의 기간 동안 또는 대상체의 남은 생애 동안 1개월마다 투여된다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서의 상기에 기재된 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제 또는 본 발명의 본 발명의 약제학적 조성물 또는 약제의 치료 유효량은 약 1 μg 내지 100 g, 1 mg 내지 1　g, 10 mg 내지 500 mg의 범위이다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서의 상기에 기재된 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제 또는 본 발명의 약제학적 조성물 또는 본 발명의 약제의 치료 유효량은 약 10 내지 100 mg, 바람직하게는 60 mg의 범위이다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서의 상기에 기재된 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제, 본 발명의 약제학적 조성물 또는 약제의 치료 유효량은 약 0.1 μg/kg 내지 1 g/kg의 체중, 0.1　mg/kg의 체중 내지 500 mg/kg, 10 mg/kg 내지 100 mg/kg의 체중의 범위이다.
[도면의 간단한 설명]
도 1은 spg11 녹아웃이 뉴런 손실 이전의 마우스에서 조기 운동 결핍을 일으키는 것을 보여주는 그래프 및 이미지의 세트이다. A Spg11 유전자의 유전자 구조 (상부), 벡터의 표적화 (중간) 및 네오마이신 내성 카세트의 절제 및 Cre-재조합효소의 작용시의 표적화된 좌위 (하부). 도입된 돌연변이는 인간에서 c.6091C>T (p.Arg2031*)에 해당하는 c.6052C>T (p.Arg2018*) 및 인간에서 c.6100 C>T (p.Arg2034*)에 해당하는 c.6061C>T (p.Gln2021*)이었다. B Spg11-/- 샘플에서 스파탁신의 부재 및 Spg15에 의해 인코딩되는 스파스티진의 훨씬 더 낮은 수준을 나타내는 뇌 단백질 추출물의 웨스턴 블로팅. 3개의 독립적인 실험의 대표 이미지. *: 비특이적 밴드. C, D 16개월령의 Spg11+/+ (C) 및 Spg11-/- (D) 마우스. 녹아웃 마우스는 비정상적인 자세 및 척추의 척추후만증을 나타내었다. E, F 일직선 통로에서 자유롭게 보행하는 Spg11+/+ (E) 및 Spg11-/- (F) 마우스의 단일 비디오 프레임. 발가락 끝 위치에서의 발/바닥 각도 (FBA)는 백색 선으로 표시되어 있다. G FBA 값은 자유로운 보행 중에 기록하였다. Spg11-/- 마우스에서 4개월령부터 FBA가 저하되었다 (n≥12 동물/유전자형/연령; 클러스컨-월리스 검정 (kruskal-wallis test); * p≤0.05 및 ***: p≤0.001). H, I. 트레드밀에서의 강제 보행 중 보행 각도 요약 (H) 및 기록된 값 (I). Spg11-/- 마우스에서 4개월령 후부터 보행 각도가 저하되었다 (n≥12 동물/유전자형/연령; 클러스컨-월리스 검정; *: p≤0.05 및 ***: p≤0.001). J Spg11-/- 마우스는 6주령부터 이형접합 및 대조군 마우보다 유의하게 더 짧은 기간 동안 가속된 로타로드에 머물러 있을 수 있었다 (n≥12 동물/유전자형/연령; 클러스컨-월리스 검정; **: p≤0.01 및 ***: p≤0.001). K, L 16개월령의 Spg11+/+ (K) 및 Spg11-/- (L) 마우스의 1차 운동 피질에서의 NeuN 및 GFAP 면역염색. 스케일 바: 200 μm. M, N 1차 운동 피질 층 I+II+III (M) 및 V+VI (N)에서 총 NeuN 양성 세포의 정량화. 면역염색은 8개월령 후부터 녹아웃 마우스에서 운동 피질의 층 I-VI로부터의 뉴런 수의 유의한 저하를 나타내었다 (n≥10 절편/동물 및 n≥5 동물/유전자형/연령; 클러스컨-월리스 검정; **: p≤0.01 및 ***: p≤0.001). O, P 1차 운동 피질 층 I+II+III (O) 및 V+VI (P)에서 총 GFAP 양성 세포의 정량화. 뉴런 손실은 현저한 별아교세포증을 동반하였다 (n≥10 절편/동물 및 n≥5 동물/유전자형/연령; 클러스컨-월리스 검정; ***:p≤0.001).
도 2는 Spg11-/- 마우스의 피질 운동 뉴런에서 Lamp1과 공동 위치화된 자가형광성 입자의 축적을 보여주는 이미지 세트이다. A 6주, 4개월, 8개월 및 16개월령의 Spg11+/+ 및 Spg11-/- 피질 운동 뉴런의 자가형광성 물질 (여기 488 nm, 방출 515 내지 530 nm). 녹아웃 마우스는 6주령 후부터 그의 피질 운동 뉴런에 자가형광성 침착물을 나타내었다. 16개월령에 이러한 자가형광성 물질은 대조군 마우스에도 존재하지만, 녹아웃 마우스보다 더 적은 양이다. 스케일 바: 10 μm. B 405 nm, 473 nm, 543 nm 및 635 nm에서 여기시, 8개월령의 Spg11-/- 피질 운동 뉴런의 화살표 표시된 자가형광성 물질. 스케일 바: 20 μm. C 6주령 및 8개월령의 동물의 Spg11+/+ 및 Spg11-/- 피질 운동 뉴런의 Lamp-1 (리소좀 마커) 면역염색 및 자가형광성 물질. 공초점 현미경 이미지는 Spg11-/- 뉴런에서 자가형광성 입자 주위에 Lamp-1-양성 염색이 분포함을 보여준다. 스케일 바: 10 μm.
도 3은 Spg11-/- 마우스의 피질 운동 뉴런에서의 리소좀 기능의 초기 변화 및 p62 입자의 후기 축적을 보여주는 그래프 및 이미지의 세트이다. A 6주, 8개월 및 16개월령의 Spg11+/+ 및 Spg11-/- 피질 운동 뉴런에서의 p62 면역염색 및 자가형광성. 공초점 현미경 이미지는 16개월령의 Spg11-/- 마우스의 피질 운동 뉴런에서만 p62 양성 염색과 자가형광성 입자가 공동 위치화되었음을 보여준다. 스케일 바: 10 μm. B 상이한 월령의 동물에서 채취한 Spg11+/+ 및 Spg11-/- 마우스 피질의 추출물에서 LC3I, LC3-II의 수준 및 튜불린 수준을 보여주는 웨스턴 블로팅. 튜불린에 대해 정규화된 LC3-II 밴드 강도의 정량화. 그래프는 평균 ± SEM 값을 보여준다. n=3 독립 샘플. C 상이한 월령의 동물에서 채취한 Spg11+/+ 및 Spg11-/- 마우스 피질의 추출물에서 카텝신 D (cathepsin D)의 전구체 (CstDp), 및 성숙한 형태의 프로테아제 (CstDm) 및 튜불린의 수준을 보여주는 웨스턴 블롯. 튜불린에 대해 정규화된 성숙 카텝신 D 밴드 강도의 정량화. 그래프는 평균 ± SEM 값을 보여준다. n=3 독립 샘플을 2회 로딩하였다. 클러스컨-월리스 검정, *: p≤0.05.
도 4는 스파탁신 손실이 리소좀 내의 분해되지 않은 물질의 축적을 촉진하는 것을 보여주는 그래프 및 이미지의 세트이다. A-F 2개월령의 Spg11+/+ (A 및 B) 또는 Spg11-/- (C-F) 마우스의 피질 뉴런의 전자 현미경 사진. B A로 표시된 구역 중 더 높은 배율. D 및 E: C 표시된 구역으로부터의 더 높은 배율의 리포푸신 (lipofuscin) 입자. D 및 E의 삽입물은 화살표 표시된 리포푸신형 구조에 존재하는 막 및 입상 구조를 나타낸다. F 리포푸신형 구조 주위에 분해되지 않은 물질을 포함하는 리소좀의 군집화를 보여주는 전자 현미경 사진. 별표는 지질 액적과 일치하는 저 밀도의 구조를 나타낸다. F의 삽입물은 리포푸신형 입자 주위의 막을 보여준다. 스케일 바: 5 μm (A 및 C); 500 nm (B, D-F). G 카텝신 D 면역 전자 현미경에 의해, 디아미노벤지딘 (DAB)이 리포푸신형 구조의 DAB 침전물 (화살표)의 존재를 보여주는 것으로 나타났다. 리소좀에서 DAB 침전물 (화살표)의 존재를 확인한다. 스케일 바: 500 nm. H 리포푸신의 축적 (화살표)을 나타내는 SPG11 환자 (질병 기간: 10년, 사망 연령: 32세)의 뇌에서 피질 뉴런의 전자 현미경 이미지. 상기 환자는 SPG11의 통상적인 임상 특징을 나타내며, 트랜스형의 엑손 13의 이형접합 돌연변이 c.2358_2359delinsTT (p.Glu786_Gly787delinsAspfs*) 및 엑손 28의 c.4868delT (p.Leu1623Tyrfs*17)를 보유한다. 스케일 바: 2μm. I-L 2개월령의 Spg11+/+ 또는 Spg11-/- 마우스의 피질 뉴런의 전자 현미경 사진에서 다양한 리소좀 매개변수의 정량화. 그래프는 평균 ± SEM을 보여준다. 각 유전자형에 대해 2개의 독립적인 동물에서 분석한 n> 40 세포. t-검정; *:p=0.041 및 ***:p≤0.0001.
도 5는 스파탁신 손실이 피질 뉴런에서 GM2 및 GM3의 축적을 촉진하는 것을 보여주는 그래프 및 이미지의 세트이다. A 6주령 및 8개월령의 동물의 Spg11+/+ 및 Spg11-/- 피질 운동 뉴런에서의 GM2 면역염색 및 자가형광성 물질. 6주령 및 8개월령의 동물에서 GM2 양성 염색과 자가형광성 입자의 공동 위치화를 보여주는 공초점 현미경 이미지. 스케일 바: 10 μm. B 뉴런 당 GM2 면역염색 강도의 평균 (좌측 패널) 및 분산 (우측 패널)의 정량화. 그래프는 평균 ± SEM 값을 보여준다. 5개의 독립적인 피질 절편에서 정량화된 n>10 뉴런. 클러스컨-월리스 검정; ***: p≤0.0001. C 6주령 및 8개월령의 동물의 Spg11+/+ 및 Spg11-/- 피질 운동 뉴런의 GM3 면역염색 및 자가형광성 물질. Spg11-/- 뉴런에서 8개월령에서 GM3 염색과 자가형광성 입자의 공동 위치화를 보여주는 공초점 현미경 이미지. 스케일 바: 10 μm. D 뉴런 당 GM3 면역염색 강도의 평균 (좌측 패널) 및 분산 (우측 패널)의 정량화. E-F 뉴런 당 GD2 (E) 및 GD3 (F) 면역염색 강도의 평균 (좌측 패널) 및 분산 (우측 패널)의 정량화. 그래프는 평균 ± SEM 값을 보여준다. 5개의 독립적인 피질 절편에서 정량화된 n> 10 뉴런. 클러스컨-월리스 검정; **: p≤0.01; ***: p≤0.0001.
도 6은 피질 뉴런에서의 GM2 및 GM3의 축적이 뉴런 사멸에 기여한다는 것을 보여주는 그래프이다. A Spg11+/+ 및 Spg11-/- 피질 뉴런의 1차 배양시 GM2 및 뉴런 마커 βIII-튜불린 면역염색. B Spg11+/+ 및 Spg11-/- 피질 뉴런의 1차 배양시 GM2 (좌측 패널) 및 GM3 (우측 패널) 면역염색의 형광 강도의 정량화. 그래프는 평균 ± SEM 값을 보여준다. 각 실험에서 정량화된 적어도 200개의 뉴런에 의한 n>11 독립 측정. t-검정; *: p = 0.03 (GM2) 및 p = 0.0099 (GM3). C GM3 합성효소를 하향 조절하기 위해, miRNA 및 GFP를 발현하는 벡터로 형질감염된 세포에서의 GM2 또는 GM3 면역염색 (화살표). D GM3 합성효소에 대한 2개의 상이한 miRNA 또는 대조군 miRNA를 발현하는 벡터로 형질감염된 뉴런에서 GM2 (좌측 패널) 또는 GM3 (우측 패널)의 형광 강도의 정량화. n>50 뉴런, 2개의 독립적인 실험. 일원 ANOVA; *: p = 0.041; ** p = 0.0028 및 ***: p≤0.001. E GM3 합성효소에 대한 2개의 상이한 miRNA 또는 대조군 miRNA를 발현하는 벡터로 형질감염된 Spg11+/+ 및 Spg11-/- 피질 뉴런의 1차 배양시 뉴런을 글루탐산염 (200 μM)으로 인큐베이션하고 30시간 후의 뉴런 사멸의 정량화. 각 실험에서 정량화된 적어도 100개의 뉴런에 의한 n>5 실험. Kruskal Wallis test; **:p = 0.0058; *:p = 0.0123. F 미글루스타트로 치료한 Spg11+/+ 또는 Spg11-/- 피질 뉴런의 1차 배양시 뉴런을 글루탐산염 (200μM)으로 인큐베이션하고 30시간 후의 뉴런 사멸의 정량화. 각 실험에서 정량화된 적어도 100개의 뉴런에 의한 n>8 실험. Kruskal Wallis test; *:p = 0.0188; ***:p = 0.0002.
도 7은 SPG11 환자 iPS 세포 유래 뉴런의 리소좀 내 GM2 및 GM3 축적을 보여주는 그래프이다. A 전능성 마커에 의한 iPS 세포의 면역염색. B 뉴런 마커 β-III 튜불린 및 글루탐산성 마커 v-Glut1에 대한 항체에 의한 iPS 세포주로부터 유래한 뉴런 배양의 면역염색. 스케일 바: 10 μm. C iPS 세포로부터 유래한 뉴런의 GM2 및 Lamp1 면역염색. 스케일 바: 5 μm. D iPS 세포로부터 유래한 뉴런의 리소좀에서의 GM2 및 GM3의 상대량의 정량화. n>30 뉴런, 3개의 독립적인 실험. t-검정; **: p = 0.0042 (GM2); *** p = 0.0002 (GM3). E Lamp2 염색과 공동 위치화된 GM2 (좌측 패널) 또는 GM3 (우측 패널) 면역염색의 비율의 정량화. n>30 뉴런, 3개의 독립적인 실험. t-검정, ***:p≤0.0001.
도 8은 spg11 녹아웃이 소뇌에서 뉴런 사멸을 일으키는 것을 보여주는 그래프 및 이미지의 세트이다. A, B 대조군 마우스 (B)와 비교하여, 녹아웃 마우스 (B)에서 일련의 푸르키니에 세포 (Purkinje cell) 손실을 나타내는 GFAP (별아교세포 마커), 칼빈딘 (Calbindin) (푸르키니에 세포 마커), 및 Hoechst-33258 (청색, 핵 마커)에 대해 면역염색된 소뇌 절편. 스케일 바: 100 μm. PCL: 푸르키니에 세포 층. C 푸르키니에 세포의 수는 녹아웃 마우스에서 8개월령부터 감소하였다 (n≥5 절편/동물 및 n≥5 동물/유전자형/연령; 클러스컨-월리스 검정; ***:p<0.001).
도 9는 Spg11 녹아웃 마우스의 소뇌 푸르키니에 세포에서 Lamp1과 공동 위치화된 자가형광성 입자의 축적을 보여주는 이미지 세트이다. A 6주령, 4개월령, 8개월령 및 16개월령 동물의 Spg11+/+ 및 Spg11-/- 푸르키니에 세포의 자가형광성 물질 (여기 488 nm, 방출 515 내지 530 nm). 녹아웃 마우스는 이미 6주령 후부터 푸르키니에 세포에 자가형광성 침착물을 나타내었다. 스케일 바: 10 μm. B. 6 주령 및 8개월령의 동물의 Spg11+/+ 및 Spg11-/- 푸르키니에 세포의 자가형광성 물질과 비교한 Lamp-1 (리소좀 마커) 면역염색. 공초점 현미경 이미지는 녹아웃 동물에서 자가형광성 입자 주위에 Lamp-1 양성 염색이 분포함을 보여주었다. 스케일 바: 10 μm. C. 6주 및 8개월령의 Spg11+/+ 및 Spg11-/- 푸르키니에 세포에서의 p62 면역염색 및 자가형광성. 공초점 현미경 이미지는 8개월령의 Spg11-/- 마우스의 푸르키니에 세포에서만 p62 양성 염색과 자가형광성 입자가 공동 위치화되었음을 보여준다. 스케일 바: 10 　μm.
도 10은 스파탁신의 손실이 소뇌의 푸르키니에 세포에서 GM2 및 GM3의 축적을 촉진하는 것을 보여주는 그래프 및 이미지의 세트이다. A 6주령 및 8개월령의 동물의 Spg11+/+ 및 Spg11-/- 푸르키니에 세포에서 GM2 면역염색 및 자가형광성 물질. 8개월령의 동물에서 GM2 양성 염색과 자가형광성 입자의 공동 위치화를 보여주는 공초점 현미경 이미지. 스케일 바: 10 μm. B 푸르키니에 세포 당 GM2 면역염색 강도의 평균 (좌측 패널) 및 분산 (우측 패널)의 정량화. 그래프는 평균 ± SEM 값을 보여준다. 5개의 독립적인 소뇌 절편에서 정량화된 n>10 푸르키니에 세포. 클러스컨-월리스 검정; *: p≤0.05; **: p≤0.01; ***: p≤0.0001. C 6주령 및 8개월령의 동물의 Spg11+/+ 및 Spg11-/- 푸르키니에 세포에서의 GM3 면역염색 및 자가형광성 물질. Spg11-/- 뉴런에서 8개월령에서만 GM3 염색과 자가형광성 입자가 공동 위치화되었음을 보여주는 공초점 현미경 이미지. 스케일 바: 10 μm. D 푸르키니에 세포 당 GM3 면역염색 강도의 평균 (좌측 패널) 및 분산 (우측 패널)의 정량화. 그래프는 평균 ± SEM 값을 보여준다. 5개의 독립적인 소뇌 절편에서 정량화된 n>10 푸르키니에 세포. 클러스컨-월리스 검정; ***: p≤0.0001.
도 11은 스파탁신 손실이 SPG11 환자로부터 유래한 뉴런에서 강글리오사이드의 리소좀 축적을 촉진시키는 것을 보여주는 그래프 및 이미지의 세트이다. A 전구체 마커 Pax6 및 뉴런 특이적 마커인 βIII-튜불린에 대한 항체에 의해 시험관내에서 90일 동안 분화된 뇌 유기관의 면역염색. 신경 세포는 유기관 주위에 집중되어 있음을 확인한다. 스케일 바: 50μm. B 건강한 대상체 또는 SPG11 환자에서 유래한 유기관의 뉴런 층에서의 GM2 및 Lamp1 면역염색. βIII-튜불린은 분석된 세포의 뉴런 정체성을 보여준다. SPG11 환자에서 유래한 유기관의 Lamp1 염색으로 표지된 리소좀에서의 GM2 양성 염색의 축적 (화살표)을 보여주는 공초점 현미경 이미지. 스케일 바: 10 μm. C-F 뉴런 당 GM2 (C), GM3 (D), GD2 (E), 및 GD3 (F) 면역염색 강도의 평균 (좌측 패널) 및 분산 (우측 패널)의 정량화. 그래프는 평균 ± SEM 값을 보여준다. 5개의 독립적인 피질 절편에서 정량화된 N>10 뉴런. 일원 ANOVA; *** p≤0.001.
도 12는 스파탁신 손실이 피질 뉴런의 1차 배양시 강글리오사이드의 리소좀 축적을 유도하는 것을 보여주는 그래프 및 이미지의 세트이다. A 시험관내에서 6일 동안 배양된 Spg11+/+ 및 Spg11-/- 뉴런의 GM2 및 Lamp1 면역염색. Lamp1 염색으로 표지된 리소좀의 GM2 양성 염색의 축적을 보여주는 공초점 현미경 이미지. 스케일 바: 10 μm. B-E 리소좀에 위치화된 GM2 (B), GM3 (C), GD2 (D), 및 GD3 (E) 염색 비율의 정량화. 그래프는 평균 ± SEM 값을 보여준다. 3개의 독립적인 뉴런 제조물에서 정량화된 N>50 뉴런. t-검정; **p≤0.01, *** p≤0.001.
도 13은 리소좀 내의 GM2 축적이 자가용해소체의 형성을 촉진하는 것을 보여주는 그래프 및 이미지의 세트이다. A 또한, 시험관내에서 3일 및 6일 후에 Spg11+/+ 및 Spg11-/- 뉴런에서 p62에 대해 양성인 Lamp1로 염색된 리소좀의 비율. 적어도 4개의 독립적인 뉴런 제조물에서 정량화된 N>50 뉴런. 이원 ANOVA; * p = 0.04; *** p < 0.001. B GM2 항체, 리소좀 마커 Lamp1, 및 자가 식작용 마커 p62에 의한 Spg11-/- 뉴런의 면역염색. 화살표은 GM2 염색에 양성인 자가용해소체를 나타낸다. 스케일 바: 10μm. C 시험관내에서 3일 및 6일 후에 Spg11+/+ 및 Spg11-/- 뉴런에서 p62 및 GM2 둘 모두에 대해 양성인 Lamp1로 염색된 리소좀의 비율. 적어도 4개의 독립적인 뉴런 제조물에서 정량화된 N > 50 뉴런. 이원 ANOVA; *** p <0.001. D 다양한 농도의 미글루스타트로 시험관내에서 6일 동안 배양한 Spg11+/+ 및 Spg11-/- 피질 뉴런의 1차 배양의 GM2 면역염색의 형광 강도의 정량화. 각 실험에서 정량화된 적어도 200개의 뉴런에 의한 N>3 측정. E 시험관내에서 6일 후에 Spg11+/+ 및 Spg11-/- 뉴런에서 p62에도 양성인 Lamp1로 염색된 리소좀의 비율에 대한 미글루스타트 처리 (100μM)의 효과. 적어도 4개의 독립적인 뉴런 제조물에서 정량화된 N>50 뉴런. 이원 ANOVA; *** p < 0.001. F 시험관내에서 6일 후에 대조군 뉴런에서 p62에도 양성인 Lamp1로 염색된 리소좀의 비율에 대한 2개의 독립적인 miRNA (GM3S-1 및 GM3S-2)에 의한 GM3 합성효소의 하향조절의 효과. 적어도 3개의 독립적인 뉴런 제조물에서 정량화된 N>20 뉴런. 이원 ANOVA; *** p<0.001. G GM2 및 Lamp1에 대한 항체의 염색에 대한 Neu1 하향조절의 효과. Neu1의 하향조절 후에 GM2로 표지된 리소좀 수의 증가를 확인한다. 스케일 바: 10μm. H Neu1에 대한 2개의 독립적인 miRNA를 발현하는 벡터로 형질감염된 뉴런에서 리소좀에 위치화된 GM2 염색의 비율의 정량화. 3개의 독립적인 뉴런 제조물에서 정량화된 N>20 뉴런. 일원 ANOVA; * p = 0.02; ** p = 0.0017. I 시험관내에서 6일 후에 대조군 뉴런에서 p62에도 양성인 Lamp1로 염색된 리소좀의 비율에 대한 2개의 독립적인 miRNA (Neu1-1 및 Neu1-2)에 의한 Neu1 하향조절의 효과. 3개의 독립적인 뉴런 제조물에서 정량화된 N>20 뉴런. 일원 ANOVA; *** p < 0.001. 모든 그래프는 평균 ± SEM 값을 보여준다.
도 14는 GM2 수준을 조절하는 처리가 글루탐산염에 의해 유발된 뉴런 사멸을 조절한다는 것을 보여주는 일련의 그래프 및 이미지의 세트이다. A 2개의 독립적인 miRNA (Neu1-1 및 Neu1-2)에 의해 Neu1을 하향조절하는 벡터로 형질감염된 대조군 뉴런의 1차 배양시 글루탐산염 (200 μM)으로 뉴런을 배양하고 30시간 후에 뉴런 사멸의 정량화. N>3 독립적인 실험. 일원 ANOVA; * p = 0.016; ** p = 0.003. B 미글루스타트 (100 μM)로 처리되거나, 처리되지 않은 Spg11+/+ 및 Spg11-/- 피질 뉴런의 p62 수준의 웨스턴 블롯 분석. 뉴런을 글루탐산염 (200 μM)와 24시간 동안 인큐베이션하였다. 미글루스타트 또는 글루탐산염으로 처리한 Spg11+/+ 및 Spg11-/- 피질 뉴런에서 튜불린으로 정규화된 p62의 상대량의 정량화를 보여주는 그래프. N>5 독립적인 실험. 일원 ANOVA; ** p < 0.01. 모든 그래프는 평균 ± SEM 값을 보여준다.
도 15는 Spg11+/+ 및 Spg11-/- 마우스 뇌로부터의 리소좀-다함유 분획의 정제를 보여주는 그래프 및 이미지의 세트이다. A 리소좀 다함유 분획을 정제하는데 사용되는 절차를 보여주는 도식. B Spg11+/+ 및 Spg11-/- 마우스 뇌로부터 획득한 전체 뇌 용해물, 분획 S20, P20 및 리소좀 다함유 분획의 웨스턴 블롯 분석.
도 16. 건강한 대상체 또는 SPG11 환자의 섬유아세포로부터 유래한 iPS 세포의 특성화. 전능성 마커에 의한 iPS 세포의 면역염색. 스케일 바: 20μm.
도 17은 GM3 합성효소의 하향조절이 배양된 뉴런의 강글리오사이드 수준을 저하시키는 것을 보여주는 그래프 및 이미지의 세트이다. A 대조군 벡터 또는 GM3 합성효소를 효적화하는 2개의 상이한 miRNA를 발현하는 벡터로 형질감염된 마우스 NIH-3T3 세포에서 GM3 합성효소 mRNA의 저하를 보여주는 qRT-PCR. N = 3. 클러스컨-월리스 검정, * p = 0.048; ** p = 0.003. B GM3 합성효소를 하향조절하기 위해, GFP 및 miRNA를 발현하는 벡터로 형질감염된 세포의 GM2 면역염색. 화살표는 GM3 합성효소에 대한 miRNA로 형질감염된 세포를 나타내며, 이는 약한 GM2 염색을 나타낸다. 화살표는 형질감염되지 않은 세포를 나타낸다. 스케일 바: 10μm. C GM3 합성효소에 대한 2개의 상이한 miRNA 또는 대조군 miRNA를 발현하는 벡터로 형질감염된 뉴런에서 GM2의 형광 강도의 정량화. N>50 뉴런, 2개의 독립적인 실험. 일원 ANOVA, * p = 0.03, ** p = 0.001.
도 18 특이적 miRNA를 발현하는 벡터의 형질감염에 의한 Neu1의 하향조절. 대조군 벡터 또는 Neu1을 효적화하는 2개의 상이한 miRNA를 발현하는 벡터로 형질감염된 마우스 NIH-3T3 세포에서 Neu1 mRNA의 저하를 보여주는 qRT-PCR. N = 4. 클러스컨-월리스 검정, * p < 0.05.
도 19는 Spg11 녹아웃 마우스가 인지 및 기억 결핍을 나타내는 그래프 및 이미지의 세트이다. A-B Y자 미로 원리 (A) 및 자발적인 교대 값 (B). 녹아웃 마우스는 4개월령부터 미로의 미지의 갈림길과 진입 경험이 있는 갈림길 사이에 선호도를 나타내지 않았다 (n≥12 동물/유전자형/연령; 클러스컨-월리스 검정; ***p ≤ 0.001). 이러한 변화된 인지 행동은 공간 학습 또는 기억 결핍에 근거한다. C-D 두려움 조건화. 전기 충격 전 및 후의 1일째에 부동 자세에서 보낸 시간의 백분율 (C). 임의의 월령에서 마우스의 조건화 동안 명백한 학습 결핍은 존재하지 않았다. 조건화 후 전기 충격을 가하지 않은 2일째에 부동 자세에서 보낸 시간의 백분율 (D). 녹아웃 마우스는 행동 요령을 학습하였으나, 8개월령부터 부동 위치에서 보내는 시간이 적어졌으며, 이는 인지 및 기억 결핍을 나타낸다 (n≥10 동물/유전자형/연령; 클러스컨-월리스 검정; **p ≤ 0.01 및 ***p ≤ 0.001).
도 20은 미글루스타트 처리가 제브라피쉬 (zebrafish) zspg11 모델에서 운동 기능 이상을 방지하는 것을 보여주는 그래프 및 이미지 세트이다. A. 1.2 pmol zspg11spl 또는 1.2 pmol 미스매치 (mm) 모르폴리노를 주입하였거나, 주입하지 않은 모펀트 (morphant)의 표현형. 수정 후 48시간째에, 모펀트를 정상적인 표현형, 느리게 헤엄치기, 마비 또는 구부러진 모펀트로 분류하였다. zspg11spl 모르폴리노의 주입은 고비율의 마비 또는 느리게 헤엄치는 표현형을 유도한다. 미글루스타트로 처리하면, 마비 모펀트의 비율이 저하되었다. 각 그룹에서 분석된 N>100 모펀트. 카이 제곱 검정 (chi square test) *** p<0.0001. B-C. 접촉-유발 회피 반응 후, 유충이 이동한 거리의 추적 (B) 및 정량화 (C). zspg11spl 모르폴리노를 주입하면, 모펀트의 헤엄치기가 손상되었으며, 이는 미글루스타트에 의해 처리되는 경우, 교정되었다. 각 조건에서 분석된 N=12 모펀트. 일원 ANOVA *** p<0.001. D-E. 1.2 pmol zspg11spl 또는 1.2 pmol 미스매치 (mm) 모르폴리노를 주입한 모펀트의 종뇌에서의 면역염색 (D) 및 GM2 면역염색의 정량화 (E). zspg11spl 모르폴리노를 주입하면, GM2 면역염색 강도의 평균 및 분산이 증가하였다. 이러한 표현형은 모펀트를 미글루스타트로 처리하는 경우, 교정되었다. 각 조건에서 분석된 N>6 모펀트. 일원 ANOVA *** p<0.001.
도 21은 SPG11, SPG4 및 SPG7 환자의 뇌 피질에서의 GM2의 뉴런 축적을 보여주는 이미지의 세트이다. 신경계 증상이 없는 대조군의 뇌 절편과 비교한 SPG11, SPG4 및 SPG7 환자의 전두엽 피질의 뇌 절편의 GM2 항체에 의한 면역염색. SPG11, SPG4 및 SPG7 환자 절편에 GM2 면역염색이 더 높은 뉴런이 존재함을 확인한다. 더 높은 배율에서, 백색 화살표는 SPG11, SPG4 및 SPG7 환자의 뉴런에서 GM2의 소포 축적을 나타낸다.
실시예
본 발명은 다음 실시예에 의해 추가로 예시된다.
실시예 1: Spg11-녹아웃 마우스는 신경 퇴행이 발생하기 전에 조기 발병 운동 결핍이 발생한다.
본 발명자들은 Spg11-녹아웃 마우스 모델을 생성하여, 노화 동안 행동, 뉴런 사멸 및 세포 변화를 분석하였다. Spg11 녹아웃 마우스는 6주령부터 운동 기능 이상을 나타냈고, 8개월령에 대뇌 피질 및 소뇌에서 뉴런 사멸이 처음 검출되어, 인간 병리의 주요 특징을 재현하였다. 뉴런 사멸 전에, 리소좀에서 GM2 및 GM3 강글리오사이드를 포함한 지질의 초기 및 점진적 축적이 선행되었다. 리소좀의 지질 축적은 SPG11 환자의 뇌의 피질 뉴런에서도 관찰되었다. GM2 및 GM3이 또한 SPG11 환자의 피부 생검으로부터 얻은 hiPSC로부터 유래한 뉴런의 리소좀에 축적되었으며, 이는 이러한 지질이 병리에 기여한다는 것을 시사한다. 배양된 뉴런을 사용하여, 본 발명자들은 생합성시 주요 효소를 하향 조절하거나, 강글리오사이드 생합성을 방지하고, I형 고셔병 및 C형 니만 피크병의 치료를 위해, 승인된 약제인 미글루스타트로 치료함으로써, 강글리오사이드 수준을 저하시켰다. 강글리오사이드 수준의 저하는 글루탐산염에 의해 유발된 뉴런 사멸을 방지하였다.
본 발명자들은 마우스에서 Spg11 발현을 무효화함으로써, 신경 퇴행에서 스파탁신의 생리병리학적 역할을 조사하였다. 본 발명자들은 SPG11 환자에서 관찰된 엑손의 가장 빈번한 돌연변이를 모방한 것으로, 유전자의 엑손 32에 2개의 연속 종결 코돈을 삽입하였다 (도 1a). 본 발명자들은 Spg11 유전자의 파괴가 스파탁신 고갈을 일으키는지 확인하기 위해, 웨스턴 블로팅을 사용하였다 (도 1b). 이형접합 마우스 (Spg11+/-)의 교배시, 예상되는 멘델 비율로 녹아웃 마우스가 생성되어, 생존하였다. 이들은 정상적으로 발달하고, 생식력이 있었으며, 생존율이 그의 야생형 및 이형접합 한배새끼와 유사하였다. Spg11-/- 마우스는 대조군 한배새끼와 비교하여, 8개월령까지는 이형적 특징 또는 이상이 나타나지 않았다. 그러나, 본 발명자들이 윤리적 이유로 연구를 중단한 월령인 16개월에, 대부분의 녹아웃 마우스는 뒷다리가 확장되고, 골반 높이가 더 낮으며, 흉추의 척추후만증이 뚜렷한 비정상적인 자세를 나타내었다 (도 1c 및 도 1d).
본 발명자들은 먼저 피질 및 소뇌의 뉴런에 의해 제어되는 운동 기능에 초점을 두고, 뉴런 사멸의 시간 경과 및 운동 기능에 대한 스파탁신 무효화에 대한 결과를 평가하였다. 4개월령 후부터, Spg11-/- 마우스는 진행성 보행 장애를 나타내었으며, 이를 발가락 끝 위치에서 뒷발의 발바닥 각도 (FBA)를 측정하여, 정량화하였다 (도 1e, 도 1f 및 도 1g). 유사하게, 트레드밀 (treadmill)에서 적당한 속도 (10 cm.s-1)로 마우스의 보행을 기록하면, 몸의 축에 대한 뒷발의 위치인 보행 각도는 4개월령 후부터 대조군 마우스보다 녹아웃 마우스에서 유의하게 더 큰 것으로 나타났다 (도 1h 및 도 1i). 월령이 증가하면서, Spg11-/- 마우스는 뒷다리가 확장되어, 강제 보행 동안 발을 약간씩 끌기 시작하였다. 운동 결핍은 강제 달리기의 통상적인 예인 로타로드 검사에서 훨씬 더 두드러졌다. 이러한 검사에서 Spg11-/- 마우스는 6주령에 운동 손상의 첫 징후 및 운동 실조 보행을 나타내었다. 녹아웃 마우스는 이형접합 및 대조군 마우스보다 훨씬 적은 시간 동안 가속 로타로드에서 유지하였고 (도 1j), 이러한 운동 결핍은 시간 경과에 따라 악화되었다. 운동 수행능은 대조군 및 이형접합 마우스에서 월령이 증가함에 따라, 저하되었지만, 이들 마우스에서 녹아웃 마우스보다 규칙적으로 더 우수하였다.
본 발명자들은 Spg11-/- 마우스에서 피질 및 소뇌를 분석함으로써, 행동 표현형이 신경 퇴행으로부터 기인하였는지를 조사하였다. 다양한 월령에서, 본 발명자들은 NeuN에 대한 면역염색에 의해 1차 운동 피질의 피질 뉴런의 총 수를 결정하였다 (도 1k 및 도 1l). 뇌의 코로나 단면에서, 피질 층의 뉴런의 수는 4개월령의 녹아웃 마우스에서는 영향을받지 않았지만, 8개월령 후부터는 Spg11+/+ 마우스에서보다 현저하게 더 소수였다 (도 1m 및 도 1n). 뉴런의 퇴행은 시간 경과에 따라, 악화되었고, 별아교세포증이 동반되었으며, 이는 GFAP 양성 세포의 증가에 의해 제시되는 바와 같다 (도 1l, 도 1o 및 도 1p). 소뇌에서는 칼빈딘 면역염색으로 표지된 푸르키니에 세포의 수가 8개월령부터 대조군 마우스에 비해 녹아웃 마우스 소뇌에서 크게 감소하였다 (도 8c). 또한, 푸르키니에 세포의 퇴행은 1차 운동 피질에서와 같이 현저한 별아교세포증를 동반하였으며, 이는 GFAP 면역염색에 의해 나타난 바와 같다 (도 8a 및 도 8b). 따라서, 운동 기능은 명백한 뉴런 사멸의 발생 이전에 손상되었으며, 이는 초기 뉴런 기능 이상의 존재를 시사한다.
실시예 2: 스파탁신 손실은 뉴런에서 초기 리소좀 기능 이상을 초래한다.
자가형광성 세포내 물질이 Spg11-/- 마우스에서 대뇌 피질의 뉴런에 축적되었다. 이러한 축적은 녹아웃 마우스의 경우 6주령에 개시되었지만, 대조군 마우스의 경우 큰 자가형광성 입자는 16개월령까지는 검출되지 않았다. 이 단계에서, 녹아웃 마우스의 운동 뉴런에서 침착이 더 빈번하고, 더 방대하였다 (도 2a). 자가형광성은 635 nm에서 여기시 검출되지 않았으므로 (도 2b), 다양한 마커로 공동 위치화를 분석할 수 있었다. Lamp1 면역반응은 자가형광성 응집체 주위에 분포되어 있으며 (도 2c), 이는 스파탁신의 손실이 리소좀 기능을 변화시킴을 시사한다. 리소좀은 자가 식작용포 분해에 핵심적인 역할을 하며, 리소좀 기능 이상은 자가 식작용리소좀의 축적을 유도하는 것으로 생각된다. 본 발명자들은 자가형광성 응집체가 자가 식작용 기질의 마커인 p62와 공동 위치화되어 있는지 조사하였다. 자가형광성 응집체와 p62의 공동 위치화는 16개월령의 Spg11-/- 마우스에서만 관찰되었다 (도 3a). 6주 및 8개월령의 Spg11-/- 동물 및 16개월령의 Spg11+/+ 마우스에서, p62는 자가형광성 응집체와 관련이 없었다. Lamp1 면역염색이 주위에 분포하는 유사한 자가형광성 응집체가 Spg11-/- 마우스 소뇌의 푸르키니에 세포에서 관찰되었다 (도 9a 및 도 9b). 자가 식작용 마커 p62는 또한 8개월령부터 Spg11-/- 마우스의 푸르키니에 세포에서 자가형광성 응집체와 공동 위치화되었다 (도 9c). 이러한 데이터는 Spg11-/- 마우스의 후기 질병 단계에서 대뇌 및 소뇌 피질의 리소좀 구조에 자가 식작용 기질이 축적되어 있음을 시사한다.
본 발명자들은 자가 식작용포에 집약된 LC3의 지질화 형태인 LC3-II 및 리소좀 프로테아제인 카텝신 D의 수준을 측정하기 위해, 웨스턴 블로팅을 수행하여, 자가 식작용 또는 리소좀 기능 이상의 변화를 조사하였다. LC3-II 수준은 모든 월령의 대조군 마우스 및 녹아웃 마우스에서 유사하였다 (도 3b). 이와 달리, 활성 형태의 리소좀 프로테아제인 성숙한 카텝신 D의 수준은 대조군보다 월령이 적은 6주령 및 4개월령의 Spg11-/- 마우스의 피질에서 유의하게 더 높았다. 성숙한 카텝신 D 수준은 월령이 증가함에 따라 증가했으므로, 유전자형 간의 차이는 8개월 및 16개월령에 더 이상 나타나지 않았다 (도 3c). 따라서, 스파탁신 손실은 p62 자가 식작용 마커의 축적 이전에 리소좀 기능의 초기 변화를 유도하였고, 이는 후기 질병 단계에서만 검출되었다.
실시예 3: 스파탁신 손실은 마우스 및 인간 뇌의 리소좀에서 지질 축적을 촉진한다.
본 발명자들은 2개월령에 피질 뉴런을 분석하기 위해, 전자 현미경을 사용하여, 초기 단계에서 리소좀 기능 이상에 대한 스파탁신 무효화의 결과를 평가하였다 (도 4). 리소좀의 평균 밀도 및 표면적은 유전자형 간에 차이가 없었다 (도 4i 및 도 4k). 그러나, 분해되지 않은 물질을 포함하는 소기관의 수는 Spg11-/- (도 4c 내지 도 4f 및 도 4j)에서 대조군 뉴런 (도 4a 및 도 4b)보다 유의하게 더 높았다. 이러한 리소좀 입자 중 일부는 또한 지질 액적 외에 입상 및 막 물질을 포함하고, 리포푸신형 구조를 연상시킨다 (도 4d, 도 4e 및 도 4f). 본 발명자들은 또한, 분해되지 않은 물질을 포함하고 있는 리소좀과 지질 액적을 포함하는 더 큰 리포푸신형 구조가 뉴런 소마 (neuronal soma)에 군집되어 있음을 관찰하였다 (도 4f). 이러한 구조는 카텝신 D에 양성으로 나타나므로, 이는 리소좀 유래임을 시사한다 (도 4g). 리포푸신형 구조는 2개월령에 Spg11-/- 피질 뉴런에서 대조군 뉴런보다 이미 유의하게 더 컸다 (도 4l). 유사한 구조가 트랜스형의 2개의 절단 이형접합 돌연변이를 갖는 SPG11 환자의 뇌의 피질 뉴런에서 다수 관찰되었으며 (도 4h) (문헌 [Denora et al, Brain. 2016 Jun; 139(Pt 6):1723-34]), 이는 신경병리적 과정에 기여함을 시사한다. 이러한 데이터는 스파탁신의 부재가 뉴런 사멸이 일어나기 오래 전의 2개월령의 동물에서, 마우스 피질 뉴런에서 리소좀 기능 이상을 초래함을 시사한다. Spg11-/- 뉴런의 지질 및 막-포함 구조의 유의한 증가는 리소좀에 의한 지질 제거가 손상될 수 있음을 시사한다.
실시예 4: 스파탁신 손실은 GM2, GM3, GD2 및 GD3 강글리오사이드의 점진적인 축적을 촉진한다.
본 발명자들은 초기 질병 단계에서 리피도믹 (lipidomic) 분석을 수행함으로써, Spg11-/- 마우스의 대뇌 피질에서 지질 축적의 성질을 조사하였다. 6주령의 마우스의 피질로부터 지질을 추출하고, 액체 크로마토그래피-고 분해능 질량 분광분석에 의해 분석하였다. 다양한 종류의 지질 중에서 GM2 및 GM3 강글리오사이드의 2종의 수준은 Spg11-/- 마우스 피질에서 대조군 마우스 피질보다 유의하게 더 높았다 (표 1; 2종의 지질 모두에 대한 p 값 0.08, n=3).
[표 1]
Figure pct00064
Figure pct00065
이러한 지질의 동일성을 직렬 질량 분광분석 실험에 의해 확인하였다. 따라서, 본 발명자들은 지질 종류에 대한 특이적 항체를 사용하여, Spg11-/- 뇌의 피질 뉴런에서의 이러한 화합물의 축적을 평가하였다. 면역염색은 GM2가 녹아웃 마우스에서 6주령부터 자가형광성 리소좀과 공동 위치화되었지만, 대조군 마우스의 뉴런에서는 점상 분포를 나타내었음을 보여주었다. 형광 강도의 정량화는 GM2 수준이 모든 월령의 피질에서 대조군 뉴런보다 Spg11-/-에서 더 높다는 것을 보여주었다 (도 5b). 흥미롭게도, 염색의 불균일한 분포를 나타내는 형광 강도의 분산의 정량화는 녹아웃 조직에서 월령이 증가함에 따라, 크게 증가하였다 (도 5b). 따라서, GM2는 녹아웃 마우스의 모든 자가형광성 응집체에 축적되었다. 이러한 축적은 자가형광성 리소좀의 크기와 마찬가지로 월령이 증가함에 따라 증가하였다 (도 5a). GM3 염색은 6주령의 동물의 대조군 및 Spg11-/- 피질 뉴런에서 점상의 세포질이었으나, Spg11-/- 동물에서는 더 강하였다 (도 5c 및 도 5d). 형광 강도의 분산의 정량화는 또한 녹아웃 동물에서 GM3의 불균일한 염색을 나타내었다 (도 5d). 실제로, GM3는 6주령 후부터 Spg11-/- 마우스 피질의 자가형광성 리소좀에 축적되었다 (도 5c). 유사한 패턴의 GM2 및 GM3 축적이 Spg11-/- 마우스의 푸르키니에 세포에서 관찰되었다 (도 10a 내지 도 10d).
본 발명자들의 리피도믹 분석을 전체 피질에 대해 수행하였다. 따라서, 다른 지질은 그 수준의 전반적 변화가 없더라도, 리소좀에 축적될 수 있다. 또한, (i) 총 지질 추출물 내의 그의 낮은 수준 및/또는 (ii) 고강도 인지질을 포함하는 수종의 지질 종류의 존재로 인한 이온 억제 효과에 의해, 일부 지질이 검출되지 않을 가능성이 있다. 따라서, 본 발명자들은 Spg11+/+ 및 Spg11-/- 마우스의 뇌로부터 리소좀이 다함유된 분획을 정제하고 (도 15a 및 도 15b), Folsch 절차를 사용하여 지질을 추출하였다 (문헌 [Folch et al., J Biol Chem 1957, 226, 497]). 요약하면, 뇌 조직을 2:1 클로로포름-메탄올 혼합물로 균질화시키고, 0.2 부피의 물을 첨가하여 세척하였다. 생성된 혼합물은 2개의 상으로 분리된다. 강글리오사이드를 포함하는 Folsch 상부 상에서 리피도믹 분석을 수행하였다. 강글리오사이드 GM2, GM3, GD2 및 GD3의 수준은 Spg11-/- 마우스 뇌에서 획득한 리소좀 분획에서 대조군 뇌보다 현저하게 더 높았다 (표 2). 본 발명자들은 특이적 항체로 면역염색하여, 리소좀에서의 이들 강글리오사이드의 다함유를 확인하였다. 지질 GM3, GD2 및 GD3은 GM2와 같이, 리소좀과 공동 위치화되었다. 형광 강도의 정량화는 4종의 지질의 수준이 월령이 증가함에 따라 증가하고, Spg11-/- 마우스 뇌에서 대조군 뇌보다 더 높다는 것을 보여주었다 (도 5b, 도 5d, 도 5e 및 도 5f). 형광 강도의 분산의 정량화는 녹아웃 조직에서 월령이 증가함에 따라 증가하였으며, 이는 큰 리소좀에서의 축적과 일치한다. 복합 강글리오사이드 (GM1, GD1, GT1)의 수준은 리소좀이 다함유된 분획에서 유의한 것은 아니나, 약간 더 높았다 (표 2). 따라서, 면역염색에 의해 평가된 바와 같이, Spg11+/+ 및 Spg11-/- 마우스 뇌 사이에 GM1의 위치화에 차이가 없었다 (데이터 미제시).
[표 2]
Figure pct00066
Figure pct00067
이들 데이터는 스파탁신 기능의 손실이 신경 퇴행이 발생하기 전에 대뇌 및 소뇌 피질의 뉴런의 리소좀에서 강글리오사이드의 조기 및 점진적 축적을 유도한다는 것을 확인시킨다.
실시예 5: 강글리오사이드 축적은 배양된 뉴런에서 신경 퇴행에 기여한다.
이어서, 본 발명자들은 피질 뉴런의 1차 배양을 사용하여, 신경 퇴행에서 GM2 및 GM3 축적의 결과를 평가하였다. GM2 및 GM3 항체로 면역염색하면, 녹아웃 배아에서 유래한 배양 뉴런에서 2종의 강글리오사이드가 모두 유의하게 축적된 것으로 나타났다 (도 6a 및 도 6b). 강글리오사이드의 생합성 경로의 주요 효소인 GM3 합성효소를 표적화하는 miRNA의 발현은 GM2 및 GM3의 수준을 유의하게 저하시켰다 (도 6c 및 도 6d). 따라서, 본 발명자들은 뉴런 사멸에서의 강글리오사이드 축적의 의미를 검사할 수 있었다. 모델로서, 본 발명자들은 신경퇴행성 질병의 다수의 모델에 관여하는 글루탐산염에 의해 유발된 뉴런 사멸을 평가하였다. 뉴런 사멸은 Spg11-/- 배아로부터 획득한 세포에서 대조군 뉴런에 비해 더 높았다 (도 6e). 중요하게는, GM3 합성효소의 하향조절 후에 GM2 및 GM3의 수준이 저하된 경우, 글루탐산염에 의한 뉴런 사멸은 Spg11-/- 뉴런에서 현저히 저하되었다 (도 6e). 다음으로, 본 발명자들은 글루탐산염에 의해 유발된 뉴런 사멸에 대한 미글루스타트, 기질 감소 요법 (SRT)의 효과를 평가하였다. 미글루스타트는 테이 삭스병 (Tay Sachs disease)의 마우스 모델에서 GM2의 뇌 수준을 저하시키는데 사용되어 온 글루코실세라마이드 합성효소의 억제제이다 (문헌 [Platt et al, Science. 1997 Apr 18;276(5311):428-31]). Spg11-/- 뉴런에서 미글루스타트는 글루탐산염에 의해 유도된 뉴런 사멸을 투여량 의존적 방식으로 저하시켰다 (도 6f). 이러한 데이터는 GM2 및 GM3의 축적이 뉴런 사멸에 기여함을 시사한다.
실시예 6: 스파탁신 손실은 피질 뉴런의 1차 배양시 자가용해소체에서 단순 강글리오사이드 축적을 촉진한다.
Spg11-/- 마우스 배아로부터 유래한 피질 뉴런의 1차 배양시, GM2 및 GM3가 축적되므로, 본 발명자들은 또한, 배아 유사 구조인 뇌 유기관에 축적된 강글리오사이드로서, 강글리오사이드가 그의 리소좀 내에 축적되었는지를 추가적으로 분석하였다. GM2, GM3, GD2 및 GD3은 Spg11-/- 배아에서 유래한 배양 뉴런의 리소좀 내에 유의하게 축적되었다 (도 12a 내지 도 12e). 따라서, 피질 뉴런의 1차 배양은 세포 기능에 대한 강글리오사이드 축적의 결과를 조사하기 위해, 적절한 모델이다. GM2가 리소좀에 가장 많이 축적된 강글리오사이드이었으므로, 본 발명자들은 이를 후속 실험에서 강글리오사이드 축적의 마커로 사용하였다.
그 후, 본 발명자들은 Spg11 녹아웃 뉴런의 리소좀 기능에 대한 강글리오사이드 축적의 결과를 조사하였다. 스파탁신의 손실은 자가 식작용 제거를 손상시키고, 자가용해소체의 축적을 야기한다. 따라서, 리소좀 마커 Lamp1 및 자가 식작용 마커 p62에 대한 양성 염색에 의해 정의되는 자가용해소체인 리소좀의 비율은 Spg11-/- 뉴런에서 대조군 뉴런보다 높았으며, 이 비율은 배양된 Spg11-/- 뉴런에서 시간 경과에 따라 증가하였다 (도 13a). 그 후, 본 발명자들은 GM2가 자가용해소체의 비율을 증가시키는 데 기여했는지를 조사하였다. 뉴런에서 GM2 염색을 면밀히 검사한 결과, 또한 p62로 염색된 리소좀의 하위세트에 주로 축적된 것으로 나타났다 (도 13b). p62 및 GM2 항체로 염색된 리소좀의 비율은 Spg11-/- 뉴런에서 대조군 뉴런보다 더 높았고, 시간 경과에 따라 증가했으며 (도 13c), 이는 GM2가 자가용해소체의 축적에 기여할 수 있음을 시사한다.
실시예 7: GM2는 자가용해소체의 축적에 기여한다.
본 발명자들은 당스핑고지질 합성의 초기 단계인 글리코실세라마이드 합성효소를 억제하는 기질 감소 요법 (SRT)인 미글루스타트를 사용하여, 자가용해소체의 축적에서 GM2의 역할을 평가하였다. 본 발명자들의 시험관내 모델에서, 미글루스타트는 대조군 및 Spg11-/- 뉴런에서 투여량 의존적 방식으로 GM2의 수준을 유의하게 저하시켰다 (도 13d). 미글루스타트 (100 μM)는 또한 Spg11-/- 뉴런에서 p62 마커에 대한 양성 리소좀의 양을 현저하게 저하시켰다 (도 13e). 본 발명자들은 생합성 경로에서 첫 번째 강글리오사이드를 생성하는 효소인 GM3 합성 효소를 표적화하는 miRNA, 다른 모든 시알릴화된 강글리오사이드가 생성되는 miRNA의 2개의 독립적인 miRNA를 사용하여, 자가용해소체 형성에서의 강글리오사이드 축적의 역할을 더욱 직접적으로 검사하였다. 이러한 miRNA의 발현은 GM3 합성효소 mRNA 및 GM2 수준의 발현을 유의하게 저하시켰다 (도 17a 내지 도 17c). GM3 합성효소의 하향조절 후에 GM2의 수준이 저하된 경우, p62를 포함하는 리소좀의 비율이 Spg11-/- 뉴런에서 유의하게 저하하였다 (도 13f). 전반적으로, 본 발명자들의 데이터는, 자가용해소체 내의 GM2의 축적이 그의 내용물의 분해 및 그의 재활용을 방지함을 시사한다.
본 발명자들은 대조군 세포에서 리소좀에서의 강글리오사이드의 분해에 관여하는 효소인 뉴라미니다제 1 (neuraminidase 1) (Neu1)의 발현의 하향조절에 의해, 이러한 가정을 직접 검사하였다. 본 발명자들은 Neu1 발현을 효율적으로 하향조절하는 2개의 독립적인 miRNA 서열을 사용하였다 (도 18). Neu1의 하향조절은 형질감염된 세포의 리소좀에서 GM2의 유의한 축적을 촉진시켰다 (도 13g 및 도 13h). Neu1의 하향조절 후에 리소좀 내의 GM2 수준의 증가는 자가 식작용 마커 p62에 양성인 리소좀 비율의 유의한 증가를 야기시켰다 (도 13i). 이는 리소좀 내의 GM2의 축적이 자가용해소체의 축적을 야기함을 시사한다.
실시예 8: GM2는 배양 뉴런에서 신경 퇴행에 기여한다.
본 발명자들은 마우스 피질 뉴런의 1차 배양을 사용하여, GM2 및 자가용해소체의 축적이 신경 퇴행에 기여하는지를 조사하였다. 본 발명자들은 다수의 신경 퇴행성 질병 모델에서 발생하는 것으로, 글루탐산염에 의해 유발되는 뉴런 사멸을 평가하였다. 글루탐산염 처리는 배양 뉴런에서 강글리오사이드 수준을 증가시키는 것으로 나타났다 (문헌 [Park D.H. et al., Anal Chem, 2016]). 따라서, 본 발명자들은 대조군 (+20.0 ± 4.6%, p = 0.02, t-검정, n>9) 및 Spg11-/- 뉴런 (+15.7 ± 3.9% p = 0.007, t-검정, n>10) 둘 모두에서 전반적인 GM2 수준이 중간 정도이나, 유의하게 증가한 것을 관찰하였다.
글루탐산염에 의해 유발된 뉴런 사멸은 대조군 뉴런보다 Spg11-/- 배아로부터 획득된 뉴런에서 유의하게 더 높았다 (도 6f). Spg11-/- 뉴런의 미글루스타트 처리는 글루탐산염 유발 뉴런 사멸을 투여량 의존적 방식으로 저하시켰다 (도 6f). GM3 합성효소의 하향조절 후에 GM2 수준이 저하된 경우, 유사한 데이터가 획득되었다 (도 6e). 이러한 데이터는 GM2 축적이 뉴런 사멸에 기여함을 시사한다. 본 발명자들은 Neu1의 하향조절 후, 리소좀 내의 강글리오사이드의 축적 및 글루탐산염에 의해 유발된 뉴런의 사멸의 모니터링에 의해, 이러한 가정을 확인하였다. 강글리오사이드 수준의 증가는 글루탐산염에 의해 유발되는 세포 사멸에 대해 뉴런을 감작화시켰다 (도 14a).
본 발명자들은 24시간 동안 글루탐산염으로 처리된 Spg11-/- 및 대조군 뉴런에서 p62 수준을 모니터링하여, 강글리오사이드-매개 자가용해소체 축적이 글루탐산염에 의해 유발되는 뉴런 사멸에 기여하는지를 판정하였다. 본 발명자들은 대조군 뉴런에서 p62 수준의 차이를 관찰하지 못했다. 이와 달리, 글루탐산염 처리는 Spg11-/- 뉴런에서 p62 수준을 유의하게 증가시켰는데, 이는 미글루스타트 처리에 의해 GM2 수준이 저하된 경우, 억제되었다 (도 14b). 이러한 데이터는 GM2가 자가용해소체의 축적을 촉진하여, 뉴런 사멸에 기여함을 시사한다.
실시예 9: 스파탁신 손실은 인간 뉴런에서 GM2 및 GM3 강글리오사이드의 리소좀 축적을 촉진한다.
강글리오사이드의 축적이 또한 인간 병리와 관련이 있는지를 검사하기 위해, 본 발명자들은 환자-유래의 유도된 전능성 줄기 (iPS) 세포를 사용하였다. 먼저, 본 발명자들은 Spg11-/- 마우스 모델에 도입된 것과 유사한 돌연변이인 엑손 32 (c.6100 C>T, p.R2034X)에서 동형접합 종결 돌연변이를 가진 첫 번째 SPG11 환자의 섬유아세포를 사용하였다 (도 1a). 상기 환자는 통상적인 SPG11 병리를 나타내었고, 6세에 이 질병이 발병하여, 19세에 원거리 소모의 강직성 보행이 나타났다. 대뇌 영상에, 얇은 뇌들보뿐만 아니라, 피질 위축이 나타났다 (문헌 [Stevanin et al, Nat Genet. 2007 Mar;39(3):366-72]). 이러한 환자의 섬유아세포뿐만 아니라, 성별 및 연령이 일치하는 대조군의 섬유아세포를 iPS 세포로부터 유도하였다.
iPS 세포주를 전능성 마커에 대해 조사하였다 (도 7a). 그 후, 뉴런 특이적 마커 βIII-튜불린 및 v-Glut1에 대한 양성 염색에 의해 확인된 바와 같이, 이를 시험관내에서 49일 동안 신경 전구세포로 분화시킨 다음, 글루탐산성 뉴런으로 분화시켰다 (도 7b). 스파탁신의 부재하에 강글리오사이드의 축적을 분석하기 위해, 뉴런을 GM2 또는 GM3에 대한 항체로 면역염색하였다 (도 7c). GM2 및 GM3의 수준은 대조군에 비해 첫 번째 SPG11 환자로부터 유래한 뉴런에서 상향조절되었다 (도 7d). 이러한 차이는 신경 전구세포에서는 관찰되지 않았으며, 이는 뉴런의 분화 또는 노화에 따라, 강글리오사이드의 축적이 발생함을 시사한다. 마지막으로, GM2 및 GM3이 리소좀에 축적되었는지를 조사하기 위해, 강글리오사이드 및 리소좀의 이중 면역염색을 수행하였다 (도 7c). Spg11-/- 마우스의 뇌에서 관찰된 바와 같이, 리소좀과 공동 위치화된 GM2 및 GM3의 비율은 첫 번째 SPG11 환자에서 유래한 뉴런에서 대조군 뉴런보다 유의하게 더 높았다 (도 7e). 이러한 결과는 마우스에서 확인된 병리적 경로가 인간 뉴런과 공유됨을 나타낸다.
그 후, 본 발명자들은 2명의 다른 독립적 SPG11 환자의 섬유아세포로부터 유래한 iPS 세포를 뇌 유기관으로 분화시켰다. 뇌 유기관은 시냅스에 의해 연결되어 있고, 비 반응성 아교 세포망이 주위에 분포하는 전사 및 전기생리적으로 성숙한 뉴런을 포함하는 대뇌 피질형 적층 구조이다. 두 번째 환자 SPG11은 트랜스형의 2개의 이형접합 절단 돌연변이 (c.2431 C>T, pGln811X, 엑손 29의 결실)를 보유하였다. 이 환자는 정상적인 지적 발달을 나타내었고, 14세에 보행의 어려움을 경험하였으며, 점점 악화되어, 20세에는 지팡이에 의지하게 되었다. 23세의 검사에서, 상기 여성 환자는 여전히 지팡이에 의지하여 보행할 수 있는 것으로 나타났다. 상지에서는 긴장도 및 근력이 정상이었지만, 하지에서는 강직 및 근약화가 나타났다. 상기 여성 환자는 상지의 호프만 징후뿐만 아니라, 양측성 신전근 족저 반사 반응 및 발목 클로누스에 의한 반사 반응이 증가하였다. 심부 감각은 정상이었다. 상기 여성 환자는 팔에 자세성 진전이 있었고, 시선은 정상이었으며, 인지 손상은 없었다. 소뇌 징후는 분명하지 않았다. 세 번째 환자 SPG11은 트랜스형의 2개의 이형접합 절단 돌연변이 (c.1951 C>T, pArg651X; c.5623 C>T, pGln1875X)를 보유하였다. 이 여성 환자는 17세에 강직성 보행이 발병하였다. 상기 여성 환자는 26세부터 보행 보조기구가 필요하였고, 27세에 중등도의 강직성 보행이 나타났으며, 더욱 최근에는 휠체어가 필요하였다. 이 여성 환자는 양측성 신전근 족저 반사 반응을 포함하여, 하지의 반사 반응이 증가하였으며, 상지에 호프만 징후가 나타났다. 상기 여성 환자는 다리에 중등도의 근약화가 나타났으며, 발목의 심부 감각이 저하하였다. 운동완서가 분명하게 나타났고, 손가락 코 검사를 수행한 경우, 경미한 진전이 나타났다. 상기 여성 환자는 인지 기능이 임상적으로 정상이었고, 비정상적인 안구 운동이 나타나지 않았다. 뇌 영상에 얇은 뇌들보가 나타났다. 또한, 성별 및 연령이 일치하는 2개의 대조군의 섬유아세포를 사용하여, iPS 세포를 유도하였다. 본 발명자들은 전능성 마커에 의해, iPS 세포주를 확인하였다 (도 16).
SPG11 환자 (2번째 및 3번째) 및 건강한 대상체의 iPS 세포를 자유 부동 3차원 배양법 (문헌 [Pasca A.M. et al., Nat. Methods, 2015])을 사용하여 시험관내에서 우세한 피질성 동질성을 갖는 뇌 유기관으로 분화시켰다. 간단히 말해서, iPS 세포의 응집 및 분화를 촉진하여, 신경외배엽형 상피를 형성시킨 후, 결과적으로 초기 피질 생성을 연상시키는 방식으로 자체 조직화되는 피질 뉴런을 생성시킨다. 분화 90일 후, Pax6 및 Nestin에 의해 표지된 방사상 신경교 세포의 층 및 βIII-튜불린 및 NeuN을 발현하는 뉴런의 주위 층에 유기관이 조직화되었다 (도 11a 및 데이터 미제시). 본 발명자들은 강글리오사이드가 이러한 지질 종에 대한 항체를 사용하여, 뉴런 주위 층의 리소좀에 축적되었는지를 조사하였다 (도 11b 내지 도 11f). GM2, GM3, 및 GD3은 대조군 및 SPG11 뇌 유기관의 주위 층의 뉴런에서 점상으로 위치화되었고, 이는 주로 SPG11 뇌 유기관의 뉴런 내의 리소좀과 공동 위치화되었다 (도 11b, 데이터 미제시). 형광 강도의 정량화는 GM2 및 GM3 수준이 대조군 유기관보다 SPG11 피질 유기관에서 더 높다는 것을 보여주었다 (도 11c 내지 도 11f). 추가로, 또한, GM2, GM3 및 GD3 염색의 형광 강도의 분산은 건강한 대조군으로부터 유래한 유기관보다 SPG11 환자로부터 유래한 유기관에서 더 높았으며, 이는 리소좀 내의 그의 축적과 일치하였다. 초기 단계에서 SPG11 환자 및 건강한 대조군으로부터 유래한 유기관 사이에 GD2 염색에 차이가 없었으며, 이는 Spg11+/+ 및 Spg11-/- 마우스의 피질에서 GD2 염색의 차이가 없는 것과 일치하였다 (도 5e). 전반적으로, 이들 데이터는 단순 강글리오사이드가 피질 유기관 모델로 대표되는 발달의 초기 단계에 시작하여, 인간 뉴런의 리소좀에 축적되었음을 보여준다.
실시예 10: 스파탁신 손실은 마우스에서 인지 결핍을 야기한다.
SPG11 환자의 증상은 일반적으로 인지 손상 및 정신지체를 포함한다. 따라서, Spg11 녹아웃 마우스가 인간에서 관찰되는 인지 결핍을 재현하는지를 조사하기 위해, 본 발명자들은 마우스를 Y자 미로 자발적 대체 시험에 적용하여, 임의의 인지 결핍을 평가하였다. 이러한 시험은 새로운 환경을 탐색하는 마우스의 경향성에 따르며, 공간 기억을 모니터링하는 데 사용된다 (Hughes, R. N., Neurosci Biobehav Rev, 2004) (도 19a). 첫 번째 단계 동안, 마우스를 미로의 개방된 갈림길만을 자유롭게 탐색할 수 있도록 하였으며, 마우스가 통과한 후에는 문을 폐쇄함으로써, 1분 동안 출입을 제한시켰다. 두 번째 단계 동안에는, 갈림길 둘 모두를 개방하고, 마우스를 미로의 입구에 배치하였다. 예상대로, Spg11+/+ 및 Spg11+/- 마우스는 약 75%의 시험에서 이미 탐색한 미로의 일부가 아니라, 새로운 환경인 미로의 미지의 갈림길을 탐색하는 것을 자연스럽게 선택하였다. 이와 달리, Spg11-/- 마우스는 6주령에 Spg11+/+ 마우스보다 미지의 갈림길에 진입하는 경향이 더 낮았고, 4개월 후, Spg11-/- 마우스는 진입 경험이 있는 갈림길과 미지의 갈림길 사이에 선호도를 나타내지 않았으며 (도 19b), 이는 녹아웃 마우스의 단기 공간 작업 기억이 변화되었음을 시사한다. 본 발명자들은 상이한 유형의 기억이 영향을 받았는지를 측정하기 위해, 중성 상태와 2회의 혐오적 전기 충격을 결합한 두려움 조건화 실험을 수행하였다. 부동성은 일반적으로 혐오 자극에 대한 반응인 스트레스성 행동을 반영한다. 부동성의 기준선은 월령이 증가함 따라 약간 증가하였지만, 본 발명자들은 녹아웃 마우스와 야생형 또는 이형접합 한배새끼 간에 유의한 차이가 없음을 관찰하였다. 2회의 전기 충격은 모든 그룹에서 부동성의 현저한 증가를 초래하였다 (도 19c). 그 다음 날, 야생형 및 이형접합 마우스가 전기 충격 없이 부동 자세로 보낸 시간의 백분율은 높았으며, 이는 상기 작업이 학습되었음을 시사한다. 이와 달리, Spg11-/- 마우스는 8개월 후부터 부동 자세에서 보내는 시간이 더 적었으며 (도 19d), 이는 녹아웃 마우스가 장기 정서적 기억 결핍을 나타냄을 시사한다.
실시예 11: 강글리오사이드 합성의 억제는 제브라피쉬 모델에서 Spg11 병리를 구제한다.
본 발명자들은 강글리오사이드 합성의 억제가 치료 전략이 될 수 있는지를 시험하였다. 강글리오사이드는 배아 단계에서 리소좀 내에 축적되므로, 본 발명자들은 스파탁신의 발현을 저하시키기 위해, 모르폴리노를 주입한 모델 제브라피쉬 유충을 사용하였다. zspg11 모르폴리노를 주입한 유충은 각각 주입하지 않은 유충 또는 미스매치 모르폴리노를 주입한 유충에서 거의 또는 전혀 관찰되지 않았던 운동성 손실 또는 마비를 특징으로 하는 운동 표현형을 나타내었다 (도 20a). 유충을 미글루스타트로 처리한 경우, 마비된 유충의 비율은 대조군에 비해 투여량 의존적 방식으로 유의하게 감소하였다. 이러한 데이터를 확인하기 위해, 본 발명자들은 접촉 유발 회피 반응 후, 유충이 이동한 거리를 모니터링하였다. zspg11 모르폴리노를 주입한 모펀트는 대조군 모르폴리노를 주입한 유충보다 유의하게 더 짧은 접촉 유발 회피를 나타내었다. 미글루스타트는 미스매치 모르폴리노를 주입한 모펀트에 아무런 영향을 주지 않았지만, 유충을 미글루스타트로 처리한 경우에는 이 표현형이 유의하게 교정되었다 (도 20b, 도 20c). 마지막으로, 미글루스타트의 이러한 작용이 강글리오사이드 합성에 대한 그 효과에 의존적인지를 시험하기 위해, 본 발명자들은 유충에서의 면역형광에 의해 GM2 강글리오사이드를 모니터링하였다. zspg11 모르폴리노를 주입한 제브라피쉬는 미스매치 모르폴리노를 주입한 유충보다 종뇌에서 더 강한 GM2 염색을 나타내었다. GM2 항체의 더 강한 염색은 미글루스타트로 처리된 유충에서 교정되었다 (도 20d, 도 20e). 종합하면, 이러한 데이터는 강글리오사이드의 합성을 억제하면, SPG11 병리의 제브라피쉬 모델의 운동 표현형이 개선된다는 것을 보여준다.
실시예 12: SPG4, SPG7 및 SPG11 환자 뇌에서의 GM2 강글리오사이드의 축적
본 발명자들은 강글리오사이드가 다른 형태의 HSP의 생리병리에 관련되어 있는지를 확인하였다. 본 발명자들은 SPG4 유전자 또는 SPG7 유전자에 돌연변이를 보유하는 2명의 환자의 뇌 피질을 검사하여, 이를 SPG11 병리가 발병한 환자 (문헌 [Denora et al, 2016])의 뇌 피질 및 61세에 급성 췌장염으로 사망한 신경계 질병이 동반되지 않은 환자와 비교하였다. 환자 FSP-SAL-PIR-625는 SPG4 유전자에서 이형접합 c.1215_1219del (p.Asn405LysfsX36) 돌연변이를 보유한다. 이 남성 환자는 59세에 방광암으로 사망하였다. 상기 남성 환자는 첫 증상이 25세에 발견되었고, 37세에는 보행 보조기구가 필요하였고, 48세에는 휠체어가 필요하였다. 임상적 검사에서 진행성 운동 결핍을 동반한 하지의 현저한 강직이 나타났다. 상지는 발병하지 않았지만, 양측 호프만 및 바빈스키 징후를 동반한 테트라피라미드로 증후군이 나타났다. 강직성 대마비 등급 척도는 55세에 43/52이었고, 58세에는 49/52로 증가하였다. 심부 감각은 저하되어, 43세에 최종적으로 제거되었다. 추체외로 또는 소뇌 징후는 발견되지 않았다. 뇌 및 중앙 MRI는 38세 및 55세에 현저하지 않았으며, 59세의 근전도 검사는 좌측 카피안 (carpian) 압박의 징후를 제외하면 정상이었다. 환자 AAR-247은 엑손 13에서 SPG7: c.1749G>C (p.Trp583Cys) 및 엑손 16에서 c.2181+2dup의 2종의 복합 이형접합 돌연변이를 보유하였다. 이 여성 환자는 56세에 췌장암으로 사망하였다. 첫 증상은 약 30세에서 발견되었으며, 불안정성 및 그 후 다리 결림을 동반하였다. 상기 여성 환자는 45세에 보행 보조기구가 필요하였고, 50세에는 휠체어가 필요하였다. 상기 여성 환자는 구음 장애를 나타내었고, 연하 곤란은 나타나지 않았다. 55세의 임상 평가에서 하지의 경증의 근위 운동 결핍 및 양측 바빈스키 징후를 동반한 테트라피라미드로 증후군으로서 하지 강직이 나타났다. 심부 감각이 손상되었다. 상기 여성 환자는 소뇌 증후군이 나타났으며, 이는 16.5/40 SARA 등급에 의해 제시되는 바와 같다. 안구 운동 검사에서 비대칭 하수증, 경련성 추종운동 및 수직 시선의 한계가 나타났다. 상기 환자가 40세 및 55세일 때, 수행된 뇌 MRI에서 소뇌 위축이 주로 충부에 발병한 것으로 나타났다. 근전도는 43세 및 55세에 두 차례 정상이었다. 55세에 신경심리학적 평가를 수행하였으며, 이 때, 인지능은 정상이었으나, 무감각증 및 우울증 징후가 나타났다.
4명의 개체의 운동 피질의 40 μm 두께의 절편을 항-GM2 항체로 염색하였다. Spg11 녹아웃 마우스의 피질에서 획득한 데이터와 일치하는 것으로, 본 발명자들은 SPG11 환자의 일부 뉴런이 GM2 항체로 강하게 염색된 것을 관찰하였다. 더 높은 배율 이미지에서 큰 소수포 내에 GM2가 존재하는 것으로 나타났다 (도 21). 본 발명자들은 SPG4 및 SPG7 환자의 피질에서 GM2 염색의 강도가 일부 뉴런에서 약간 증가한 것을 관찰하였다. 본 발명자들은 또한 더 높은 배율에서, GM2 염색이 큰 소수포 내에 집중되어 있음을 관찰하였다. 종합하면, 이러한 데이터는 GM2 강글리오사이드가 SPG4 환자 및 SPG7 환자의 뉴런에 축적되나, 이는 SPG11 환자에 비해 더 낮은 수준임을 시사한다. 이에 의해, 이들 환자들 간에 증상의 중증도 차이를 설명할 수 있다.
영향
본 발명자들의 데이터는 리소좀 내의 GM2 및 GM3 강글리오사이드의 축적을 포함하는 리소좀 기능의 초기 변화가 인간 유래 모델을 포함하여, SPG11 생리병리의 초기 단계에 기여한다는 것을 나타낸다. 본 발명자들은 강글리오사이드를 SPG11 병리의 진행을 방지하거나, 지연시키기 위한 추정 표적으로 확인하는 바이다. 강글리오사이드의 축적은 SPG11 환자에 국한되지 않고, SPG4 및 SPG7 환자의 뇌에서도 발견되며, 이는 강글리오사이드가 다양한 세포 경로에 영향을 미치는 유전자의 돌연변이에 의해 야기되는 다양한 형태의 HSP에서 치료 표적이 됨을 시사한다.
재료 및 방법
Spg11-녹아웃 마우스의 생성 및 사육
Spg11-녹아웃 마우스를 종래에 기재된 바와 같이 생성시켰다 (문헌 [Schnutgen et al., Nat Biotechnol. 2003 May; 21 (5): 562-5]). 마우스의 엑손 32에서 엑손 34에 해당하는 단편 (sv129 유전적 배경)을 인트론 34에 역 배향으로 삽입하고, 엑손 32에 c.6052C>T 및 c.6061C>T 치환을 삽입함으로써, 유전자 표적화 벡터를 작제하였다 (도 1a). MCI-129Sv/Pas ES 세포주를 생성된 작제물로 형질감염시키고, 서던 블로팅 및 PCR로 스크리닝하였다. 상종 재조합 클론을 배반포에 주입하였다. 키메라 마우스를 C57BL/6 암컷과 교배시켜, 생식선 전이를 획득하였다. Neo 선택 카세트를 flp-발현 마우스와 이종 교배하여 제거하였다. CMV 프로모터의 제어하에 Cre 재조합 효소를 발현하는 계열을 갖는 마우스를 이종 교배함으로써, 엑손 32-보유 종결 돌연변이의 비 편재 삽입을 수행하였다. 그 후, 이형접합 마우스를 10세대 동안 C57BL/6N 마우스와 역교배하였다.
5'-GCCAAGGTATGCACCAGACGGGG-3' (서열번호 1) 및 5'-TCCTGCCCTTCACCACGTCAGG-3' (서열번호 2) 프라이머에 의한 PCR에 의해 유전자형 분석을 수행하였다. 무효화된 대립 유전자 및 야생형 대립 유전자에 대해 각각 493 및 434 bp의 PCR 산물을 획득하였다. 마우스를 동성 그룹에 수용시켜, 12시간의 명/12시간의 암 주기를 유지하면서, 사료 및 물에 제한 없이 접근 가능하도록 하였다.
행동 평가
모든 행동 관련 절차는 오전 8:00와 오후 1:00 사이에 수행하였다. 마우스를 유전자형에 관계없이 무작위로 실험용 코호트에서 시험함으로써, 편향성을 최소화되었다. 발/바닥 각도 (FBA)를 측정하기 위해, 마우스를 암소 상자 및 일반 사료로 이어지는 평행한 복도를 보행하도록 훈련하였다. 마우스를 4회의 보행 동안 파나소닉 풀 HD 카메라 HC-V720 (Panasonic Full HD Camera HC-V720)으로 개별적으로 촬영하였다. 뒷발의 발가락 끝 위치에서의 FBA를 기록된 것으로부터 단일 비디오 프레임을 사용하여, ImageJ로 측정하였다. 4x 16 cm 트레드밀 (CleverSys)이 포함된 플라스틱 챔버로 구성된 장치에 의해, 트레드밀 시험을 수행하였다. 마우스를 10 cm.s-1의 제어 속도에서 개별적으로 시험하였다. 1분간의 습관화 단계 후에, 마우스의 보행을 20초 동안 기록하였다 (80 프레임/s, BCam). 보행을 GaitScan 소프트웨어 (CleverSys)로 분석하였다. 운동 협응 및 평형을 로타로드 장치 (가속 모델 LE8200, Bioseb)로 평가하였다. 마우스를 4 rpm의 시작 속도의 가속 로드 상에 배치하였다. 5분 내에 40 rpm의 최종 속도에 도달하였다. 마우스를 2일 연속으로, 시험 간에 15분의 간격을 두어 1일 5회 시험하였다. 마우스가 로드 위에서 유지하는 시간을 기록하였다. Y자 미로 및 두려움 조건화 시험을 사용하여, 인지 기능을 모니터링하였다. Y자 미로는 동일한 거리만큼 분리된 동일한 길이의 3개의 투명한 갈림길로 구성되어 있다 (40 cm 길이, 20 cm 높이, 10 cm 폭, 120°). 시각적 신호를 실내에 배치한다. 미로의 한쪽 갈림길 (갈림길 B)을 불투명한 이동식 칸막이에 의해 차단하고, 마우스를 미로의 중심을 향하는 장치의 시작 갈림길 (갈림길 A)에 개별적으로 배치하였다. 마우스를 미로 내로 자유롭게 보행할 수 있도록 하였다. 개방된 갈림길 (갈림길 C)의 끝 부분에 도착했을 때, 칸막이를 원위치에 두어, 마우스를 유지시켰다. 1분 후 마우스를 시작 갈림길에 즉시 다시 배치하고 (갈림길 A), 칸막이를 제거하여, 2가지 선택을 제공하였다. 교대는 진입 경험이 없는 갈림길 (갈림길 B)로의 자발적 진입으로 정의하였다. 이와 달리, 이미 탐색한 갈림길 (갈림길 C)로의 재진입은 오류로 간주하였다. 상황 두려움 조건화를 흡음 박스 (Fear Conditioning Systems Series 46000, Ugo Basile SRL Comerio Italy)에 설치된 플렉시글라스 챔버 (Plexiglas chamber) (17 x 17 x 25 cm)에서 수행하였다. 챔버의 벽은 이동식 바둑판 형태로 도포되어 있다. 챔버 바닥은 신호 변환 충격 발생기에 연결된 스테인리스 강철 격자 바닥 (2 mm 직경 및 1 cm 간격의 로드)으로 구성된다. 훈련 상황에 마우스를 배치하여 훈련을 시작했으며, 처음 120초 동안 부동성 기준선을 등급화하였다. 그런 다음, AnyMaze 소프트웨어의 제어하에 2회의 전기 충격 (2초, 60초 간격의 0.62 mA)을 전달하였다. 훈련 기간의 종료는 120초의 시간으로 이루어졌으며, 그 동안 부동성을 기록하였다. 훈련 후, 24시간째에 상황 두려움 조건화를 시험하고, 마우스를 훈련 챔버로 복귀시켰으며, 전기 충격 없이 180초 동안 부동성을 등급화하였다.
항체
연구에 사용된 항체는 다음과 같다: 토끼 항-스파탁신 (단백질 Tech); 토끼 항-스파스티진 (문헌 [Murmu et al, 2011 Mol Cell Neurosci. 2011 Jul;47(3):191-202]); 마우스 항-α-튜불린 (Abcam); 마우스 항-NeuN (Millipore); 토끼 항-GFAP (DAKO); 단일클론 마우스 항-칼빈딘, 1:300, (Swant); 랫트 항-Lamp1 (클론 1D4B), 마우스 항-Lamp1 (클론 H5G11; Santa Cruz Biotechnologies), 마우스-항-클라트린 (mouse-anti-clathrin) (클론 X-22, Abcam; 클론 23, BD Biosciences), 토끼 항-Pax-6 (Covance), 토끼 항-sox2 (Millipore), 마우스 항-oct4 (Santa Cruz biotechnology), 마우스 항-Tra1-60 (Millipore), 토끼 항-PIP5K1B (Proteintech), 토끼 항-다이나민1 (rabbit anti-dynamin1) (Abcam), 마우스 항-GRP78 (BD Biosciences), 마우스 항-p62 (Abcam); 토끼 항-카텝신 D (Abcam); 토끼 항-LC3 (Novus Biologicals); 토끼 항-v-Glut1(Synaptic Systems), 마우스 항-β-III 튜불린 (clone TUJ1, Covance), 마우스 항-GM2 (문헌 [Dobrenis et al, 1992; Natoli et al, 1986]) (도브레니스 (Dobrenis) 박사 제공) 및 마우스 항-GM3 (Cosmo Bio), 마우스 항-GD2 (Millipore), 및 마우스 항-GD3 (Invitrogen). 면역 블로팅을 위해, 2차 항체를 양 고추냉이 퍼옥시다제 (Jackson Laboratories) 또는 형광 색소 (IR-염료 800 또는 IR-염료 680; LI-COR)에 접합시켰다. 면역형광에 사용된 2차 항체는 Life Technologies로부터 제공되었다.
면역조직화학적 분석
마우스를 인산염 완충 식염수 (PBS) 중의 1/6 2% 자일라진 (Rompun), 1/3 케타민 (10 mg.ml-1, Imalgen 1000)의 복막내 주입에 의해 마취시키고, PBS 중 4% 파라포름 알데하이드의 심장내 관류에 적용하였다. 뇌를 해부하고, 4% 파라포름알데하이드에서 24시간 동안 배양하여, 사후 고정시켰다. 뇌 절편 (20 μm)을 동결 마이크로톰 (Microm HM450, Thermo Scientific)에서 절단하고, 4℃에서 PBS 중 0.02% 아지드화나트륨 중에 유지시켰다. 블로킹 용액에서 90분 인큐베이션 후, 절편을 4℃에서 밤새 PBS 중의 2% BSA/0.25% Triton X-100 중의 1차 항체와 인큐베이션하였다. 세척 후, 절편을 실온에서 90분 동안 2차 항체와 인큐베이션하고, Fluoromount-G 봉입제 (Southern Biotechnology)에서 봉입시켰다. 1차 항체의 부재하에 인큐베이션시킴으로써, 염색 특이성을 측정하였다. 20x 대물렌즈가 장착된 NanoZoomer 2.0-RS (Hamamatsu)로 이미지를 획득하였다. ImageJ 소프트웨어에 의해, 각각의 1차 운동 피질 층의 뉴런 및 별아교세포의 수를 측정하였다. 전 그룹에 동일한 밝기, 콘트라스트 (contrast) 및 컬러 밸런스 (color balance) 조정을 적용하였다. 60x 대물렌즈가 장착된 Olympus FV-1000 공초점 레이저 주사 현미경으로 공초점 이미지를 획득하였다. 488 nm 레이저로 여기시킴으로써, 자가형광성을 발생시켰다.
리피도믹 분석
6주령의 Spg11-/- 마우스 및 Spg11+/+ 마우스의 대뇌 피질을 종래에 기재된 바와 같이 처리하고, 분석하였다 (문헌 [Seyer et al, Metabolomics. 2016;12:91]). 액체 크로마토그래피-고 분해능 질량 분광분석 후, 포함 목록을 사용하여, 표적 모드로 설정된 장치에 의한 음이온 모드의 고 에너지 충돌 해리 (HCD) 텐덤 질량 분광분석 실험 (MS/MS)을 위해, 샘플을 다시 주입하였다. 단리 폭을 m/z 0.4로 설정하고, 충돌 에너지를 26%로 정규화하였으며, 질량분석 분해능을 m/z 200에서 17,500 FWHM으로 설정하였다. HCD 질량 스펙트럼을 수동으로 검사하여, 강글리오사이드 종류의 동일성을 확인하였다.
리소좀 분획
종래에 기재된 자체 생성 Percoll 구배 프로토콜 (문헌 [Graham J.M., Curr Protoc Cell Biol, 2001])에 따라 8개월령의 동물의 전체 뇌로부터 리소좀-다함유 분획을 정제하였다 (도 15a). 프로토콜의 끝 부분에서, 리소좀-다함유 분획을 PBS에서 1회 세척하고, BCA 키트 (Pierce)에 의해 단백질을 정량화하였다. 웨스턴 블롯을 종래에 기재된 바와 같이 수행하였다 (문헌 [Esteves T. et al., The American J of Human Genetics, 2014]). 리소좀-다함유 분획을 Folch 절차 (문헌 [Folch J. et al., J Biol Chem, 1957])에 따라 추출하였다. 강글리오사이드를 포함하는 탈염된 Folch 상부 상 (수성 상)을 음이온화 모드에서 고분해능 질량 분광분석기 (LC-HRMS)와 연동된 액체 크로마토그래피로 분석하여, 탈양성자화된 1가 음이온[M-H]-및 2가 음이온[M- 2H]2-을 검출하였다. 데이터를 종래에 기재된 바와 같이 처리하고, 분석하였다 (문헌 [Seyer A. et al., Metabolomics, 2016]). 각각의 지질의 상대량은 크로마토그래피 피크의 면적으로 정량화하였고, 이를 각각의 리소좀-다함유 분획의 단백질 농도로 정규화하였다. 리소좀 분획을 자체 생성 Percoll 구배를 사용하여 추가로 분리하였다. 리소좀 분획을 Percoll에 의해 혼합하여, 50% Percoll (v:v) 용액을 획득하고, 20,000 g에서 90분 동안 원심분리하였다. 동량의 8개의 분획을 상부로부터 수집하고, 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
뉴런의 1차 배양
마우스 피질 뉴런의 1차 배양물을 배양 2일째로부터 미글루스타트 (Tocris)로 처리하였다. 배지를 3일마다 교체하였다. 종래에 기재된 바와 같이 (문헌 [Murmu et al., 2011]), 시험관내에서 배양한지 6일 후에 면역염색을 수행하였다. GM3 합성효소 발현을 하향조절하기 위해, Block-it 키트 (Life Technologies)를 사용하여, miRNA를 발현하는 벡터를 생성하였다. miRNA 서열은 다음과 같다: ATGTACAGGAGCCAGACTCCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGGAGTCTCTCCTGTACAT (miRNA GM3S-1) (서열번호 3), ATAACAGAGCCATAGCCGTCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGACGGCTGGCTCTGTTAT (miRNA GM3S-2) (서열번호 4), TCTACAGAGCCGATCTGCTTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAAGCAGAGGCTCTGTAGA (miRNA Neu1-1) (서열번호 5) 및 CTACGATGAAGGCTGTAGAGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCTCTACACTTCATCGTAG (miRNA Neu1-2) (서열번호 6). Neon 형질감염 시스템 (Life Technologies)을 사용하여 miRNA 및 GFP를 발현하는 벡터로 뉴런을 형질감염시켰다. NIH-3T3 세포를 형질 감염시키고, 제조사의 지시에 따라, LightCycler 480 장치 (Roche)를 사용하여 정량적 RT-PCR을 수행함으로써, miRNA 서열의 효율을 확인하였다. 종래에 기재된 바와 같이 (문헌 [Murmu R.P. et al., Mol Cell Neurosci, 2011]), 시험관내에서 배양한지 6일 후에 면역염색을 수행하고, 대물렌즈 Plan-Apochromat 63x (N.A. 1.4)가 장착된 Apotome2 현미경 (Zeiss) 또는 Olympus FV-1000 공초점 현미경을 사용하여, 이미지를 획득하였다. General Intensity Measurement 프로토콜을 사용한 자동 ArrayScan XTI 장치 (Thermo-Fisher) 또는 Nikon Eclipse Ti-U 현미경으로 얻은 이미지의 ImageJ에 의해, 강글리오사이드 수준의 정량화를 수행하였다. 200μM 글루탐산염 (Sigma-Aldrich)을 배양 배지에 첨가하여 뉴런 사멸을 유도하였다. 리소좀과 강글리오사이드 염색의 공동 위치화를 ImageJ를 사용하여 정량화하였다. 마스크를 Lamp1 염색 채널로부터 제조하고, 해당 강글리오사이드 형광을 모든 세포에서 총 강글리오사이드 형광의 백분율로서 정량화하였다. 200 μM 글루탐산염 (Sigma-Aldrich)을 배양 배지에 첨가하여 뉴런 사멸을 유도하였다. 뉴런 사멸을 정량화하기 위해, 글루탐산염 처리 30시간 후, 모든 뉴런을 100 nM 세포 추적기 Deep Red (Life Technologies)로 표지하고, 사멸 세포를 프로피디움 요오드화물 (5 μM)로 표지하였다. 대안적으로, 글루탐산염 처리 30시간 후, 뉴런을 4% 파라포름알데하이드에 고정시키고, Tuj-1 항체로 면역염색시켰다. 웰 당 Tuj-1 양성 세포의 수를 구획 분석 프로토콜을 사용하여 자동 ArrayScan XTI 장치 (Thermo-Fisher)로 정량화하였다. 뉴런 사멸을 글루탐산염 처리 및 비 처리 뉴런을 비교하여 정량화하였다.
iPS의 세포 재 프로그래밍, 특성화 및 분화
3명의 건강한 여성 대상체 및 3명의 SPG11 여성 환자로부터 피부 생검을 수집하였다. 에피솜 벡터를 사용하여 OCT3/4, L-MYC, SOX2, KLF4 및 LYN28의 일시적인 발현에 의해 섬유아세포를 iPS 세포로 재 프로그래밍하였다. iPS 세포를 완전한 E8 배지 (Life technologies)에서 Geltrex 지지체 상에서 배양하였다. iPS 세포의 전능성을 평가하기 위해, 이를 배아체 (EB)로 분화시켰다. iPSc 클론을 콜라게나제 처리에 의해 수집하고, FGF2의 부재하에 E8 배지에 재현탁시켰다. 2주 후, EB를 폴리오르니틴 (20 μg/ml) 및 라미닌 (10 μg/ml)-코팅된 커버슬립에 플레이팅하고, 추가로 7일 동안 인큐베이션하였다. 외배엽 (Nestin, Millipore), 중배엽 (α-평활근 액틴, Abcam) 및 내배엽 (α-태아단백질, Cell Signaling)의 3개의 배엽층에 대한 마커로 EB를 평가하였다. iPS 세포 및 EBS를 또한 실시간 qPCR 분석 (TaqMan hPSC Scorecard Panel, Life Technologies)으로 분석하여, 전능성 마커의 발현을 확인하였다. iPS 세포를 전뇌 신경 전구세포로 분화시킨 후, 피질 뉴런의 농축된 집합으로 분화시켰다. 뉴런을 7주 동안 성장시키고, 고정시켜, 면역염색을 위해, 처리하였다. Zeiss apotome 시스템 (AxoVision LE Rel 4.5)으로 이미지를 획득하였다. ImageJ를 사용하여, 리소좀과 GM2 또는 GM3 염색의 공동 위치화를 정량화하였다. 대안적으로, iPS 세포를 종래에 기재된 프로토콜 (문헌 [Pasca A.M.et al., Nat. Methods 2015])에 따라, 뇌 유기관으로 분화시켰다. 시험관내에서 90일 후에, 유기관을 4% 파라포름알데하이드에서 24시간 동안 고정시키고, -80℃에 저온 보존하여 저장하였다. 유기관 절편 (12 μm)을 저온 유지 장치 (LEICA_CM3050S)에서 절단하고, 마우스 뇌 절편에 대해 기재된 바와 같이, 면역염색을 위해, 처리하였다. 60x 대물렌즈 (NA 1.4)가 장착된 Leica SP-8 공초점 현미경을 사용하여, 이미지를 획득하였다. 마우스 뇌 절편에 대해 강글리오사이드 축적의 정량화를 수행하였다.
전자 현미경
표준 전자 현미경 분석을 위해, SPG11 환자로부터 얻은 전두엽 피질의 포르말린-고정 샘플 (문헌 [Denora et al, Brain. 2016 Jun;139(Pt 6):1723-34])을 탈 파라핀화하고, pH 7.4의 0.1 M 인산염 완충액 중 2% 글루타르알데하이드에서 추가로 24시간 동안 인큐베이션하여, 고정시켰다. 마우스 운동 피질의 샘플을 1% 글루타르알데하이드로 인큐베이션하여 고정시켰다. 그런 다음, 샘플을 2% 사산화오스뮴에 후 고정시키고, 탈수시켜, Araldite에 포매시켰다. 사전-포매 면역조직화학을 또한 수행하였다. Ultrathin 절편을 절단하고, 아세트산우라닐 및 시트르산납로 염색하여, Hitachi 투과 전자 현미경으로 조사하였다. 이미지를 ImageJ로 분석하여, 각 절편의 리소좀의 수뿐만 아니라, 세포질 및 리소좀의 표면을 정량화하였다.
웨스턴 블롯 분석
세포 또는 조직을 실온에서 5분 동안 100 mM NaCl, 10 mM Tris HCl pH 7.4, 1　mM EGTA, 2 mM MgCl2, 1% SDS 및 Halt™ 프로테아제 억제제 Cocktail (Thermo Scientific)에서 인큐베이션시킴으로써, 용해시켰다. 웨스턴 블롯을 수행하고, 신호를 화학발광 기질 (SuperSignal West Dura)로 가시화하거나, Odyssey ClX (Li-COR)로 획득하였다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 신호 강도를 정량화하였다.
제브라피쉬 모델링
제브라피쉬에서의 Spg11 병리의 모델링을 종래 기재된 바와 같이 (문헌 [Martin, 2012]), 수행하였다. zspg11의 녹다운을 스플라이싱 공여 부위인 zspg11spl (5'-ACCAATCATAGCGTCTCGTACCCTC-3'-서열번호 88)을 표적화하는 모르폴리노를 사용하여 수행하였다. 모르폴리노 독성 또는 주입으로 인한 비특이적인 효과로부터 zspg11의 녹다운에 기인한 특정 표현형 효과를 구별하기 위해, 5개의 미스매치 뉴클레오타이드를 포함하는 대조군 모르폴리노 mmzspg11spl (5'-ACgAATgATAGCcTCTCGTAgCgTC-3'-서열번호 89)을 사용하였다. zspg11spl 또는 mmzspg11spl의 1.2 mM 용액 1 nl을 1 내지 2의 세포 단계 배아의 난황에 주입하였다. 주입 후, 대조군의 경우, 배아를 DMSO 또는 100 또는 300 uM의 미글루스타트 (Tocris Bioscience)를 포함하는 E3 배지에서 28℃로 유지시켰다. 24 hpf에서 이를 미세 포셉 (forcep)을 사용하여 수작업으로 장막을 제거하였다. 48 hpf에 배아 형태가 관찰되었다. 운동 활성을 정량화하기 위해, 본 발명자들은 종래에 기재된 바와 같이 (문헌 [Martin, 2012]), 명백한 발달 이상이 없는 어류에서 수정 후 48시간째에 접촉 유발 회피 반응을 모니터링하였다. 이미지를 초당 500 이미지로 획득하였다. Image J 수동 추적 플러그인 (plugin)을 사용하여 접촉 유발 회피 반응 추적을 수행하였다. 실온에서 2시간 동안 PBS 중의 4% 파라포름알데하이드에 고정된 48 hpf 배아를 사용하여 전체 봉입 생체내 면역조직화학법에 의해, GM2 강글리오사이드 수준의 평가를 수행하였다. 배아를 PBS-0.1% Triton X-100 (PBST)에서 3회 (각각 5분) 세척하였다. 1% DMSO 및 1% Triton X-100 (PBDT)을 포함하는 PBS 중의 5% 정상 염소 혈청에서 배아를 1시간 동안 블로킹한 다음, GM2 1차 항체를 포함하는 블로킹 용액에서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 실온에서 PBST에서 4회 세척한 후, 배아를 Alexa-488 (Thermo Fishser)에 연계된 항 IgM 항체와 PBDT에서 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 관찰 전에, 배아를 PSBT에서 3회 세척하고, 한 방울의 Fluoromount™ 수성 봉입제 (Sigma Aldrich)에 봉입하였다. 전체 봉입 배아를 공초점 현미경 (Leica SP8, 40X, NA 0.8)에서 촬영하였다. 정량화의 잠재적인 편향성을 최소화하기 위해, 유충을 이미지 포착시화 동일한 위치에 배치하였다. 이미지 스택 (Image stack)을 0.35 μm의 스텝 크기로 수집하였다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여, z-스택의 최대 강도 투사를 종뇌에서 형광을 정량화하기 위해, 사용하였다. 형광 강도의 평균 및 분산을 100 픽셀당 100 픽셀의 정사각형으로 각 모펀트에 대해 정량화하였다.
환자 뇌의 면역세포화학법
3명의 발병 환자 (SPG4, SPG7 및 SPG11) 및 1명의 비 신경계 환자로부터의 전두엽 피질을 포르말린에 고정시켰다. 조직 절편을 비브라톰 (vibratome) (40 μm)에서 절단하고, 인산염 완충 식염수 용액 (PBS) 중에 수집하였다. 0.1% Triton™ X-100 (Sigma), 10% 메탄올 및 0.003% H2O2를 포함하는 PBS 중에서 실온에서 20분 동안 인큐베이션시킴으로써, 내인성 퍼옥시다제를 켄칭 (quenching)시켰다. 뇌 절편을 PBS로 3회 세척하고, 실온에서 1시간 동안 블로킹 용액 (PBS, 0.4% Triton X-100, 4% 정상 염소 혈청, 2% 소 혈청 알부민)에서 인큐베이션하였다. 절편을 동일한 블로킹 용액에서 1/150으로 희석된 항-GM2 IgM과 4℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 절편을 PBS로 3회 세척하고, 블로킹 용액으로 희석한 항-IGM 바이오티닐화 2차 항체 (1:200)와 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 기질로서 3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드 (DAB Metal Concentrate; Biogenex)에 의한 ABC 증폭 시스템 (Vectastain ABC 키트, Vector Laboratories)을 사용하여, 결합된 항체를 가시화였다. 절편을 에탄올 및 크실렌 용액에서 2회 탈수시키고, Eukitt로 봉입시켰다.
통계
데이터가 정상적으로 분배되었는지를 측정하기 위해, 콜모고로프 스미르노프 분석 (Kolmogorov-Smirnov analysis)을 먼저 수행하였다. 비모수적 데이터의 클러스컨-월리스 검정 및 모수적 데이터의 양방향 스튜던트 t-검정 또는 일원 ANOVA를 사용하여 데이터 세트를 비교하였다. 0.05 이하의 P 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 리피도믹 데이터를 log10 변환 후 R 소프트웨어의 표준 비모수 검정에 의해 분석하였다. 유전자형 간의 차이점은 맨-위트니 검정으로 평가하였다. 0.1 이하의 P 값을 통계적으로 유의 한 것으로 간주하였다.
윤리적 승인
동물의 관리 및 처리는 실험 동물의 수용, 사용 및 윤리적 처우에 관한 유럽 법 (N° 2010/63/UE) 및 국가적 (Ministere de l'Agriculture, France) 지침에 따랐다. 모든 동물 실험은 지역 윤리위원회 (Ce5/2012/045 승인 번호)의 승인을 받았으며, 공인 인력에 의해 수행되었다. 환자 유래 물질은 윤리위원회에서 승인한 절차를 통해, 가족의 정보 근거 서면 동의 하에 획득된 것이다 (인간 피질 샘플에 대한 승인 SST04/11/04052011; 피부 생검에 대한 승인 RBM-1-029).
SEQUENCE LISTING <110> ICM(INSTITUT DU CERVEAU ET DE LA MOELLE EPINIERE) SORBONNE UNIVERSITE CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE INSERM(Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale) ASSISTANCE PUBLIQUE-HOPITAUX DE PARIS ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES <120> INHIBITORS OF GANGLIOSIDES METABOLISM FOR THE TREATMENT OF MOTOR NEURON DISEASES <130> IPA190575-FR <150> EP 16197362.3 <151> 2016-11-04 <160> 89 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Genotyping primer forward <400> 1 gccaaggtat gcaccagacg ggg 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Genotyping primer reverse <400> 2 tcctgccctt caccacgtca gg 22 <210> 3 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA GM3S-1 <400> 3 atgtacagga gccagactcc agttttggcc actgactgac tggagtctct cctgtacat 59 <210> 4 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA GM3S-2 <400> 4 ataacagagc catagccgtc tgttttggcc actgactgac agacggctgg ctctgttat 59 <210> 5 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA Neu1-1 <400> 5 tctacagagc cgatctgctt cgttttggcc actgactgac gaagcagagg ctctgtaga 59 <210> 6 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA Neu1-2 <400> 6 ctacgatgaa ggctgtagag ggttttggcc actgactgac cctctacact tcatcgtag 59 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 7 ggguuauucu gaacauguut t 21 <210> 8 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 8 gaagacccag cttgttaatg tgtgctgtcc attaacaagc tgggtcttct tttt 54 <210> 9 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 9 gccaatgatt tgttcgttag tgtgctgtcc taacgaacaa atcattggct tttt 54 <210> 10 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 10 atcacttctc agtttcacat 20 <210> 11 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 11 gctttgagct cgggtgtacc 20 <210> 12 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 12 ggccttctca tcttgctttg 20 <210> 13 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 13 tcttttaata acaagctggg 20 <210> 14 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 14 ggatgtcttt taataacaag 20 <210> 15 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 15 aacacaagca atgtacattt 20 <210> 16 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 16 tccacactcc aaacacaagc 20 <210> 17 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 17 ttacatggtc agggtccaca 20 <210> 18 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 18 tctgagctct ctttacatgg 20 <210> 19 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 19 aagacttgct gagcatattt 20 <210> 20 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 20 acattccttc tgcaagactt 20 <210> 21 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 21 ggcaaacttg ggacgacatt 20 <210> 22 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 22 tctgcacaaa agggagtaag 20 <210> 23 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 23 ttactggaga acttccggaa 20 <210> 24 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 24 ggactttact ggagaacttc 20 <210> 25 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 25 agtattcctc cgcttccaat 20 <210> 26 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 26 aatccgtgca gtattcctcc 20 <210> 27 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 27 actgtttaac cttatcacaa 20 <210> 28 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 28 tatccctcaa ctggtgcact 20 <210> 29 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 29 gtagttttat ttccaacatg 20 <210> 30 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 30 agtcatcctt atagtagttt 20 <210> 31 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 31 tgaaatcaac actcttaaat 20 <210> 32 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 32 ttgaagccag ttgaaatcaa 20 <210> 33 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GM3 synthase <400> 33 tttaccattg cttgaagcca 20 <210> 34 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 34 cccagaatgg cagggtttcc 20 <210> 35 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 35 acctgcttcc aaaagaagag 20 <210> 36 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 36 ctgccacctg cttccaaaag 20 <210> 37 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 37 tttttctgcc acctgcttcc 20 <210> 38 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 38 tttggctgca gtgggatttt 20 <210> 39 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 39 tggattcaaa atcctgaaat 20 <210> 40 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 40 tctgagtact gaaggatgtc 20 <210> 41 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 41 gaggctctga gtactgaagg 20 <210> 42 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 42 tgactgaggc tctgagtact 20 <210> 43 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 43 atctcggccc cagaaccttg 20 <210> 44 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 44 tgcatggtct gaaagttcat 20 <210> 45 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 45 accagcttta agaggaactt 20 <210> 46 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 46 tttcaccact ccctctttga 20 <210> 47 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 47 tttctgtgtt caaaattcac 20 <210> 48 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 48 agagttgcat tttcaactga 20 <210> 49 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 49 ctgtcaaaaa cagctctcag 20 <210> 50 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 50 tatctgcagg atggagaaat 20 <210> 51 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 51 acatgagctg cacttcaaag 20 <210> 52 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 52 ccaattcaat tcttaagttt 20 <210> 53 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 53 gttacataca attctctttg 20 <210> 54 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 54 gcagaagttt tacaaattaa 20 <210> 55 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 55 caaaagagtg acctcccctc 20 <210> 56 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 56 caccatcaaa agagtgacct 20 <210> 57 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 57 aatgaggttc agggccacca 20 <210> 58 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 58 tcacaccaag cagcgcagca 20 <210> 59 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 59 ggatcctccg tgggtcacac 20 <210> 60 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 60 atcctgggag tggatcctcc 20 <210> 61 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 61 gctacggagc acgtcatcct 20 <210> 62 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 62 gcagacccag tatcagcagc 20 <210> 63 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 63 gccgctgcat cgcagaccca 20 <210> 64 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 64 ccctggttgg ttctcgagtc 20 <210> 65 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 65 cctccaggac agcttccctg 20 <210> 66 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 66 tatgtccctc tccgaccagg 20 <210> 67 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 67 tcacctcaga cagacactgg 20 <210> 68 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 68 agggtgtact ctcccatgac 20 <210> 69 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 69 gtgtttccca aaacattatt 20 <210> 70 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 70 tttataatac tgggaagatt 20 <210> 71 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 71 ggtatacacc gccaggtagg 20 <210> 72 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 72 atccatataa caggcacatg 20 <210> 73 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 73 cttcctatct cacctgtttc 20 <210> 74 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 74 acagcaggaa atttgttggt 20 <210> 75 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 75 ggtagatgac tgaatcatgg 20 <210> 76 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 76 gtgacatggt agatggacac 20 <210> 77 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 77 gctgcagtaa tgaaggcggg 20 <210> 78 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 78 cggtgtaggt ctgcagagtc 20 <210> 79 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 79 cagtagtcac cttctgactg 20 <210> 80 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 80 gcactgagtt ctagaggaga 20 <210> 81 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 81 accaagagca gtgcactgag 20 <210> 82 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 82 tgccacttac tgtagccagc 20 <210> 83 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 83 actgtttaac ctatttaaat 20 <210> 84 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 84 cacttggcat tgctgtttct 20 <210> 85 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 85 ccttcaggag ctctaagata 20 <210> 86 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 86 agctctcttc tgactgtgac 20 <210> 87 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iRNA GM3 synthase <400> 87 gcactgagtt cttatcacaa 20 <210> 88 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> zspg11spl primer <400> 88 accaatcata gcgtctcgta ccctc 25 <210> 89 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mmzspg11spl primer <400> 89 acgaatgata gcctctcgta gcgtc 25

Claims (12)

  1. 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제를 포함하는 운동 뉴런 질병의 치료에 사용하기 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 강글리오사이드 대사 억제제는 유기 소분자, 항체, 길항제, 억제제 지지체(inhibitor scaffold), 앱타머 (aptamer), 리보자임, 펩타이드, 화학적 샤페론 (chemical shaperone), 리보핵산 간섭 (RNAi), 올리고뉴클레오타이드 안티센스, 소 간섭 RNA (siRNA), 안티센스 RNA (asRNA), 모르폴리노 (morpholino) 및 조작된 뉴클레아제를 포함하는 군으로부터 선택되는, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 강글리오사이드 대사 억제제는 바람직하게는 이미노 당, D-트레오-1-페닐-2-데카노일아미노-3-모르폴리노-프로판올 (PDMP)의 유사체, 세라마이드 유사체, 카복사미드, 카바메이트, 글리코사이드 가수분해효소 샤페론을 포함하는 군으로부터 선택되는 글루코실세라마이드 합성효소의 억제제인, 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 글루코실세라마이드 합성효소의 억제제는 N-부틸데옥시노지리마이신 (NB-DNJ), 퀴누클리딘-3-일 (2-(4'-플루오로-[l,-바이페닐]-3-일)프로판-2-일)카바메이트 (GZ161), N-[(1R,2R)-1-(2,3-디하이드로-1,4-벤조디옥신-6-일)-1-하이드록시-3-(1-피롤리디닐)-2-프로파닐]옥탄아미드, N-(5-아다만탄-1-일-메톡시펜틸) 데옥시노지리마이신 (AMP-DNJ); N-부틸-1-데옥시-노지리마이신 (KTB-DNJ); N-에틸-1-데옥시노지리마이신 (NE-DNJ); N-부틸데옥시만노직사마이신; N-5-카복실-1-데옥시노지라마이신; N-도세실-1-데옥시노지리마이신; 노지리마이신 바이술페이트; 노직시마이신-1-술폰산; N-(n-노닐)-1-데옥시노지리마이신; N-(7-옥사데실)-1-데옥시노지리마이신; N-(7-옥사-9,9,9,-트리플루오로노닐)-1-데옥시노지리마이신; (2R,3S,4R,5S)-2-(하이드록시메틸)-3,4,5-피페리딘트리올; N-부틸데옥시갈락토노지리마이신 (NB-DGJ); N-(n-노닐)데옥시노지리마이신; (3S,4S)-3-(하이드록시메틸)피롤리딘-3,4-디올 (이소LAB); 1,4-디데옥시-1,4-이미노-D-아라비니톨, (2S,3R,4S,5R)-3,4,5-트리하이드록시-6-옥소피페리딘-2-카복실산, D-글루카로-델타-락탐, 1,4-디데옥시-2-하이드록시메틸-1,4-이미노-D-트레이톨; (2S,3S,4R)-2,4-비스(하이드록시메틸)피롤리딘-3,4-디올, 이소DGDP, D-트레오-1-페닐-2-데카노일아미노-3-모르폴리노-프로판올 (PDMP); PDMP의 거울상이성질체, L-트레오-및 DL-에리트로-1-페닐-2-아미노-1,3-프로판디올, D-트레오 (R,R) 거울상이성질체; 1-페닐-2-팔미토일아미노-3-모르폴리노-1-프로판올; 1-페닐-2-팔미토일아미노-3-피롤리디노-1-프로판올 (P4), D-트레오-1-에틸렌디옥시페닐-2-팔미토일-3-피롤리디노-프로판올 (EtDO-P4); DL-트레오-1-페닐-2-팔미토일아미노-3-피롤리디노-1-프로판올 (DL-트레오-P4); 2-(2,3-디하이드로-1H-인덴-2-일)-N-((1R,2R)-1-(2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-일)-1-하이드록시-3-(피롤리딘-1-일)프로판-2-일)아세트아미드; N-((1R,2R)-1-(2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-일)-1-하이드록시-3-(피롤리딘-1-일)프로판-2-일)노난아미드; BML-119; IV-231B, (S)-퀴누클리딘-3-일 (2-(2-(4-플루오로페닐)티아졸-4-일)프로판-2-일)카바메이트 (S)-2-하이드록시숙시네이트 (GZ 452), 퀴누클리딘-3-일 (2-(4'-플루오로-[1,-바이페닐]-3-일)프로판-2-일)카바메이트, (1R,2R)-옥탄산[2-(2',3'-디하이드로-벤조[1,4]디옥신-6'-일)-2-하이드록시-1-피롤리딘-1-일메틸-에틸]-아미드-L-타르타르산, EXEL-0346, 이소파고민, 트랜스-4-(2-아미노-3,5-디브롬벤질아미노)-사이클로헥산올, 5-(4-클로로페닐)-6-에틸-2,4-피리미딘디아민, (3R,4R,5R)-5-(하이드록시메틸)-3,4-피페리딘디올, 암브록솔, 이미글루세라제,), α-호모갈락토노지리마이신, α-호모알로노지리마이신, β-1-C-부틸-DGJ, N-노닐-DNJ를 포함하는 군으로부터 선택되는, 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 강글리오사이드 대사 억제제는 GM3 합성효소의 억제제인, 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 GM3 합성효소의 억제제는 바람직하게는 서열번호 3, 서열번호 4 및 이들의 기능 유지 변이체로부터 선택되는 miRNA인, 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 GM3 합성효소의 억제제는 시티딘 모노포스포-N-아세틸뉴라민산의 탄소-연결 유사체인, 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 경구, 국소, 경피, 근육내, 피하, 정맥내, 비경구, 비강내 투여에 의해 투여되어야 하는, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 운동 뉴런 질병은 (예를 들어, 말초 신경병증 발현 HSP와 같은) 유전성 강직성 대마비 (HSP), 유전성 강직성 대부전마비, 가족성 강직성 대마비, 프렌치 세틀먼트병 (French settlement disease), 또는 스트럼펠-로라인병, 영아 발병 상행성 유전성 강직성 마비, MASA 증후군, 또한 이른바 CRASH 증후군 및 가레이스 메이슨 증후군 (Gareis-Mason syndrome), 운동 신경병증 발현 백내장, 짧은 신장 (short stature) 및 골격 이상, MAST 증후군, 알란-헌던-더들리 증후군 (Allan-Herndon-Dudley syndrome), 트로이어 증후군 (Troyer syndrome), 리슨 증후군 (Lison syndrome), 강직성 운동실조 (특히 유전성 강직성 운동실조), SPOAN 증후군, 유전성 운동 감각 신경병증 (HMSN), 말초 신경병증, 체린 증후군 (Kjellin syndrome)을 포함하는 군으로부터 선택되는, 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 운동 뉴런 질병은 바람직하게는 SPG11, SPG15, SPG48, SPG4 및 SPG7로부터 선택되는 HSP인, 조성물.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 필수적으로 이루어진 운동 뉴런 질병의 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 강글리오사이드 대사 억제제를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 필수적으로 이루어진 운동 뉴런 질병의 치료에 사용하기 위한 약제(medicament).
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