JP7302871B2 - リソソーム蓄積障害およびリソソーム機能不全によって特徴付けられる障害を治療するための組成物および方法 - Google Patents
リソソーム蓄積障害およびリソソーム機能不全によって特徴付けられる障害を治療するための組成物および方法 Download PDFInfo
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Description
本出願は、2016年4月21日に出願された米国仮特許出願第62/325,535号および2017年3月23日に出願された米国仮特許出願第62/475,295号の利益を主張するものであり、当該出願はその全開示内容が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、たとえば、以下の項目を提供する。
(項目1)
リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、プロテインキナーゼB阻害剤を含む組成物の治療有効量を投与することを含む方法。
(項目2)
前記リソソーム機能不全障害が、若年性神経セロイドリポフスチン症である、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記プロテインキナーゼB阻害剤がトレハロースおよびMK-2206から選択される、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記プロテインキナーゼB阻害剤がトレハロースである、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記組成物が、プロテインキナーゼBを阻害するためのトレハロースからなる単一活性成分を含む、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記組成物がトレハラーゼ阻害剤をさらに含む、項目4に記載の方法。
(項目7)
前記トレハラーゼ阻害剤がミグルスタットである、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記ミグルスタットが、約30~約100mg/kg、約100~約300mg/kg、または約100~約150mg/kgの投薬量範囲で投与される、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記トレハロースがトレハロース類似体である、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記トレハロース類似体が、レンツトレハロースA、レンツトレハロースB、およびレンツトレハロースCから選択される、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記組成物が、トレハロースの1回投与用量が0.1g/kgから1g/kgの間で非経口投与される、項目4に記載の方法。
(項目12)
前記投与が120分以内に完了する、項目10に記載の方法。
(項目13)
前記組成物が、トレハロースの1回投与用量が0.1g/kgから1g/kgの間、ならびにミグルスタットの1回投与用量が約30から約100mg/kg、約100から約300mg/Kg、または約100から約150mg/Kgの範囲で非経口投与される、項目7に記載の方法。
(項目14)
前記組成物が、トレハロースの1回投与用量が0.1g/kgから1g/kgの間で経口投与される、項目4に記載の方法。
(項目15)
前記組成物が、トレハロースの1回投与用量が0.1g/kgから1g/kgの間、ならびにミグルスタットの1回投与用量が約30から約100mg/kg、約100から約300mg/Kg、または約100から約150mg/Kgの範囲で経口投与される、項目7に記載の方法。
(項目16)
前記組成物が1日1回投与される、項目4に記載の方法。
(項目17)
前記組成物が1日2回投与される、項目4に記載の方法。
(項目18)
前記プロテインキナーゼB阻害剤がMK-2206である、項目1に記載の方法。
(項目19)
前記組成物が、約30~約100mgのMK-2206を含む、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記組成物が約100~約300mgのMK-2206を含む、項目18に記載の方法。
(項目21)
前記組成物が非経口投与される、項目18に記載の方法。
(項目22)
前記組成物が、MK-2206の1回投与用量が約100mg/kgから約150mg/kgで投与される、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記組成物が1日1回投与される、項目21に記載の方法。
(項目24)
前記組成物が1日2回投与される、項目21に記載の方法。
(項目25)
リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、トレハロースを含む組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。
(項目26)
前記リソソーム機能不全障害が若年性神経セロイドリポフスチン症である、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記組成物がトレハラーゼ阻害剤をさらに含む、項目25に記載の方法。
(項目28)
前記トレハラーゼ阻害剤がミグルスタットである、項目27に記載の方法。
(項目29)
トレハロースを含む組成物の治療有効量を投与することにより、プロテインキナーゼBの活性を阻害する、項目25に記載の方法。
(項目30)
前記組成物が、プロテインキナーゼBを阻害するためのトレハロースからなる単一活性成分を含む、項目25に記載の方法。
(項目31)
前記組成物が、トレハロースの1回投与用量が0.1g/kgから1g/kgの間で非経口投与される、項目25に記載の方法。
(項目32)
前記投与が120分以内に完了する、項目28に記載の方法。
(項目33)
前記組成物が、トレハロースの1回投与用量が0.1g/kgから1g/kgの間で経口投与される、項目22に記載の方法。
(項目34)
前記組成物が1日1回投与される、項目22に記載の方法。
(項目35)
前記組成物が1日2回投与される、項目22に記載の方法。
(項目36)
リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、MK-2206を含む組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。
(項目37)
前記リソソーム機能不全障害が、若年性神経セロイドリポフスチン症である、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記組成物が、約30~約100mgのMK-2206を含む、項目36に記載の方法。
(項目39)
前記組成物が約100~約300 mgのMK-2206を含む、項目36に記載の方法。
(項目40)
前記組成物が、100mg/kgから150mg/kgの間の1回投与用量で投与される、項目36に記載の方法。
(項目41)
前記組成物が1日1回投与される、項目36に記載の方法。
(項目42)
前記組成物が1日2回投与される、項目36に記載の方法。
(項目43)
前記組成物がトレハラーゼ阻害剤をさらに含む、項目36に記載の方法。
(項目44)
前記トレハラーゼ阻害剤がミグルスタットである、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記ミグルスタットが、約30~約100mg/kg、約100~約300mg/kg、または約100~約150mg/kgの投薬量範囲で投与される、項目44に記載の方法。
(項目46)
リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、トレハロース類似体を含む組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。
(項目47)
前記リソソーム機能不全障害が若年性神経セロイドリポフスチン症である、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記組成物が、プロテインキナーゼBを阻害するための前記トレハロース類似体からなる単一活性成分を含む、項目46に記載の方法。
(項目49)
前記組成物がトレハラーゼ阻害剤をさらに含む、項目46に記載の方法。
(項目50)
前記トレハラーゼ阻害剤がミグルスタットである、項目49に記載の方法。
(項目51)
リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、トレハロースおよびトレハロース阻害剤を含む組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。
(項目52)
リソソーム機能不全障害が若年性神経セロイドリポフスチン症である、項目51に記載の方法。
(項目53)
前記トレハラーゼ阻害剤がミグルスタットである、項目51に記載の方法。
(項目54)
前記ミグルスタットが、約30~約100mg/kg、約100~約300mg/kg、または約100~約150mg/kgの投薬量範囲で投与される、項目53に記載の方法。
(項目55)
前記トレハロースがトレハロース類似体である、項目51に記載の方法。
(項目56)
前記トレハロース類似体が、レンツトレハロースA、レンツトレハロースB、およびレンツトレハロースCから選択される、項目55に記載の方法。
(項目57)
前記組成物が、トレハロースの1回投与用量が0.1g/kgから1g/kgの間、ならびにミグルスタットの1回投与用量が約30から約100mg/kg、約100から約300mg/Kg、または約100から約150mg/Kgの範囲で非経口投与される、項目53に記載の方法。
(項目58)
前記組成物が、トレハロースの1回投与用量が0.1g/kgから1g/kgの間、ならびにミグルスタットの1回投与用量が約30から約100mg/kg、約100から約300mg/Kg、または約100から約150mg/Kgの範囲で経口投与される、項目53に記載の方法。
(項目59)
前記組成物が1日1回投与される、項目51に記載の方法。
(項目60)
前記組成物が1日2回投与される、項目51に記載の方法。
(項目61)
トレハロースを使用する方法であって、プロテインキナーゼBとトレハロースを含む組成物とを接触させることによって前記プロテインキナーゼBの活性を阻害することを含む方法。
(項目62)
前記トレハロースがトレハロース類似体である、項目61に記載の方法。
(項目63)
前記トレハロース類似体が、レンツトレハロースA、レンツトレハロースB、およびレンツトレハロースCから選択される、項目62に記載の方法。
(項目64)
前記プロテインキナーゼBが、プロテインキナーゼBを有する細胞をトレハロースを含む組成物と接触させることによって接触させられる、項目61に記載の方法。
(項目65)
前記プロテインキナーゼBが、トレハロースを含む組成物を対象に投与することによって接触させられる、項目61に記載の方法。
(項目66)
プロテインキナーゼBによって媒介される病状を、それを必要とする対象において治療するために使用される、項目61に記載の方法。
(項目67)
前記病状が、リソソーム蓄積障害およびリソソーム機能不全を特徴とする障害、過剰増殖性疾患、および免疫障害から選択される、項目66に記載の方法。
(項目68)
前記リソソーム機能不全障害が、若年性神経セロイドリポフスチン症である、項目67に記載の方法。
(項目69)
トレハロースを使用する方法であって、プロテインキナーゼBとトレハロース類似体を含む組成物とを接触させることによって前記プロテインキナーゼBの活性を阻害することを含む方法。
(項目70)
前記トレハロース類似体が、レンツトレハロースA、レンツトレハロースB、およびレンツトレハロースCから選択される、項目69に記載の方法。
(項目71)
過剰増殖性疾患をそれを必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量のトレハロース、および任意選択でトレハラーゼ阻害剤を前記対象に投与することを含む方法。
(項目72)
過剰増殖性疾患をそれを必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量のトレハロース、およびミグルスタットを前記対象に投与することを含む方法。
(項目73)
過剰増殖性疾患をそれを必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量のトレハロース類似体を前記対象に投与することを含む方法。
(項目74)
免疫障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量のトレハロース、および任意選択でトレハラーゼ阻害剤を前記対象に投与することを含む方法。
(項目75)
免疫障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量のトレハロース、およびミグルスタットを前記対象に投与することを含む方法。
(項目76)
免疫障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量のトレハロース類似体を前記対象に投与することを含む方法。
(項目77)
機能不全リソソームクリアランスを示す細胞中の未分解物質のクリアランスを増強する方法であって、前記細胞をプロテインキナーゼB阻害剤を含む組成物と接触させることによって前記細胞中のプロテインキナーゼBを阻害することを含む方法。
(項目78)
前記細胞がインビトロで接触させられる、項目77に記載の方法。
(項目79)
前記細胞が、ある量のプロテインキナーゼB阻害剤を含む組成物を、それを必要とする対象に投与することによってインビボで接触させられる、項目77に記載の方法。
(項目80)
前記プロテインキナーゼB阻害剤が、トレハロース、トレハロース類似体、およびMK-2206から選択される、項目77に記載の方法。
(項目81)
前記プロテインキナーゼB阻害剤がトレハロースである、項目77に記載の方法。
(項目82)
前記組成物が、プロテインキナーゼBを阻害するためのトレハロースからなる単一活性成分を含む、項目81に記載の方法。
(項目83)
前記組成物がトレハラーゼ阻害剤をさらに含む、項目81に記載の方法。
(項目84)
前記トレハラーゼ阻害剤がミグルスタットである、項目83に記載の方法。
(項目85)
前記プロテインキナーゼB阻害剤がMK-2206である、項目80に記載の方法。
(項目86)
前記プロテインキナーゼB阻害剤がトレハロース類似体である、項目80に記載の方法。
(項目87)
前記トレハロース類似体が、レンツトレハロースA、レンツトレハロースB、およびレンツトレハロースCから選択される、項目86に記載の方法。
一態様では、本開示は、活性成分としてプロテインキナーゼBの阻害剤(AKT)を含む組成物を提供する。AKTは、他の細胞プロセスの中でもとりわけ、グルコース代謝、アポトーシス、細胞増殖、転写、および細胞遊走において中心的な役割を果たすセリン/スレオニン特異的プロテインキナーゼ酵素である。
上記のように、本発明者らはトレハロースがAKTを阻害することを発見した。したがって、本開示はまた、活性成分としてトレハロースを含む組成物を提供する。本明細書で使用される「トレハロース」という用語は、トレハロース化合物自体の形態、ならびに塩、多形体、エステル、アミド、プロドラッグ、類似体、誘導体などの任意の他の形態を、前記塩、多形体、エステル、アミド、プロドラッグ、類似体、または誘導体が、AKTを阻害することができるトレハロース類似体として薬理学的に適していることを条件に指す。
トレハロース
本開示の組成物は、トレハロース以外のAKT阻害剤も含み得る。トレハロース以外のAKT阻害剤の非限定的な例としては、抗体または抗体フラグメント、受容体リガンド、小分子、ペプチド、ポリペプチド、脂質、炭水化物、核酸、siRNA、shRNA、アンチセンスRNA、デンドリマー、マイクロバブル、もしくはアプタマー、またはこれらの組み合わせを挙げることができる。トレハロース以外の本開示の組成物に適したAKT阻害剤は当技術分野において公知である。本開示の組成物に適したAKT阻害剤の非限定的な例としては、8-[4-(1-アミノシクロブチル)フェニル]-9-フェニル-1,2,4-トリアゾロ[3,4-f][1,6]ナフチリジン-3(2H)-オン(MK-2206)、N-{(1S)-2-アミノ-1-[(3,4-ジフルオロフェニル)メチル]エチル}-5-クロロ-4-(4-クロロ-1-メチル-1H-ピラゾール-5-イル)-2-フランカルボキサミド、API-2、AKT VIII、ペリフォシン、GSK690693、GSK690693、GSK2141795、イパタセルチブ(GDC-0068)、SR13668、BAY1125976、AZD5363、BKM120、TIC10、Akti-1/2、SC79、アフレセルチブ(GSK2110183)、PF-04691502、AT7867、AT13148、類似体、トリシリビン、PHT-427、A-674563、CCT128930、A-443654、VQD-002、パロミド529、ホノキオール、A-674563、BX795、ミルテフォシン、ペリフォシン、ホスホ-Akt(Ser473)抗体、ホスホ-(Ser/Thr)Akt基質抗体、汎-AKT抗体、およびAKT抗体が挙げられる。当該技術分野において以前に記載された他のAKT阻害剤は、国際特許公開第2008070016号、第2006135627号、第2008006040号、第2008070134号、第2011055115号、第2010088177号、第2011077098号、および第2008070041号のAKT阻害剤を含むことができ、これらの開示はその全体が本明細書に組み込まれる。当業者には、本開示の組成物に適したAKT阻害剤が開発中のAKT阻害剤および/または臨床試験を受けているAKT阻害剤であってもよいことが認識されるであろう。例えば、臨床試験を受けているAKT阻害剤は、clinicaltrials.gov/ct2/results?term=AKt&Search=Searchに記載されているものであってよい。
本開示は、AKT阻害剤を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。賦形剤は希釈剤であり得る。希釈剤は、圧縮性(すなわち、塑性変形可能)または摩耗性で脆いものであり得る。適切な圧縮性希釈剤の非限定的な例としては、微結晶セルロース(MCC)、セルロース誘導体、セルロース粉末、セルロースエステル(すなわち、アセテートおよびブチレート混合エステル)、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、コーンスターチ、リン酸化コーンスターチ、アルファ化コーンスターチ、米デンプン、ジャガイモデンプン、タピオカデンプン、デンプン-ラクトース、デンプン-炭酸カルシウム、デンプングリコール酸ナトリウム、グルコース、フルクトース、ラクトース、ラクトース一水和物、スクロース、キシロース、ラクチトール、マンニトール、マリトール、ソルビトール、キシリトール、マルトデキストリン、およびトレハロースが挙げられる。適切な摩耗性脆性希釈剤の非限定的な例としては、二塩基性リン酸カルシウム(無水または二水和物)、リン酸カルシウム三塩基性、炭酸カルシウム、および炭酸マグネシウムが挙げられる。
別の態様では、本開示は、リソソーム蓄積障害およびリソソーム機能不全を特徴とする障害を、対象において治療する方法を提供する。本発明の方法は、対象においてAKTを阻害することによって、リソソーム蓄積障害およびリソソーム機能不全を特徴とする障害を、対象において治療することを含む。AKTは、AKT阻害剤を含む組成物の治療有効量を対象に投与することによって対象において阻害することができる。AKT阻害剤はトレハロースであり得る。または、AKT阻害剤はトレハロース以外のAKT阻害剤である。
対象は、げっ歯類、ヒト、家畜動物、コンパニオンアニマル、または動物学上の動物であり得る。一実施形態では、対象はげっ歯類、例えばマウス、ラット、モルモットなどであり得る。別の実施形態では、対象は家畜動物であり得る。適切な家畜動物の非限定的な例は、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラマおよびアルパカを含み得る。さらに別の実施形態では、対象はコンパニオンアニマルであり得る。コンパニオンアニマルの非限定的な例は、イヌ、ネコ、ウサギ、およびトリなどのペットを含み得る。さらに別の実施形態では、対象は動物学上の動物であり得る。本明細書中で使用される場合、「動物学上の動物」とは、動物園で見ることができる動物を指す。そのような動物には、非ヒト霊長類、大型ネコ科動物、オオカミ、およびクマが含まれ得る。いくつかの好ましい実施形態において、対象はマウスである。他の好ましい実施形態では、対象はヒトである。
治療適用のためには、治療有効量の本発明の組成物が対象に投与される。本明細書中で使用される場合、「治療有効量」のAKT阻害剤という用語は、治療されるリソソーム蓄積障害およびリソソーム機能不全を特徴とする障害に対して測定可能な効果を生じるのに十分な量のAKT阻害剤を指す。本発明の治療用組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、特定の対象に対して所望の治療応答を達成するのに有効な量の(1または複数の)活性成分を投与するように変動させてよい。
別の態様では、本開示はトレハロースを使用する方法を提供する。この方法は、トレハロースをそれを必要としている対象に投与して、その対象においてプロテインキナーゼBによって媒介される病状を治療することを含む。プロテインキナーゼBによって媒介される病状は、リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害、過剰増殖性疾患、子宮内膜症、代謝性疾患、および関節炎疾患であり得る。好ましくは、トレハロースを使用する方法は、リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害を治療することを含み、上記の通りであり得る。
本開示またはその(1または複数の)実施形態の要素を紹介するとき、冠詞「a」、「an」、「the」、および「said」は、1または複数の要素の存在を意味することを意図している。「含む(comprising)」、「含む(including)」および「有する(having)」という用語は、包括的であり、列挙された要素以外の追加の要素が存在し得ることを意味することを意図している。
神経変性疾患は、平均余命の延長および世界的な人口高齢化のために今後数十年で増加すると予想される、公衆衛生に大きな負担をかけるものである。他のヒトの健康状態とは異なり、神経変性疾患はその進行を停止させたり遅らせたりしようとする試みに対して非常に難治性であることが証明されている。実際、寿命を大幅に延ばしたり臨床経過を変えたりする、神経変性疾患のための承認済みの治療法は存在しない1。したがって、神経変性疾患は、有効な薬理学的に作用可能な標的の同定が緊急に必要とされている、未だ対処されていない医学的状態の代表である。
細胞培養および処理
対照(Coriell Institute、USA)およびJNCL線維芽細胞(Gaslini Institute、Italy)を、10%熱不活性化ウシ胎児血清(FBS、Atlanta Biologicals)、2mM L-グルタミン、100U/ml ペニシリンおよび100mg/ml ストレプトマイシン(Invitrogen)を添加したDMEM(1:1、HyClone)中で増殖させた。HeLa細胞を、LY294002(50mM、Cell Signaling)、Torin 1(300nM、Cayman Chemical)と共に2時間、またはトレハロース(100mM、Sigma)、ラパマイシン(300nM、Sigma)、MK2206(1μM、Selleckchem)、U0126(10mM、Tocris)と共に24時間および透析血清(GE Healthcare Life Sciences)と共に30分間インキュベートした。
皮質および海馬ニューロンをE17.5および生後0~1日のマウスから調製し、ポリ-D-リジンコーティング6ウェルプレート(BD Biosciences)においてGlutaMAX-1(Invitrogen)、B-27および1%FBSを添加したNeurobasal培地にプレーティングした。インビトロでの日数(DIV)4にニューロンを100mMトレハロースで処理した。DIV8において、ニューロンを収集し、RNA抽出を行った。
星状細胞をP0-1マウスから単離し、10%FBSおよび100U/mlのペニシリンおよび100mg/mlのストレプトマイシンを添加したDMEM高グルコースの存在下でポリ-D-リジンコーティング6ウェルプレート(BD Biosciences)にプレーティングした。7日後、グリア細胞層を除去し、星状細胞を処理のためにプレーティングした。翌日、100mMの量のトレハロースを培地に溶解し、4日間保持した。最後に、星状細胞を収集し、タンパク質抽出物をウエスタンブロットアッセイにより分析した。
免疫蛍光アッセイのために、細胞を24ウェルプレート中のカバーガラス上で増殖させた。処理後、細胞をPBSで洗浄し、メタノールで10分間固定した。次いで細胞をブロッキング剤(PBS中0.1%サポニン、10%ウシ血清)で1時間ブロックし、適切な一次抗体(1:100)と共に室温で3時間インキュベートした。PBSで3回洗浄した後、細胞を適切な二次抗体(1:500)と共に室温で1時間インキュベートした。次いで、共焦点顕微鏡による画像化のために、4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(H-1200)を含有するベクタシールド(vectashield)でカバーガラスを封入した。
脳組織および培養細胞を収集し、プロテアーゼのカクテル(Roche)およびホスファターゼ(SIGMA)阻害剤を含むRIPA緩衝液(50mM Tris-HCl、pH7.4、1%NP40、0.5%Na-デオキシコール酸、0.1%SDS、150mM NaCl、2mM EDTAおよび50mM NaF)中で溶解した。タンパク質濃度を、標準としてウシ血清アルブミンを使用して、ビシンコニン酸タンパク質アッセイキット(Pierce、Rockford、IL)を用いて測定した。溶解物をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)で分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写した。ブロットをブロッキング緩衝液(Tris緩衝食塩水、pH7.4および0.2%Tween 20、TBST中5%w/vの乾燥脱脂粉乳)中でインキュベートし、続いてブロッキング緩衝液(5%乾燥乳)中に希釈した適切な抗体と共に一晩インキュベートした。ウエスタンブロット画像をLAS 4000(GE Healthcare)によって取得し、ImageJを用いて定量化した。画像を発表用にトリミングした。フルサイズ画像を図27に示す。
以下に対する抗体:Akt(#9272、1:1,000)、ホスホ-Akt(S473)(#4060、1:500)、ホスホ-Akt(T308)(#13038、1:500)、p70 S6K(#9202、1:1,000)、ホスホ-P70 S6K(T389)(#9205、1:500)、4E-BP1(#39452、1:1,000)、ホスホ-4EBP1(T37/46)(#9459、1:500)、S6リボソームタンパク質(#2217、1:1,000)、ホスホ-S6リボソームタンパク質(S240/244)(#2214、1:1,000)、LAMP1(#3243、1:1,000)、ヒストン3(#4469、1:1,000)、ホスホ-(Ser)14-3-3結合モチーフ(#9601S、1:500)、Rictor(#2114、1:500)、Raptor(#2280、1:500)、ERK1/2(#9102、1:1,000)、蛍光体-ERK1/2(#9101、1:1,000)、GSK-3b(D5C5Z)XP(#12456S、1:1,000)、ホスホ-GSK-3b(Ser9)(#9336S、1:500)、GFP(D5.1)(#29556、1:1,000)およびヒトTFEB(#4240、1:500)を、Cell Signalingから購入した。GAPDHに対する抗体(#32233、1:1,000)はSanta Cruzから購入した。GFAPに対する抗体はDAKOから購入した(#Z0334、1:1,000)。CD68に対する抗体はAbD Serotec(#MCA1957、1:1,000)から購入した。マウスTFEBに対する抗体は、Proteintechから購入した(#13372-1-AP、1:500)。マウス抗FLAG M2(#F1804、1:1,000)およびウサギ抗FLAG(#F7425、1:1,000)抗体は、Sigmaから購入した。汎14-3-3抗体(K-19)(#SC629、1:300)は、Santa Cruzから購入した。TSC2に対する抗体はAbcamから購入した(#32554、1:1,000)。
細胞ペレットを、阻害剤と共に溶解緩衝液(10mM Hepes pH 7.9、10mM KCl、0.1mM EDTAおよび0.4%Nonidet P40)中にピペッティングにより再懸濁し、氷中で30分間保持した。最高速度で1分間遠心した後、上清を細胞質ゾル画分として回収した。ペレットを溶解緩衝液で2回洗浄し、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を含有する核緩衝液(20mM Hepes pH7.9、0.4M NaClおよび1mM EDTA)に再懸濁した。エッペンドルフシェーカーで15分間激しく振とうした後、ペレットを10分間最高速度で遠心沈殿させた。上清を核画分として使用した。
精製された活性AKT1酵素(SignalChem、Richmond、Canada)を使用してインビトロキナーゼアッセイを実施した。IP用の全細胞溶解物を、プロテアーゼ阻害剤および1mMのNa3VO4を含有するIP溶解緩衝液(20mM Tris、pH7.5、150mM NaCl、1mM EDTAおよび1% Triton X-100)中で調製した。細胞溶解物(1,000μg)を、プロテインA/Gビーズ(Pierce Crosslink IPキット、Life Technologies、Grand Island、NY)に架橋した10μgのマウス抗FLAG抗体またはマウスIgG(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)のいずれかと共に4℃において一晩インキュベートし、IP溶解緩衝液で総量300μlにした。免疫複合体を遠心分離により収集し、IP溶解緩衝液中で5回洗浄し、10μlの3×FLAGペプチドで溶出した。溶出液を、1×キナーゼ緩衝液(25mM Tris、pH7.5、5mM β-グリセロールホスフェート、10μM ATP、2mMジチオトレイトール、0.1mM Na3VO4および10mM MgCl2)で30μlに希釈した。20μlのキナーゼ緩衝液中200ngのAKT1および0.5μCiの[γ-32P]ATP(3,000Ci/mmol、PerkinElmer Life Sciences)を添加することによって、キナーゼ反応を開始させた。30℃で15分間インキュベートした後、SDS-PAGE添加液を添加し、95℃で10分間加熱することにより反応を停止させた。試料を4~12%SDS-PAGEゲルで分離し、オートラジオグラフィーで分析した。TFEB-S467A-3xFlagを、QuikChange XLII部位特異的突然変異誘発キット(Agilent)および以下のオリゴ:50-AGCAGCCGCCGGAGCGCCTTCAGCATGGAGGAG-3’、5-CTCCTCCATGCTGAAGGCGCTCCGGCGGCTGCT-3’を、製造業者の指示書に従って使用することによって生成した。
製造業者の説明書に従ってRNEasyキット(Qiagen)を用いて、対照およびJNCL線維芽細胞ならびにWTおよびCln3Δex7-8皮質ニューロン培養物から全RNAを抽出した。マウス脳の半分をRNA抽出のために処理し、1マイクログラムをQuantiTect Reverse Transcription kit(Qiagen)による相補的DNA合成に使用した。逆転写反応を用いるPCR用のプライマーを表S1に列挙する。定量的リアルタイムPCRは、CFX96 Touch Real-Time Detection System(Bio-Rad Laboratories)においてiQ SYBR Green Supermixを使用することによって実施した。試料を95℃で3分間加熱し、95℃で11秒間、60℃で45秒間で39サイクル、および最終サイクルは95℃で10秒間、65℃で5秒間および95℃で5秒間で増幅させた。分析は、CFXマネージャーソフトウェア(Bio-Rad)を用いて行い、閾値サイクル(CT)はPCR増幅プロットから抽出した。相対的遺伝子発現は、ΔΔCT法を使用して決定し、GAPDH(ヒト遺伝子について)およびシクロフィリン(マウス遺伝子について)に対して正規化した。遺伝子のメッセンジャーRNAレベルの変化は、以前に記載されたように倍数変化で表した。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
siRNAノックダウンのために、Lipofectamine RNAiMAXトランスフェクション試薬(Invitrogen)を使用して、細胞に、Stealth RNAi Negative Control Duplex(Thermo-Scientific 12935-300)またはAKT1を標的とするStealth siRNA二本鎖(Thermo Scientific、HSS176614、HSS100346およびHSS100345)をトランスフェクトした。Rictorに対するsiRNAはCell Signalingから購入した(8622)。トランスフェクションの72時間後に細胞を分析した。
トレハロース処理あり、およびなしの対照およびJNCL線維芽細胞由来の全RNA(100mM、4日間)を用いて、Illumina Human HT-12 V4.0アレイプラットフォームへのハイブリダイゼーションのための相補的DNAを調製した。実験は3連に行った。発現分析は、Microarray Core and Cell and Regulatory Biology、University of Texas、Houston、TX、USAで行った。差次的遺伝子発現を評価するための有意性の閾値として、Po0.01を用いた。GSEAを前記のように実施した10、11。累積分布関数は、1,000個のランダム遺伝子セットメンバーシップ割り当てを行うことによって構築した。名目上のP<0.01およびFDR<10%を、ESの有意性についての閾値として使用した。遺伝子オントロジー解析は、デフォルトパラメータを使用し、ウェブツールDAVID(https://david.ncifcrf.gov/)を用いて行った。経路共発現分析は、前記のように行われ8、9、Cytoscapeを使用して発現相関データをグラフで表した。
Cln3Δex7-8マウス(ストック番号004685;Cln3tm1.1Mem/J;CD-1バックグラウンド)32をJackson Laboratoryから入手した。対照(CD-1)マウスおよびCln3Δex7-8マウスを3~4匹/ケージで、12時間明期/12時間暗期周期の部屋で飼育した。食料と水は自由に与えた。この研究で使用されたすべてのマウスは、生後8ヶ月齢および12ヶ月齢において分析し、ヘテロ接合性Cln3Δex7-8マウスを交配することによって産生された同腹仔であった。この分析には雄のみを使用した。データを分析する際に研究者は盲検化されており、無作為化は不要であった。この研究から除外されたデータはなかった。
マウスにMK2206(120mg/kg)を1日おきに4回腹腔内注射した。MK2206は水中30%のカプチソール中に配合した。4匹のCln3Δex7-8マウスにMK2206を注射し、4匹にビヒクル対照として30%のカプチソールを注射した。
トレハロース(Swanson)を飲料水に最終濃度2%まで溶解し、週に2回交換した。トレハロース含有水を、21日齢から始めてマウスが自然に死亡するかまたは他の研究のために屠殺する日まで継続する自発経口投与(寿命評価)によってCln3Δex7-8マウスおよびWTマウスに与えた。
8ヶ月齢および12ヶ月齢のホモ接合性Cln3Δex7-8マウスおよび同齢対照をイソフルランで麻酔し、経心的にPBSで潅流し、続いて0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4中4%の緩衝化パラホルムアルデヒドで灌流した。続いて脳を取り出し、一晩後固定した。切片化する前に、Tris-緩衝食塩水(TBS:50mM Tris、pH7.6)中30%のスクロースを含有する溶液中で脳を凍結保護した。連続した40mmの浮遊冠状切片を96ウェルプレートに収集した。次に一連の切片をCD68またはGFAPに対する一次抗血清、続いてウサギ抗ラット(VectorLab)およびブタ抗ウサギ(DAKO)二次抗体のいずれかで染色し、そして免疫反応性をVectastain ABC(アビジン-ビオチン)キット(Vector)および色素原としてのジアミノベンジジンで検出した。
目的の各領域を通して、3つの連続した切片において30の重複しない画像を撮影した。すべてのRGB画像は、X40対物レンズを用いたZeiss Axioplan顕微鏡に据え付けられたライブビデオカメラ(JVC、3CCD、KY-F55B)により撮影し、JPEGとして保存した。ランプ強度、ビデオカメラの設定および較正を含むすべてのパラメータは、画像撮影の間を通じて一定に維持された。続いて、ImageJ分析ソフトウェア(NIH)を使用して、背景より上の前景免疫反応性を選択する適切な閾値を使用して、画像を分析した。次いで、この閾値を、動物のバッチごとに分析したすべてのその後の画像および各領域の各抗原についての免疫反応性の特異的領域を決定するために使用した試薬に定数として適用した。この分析は遺伝子型に対して盲検的に行われた。データは、各領域について視野当たりの免疫反応性の平均面積百分率±平均値の標準誤差としてグラフにプロットした。
各脳領域に存在する自己蛍光蓄積物質の相対レベルを分析するために、S1BFおよびVPM/VPLにまたがるマウス脳切片をゼラチンクロムコーティングスライド上に載置し、Vectashield(Vector Laboratories、Peterborough、UK)で封入した。各切片からの非重複画像を、Leica SP5共焦点顕微鏡および488nm励起レーザー(Leica Microsystem)を使用して倍率×63で撮影した。各領域に存在する蓄積負荷を決定するために閾値画像分析を実施した。画像撮影中、すべてのレーザーパラメータおよび較正は一定に保たれた。ImageJ(NIH)を用いて半定量的閾値画像分析を行った。
マウスを麻酔し、生理食塩水、続いて0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)中2%ホルムアルデヒド+2.5%グルタルアルデヒドで心臓内灌流した。脳を摘出し、小脳および皮質の小片を収集し、さらに2%ホルムアルデヒド+ 2.5%グルタルアルデヒド、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)中で24時間後固定した。100マイクロメートルの冠状切片をビブラトームで切断し、0.1Mカコジル酸中1%OsO4で1時間固定し、脱水した酢酸ウラニルで染色し、Eponate 812に包埋した。60nmの超薄切片をRMC MT6000ウルトラミクロトームで得て、日立H7500透過型電子顕微鏡で調べた。Gatan US1000高解像度デジタルカメラおよびDigital Micrographソフトウェア(v1.82.366)を用いて画像を撮影した。
画像化の前にマウスを経心的に灌流した。頭部を取り除き、次いで頭蓋骨を露出させるために皮膚、筋肉、耳、鼻の先端および下顎を取り除いた。頭部を4℃の4%パラホルムアルデヒドで一晩固定した。次に頭部をPBS中0.01%アジ化ナトリウム40mLに移し、4℃で7日間振とうした。頭部をPBS中5mMガドペンテト酸ジメグルミン(Bayer HealthCare Pharmaceuticals Inc.、Wayne、NJ)および0.01%アジ化ナトリウムの溶液に移し、4℃で25~35日間振とうした。ガドペンテト酸ジメグルミンとのインキュベーションによりシグナル対ノイズ比が改善された。画像化前に、頭部を6~8時間室温に平衡化した。
マウスあたり合計48スキャンを、9.4 T Bruker Avance Biospec Spectrometer、内径21-cmの水平スキャナー(35mm容積共振器付き)(Bruker Biospin、Billerica、MA)でParavision 5.0ソフトウェア(Bruker Biospin、Billerica、MA)を用いて取得した。3次元DTIスキャンパラメータは以下の通りである:スピンエコー、b値=0および1,000s/mm2、20の拡散方向および1つの非拡散強調画像、TR=500ms、TE=14.8ms、FOV=1.7×1.2×2.4cmまたは2.0×1.4×3.2cm、マトリックス=128×96×96、NEX=1、δ=3ms、Δ=7ms。取得時間は約15時間であった。
MRI画像を最初にDTIスタジオで処理して、異方性比率を推定した。その後、Amiraソフトウェア(Visage Imaging、Inc.、San Diego、CA)を使用してCCのROIを定義し、各マウスの容積を計算した。CCの容量測定は盲検法で行った。
ABRを以前に記載されたように測定した69。簡単に説明すると、10ヶ月齢のマウス(n=4~6/遺伝子型/治療群)をケタミン(100 mg/kg)およびキシラジン(10 mg/kg)の腹腔内注射を用いて麻酔し、次いでヘッドホルダーに固定した。マウスを加温パッドの上に置くことによって、この手順の間を通して通常の体温を維持した。4~48kHzの純音刺激を、Tucker-Davis Technologies System 3デジタル信号処理ハードウェアおよびソフトウェア(Tucker-Davis Technologies、Alachua、FL、USA)を使用して発生させ、音刺激の強度をタイプ4,938の1/4インチ音圧音場較正マイクロホン(Bruel and Kjar、Naerum、Denmark)を使用して較正した。応答信号を、頭皮の頂点、耳介後部および後脚(接地)に挿入された皮下針電極を用いて記録した69。聴覚閾値は、応答において再現可能で認識可能な波を有する最低の音強度に達するまで、90から10dBまで5dBごとに各刺激の音強度を減少させることによって決定した。平均聴覚閾値±標準偏差(dB SPL)を刺激周波数(kHz)の関数としてプロットした。統計分析は、周波数固有の効果を評価するために、個々の周波数で両側スチューデントt検定を伴う全体的な傾向を明らかにするための一元配置分散分析で構成された。T検定のP値はHolm法を用いて多重比較について調整した。R(バージョン2.13)をすべての統計分析に使用した。
Aktが標的とする可能性がある候補リン酸化部位を同定するために、実験的に決定された非重複性Aktリン酸化部位配列をPhosphocitePlusウェブサイト(www.phosphosite.org/)からダウンロードし、MEME Suite 4.11.0(meme-suite.org/)を用いてTFEBアミノ酸配列をスキャンするPWMの構築に使用した。TFEB配列は、デフォルトパラメータを用いてMultAlin(multalin.toulouse.inra.fr/)を使用することによりアライメントした。
結果は平均値±平均値の標準誤差として表す。各パラメータの平均差の統計的有意性は、特に明記しない限り、遺伝子型と治療の分散分析とそれに続くTukeyの事後検定によって決定した。P<0.05を有意と見なした。
すべてのマウス実験手順は、Baylor College of MedicineのInstitutional Animal Care and Use Committeeによって検討および承認された。
著者らは、この研究の調査結果を裏付けるデータはすべて、この論文とその補足情報ファイルに含まれていることを宣言する。遺伝子発現マイクロアレイのGene Expression Omnibusアクセッション番号はGSE76643である。
トレハロースは、JNCLのモデルにおいて神経病理を減弱させる。
細胞クリアランスのmTORC1非依存性活性化の最も実証された例は、トレハロースによって発揮されたものである22~26。本発明者らは、トレハロースがこれまでに特徴付けられていない経路を介してTFEBを活性化するという仮説を立て、小児の最も一般的な神経変性障害である幼若ニューロンセロイドリポフスチン症(JNCLまたはバッテン病;OMIM#204200)に代表される異常なリソソーム内蓄積の原型モデルを用いてこの仮説を検証することにした。JNCLは、リソソームのホメオスタシスの調節に関与する遺伝子であるCLN3の突然変異によって引き起こされ27~29、共焦点顕微鏡および電子顕微鏡で検出可能なオートファジーの障害およびセロイド脂肪色素のリソソーム内蓄積によって特徴付けられる30、31。
TFEBおよびCLEARネットワークのmTORC1非依存的活性化。
Cln3Δex7-8マウスにおいて観察された蓄積物質の減少は、トレハロースがリソソーム機能を増強することを示唆している。TFEBは、それらのプロモーターに存在する「協調的リソソーム発現および調節(coordinated lysosomal expression and regulation)」(CLEAR)部位に直接結合することにより、リソソーム遺伝子の発現を調節する8。トレハロースがTFEBの核内移行(TFEB活性化の特徴)を誘導するかどうかを試験するために、TFEB-3xFLAG(HeLa/TFEB)8を安定に発現する細胞を調べた。共焦点顕微鏡により、トレハロース投与による24時間以内の進行性TFEB核内移行が示された(図7a)。定量分析は、この時間枠内で、核TFEBを有する細胞が20から>80%に増加したことを明らかにした(図7b)。最近の報告は、mTORC1がTFEBをリン酸化し、それによってTFEBの細胞質ゾル保持を促進することを示している18~20。トレハロースがmTORC1非依存性経路を介してTFEBを活性化するかどうかを機構的に試験するために、mTORC1の構成的活性化の2つのモデルを使用した。第1のモデルは、結節性硬化症複合体2遺伝子、Tsc2(Tsc2-/-)に関してヌルである細胞によって表される39。TSC2は、TSC1とmTORC1活性を抑制するヘテロ二量体複合体を形成し、したがって、TSC2またはTSC1のいずれかが失われると、mTORC1の構成的活性化が起こる40。Tsc2-/-マウス胚性線維芽細胞および対照マウス胚性線維芽細胞のウエスタンブロットおよび共焦点顕微鏡分析は、mTORC1阻害剤(ラパマイシンおよびTorin1)とは異なり、トレハロースがmTORC 1シグナル伝達を変化させず(図7c;図8)、TFEB S211(mTORC1標的部位)のリン酸化を修正しないことを示したが18、19(図9)が、活性mTORC1を用いてもTFEB核内移行を誘導する(図7d、e)ことを示した。使用された第2のモデルは、mTORキナーゼドメインにおいてE2419Kアミノ酸置換を有する構築物により得られ、これは構成的に活性なmTOR(mTORE2419K)をもたらす41。共焦点顕微鏡分析は、トレハロース処理が、WT mTORまたはmTORE2419Kをトランスフェクトされた細胞においてTFEBの核内移行を誘導することを示した(図7f、g)。まとめると、これらのデータは、トレハロースシグナル伝達が、TFEB局在化のmTORC1制御を無効にすることを示している。mTORC2がTFEB核内移行を調節しないことを示す以前の研究と一致して、mTORC2特異的成分RICTORの低分子干渉RNA(siRNA)媒介性枯渇は、TFEB細胞内局在化に影響を及ぼさなかった(図10a、b)18。
S467において、Aktはリン酸化を介してTFEB活性を制御する。
データは、薬理学的に作用可能な経路が、mTORC1とは無関係に、TFEBを活性化し、細胞クリアランスを増強することを示している。真核細胞では、調節経路は、絶えず変化する細胞条件への適応性を維持しながら、出力の有効性を最大化する冗長で動的に階層化されたシグナル伝達ネットワークに基づく傾向がある42、43。したがって、TFEBの上流調節因子は、mTORC1を含む同じシグナル伝達カスケードにあり得ると推論された。mTORC1のキナーゼ活性はTSC2によって厳密に調節されており、TSC2はPI3K/Aktシグナル伝達経路によるリン酸化により不活性になる44。PI3KまたはAktのいずれかを阻害すると、Torin 1によるmTORC1阻害と同様のTFEB核内移行が生じたので(図14a、b)、AktがmTORC1とは無関係にTFEB活性を直接調節するかどうかを調べた。Tsc2-/-細胞を用いて、mTORC1の構成的活性化の条件下でAkt活性に対するTFEBの応答性を試験した。以前の研究44と一致して、mtORC1経路が血清除去または刺激に対して非感受性であるTsc2-/-細胞では、Akt活性は血清補充によって刺激される可能性がある(図15a)。重要なことに、血清飢餓Tsc2-/-細胞の血清再刺激は、TFEB核から細胞質ゾルへの移行をもたらし、これはAkt阻害剤MK2206とのプレインキュベーションによって防止された(図15b)。したがって、Akt活性はmTORC1とは無関係に血清刺激におけるTFEB細胞質ゾル局在化に必要である。TFEBの細胞内局在を調節するもう1つの因子であるGSK3βとの相互依存の可能性も確認した45~47。免疫ブロット分析は、GSK3β活性に対するトレハロースの検出可能な効果を示さず(図16a)、共焦点顕微鏡分析は、トレハロースおよびMK2206の両方が構成的に活性なGSK3βを発現する細胞においてTFEBの核内移行を誘導できることを示した(CA-GSK3β/S9A-GSK3β;図16b)。相互実験では、GSK3β阻害剤CHIR-99021は、構成的に活性なAkt(Akt308D/473DまたはAkt-DD)を発現する細胞においてTFEBの核内移行を促進した48(図16c)。したがって、これらの結果は、AktおよびGSK3βが独立してTFEBを調節することを示している。トレハロースが、以前に報告されたTFEB活性の調節因子であるERKを阻害しないことも確認した10(図17)。
この研究は、神経変性蓄積疾患の治療に関連する可能性のあるmTORC1非依存性の薬理学的に作用可能な標的としてのTFEB活性のAkt制御を特定している。TFEBは実際にリソソームベースの細胞クリアランスを制御する中心的なハブであり8、その潜在的な治療上の関連性は、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病を含む主要な神経変性疾患のモデルにおいてTFEBの異種発現に基づく原理証明研究を通して実証されている8、13~17。ニューロンのリソソーム内蓄積のインビボモデルとしてバッテン病マウスを使用して本明細書に提示されたデータは、リソソームの恒常性および機能の一次障害によるクリアランス経路の欠陥を打ち消すためにリソソーム増強を利用できることを実証している。これらの所見は、若年型のバッテン病のように、骨髄移植または遺伝子治療に基づくアプローチが本質的に適用困難である、膜結合タンパク質の欠損によって引き起こされるリソソーム蓄積障害に関連している52。さらに広くは、この知見は、有効な治療標的がまだ確立されていない神経変性蓄積疾患に対する潜在的対象であるが、実験的証拠により、細胞クリアランス経路の増強が治療標的候補として同定されている。先駆的な遺伝的および機構的研究は、実際、これらの疾患における病原性機構とリソソーム機能の間の強い関連性を明らかにした2~6。
ミグルスタットならびにトレハロースとミグルスタットとの併用は、バッテン病マウスにおいて神経細胞死を阻害する。
バッテン病マウス(Cln3 KOマウス)にトレハロース、低用量のミグルスタット、高用量のミグルスタット、またはトレハロースとミグルスタットの併用を投与した。これらの実験では2つの対照を使用した:(1)未処置のバッテンマウス、および(2)未処置の野生型マウス。神経細胞死(CAS-3陽性細胞の密度(細胞数/面積)で測定)、神経炎症(神経系のGFAP陽性星状細胞の数で測定)、および神経系へのマクロファージ浸潤(CD68の面積%により測定した)を測定した。
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Claims (7)
- 若年性神経セロイドリポフスチン症(CLN3病)を治療するための、トレハロース、その塩、または類似体を含む組成物であって、前記トレハロース類似体が、レンツトレハロースA、レンツトレハロースB、およびレンツトレハロースCから選択される、組成物。
- 前記トレハロース、その塩、または類似体が、汚染物質を含まない、請求項1に記載の組成物。
- ミグルスタットと一緒に投与されるものであることを特徴とする、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記ミグルスタットは、30~100mg/kgの範囲の用量で存在する、請求項3に記載の組成物。
- 50%、40%、30%、20%、10%、または5%以下のトレハロース(w/v)を含むトレハロースの水溶液として投与されることを特徴とする、請求項1~4のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が非経口投与されることが意図される、請求項1~5のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、静脈内投与用であることが意図される、請求項1~6に記載の組成物。
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