CN109789316B - 用于治疗溶酶体贮积症和以溶酶体功能障碍为特征的病症的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及治疗溶酶体贮积病的组合物和方法以及使用海藻糖的方法。

Description

用于治疗溶酶体贮积症和以溶酶体功能障碍为特征的病症的 组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年4月21日提交的美国临时专利申请62/325,535，2017年3月23日提交的美国临时专利申请62/475,295的权益，其全部公开内容通过引用结合在此。

发明领域

本发明提供了包含蛋白激酶B抑制剂的组合物，其用于治疗溶酶体贮积症和以溶酶体功能障碍为特征的病症。本发明还提供了使用包含海藻糖的组合物治疗溶酶体贮积症和以溶酶体功能障碍为特征的病症和状况的方法，以及使用海藻糖治疗由AKT介导的疾病状况的方法。

背景技术

溶酶体是膜结合的细胞器，它们是动物细胞中降解过程的核心。诸如吞噬作用吸收的微生物、内吞作用的大分子和不需要的细胞器的细胞外物质与溶酶体融合，并分解成它们的基本分子。因此，溶酶体是细胞的回收单元。溶酶体还负责在分泌，质膜修复，细胞信号传导和能量代谢中所起作用的细胞自身稳定。

溶酶体在细胞降解过程中的必不可少的作用使这些细胞器处于几个细胞过程的十字路口，对健康和疾病具有重要意义。60种溶酶体酶，跨膜蛋白或该细胞器的其他成分之一的缺陷可防止靶分子的分解，并导致超过60种不同的人类遗传疾病，这些疾病统称为溶酶体贮积症。如果不是由异常的溶酶体功能引起，以异常的溶酶体功能为特征的大量和多种人类病理状况强调了自噬-溶酶体途径对细胞代谢的至关重要性。在这些疾病以及以溶酶体功能障碍为特征的疾病中，未降解的物质在溶酶体内积累，导致疾病的存在或严重程度，范围从溶酶体贮积症到神经变性疾病，到癌症，到心血管疾病。例如，神经元腊样脂褐质症(NCL)，溶酶体贮积症，也称为Batten病，是一组神经退行性疾病，被认为是最常见的神经遗传性贮积疾病，在一些人群中患病率为1/12,500。对于14种Batten病中的任何一种，目前都没有治愈或批准的治疗方法。

本发明人先前已发现细胞清除途径由称为CLEAR基因网络(协调溶酶体表达和调节)的整合控制系统协调，其主转录调节因子是TFEB。然而，调节TFEB和CLEAR网络的体内途径未被充分理解，使得用于治疗此类疾病的药物开发具有挑战性。例如，目前不存在针对TFEB的治愈或批准的治疗。另外，虽然临床试验正在对这些疾病中的一些疾病进行可能的治疗，但目前还没有针对大多数溶酶体贮积症或许多以溶酶体功能障碍为特征的疾病的批准治疗。

因此，本领域需要基于溶酶体清除率的增强和细胞聚集体的去除来治疗以溶酶体功能障碍为特征的溶酶体贮积症和病症的组合物和方法。

发明内容

一方面，本发明提供了在有需要的对象中治疗溶酶体贮积症和以溶酶体功能障碍为特征的病症的方法。该方法包括给予治疗有效量的包含蛋白激酶B抑制剂的组合物。溶酶体功能障碍病症可以是幼年神经元蜡样质脂褐质沉积症。蛋白激酶B抑制剂可以选自海藻糖和MK-2206。

在一些实施方式中，蛋白激酶B抑制剂是海藻糖。当蛋白激酶B抑制剂是海藻糖时，该组合物可包含由海藻糖构成的单一活性成分，用于抑制蛋白激酶B。当蛋白激酶B抑制剂是海藻糖时，该组合物可进一步包含海藻糖酶抑制剂。海藻糖酶抑制剂可以是美格鲁特(miglustat)。美格鲁特可以以约30至约100mg/Kg，约100至约300mg/Kg，或约100至约150mg/Kg的剂量施用。另外，蛋白激酶B抑制剂可以是海藻糖类似物。优选地，海藻糖类似物选自伦茨海藻糖(lentztrehalose)A，伦茨海藻糖B和伦茨海藻糖C。包含海藻糖的组合物可以以每次0.1g/kg至1g/kg海藻糖的给药剂量胃肠外给药，并且可以在不到120分钟内完成给药。当组合物进一步包含美格鲁特时，组合物可以以每次0.1g/kg至1g/kg海藻糖的给药剂量和每次约30至约100mg/Kg，100至约300mg/Kg，或约100至约150mg/Kg美格鲁特的给药剂量胃肠外给药。

或者，包含海藻糖的组合物可以以每次0.1g/kg至1g/kg海藻糖的给药剂量口服给药。当组合物进一步包含美格鲁特时，组合物可以以每次0.1g/kg至1g/kg海藻糖的给药剂量和每次约30至约100mg/Kg，100至约300mg/Kg，或约100至约150mg/Kg美格鲁特的给药剂量口服给药。

蛋白激酶B抑制剂可以是MK-2206。当蛋白激酶B抑制剂是MK-2206时，该组合物可包含约30至约100mg MK-2206。或者，组合物可包含约100至约300mg MK-2206。当蛋白激酶B抑制剂是MK-2206时，组合物可以以每次约100mg/kg至约150mg/kg的给药剂量给药。包含MK-2206的组合物可以每天施用一次。或者，包含MK-2206的组合物可以每天施用两次。该组合物可进一步包含海藻糖酶抑制剂。海藻糖酶抑制剂可以是美格鲁特(miglustat)。

包含海藻糖酶的组合物可以每天施用一次。或者，包含海藻糖酶的组合物可以每天施用两次。

在一些实施方式中，蛋白激酶B抑制剂是MK-2206。该组合物可包含约30至约100mgMK-2206。或者，组合物可包含约100至约300mg MK-2206。组合物可以胃肠外给药。该组合物可以以每次约100mg/kg至约150mg/kg MK-2206的给药剂量给药。该组合物可以每天给药一次。或者，该组合物可以每天给药两次。

另一方面，本发明提供了在需要的对象中治疗以溶酶体功能障碍为特征的溶酶体贮积症的方法，包括给予所述对象治疗有效量的包含海藻糖的组合物。溶酶体功能障碍病症可以是幼年神经元蜡样质脂褐质沉积症。给予治疗有效量的包含海藻糖的组合物可以抑制蛋白激酶B的活性。

该组合物可进一步包含海藻糖酶抑制剂。海藻糖酶抑制剂可以是美格鲁特(miglustat)。或者，组合物可包含由海藻糖构成的单一活性成分，用于抑制蛋白激酶B。

组合物可以以每次0.1g/kg至1g/kg海藻糖的给药剂量胃肠外给药，并且可以在不到120分钟内完成给药。或者，组合物可以以每次0.1g/kg至1g/kg海藻糖的给药剂量口服给药。组合物可以每天施用一次或每天施用两次。

又一方面，本发明提供了在需要的对象中治疗溶酶体贮积症或以溶酶体功能障碍为特征的病症的方法，包括给予所述对象治疗有效量的包含MK-2206的组合物。溶酶体功能障碍病症可以是幼年神经元蜡样质脂褐质沉积症。组合物可包含约30至约100mg MK-2206，或约100至约300mg MK-2206。组合物可以以每次100mg/kg至150mg/kg的给药剂量给药。组合物每天施用一次或每天施用两次。

该组合物可进一步包含海藻糖酶抑制剂。海藻糖酶抑制剂可以是美格鲁特(miglustat)。美格鲁特可以以约30至约100mg/Kg，约100至约300mg/Kg，或约100至约150mg/Kg的剂量施用。

另一方面，本发明提供了在需要的对象中治疗溶酶体贮积症或以溶酶体功能障碍为特征的病症的方法，包括给予所述对象治疗有效量的包含海藻糖类似物的组合物。溶酶体功能障碍病症可以是幼年神经元蜡样质脂褐质沉积症。组合物可包含由海藻糖类似物构成的单一活性成分，用于抑制蛋白激酶B。该组合物可进一步包含海藻糖酶抑制剂。海藻糖酶抑制剂可以是美格鲁特(miglustat)。

另一方面，本发明提供了在需要的对象中治疗溶酶体贮积症或以溶酶体功能障碍为特征的病症的方法，包括给予所述对象治疗有效量的包含海藻糖和海藻糖酶抑制剂的组合物。溶酶体功能障碍病症可以是幼年神经元嗜酸性脂褐质沉积症。海藻糖酶抑制剂可以是美格鲁特(miglustat)。美格鲁特可以以约30至约100mg/Kg，约100至约300mg/Kg，或约100至约150mg/Kg的剂量施用。海藻糖可以是海藻糖类似物，海藻糖类似物可以选自：伦茨海藻糖A,伦茨海藻糖B和伦茨海藻糖C。当组合物包含美格鲁特时，组合物可以以每次0.1g/kg至1g/kg海藻糖的给药剂量和每次约30至约100mg/Kg，100至约300mg/Kg，或约100至约150mg/Kg美格鲁特的给药剂量胃肠外给药。当组合物包含美格鲁特时，组合物也可以以每次0.1g/kg至1g/kg海藻糖的给药剂量和每次约30至约100mg/Kg，100至约300mg/Kg，或约100至约150mg/Kg美格鲁特的给药剂量口服给药。组合物可以每天施用一次或每天施用两次。

在又一方面，本发明提供了一种使用海藻糖的方法，该方法包括通过使蛋白激酶B与包含海藻糖的组合物相接触来抑制蛋白激酶B的活性。海藻糖可以是海藻糖类似物。海藻糖类似物可以选自：伦茨海藻糖A、伦茨海藻糖B和伦茨海藻糖C。可以通过使具有蛋白激酶B的细胞与包含海藻糖的组合物接触来接触蛋白激酶B。或者，可以通过给予对象包含海藻糖的组合物来接触蛋白激酶B。

该方法可用于在需要的对象中治疗由蛋白激酶B介导的疾病状况。疾病状况可选自：溶酶体贮积症和以溶酶体功能障碍为特征的病症，过度增殖性疾病和免疫病症。溶酶体功能障碍病症可以是幼年神经元嗜酸性脂褐质沉积症。

在又一方面，本发明提供了一种使用海藻糖的方法，该方法包括通过使蛋白激酶B与包含海藻糖类似物的组合物相接触来抑制蛋白激酶B的活性。海藻糖类似物可以选自：伦茨海藻糖A、伦茨海藻糖B和伦茨海藻糖C。

在另一方面，本发明提供了一种在需要的对象中治疗过度增殖性疾病的方法，该方法包括给予所述对象治疗有效量的海藻糖以及任选的海藻糖酶抑制剂。

一方面，本发明提供了一种在需要的对象中治疗过度增殖性疾病的方法，该方法包括给予所述对象治疗有效量的海藻糖类似物。

另一方面，本发明提供了一种在需要的对象中治疗免疫病症的方法，该方法包括给予所述对象治疗有效量的海藻糖以及任选的海藻糖酶抑制剂。

另一方面，本发明提供了一种在需要的对象中治疗免疫病症的方法，该方法包括给予所述对象治疗有效量的海藻糖和美格鲁特。

另一方面，本发明提供了一种在需要的对象中治疗免疫病症的方法，该方法包括给予所述对象治疗有效量的海藻糖类似物。

在另一方面，本发明提供了一种表现出功能失调的溶酶体清除的细胞中未降解物质清除增强的方法，该方法包括通过使细胞与包含蛋白激酶B抑制剂的组合物接触来抑制细胞中的蛋白激酶B。可以在体外接触细胞。或者，可以通过给予需要的对象包含一定量蛋白激酶B抑制剂的组合物来体内接触细胞。蛋白激酶B抑制剂可选自海藻糖，海藻糖类似物和MK-2206。在一些实施方式中，蛋白激酶B抑制剂是海藻糖。组合物包含由海藻糖组成的单一活性成分用于抑制蛋白激酶B。或者，该组合物可进一步包含海藻糖酶抑制剂。海藻糖酶抑制剂可以是美格鲁特(miglustat)。

在一些实施方式中，蛋白激酶B抑制剂是MK-2206或海藻糖类似物。海藻糖类似物可以选自：伦茨海藻糖A、伦茨海藻糖B和伦茨海藻糖C。

附图简要说明

图1：用海藻糖喂养的JNCL小鼠中疾病病理学的改善。(a)海藻糖显著延长了Cln3^Δex7–8小鼠的存活率。处理的(Tre)Cln3^Δex7–8小鼠：n＝13。未处理(UT)Cln3^4ex7-8小鼠：n＝12。(b)用海藻糖处理过或未用海藻糖处理过的来自12个月大的WT和Cln3^Δex7–8小鼠的脑的重量。所有组的小鼠，n＝4或5。(c)用海藻糖处理过或未用海藻糖处理过的来自12个月大的WT和Cln3^Δex7–8小鼠的脑的分数各向异性。左图：四组大脑的代表性冠状图像；黄色箭头表示胼胝体。右图：胼胝体体积的量化。所有组的小鼠，n＝3或4。比例尺，2μm。在补充视频1-4中报道了来自处理组和对照组的小鼠胼胝体的三维重建。(d)在热板试验中，与野生型(WT)对应物相比，当放置在50℃加热的金属表面上时，Cln3^Δex7–8小鼠反应较慢，表明疼痛敏感性降低。海藻糖(Tre)处理在Cln3^Δex7–8小鼠中拯救了这种表型。所有小鼠组，n＝14-19。数据代表平均值±s.e.m。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图2：对处理和未处理小鼠的体重的评估。12个月大的WT和Cln3^Δex7-8小鼠的体重的图表显示基因型之间没有差别，不管海藻糖(Tre)处理与否。ns，不显著。所有组的小鼠，n＝8-11。数据表示为平均值±SEM。

图3：对处理和未处理小鼠的听力功能的评估。(a)与WT同窝小鼠相比，10月龄时的听觉脑干反应(ABR)显示Cln3^Δex7-8小鼠的ABR阈值升高，表明听力丧失。(b)海藻糖处理降低了两种基因型的ABR阈值，表明听力改善。所有组的小鼠，n＝4-6。数据表示为平均值±SEM。*P<0.05。

图4：贮积负荷的评估。(a，b)在初级躯体感觉皮层(S1BF；a)和相互关联的丘脑中继核(VPM/VPL；b)中7月龄时海藻糖处理(Tre)和未处理小鼠的贮积物质的共聚焦图像和定量。阈值图像分析显示Cln3^Δex7-8小鼠的皮质和丘脑中自发荧光贮积物质的水平较高，其通过海藻糖处理而降低。比例尺，50μm。所有组的小鼠，n＝3或4。(c，d)在初级躯体感觉皮层(S1BF；c)和相互关联的丘脑中继核(VPM/VPL；d)中12月龄时海藻糖处理和对照小鼠中的共聚焦图像和贮积物质量的定量。阈值图像分析显示Cln3^Δex7-8小鼠的皮质和丘脑中的自发荧光贮积物质水平较高，其通过海藻糖处理部分得到拯救。所有组的小鼠，n＝3或4。比例尺，50μm(a-d)。数据代表均值±s.e.m.。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。(e，f)未处理(UT)Cln3^Δex7-8小鼠脑的TEM分析显示浦肯野细胞(e)和皮质神经元(f)中电子致密细胞质材料(黄色箭头)的显著积累。FPP计数的频率分布揭示了海藻糖(Tre)处理的小鼠中FPP的显著降低。每组小鼠＝18的n个细胞。Kolmogorov-Smirnov检验用于频率分析。比例尺，2μm。

图5：在处理和未处理的Cln3^Δex7-8小鼠中12月龄时溶酶体贮积负荷的传递电子显微镜检查。电子显微照片显示未处理的JNCL小鼠的溶酶体中存在指纹图谱(FPP)，其在处理的小鼠中显著降低。显微照片是来自未处理(UT)和处理(Tre)小鼠的群组的浦肯野细胞的代表性实例。箭头表示FPP。比例尺为0.2μm。

图6：神经炎症的评估。(a，b)在初级躯体感觉皮层(S1BF；a)和相互关联的丘脑中继核(VPM/VPL；b)中7月龄时使用免疫组织化学染色GFAP的海藻糖处理(Tre)和未处理(UT)WT和Cln3^Δex7-8小鼠星形细胞增生的分析和定量。(c，d)在S1BF(c)和VPM/VPL(d)脑区中使用免疫组织化学染色CD68小胶质细胞活化的分析和定量。在Cln3^Δex7-8小鼠的S1BF和VPM/VPL区域中小胶质细胞活化是明显的，在S1BF区域中通过海藻糖处理得到显著改善。所有组的小鼠，n＝4或5。(e，f)在S1BF(e)和VPM/VPL(f)中使用免疫组织化学染色GFAP对12月龄时的海藻糖处理(Tre)和对照(UT)小鼠中星形细胞增生进行分析和定量。海藻糖处理使Cln3^Δex7-8小鼠的GFAP免疫反应性在S1BF区域降低43％，在VPM/VPL区域降低67％。(g，h)在S1BF(g)和VPM/VPL(h)脑区中使用免疫组织化学染色CD68对小胶质细胞活化的分析和定量。在Cln3^Δex7-8小鼠的S1BF和VPM/VPL区域中小胶质细胞活化是明显的，在VPM/VPL区域中通过海藻糖处理降低48％。所有组的小鼠，n＝3或4。比例尺，50mm。数据代表均值±s.e.m.。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图7：海藻糖处理的TFEB的mTORC1非依赖性核转位。(a)HeLa/TFEB细胞的共聚焦显微镜分析显示海藻糖处理的TFEB(绿色信号)的时间依赖性核转位。(b)海藻糖处理24小时(Tre)后或在未处理细胞(UT)中TFEB亚细胞定位的定量(C，细胞质；N，核)。a，b中的比例尺为40μm。(c)免疫印迹分析显示mTORC1下游底物的表达水平。用海藻糖(Tre；100mM)处理野生型(WT)和TSC2无效MEF细胞24小时或不处理。作为对照，在提取裂解物之前，用Torin 1(300nM)或雷帕霉素(300nM)处理细胞2小时。磷酸和总S6K1(P-S6K1和T-S6K1)，磷酸和总S6(P-S6和T-S6)以及磷酸和总4E-BP1(P-4E-BP1和T-4E-BP1)被检测为mTORC1活性的读数。用TFEB-3xFLAG瞬时转染(d)WT和(e)TSC2无效MEF细胞，并在给予海藻糖后测试TFEB的核转位。(f)用TFEB-3xFLAG和mTOR共转染的HeLa细胞或(g)TFEB-3xFLAG和组成型活性mTOR(CA-mTOR，C2419K)构建体用海藻糖(100mM，24小时)处理或不进行处理，然后分别用FLAG和mTOR抗体进行TFEB(红色)和mTOR(绿色)的免疫荧光标记。比例尺，10μm(d-g)。数据代表均值±s.e.m.。

图8：海藻糖不改变mTORC1活性。用海藻糖处理Hela细胞24小时或48小时，或者用雷帕霉素(600nM，16小时)或Torin1(300nM，2小时)处理作为mTORC1抑制的对照。mTORC1底物的免疫印迹分析显示海藻糖处理时其磷酸化状态没有变化。GAPDH用作加样对照。

图9：海藻糖在S211不改变TFEB的磷酸化。将TFEB-Flag从用TFEB-Flag转染的HeLa细胞中免疫沉淀，并用海藻糖处理24小时或不进行处理。使用针对磷酸(Ser)-14-3-3结合基序的抗体和对照抗体进行免疫印迹分析。

图10：TFEB亚细胞定位与mTORC2无关。(a)用针对Rictor的siRNA转染HeLa细胞72小时，如图所示。需要时在测试之前将细胞用海藻糖处理24小时。条形图表示三次重复的平均值。数据代表平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.001(b)如(a)中那样处理HeLa/TFEB-Flag细胞并标记用于免疫荧光共聚焦分析。比例尺为20μm。

图11：海藻糖对CLEAR网络的活化。(a，b)对照(CTRL；a)和JNCL成纤维细胞(b)的表达分析，显示海藻糖处理导致溶酶体基因的上调。基因表达相对于管家基因GAPDH标准化。(c)Cytoscape产生的网络，其代表通过给予海藻糖而上调的基因。点(代表基因)通过蓝线连接，其颜色强度与共调节程度成比例。该网络具有包含TFEB溶酶体靶标(网络中心)的更紧密表达关系的基因核心，而在网络外围发现更松散相关的其他基因。(d，e)海藻糖给予CTRL(d)和JNCL成纤维细胞(e)后，具有溶酶体基因的转录组改变的GSEA。上图显示由GSEA产生的分级基因表达数据的富集图(左，红色：上调；右，蓝色：下调)。垂直蓝条表示分级列表内每个选定基因组中基因的位置。下图显示了分级列表中溶酶体基因的累积分布。显示了包括50％分析基因的分级位置。该分析显示在给予海藻糖后上调的基因中溶酶体基因的富集。(f，g)在向CTRL(f)和JNCL成纤维细胞(g)施用海藻糖后，具有溶酶体基因的转录组改变的GSEA，并报道了在溶酶体代谢中具有已知作用的TFEB靶标。TFEB溶酶体靶标具有比一般溶酶体基因更高的ES评分，表明海藻糖在对照和JNCL成纤维细胞中优先上调参与溶酶体功能的TFEB靶标。数据代表均值±s.e.m.。

图12：体内TFEB核转位和CLEAR网络激活。(a，b)来自WT(a)和Cln3^Δex7-8胚胎(b)的培养的皮质神经元在E17.5的表达分析显示在给予海藻糖时溶酶体基因的转录激活。(c，d)来自WT(c)和Cln3^Δex7-8(d)小鼠的脑切片的共聚焦显微镜显示TFEB在处理小鼠的浦肯野中的普遍核分布。条形图中的C和N分别表示细胞溶质和核分布。比例尺，20μm。(e，f)与未处理的小鼠相比，来自WT(e)和Cln3^Δex7-8(f)小鼠的脑匀浆在给予海藻糖后的表达分析，显示溶酶体基因的转录激活。基因表达相对于管家基因S16标准化。红色虚线表示未处理小鼠中的相对基因表达。数据代表均值±s.e.m.。

图13:来自WT和Cln3^Δex7-8小鼠的经处理的星形胶质细胞的溶酶体增强。从野生型(WT)和JNCL(Cln3^Δex7-8)小鼠分离的培养的星形胶质细胞上的溶酶体标记物Lamp1的免疫印迹分析。

图14:Akt在Ser467处磷酸化TFEB。(a)HeLa/TFEB细胞的共聚焦显微镜分析显示加入海藻糖和激酶抑制剂(MK2206用于Akt；LY294002用于PI3K；torin 1和雷帕霉素用于mTOR)的TFEB核转位。虚线框(上排)显示较高功率插入件(下排)的位置。(b)用相同的激酶抑制剂孵育的HeLa/TFEB细胞的亚细胞分级分离。(c)来自以下物种的TFEB氨基酸序列的多重比对:Ac,安乐蜥(Anolis carolensis)；Bt,牛(Bos Taurus)；Dr,斑马鱼(Danio rerio)；Fc,菲利克斯猫(Felix catus)；Gg,狮头鸡(gallus gallus)；Hs,智人(Homo sapiens)；La,非洲象(Loxodonta Africana)；Mm,小家鼠(Mus musculus)；Rn,大白鼠(RattusNorvegicus)；Sh,袋獾(Sarcophilus harrisii)；Sp,紫色球海胆(Strongylocentrotuspurpuratus)；Xl,有爪蟾蜍(Xenopus laevis)。Akt磷酸化位点的共识标识(在weblogo.berkeley.edu/logo.cgi中生成)与TFEB序列比对。位置467指人蛋白质序列。(d)TFEB和TFEB的亚细胞定位(S467A)。(e)用TFEB或TFEB转染的HeLa细胞中溶酶体和自噬基因的表达分析(S467A)。基因表达相对于管家基因GAPDH标准化。虚线表示用空载体转染的细胞中的相对基因表达。(f)HeLa细胞中14-3-3蛋白和TFEB-Flag或TFEB(S467A)的共定位测定。(g)TFEB或TFEB(S467A)与14-3-3蛋白的共免疫沉淀测定。(h)Akt体外激酶测定。将重组活性AKT1和纯化的TFEB-Flag或TFEB(S467A)-Flag在[³²P]ATP存在下孵育，揭示Akt磷酸化TFEB并且该反应需要S467。(i)由三种不同的AKT siRNA介导的AKT沉默导致TFEB核转位和溶酶体扩增，如蛋白质印迹分析所示。(j)HeLa细胞的时程分析显示海藻糖诱导的AKT失活和自噬通量的增加，如LAMP1，p62和LC3标记所示。(k)在用TFEB(红色)和AKT-GFP(绿色)进行免疫荧光标记之前，用海藻糖处理用TFEB-FLAG和AKT-GFP或AKT(DD)-GFP共转染的HeLa细胞24小时。DAPI表示细胞核。(l)在来自海藻糖处理的小鼠的WT和Cln3^Δex7-8脑匀浆中观察到AKT的活化减少。比例尺，10μm(a，e，f，k)。数据代表平均值±s.e.m.。*P<0.05。

图15：血清刺激通过调节Akt活性调节TFEB的亚细胞定位。(a)WT和Tsc2^-/-细胞血清饥饿(16小时)，在指示时饥饿的最后2小时用MK2206处理，并在指示时用透析的血清刺激最后30分钟。如所示用抗体探测细胞裂解物。(b)用TFEB-Flag瞬时转染WT和Tsc2^-/-细胞，并如(a)中那样处理，并通过免疫荧光共聚焦显微镜分析。比例尺为60μm。

图16：海藻糖以GSK3β非依赖性方式控制TFEB的Akt调节。(a)用海藻糖处理HeLa细胞24小时或未处理。免疫印迹分析用于评估GSK33的水平及其磷酸化状态。GAPDH用作加样对照。(b)用TFEB-3xFlag和组成型活性GSK3β(CA-GSK3β)共转染HeLa细胞，用海藻糖或MK2206处理24小时，并通过Flag(红色)和GSK3β(绿色)的免疫荧光标记检查。比例尺为20&m。(c)用TFEB-3xFlag和组成型活性Akt(Akt-DD)共转染HeLa细胞，用GSK3β抑制剂CHIR99021处理24小时，并通过免疫荧光标记检测Flag(红色)和Akt(绿色)。比例尺为20μm。

图17：海藻糖不抑制ERK。来自用TFEB-Flag或TFEB-S467A-Flag质粒瞬时转染的HeLa细胞的总蛋白质提取物的Western印迹分析显示TFEB-S467A向较低分子量的转变。

图18：S467A TFEB版本的分子量的移动。来自用TFEB-Flag或TFEB-S467A-Flag质粒瞬时转染的HeLa细胞的总蛋白质提取物的Western印迹分析显示TFEB-S467A向较低分子量的转变。

图19：TFEB-S142A和TFEB-S211A的共聚焦显微镜分析。用指定的构建体瞬时转染HeLa细胞，并通过免疫荧光共聚焦显微镜分析进行分析。比例尺为10μm。

图20：TFEB(S467A)在WT和Tsc2^-/-小鼠胚胎成纤维细胞中的核定位。Tsc2^-/-小鼠胚胎成纤维细胞。用TFEB(S467A)瞬时转染WT和Tsc2^-/-MEF，并通过共聚焦显微镜分析。比例尺为10μm。

图21：Akt调节TFEB稳定性。来自用双顺反子TFEB-Flag-IRES-GFP或TFEB(S467A)-Flag-IRES-GFP共转染的细胞裂解物的免疫印迹，有和没有Akt(DD)-GFP载体，表明突变体TFEB蛋白比野生型TFEB更稳定。

图22：Akt与TFEB相互作用。(a)显示TFEB与Akt相互作用的共免疫沉淀测定。(b)用Ala取代TFEB Ser467不影响与Akt的结合。

图23：对AKT的药理学抑制诱导TFE3和MITF的核转位。用TFE3-3xFlag(a)和MITF-3xFlag(b)瞬时转染HeLa细胞，并通过共聚焦显微镜分析。比例尺为10μm。

图24：Akt抑制促进TFEB核转位和CLEAR网络的激活。(a)LC3染色显示用海藻糖或MK2206处理的细胞中斑点数增加。(b)LC3脂化的免疫印迹分析。(c)HeLa细胞的显微照片显示用海藻糖或MK2206处理的样品中自噬囊泡(黄色箭头)的数量增加。(d)用MK2206处理的HeLa细胞中溶酶体和自噬基因的表达分析。基因表达相对于管家基因GAPDH标准化。虚线表示未处理细胞中的相对基因表达。(e-g)在Cln3^Δex7-8小鼠中腹膜内注射MK2206显示Akt的失活(e)，TFEB的核转位(f)和溶酶体和自噬基因的上调(g)。比例尺，10μm(a)，50nm(c)和20μm(f)。

图25：Akt的药理学抑制调节来自患有溶酶体内蜡样质脂褐素的患者的原代细胞中的细胞清除。(a-d)具有缺陷(c.461-677del；a),PPT1(c.665T>C,p.L222P；b),TPP1(c.380G>A,p.R127Q；g.3556,IVS5-1G>C；c)或MFSD8(c.103C>T,p.R35X；d)的原代成纤维细胞的共聚焦显微镜分析表明MK2206和海藻糖诱导清除蜡样质脂褐素沉积物(绿色)。指示缺陷蛋白质。每个小组已经分析了60多个细胞。比例尺，30jtm。(e)TFEB的Akt依赖性海藻糖活化的示意图。数据代表均值±s.e.m.。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图26：海藻糖和Akt对溶酶体内蜡样质脂褐素贮积的影响。具有缺陷CLN3的原代成纤维细胞的共聚焦显微镜分析(c.461-677del)。(a)用海藻糖处理细胞7天或4天，然后除去海藻糖，再生长3天。(b)将细胞用MK2206处理7天，持续4天，然后除去MK2206，再生长3天。数据代表平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01。比例尺为30μm。

图27描绘了图7,8,9,10,13,14,15,16,17,18,21,22和24中所示的Western印迹的完全扫描。

图28描绘了海藻糖和伦茨海藻糖A，B和C的化学结构。

图29描绘了海藻糖及其类似物乳海藻糖(lactotrehalose)的化学结构(b)；半乳海藻糖(c)；和6-叠氮基海藻糖(d)。

图30：海藻糖、美格鲁特以及海藻糖和美格鲁特的组合对Batten小鼠神经细胞死亡的影响。野生型小鼠、未经处理的Batten小鼠、用海藻糖、低浓度的美格鲁特、高浓度的美格鲁特、美格鲁特和海藻糖的组合处理的Batten小鼠中CAS-3阳性细胞密度(细胞数/区域)的直方图。

图31：海藻糖，美格鲁特以及海藻糖和美格鲁特的组合对Batten小鼠的星形胶质细胞增生的影响。(A)显示来自野生型小鼠、未经处理的Batten小鼠、用海藻糖、低浓度的美格鲁特、高浓度的美格鲁特、美格鲁特和海藻糖的组合处理的Batten小鼠的神经元组织中的GFAP染色的显微镜图像。(B)野生型小鼠、未经处理的Batten小鼠、用海藻糖、低浓度的美格鲁特、高浓度的美格鲁特、美格鲁特和海藻糖的组合处理的Batten小鼠中GFAP阳性细胞密度(细胞数/区域)的直方图。

图32：海藻糖、美格鲁特以及海藻糖和美格鲁特的组合对Batten小鼠巨噬细胞浸润的影响。(A)显示来自野生型小鼠、未经处理的Batten小鼠、用海藻糖、低浓度的美格鲁特、高浓度的美格鲁特、美格鲁特和海藻糖的组合处理的神经元组织中CD68染色的显微镜图像。(B)野生型小鼠、未经处理的Batten小鼠、用海藻糖、低浓度的美格鲁特、高浓度的美格鲁特、美格鲁特和海藻糖的组合处理的Batten小鼠中CAS-3阳性细胞密度(细胞数/区域)的直方图。

发明详述

本发明部分基于以下发现：蛋白激酶B(也称为PKB和AC相关(RAC)；下文称为AKT)是溶酶体贮积症、以溶酶体功能障碍为特征的病症以及溶酶体相关的细胞清除途径的主要调节剂。发明人发现AKT在体内以mTORC1非依赖性方式调节TFEB和由TFEB转录调节的CLEAR基因网络。此外，发现抑制AKT阻止TFEB的AKT磷酸化，从而激活TFEB和CLEAR基因网络以及由CLEAR基因网络协调的细胞清除途径，并导致溶酶体依赖性细胞清除途径的清除增强。值得注意的是，使用已知的AKT抑制剂抑制AKT诱导溶酶体贮积症和以溶酶体功能障碍为特征的病症中的未降解物质的清除。例如，抑制AKT清除未降解物质并改善由溶酶体代谢受损引起的神经退行性疾病的症状。值得注意的是，还惊人地发现使用包含二糖海藻糖的组合物可以抑制AKT。

因此，本发明涉及治疗溶酶体贮积症和以溶酶体功能障碍为特征的病症以及以溶酶体功能障碍和细胞废物累积为特征或加剧的其他病症的组合物和方法。本发明还涉及使用海藻糖治疗对象中由蛋白激酶B介导的疾病状况的方法。以下详细描述基于这些发现的组合物和方法。

I.组合物

在一个方面，本发明提供了包含蛋白激酶B(AKT)抑制剂作为活性成分的组合物。AKT是丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，在葡萄糖代谢、细胞凋亡、细胞增殖、转录和细胞迁移等细胞过程中发挥重要作用。

适用于本发明的组合物的AKT抑制剂可以抑制任何AKT蛋白同种型。人体中已知的AKT蛋白同种型包括AKT1(PKBα)、AKT2(PKBβ)和AKT3(PKBγ)。本发明的组合物可以包含对AKT同种型之一特异的AKT抑制剂。例如，组合物可包含AKT1抑制剂，AKT2抑制剂或AKT3抑制剂。或者，组合物可包含能够抑制多于一种AKT同种型的AKT抑制剂。例如，组合物可包含能够抑制AKT1和AKT2的AKT抑制剂，能够抑制AKT1和AKT3的AKT抑制剂，能够抑制AKT2和AKT3的AKT抑制剂，或能够抑制AKT1，AKT2和AKT3的全-AKT抑制剂。组合物还可包含对一种或多种AKT同种型特异的AKT抑制剂的组合。

术语“AKT抑制剂”或“AKT的抑制剂”在本文中可互换使用，并且可以指具有优先直接降低或阻断AKT活性的作用的任何化合物。AKT抑制剂可通过抑制AKT的活性直接作用于AKT。例如，直接AKT抑制剂可通过抑制底物进入酶的活性位点而直接抑制AKT激酶活性。直接AKT抑制剂也可以是变构抑制剂，其中抑制剂结合AKT上除底物结合位点之外的位点。或者，直接AKT抑制剂可以是正构抑制剂，其中抑制剂通过影响AKT配体的结合来抑制AKT的活性。AKT抑制剂可以是竞争性的，非竞争性的，无竞争性抑制剂或可逆抑制剂。另外，AKT抑制剂对AKT的抑制可能是不可逆的。

AKT抑制剂还可以通过抑制AKT的一种或多种上游激活剂，或通过在一种或多种能够调节AKT活性的信号传导途径中激活AKT的一种或多种上游抑制剂来抑制AKT活性。AKT抑制剂还可以通过阻断多种途径直接或间接抑制AKT活性的机制的组合起作用，从而实现有效抑制。此外，AKT抑制剂可通过阻止或减少AKT的转录，翻译，翻译后加工，移动(即，降低AKT的表达)或AKT表达的上游激活剂或其组合来抑制AKT活性。因此，适用于本发明组合物的AKT抑制剂的非限制性实例包括：抑制PI3K或PI3K的下游效应物的化合物，抑制PDPK1和/或mTORC2或相关激酶的化合物，抑制胆碱激酶的化合物，抑制bcl-2的化合物，抑制Hsp-90的化合物，抑制mTOR激酶的化合物，蛋白酶体抑制剂，多激酶抑制剂，直接抑制AKT的化合物，激活PTEN的化合物，以及导致AKT活化减少的任何其他化合物。此外，AKT抑制剂可以是小化学实体，肽，抗体，抗体形式，蛋白质以及非蛋白质结合物，小干扰RNA，双链RNA或核酶。当抑制剂不是结合和抑制AKT活性的AKT底物时，AKT抑制可以是变构的。直接AKT抑制剂也可以是正构抑制剂，其中抑制剂通过影响AKT配体的结合来抑制AKT的活性。

(a)海藻糖

如上所述，发明人发现海藻糖抑制AKT。因此，本发明也提供了包含海藻糖作为活性成分的组合物。如本文所用，术语“海藻糖”是指海藻糖化合物本身的形式，以及任何其他形式，例如盐，多晶型物，酯，酰胺，前药，类似物，衍生物等，条件是盐，多晶型物，酯，酰胺，前药，类似物或衍生物是在药理学上合适的能够抑制AKT的海藻糖类似物。

海藻糖(也称为mycose或tremalose)，是一种稳定的非还原性二糖，其中两个葡萄糖分子以1,1构型连接。海藻糖的结构如下图所示。海藻糖具有蛋白质稳定性，并广泛用于许多应用中，在冷冻干燥生物系统和细胞中作为冷冻食品的稳定剂，作为治疗性胃肠外蛋白质的稳定剂，以及作为片剂和IV溶液中的赋形剂。海藻糖被FDA认可为GRAS(通常被认为是安全的)食品成分，并列于USP-NF(美国药典国家处方集)，EP(欧洲药典)和JP(日本药典)上。已广泛研究海藻糖的安全性和毒性，并且当以显著高于预期治疗剂量的剂量口服和静脉内施用时，发现该物质是安全的。

海藻糖被海藻糖酶有效地水解，在许多生物体中广泛表达，包括微生物。在人体中，海藻糖在消化道中上皮刷状缘处被海藻糖酶代谢为两个D-葡萄糖分子。摄入的海藻糖不到0.5％被吸收到血流中，在那里它通过肾刷状缘细胞的海藻糖酶通过肝脏和肾脏进一步代谢。口服海藻糖的量超过每天40-50克可能导致腹泻和腹胀。因此，本领域技术人员将认识到，为了提供更高治疗剂量的的海藻糖，可以通过胃肠外给予海藻糖以避免胃肠道中的代谢，通过进一步提供在包含海藻糖的组合物中的海藻糖酶抑制剂，或其组合，避免GI道或肾脏中海藻糖的代谢。组合物中可以使用海藻糖酶抑制剂以增强组合物中海藻糖的稳定性。因此，当海藻糖是活性成分时，本发明的组合物可以进一步包含一种或多种海藻糖酶抑制剂。

海藻糖类似物或基于海藻糖的化合物也可具有类似于海藻糖的治疗特性。此外，海藻糖类似物还可以抵抗海藻糖酶或其他降解酶的降解。因此，本发明还设想使用能够抑制AKT的任何海藻糖类似物或基于海藻糖的化合物。本领域已知的海藻糖类似物可以参见Walmagh等,Int.J.Mol.Sci.2015,16,13729-13745；Wada等,Journal of Agriculturaland Food Chemistry 2016,64,7121-7126；Wyatt等,Carbohydr.Res.2015,411,49–55；Babu等,J.Carbohydr.Chem.2005,24,169–177；Umezawa等,J.Antibiot.1967,20,388；Uramoto等,J.Antibiot.1967,20,236；其公开内容以其整体并入本文。可适用于本发明组合物的海藻糖类似物的非限制性实例包括：伦茨海藻糖化合物，甘露吡喃糖基取代的海藻糖化合物，海藻糖的氨基类似物，例如GlcNAc-α-(1,1)-α-Glc和GlcNAc-α-(1,1)-α-Man，维持海藻糖的非还原性α-(1,1)-α连接键的含有除葡萄糖、二-寡糖或多糖外的糖部分的海藻糖类似物。可适用于本发明组合物的海藻糖类似物的非限制性实例包括：基于海藻糖的三-、四-和五聚糖，新赛糖(neosartose)，费氏糖(fischerose)，乳海藻糖(lactotrehalose)，图28显示的伦茨海藻糖A、B或C，以及图29显示的乳海藻糖，半乳海藻糖(galactotrehalose)，或6-叠氮海藻糖。

当海藻糖或海藻糖类似物化合物是本发明组合物中的活性成分时，活性成分是药学上可接受的形式。活性成分可以以化合物本身的形式，也可以以盐，多晶型物，酯，酰胺，前药，衍生物等的形式给药，条件是盐，多晶型物，酯，酰胺，前药或衍生物是药理学上合适的。活性剂的盐，酯，酰胺，前药和其它衍生物可以使用合成有机化学领域的技术人员已知的标准方法制备，例如参见J.March，《高等有机化学：反应、机理和结构》(AdvancedOrganic Chemistry：Reactions，Mechanisms and Structure)，第四版(纽约：Wiley-Interscience，1992)。对于可以以对映体形式存在的任何活性剂，活性剂可以作为外消旋物或以对映体纯的形式掺入本发明的组合物中。

此外，包含海藻糖或海藻糖类似物的组合物，含有或不含有海藻糖酶抑制剂，优选包含医用级海藻糖。优选地，海藻糖基本上不含由海藻糖的分离和纯化过程产生的污染物。海藻糖可以通过从干酵母等中提取来分离；通过酶促生产和分离；以及通过培养微生物。因此，海藻糖优选基本上不含诸如酶，有机溶剂如铵，乙腈，乙酰胺，醇(如甲醇，乙醇或异丙醇)，TFA，醚等的污染物或者在制备和纯化海藻糖过程中使用的其它污染物等。术语“基本上”不含污染物可以指，基于海藻糖的总重量，海藻糖中的污染物含量优选小于0.5％，小于0.3％，小于0.25％，小于0.1％，小于0.05％，小于0.04％，小于0.03％，小于0.02％，小于0.01％，小于0.005％，小于0.003％或小于0.001％。确定污染物含量的方法是本领域已知的，并且可以通过常规方法如气相色谱法测定。优选地，本发明的纯化海藻糖中的残留溶剂小于ICH指南中设定的极限，例如，IMPURITIES:GUIDELINE FOR RESIDUAL SOLVENTS Q3C(R5)(可从www.ich.Org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/ Quality/Q3C/Step4/Q 3C_R5_Step4.pdf获得)。例如，纯化的海藻糖含有<5000ppm乙醇(例如，<140ppm)和/或<3000ppm甲醇。

包含海藻糖或海藻糖类似物的组合物，含有或不含有海藻糖酶抑制剂，优选包含低水平的内毒素。细菌内毒素是脂多糖(LPS)，革兰氏阴性细菌细胞壁的成分，已知在注入血液时会引起发烧和疾病。细菌内毒素是热稳定的，毒性不依赖于细菌细胞的存在。由于可以在细菌中制备许多治疗剂，包括海藻糖，因此使用内毒素测试来确保治疗产品不含内毒素。包含海藻糖的组合物可含有每mL少于1.0,0.9,0.8,0.75,0.7,0.6,0.5,0.4,0.3,0.2,0.1或更少的内毒素单位。优选地，包含海藻糖的组合物含有小于0.75的内毒素单位/mL。

如上所述，当本公开的组合物中的活性成分是海藻糖时，除海藻糖外，组合物还可包含海藻糖酶抑制剂。海藻糖酶是小肠和其他细胞的刷状缘细胞中的糖苷水解酶，其催化海藻糖向葡萄糖的转化。海藻糖酶属于碳水化合物活性酶(CAZy)分类(EC 3.2.1.28)的GH37家族。能够抑制海藻糖酶的酶活性的任何化合物都可以用作海藻糖酶抑制剂。海藻糖酶抑制剂的非限制性实例包括：有效羟胺A(validoxylamine A)，有效霉素A(validamycinA)，海藻唑啉(trehazolin)，1-硫杂海藻唑啉(1-thiatrehazolin)，苏达海斯汀(suidatrestin)，善宁(salbostatin)，MDL26537，木麻黄-6-O-α-D-吡喃葡糖苷，美格鲁特和来自美洲蟑螂(Periplaneta americana)的86kD蛋白质(参见Hayakawa等，J Biol Chem1989；264(27)：16165-16169)，其公开内容通过引用整体并入本文。其他海藻糖酶抑制剂可以如US 5354685和CN101627763中所述，其公开内容通过引用整体并入本文。可以使用本领域已知的方法测定其他合适的海藻糖酶抑制剂。例如，化合物与海藻糖酶的结合亲和力可用于确定化合物是否可以是海藻糖酶的抑制剂，其中化合物与海藻糖酶的高亲和力结合表明该化合物可以是海藻糖酶的抑制剂。此外，海藻糖酶在化合物存在下的酶活性可用于确定化合物是否是海藻糖酶的抑制剂，其中酶活性的降低表明该化合物是海藻糖酶的抑制剂。另外，可以将化合物建模到海藻糖酶的活性位点上以确定该化合物是否是海藻糖酶的抑制剂，其中如果该化合物被建模为在海藻糖酶的活性位点中具有多种相互作用，则该化合物是海藻糖酶抑制剂。例如，参见Gibson等,Angew.Chem.Int.Ed 2007；46:4115-4119，其公开内容通过引用整体并入本文，其证明了海藻糖酶的结构并鉴定了测定海藻糖酶抑制剂的方法。优选地，合适的海藻糖酶抑制剂是美格鲁特。

本文公开的组合物中的海藻糖或海藻糖类似物和任选的海藻糖酶抑制剂的量可以并且将随对象而变化，取决于许多因素。这些因素包括：组合物中使用的海藻糖形式(前药或盐等)，待治疗的溶酶体贮积症或以溶酶体功能障碍为特征的疾病，疾病症状的严重程度，包含海藻糖的组合物的给药途径，待给予的组合物中是否存在海藻糖酶抑制剂，患者的年龄，体重和一般状况，以及处方医师的判断。

通常，本发明组合物是海藻糖的水溶液，其包含约50％,40％,30％,20％,10％,或约5％或更少的海藻糖(w/v)。当组合物用于口服给药时，组合物可包含约50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％,10％,5％,或约1％或更少的海藻糖(w/v)。例如，用于口服给药的组合物可包含约50％,49％,48％,47％,46％,45％,44％,43％,42％,41％,约40％海藻糖(w/v),约39％,38％,37％,36％,35％,34％,33％,32％,31％,或约30％海藻糖(w/v),约29％,28％,27％,26％,25％,24％,23％,22％,21％,或约20％海藻糖(w/v),约19％,18％,17％,16％,15％,14％,13％,12％,11％,或约10％海藻糖(w/v),或约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,或约1％或更少的海藻糖(w/v)。优选地，用于口服给药的包含海藻糖的组合物包含约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,或约1％或更少的海藻糖(w/v)。

当包含海藻糖的组合物用于胃肠外给药时，组合物可包含约50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％,10％,5％,或约1％或更少的海藻糖(w/v)。例如，用于胃肠外给药的组合物可包含约50％,49％,48％,47％,46％,45％,44％,43％,42％,41％,或约40％海藻糖(w/v),约39％,38％,37％,36％,35％,34％,33％,32％,31％,或约30％海藻糖(w/v),约29％,28％,27％,26％,25％,24％,23％,22％,21％,或约20％海藻糖(w/v),约19％,18％,17％,16％,15％,14％,13％,12％,11％,或约10％海藻糖(w/v),或约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,或约1％或更少的海藻糖(w/v)。优选地，用于口服给药的包含海藻糖的组合物包含约29％,28％,27％,26％,25％,24％,23％,22％,21％,或约20％的海藻糖(w/v)。本文公开的包含海藻糖的胃肠外组合物中海藻糖和任选的海藻糖酶抑制剂的量的其他指导可以如美国专利9,125,924中所述，其公开内容以其整体并入本文。

包含海藻糖的组合物的pH可以约为2-9。优选地，海藻糖的pH约为4.5-8.0。更优选地，海藻糖的pH约为4.5-7.0。

如上所述，包含海藻糖的组合物可进一步包含海藻糖酶抑制剂。优选地，海藻糖酶抑制剂是美格鲁特。当包含海藻糖的组合物还包含美格鲁特时，该组合物可包含约10,50,100,150,200,250,300,350,400,450,或约500mg的美格鲁特。例如，包含海藻糖的组合物还包含约10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,150,或约200mg的美格鲁特,约100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,或约200mg的美格鲁特,约200,210,220,230,240,250,260,270,280,290,300,310,320,330,340,或约350mg的美格鲁特,或约300,310,320,330,340,350,360,370,380,390,或约400mg的美格鲁特。

本领域技术人员将理解，当本公开的组合物包含海藻糖时，该组合物包含用于抑制由海藻糖组成的蛋白激酶B的单一活性成分。因此，优选的组合物是包含海藻糖作为单一活性成分的组合物。另一种优选的组合物是包含海藻糖和美格鲁特的组合物。

或者，当本公开的组合物包含海藻糖时，该组合物可进一步包含除海藻糖之外的一种或多种AKT抑制剂。例如，包含海藻糖的组合物可以进一步包含除海藻糖之外的一种，两种，三种或更多种AKT抑制剂。除海藻糖之外的AKT抑制剂可以如下所述。

(b)其他AKT抑制剂

本公开的组合物还可包含除海藻糖之外的AKT抑制剂。除海藻糖之外的AKT抑制剂的非限制性实例可包括抗体或抗体片段，受体配体，小分子，肽，多肽，脂质，碳水化合物，核酸，siRNA，shRNA，反义RNA，枝状聚合物，微泡或适体，或其组合。适用于除海藻糖之外的本公开组合物的AKT抑制剂是本领域已知的。适用于本发明组合物的AKT抑制剂的非限制性实例包括8-[4-(1-氨基环丁基)苯基]-9-苯基-1,2,4-三唑并[3,4-f][1,6]萘啶-3(2H)-酮(MK-2206)、N-{(1S)-2-氨基-1-[(3,4-二氟苯基)甲基]乙基}-5-氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-2-呋喃甲酰胺、API-2、AKT VIII、哌立福辛、GSK690693、GSK690693、GSK2141795、依帕他赛(GDC-0068)、SR13668、BAY1125976、AZD5363、BKM120、TIC10、Akti-1/2、SC79、奥瑞舍替(Afuresertib)(GSK2110183)、PF-04691502、AT7867、AT13148、模拟物(Analogue)、曲西立滨(Triciribine)、PHT-427、A-674563、CCT128930、A-443654、VQD-002、Palomid 529、和厚朴酚、A-674563、BX795、米替福新、哌立福辛(perifosine)、磷酸-Akt(Ser473)抗体、磷酸-(Ser/Thr)Akt底物抗体、全-AKT抗体和AKT抗体。本领域过去已经描述的其他AKT抑制剂可包括国际专利公开WO2008070016,WO2006135627,WO2008006040,WO2008070134,WO2011055115,WO2010088177,WO2011077098和WO2008070041的AKT抑制剂，其公开内容以其整体并入本文。本领域技术人员将认识到，适用于本公开组合物的AKT抑制剂可以是正在开发的AKT抑制剂和/或正在进行临床试验的AKT抑制剂。例如，正在进行临床试验的AKT抑制剂可以如clinicaltrials.gov/ct2/results？term＝AKt&Search＝Search中所述。

包含除海藻糖之外的AKT抑制剂的组合物可包含除海藻糖之外的一种以上AKT抑制剂的组合。例如，组合物可包含除海藻糖之外的一种，两种，三种或更多种AKT抑制剂。此外，如上所述，应当认识到，当本公开的组合物包含除海藻糖之外的AKT抑制剂时，该组合物可进一步包含海藻糖。

适用于本发明组合物的优选AKT抑制剂是MK-2206。MK-2206是一种口服生物可利用的变构全-AKT抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。MK-2206以非ATP竞争方式结合并抑制AKT的活性。MK-2206的化学结构如下所示。

如本领域技术人员将认识到的，本公开的组合物中AKT抑制剂的量可以并且将根据AKT抑制剂，给药途径，溶酶体病症，症状的严重程度，对象的年龄，体重和一般状况，以及医生的判断和其他因素，并且可以通过实验确定。当本公开的组合物包含MK-2206作为AKT抑制剂时，该组合物优选配制用于口服给药，并且可包含约1至约500mg MK-2206，约10至约200mg MK-2206，约30mg至约100mg MK-2206，或约100至约300mg MK-2206。

(c)药物组合物

本发明提供了包含AKT抑制剂的药物组合物。药物组合物可进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂。赋形剂可以是稀释剂。稀释剂可以是可压缩的(即可塑性变形的)或磨蚀性的脆性。合适的可压缩的稀释剂的非限制性实例包括微晶纤维素(MCC)，纤维素衍生物，纤维素粉末，纤维素酯(即乙酸酯和丁酸酯混合酯)，乙基纤维素，甲基纤维素，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，玉米淀粉，磷酸化玉米淀粉，预糊化玉米淀粉，大米淀粉，马铃薯淀粉，木薯淀粉，淀粉-乳糖，淀粉-碳酸钙，羟基乙酸淀粉钠，葡萄糖，果糖，乳糖，乳糖一水合物，蔗糖，木糖，乳糖醇，甘露醇，麦哲醇，山梨糖醇，木糖醇，麦芽糖糊精和海藻糖。合适的磨蚀性脆性的稀释剂的非限制性实例包括磷酸氢钙(无水或二水合物)，磷酸三钙，碳酸钙和碳酸镁。

赋形剂也可以是粘合剂。合适的粘合剂包括但不限于淀粉，预糊化淀粉，明胶，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，乙基纤维素，聚丙烯酰胺，聚乙烯基噁唑烷酮，聚乙烯醇，C₁₂-C₁₈脂肪酸醇，聚乙二醇，多元醇，糖类，低聚糖，多肽，寡肽及其组合。

赋形剂可以是填充剂。合适的填充剂料包括但不限于碳水化合物，无机化合物和聚乙烯吡咯烷酮。作为非限制性实例，填充剂可以是硫酸钙，二-和三-碱式的，淀粉，碳酸钙，碳酸镁，微晶纤维素，磷酸氢钙，碳酸镁，氧化镁，硅酸钙，滑石，改性淀粉，乳糖，蔗糖，甘露醇或山梨糖醇。

赋形剂可以是缓冲剂。合适的缓冲剂的代表性实例包括但不限于磷酸盐，碳酸盐，柠檬酸盐，三(羟甲基)氨基甲烷(tris)缓冲液和缓冲盐水盐(例如Tris缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)。赋形剂也可以是用于改变渗透压的盐。

赋形剂可以是pH调节剂。作为非限制性实例，pH调节剂可以是碳酸钠，碳酸氢钠，柠檬酸钠，柠檬酸或磷酸。

赋形剂可以是用于改变渗透压的盐。如本领域技术人员将认识到的，通常调节胃肠外制剂的重量摩尔渗透压浓度以匹配人血浆的重量摩尔渗透压浓度(290mOsm/L)。因此，本公开的胃肠外制剂的重量摩尔渗透压浓度可为约280至约330mOsm/kg。

赋形剂可以是崩解剂。崩解剂可以是非泡腾的或泡腾的。非泡腾崩解剂的合适实例包括但不限于淀粉，例如玉米淀粉，马铃薯淀粉，其预糊化和改性的淀粉，甜味剂，粘土，例如膨润土，微晶纤维素，藻酸盐，羟基乙酸淀粉钠，如琼脂，瓜尔胶，刺槐豆胶，刺梧桐树胶，果胶(pecitin)和黄蓍胶的树胶。合适的泡腾崩解剂的非限制性实例包括碳酸氢钠与柠檬酸的组合以及碳酸氢钠与酒石酸的组合。

赋形剂可以是分散剂或分散增强剂。合适的分散剂可包括但不限于淀粉，海藻酸，聚乙烯吡咯烷酮，瓜尔胶，高岭土，膨润土，纯化木纤维素，羟基乙酸淀粉钠，异戊酸硅酸盐和微晶纤维素。

赋形剂可以是防腐剂。合适的防腐剂的非限制性实例包括：抗氧化剂，例如BHA，BHT，维生素A，维生素C，维生素E或棕榈酸视黄酯，柠檬酸，柠檬酸钠；螯合剂，例如EDTA或EGTA；和抗微生物剂，例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇或苯酚。

赋形剂可以是润滑剂。合适的润滑剂的非限制性实例包括矿物质，例如滑石或二氧化硅；和脂肪，如蔬菜硬脂精，硬脂酸镁或硬脂酸。

赋形剂可以是味道掩蔽剂。味道掩蔽材料包括纤维素醚；聚乙二醇；聚乙烯醇；聚乙烯醇和聚乙二醇共聚物；甘油单酯或甘油三酯；丙烯酸聚合物；丙烯酸聚合物与纤维素醚的混合物；醋酸邻苯二甲酸纤维素；以及它们的组合。

赋形剂可以是调味剂。调味剂可选自合成香料油和调味芳香剂和/或天然油，源自植物，叶子，花，果实的提取物，以及它们的组合物。

赋形剂可以是着色剂。合适的着色添加剂包括但不限于：食品、药物和美容剂色素(FD&C)、药品和美容剂色素(D&C)或外用药物和美容剂色素(Ext.D&C)。

基于组合物的总重量，组合物中赋形剂或赋形剂组合的重量分数可为约99％或更少，约97％或更少，约95％或更少，约90％或更少，约85％或更少，约80％或更少，约75％或更少，约70％或更少，约65％或更少，约60％或更少，约55％或更少，约50％或更少，约45％或更少，约40％或更少，约35％或更少，约30％或更少，约25％或更少，约20％或更少，约15％或更少，约10％或更少，约5％或更少，约2％，或约1％或更少。

本发明的药物组合物可配制为与其预期的给药途径相容。给药途径的示例包括胃肠道外给药，例如静脉内、皮内、皮下、口服(如吸入)、透皮(局部)、经粘膜和直肠给药。用于胃肠道外、皮内或皮下应用的溶液或悬液可包括以下组分：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和调节张力的物质如氯化钠或右旋糖。pH可用酸或碱，例如盐酸或氢氧化钠调节。胃肠道外制剂可封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。

口服组合物通常可包括惰性稀释剂或可食用载体。口服组合物可包封在凝胶胶囊中或压制成片剂。对于口服治疗给药目的，可用赋形剂将活性化合物掺入并以片剂、含片或胶囊的形式使用。口服组合物也可使用液体载体制备以用作漱口水，其中液体载体中的所述化合物口服使用以及冲刷并吐出或吞咽。药学上可相容的结合剂和/或辅助材料可作为组合物的一部分包含在内。片剂、丸剂、胶囊、含片等可含有任何以下成分或具有相似特性的化合物：粘合剂例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖，崩解剂例如海藻酸、羧甲基淀粉(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或完全氢化植物油(Sterotes)；助流剂例如二氧化硅胶体；甜味剂例如蔗糖或糖精；或调味剂例如薄荷、水杨酸甲酯、橙调味剂。就吸入给药而言，所述化合物以来自含合适推进剂(例如，如二氧化碳气体)或喷雾剂的受压容器或分配器的气雾剂喷雾形式递送。

本发明的药物组合物也可配制为与胃肠外给药途径相容。例如，适于注射应用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性时)或分散液，以及用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、克列莫佛EL(巴斯夫(BASF)，新泽西州帕西潘尼)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在示例性实施方式中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)配制本发明的药物组合物。

所有情况下，组合物可以无菌，并可以是达到存在易注射性(easysyringability)程度的流体。组合物可以在生产和贮存的条件下稳定并且可以针对微生物如细菌和真菌的污染作用加以保存。载体可以是包含水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可维持合适的流动性，例如通过使用诸如卵磷脂的涂料、分散液情况下通过保持所需粒度以及通过使用表面活性剂。也可通过各种抗菌剂和抗真菌剂(如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)实现防止微生物的作用。在许多情况下，组合物中可优选地包含等张剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、或氯化钠。可在组合物中包含延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝和明胶)以延长可注射组合物的吸收。

可将所需量的活性化合物和一种上述组分或其组合根据需要掺入合适溶剂后过滤灭菌，从而制备无菌注射液。通常，将活性活化物掺入含有碱性分散介质和上述其它所需成分的无菌载剂中来制备分散液。在制备无菌注射液所需的无菌粉末时，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，由之前无菌过滤的溶液得到活性组分和任何其它所需组分的粉末。

也可通过经粘膜或透皮方法进行全身给药。对于经粘膜或透皮给药，在制剂中采用适合渗透屏障的渗透剂。这类渗透剂通常为本领域已知，并包括例如用于经粘膜给药的去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药可通过使用鼻喷雾或栓剂实现。对于透皮给药，将活性化合物配制成药膏、软膏、凝胶或霜剂，如本领域通常已知的那样。还可以栓剂(例如使用常规的栓剂基料，如可可油或其他甘油酯)或滞留灌肠剂的形式制备化合物用于直肠递送。

所述活性化合物可联合载体制备，所述药学上可接受的载体保护所述化合物不被身体快速清除，例如控释配方，包括植入和微囊化递送系统。可利用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备该制剂的方法是本领域技术人员显而易见的。这些可按本领域技术人员已知的方法制备，例如，如美国专利4,522,811中所述。

在某些实施方式中，将本公开的活性成分包封在合适的载剂中以有助于将化合物递送至靶细胞，增加组合物的稳定性，或使组合物的潜在毒性最小化。如本领域技术人员所理解的，各种载剂适合于递送本发明的组合物。合适的结构化流体递送系统的非限制性实例可包括纳米颗粒，脂质体，微乳液，胶束，枝状大分子和其他含磷脂的系统。将组合物掺入递送载剂的方法是本领域已知的。

在一个可选的实施方式中，可使用脂质体递送载剂。取决于实施方式，脂质体适合于鉴于其结构和化学性质递送本发明的化合物。一般而言，脂质体是具有磷脂双层膜的球形囊泡。脂质体的脂质双层可以与其他双层(例如，细胞膜)融合，从而将脂质体的内容物递送至细胞。以这种方式，本发明的活性成分可以通过包封在与靶细胞膜融合的脂质体中而选择性地递送至细胞。

脂质体可以由具有不同烃链长度的各种不同类型的磷脂组成。磷脂通常包含通过甘油磷酸酯连接到各种极性基团之一的两种脂肪酸。合适的磷脂包括磷脂酸(PA)，磷脂酰丝氨酸(PS)，磷脂酰肌醇(PI)，磷脂酰甘油(PG)，二磷脂酰甘油(DPG)，磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)。包含磷脂的脂肪酸链的长度可以为约6至约26个碳原子，并且脂质链可以是饱和的或不饱和的。合适的脂肪酸链包括(括号中的通用名称)正十二烷酸酯(月桂酸酯)，N-十三烷酸酯(肉豆蔻酸酯)，正十六烷酸酯(棕榈酸酯)，正十八烷酸酯(硬脂酸酯)，正二十烷酸酯(花生酸酯)，正二十二烷酸酯(山嵛酸酯)，正二十四烷酸酯(木蜡酸酯)，顺式-9-十六烯酸酯(棕榈油酸酯)，顺式-9-十八烷酸酯(油酸酯)，顺式，顺式-9,12-十八碳二烯酸酯(亚油酸酯)，所有顺式-9,12,15-十八碳三烯酸酯(亚麻酸酯(linolenate))，和所有顺式-5,8,11,14-二十碳四烯酸酯(花生四烯酸)。磷脂的两条脂肪酸链可以相同或不同。可接受的磷脂包括二油酰PS，二油酰PC，二硬脂酰PS，二硬脂酰PC，二肉豆蔻酰PS，二肉豆蔻酰PC，二棕榈酰PG，硬脂酰基，油酰基PS，棕榈酰基，亚麻酰基(linolenyl)PS等。

磷脂可以来自任何天然来源，并且因此可以包含磷脂的混合物。例如，蛋黄富含PC，PG和PE，大豆含有PC，PE，PI和PA，动物脑或脊髓富含PS。磷脂也可能来自合成来源。可以使用具有不同比例的各种磷脂的磷脂混合物。不同磷脂的混合物可导致脂质体组合物具有有利的活性或活性稳定性。上述磷脂可以与阳离子脂质以最佳比例混合，N-(1-(2,3-二油酰基(dioleoly)氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵,1,1’-双十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐,3,3’-去庚基氧杂羰花青碘化物,1,1’-十二烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐,1,1’-二油酰基(dioleyl)-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青甲烷磺酸盐,N-4-(去亚油基氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶鎓碘化物,或1,1,-二亚油酰基(dilinoleyl)-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐。

脂质体可任选地包含鞘脂(其中鞘氨醇是甘油的结构对应物和磷酸甘油酯的脂肪酸之一)或胆固醇(动物细胞膜的主要组分)。脂质体可任选地含有聚乙二醇化脂质，其是与聚乙二醇(PEG)聚合物共价连接的脂质。PEG的大小范围可为约500至约10,000道尔顿。

脂质体可进一步包含合适的溶剂。溶剂可以是有机溶剂或无机溶剂。合适的溶剂包括但不限于二甲基亚砜(DMSO)，甲基吡咯烷酮，N-甲基吡咯烷酮，乙腈，醇，二甲基甲酰胺，四氢呋喃或其组合。

携带本公开的活性成分(即，具有至少一种甲硫氨酸化合物)的脂质体可以通过任何已知的制备用于药物递送的脂质体的方法来制备，例如，在美国专利4,241,046,4,394,448,4,529,561,4,755,388,4,828,837,4,925,661,4,954,345,4,957,735,5,043,164,5,064,655,5,077,211和5,264,618中详述，其公开内容在此全文引入作为参考。例如，脂质体可以通过在水溶液中超声处理脂质，溶剂注射，脂质水合，反向蒸发，或通过反复冷冻和解冻的冷冻干燥来制备。在优选的实施方式中，脂质体通过超声形成。脂质体可以是多层的，其具有像洋葱那样的许多层，或是单层的。脂质体可以大或小。持续的高剪切超声处理倾向于形成较小的单层脂质体。

对于普通技术人员显而易见的是，可以改变控制脂质体形成的所有参数。这些参数包括但不限于温度，pH，蛋氨酸化合物的浓度，脂质的浓度和组成，多价阳离子的浓度，混合速率，溶剂的存在和浓度。

在另一个实施方式中，本公开的活性成分可以作为微乳液递送至细胞。微乳液通常是透明的，热力学稳定的溶液，包括水溶液，表面活性剂和“油”。在这种情况下，“油”是超临界流体相。表面活性剂位于油-水界面。任何各种表面活性剂适用于微乳液制剂，包括本文所述的那些或本领域已知的那些。适用于本发明的含水微区通常具有约5nm至约100nm的特征结构尺寸。这种尺寸的聚集体是不良的散射体，因此，这些溶液是光学透明的。如本领域技术人员所理解的，微乳液可以并且将具有多种不同的微观结构，包括球形，棒形或盘形聚集体。在一个实施方式中，该结构可以是胶束，这是最简单的微乳液结构，通常是球形或圆柱形物体。胶束就像油滴在水中，反胶束就像油滴中的水。在另一个实施方式中，微乳液结构是薄片。它包括由表面活性剂层分隔的连续水和油层。微乳液的“油”最佳地包含磷脂。以上针对脂质体详述的任何磷脂都适用于涉及微乳液的实施方式。本公开的活性成分可以通过本领域公知的任何方法包封在微乳液中。

在另一个实施方式中，本发明的活性成分可以在枝状大分子或枝状聚合物中递送。一般而言，枝状聚合物是支化的树状分子，其中每个分支是在一定长度之后分成两个新的分支(分子)的分子的互连链。这种分支一直持续到各分支(分子)变得如此密集以至于树冠形成一个球体。通常，枝状聚合物的性质由其表面的官能团决定。例如，亲水性端基(例如羧基)通常会形成水溶性枝状聚合物。或者，磷脂可以掺入枝状聚合物的表面中以促进皮肤的吸收。详述用于脂质体实施方式的任何磷脂都适用于枝状聚合物实施方式。可以使用本领域公知的任何方法制备枝状聚合物并将本发明的活性成分包封在其中。例如，枝状聚合物可以通过反应步骤的迭代序列产生，其中每次额外的迭代产生更高级的枝状聚合物。因此，它们具有规则的、高度支化的3D结构，具有几乎均匀的尺寸和形状。此外，枝状聚合物的最终大小通常由合成期间使用的迭代步骤的数量控制。各种枝状聚合物尺寸适用于本发明。通常，枝状聚合物的尺寸可以为约1nm至约100nm。

药物组合物的其他制剂可以参见例如Hoover,John E.,雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences),Mack Publishing Co.,Easton,Pa.(1975),以及Liberman,H.A.和Lachman,L.,编纂,药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms),MarcelDecker,New York,N.Y.(1980)。

本领域技术人员将认识到，本发明的活性成分在药物组合物中的浓度可以并且将部分地取决于给药途径，对象和给药原因，并且可以通过实验确定。在药物组合物中实验测定活性剂如本发明的纳米颗粒的浓度的方法是本领域已知的。

II.治疗溶酶体贮积症和以溶酶体功能障碍为特征的病症的方法

另一方面，本发明提供了在对象中治疗溶酶体贮积症和以溶酶体功能障碍为特征的病症的方法。本发明的方法包括通过抑制对象的AKT来治疗对象的溶酶体贮积症和以溶酶体功能障碍为特征的病症。通过向对象施用治疗有效量的包含AKT抑制剂的组合物，在对象中抑制AKT。AKT抑制剂可以是海藻糖。或者，AKT抑制剂是海藻糖以外的AKT抑制剂。

如本文所用，术语“治疗”可用于描述溶酶体贮积症和以溶酶体功能障碍和/或其一种或多种相关症状为特征的病症的预防，改善，防止或治愈。例如，治疗现有的溶酶体贮积症和以溶酶体功能障碍为特征的病症可以减少，改善或完全消除病症，或防止病情恶化。如果疾病随后发展，预防性治疗可以降低发生疾病的风险和/或减轻其严重性。

术语“溶酶体贮积症和以溶酶体功能障碍为特征的病症”在本文中可用于描述可能由溶酶体代谢受损或任何由溶酶体功能障碍表现或加剧的病症引起的任何病症。存在至少60种已知的溶酶体贮积症和许多其他以溶酶体功能障碍为特征的病症，其可能影响身体的不同部位，包括骨骼，脑，皮肤，心脏和中枢神经系统。以溶酶体功能障碍为特征的其他疾病处于持续被发现中。可以使用本公开内容的方法治疗的溶酶体功能障碍为特征的溶酶体贮积症和病症的非限制性实例包括：天冬氨酰葡糖氨酸尿症，幼年神经元蜡样质脂褐质沉积症(JNCL，幼年贝登氏病或CLN3病)，胱氨酸病，法布里病，戈谢病I型，II型和III型，糖原贮积病II(庞贝氏病)，GM2-神经节苷脂病I型(泰伊-萨克斯二氏病)，GM2-神经节苷脂病II型(Sandhoff病)，异染性脑白质营养不良，粘液病I型，II/III型和IV型，粘多糖贮积疾病(胡氏(Hurler)病和变体，亨特病(Hunter)，沙费利波症A，B，C，D型，莫奎欧氏症A型和B型，马-拉二氏症(Maroteaux-Lamy)和Sly病)，尼曼-匹克氏病A/B，C1和C2型，亨廷顿氏病，脊髓小脑性共济失调，帕金森病和阿尔茨海默病，以及I型和II型辛德勒病。

本公开内容的方法可以包括通过抑制对象的AKT来治疗患有JNCL的对象的幼年神经元蜡样质脂褐质沉积症(JNCL)。因此，本公开的方法包括通过向对象施用治疗有效量的包含AKT抑制剂的组合物来治疗对象中的JNCL。优选地，AKT抑制剂是海藻糖。还优选地，AKT抑制剂是MK-2206。

JNCL是儿童期最常见的神经退行性疾病。JNCL的标志是大多数神经细胞和各种脑外组织中的蜡样质脂褐素的溶酶体内积聚，表明自噬-溶酶体途径受损。JNCL表现为视力衰竭和听力丧失，并且包括癫痫发作，运动功能障碍和痴呆症。JNCL患者经历了无情的身体和认知衰退，导致生命在30岁之前死亡。因此，使用本公开的方法治疗JNCL可以防止患有JNCL的对象的神经细胞和各种脑外组织中的蜡样质脂褐素的溶酶体积聚，或者可以减少或消除蜡样质脂褐素的溶酶体内积聚。确定蜡样质脂褐素的溶酶体内积聚的方法是本领域已知的，并且可以如实施例中所述。另外，使用本公开的方法治疗JNCL可以预防，逆转或阻止对象的认知衰退。确定对象中由JNCL引起的认知衰退的方法是本领域已知的，并且可以如实施例中所述。例如，使用本公开的方法治疗JNCL可以预防，逆转或阻止视力衰竭。使用本公开的方法治疗JNCL还可以预防，逆转或阻止听力损失。使用本公开的方法治疗JNCL还可以降低癫痫发作的严重性和/或强度。另外，使用本公开的方法治疗JNCL可以改善或预防运动功能障碍。使用本公开的方法治疗JNCL还可以改善或预防痴呆。

使用本公开的方法治疗JNCL还可以延长有此需要的对象的寿命。使用本公开的方法，患有JNCL的对象的中位寿命可以延长约1％,5％,10％,15％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,或约90％，或者直至疾病不再是对象寿命的影响因素。例如，本公开的方法可以将患有JNCL的对象的中位寿命延长约60％,65％,70％,75％,80％,85％,或约90％，或者直至疾病不再是对象寿命的影响因素。或者，本公开的方法可以使患有JNCL的对象的中位寿命延长约20％,25％,30％,35％,40％,45％或约50％。本公开的方法还可以将患有JNCL的对象的中位寿命延长约1％,2％,3％,4％,5％,6％,7％,8％,9％,10％,11％,12％,13％,14％,15％,16％,17％,18％,19％,20％,21％,22％,23％,24％或约25％。

在又一方面，本发明提供了一种使用海藻糖的方法，该方法包括通过使蛋白激酶B与包含海藻糖的组合物相接触来抑制蛋白激酶B的活性。通过使具有蛋白激酶B的细胞与包含海藻糖的组合物接触，或通过向对象施用包含海藻糖的组合物来接触蛋白激酶B。疾病状况可以是溶酶体贮积症或以溶酶体功能障碍为特征的病症，过度增殖性疾病或免疫病症。

在另一方面，本发明提供了一种增强表现出功能失调的溶酶体清除的细胞中未降解物质清除的方法，该方法包括通过使细胞与包含蛋白激酶B抑制剂的组合物接触来抑制细胞中的蛋白激酶B。可以在体外接触细胞。或者，可以通过给予需要的对象包含一定量蛋白激酶B抑制剂的组合物来体内接触细胞。

(a)对象

对象可以是啮齿动物，人，牲畜，陪伴动物或动物学动物。在一个实施方式中，对象可以是啮齿动物，例如小鼠，大鼠，豚鼠等。在另一个实施方式中，对象可以是家畜。合适的家畜动物的非限制性实例可包括猪，牛，马，山羊，绵羊，美洲驼和羊驼。在又一个实施方式中，对象可以是陪伴动物。陪伴动物的非限制性实例可包括宠物，例如狗，猫，兔和鸟。在又一个实施方式中，对象可以是动物学动物。如本文所用，“动物学动物”是指可以在动物园中发现的动物。这些动物可包括非人灵长类动物，大型猫科动物，狼和熊。在一些优选的实施方式中，对象是小鼠。在其他优选的实施方式中，对象是人。

对象可能具有或不具有与溶酶体贮积症或以溶酶体功能障碍为特征的病症相关的体征或症状。技术人员将理解，病理性溶酶体贮积症和以溶酶体功能障碍为特征的病症可能在诊断与溶酶体贮积症相关的症状或以溶酶体功能障碍为特征的症状或在这些症状发作之前开始。因此，有此需要的对象可以是具有与溶酶体贮积症或以溶酶体功能障碍为特征的病症相关的症状的对象，或者没有与溶酶体贮积症或以溶酶体功能障碍为特征的病症相关的任何症状的对象，或仅与溶酶体贮积症或以溶酶体功能障碍为特征的病症相关的一种或一些症状。

(b)给药

对于治疗应用，将治疗有效量的本发明组合物给予对象。如本文所用，术语“治疗有效量”的AKT抑制剂是指足以对需要治疗的溶酶体贮积症和以溶酶体功能障碍为特征的病症产生可测量作用的AKT抑制剂的量。可改变本发明治疗组合物中活性成分的实际剂量水平，以便给予有效实现特定对象所需治疗反应的量的活性成分。

对于任何AKT抑制剂，治疗持续时间可以是从一次性给药的单剂量到终生的治疗过程。治疗的持续时间可以并且将根据对象和待治疗的疾病而变化。例如，治疗持续时间可以是1天，2天，3天，4天，5天，6天或7天。或者，治疗持续时间可以是1周，2周，3周，4周，5周或6周。或者，治疗持续时间可以是1个月，2个月，3个月，4个月，5个月，6个月，7个月，8个月，9个月，10个月，11个月或12个月。治疗持续时间也可以是1年，2年，3年，4年，5年或大于5年。还预期给药可以持续一段时间，然后给药可以断开一段时间。例如，治疗持续时间可以是5天，然后断开治疗9天，然后再治疗5天。

治疗的给药时间相对于疾病本身和治疗持续时间将取决于病例周围的情况。治疗可以立即开始，例如在诊断时，或者可以在其他治疗之后开始治疗。治疗可以在医院或诊所本身开始，或者在出院后或在门诊诊所看过之后开始

本文所述组合物的施用可以作为治疗方案的一部分进行，所述治疗方案可以包括一种或多种包含AKT抑制剂的组合物的施用以及其他药物活性组合物的施用的多个实例。这样的方案可以被设计为治疗溶酶体贮积症或以溶酶体功能障碍为特征的病症的方法，和/或作为在治疗疾病后长期维持患者健康的方法(例如，预防)。治疗方案可以被设计为治疗对于溶酶体贮积症或以溶酶体功能障碍为特征的病症无症状的对象的方法。此类治疗方案可延迟对象中溶酶体贮积症或以溶酶体功能障碍为特征的病症和/或溶酶体贮积症或以溶酶体功能障碍为特征的病症的症状的发作。应当理解，确定合适的治疗方案在本领域技术人员的技能范围内。

可以使用标准有效技术进行给药，包括外周(即，不通过给予中枢神经系统)或局部给予中枢神经系统。外周给药可包括但不限于皮下，皮内，静脉内，肌肉内和腹膜内。局部给药，包括直接进入中枢神经系统(CNS)，可包括但不限于通过腰椎，心室内或实质内导管给药，或使用手术植入的控释制剂。本发明的组合物可以通过输注(连续或推注)给药。

本领域技术人员将理解，可以使用多于一种本发明组合物的组合。本领域技术人员还将理解，本公开的组合物可以在用本公开的组合物治疗之前，之后和/或期间与其他治疗剂组合使用。此外，本发明的方法可以与特定溶酶体贮积病症和以溶酶体功能障碍为特征的病症的标准治疗组合使用。

选择的剂量水平可取决于多种因素，包括组合物中具体的AKT抑制剂，治疗组合物的活性，制剂，给药途径，与其他药物或治疗的组合，疾病，需要治疗的对象的寿命和身体状况，以及既往病史。例如，当活性成分是海藻糖时，组合物中海藻糖酶抑制剂的存在和包含海藻糖和任选海藻糖酶的组合物的预期给药途径可以影响选择的海藻糖剂量水平。

已经确定海藻糖在显著高于预期治疗剂量的剂量下是安全且无毒的。包含除海藻糖之外的AKT抑制剂的组合物的毒性和治疗功效(如果未知)可通过细胞培养物或实验动物中的标准药学方法测定，例如，用于确定最大耐受剂量(MTD)的方法，用于确定ED₅₀(即实现50％最大响应的有效剂量的方法，以及用于确定治疗指数(TI)(即MTD与ED₅₀的比率)的方法。显然，具有高TI的组合物是本文中最优选的组合物，优选的剂量方案是将海藻糖的血浆水平维持在或高于最小浓度以维持所需治疗效果的那些。在一些实施方式中，可施用最小剂量的包含AKT抑制剂的组合物，并且在不存在剂量限制性毒性的情况下增加剂量。确定和调整治疗有效剂量，以及评估何时以及如何进行这种调整，是医学领域普通技术人员已知的。

当给药途径是口服时，包含海藻糖的组合物的给药剂量范围可以是约10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,200,300mg/Kg体重/天,或最高达约400,450,500,550,600,650,700,750,800,850,900,950和1000mg/Kg体重/天。例如，包含海藻糖的组合物的口服剂量范围可以是约10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,200,或约300mg/Kg体重/天。包含海藻糖的组合物的口服剂量范围可以是约150,160,170,180,190,200,210,220,230,240,250,260,270,280,290,或约300mg/Kg体重/天。或者，包含海藻糖的组合物的口服剂量范围也可以是约400,450,500,550,600,650,700,750,800,850,900,950和1000mg/Kg体重/天。优选地，包含海藻糖的组合物的口服剂量范围可以是约0.1g/kg/天至1g/kg/天。

或者，当肠胃外施用本发明包含海藻糖的组合物时，海藻糖组合物可如美国专利9,125,924中所公开的那样施用，其公开内容以其整体并入本文。当给药途径是肠胃外时，包含海藻糖的组合物的给药剂量范围可以是约10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,200,300mg/Kg体重/天,或最高达约400,450,500,550,600,650,700,750,800,850,900,950和1000mg/Kg体重/天。例如，包含海藻糖的组合物的胃肠外剂量范围可以是约10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,200,或约300mg/Kg体重/天。包含海藻糖的组合物的胃肠外剂量范围可以是约150,160,170,180,190,200,210,220,230,240,250,260,270,280,290,或约300mg/Kg体重/天。或者，包含海藻糖的组合物的胃肠外剂量范围也可以是约400,450,500,550,600,650,700,750,800,850,900,950和1000mg/Kg体重/天。包含海藻糖的组合物的胃肠外剂量范围可以是约0.1g/kg/天至1g/kg/天。剂量可以小于0.54g/kg/天。

当施用本发明包含海藻糖并且还包含美格鲁特作为海藻糖酶抑制剂的组合物时，美格鲁特的给药剂量范围可以是约10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,200,300mg/Kg体重/天，或者最高达约400,450,500,550,600,650,700,750,800,850,900,950和1000mg/Kg体重/天。例如，美格鲁特可以以约30至约100mg/Kg，约100至约300mg/Kg，或约100至约150mg/Kg的剂量施用。

当静脉内施用时，包含海藻糖的组合物的给药时间可以是约5分钟的时间内直至数天或数周的时间。优选地，当静脉内施用时，可以在约75,80,85,90,95至约120分钟的时间内施用包含海藻糖的组合物。更优选地，当静脉内施用时，可以在少于90分钟内施用包含海藻糖的组合物。

此外，可以静脉内施用包含海藻糖的组合物，使得最大内毒素水平小于每小时每千克体重5EU。具体说，可以静脉内施用包含海藻糖的组合物，使得内毒素水平小于每小时每千克体重约1,2,3或小于约4个内毒素单位。

无论是口服给药还是胃肠外给药，可给予包含海藻糖的组合物以在海藻糖给药后约10至约20或30或40或50或60分钟内达到有效的海藻糖血清水平。在某些实施方式中，活性成分的有效血清水平在海藻糖给药后约5至约20或30或40或50或60分钟内达到。在某些实施方式中，活性成分的有效血清水平在海藻糖给药后约10至约20或30或40或50或60分钟内达到。在某些实施方式中，活性成分的有效血清水平在海藻糖给药后约5,10,15,20,30,40,50或60分钟内达到。

可以施用包含海藻糖的组合物，使得总日剂量(在施用当天)为约5克至50克。在优选的实施方式中，每次给药剂量的海藻糖总量为8,15或30克。在具体实施方式中，海藻糖以5,8,15,30,40或50克的单剂量施用。

海藻糖的给药频率可以是每天一次，两次，三次或更多次，或者每周或每月一次，两次，三次或更多次，取决于有效治疗症状或疾病的需要。在某些实施方式中，给药频率可以是每日一次，两次或三次。例如，可以每24小时，每12小时或每8小时施用一剂。在一个具体实施方式中，给药频率可以是每周三次。在另一个具体实施方式中，给药频率可以是每周一次。在另一个具体实施方式中，给药频率可以是每天。

当组合物包含MK-2206作为AKT抑制剂时，MK-2206的给药剂量范围可以是约10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,200,300mg/Kg体重/天。例如，MK-2206的给药剂量范围可以是约10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,200,或约300mg/Kg体重/天。MK-2206的给药剂量范围也可以是约150,160,170,180,190,200,210,220,230,240,250,260,270,280,290,或约300mg/Kg体重/天。或者，MK-2206的给药剂量范围也可以是约400,450,500,550,600,650,700,750,800,850,900,950和1000mg/Kg体重/天。优选地，MK-2206的给药剂量范围也可以是约100mg/kg/天至150mg/kg/天。

III.使用海藻糖的方法

另一方面，本发明提供了使用海藻糖的方法。该方法包括在需要的对象中给予海藻糖以治疗对象中由蛋白激酶B介导的疾病状况。由蛋白激酶B介导的疾病状况可以是溶酶体贮积症或以溶酶体功能障碍为特征的病症，过度增殖性疾病，子宫内膜疾病，代谢疾病和关节炎。优选地，使用海藻糖的方法包括治疗溶酶体贮积症或以溶酶体功能障碍为特征的病症，并且可以如上所述。

使用海藻糖的方法可以进一步包括治疗过度增殖性疾病，例如癌症。包含海藻糖的组合物和使用海藻糖的方法可以如上所述。可以治疗的肿瘤或癌细胞的非限制性实例包括：急性淋巴细胞系白血病，急性骨髓性白血病，肾上腺皮质癌，AIDS相关癌症，AIDS相关淋巴瘤，肛门癌，阑尾癌，星形细胞瘤(儿童小脑或脑)，基底细胞癌，胆管癌，膀胱癌，骨癌，脑干胶质瘤，脑肿瘤(小脑星形细胞瘤，脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤，室管膜瘤，成神经管细胞瘤，幕上原始神经外胚层肿瘤，视通路和下丘脑胶质瘤)，乳腺癌，支气管腺瘤/类癌，伯基特淋巴瘤，类癌(儿童期，胃肠道)，原发灶不明癌，中枢神经系统淋巴瘤(原发性)，小脑星形细胞瘤，脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤，宫颈癌，儿童癌症，慢性淋巴细胞性白血病，慢性粒细胞白血病，慢性骨髓增生性疾病，结肠癌，皮肤T细胞淋巴瘤，促纤维增生性小圆细胞肿瘤，子宫内膜癌，室管膜瘤，食管癌，尤文氏肿瘤家族中的尤文氏癌，颅外生殖细胞肿瘤(儿童期)，性腺外生殖细胞肿瘤，肝外胆管癌，眼癌(眼内黑色素瘤，视网膜母细胞瘤)，胆囊癌，胃癌，胃肠道类癌，胃肠道间质瘤，生殖细胞肿瘤(儿童颅外，外颅，卵巢)，妊娠滋养细胞肿瘤，胶质瘤(成人，儿童脑干，儿童脑星形细胞瘤，儿童视通路和下丘脑))，胃类癌，毛细胞性白血病，头颈癌，肝细胞癌(肝癌)，霍奇金氏淋巴瘤，下咽癌，下丘脑和视通路胶质瘤(儿童期)，眼内黑色素瘤，胰岛细胞癌，卡波西肉瘤，肾癌(肾细胞癌)，喉癌，白血病(急性淋巴细胞，急性髓细胞，慢性淋巴细胞，慢性粒细胞，毛细胞)，唇癌和口腔癌，肝癌(原发性)，肺癌(非小细胞，小细胞)，淋巴瘤(艾滋病相关，伯基特，皮肤T细胞，霍奇金，非霍奇金，原发性中枢神经系统)，巨球蛋白血症(瓦尔登斯特伦)，骨/骨肉瘤恶性纤维组织细胞瘤，成神经管细胞瘤(儿童期)，黑色素瘤，眼内黑色素瘤，默克细胞癌，间皮瘤(成人恶性，童年)，具有隐匿原发灶的转移性鳞状颈癌，口腔癌，多发性内分泌肿瘤综合征(儿童期)，多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤的蕈样肉芽肿，骨髓增生异常综合征，骨髓增生异常/骨髓增生性疾病，髓性白血病(慢性)，髓性白血病(成人急性，儿童急性)，多发性骨髓瘤，骨髓增生性疾病(慢性)，鼻腔和鼻窦癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤，非霍奇金氏淋巴瘤，非小细胞肺癌，口腔癌，口咽癌，骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤，卵巢癌，卵巢上皮癌(表面上皮-间质瘤)，卵巢生殖细胞肿瘤，卵巢低恶性潜在肿瘤，胰腺癌，胰腺癌(胰岛细胞)，鼻窦和鼻腔癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，咽癌，嗜铬细胞瘤，松果体星形细胞瘤，松果体生殖细胞瘤，松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤(儿童期)，垂体腺瘤，浆细胞瘤，胸膜肺母细胞瘤，原发性中枢神经系统淋巴瘤，前列腺癌，直肠癌，肾细胞癌(肾癌)，肾盂和输尿管移行细胞癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤(儿童期)，唾液腺癌，肉瘤(尤文肿瘤家族，卡波西，软组织，子宫)，塞扎里综合症，皮肤癌(非黑色素瘤，黑色素瘤)，皮肤癌(默克细胞)，小细胞肺癌，小肠癌，软组织肉瘤，鳞状细胞癌，具有隐匿原发灶的鳞状颈癌(转移性)，胃癌，幕上原始神经外胚层肿瘤(儿童期)，T细胞淋巴瘤(皮肤)，睾丸癌，咽喉癌，胸腺瘤(儿童期)，胸腺瘤和胸腺癌，甲状腺癌，甲状腺癌(儿童期)，肾盂和输尿管移行细胞癌，滋养细胞肿瘤(妊娠)，未知原发灶位点癌(成人，儿童期)，输尿管和肾盂移行细胞癌症，尿道癌，子宫癌(子宫内膜)，子宫肉瘤，阴道癌，视通路和下丘脑神经胶质瘤(儿童期)，外阴癌，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和肾母细胞瘤(儿童期)。

使用海藻糖的方法可以进一步包括治疗由AKT介导的免疫病症。因此，本发明的方法还可包括使用海藻糖来治疗疾病和病症，例如类风湿性关节炎，骨关节炎，克罗恩病，血管纤维瘤，眼部疾病(例如，视网膜血管形成，糖尿病性视网膜病，年龄相关性黄斑变性，黄斑变性等)，肥胖，阿尔茨海默病，再狭窄，自身免疫性疾病，过敏，哮喘，子宫内膜异位症，动脉粥样硬化，静脉移植狭窄，动脉周围假性移植物狭窄，前列腺增生，慢性阻塞性肺病，银屑病，抑制组织修复引起的神经损伤，瘢痕组织形成(并有助于伤口愈合)，多发性硬化，炎性肠病，感染，特别是细菌，病毒，逆转录病毒或寄生虫感染(通过增加细胞凋亡)，肺部疾病，肿瘤，帕金森病，移植排斥(作为免疫抑制剂)，感染性休克等。

定义

当本发明或其示例性实施方式引入元件时，冠词“一种”、“一个”、“该”和“所述”是指存在一种或多种元件。术语“包含”、“含有”、和“具有”意欲包括和指除了列出的元素还有额外的元素。

本文所用的术语“治疗”和“处理”是指降低体征或症状的严重性和/或频率，消除体征或症状和/或潜在病因，预防症状发生和/或其根本原因(例如，预防性治疗)，以及损害的改善或补救。

术语“有效量”和“治疗有效量”可互换使用，并且是指无毒但足够量的药物或药剂以提供所需效果。

术语“药学上可接受的”是指可以掺入给予患者的药物组合物中而不会引起任何不希望的生物学效应或以有害方式与包含它的组合物的任何其他组分相互作用的物质。当术语“药学上可接受”用于指药物载体或赋形剂时，其表示所述载体或赋形剂符合毒理学和生产测试的所需标准或其包含于美国食品药品管理局制定的非活性成分指南。

尽管本文所述的发明易于各种改良和另外反复，其具体实施方式已于上详细描述。然而应理解，对于这些组合物的详细描述并不旨在将本公开限制在公开的具体实施方式中。而是应理解本发明旨在包括落在权利要求书所定义的本发明的精神和范围中的所有改良、等价物，及替代方式。

实施例

下列实施例描述本发明的多个实施方式：

实施例1-3的介绍

神经退行性疾病对公共健康构成重大负荷，由于预期寿命延长和全球人口老龄化，预计未来几十年公共卫生将增加。与其他人类健康状况不同，神经退行性疾病已被证明对试图停止或减缓其进展极其难以控制。实际上，对于任何显著延长寿命或改变临床进展的神经退行性疾病都没有经过批准的治疗方法¹。因此，神经退行性疾病代表未满足的医学病症，迫切需要鉴定有效的、药理学上可操作的靶标。

越来越多的遗传和实验证据汇集在细胞清除途径上，作为神经退行性疾病发病机制的主要过程。事实上，绝大多数患有神经退行性疾病的患者由于细胞降解系统不堪重负或受损而导致未消化的大分子异常神经元积聚^2,3。确定的原因包括积聚倾向蛋白的异常产生(其导致细胞不能有效进行处理)以及遗传缺陷(其直接或间接影响自噬-溶酶体降解途径)⁴。因此，一种普遍的方案正在出现，提出在这些疾病条件下增强细胞清除将有助于维持细胞稳态和预防神经细胞死亡^5,6。发明人最近鉴定了监测溶酶体生物发生和功能的遗传方法，为操纵溶酶体降解途径提供了合适的靶标⁷。基本的螺旋-环-螺旋转录因子EB(TFEB)确实通过增强包括溶酶体增殖⁸，降解酶表达^8,9，自噬¹⁰，溶酶体胞吐作用¹¹和溶酶体蛋白稳态¹²在内的几个过程作为细胞清除的主要调节因子。体内基于TFEB异源表达的研究表明，在神经退行性疾病(例如阿尔茨海默病^13,14，滔蛋白病变¹⁵，帕金森病¹⁶和亨廷顿病^8,17)的啮齿动物模型中，疾病表型的清除得到改善和缓解。TFEB药理活化的机会源于基于细胞的研究，表明TFEB受雷帕霉素复合物1(mTORC1)^18-20的机制靶标的负调控，这是限制自噬诱导的主要已知因子。细胞中mTORC1的催化抑制导致TFEB活化；然而，雷帕霉素(mTORC1变构抑制剂及其类似物在mTOR相关的翻译应用中是领先的研究)在激活TFEB方面效果非常不佳^18–20。实际上，尚未提出TFEB活化的药理学疗法。因此，需要确定激活TFEB的替代途径，以便在转化应用中推进该领域。

以下实施例将丝氨酸/苏氨酸激酶Akt(蛋白激酶B)鉴定为药理学上可操作的靶标，其独立于mTORC1控制TFEB活性。发现葡萄糖的非还原性二糖，α-D-吡喃葡萄糖基α-D-吡喃葡萄糖苷或海藻糖，mTOR非依赖性自噬诱导剂²¹，通过抑制Akt促进TFEB的核转位。显示海藻糖施用减少了表现出未降解的蛋白质材料的异常溶酶体内积累的原型神经变性疾病的小鼠模型中的疾病负荷。已经证明TFEB活性受Ser467处的Akt磷酸化调节，并且Akt药理学抑制促进了存在溶酶体途径损伤的多种遗传疾病模型中的细胞清除。Akt活性的调节是集中临床研究的主题。

实施例1-3的方法

细胞培养和处理

对照(科里尔研究所(Coriell Institute),USA)和JNCL成纤维细胞(盖斯林研究所(Gaslini Institute),意大利)在补充有10％热灭活的胎牛血清(FBS,AtlantaBiologicals公司)、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素(Invitrogen公司)的DMEM(1:1,HyClone公司)中生长。HeLa细胞与LY294002(50mM,细胞信号公司)、Torin 1(300nM,卡曼化学公司公司)孵育2小时，或者与海藻糖(100mM,Sigma公司)、雷帕霉素(300nM,Sigma公司)孵育24小时，MK2206(1μM,Selleckchem公司)、U0126(10mM,Tocr is公司)和透析血清(GE医疗生命科学公司)孵育30分钟。

皮质和海马神经元培养

从E17.5和出生后第0-1天小鼠制备皮质和海马神经元，并将其接种到补充有GlutaMAX-1(Invitrogen公司)、B-27和1％FBS的Neurobasal培养基中的聚-D-赖氨酸包被的六孔板(BD Biosciences公司)。在体外天数(DIV)4，用100mM海藻糖处理神经元。在DIV8，收集神经元并进行RNA提取。

皮质星形胶质细胞培养

从P 0-1小鼠中分离星形胶质细胞，并在补充有10％FBS和100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM高葡萄糖的存在下，在聚-D-赖氨酸包被的六孔板(BD Biosciences公司)上铺板。7天后，除去神经胶质细胞层，将星形胶质细胞接种处理。在第二天将100mM海藻糖的量溶解在培养基中并保持4天。最后，收集星形胶质细胞并通过蛋白质印迹分析分析蛋白质提取物。

免疫荧光试验

对于免疫荧光测定，细胞在24孔板中的盖玻片上生长。处理后，用PBS洗涤细胞并用甲醇固定10分钟。然后用封闭试剂(0.1％皂苷，10％牛血清的PBS溶液)封闭细胞1小时，并在室温下与适当的一抗(1：100)一起温育3小时。用PBS洗涤三次后，将细胞与合适的二抗(1：500)在室温下孵育1小时。然后用含有4,6-二脒基-2-苯基吲哚(H-1200)的Vectashield安装盖玻片，用于通过共聚焦显微镜成像。

Western印迹

收集脑组织和培养的细胞并在包含蛋白酶混合物(罗氏)和磷酸酶(SIGMA)抑制剂的RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.4，1％NP40,0.5％脱氧胆酸盐，0.1％SDS，150mMNaCl，2mM EDTA和50mM NaF)中裂解。使用牛血清白蛋白作为标准，用二辛可宁酸蛋白质测定试剂盒(伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯公司(Pierce，Rockford，IL))测量蛋白质浓度。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离裂解物，然后转移到硝酸纤维素膜上。将印迹在封闭缓冲液(5％，w/v，在Tris缓冲盐水中干燥的脱脂乳，pH7.4和0.2％吐温20，TBST)中孵育，然后与在封闭缓冲液(5％干乳)中稀释的适当抗体一起孵育过夜。通过LAS 4000(GE医疗集团(GE Healthcare))获得Western印迹图像并使用ImageJ定量。已裁剪图像以供演示。全尺寸图像呈现在图27中。

抗体

针对Akt(#9272,1:1,000),磷酸-Akt(S473)(#4060,1:500),磷酸-Akt(T308)(#13038,1:500),p70S6K(#9202,1:1,000),磷酸-P70S6K(T389)(#9205,1:500),4E-BP1(#39452,1:1,000),磷酸-4EBP1(T37/46)(#9459,1:500),S6核糖体蛋白(#2217,1:1,000),磷酸-S6核糖体蛋白(S240/244)(#2214,1:1,000),LAMP1(#3243,1:1,000),组蛋白3(#4469,1:1,000),磷酸-(Ser)14-3-3结合基序(#9601S,1:500),Rictor(#2114,1:500),Raptor(#2280,1:500),ERK1/2(#9102,1:1,000),磷酸-ERK1/2(#9101,1:1,000),GSK-3b(D5C5Z)XP(#12456S,1:1,000),磷酸-GSK-3b(Ser9)(#9336S,1:500),GFP(D5.1)(#29556,1:1,000)和人TFEB(#4240,1:500)的抗体购自细胞信号公司(Cell Signaling)。针对GAPDH(#32233,1:1,000)的抗体购自圣克鲁兹公司(Santa Cruz)。针对GFAP的抗体购自DAKO(#Z0334,1:1,000)。针对CD68的抗体购自AbD Serotec(#MCA1957,1:1,000)。针对小鼠TFEB的抗体购自Proteintech(#13372-1-AP,1:500)。小鼠抗-FLAG M2(#F1804,1:1,000)和兔抗-FLAG(#F7425,1:1,000)抗体购自西格玛公司(Sigma)。全14-3-3抗体(K-19)(#SC629,1:300)购自圣克鲁兹公司。TSC2抗体购自Abcam(#32554,1:1,000)。

细胞溶质和核蛋白分馏

通过移液将细胞沉淀重悬于含有抑制剂的裂解缓冲液(10mM Hepes pH 7.9,10mMKCl，0.1mM EDTA和0.4％Nonidet P40)中并在冰中保持30分钟。在全速旋转1分钟后，收集上清液作为胞质部分。用裂解缓冲液洗涤沉淀两次，并用含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的核缓冲液(20mM Hepes pH 7.9,0.4M NaCl和1mM EDTA)重悬。在Eppendorf振荡器上剧烈振荡15分钟后，将沉淀物全速旋转10分钟。将上清液用作核部分。

体外激酶试验

使用纯化的活性AKT1酶(SignalChem，加拿大里士满)进行体外激酶试验。在含有蛋白酶抑制剂和1mM Na₃V0₄的IP裂解缓冲液(20mM Tris，pH 7.5,150mM NaCl，1mM EDTA和1％Triton X-100)中制备IP的全细胞裂解物。将细胞裂解物(1,000μg)在4℃下与交联至蛋白A/G珠(皮尔斯交联IP试剂盒(Pierce Crosslink IP Kit)，纽约州格兰德岛的生命技术公司(Life Technologies，Grand Island，NY))的10μg小鼠抗FLAG抗体或小鼠IgG(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，密苏里州圣路易斯)孵育过夜，用IP裂解缓冲液总体积达300μl。通过离心收集免疫复合物，在IP裂解缓冲液中洗涤五次，并用10μl 3X FLAG肽洗脱。用1X激酶缓冲液(25mM Tris，pH7.5,5mMβ-甘油磷酸盐，10μMATP，2mM二硫苏糖醇，Na₃VO₄和10mM MgCl₂)将洗脱液稀释至30μl。通过在20μl激酶缓冲液中加入200ng AKT1和0.5μCi[γ-³²P]ATP(3,000Ci/mmol,PE生命分析科学公司(PerkinElmer Life Sciences))引发激酶反应。通过加入SDS-PAGE上样缓冲液并加热至95℃10分钟，在30℃温育15分钟后停止反应。将样品在4-12％SDS-PAGE凝胶上分离并通过放射自显影分析。根据制造商的说明，使用QuikChange XLII定点诱变试剂盒(Agilent)和以下寡聚物：5’-AGCAGCCGCCGGAGCGCCTTCAGCATGGAGGAG-3’(SEQ ID NO.1),5’-CTCCTCCATGCTGAAGGCGCTCCGGCGGCTGCT-3’(SEQ IDNO.2)，产生TFEB-S467A-3xFlag。

定量实时PCR

根据制造商的说明书，使用RNEasy试剂盒(Qiagen)从对照和JNCL成纤维细胞以及WT和Cln3^Δex7-8皮质神经元培养物中提取总RNA。处理一半小鼠脑用于RNA提取，并通过QuantiTect逆转录试剂盒(Qiagen)将1微克用于补充DNA合成。用于具有逆转录反应的PCR的引物列于表S1中。通过在CFX96 Touch实时检测系统(Bio-Rad Laboratories)上使用iQSYBR Green Supermix进行定量实时PCR。将样品在95℃下加热3分钟，95℃下11s(秒),60℃下45s，扩增39个循环，最后循环是95℃下10s，65℃下5s和95℃下5s。使用CFX管理器软件(Bio-Rad)进行分析，并从PCR扩增图中提取阈值循环(C_T)。使用ΔΔC_T方法测定相对基因表达，归一化为GAPDH(对于人类基因)和亲环蛋白(对于小鼠基因)。如前所述，基因的信使RNA水平的变化以倍数变化表示。误差线代表s.e.m.*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

RNA干扰

对于siRNA敲低，使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(Invitrogen)和StealthRNAi阴性对照双链体(Thermo-Scientific12935-300)或靶向AKT1的Stealth siRNA双链体(Thermo Scientific，HSS176614，HSS100346和HSS100345)转染细胞。针对Rictor的siRNA购自细胞信号公司(8622)。转染后72小时分析细胞。

微阵列实验

来自对照和具有和不具有海藻糖处理的JNCL成纤维细胞的总RNA(100mM，4天)用于制备用于与Illumina Human HT-12V4.0阵列平台杂交的互补DNA。实验一式三份进行。表达分析在美国德克萨斯州休斯顿的德克萨斯大学微阵列核心和细胞和调节生物实验室(Microarray Core and Cell and Regulatory Biology,University of Texas)进行。Po0.01用作评估差异基因表达的显著性阈值。GSEA如前所述进行^10,11。通过执行1,000个随机基因集成员资格分配来构建累积分布函数。标称P<0.01和FDR<10％用作ES显著性的阈值。使用默认参数，用网络工具DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)进行基因本体分析。如前所述进行途径共表达分析^8,9并使用Cytoscape以图形方式表示表达相关数据。

动物养殖

从Jackson实验室获得Cln3^Δex7-8小鼠(库存号004685；Cln3^tm1.1Mem/J；CD-1背景)³²。将对照(CD-1)和Cln3^Δex7-8小鼠每笼3-4只饲养在具有12小时光照/12小时黑暗循环的房间中。随意提供食物和水。在该研究中使用的所有小鼠在8和12月龄时进行分析，并且通过杂交的杂合Cln3^Δex7-8小鼠产生同窝小鼠。只有雄性用于此分析。研究人员在分析数据时不知情，不需要随机化。没有数据被排除在本研究之外。

腹腔注射

每隔一天给小鼠腹膜内注射MK2206(120mg/kg)四次。MK2206在30％Captisol水溶液中配制。向四只Cln3^Δex7-8小鼠注射MK2206，并且四只注射30％Captisol作为载体对照。

海藻糖处理

将海藻糖(Swanson)溶解在饮用水中至终浓度为2％并且每周更换两次。通过自发口服给予含有海藻糖的水至Cln3^Δex7-8和WT小鼠，从21日龄开始并持续至小鼠自然死亡的那天(寿命评估)或者将其处死用于其他研究。

免疫组织化学法

将8个月和12个月大的纯合Cln3^Δex7-8小鼠和年龄匹配的对照用异氟烷麻醉并用PBS经心脏灌注，然后用0.1％磷酸钠缓冲液(pH7.4)中的4％缓冲多聚甲醛灌注。随后取出脑并固定过夜。在切片之前，将脑在含有30％蔗糖的Tris缓冲盐水(TBS：50mM Tris，pH7.6)的溶液中冷冻保护。在96孔板中收集连续的40mm浮动冠状切片。然后用针对CD68或GFAP的初级抗血清染色系列切片，接着用兔抗大鼠(VectorLab)和猪抗兔(DAKO)二抗染色，并用Vectastain ABC(抗生物素蛋白-生物素)试剂盒(Vector)和二氨基联苯胺作为色原体检测免疫反应性。

胶质表型的定量分析

通过每个感兴趣的区域在三个连续的切片上捕获30个非重叠图像。所有RGB图像均使用X 40物镜通过安装在Zeiss Axioplan显微镜上的实时摄像机(JVC，3CCD，KY-F55B)捕获并保存为JPEG。在整个图像捕获过程中，所有参数(包括灯强度，摄像机设置和校准)都保持不变。随后使用ImageJ分析软件(NIH)用选择高于背景的前景免疫反应性的适当阈值分析图像。然后将该阈值作为常数应用于每批动物分析的所有后续图像和用于确定每个区域中每种抗原的免疫反应性的特定区域的试剂。该分析是对基因型盲法进行的。数据以图形方式绘制为对于每个地区每个视野的免疫反应性的平均百分比面积±s.e.m.。

贮积负荷

为了分析存在于每个脑区域中的自发荧光存储材料的相对水平，将跨S1BF和VPM/VPL的小鼠脑切片安装到涂有明胶铬的载玻片上，并用Vectashield(VectorLaboratories，英国彼得堡)覆盖滑动。使用Leica SP5共聚焦显微镜和488nm激发激光(Leica Microsystem)在X 63放大率下捕获来自每个切片的非重叠图像。进行阈值图像分析以确定每个区域中存在的贮积负荷。在图像捕获期间，所有激光参数和校准保持恒定。使用ImageJ(NIH)进行半定量阈值图像分析。

TEM

将小鼠麻醉并用盐水溶液心内灌注，然后用0.1M二甲胂酸钠缓冲液(pH7.4)中的2％甲醛+2.5％戊二醛灌注。取出脑并收集小块小脑和皮质，并进一步在2％甲醛和2.5％戊二醛，0.1M二甲胂酸钠缓冲液(pH7.4)中后固定24小时。用振动切片机切割100微米冠状切片并在0.1％二甲胂酸盐中1％OsO₄中固定1小时，用乙酸双氧铀染色脱水并包埋在Eponate812中。在RMC MT6000超薄切片机上获得60nm的超薄切片并用日立H7500透射电子显微镜检测。使用Gatan US1000高分辨率数码相机和数字显微镜软件(v1.82.366)捕获图像。

用于MRI的组织制备

在成像前经心脏灌注小鼠。移除头部，然后移除皮肤，肌肉，耳朵，鼻尖和下颌以暴露头骨。将头部在4％多聚甲醛中于4℃固定过夜。然后将头转移到PBS中的40mL 0.01％叠氮化钠中并在4℃下摇动7天。将头转移至5mM钆喷酸二葡甲胺(拜尔医疗药物有限公司(Bayer HealthCare Pharmaceuticals Inc.)，新泽西州韦恩市)和0.01％叠氮化钠的PBS溶液中，并在4℃下摇动25-35天。与钆喷酸二葡甲胺一起孵育可提高信噪比。在成像之前，将头部平衡至室温6-8小时。

核磁共振协议

在具有Paravision 5.0软件(瑞卡布鲁克公司，马塞诸塞州比尔瑞卡)的具有35mm体积谐振器(瑞卡布鲁克公司(Bruker BioSpin)，马塞诸塞州比尔瑞卡)的9.4T BrukerAvance Biospec光谱仪，21cm孔水平扫描仪上捕获每只小鼠总共48次扫描。三维DTI扫描参数如下：自旋回波，b值＝0和1,000s/mm²,20个扩散方向，一个非扩散加权图像，TR＝500ms(毫秒)，TE＝14.8ms，FOV＝1.7×1.2X 2.4cm或2.0X 1.4X 3.2cm，矩阵＝128X 96X 96，NEX＝1，δ＝3ms，Δ＝7ms。捕获时间约为15小时。

MRI图像处理

首先在DTI工作室处理MRI图像以推断分数各向异性。随后，使用Amira软件(Visage Imaging有限公司，加利福尼亚州圣地亚哥)来定义CC的ROI并计算每只小鼠的体积。CC的体积测量以盲法进行。

ABR测量

如前所述测量ABR ⁶⁹。简言之，使用腹膜内注射氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)麻醉10个月大的小鼠(每个基因型/治疗组n＝4-6)，然后固定在头部固定器中。通过将小鼠放在加热垫上，在整个过程中维持正常的体温。使用Tucker-Davis技术系统3数字信号处理硬件和软件(Tucker-Davis Technologies，Alachua，FL，USA)产生4至48kHz的纯音刺激，并且使用类型4,938¹/₄”压力场校准麦克风(Bruel和Kjar，

丹麦)校准音调刺激的强度。用插入头皮顶点，耳后区域和后腿(地面)的皮下针电极记录响应信号⁶⁹。通过以5dB步长将每个刺激的声强从90降低到10dB来确定听觉阈值，直到达到响应中具有可再现和可识别波的最低声强。将平均听力阈值±s.d.(dB SPL)绘制为刺激频率(kHz)的函数。统计分析包括方差的单向分析，以揭示总体趋势，伴随着在各个频率上的双尾Student’s t检验，以评估频率特异性效应。使用Holm方法调整T检验P值以进行多重比较。R(版本2.13)用于所有统计分析。

Akt磷酸位点预测

为了鉴定可能被Akt靶向的候选磷酸盐，从PhosphositePlus网站(www.phosphosite.org/)下载实验确定的非冗余Akt磷酸盐序列并用于构建PWM以使用MEME Suite扫描TFEB氨基酸序列4.11.0(meme-suite.org/)。通过使用具有默认参数的MultAlin(multalin.toulouse.inra.fr/)比对TFEB序列。

统计

结果表示为平均值±s.e.m.除非另有说明，否则每个参数的平均差异的统计学显著性通过基因型和治疗的方差分析确定，然后进行Tukey事后检验。P<0.05视作具有显著性。

研究批准

所有小鼠实验过程均得到贝勒医学院的机构动物护理和使用委员会的审查和批准。

数据可用性

作者声明，支持本研究结果的所有数据均可在文章及其补充信息文件中找到。基因表达微阵列的Gene Expression Omnibus登录号是GSE76643。

实施例1:海藻糖在JNCL模型中减弱神经病理学

mTORC1独立激活细胞清除的大多数记录的例子是由海藻糖施加的^22-26。本发明人假设海藻糖通过迄今未表征的途径激活TFEB，并开始使用由幼年神经元蜡样质脂褐质沉积症(JNCL或Batten病；OMIM#204200)(一种最普遍的神经退行性疾病)代表的异常溶酶体内贮积的原型模型来测试该假设。JNCL是由CLN3的突变引起的，CLN3是一种参与溶酶体同源稳态调控的基因^27–29，其特征是自噬损伤和蜡样质脂褐质的溶酶体内积聚，可通过共聚焦和电子显微镜检测^30,31。

对Cln3^Δex7-8小鼠口服给予海藻糖，这是一种已建立的JNCL模型³²，显著延长了它们的寿命。Cln3^Δex7-8小鼠的中位存活期从454天增加至522天(增加15％，对数秩P＝0.00566)并且最大寿命从544天增加至699天(增加28％；图1a)。JNCL患者的死后检查和神经影像学研究显示全身性脑萎缩，包括胼胝体(CC)和脑干显著变薄^33,34。JNCL小鼠的磁共振成像(MRI)研究报道，CLN3蛋白缺乏导致大脑相似的全身性萎缩，从而反映了人类的状况³⁵。在这项研究中，测量了12个月大的Cln3^Δex7-8小鼠的湿大脑重量(0.355±0.024g)，发现它确实显著低于年龄匹配的野生型(WT)小鼠(0.516±0.021g；P＝0.0016)；然而，这种差异通过海藻糖处理得到大大改善(0.473±0.028g；与未处理的Cln3^Δex7-8小鼠的差异，P＝0.032；图1b)。相反，给予海藻糖不影响Cln3^Δex7-8或WT小鼠的体重(图2)。我们接下来通过MRI分析评估固定脑的CC体积。每个样品48个堆叠的定量测量显示，与其WT对应物(16.81±0.89mm³；P＝0.0081；图1c)相比，Cln3^Δex7-8小鼠的CC体积显著减少(12.96±0.43mm³)，这种差异也可通过治疗改善(15.02±0.33mm³；与未处理的Cln3^Δex7-8小鼠的差异,P＝0.027；图1c)。用海藻糖处理的WT小鼠的分析未显示CC体积的任何显著变化(18.27±0.66mm³；图1c)。

6个月大的Cln3^Δex7-8小鼠在热板测定中表现出降低的疼痛敏感性，其通过海藻糖完全恢复(图1d)。在10个月大的小鼠中的听觉脑干反应(ABR)分析显示，相对于WT小鼠，Cln3^Δex7-8小鼠的ABR阈值升高(P＝0.01027)，表明低频听力损失(图3)。与未处理的年龄匹配的对照相比，海藻糖处理导致两种基因型中较低的ABR阈值，表明保护听觉功能(图3)。通过对11月龄小鼠进行视网膜电图分析，也尝试评价视网膜功能；然而，一些未治疗的WT小鼠显示出对测试的不良反应，表明严重的视力丧失。本文使用的小鼠集落(CD-1)的遗传背景先前已与约60％的雄性性和其他减少视力表型的遗传性视网膜变性相关^36,37。因此，不能进行视网膜电图的处理相关变化的评估。

接下来，进行Cln3^Δex7-8小鼠脑的显微分析以确定海藻糖是否改变了蜡样质脂褐素的积累。这些研究主要集中在初级躯体感觉桶状野外皮层(S1BF)和丘脑腹侧后内侧和外侧核(VPM/VPL)上，后者将感觉信息传递给S1BF，因为-与大脑的其他区域不同-两种结构在Batten病小鼠模型中持续受到严重影响³⁸。与WT小鼠相比，来自7个月和12个月大的Cln3^Δex7-8小鼠的两个区域都显示出强烈存在的点状自发荧光材料，发现在两个时间点通过海藻糖处理显著降低(图4a-d)。Cln3^Δex7-8小鼠脑的透射电子显微镜(TEM)分析证实了浦肯野细胞和皮质神经元中电子致密细胞质材料的显著积累(图4e，f)。更高的放大率显示这种电子致密材料由先前与人和小鼠JNCL病理学相关的特征指纹图谱结构(图5)组成^31,32。海藻糖处理显著减少了浦肯野细胞(P＝0.047)和皮质神经元(P＝0.017；图4e，f)中的指纹图谱的数量，证实了神经元中细胞清除的增强。接下来，评估海藻糖对炎症的影响。先前的研究报道了Cln3^Δex7-8小鼠的VPM/VPL和S1BF区域的反应性胶质增生和小胶质细胞激活³⁸。体视学分析显示，与年龄匹配的WT小鼠相比，7个月大的Cln3^Δex7-8小鼠在这些脑区域中具有GFAP和CD68免疫反应性的显著增加，因此证实了反应性胶质增生和小神经胶质细胞活化(图6a-d)。在12月龄时，星形细胞增生和小胶质细胞的活化都加剧(图6e-h)。通过给予海藻糖减轻了这种进行性神经炎症(图6a，c，e，f，h)。总之，数据显示在由溶酶体系统的初级损伤引起的原型贮积障碍模型中用mTORC1非依赖性清除增强剂治疗可减少脑萎缩，脂褐质积聚和神经炎症。

实施例2:mTORC1非依赖性激活TFEB和CLEAR网络

观察到Cln3^Δex7-8小鼠中贮积物质的减少表明海藻糖增强了溶酶体功能。TFEB通过直接结合存在于其启动子的“协调的溶酶体表达和调节”(CLEAR)位点来调节溶酶体基因的表达⁸。为了测试海藻糖是否诱导TFEB的核转位(TFEB激活细胞的标志)，检查了稳定表达TFEB-3xFLAG(HeLa/TFEB)⁸的细胞。共聚焦显微镜显示在24小时内给予海藻糖导致TFEB核转位(图7a)。定量分析显示，在该时间范围内，具有核TFEB的细胞从20增加至>80％(图7b)。最近的报道已经证明mTORC1使TFEB磷酸化，从而促进TFEB细胞溶质保留^18-20。为了机械地测试海藻糖是否通过mTORC1非依赖性途径激活TFEB，使用两种mTORC1的组成型活化模型。第一个模型是块状硬化复合体2基因无效的细胞Tsc2(Tsc2^-/-)³⁹。TSC2与TSC1形成异二聚体复合物，抑制mTORC1活性；因此，TSC2或TSC1的丢失导致组成型mTORC1活化⁴⁰。Tsc2^-/-小鼠胚胎成纤维细胞和对照小鼠胚胎成纤维细胞的Western印迹和共聚焦显微镜分析显示，与mTORC1抑制剂(雷帕霉素和Torin 1)不同，海藻糖不改变mTORC1信号传导(图7c；图8)并且不改变TFEB S211(mTORC1靶位点)^18,19(图9)的磷酸化，但即使用活性mTORC1也确实诱导TFEB核转位(图7d，e)。使用的第二个模型是在mTOR激酶结构域中携带E2419K氨基酸取代的构建体，其产生组成型活性mTOR(mTOR^E2419K)⁴¹。共聚焦显微镜分析显示海藻糖处理诱导用WTmTOR或mTOR^E2419K转染的细胞中TFEB的核转位(图7f，g)。总之，这些数据表明海藻糖信号传导优先于mTORC1对TFEB定位的控制。短干扰RNA(siRNA)介导的mTORC2特异性组分RICTOR的消耗在海藻糖存在或不存在下不影响TFEB亚细胞定位(图10a，b)，与之前的研究一致，表明mTORC2不调节TFEB核转位¹⁸。

然后探讨TFEB的海藻糖激活是否发挥对CLEAR网络特异性的转录效应，或海藻糖是否激活可能独立于TFEB的其他程序。为了解决这个问题，首先证实海藻糖在正常和病理条件下激活人原代细胞中的CLEAR网络。我们使用从患者来源的JNCL成纤维细胞中提取的信使RNA和在培养基中施用海藻糖后控制成纤维细胞进行实时定量PCR(qPCR)。结果显示在具有遗传背景的处理的与未处理的成纤维细胞中被测试的CLEAR基因的表达增加(图11a，b)。接下来，进行海藻糖处理后JNCL和对照成纤维细胞的微阵列表达分析。与未处理对照相比，表达水平至少有两倍变化的基因的基因本体分析表明，只有过量代表的基因类型与JNCL和对照成纤维细胞中的溶酶体代谢相关(两个分析均为倍数增加>5且P<10^-10)。共调节分析^8,9显示CLEAR基因位于由海藻糖诱导的基因网络的中心(图11c)，提示TFEB活化可能是细胞对海藻糖施用的第一转录反应。对照成纤维细胞中表达变化的基因组富集分析(GSEA)证实绝大多数溶酶体基因在海藻糖给药时上调(富集评分，ES＝0.67，P<0.0001；图11d)。在溶酶体代谢中具有已知作用的TFEB直接靶标的GSEA显示甚至更大的富集(ES＝0.82，P<0.0001；图11e)，表明海藻糖特异性激活TFEB介导的溶酶体调节。JNCL成纤维细胞中基因表达变化的GSEA产生相似的结果(图11f，g)；因此，CLN3缺乏不会破坏TFEB介导的溶酶体增强。

通过实时qPCR证实TFEB活化诱导来自WT和Cln3^Δex7-8小鼠的原代皮层神经元培养物中的CLEAR网络(图12a，b)。从WT和Cln3^Δex7-8小鼠的原代皮质星形细胞培养物中提取的蛋白质的免疫印迹显示给予海藻糖时LAMP1水平(溶酶体的标记物)增加(图13)，证实神经胶质细胞中的溶酶体扩增。小鼠脑切片的共聚焦显微镜检查和来自WT和Cln3^Δex7-8小鼠的全脑匀浆的实时qPCR的表达分析显示口服给予海藻糖导致TFEB核转位(图12c，d)和溶酶体和自噬基因的上调(图12E，F)。因此，TFEB和CLEAR网络在体内被激活。

实施例3:Akt通过在S467的磷酸化控制TFEB活性。

数据表明，药理学上可行的途径激活TFEB并增强细胞清除，与mTORC1无关。在真核细胞中，调节途径倾向于基于冗余的，动态分层的信号传导网络，其最大化输出效率，同时保持对不断变化的细胞条件的适应性^42,43。因此，有理由认为TFEB的上游调节因子可能位于包含mTORC1的相同信号级联中。mTORC1的激酶活性受TSC2的严格调节，TSC2在PI3K/Akt信号通路的磷酸化作用下变得无活性⁴⁴。因为对PI3K或Akt的抑制导致TFEB核转位类似于Torin1的mTORC1抑制(图14a，b)，因此研究了Akt是否直接调节独立于mTORC1的TFEB活性。Tsc2^-/-细胞用于在mTORC1的组成型活化条件下测试TFEB对Akt活性的反应性。与先前的研究⁴⁴一致，可以通过Tsc2^-/-细胞中的血清补充来刺激Akt活性，其中mTORC1途径对血清去除或刺激不敏感(图15a)。重要的是，血清饥饿的Tsc2^-/-细胞的血清再刺激导致TFEB细胞核-细胞溶质易位，这通过用Akt抑制剂MK2206预孵育来防止(图15b)。因此，独立于mTORC1的TFEB细胞溶质定位在血清刺激上需要Akt活性。还检查了与GSK3β可能的相互依赖性，GSK3β是另一种调节TFEB亚细胞定位的因子^45-47。免疫印迹分析显示海藻糖对GSK3β活性没有可检测的影响(图16a)，并且共聚焦显微镜分析显示海藻糖和MK2206均能够在表达组成型活性GSK3β的细胞中诱导TFEB的核转位(CA-GSK3β/S9A-GSK3β；图16b)。在交互实验中，GSK3β抑制剂CHIR-99021促进表达组成型活性Akt(Akt308D/473D或Akt-DD)的细胞中TFEB的核转位⁴⁸(图16c)。因此，这些结果表明Akt和GSK3β独立地调节TFEB。还证实海藻糖不抑制ERK，ERK是先前报道的TFEB活性的修饰物¹⁰(图17)。

为了确定Akt是否直接磷酸化TFEB，首先通过使用实验验证的Akt底物构建Akt靶序列的位置权重矩阵(PWM)，并使用Akt PWM来扫描来自多个物种的TFEB氨基酸序列。该分析将S467鉴定为Akt的保守候选磷酸受体基序(图14c)。当通过蛋白质印迹分析时，突变形式的TFEB(S467A)转变为较低分子量(图18)并且显示出与mTORC1靶位点的突变体类似的减少的细胞溶质定位和增加的双核-胞质分布(图14d)(图19)。重要的是，与WT TFEB相比，TFEB(S467A)显示出诱导TFEB靶基因表达的能力增强(图14e)。已显示细胞溶质TFEB与14-3-3蛋白相互作用^18,19。如所预期的，TFEB(S467A)显示减少的共定位和与14-3-3蛋白的相互作用可能是由于其增加的核定位(图14f，g)。TFEB(S467A)还在具有组成型活性mTORC1的细胞中显示核定位(图20)。

体外Akt激酶测定显示Akt使纯化的TFEB磷酸化，但不磷酸化TFEB的S467A突变形式(图14h)。因此，这些结果将TFEB鉴定为Akt的直接磷酸化底物，并证明S467是这种磷酸化的关键残基。双顺反子TFEB-Flag-IRES-绿色荧光蛋白(GFP)和TFEB(S467A)-Flag-IRES-GFP载体的转染显示突变型TFEB蛋白比WT TFEB更稳定(图21)，因此表明Akt也调节TFEB稳定性。AKT敲低增强TFEB核转位并增加LAMP1表达(图14i)，从而证实Akt负调节TFEB活性。重要的是，海藻糖抑制Akt活性同时增加自噬通量(图14j)，并且组成型活性Akt(Akt-DD)的表达消除了海藻糖对TFEB核转位的影响(图14k)。这些实验在机理上证明Akt抑制介导TFEB的海藻糖活化。在海藻糖处理的小鼠的脑中证实了海藻糖介导的Akt抑制(图141)。共免疫沉淀(IP)实验证实Akt与TFEB相互作用(图22a)，并且当使用S467A突变形式的TFEB时这种相互作用基本上没有变化(图22b)，表明海藻糖影响Akt的活性而不是其与TFEB相互作用。还测试了TFEB旁系同源物，MITF和TFE3是否对Akt活性有反应。用MITF和TFE3构建体转染的HeLa细胞的共聚焦显微镜分析显示用MK2206抑制Akt促进了这两种因子的核转位(图23)，因此表明可能保留这种调节机制。

由于其参与癌症，Akt是密集临床研究的主题。在Akt调节剂中，MK2206是一种有效的Akt口服抑制剂，目前正处于临床前和I期临床研究中^49,50。与海藻糖相似，向HeLa细胞施用MK2206导致LC3斑点数量增加(图24a)，LC3-II蛋白质水平增加(图24b)，并且通过TEM观察到自体囊泡数量增加(图24c)，表明MK2206激活自噬。此外，MK2206处理还上调溶酶体和自噬基因的表达(图24d)。腹膜内注射MK2206导致Akt活性的抑制(图24e)并导致小鼠脑中的TFEB核转位(图24f)，其反过来促进溶酶体和自噬基因的上调，如通过全脑匀浆的表达分析所检测的(图24g)。总之，这些数据提供了Akt的药理学抑制在体外和体内增强自噬-溶酶体途径的证据。

最后，测试了MK2206是否使用蜡样脂褐质的积累作为直接读数来调节细胞清除。MK2206在JNCL成纤维细胞中对Akt的抑制确实导致类似于用海藻糖处理观察到的蜡样脂褐质的清除(图25a)，其通过撤回MK2206或海藻糖而逆转(图26)。然后，使用具有其他溶酶体基因突变的细胞系来测试Akt抑制是否增强细胞清除，而不依赖于分子途径，其功能障碍导致异常的溶酶体内贮积。首先测试的是在编码棕榈酰-蛋白质硫酯酶-1(PPT1)的基因中携带突变的细胞系，PPT1是一种参与蛋白质降解的酶，其缺乏导致棕榈酰化蛋白质的内部贮积和神经变性(OMIM#600722)。以前的研究表明，棕榈酰化蛋白中硫酯键的化学切割导致PPT1缺陷小鼠模型的神经保护作用，从而直接将未降解蛋白的积累与疾病发病机制联系起来⁵¹。使用MK2206抑制Akt显著降低了携带PPT1突变的患者来源的原代成纤维细胞中的溶酶体内蛋白质积累(图25b)。类似地，MK2206施用降低了具有缺陷的三肽基肽酶I(TPP1；图25c)的原代成纤维细胞中的蛋白质累积，该外肽酶从蛋白质的N末端顺序去除三肽并且其缺陷导致神经变性(OMIM#607998)。最后，测试了由跨膜转运蛋白MFSD8(OMIM#611124)缺乏引起的溶酶体内贮积模型。虽然将MFSD8功能与蛋白质物质的累积联系起来的分子途径目前尚不清楚，但这种异常储存与神经变性有关。用MK2206抑制Akt导致MFSD8缺陷的原代成纤维细胞中的细胞清除显著增强(图25d)。总之，这些数据证明Akt抑制可以增强下游的细胞清除并且不依赖于主要的中断途径。基于本文提供的结果，提出Akt-TFEB信号传导途径(图25e中示意性)可以与小分子一起使用以改善神经变性疾病中毒性物质的清除。

实施例1-3的讨论

该研究将Akt对TFEB活性的控制鉴定为mTORC1非依赖性、药理学可操作的靶标，其与神经变性贮积疾病的治疗具有潜在相关性。TFEB确实是控制基于溶酶体的细胞清除的中心枢纽⁸，其潜在的治疗相关性已经在主要神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病，帕金森病和亨廷顿病的模型中得到证实，通过基于TFEB异源表达的原理证明研究^8,13–17。本文使用Batten病小鼠作为神经元溶酶体内贮积的体内模型呈现的数据表明，溶酶体增强可用于抵消由于溶酶体稳态和功能的初级损伤导致的清除途径中的缺陷。这些研究结果与溶酶体贮积症有关，如幼体形式的Batten病，是由膜结合蛋白的缺乏引起的，基于骨髓移植或基因治疗的方法固有地难以应用⁵²。更广泛地说，该发现对神经退行性贮积疾病具有潜在的兴趣，其中尚未建立经验证的治疗靶标，但实验证据已经确定细胞清除途径的增强作为候选治疗靶标。开创性的遗传和机制研究确实揭示了这些疾病中致病机制和溶酶体功能之间的紧密联系^2-6。

迫切需要了解如何药理学控制TFEB活性以推动该领域的发展，并帮助建立临床研究以评估TFEB介导的溶酶体增强在神经退行性疾病中的功效。最近基于细胞的研究表明，TFEB活性可能响应营养状态的变化，受mTORC1介导的特定丝氨酸残基磷酸化的调节^18-20。这代表了一项重大发现，因为已知mTORC1本身参与自噬的调节，因此已成为神经退行性疾病模型的临床前研究的主题。多项研究的结果表明，通过mTORC1抑制的自噬上调在亨廷顿氏病⁵³，阿尔茨海默病^54,55，tau病变⁵⁶，额颞叶痴呆⁵⁷，脊髓小脑性共济失调III⁵⁸型和家族性朊病毒病⁵⁹的小鼠模型中减弱了神经退行性病变。然而，通过调节蛋白质，脂质和核苷酸的合成⁶⁰，mTORC1作为控制合成代谢途径(如细胞生长)的中央调节中心，并且长期mTORC1抑制导致免疫抑制的诱导和伤口愈合受损^3,61。临床上，通过使用雷帕霉素(第一种鉴定的mTORC1变构抑制剂⁶²)或雷帕霉素类似物(其呈现改善的药理学特征)获得mTORC1抑制。然而，雷帕霉素对mTORC1的变构抑制对TFEB活化具有很小的影响或没有影响^18–20。我们鉴定了mTORC1非依赖性药理学激活TFEB的途径，为测试TFEB介导的神经退行性疾病细胞清除增强提供了新的途径。有趣的是，TFEB药理学活化和mTORC1变构抑制可用作自噬-溶酶体清除途径的正交、协同激活剂，理想地鉴定可最小化任一药物的潜在副作用的药物剂量。因此，Akt抑制剂和重要的双重PI3K/mTOR抑制剂的可用性增加可能证明对未来的临床前和临床研究有益。

Akt是AGC丝氨酸/苏氨酸激酶家族的成员，在细胞存活和细胞凋亡抑制中起关键作用。Akt的异常激活可能通过诸如Akt突变或上游信号传导途径失调等机制发生，并且是恶性进展和化学抗性的重要驱动因素⁶³。这使得Akt成为癌症治疗的潜在治疗靶点。确实正在进行强烈的临床前和临床努力，以表征由Akt调节的下游途径和测试癌症患者中Akt的化学抑制^49,50,64,65。有趣的是，开创性的研究表明，Akt调节巨自噬⁶⁶和分子伴侣介导的自噬⁶⁷。虽然像海藻糖这样的二糖如何调节Akt活化仍有待确定，但Akt通过TFEB调节溶酶体功能的发现为Akt在自噬-溶酶体清除途径中的作用的表征增加了关键层，并为理解临床使用Akt抑制剂影响细胞过程提供了新的视角。由于PI3K-Akt途径在来自分泌的生长因子的信号整合中起关键作用以刺激mTORC1活性，因此海藻糖对Akt的抑制不抑制mTORC1也是有趣的。响应生长因子，Akt磷酸化并抑制TSC2，TSC2通过维持mTORC1直接激活剂Rheb处于其无活性的GDP结合状态而充当mTORC1的负调节因子⁶⁸。另一种通过相同的TSC2/Rheb级联与Akt平行作用的mTORC1上游调节因子是ERK，其通过Ras-ERK Q5途径整合来自生长因子的信号。与Akt相似，ERK也抑制TSC2。我们发现海藻糖抑制Akt但不抑制ERK活性；因此，活性ERK可能足以使TSC2保持无活性，从而导致未修饰的mTORC1信号传导。TSC蛋白还整合来自其他途径的信号，因此额外的调节层可能是mTORC1对海藻糖不敏感的原因。

总之，鉴定Akt作为TFEB的mTORC1非依赖性调节剂为TFEB介导的细胞清除的药理学控制开辟了新的前景。TFEB的Akt调节可以在治疗上用于增强神经退行性储存障碍中的细胞清除，并且靶向Akt-TFEB信号传导途径的药物的可用性保证了针对TFEB介导的溶酶体增强在神经变性疾病中的临床转化的未来研究。

实施例4:美格鲁特以及海藻糖和美格鲁特的组合可抑制Batten小鼠的神经细胞死亡

Batten小鼠(Cln3KO小鼠)给予海藻糖，低剂量的美格鲁特，高剂量的美格鲁特，或海藻糖和美格鲁特的组合。在这些实验中使用两个对照：(1)未处理的Batten小鼠，和(2)未处理的野生型小鼠。测量神经细胞死亡(通过CAS-3阳性细胞的密度(细胞数/区域)测量)，神经炎症(通过神经元系统中GFAP阳性星形胶质细胞的数量测量)，以及巨噬细胞向神经系统的浸润(通过CD68的％面积测量)。

所有用美格鲁特处理的Batten小鼠比未处理的Batten小鼠具有更少的神经细胞死亡(P<0.05)。另外，所有用美格鲁特处理的Batten小鼠与野生型小鼠的神经细胞死亡无法区分(图30)。

所有用美格鲁特处理的小鼠比未处理的Batten小鼠具有更少的GFAP-阳性细胞(P<0.05)。另外，所有用美格鲁特处理的Batten小鼠与野生型小鼠的星形胶质细胞增生无法区分(图31)。

所有用美格鲁特处理的小鼠比未处理的Batten小鼠具有更少的巨噬细胞浸润(P<0.05)。另外，所有用美格鲁特处理的Batten小鼠与野生型小鼠的巨噬细胞浸润浸润无法区分(图32)。

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Claims (4)

1.一种包含蛋白激酶B抑制剂的组合物在制备用于在需要的对象中治疗幼年神经元蜡样质脂褐质沉积症的药物中的应用，其中，所述蛋白激酶B抑制剂是海藻糖，以及其中，所述组合物通过胃肠外给予所述对象。

2.如权利要求1所述的用途，其中，所述组合物以0.1g/kg至1g/kg海藻糖的每次给药剂量胃肠外给予。

3.如权利要求2所述的用途，其中，所述组合物还包含海藻糖酶抑制剂，所述海藻糖酶抑制剂是美格鲁特，所述美格鲁特可以以30至100mg/Kg，100至300mg/Kg，或100至150mg/Kg的剂量施用。

4.如权利要求2所述的用途，其中，所述海藻糖是海藻糖类似物，所述海藻糖类似物选自伦茨海藻糖A、伦茨海藻糖B和伦茨海藻糖C。

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