KR20190081719A - 산채복합 추출물을 함유하는 항염증 활성이 있는 프리바이오틱스를 갖는 프로바이오틱스 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 산채복합 추출물을 함유하는 항염증 활성이 있는 프리바이오틱스를 갖는 프로바이오틱스 조성물의 제조방법을 개시한다.
본 발명은 쇠비름, 죽순, 취나물, 뽕잎 건조시료를 활용하여 2:0.5:0.5:1로 혼합하여 물을 20배 가수하여 비스코자임 효소를 1% 첨가한 후 50℃에서 24시간 효소 분해하는 과정 및 효소 분해한 액을 100℃에서 3시간 열수 추출하여 추출물을 제조하는 과정 및 상기 추출액을 5~10 brix가 되도록 농축하는 과정으로 제조되는 산채복합 추출물로 이루어진 프리바이오틱스 제조단계와; 상기 산채복합물 프리바이오틱스에 잘 성장한 Lactobacillus fermentum , Lactobacillus casei , Lactobacillus plantarum , Bifidobacterium bifidum , Bifidobacterium animalis spp. Lactis 중 어느 하나 또는 하나 이상을 선발하여 프로바이오틱스를 구성하는 과정 및 유산균 복합 균주에 프락토올리고당을 5~10%, 난소화성말토덱스트린을 5~10%와 미량으로 치커리화이바, 분말유당, 결정셀룰로오스 중 어느 하나 또는 하나 이상을 포함하는 프로바이오틱스 제조단계로 구성된다.
이와 같이 구성되는 본 발명에 의해 제조된 산채복합 추출물의 프리바이오틱스는 산채복합물의 효소분해 추출물로 인해 최적 추출조건이 확립되어 총 페놀 화합물 및 플라보노이드 함유량이 높은 특징이 있고 이 추출물은 항염증 활성이 있어 장내 염증 활성을 낮출 수 있는 유용한 효과가 기대된다.
또한, 본 발명에 의한 프로바이오틱스 균주 선발은 산채복합 추출물에 성장이 우수한 [ Lactobacillus fermentum(락토바실러스 퍼멘텀), Lactobacillus casei(락보바실러스 카제이), Lactobacillus plantarum(락토바실러스 플란타륨), Bifidobacterium bifidum(비피도박테리움 비피둠), Bifidobacterium animalis spp. Lactis(비피도박테리움 에니멀리스 락티스)]를 선발하여 산채복합 추출물을 먹이로 하여 장내 유해균의 증식을 막고 유익한 균의 정작이 원활히 진행될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

산채복합 추출물을 함유하는 항염증 활성이 있는 프리바이오틱스를 갖는 프로바이오틱스 조성물 및 이의 제조방법{Probiotics with anti-inflammatory activation that contains charge complex extract and its method of manufacture}

본 발명은 산채복합 추출물을 함유하는 항염증 활성이 있는 프리바이오틱스를 갖는 프로바이오틱스 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

건강 및 질환에 영향을 미치는 여러 가지 요인들 중에서 염증과 산화스트레스는 여러 질환의 발병에 관여되는 것으로 알려져 있어 관심이 주목된다.

특히, 염증반응은 조직손상이나 면역인지로 염증성 매개체의 생성과 분비를 가져오고 이러한 매개체들의 인지와 결합으로 식세포가 내피세포에 부착하고 화학성 자극의 농도를 증가시키면서 혈류로부터 이동하게 되며, 신호발생영역 부근에서 염증성 매개체의 농도가 충분히 높아지면 자극인자를 소화시키거나 파괴하기 위해 또는 가수분해 효소나 유독성 산소생성물을 외부환경에 분비하기 위해 식세포가 완전히 활성화되는 데, 정상적인 생리조건에서는 자극인자가 제거된 후 염증은 진정되지만 병리적 상태에서는 염증성 반응이 만성적으로 되며 조직파괴로 이어진다.

이러한 염증반응은 비만, 노화, 동맥경화의 시작과 진행이나 암발생과의 연관성이 알려져 있고, 류마티스성 염증반응은 자가 항체에 대한 특정 면역성에 의해 작동되어 지엽적인 염증, 세포투과 및 조직손상을 일으키며, 이는 외래 미생물에 대해 방어적 면역에서 나타나는 것과 동일한 기전으로 일어난다. 또한, 산화스트레스는 생체 안에서 에너지 생성에 사용되는 산소의 일부로부터 만들어진 활성산소에 기인하거나 자외선 혹은 약물에 기인하여 생기는 데, 이를 제거하는 생체내의 방어시스템과의 균형이 무너질 때 암을 비롯한 여러 질병의 발병에 관여하므로 산화스트레스를 제거하는 항산화물질은 지질과산화와 자유라디칼을 저해하는 등의 과정을 통해 여러 질환의 발병을 완화시킬 수 있는 후보물질이 될 수 있다.

염증반응에 의한 질병 중 하나인 장염은 면역체계의 만성적인 원인인 창자 염증성 질환(Inflammatory bowel disease : IBD)으로 장 점막에 염증반응이 일어나서 상피에 손상 유도로 발병된다. 창자 염증성 질환 IBD는 궤양성 대장염 (Ulcerative colitis)과 크론씨 병(Crohn's disease : CD)으로 나누어 질 수 있고 크론씨 병은 점막에 있는 T 세포의 기능장애와 그에 따른 cytokine 생산정도가 정상상태와 달라져서 염증이 생기고 궁극적으로 소장과 대장의 점막이 손상되는 만성적인 염증성 질환이다.

인간의 장관 내에는 400여종 이상의 세균이 대장 내용물 g당 100조 정도의 숫자로 서식하고 있으며 일정한 균형을 유지하는 복잡한 생태계로 구성되어 있으며, 장내 균총은 유익균과 유해균으로 나눌 수 있으며, 이들의 균형에 의해 건강상태가 조절된다. 건강을 유지하기 위해서는 유익균이 많고 유해균이 적은 상태로 장내 균총을 유지시켜야 한다.

균총은 외부에서 유입된 음식물이나 스트레스, 호르몬 분비 등 인체의 상태에 따라 변화될 수 있으며, 이들이 생성하는 효소와 대사산물들은 여러 가지 물질의 인체 내 대사에 관여하고, 영양분이나 약물의 흡수, 독성물질의 생성에 영향을 미친다. 식습관과 환경조건에 따라 장내 미생물 분포의 균형이 붕괴되면 유해균의 침입 및 번식, 그에 따른 세균성 질환과 소화불량 등 생체에 다양 한 악영향을 끼치게 된다. 이러한 균형 붕괴를 예방하기 위해 간편하게 건강유지에 도움이 될 수 있는 미생물제제로서 프로바이오틱스의 개념이 등장하게 되었다.

프로바이오틱스란 2001년 WHO에서 살아있는 미생물로 서 적정량을 섭취하였을 때, 숙주에게 유익한 영향을 미치는 것으로 정의한 이래 현재까지 사용되고 있으며, 프로바이오틱스의 활성에 대한 연구에 의하면 항균활성, 항암효과, 숙주의 영양흡수 증진 면역력 강화, 활성산소 소거 등 다양한 생리 활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다.

즉, 프로바이오틱스는 장 기능과 면역력을 충분히 유지하기 위해 장내 세균이 매우 중요하며, 장내 유익균이 면역에 필요하는 것이 알려지면서 유익균, 유산균이 주목받고 있는데, 이 유익균, 유산균을 지칭하며, 프로바이오틱스라 불리는 유산균의 종류는 많은 종류가 있으며 유익균은 종마다 그 효능이 다르기 때문에 단일 균주의 제품보다는 여러 종류의 균이 다양하게 들어간 복합균주 제품이 개발되고 있다.

한편, 프로바이오틱스의 개념이 대두되면서 프리바이오틱스를 장내 잘 정착시키기고 성장에 도움이 되기 위하여 유산균의 먹이에 대한 연구가 시작되었고 유산균 먹이를 총칭하여 프리바이오틱스(prebiotics)라고 한다.

즉, 프리바이오틱스는 유익균이 장에서 정착해 생존하기 위한 일종의 먹이에 해당하는 것으로, 유익균에 먹이만 충분히 공급되는 경우 1마리가 하루만에 200억 마리로 증식한다.

Gibson & Roberfroid(1995)는 연구에서 프리바이오틱스를 대장에서 하나 또는 제한된 몇몇 세균의 성장과 활동을 선택적으로 자극하여 건강을 개선함으로써 숙주에게 유익을 주는 비소화성 식품 성분이라고 최초로 정의하였다. 흔히 알려진 프리바이오틱스로는 이눌린(inulin), 올리고프락토오스(oligofructose), 갈락토-올리고당(galacto-oligosaccharide), 갈락토프락토오스(galactofructose) 등이 있으며, 이들은 고유의 물리화학적 특성과 더불어 유산균의 기질로 작용하여 유산균의 활동을 도움으로써 건강에 도움을 준다.

따라서 식이 조절은 유익균의 장내 증식을 촉진시키고 유해균을 억제할 수 있는 방법 중 유용하며 천연물 소재 추출물을 이용하여 장내 유익균 증식에 관한 연구로는 인진쑥, 등록특허 10-1395875 대추, 오미자 및 미나리 발효액 등이 있다.

그러나 종래 기술에 따른 프로바이오틱스 들은 균의 종류에 따라 인체에 미치는 영향이 상이할 뿐만 아니라, 섭취한 프로바이오틱스가 원하는 신체 부위, 즉 소장, 대장 등까지 살아서 도달하는 확률 또한 낮은 문제가 있으며, 이에 프로바이오틱스의 체내 활성과 수명을 증진시키기 위하여 프로바이오틱스의 먹이가 되는 유기물들, 즉 프리바이오틱스를 프로바이오틱스와 함께 섭취하게 하고 있다.

한편, 산채류에 속하는 쇠비름(Portulaca oleracea L.)은 쇠비름과의 한해살이 식물로 예로부터 민간요법과 한방에서 널리 사용되어 왔으며, 오래 먹으면 장수한다는 의미로 장명채(長命菜)라고도 하고, 잎이 말의 이를 닮아 마치채(馬齒菜), 다섯 가지 색을 가지고 있어 오행초(五行草)라고도 불리며, 우리나라 각지의 길가, 채소밭, 빈터 등지에서 흔히 볼 수 있다. 쇠비름은 봄에서 여름까지의 연한 순을 데쳐 나물로 먹기도 하고, ‘본초강목’과 ‘동의보감’에서는 충독이나 사독 등의 해독제로도 사용한다. 쇠비름에 함유된 유효성분으로는 노르아드레날린, 도파민 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine(L-DOPA)과 같은 테르펜(terpene) 배당체가 다량 함유되어 있고, 잎이나 줄기에는 γ-리놀렌산과 같은 오메가 3 지방산의 함량이 높은 것으로 알려져 있다. 또한 다량의 식이섬유와 칼슘, 여러 종류의 유기산, 글루타민산(glutamic acid), 아스파틴산(aspartic acid), 페놀성 화합물, 알칼로이드, 칼륨, 비타민 B1과 C 등이 함유되어 있으며(17,18), 그 외 항 괴혈병제, 진경제, 이뇨제, 구충제, 피부진정제 및 항산화제로도 이용되는 것으로 알려지고 있다.

또 다른 산채류에 속하는 취나물은 우리나라에서 자생하며, 전국 산림이나 초생지에서 자생하는 다년생 풀로 항암, 항산화 활성이 우수하고, 저칼로리의 다이어트 식품으로 인식되어 소비 선호도가 높은 것으로 알려져 있다. 주로 봄에 어린 잎을 채취하여 생채, 나물, 쌈 등으로 식용하며, 이 같은 경우 출하시기가 한정적이고, 저장이 제한적이기 때문에 취나물은 건조 또는 데친 형태로 유통되고 있다.

죽순(Phyllostachys spp.)은 벼과(화본과)의 대나무족(bambuseae)에 속하는 식물로서 죽피로 둘러 쌓여있는 대나무의 어리고 연한 싹이다. 일반적으로 20-30 cm 높이로 자라면 이를 수확하여 식용으로 사용한다. 죽순은 지방과 콜레스테롤의 함량이 적은 반면, 단백질, 탄수화물 및 섬유질의 함량이 높고 비타민, 미네랄, 아미노산, 플라본 등의 영양학적 물질들이 풍부하여 건강식품으로서의 활용 가치가 높은 것으로 보고되어있다. 현재까지 보고된 죽순의 약리학적 작용은 항산화, 항암, 당뇨, 변비예방, 불면증, 비만증, 고혈압 등이 있다.

뽕나무의 잎은 한방의 전통생약으로 당뇨병을 예방, 치료하며 갈증을 해소시키는 것으로 알려져 있고, 뽕나무 잎에는 flavonoids, steroids, triterpenes, amino acids, vitamins 등과 다량의 미네랄 성분이 존재하며, 뽕잎의 혈당 강화효과에 대한 과학적인 입증 연구가 보고되고 있다.

본 발명의 발명자들은 생체 활성이 증진된 프로바이오틱스를 연구하던 중 특정 프로바이오틱스들을 위의 4가지의 산채 추출물과 함께 섭취시 건강이 증진되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

등록특허공보 제10-1395875호(2014.05.09) 등록특허공보 제10-1765559호(2017.08.01), 등록특허공보 제10-1498229호(2015.02.25),

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 창출된 것으로서, 본 발명의 목적은 현재까지 알려진 주요 프리바이오틱스와 프로바이오틱스에 관한 내용에 대한 발명으로 널리 알려진 프리바이오틱스에 위해 미생물의 성장을 방해하고 유익균의 성장이 증진될 수 있도록 산채를 활용하여 프리바이오틱스 조성물을 제공하는데 있다.

상기의 목적을 실현하기 위한 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 산채복합 추출물을 함유하는 항염증 활성이 있는 프리바이오틱스를 갖는 프로바이오틱스 조성물의 제조방법은;,

쇠비름, 죽순, 취나물, 뽕잎 건조시료를 활용하여 2:0.5:0.5:1로 혼합하여 물을 20배 가하고 비스코자임 효소를 1% 첨가한 후 50℃에서 24시간 효소 분해하는 과정 및 효소분해한 액을 100℃에서 3시간 열수 추출하여 추출물을 제조하는 과정 및 상기 추출액을 5~10 brix가 되도록 농축하는 과정으로 제조되는 산채복합 추출물로 이루어진 프리바이오틱스 제조단계와;

상기 산채복합물 프리바이오틱스에 잘 성장한 Lactobacillus fermentum , Lactobacillus casei , Lactobacillus plantarum , Bifidobacterium bifidum , Bifidobacterium animalis spp. Lactis 중 어느 하나 또는 하나 이상을 선발하여 프로바이오틱스를 구성하는 과정 및 유산균 복합 균주에 프락토올리고당을 5~10%, 난소화성말토덱스트린을 5~10%와 미량으로 치커리화이바, 분말유당, 결정셀룰로오스 중 어느 하나 또는 하나 이상을 포함하는 프로바이오틱스 제조단계;로 구성되는 것을 그 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 한 특징으로서, 상기 프리바이오틱스 제조단계에서, 상기 프리바이오틱스의 활성을 증대시키기 위하여 이눌린 함량이 다량 함유된 돼지감자 추출물을 첨가하며;, 상기 돼지감자 추출물은 3-5일 음건하여 세척한 돼지감자에 0.5~~2% 비스코자임이 함유된 물을 20배 가하여 50℃에서 효소분해하고, 이를 100℃에서 5시간 열수 추출한 후 여과한 여액을 농축하여 30brix로 농축하는 단계로 제조되는 것에 있다.

본 발명의 바람직한 다른 특징으로서, 상기 산채복합 추출물 5brix 농도로 제조된 것을 10~20% 중량부와;, 상기 돼지감자 추출물을 20~60% 중량부 또는 프락토올리고당을 10~20% 중량부로 첨가하여 제조되는 것에 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 특징으로서, 상기 산채복합 추출물 10~20% 중량부와, 돼지감자 20~60% 중량부, 올리고당 10~20% 중량부를 함유하도록 한 프리바이오틱스와;, 상기 프로바이오틱스를 1:1의 비율로 혼합하여 조성한 것에 있다.

본 발명에 의해 제조된 산채복합 추출물의 프리바이오틱스는 산채복합물의 효소분해 추출물로 인해 최적 추출조건이 확립되어 총 페놀 화합물 및 플라보노이드 함유량이 높은 특징이 있고 이 추출물은 항염증 활성이 있어 장내 염증 활성을 낮출 수 있는 유용한 효과가 기대된다.

또한 본 발명에 의한 프로바이오틱스 균주는 산채복합 추출물에 성장이 우수한 Lactobacillus fermentum(락토바실러스 퍼멘텀), Lactobacillus casei(락토바실러스 카제이), Lactobacillus plantarum(락토바실러스 플란타륨), Bifidobacterium bifidum(비피도박테리움 비피둠), Bifidobacterium animalis spp. Lactis(비피도박테리움 에니멀리스 락티스)를 선발하여 산채복합 추출물을 먹이로 하여 장내 유해균의 증식을 막고 유익한 균의 정착이 원활히 진행될 수 있을 것으로 기대된다.

또한, 두 제품을 각각의 스틱형으로 포장하여 따로 섭취도 가능하고 혼합 섭취도 가능하게 제조하였고 시판 우유를 활용하여 요구르트 제조 최적 조건을 제시함으로써 다양하게 활용이 가능하도록 제조하였다.

본 발명의 특징 및 이점들은 첨부도면에 의거한 다음의 상세한 설명으로 더욱 명백해질 것이다. 이에 앞서 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이고 사전적인 의미로 해석되어서는 아니 되며, 발명자가 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합되는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

도 1은 산채물 추출물의 세포 독성을 나타낸다.
도 2는 산채물 추출물의 일산화질소(NO) 생성에 대한 억제 활성을 나타낸다.
도 3은 산채물 추출물의 활성산도(ROS) 생성에 대한 억제 활성을 나타낸다.
도 4는 산채 에탄올 추출물의 세포 독성을 나타낸다.
도 5는 산채 에탄올 추출물의 일산화질소 생성에 대한 억제 활성을 나타낸다.
도 6은 산채 에탄올 추출물의 활성산소 생성에 대한 억제 활성을 나타낸다.
도 7은 산채복합 추출물 첨가에 따른 유산균 발효력을 나타낸다.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하면서 본 발명의 실시예에 대한 구성 및 작용을 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 본 발명을 특정한 개시형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 출원에서 "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 즉, 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

또한, 다르게 정의되지 않는 한 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

여기서, 반복되는 설명, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능, 및 구성에 대한 구체적인 설명은 본 발명의 요지를 모호하지 않게 하기 위하여 생략한다. 본 발명의 실시형태는 당 업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서, 도면에서의 요소들의 형상 및 크기 등은 보다 명확한 설명을 위해 과장될 수 있다.

또한, 본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.

도 1 내지 도 6은 뽕잎, 쇠비름, 죽순, 취나물의 물과 에탄올 추출물에 대한 세포독성을 확인하고 NO( Nitric Oxide; 일산화질소) 및 ROS(Reactive Oxygen Species; 활성산소) 생성에 대한 산채 추출물의 억제 활성을 평가한 것을 나타낸 것으로, 이상의 도면을 참조하여 본 발명에 따른 산채복합 추출물을 함유하는 항염증 활성이 있는 프리바이오틱스를 갖는 프로바이오틱스 조성물의 제조방법를 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 현재까지 알려진 주요 프리바이오틱스와 프로바이오틱스에 관한 내용에 대한 것으로 흔히 알려진 프리바이오틱스에 위해 미생물의 성장을 방해하고 유익균의 성장이 잘 될 수 있도록 산채를 활용하여 프리바이오틱스 조성물을 제조하고자 한다.

먼저, 본 발명에서 산채물은 쇠비름, 취나물, 죽순, 뽕나무가 사용되며, 이하 이들 산채를 이용한 복합 추출물의 제조과정을 설명하기로 한다.

본 발명에 따른 산채복합 추출물을 함유하는 항염증 활성이 있는 프리바이오틱스은 다음의 단계로 제조된다.

1단계; 프리바이오틱스 제조 ;

산채복합물 제조방법은 쇠비름, 죽순, 취나물, 뽕잎 건조시료를 활용하여 2:0.5:0.5:1로 혼합하여 물을 20배 가하여 비스코자임 효소를 1% 첨가한 후 50℃에서 24시간 효소분해하는 단계; 효소분해한 액을 100℃에서 3시간 열수 추출하여 추출물을 제조하는 단계; 추출액을 5~10 brix가 되도록 농축하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

한편 프리바이오틱스의 활성을 증대시키기 위하여 이눌린 함량이 다량 함유된 돼지감자 추출물을 제조하기 위하여 돼지감자를 세척 후 3-5일간 음건시켜서 사용한다.

이때 수분함량이 감소하고 이눌린의 추출 수율이 높아진다. 음건된 돼지감자에 1% 비스코자임이 함유된 물을 20배 가하여 50℃에서 효소분해하여 100℃에서 5시간 열수 추출한 후 여과한 여액을 농축하여 30 brix로 농축하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명에서는 두 추출물을 혼합하여 복합물을 제조함에 있어 산채복합 추출물 5 brix 농도로 제조된 것을 10~20% 중량부, 돼지감자 추출물을 20~60% 중량부, 또는 프락토올리고당을 10~20% 중량부로 첨가하여 완성할 수 있다.

2단계; 프로바이오틱스 제조

본 발명에 있어 산채 복합 추출물에 잘 성장한 Lactobacillus fermentum, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium animalis spp. Lactis 중 어느 하나 또는 하나 이상을 선발하여 프로바이오틱스를 구성한다.

그리고 상기 유산균 복합 균주에 프락토올리고당을 5~10%, 난소화성말토덱스트린을 5~10%와 미량으로 치커리화이바, 분말유당, 결정셀룰로오스 등을 포함하여 프로바이오틱스를 제조한다.

3단계; 신바이오틱스 제조

본 발명에서는 산채복합 추출물을 활용한 프리바이오틱스와 프로바이오틱스를 활용하여 시판 우유를 활용한 요구르트 제조 조건을 설정; 프리바이오틱스는 산채복합 추출물 10~20%와 돼지감자 추출물 20~60%, 10~20%을 함유하도록 하여 완성한 프리바이오틱스 제품과 선발된 우수 균주가 10⁷~10⁹이 함유되도록 구성된 프로바이오틱스 두 제품을 포함하여 신바이오틱스 제품으로 완성할 수 있다.

본 발명에서는 우유 100% 중량부에 대하여 프리바이오틱스 10~20%중량부와 프로바이오틱스 0.5~3%중량부를 첨가하여 37℃에서 배양하여 기호에 따라 간편하게 섭취할 수 있다.

또한 본 발명으로 완성된 제품은 산채복합 추출물만으로 섭취시 산채복합 추출물의 항염증 활성으로 인해 장내의 유익균의 증식 활성을 증대시킬 수 있고 장내 염증 감소에 도움이 될수 있을 것으로 기대된다.

실시예 1

산채복합 추출물 제조를 위한 쇠비름, 죽순, 취나물, 뽕잎의 활성 검증

본 발명에서는 산채복합 추출물 제조를 위해 최적 추출조건 선정을 위하여 쇠비름, 죽순, 취나물, 뽕잎 등 4종류의 산채를 선발하고 각각의 활성을 검증 하였다.

산채의 4종은 물 추출물과 에탄올 추출물로 나누어 활성을 검증하였하는데 물추출물은 각각의 산채에 20배의 물을 가하여 70℃에서 5시간 동안 열수 추출한 후 여과한 여액을 동결건조하여 시료로 사용하였으며, 에탄올 추출물은 에탄올(발효주정)을 시료에 대하여 20배를 가하여 상온에서 24시간 추출한 후 여과한 여액을 진공회전농축기로 완전 건고하여 시료로 사용하였다.

1-1) 산채의 총 페놀 화합물 및 플라보노이드 함량

1) 총 페놀화합물 함량

산채 추출출물의 총 페놀화합물의 함량을 측정하기 위하여 각각 추출물 적절한 농도로 증류수를 가하여 진탕 혼합한 다음 희석하여 시료로 사용하였다. Folin-Denis법에 따라 시료액 1 mL에 Folin-Ciocalteau 시약 및 10% NaCO3 용액을 각 1 mL씩 차례로 가한 다음 실온에서 1시간 정치한 후 분광광도계(Biochrome Ltd.)를 이용하여 760 nm에서 측정하였다. 표준물질로 gallic acid(Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA)로부터 얻은 표준 검량선에 대입하여 원료에서 총 페놀화합물을 함량을 살펴본 결과 물 추출물에서는 취나물이 59.7 mg/g으로 함량이 가장 높았고 다음으로 죽순, 뽕잎, 쇠비름 순이었다. 에탄올 추출물에서는 뽕잎 추출물이 45.2mg/g으로 가장 높았고 쇠비름이 21.1 mg/g으로 가장 낮았다.

2) 플라보노이드 함량

플라보노이드 함량은 건조된 시료를 적절한 농도로 희석한 시료액 1mL에 10% aluminum nitrate 0.1 mL, 1 M potassium acetate 0.1 mL 및 80% ethanol 4.3 mL를 차례로 가한 후 혼합하여 실온의 암실에서 40분간 정치한 다음 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. Quercetin을 표준물질로 하여 얻은 검량선으로부터 총 플라보노이드 함량을 계산하였다. 플라보노이드 함량은 물추출물에서 취나물이 28.23 mg/g으로 가장 높았고 다음으로 뽕잎이 17.65 mg/g이었으며 쇠비름과 죽순은 2.8 mg/g이하였다. 에탄올 추출물에서는 뽕잎이 1.02 mg/g으로 가장 높았고 쇠비름과 죽순은 0.15 mg/g 이하로 낮았다.

표 1-1. 4종의 산채 추출물의 총 페놀 화합물 및 플라보노이드 함량

(mg/g)

1-2) 산채 추출물의 항산화 활성

(1) ABTS 라디칼 소거활성

ABTS (2,2-azinobis-(3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulphonate) 라디칼 소거활성은 7 mM의 ABTS 용액에 potassium persulfate를 2.4 mM이 되도록 용해시킨 다음 암실에서 12∼16시간 동안 반응시킨 후 415 nm에서 흡광도가 1.5가 되도록 증류수로 조정한 ABTs 용액을 사용하였다. ABTS 용액 150 μL에 시료액 50μL를 혼합하고 실온에서 1분간 반응시킨 다음 분광광도계를 이용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 및 ABTS 라디칼 소거활성은 시료 무첨가구에 대한 시료첨가구의 흡광도비로 계산하여 %로 나타내었다.

4종의 산채 물 추출물의 ABTS 라다칼 소거활성은 1000μg/mL의 농도에서 취나물과 뽕잎에서 각각 97.21%와 99.48%로 활성이 우수하였으며, 뽕잎의 경우 에탄올 추출물도 96.44%로 시료 중 가장 활성이 높았다.

표 1-2. 4종의 산채 추출물의 [ABTS 라디칼 소거 활성]

(μg/mL)

(2) DPPH 라디칼 소거활성

DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼 소거활성은 DPPH에 대한 전자공여 활성으로 나타낸 것으로 시료액과 DPPH 용액(5 mg/100 mL methanol)을 동량으로 혼합한 다음 실온에서 20분간 반응시킨 후 분광광도계를 이용하여 525 nm에서 흡광도를 측정하였다.

산채 물 추출물의 DPPH 라디칼 활성은 250 μg/mL 농도에서 취나물이 37.8%로 타 시료에 비해 가장 높았고, 동일 농도에서 에탄올 추출물의 활성은 6.81~36.18%의 였는데, 죽순 에탄올 추출물이 가장 낮고 뽕잎 추출물이 가장 높았다.

표 1-3. 4종의 산채 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성

(%)

1-3) 산채 추출물의 항염증 활성 검증

도 1~6은 뽕잎, 쇠비름, 죽순, 취나물의 물과 에탄올 추출물에 대한 세포독성을 확인하고 NO( Nitric Oxide; 일산화질소) 및 ROS(Reactive Oxygen Species; 활성산소) 생성에 대한 산채 추출물의 억제 활성을 평가하였다.

1) RAW264.7 대식세포 증식에 대한 혼합물의 세포독성 평가

실험에 사용된 마우스의 대식세포주인 RAW264.7 세포는 한국세포주은행 (KCLB)에서 분양받았으며, 세포 배양을 위해 10% fetal bovine serum (FBS)와 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM 배지를 사용하였다. 세포는 CO₂ incubator (37℃, 5% CO2)에서 배양하였으며 추출물의 세포에 대한 독성 측정은 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide (MTT) 환원방법을 이용하여 측정하였다.

세포를 96 well-plate에 well당 5×10⁴개가 되도록 분주하고 24시간 부착시킨 후, 추출물들을 각기 일정한 농도로 희석하여 세포에 처리한 다음 30분 후 1 μg/mL lipopolysaccharide (LPS, Sigma , USA)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 시료를 포함하는 배지를 제거한 후 serum-free 배지와 5mg/mL MTT 용액을 첨가하여 37℃에서 2시간 더 배양한 다음 DMSO를 분주하여 sonication하고 10분간 교반한 뒤 570 nm에서 흡광도를 측정해 세포생존율을 구하였다.

RAW264.7 세포에 LPS 1 μg/mL을 처리함과 동시에 4종의 산채 물(도1)과 에탄올 추출물(도4)을 각각 처리하여 세포생존율을 평가한 결과 물추출물에서는 뽕잎 추출물이 800μg/mL 농도까지 독성이 없었으며 쇠비름과 죽순은 400 μg/mL까지 독성이 없었으며 취나물은 200 μg/mL까지 독성이 없었다. 산채 에탄올 추출물의 세포독성은 뽕잎과 쇠비름은 400 μg/mL 이하에서는 독성이 없었고 죽순과 취나물은 200 μg/mL 이하에서는 독성이 없었다.

2) 혼합물의 NO 생성에 대한 억제 활성평가

마우스 대식세포 RAW264.7를 5×10⁵ cell/well의 농도로 24-well plate에 분주하여 24시간 배양한 후 각각의 추출물을 농도별로 처리하였다. 이것을 30분 배양한 후에 LPS (1 μg/mL)를 처리하여 20시간 또는 24시간 배양한 후 세포상등액을 회수하였다. 회수한 세포 배양 상등액을 원심분리 (1000 rpm, 10min, 4℃) 한 다음, 50 μL를 취해 sulfanilamide solution 50 μL와 혼합하여 5분간 빛을 차단하고 반응시킨 후 NED solution 50 μL와 혼합하여 상온에서 10분간 반응시켜, ELISA reader (Epoch, Bioteck, Winooski, VT, Germany)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 1의 세포 독성 실험방법과 동일하게 4종의 산채 물추출물의 NO 생성억제활성을 측정하였다(도 2). 4종의 시료 물추출물 모두에서 대조군 대비 NO 생성량의 유의적으로 감소하였고 특히 쇠비름과 취나물 물 추출물이 800 μg/mL의 농도에서 NO 생성량을 유의적으로 감소시켰다.

4종의 산채 에탄올 추출물의 NO 생성량 억제 활성을 측정한 결과(도 5) 모든 시료에서 유의적으로 NO 생성량 억제 활성이 있었고 100 μg/mL의 낮은 농도에서도 NO 생성 억제 활성이 있었다.

3) 혼합물에 의한 reactive oxygen species(ROS)생성 억제 효과

추출물의 intracellular ROS 측정은 intracellular ROS assay kit (Cell biolabs, USA)을 이용해 LPS로 세포 내 염증반응을 유도하여 ROS 생성을 유발시켜 억제효능을 측정하였다. 96 well black plate에 5×10⁴ cell/well의 RAW 264.7 cell을 black plate에 분주하여 배양 후 serum free DMEM 배지로 교환하였다. 다시 세포를 24시간 배양한 후 시료를 농도별로 처리하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양하였다. PBS(pH 7.4)로 3회 세척한 후 1XDCFHDA를 배지에 100 μL 첨가하여 37℃, 5% CO₂에서 1시간 배양한 후 또 다시 PBS로 3회 씻어냈다. Lysis buffer 100 μL를 첨가하여 혼합한 후 fluorescence microplate reader (Perkin-Elmer Inc., Waltham, MA, USA)를 이용하여 excitation 485 nm, emisssion 535 nm에서 형광을 측정하여 ROS 생성 억제 활성을 평가하였다.

그 결과 산채 각각의 물추출물에서는 LPS 단독 처리군과 비교하였을 때 죽순 물추출물과 뽕잎 100μg/mL 물추출물을 제외한 나머지 시료에서는 유의적으로 ROS 생성 억제 효능을 나타내었다.(도 3) 주정 추출물(도 6)은 모든 시료가 유의적으로 ROS 생성을 억제하였다.

이상의 실험 결과로 부터 산채 물과 에탄올 추출물 각각은 효과적으로 NO와 ROS의 생성을 억제하여 항염증 활성을 나타냄을 확인하였다.

실시예 2

효소 분해를 통한 산채복합 추출물의 최적 조건 선정

4종의 산채 추출물의 활성을 검증한 결과 물 추출물보다는 에탄올 추출물이 더 높은 항산화 및 항염증 활성을 나타내었으나 에탄올 추출물은 세포독성이 있었으며 산업적으로 적용하기에는 물 추출물 제조가 더욱 용이하므로 물 추출물을 제조함에 있어 산채의 유용 물질을 더 잘 추출될 수 있는 효소 처리 조건을 확립하고자 하였다.

효소 처리를 통한 산채 추출물 제조의 최적 조건 선정을 위하여 산채 4종 각각에 물 20배를 가한 다음 상업적 효소인 viscozyme, celluclast, saczyme, fungamyl을 각각 1% 첨가 한 후 50℃에서 24시간 효소분해 한 후 여과하여 분석용 시료로 사용하였다.

2-1) 효소 처리에 따른 뽕잎, 쇠비름, 죽순, 취나물 추출물의 성분 분석

1) 효소 처리에 따른 뽕잎, 쇠비름, 죽순, 취나물 추출물의 고형분, pH, 산도의 변화

고형분 함량은 굴절당도계를 이용하여 측정하였으며 pH와 산도는 시료 5 g에 증류수를 가해 50 mL로 만든 다음 잘 혼합한 후 여과지(Filter paper, No. 2, Advantec, Tokyo, Japan)로 여과한 여액을 시료로 하여 자동적정기(G20 compact titrator, Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland)로 동시에 측정하였다. 적정산도는 0.1 N NaOH 용액으로 시료액의 pH가 8.4가 될 때까지 적정하여 초산 양으로 환산하였다.

4종류의 효소를 처리한 후 산채 추출물의 각각의 고형분 함량 중 뽕잎은 효소 미처리시 2.5 brix였으나 효소 처리시 2.9~3.0의 범위로 높았다. 쇠비름은 효소 미처리시 1.5 brix였고 효소 처리시에는 2.4~3.9 brix로 viscozyme 처리시 가장 높았다. 죽순 및 취나물 효소분해의 경우에도 효소 미처리보다 효소 처리시 고형분 함량이 더 높았고 그 중 viscozyme 효소 처리시 가장 높았다.

효소 분해에 따른 pH의 변화는 취나물 분해시에는 효소 미처리보다 효소 처리시 더 낮았고 뽕잎, 쇠비름, 죽순은 효소 미처리시와 효소분해에 따른 pH의 변화는 없었다. 효소분해에 따른 산도의 변화는 뽕잎 효소 분해시에는 fungamyl 처리시 0.25%로 가장 높았고 celluclast와 saczyme 처리시 0.11%로 가장 낮았고, 쇠비름은 viscozyme 처리시에는 0.36%로 가장 높았고 효소 미처리시 0.21%로 가장 낮았다. 취나물도 viscozyme 처리시 0.3%로 가장 높았고 효소 미처리시 0.13%로 가장 낮았다.

표 2-1. 효소 처리에 따른 뽕잎, 쇠비름, 죽순, 취나물 추출물의 고형분, pH, 산도의 변화

2) 효소 처리에 따른 뽕잎, 쇠비름, 죽순, 취나물 추출물의 총 페놀화합물, 플라보노이드, 환원당의 변화

총 페놀 화합물은 뽕잎의 경우 saczyme을 처리하였을 때 1.9 mg/100g으로 가장 높았고 쇠비름 시료는 효소 미처리에 비해 viscozyme 처리시 50%가 증가하였고 죽순은 fungamyl 처리시 1.93 mg/100g으로 가장 높았다. 취나물은 viscozyme 처리시 1.98 mg/100g로 가장 높은 함량이었다.

플라보노이드 함량의 변화는 뽕잎시료에서는 1% viscozyme 처리시 0.7 mg/100g으로 가장 높았고 쇠비름은 viscozyme 처리시 0.31 mg/100g, 펑가밀 처리시 0.32 mg/100g 이었다. 죽순과 취나물 역시 1% viscozyme 처리시 각각 0.37 mg/100g, 0.6 mg/100g으로 다른 효소 처리보다 높았다.

총 페놀화합물과 플라보노이드 화합물의 상기에 제시된 바에 따라 수행하였으며 환원당의 함량은 DNS법에 따라 총당의 분석시와 동일하게 추출한 시료액을 증류수로 10배 희석한 후 1mL를 취하여 DNS시약 3 mL을 가한 후 끓는 물에서 15분간 중탕 가열 한 다음 찬물에서 냉각하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여

포도당(Sigma-Aldrich Co.,)을 표준물질로 검량곡선에 따라 정량하였다.

효소 처리에 따른 환원당 함량은 뽕잎에서는 fungamyl 효소 처리시 10.6 g/100g으로 가장 높았고 celluclast 처리시 2.56 g/100g으로 가장 낮았다. 쇠비름은 viscozyme 처리시 38.59 g/100g으로 가장 높은 함량이었으며 효소 미처리시 1.25%로 가장 낮았다. 죽순도 viscozyme 처리시 33.99 g/100g으로 가장 높았고 효소 미처리시는 가장 낮아 14.3%에 불과하였다. 취나물도 viscozyme 처리시 효소 미처리에 비해 약 27백 증가하였다.

최적의 산채 추출물 제조할 때 효소 미처리시와 타 효소 처리시보다 viscozyme 효소 1% 처리시 총 페놀 화합물, 플라보노이드 및 환원당 함량이 증가될 것으로 기대된다.

표 2-2. 효소 처리에 따른 뽕잎, 쇠비름, 죽순, 취나물 추출물의 총 페놀화합물, 플라보노이드 및 환원당 함량

3) 산채복합 추출물 제조를 위한 최적 배합 비율 선정

취나물, 뽕잎, 쇠비름 및 죽순을 표 2-3의 비율로 혼합하여 혼합 추출물 제조를 위해 혼합 산채에 1% viscozyme 이 첨가된 20배의 물을 가하여 하여 50℃에서 24시간 분해 한 후 95℃에서 3시간 효소 실활 및 가온 추출하여 여과한 여액을 시료로 사용하였으며 각 추출물의 총 페놀 화합물의 함량은 각 산채를 동량으로 제조하였을 1.49 mg/100g이었으며 죽순의 비율이 높은 취나믈:뽕잎:쇠비름:죽순이 0.5:1:0.5:2의 비율일 때 1.76 mg/100g으로 가장 높았고 취나물 비율이 높았던 취나믈:뽕잎:쇠비름:죽순이 2:0.5:0.5:1의 비율일 경우 1.69 mg/100g으로 뽕잎 및 쇠비름의 비율이 높을 경우보다 높았다. 플라보노이드 함량은 취나물의 비율이 높았던 취나믈:뽕잎:쇠비름:죽순이 2:0.5:0.5:1의 비율일 때 1.07 mg/100g으로 가장 높았고 다음으로 뽕잎의 비율이 높은 시료가 0.93~0.97 mg/100g으로 높았다. 반면 총 페놀 화합물이 함량이 높았던 죽순 비율이 높은 시료에서는 가장 낮은 경향이었다.

따라서 산채복합 추출물의 총 페놀 화합물 함량은 죽순의 비율이 높았던 시료에서 높았으나, 플라보노이드 함량은 취나물이 높았던 비율에 비해 죽순 함량이 높았던 비율이 50% 이하로 활성이 낮았다.

따라서 이전 연구에서 각각 물 추출물의 항염증 활성을 비교시(도1~3) 취나물 추출물이 NO 및　ROS 생성 억제 활성이 더 높아 산채의 배합 비율을 취나물 함량이 더 높고 다음으로 죽순의 비율이 높은 취나믈:뽕잎:쇠비름:죽순이 2:0.5:0.5:1의 비율로 선정하였다.

표 2-3. 산채복합 추출물 제조를 위한 산채 배합 비율

표 2-4. 산채복합 추출물의 효소분해에 따른 총 페놀화합물 및 플라보노이드 함량

실시예 3

효소분해를 통한 돼지감자 추출물의 최적 조건 선정

최적의 프리바이오틱스 제조를 위하여 항염증 활성이 있는 산채복합 추출물에 이눌린 함량이 다량 함유된 돼지감자 추출물을 첨가하여 산채복합 추출물에 부족한 당도를 증가시키고 프로바이오틱스의 성장에 긍정적인 영향을 미치며 산채복합 추출물의 쓴맛을 감소시켜 프리바이오틱스의 관능적 특성을 향상시키고자 하였다.

돼지감자 추출물 제조 역시 유효성분 증대를 위해 4종의 효소분해를 실시하여 최적의 효소를 선정하여 최적 효소분해 조건을 확립하기 위하여 돼지감자에 각각의 효소가 1%가 첨가된 10배의 물을 가하여 50℃에서 24시간 효소분해 후 100℃에서 3시간 추출 후 여과하여 시료로 사용하였다.

그 결과 효소 미처리시보다 효소 처리에 따라 환원당 함량이 점차 증하였고 특히 viscozyme 처리시 39.78 g/100g으로 가장 높았다. 총당은 효소 처리시 62.11~79.2 g/100g으로 viscozyme 처리시 가장 높았다. 페놀 총 페놀 화합물과 플라보노이드 화합물 역시 타 효소 처리보다 viscozyme 처리시 각각 1.93 mg/g과 0.7 mg/g으로 높았다. 따라서 돼지감자 추출물 제조시에도 비스코자임 효소를 선정하였다.

표 3-1. 효소 종류에 따른 돼지감자 추출물의 성분 분석

[실시예 4]

산채복합 추출물에 발효 적합한 최적 유산균주 선발

4-1) 산채복합 추출물에 따른 유산균 성장률

본 발명에서는 실시예 1~3에서 최적 공정에 따라 확립된 프리바이오틱스(산채복합 추출물, 취나물:뽕잎:쇠비름:죽순이 2:0.5:0.5:1의 비율로 혼합된 산채복합재료를 효소분해 후 열수 추출)를 활용한 프로바이오틱스 균주를 선정하고자 하였다.

즉 시판우유에 산채복합 추출물을 0, 5, 10, 15, 20% 첨가하고 배양된 균주를 1 mL를 첨가하여 배양기에서 24시간 배양 후 성장률이 우수한 균주를 선발하여 프로바이오틱스를 제조하였다. 실험에 사용한 균주는 Lactobacillus rhamnosus , Lactobacillus fermentum , Lactobacillus casei , Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium longum , Bifidobacterium bifidum , Bifidobacterium animalis subsp. lactis 총 7종의 유산균주를 사용하여 Lactobacillus 속 균주 배양에는 MRS 배지(BD, Sparks, USA)를 이용하였으며, Bifidobacterium 속 균주는 MRS 배지에 0.05%(w/v) L-cysteine hydrochloride(Sigma-Aldrich Co.,)를 첨가하여(MRSC) 배양하였다. 각 균주는 37℃에서 24시간 정치 배양하였으며 3번 계대한 후 실험을 진행하였으며 산채 복합 추출물의 발효능을 측정하기 위한 산채 추출물은 2%(w/v) glucose를 첨가하고 autoclave하였으며, 발효능이 우수한 균주를 선발하기 위해 각 균주를 1%씩 접종하고, 접종 초기와 24시간 배양한 후 시료를 취해 0.1% 펩톤수를 이용하여 단계 희석하였으며, 생균수는 평판배지법을 이용하여 24~48시간 배양하면서 관찰하였다.

표 4-1에 의하면 Lactobacillus fermentum이 8.71%의 성장률을 보여 성장률이 가장 높았고 다음으로 Lactobacillus plantarum이 3.69%, Bifidobacterium bifidum이 3.64%의 성장률을 보였다. 반면 Bifidobacterium longum은 0.97%의 성장률을 보여 가장 낮았다.

따라서 산채복합 추출물에 활성이 가장 높았던 5종을 선발하여 유산균 혼합 제제로 선발하였다.

표 4-1. 산채복합 추출물에 배양한 유산균의 성장율

[실시예 5] 산채복합 추출물의 첨가농도 선정

산채복합 추출물의 첨가농도 선정을 위하여 시판우유에 유산균 혼합 제제를 0, 5, 10, 15, 20% 첨가하고 복합 유산균을 접종하여 37℃에서 48시간 발효시키면서 특성을 분석하였다.

산채 복합추출물의 발효 우수균주인 L. fermentum, L. casei, L. plantarum, B. bifidum, B. animalis spp. lactis 5종은 각각의 최적배지에서 24시간 배양하였고 실험 시 혼합하여 사용하였다.

산채복합 추출물을 우유에 각각 0, 5, 10, 15, 20%(v/v) 되게 첨가한 후 100℃에서 30분간 살균한 후 상온에서 방냉하였다. 각 우유에 혼합균주를 2%(v/v)씩 접종하고 37℃에서 48시간 배양하면서 0, 6, 12, 24, 48시간에 시료를 취하여 생균수를 측정하였다.

각 시료는 0.1% 펩톤수를 이용하여 10배씩 단계 희석하였으며 MRSC agar를 이용하여 생균수를 측정하였다.

5-1) pH 및 산도 측정

유산균 접종 후 pH 및 산도의 변화는 표 5-1과 같이 발효시간과 산채복합물의 증가에 따라 감소하는 경향이었다. 산채복합 추출물이 첨가되지 않은 시료는 제조 직후 7.28이던 것이 점차 감소하여 발효 48시간에 6.95로 감소하였고 산채복합 추출물 10% 첨가시 제조 직후 7.01이던 것이 48시간에 5.22로 감소하였다. 산채복합 추출물이 가장 많이 함유된 시료는 혼합 직후 6.31이던 것이 발효 24시간 후에는 3.94로 산성화되었으며 이는 전체 발효 시료 중 가장 낮은 수치였다. 산채복합 추출물에 함유된 유효성분으로 인해 산도가 낮아지며 유산균의 정상 발효시 pH가 낮아지는데 산채복합 추출물의 비율에 따라 pH가 낮아지고 발효시간에 따라 낮아지는 것으로 보아 산채복합 추출물 첨가시 원활한 발효가 진행되는 것으로 판단된다.

유산균 발효에 따른 산도 측정은 위에 제시된 바와 같으며 산도의 변화는 pH와 유사한 경향으로 산채복합 추출물의 함량이 증가할수록 발효가 진행될수록 감소하는 경향이었다. 산채복합 추출물이 첨가되지 않은 0% 시료에서 시료 혼합 직후 산도는 0.21% 이던 것이 48시간 발효 후 0.29%로 다소 증가하였으며 산채복합 추출물이 10% 함유된 시료는 혼합 직후 0.34%g 이던 것이 48시간 후에는 0.62 %로 증가하였다. 산채복합 추출물 20%가 함유된 시료는 혼합 직후 0.25% 이던 것이 48시간 발효 후에는 0.88%로 낮아졌다. 산채복합 추출물이 첨가되지 않은 시료는 발효가 원활히 진행되지 않아 산도가 낮아지지 않았으며 5% 첨가 시료도 24시간 까지 발효가 더디게 진행되었다. 따라서 산채복합 추출물을 10% 첨가시 발효가 원활히 진행되어 10% 정도 첨가하는 것이 적절할 것으로 판단된다.

표 5-1. 산채복합물 첨가 비율을 달리하여 제조한 요구르트 발효에 따른 pH 변화

표 5-2. 산채복합물 첨가 비율을 달리하여 제조한 요구르트 발효에 따른 산도의 변화

(%)

5-2) 유산균수 측정

도 7을 참조하여. 배양 중 적정 시간별로 시료 1 mL를 무균적으로 취한 후 0.1% 펩톤수를 사용 적정 희석하여 MRS agar(Difco, Detroit, MI, USA) 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양 후 나타난 콜로니 수를 계측하여 mL당 colony forming unit(CFU)로 나타낸 결과 산채 복합추출물의 첨가량이 증가할수록 유산균 성장률은 우수하였는데 산채 복합추출물 10% 첨가시 제조 직후 0.65 CFU/g×10⁸이던 것이 점자 증가하여 발효 24시간 후에는 8.30 CFU/g×10⁸으로 증가하였으며 20% 첨가시에는 8.5 CFU/g×10⁸으로 증가하여 최종 발효에서 산채복합 추출물이 첨가되지 않은 시료 보다 10% 이상 첨가시 유산균수가 약 10~11.3배가 증가하였고 10%이상 첨가시에는 큰 차이가 없었다.

5-2. 환원당의 변화

산채복합 추출물을 0~20%로 농도를 달리하여 요구르트를 제조한 시료의 환원당 함량을 측정한 결과 산채복합 추출물이 첨가되지 않은 0%시료에서는 제조 직후 6.01 g/100g이던 것이 48시간 발효 후에는 5.38 g/100g으로 감소하였고, 산채복합 추출물의 첨가량에 따라 그 함량은 감소하였는데, 산채복합 추출물 10% 첨가시에는 혼합 직후 5.15 g/100g이던 것이 48시간 후에는 3.04 g/100g으로 약 40.9%가 감소하였고 20% 첨가시에는 혼합 직후 4.33 g/100g이던 것이 48시간 후에는 약 45.9%가 감소하였다. 이는 발효기간 동안 유산균이 환원당을 이용함에 따라 감소한 것으로 판단되는데 산채복합물이 함유되지 않은 대조구는 환원당의 감소가 10%인 반면 산채복합 추출물 5%~20% 첨가시 감소율은 31.3~48.3%로 대조구보다 더 감소되어 발효가 원활히 진행된 것으로 보여진다.

표 5-3. 산채복합물 첨가 비율을 달리하여 제조한 요구르트의 발효에 따른 환원당의 변화

(g/100g)

5-3) 총 페놀 화합물의 변화

총 페놀 화합물의 변화는 표 5-4와 같으며 산채복합 추출물의 첨가 비율이 높을수록 그 함량이 높았으나 발효가 진행됨에 따라 감소하는 경향이었다. 산채복합 추출물이 첨가되지 않은 시료는 1.41~1.84 mg/100g의 범위였으며 발효가 진행에 따라 함량이 감소하여 48시간 후에는 약 23.3%가 감소하였다. 산채복합 추출물 첨가에 따라 총 페놀 화합물의 함량은 증가하였는데 10% 첨가시에는 약 1.1배가 증가하였고 20%를 첨가하였을 경우에는 2.4배가 증가하였다. 유산균 발효에 따른 총 페놀 화합물의 함량은 감소하는 경향으로 5% 첨가 시료의 경우 48시간 후에는 41.5%가 감소하여 1.28 mg/100g이었으며 10%와 20% 첨가시에는 각각 34.8%와 41.1%가 감소하였고 20% 첨가시에는 약 55.4%가 감소하여 다른 시료에 비해 감소율이 가장 높았다. 발효에 따라 총 페놀 화합물은 감소하는 경향이었는데 이는 발효에 의해 다른 화합물로 분해되어 그 함량이 감소한 결과로 판단된다.

표 5-4. 산채복합물 첨가 비율을 달리하여 제조한 요구르트의 발효에 따른 총 페놀 화합물 함량의 변화

(mg/100g)

5-4) 항산화 활성의 변화

산채복합 추출물을 첨가하여 제조한 요구르트의 항산화 활성을 ABTS 라디칼 소거활성을 통하여 조사한 결과 산채복합 추출물이 첨가되지 않은 시료에서는 항산화 활성이 없었으며 산채복합 추출물의 함량이 증가할수록 항산화 활성은 증가하였으며 발효 시간에 따라서도 증가하였다.

산채복합 추출물 5%를 첨가하였을때 혼합직후에 비해 활성이 90%가 증가였고 10% 첨가시에는 발효 24시간 후에 35.8%의 소거활성을 보여 가장 높은 소거활성을 보이다가 48시간 후에는 30.01%로 낮아졌다. 또한 산채복합 추출물이 15% 및 20% 첨가된 시료도 발효 24시간에 각각 43.12% 및 48.61%로 가장 높은 활성을 보이다가 이후 감소하였다. 이러한 결과는 원활한 발효가 진행됨에 따라 미생물의 대사산물이 증가하여 항산화 활성이 증가하는 경향이었으며 24시간 이후 다소 감소한 결과는 유산균 생장 곡선에서도 발효 24시간에서 48시간 사이에 생균수가 감소하였는데에 이러한 결과에 기인한 것으로 판단된다.

표 5-5. 산채복합물 첨가 비율을 달리하여 제조한 요구르트의 발효에 따른 ABTS 라디칼 소거활성의 변화

(%)

5-5) 관능평가

산채복합 추출물 첨가하여 발효에 따른 요구르트의 관능검사는 혼합직후 24시간 및 48시간으로 나누어 실시하였는데 각 시료에 대하여 점도, 색도, 전반적인 기호도에 대하여 최저 1점 최고 7점의 7단계의 평가법으로 실시하였다. 점도는 커드 생성이 안 되었으면 1점, 점도가 강하면 7점으로 나누어 실시하였다.

제조직후의 점도의 모든 시료에서 1점이었고 48시간 발효 후에도 산채복합 추출물이 첨가되지 않은 0% 시료에서는 1점으로 커드 형성이 되지 않았다. 반면 산채복합 추출물이 함유된 시료 중 5%의 저농도의 산채복합 추출물이 첨가된 시료에서는 24시간 후에는 약간의 커드가 형성되어 2.2의 낮은 점도를 유지하였고 48시간 후에는 4.6으로 일반 호상요구르트의 점도를 가졌으나 약간 묽은 정도였다. 10%가 첨가된 시료는 48시간 후에는 5.2로 높았다. 반면 15%와 20%에서는 발효 24시간 후에 각각 5.2 및 5.0으로 가장 높은 점도를 보였고 이후 다소 감소하는 경향이었다. 색도는 혼합 직후 산채복합 추출물이 함유되지 않은 시료가 4.6이었으나 산채복합 추출물이 함유됨에 따라 5% 첨가시에는 3.2로 미첨가보다 낮았으나 10%에서는 5.4로 가장 높았고 15% 이상 첨가시에는 산채복합 추출물 10% 첨가 시료보다 기호도가 낮았다. 향미는 산채복합 추출물 20% 첨가시 2.6으로 낮았으나 다른 시료에서는 3.1~3.8의 범위였다. 산채복합 추출물 첨가 요구르트의 전반적인 기호도는 미첨가 시료보다 산채복합 추출물 10% 첨가에서 적절한 기호도를 보였고 10% 이상 첨가시에는 기호도가 낮아지는 경향이었다.

이상의 결과를 종합하여 볼 때 산채복합 추출물을 10% 정도 첨가시 발효가 원활히 진행되어 적절한 점도를 지니고 향미와 색감을 유지할 수 있고 20% 이상 첨가하였을 경우에도 발효에 산채의 쓴맛을 인해 기호도가 떨어지고 유산균 발효력이 감소 할 수 있을 것으로 예상된다.

표 5-6. 산채복합물 첨가 비율을 달리하여 제조한 요구르트의 발효에 따른 관능평가

실시예 6

최적 프리바이오틱스 선정을 위한 돼지감자 추출물 첨가농도 선정

산채복합 추출물의 기호도 증대와 유산균 발효력 향상을 위하여 돼지감자 추출물을 첨가하여 최적 배합비율을 선정하였다. 산채복합 추출물은 쇠비름, 뽕잎, 죽순, 취나물 추출물로 약 5~10 brix의 농도의 범위로 쓴맛이 있어 이것만 섭취하기에 어려움이 있어 프로바이오틱스의 먹이로 이용이 되는 이눌린 함량이 많은 돼지감자 추출물을 첨가하여 최종 배합비를 완성하고자 하였다. 돼지감자추출물 제조는 실시예 3의 방법에 따라 돼지감자에 1% viscozyme이 함유된 물을 20배 가하여 50℃에서 효소 분해하여 100℃에서 5시간 열수 추출한 후 여과한 여액을 농축하여 30 brix로 제조하여 사용하였다.

6-1. 돼지감차 추출물 첨가에 따른 배합액의 관능평가

산채복합 추출물 10%을 기초로 하여 돼지감자 추출물을 5~30%의 비율로 첨가한 혼합액의 기호도 평가를 실시한 결과, 색도는 돼지감자 추출물 10% 첨가시 4.8로 가장 높았고 그 이상 첨가시 색도는 감소하였고 향미는 5% 첨가시 4.8로 가장 높았다. 당도는 생우유와 산채복합 추출물 첨가 시료는 2.2~2.3의 범위로 낮은 반면 돼지감자를 첨가함으로써 증가하였으며 30% 첨가시 5.4로 크게 증가하였다. 전반적인 기호도는 돼지감자 추출물을 첨가함에 따라 당도 증가에 기인하여 기호도도 증가하였는데 돼지감자 20% 첨가시 4.8로 가장 높았다.

한편, 본 발명은 기재된 실시예에 한정되는 것은 아니고, 적용 부위를 변경하여 사용하는 것이 가능하고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양하게 수정 및 변형을 할 수 있음은 이 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다. 따라서, 그러한 변형예 또는 수정예들은 본 발명의 특허청구범위에 속한다 해야 할 것이다.

Claims (5)

1. 쇠비름, 죽순, 취나물, 뽕잎 건조시료를 활용하여 2:0.5:0.5:1로 혼합하여 물을 20배 가수하여 비스코자임 효소를 1% 첨가한 후 50℃에서 24시간 효소 분해하는 과정 및 효소분해한 액을 100℃에서 3시간 열수 추출하여 추출물을 제조하는 과정 및 상기 추출액을 5~10 brix가 되도록 농축하는 과정으로 제조되는 산채복합 추출물로 이루어진 프리바이오틱스 제조단계와;
   상기 산채복합물 프리바이오틱스에 잘 성장한 Lactobacillus fermentum , Lactobacillus casei , Lactobacillus plantarum , Bifidobacterium bifidum , Bifidobacterium animalis spp. Lactis 중 어느 하나 또는 하나 이상을 선발하여 프로바이오틱스를 구성하는 과정 및 유산균 복합 균주에 프락토올리고당을 5~10%, 난소화성말토덱스트린을 5~10%와 미량으로 치커리화이바, 분말유당, 결정셀룰로오스 중 어느 하나 또는 하나 이상을 포함하는 프로바이오틱스 제조단계;
   로 구성되는 것을 특징으로 하는 산채복합 추출물을 함유하는 항염증 활성이 있는 프리바이오틱스를 갖는 프로바이오틱스 조성물의 제조방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 프리바이오틱스 제조단계에서,
   상기 프리바이오틱스의 활성을 증대시키기 위하여 이눌린 함량이 다량 함유된 돼지감자 추출물을 첨가하며;,
   상기 돼지감자 추출물은 음건에서 3-5일 건조한 세척한 돼지감자에 0.5~2% 비스코자임이 함유된 물을 20배 가하여 50℃에서 효소분해하고, 이를 100℃에서 5시간 열수 추출한 후 여과한 여액을 농축하여 30 brix로 농축하는 단계로 제조되는 것을 특징으로 하는 산채복합 추출물을 함유하는 항염증 활성이 있는 프리바이오틱스를 갖는 프로바이오틱스 조성물의 제조방법.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 산채복합 추출물 5 brix 농도로 제조된 것을 10~20% 중량부와;,
   상기 돼지감자 추출물을 20~60% 중량부 또는 프락토올리고당을 10~20% 중량부로 첨가하여 제조되는 것을 특징으로 하는 산채복합 추출물을 함유하는 항염증 활성이 있는 프리바이오틱스를 갖는 프로바이오틱스 조성물의 제조방법.
4. 제 1항에 있어서,
   상기 산채복합 추출물 10~20% 중량부와, 돼지감자 20~60% 중량부, 올리고당 10~20% 중량부를 함유하도록 한 프리바이오틱스와;,
   상기 프로바이오틱스를 1:1의 비율로 혼합하여 조성한 것을 특징으로 하는 산채복합 추출물을 함유하는 항염증 활성이 있는 프리바이오틱스를 갖는 프로바이오틱스 조성물의 제조방법.
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 산채복합 추출물을 함유하는 항염증 활성이 있는 프리바이오틱스를 갖는 프로바이오틱스 조성물.

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