KR20190056070A - 벤즈아미드 유도체 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 염증질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물 - Google Patents

벤즈아미드 유도체 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 염증질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 벤즈아미드 유도체 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 염증질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것으로써, 본 발명에 따른 벤즈아미드 유도체 화합물은 PDE4의 발현을 억제하며, IL-4(Interleukin-4), IL-5(Interleukin-4), IFN-γ(interferon-γ), IL-17(Interleukin-17), IgE(면역글로불린 E) 및 TNF-α(Tumor necrosis factor-α) 등의 염증 질환 관련 물질의 발현을 조절하므로, 염증 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물로써 유용하게 사용될 수 있다.

Description

벤즈아미드 유도체 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 염증질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물{Benzamide derivatives compounds, preparation method thereof, and pharmaceutical composition for use in preventing or treating inflammatory disease as an active ingredient}
본 발명은 벤즈아미드 유도체 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 염증질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.
아토피 피부염은 대부분 어린 아이들에게서 나타나는 염증성 피부질환으로써, 전 세계적으로 10-25%의 유병률을 보이고 있다. 습진, 피부 병변, 스케일링 및 견딜 수 없는 가려움증 등이 아토피 피부염의 임상적 특징이다. 아토피 피부염의 발병은 유전적, 환경적, 면역학적 요인 간의 복잡한 상호작용이 연결되어있다.
종래의 연구에 따르면 증가 된 phosphodiesterase-4B (PDE4B)가 아토피 피부염 환자의 백혈구에서 염증 질환 매개 물질의 증가를 일으키는 것으로 보고되었다. 따라서, cAMP 수준의 저하는 아토피 피부질환에 있어서 염증을 악화시키는 요인이라고 할 수 있다. 이러한 세포 내 cAMP의 항상성은 세포외 신호에 반응하는 아데닐사이클라제(adenylcyclase)에 의한 cAMP의 합성과 PDE(phosphodiesterases)에 의한 cAMP 합성에 의해 조절된다.
포스포디에스터라제 (PDEs)는 cAMP 및 cGMP를 5'AMP 및 5'GMP으로 각각 가수 분해하는 효소이다. PDE는 서열 유사성, 생화학적 특성 및 억제제 선택성에 기초하여 11 개의 상이한 군으로 세분된다. 구체적으로, PDE는 다음과 같이 분류된다. (i) cAMP 특이적(PDE4, 7 및 8); (ii) cGMP 특이적(PDE5, 6 및 9); 및 (iii) cAMP 또는 cGMP 특이적 (PDE1, 2, 3, 10 및 11) 여기서, 11은 둘 다에 특이적인 것으로 알려져있다. cAMP 특이적 PDE 중에서도 PDE4 효소는 염증 세포에서 유의하게 발현된다. 이전에 PDE4B는 림프구 및 대식세포에서 발현하는 PDE4의 주된 iso형태인 것으로 알려져있다(비특허문헌 01). 림프구 및 대 식세포에서의 PDE4B의 억제는 세포 내 cAMP 수준을 상승시킴으로써 효과적으로 염증성 시토카인의 발현억제로 이끌 수 있다.
따라서, 효과적인 염증 질환의 치료를 위해서는 PDE4B를 효과적으로 억제시킬 수 있는 약학적 조성물이 필요하며, 이와 관련된 연구가 필요한 실정이다. 이에, 본 발명자들은 염증 질환의 치료에 효과를 가지는 다양한 화합물을 연구하던 중 본 발명에 따른 벤즈아미드 유도체 화합물이 PDE4B의 발현 억제에 효과적인 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
Wang, P., Wu, P., Ohleth, K.M., Egan, R.W. & Billah, M.M. Phosphodiesterase 4B2 is the predominant phosphodiesterase species and undergoes differential regulation of gene expression in human monocytes and neutrophils. Molecular pharmacology 56, 170-174 (1999).
본 발명의 목적은 벤즈아미드 유도체 화합물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00001
(상기 화학식 1에서,
L, R1, R2, R3 및 R4는 본 명세서에서 정의한 바와 같다.)
또한, 본 발명은 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이
화학식 2로 표시되는 화합물과 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜, 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다.
[반응식 1]
Figure pat00002
(상기 반응식 1에서,
R1, R2, R3 및 R4는 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다).
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
더 나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강 기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 벤즈아미드 유도체 화합물은 PDE4의 발현을 억제하며, IL-4(Interleukin-4), IL-5(Interleukin-4), IFN-γ(interferon-γ), IL-17(Interleukin-17), IgE(면역글로불린 E) 및 TNF-α(Tumor necrosis factor-α) 등의 염증 질환 관련 물질의 발현을 조절하므로, 염증 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물로써 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 실시예 1, 실시예 2 화합물과 비교예 1 화합물의 PDE4B GFP fusion protein-inhibitor assay 형광 방출을 촬영한 공초점 현미경 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 실시예 1, 실시예 2 화합과 비교예 1 화합물로 처리된 PDE4B GFP 퓨전 단백질의 형광 강도 및 세포 전체 표면적 대비 GFP의 전체 표면 커버 영역 비율을 나타낸 그래프이다. 도 2에서 바 그래프는 형광강도를 나타내며, 선 그래프는 GFP 커버영역을 나타낸다.
도 3은 실험 마지막 날 촬영한 각 실험군 및 대조군 마우스의 등 피부 사진이다.
도 4는 5주 동안의 실험결과 측정된 마우스의 아토피 증상을 점수화한 결과를 나타낸 그래프로서, 도 4(a)는 실시예 1 화합물에 대한 피부염 점수 그래프이고, 도 4(b)는 실시예 25 화합물에 대한 피부염 점수 그래프이다.
도 5(a)는 각각의 실험군 및 대조군 마우스의 20분 동안 긁는 횟수를 나타낸 그래프이고, 도 5(b)는 절개된 실험군 및 대조군 마우스의 등 피부 두께를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6(a)는 실험군 및 대조군 마우스의 림프절을 촬영한 사진이고, 도 6(b)는 실험군 및 대조군 마우스의 림프절의 중량을 측정하여 나타낸 그래프이며, 도 6(c)는 실험군 및 대조군 마우스의 비장 중량을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 실험군 및 대조군 마우스의 등 피부 조직 절편을 H&E(헤마톡실린&에오신) 염색하여 촬영한 광학 현미경 사진을 나타낸다.(ⅰ=대조군, ⅱ=실시예 1, ⅲ=실시예 25, ⅳ=DNCB, ⅴ=DNCB+실시예 1, ⅵ=DNCB+실시예 25)
도 8는 실험군 및 대조군 마우스의 등 피부 조직 절편의 지방세포를 톨루이딘 블루로 염색하여 촬영한 광학 현미경 사진을 나타낸다.(ⅰ=대조군, ⅱ=실시예 1, ⅲ=실시예 25, ⅳ=DNCB, ⅴ=DNCB+실시예 1, ⅵ=DNCB+실시예 25)
도 9는 실험군 및 대조군 마우스의 등 피부 조직 절편의 지방 세포의 수를 나타낸 그래프이다.
도 10 (a)~(d)는 실험군 및 대조군 마우스의 등 피부 조직 CD4+ 세포를 염색한 후 IL-17, IFN-γ, IL-4 및 IL-5 각각의 발현 정도를 촬영한 현미경 사진이다.(ⅰ=대조군, ⅱ=실시예 1, ⅲ=실시예 25, ⅳ=DNCB, ⅴ=DNCB+실시예 1, ⅵ=DNCB+실시예 25)
도 11 (a)~(e)는 마우스 피부 조직에 대하여 샌드위치 ELISA(효소결합 면역흡착측정, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)를 수행하였을 때 나타나는 IL-4, IL-5, IFN-γ, IL-17 및 IgE 각각의 발현 수치를 나타낸 그래프이다.
도 11(f)는 실시예 1 및 실시예 25 화합물에 대한 TNF-α의 합성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 촉매결합 영역에서의 리간드와 PDE4B 사이의 결합을 나타낸 Discovery Srudio 사진이다.
도 13은 실시예 25 화합물과 PDE4B 리간드 간의 결합 거리를 나타낸 3차원 그림이다.
도 14는 실시예 25 화합물과 PDE4B 리간드 간의 결합을 2차원 그림으로 나타낸 모식도이다.
도 15는 실시예 25 화합물의 PDE4B 촉매 결합 부위에서의 아로마틱 3차원 그림이다.
도 16는 PDE4A, PDE4B, PDE4C 및 PDE4D의 액티브 영역에서의 실시예 25 화합물의 결합 구조를 나타낸 3차원 그림이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00003
이때, 상기 화학식 1에서,
L은 단일결합 또는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C6 알킬렌일 수 있고;
R1은 수소; C3-C8 사이클로 알킬; 비치환 또는 치환된 C6-C12 아릴; N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 6-12각 헤테로 아릴; 또는 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 6-10각 헤테로 사이클로 알킬일 수 있고; 이때, 상기 치환된 C6-C12 아릴은 할로겐, -NH2, 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬, 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고, 상기 치환된 6-12각 헤테로 아릴은 하나 이상의 할로겐으로 치환될 수 있고;
R2는 수소 또는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬일 수 있고;
R3는 비치환 또는 치환된 C6-C10 아릴; 또는 비치환 또는 치환된 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 6-8각 헤테로 사이클로 알킬일 수 있고; 이때, 상기 치환된 C6-C10 아릴은 하나 이상의 메톡시기로 치환될 수 있고, 상기 치환된 6-8각 헤테로 사이클로 알킬은 하나 이상의 하이드록시 에틸기로 치환될 수 있고; 및
R4는 C1-C3 할로알킬, -SR5 또는 -SO2R5일 수 있고, 이때, 상기 R5는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C6 알킬일 수 있다.
또한, 상기 화학식 1에 있어서,
L은 단일결합 또는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬렌일 수 있고;
R1은 수소; C3-C6 사이클로 알킬; 비치환 또는 치환된 C6-C10 아릴; N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 6-10각 헤테로 아릴; 또는 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 6-8각 헤테로 사이클로 알킬일 수 있고, 이때, 상기 치환된 C6-C10 아릴은 플루오로, -NH2, 메톡시 및 이소프로필로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고, 상기 치환된 6-10각 헤테로 아릴은 하나 이상의 클로로로 치환될 수 있고;
R2는 수소 또는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬일 수 있고;
R3는 비치환 또는 하나 이상의 메톡시기로 치환된 C6-C10 아릴; 또는 비치환 또는 하나 이상의 하이드록시 에틸기로 치환된 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 6-8각 헤테로 사이클로 알킬일 수 있고; 및
R4는 -CH2F, -CHF2, -CF3, -CH2Cl, -CHCl2, -CCl3, -CH2Br, -CHBr2, -CBr3, -SR5 또는 -SO2R5일 수 있고, 이때, 상기 R5는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬일 수 있다.
나아가, 상기 화학식 1에 있어서,
L은 단일결합, -CH2- 또는 -CH2CH2-일 수 있고;
R1은 수소, 사이클로 프로필, 모폴리닐, 테트라하이드로피라닐, 인돌릴, 페닐 또는 비치환 또는 하나 이상의 클로로로 치환된 피리디닐일 수 있고, 이때 상기 페닐은 메톡시, 플루오로, 이소프로필, -NH2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고;
R2는 수소, 메틸 또는 에틸일 수 있고;
R3는 모폴리닐; 비치환 또는 하나 이상의 메톡시로 치환된 페닐; 또는 비치환 또는 하나 이상의 하이드록시 에틸기로 치환된 피페라지닐일 수 있고; 및
R4는 -CHF2, -CH2F, -CF3, -SCH3 또는 -SO2CH3일 수 있다.
더 나아가, 상기 화학식 1에 있어서,
L은 단일결합 또는 -CH2CH2-일 수 있고;
R1은 수소,
Figure pat00004
,
Figure pat00005
,
Figure pat00006
,
Figure pat00007
,
Figure pat00008
,
Figure pat00009
,
Figure pat00010
,
Figure pat00011
또는
Figure pat00012
일 수 있고;
R2는 수소 또는 에틸일 수 있고;
R3는
Figure pat00013
,
Figure pat00014
또는
Figure pat00015
일 수 있고; 및
R4는 -CF3, -SCH3 또는 -SO2CH3일 수 있다.
더욱 나아가, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나인 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다.
(1) N-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드;
(2) N-(3,5-디클로로피리딘-4-일)-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드;
(3) 4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)-N-(피리딘-4-일)피리미딘-5-카복사미드;
(4) N-(2-(1H-인돌-3-일)에틸)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드;
(5) 4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)피리미딘-5-카복사미드;
(6) N-(4-플루오로페닐)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드;
(7) N-(3,4-디메톡시페네틸)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드;
(8) N-(2,4-디메톡시벤질)-4-모폴리노-2-(트리플루오로메틸)피리딘-5-카복사미드;
(9) N-(2,4-디메톡시벤질)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드;
(10) N-(3,5-디클로로피리딘-4-일)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드;
(11) N-(3,4-디메톡시페닐)-4-모폴리노-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드;
(12) 4-(3,4-디메톡시페닐)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드;
(13) 4-(3,4-디메톡시페닐)-N,N-디에틸-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드;
(14) 4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸설포닐)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)피리미딘-5-카복사미드;
(15) N-사이클로프로필-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드;
(16) N-(3,5-디클로로피리딘-4-일)-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드;
(17) 4-(3,4-디메톡시페닐)-N,N-디에틸-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드;
(18) N-사이클로프로필-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드;
(19) N-사이클로프로필-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸설포닐)피리미딘-5-카복사미드;
(20) N-(4-아미노-3,5-디이소프로필페닐)-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드;
(21) N-(4-아미노-3,5-디이소프로필페닐)-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드;
(22) N-(3,4-디메톡시페닐)-4-(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드;
(23) N-(3,4-디메톡시페네틸)-4-모폴리노-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드;
(24) N-(2-(1H-인돌-3-일)에틸)-4-모폴리노-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드;
(25) 4-(3,4-디메톡시페닐)-N-(피리딘-4-일)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드;
(26) 4-(3,4-디메톡시페닐)-N-(2-모폴리노에틸)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드;
(27) 4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)-N-(2-모폴리노에틸)피리미딘-5-카복사미드;
(28) N-(3,4-디메톡시페네틸)-4-(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드;
(29) N,4-bis(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드; 및
(30) N,4-bis(3,4-디메톡시페닐)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드.
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 아세트산, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 화학식 1의 유도체를 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜셔 제조할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 PDE4의 발현을 억제하며, IL-4(Interleukin-4), IL-5(Interleukin-4), IFN-γ(interferon-γ), IL-17(Interleukin-17), IgE(면역글로불린 E) 및 TNF-α(Tumor necrosis factor-α) 등의 염증 질환 관련 물질의 발현을 조절능력이 뛰어나므로, 염증 질환의 치료 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.(실험예 1-4 참조)
또한, 분자수준에서의 PDE4B에 대한 결합능력을 분자 도킹실험을 통하여 확인되었으므로, 신체 내의 PDE4B의 발현을 효과적으로 억제시켜 염증 질환의 치료 또는 예방을 가능하게 한다.(실험예 5 참조)
또한, 본 발명은 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이
화학식 2로 표시되는 화합물과 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜, 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다.
[반응식 1]
Figure pat00016
이때, 상기 반응식 1에서,
L, R1, R2, R3 및 R4는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다.
이하, 상기 제조 방법을 상세히 설명한다.
상기 반응식 1로 표시되는 제조 방법은 화학식 2로 표시되는 화합물의 알데하이드기에 화학식 3으로 표시되는 아민 화합물을 반응시켜 화학식 1로 표시되는 본 발명에 따른 화합물을 제조하는 방법이다.
이때, 상기 화학식 3으로 표시되는 아민 화합물을 반응시키기 위하여 화학식 2로 표시되는 화합물의 알데히드기에 클로로를 첨가하는 단계를 추가하여 하기 반응식 2와 같은 수 있다.
구체적으로, 상기 화학식 2의 화합물을 DCM 등의 용매에 용해시킨 후, 상기 용액에 옥살릴 클로라이드 및 무수 DMF을 첨가하여 반응 혼합물을 교반하여 반응시킬 수 있다.
다음으로, 반응이 종결된 혼합물을 감압 농축시켜 알데히드기에 클로로가 첨가된 하기 화학식 2'으로 표시되는 화합물을 얻을 수 있다.
[화학식 2']
Figure pat00017
상기 화학식 2'을 제조하는 단계가 완료된 후, 그 다음 과정으로 상기 수득한 화학식 2'으로 표시되는 화합물을 용매에 용해시키고, 화학식 3으로 표시되는 화합물을 첨가하여 반응 혼합물을 교반할 수 있다. 다음으로, 1 시간 동안 천천히 반응 온도를 상온 부근으로 상승시키면서 반응시킬 수 있다. 반응이 종결된 혼합물을 감압 농축시킬 수 있으며 농축된 혼합물을 컬럼 크로마토그래피 등을 통해 정제할 수 있다. 정제가 완료된 후 상기 화학식 1로 표시되는 목표 화합물을 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
이때, 상기 염증 질환은 피부염, 아토피 피부염, 천식, 비염, 관절염, 류머티스성 관절염, 위염, 장염, 신장염, 간염, 알레르기, 위궤양, 십이지장궤양, 식도염, 대장염, 전신부종, 국소부종, 각막염, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 염증성 통증, 요도염, 전립선염, 방광염, 치주염, 치은염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두통, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, PGE 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염 및 습진 다발성 경화증등 일 수 있으며, 통상적인 염증 질환이라면 상기 종류에 한정되지 않고 모두 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 PDE4의 발현을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
특히 PDE4 중에서도 PDE4B에 대한 선택적 반응을 통해 염증질환을 효과적으로 치료 및 예방할 수 있다.(실험예 5 참조)
나아가, 본 발명에 따른 상기 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 IL-4(Interleukin-4), IL-5(Interleukin-4), IFN-γ(interferon-γ), IL-17(Interleukin-17), IgE(면역글로불린 E) 또는 TNF-α(Tumor necrosis factor-α)등의 발현을 조절하는 것을 특징으로 할 수 있다
구체적으로, 항염 아토피 효능 평가 pharmacological profile(PDE4B enzyme inhibitor assay, PDE4B-GFP fusion protein assay, molecular docking with PDE4B enzyme). anti-atopic profile(DNCB-induced AD-like skin inflammation in Nc/Nga mice)
본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 임상 투여시에 직접 피부에 도포하거나, 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제, 트로키제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘 등과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염 등과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의할 수 있다. 또한, 직접 피부에 도포하는 방법을 통해 투여할 수 있으며, 도포시에는 연고, 스프레이, 화장수, 로션, 크림, 마사지크림, 에센스, 클렌징 제품, 팩, 파우더, 패치, 겔 등의 형태로 제조되어 도포될 수 있으며, 상기 종류에 특별히 제한 받지 않고 통상적인 도포 방법이라면 모두 사용될 수 있다.
이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 Kg인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.1-1000 mg/일이며, 바람직하게는 1-500 mg/일이며, 또한 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
이때, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 투여 방법 중 피부에 직접 도포하는 방법으로 투여하는 것이 바람직할 수 있으며, 경구 투여를 하지 않고 피부 도포 투여만으로도 현저히 높은 염증 질환 치료 효과가 나타난다(실험예 1-4 참조).
이에 따라 본 발명에 따른 약학적 조성물은 종래 아토피 치료제의 문제점이 었던 경구 투여시 발생할 수 있는 구토, 매스꺼움 또는 어지러움 등의 부작용이 발생하지 않는다는 장점을 가진다.
나아가, 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물은 염증 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강 기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 건강기능성 식품 조성물은 염증 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 식품, 음료 등의 건강보조 식품에 첨가할 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품, 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 g당 일반적으로 약 1 g 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 g 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 화학식 1의 화합물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 특별히 제한되는 것을 아니지만, 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
이하, 하기 실시예 및 실험예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 제조예 1> 4-(3,4- 디메톡시페닐 )-2-( 트리플루오로메틸 )피리미딘-5- 카복실릭 에시드의 제조
Figure pat00018
단계 1: 에틸 4 - 클로로 -2-( 트리플루오로메틸 )피리미딘-5- 카복실레이트의 제조
디에틸 (에톡시 메틸렌) 말로네이트 (10 g, 46.24 mmol) 및 트리플루오로아세트아미딘 (6.2 g, 55.48 mmol)의 무수 EtOH (60 mL) 용액에 소듐 에톡사이드 (3.15 g, 46.24 mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 질소분위기 하에 80°C에서 9시간 환류시켰다. 반응 종류 후, 상기 반응 혼합물을 상온에서 냉각하고, 과량의 에탄올을 rotavapor로 증발시키고, 얼음물에 부어 고체를 수득하였다. 상기 고체를 필터하고, DI water 및 헥산으로 세척한 후, 진공하에 건조하여 에틸 2-(트리플루오로메틸)-1,6-디하이드로-6-옥소피리미딘-5-카복실레이트를 옅은 노란색 고체 (5g, 60%)로 얻었으며, 이를 별도의 정제과정 없이 다음 단계에 사용하였다. 상기 중간체 (2.4 g)를 포스포릴(V)옥시클로라이드 (25 ml)에 천천히 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 100°C에서 3시간 가열하였다 상기 반응물을 상온에서 냉각시킨 후, 잘게 부순 얼음(crushed ice)에 천천히 부었다. 천천히 교반시켜 고체를 수득하고, 고체를 여과하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc 5% 의 헥산)로 정제하여 흰색 고체의 목적화합물을 얻었다. 수율: 2.5g, 95%. 1H NMR (DMSO-d6, 400MHz): 9.41(1H, s), 4.41(2H, q), 1.36(3H, t). ESIMS: 255 (M+1).
단계 2: 에틸 4-(3,4- 디메톡시페닐 )-2-( 트리플루오로메틸 )피리미딘-5- 카복실 레이트의 제조
P(t-Bu)3 (0.32 g, 1.57 mmol) 및 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(Pd2(dba)3 (0.72 g, 0.78 mmol)의 10ml THF의 용액을 상온에서 30분간 교반시키고, 검붉은 색의 비균질 용액 Pd(P(t-Bu)3)2 를 형성하였다. 이후 KF (2.74 g, 47.24 mmol), 및3,4-디메톡시페닐보로닉에시드 (2.15 g, 11.80 mmol)의 dry THF (50ml)를 첨가하였다. 최종적으로, 에틸4-클로로-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복실레이트 (2g, 7.8mmol)를 질소분위기 하에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 55°C에서 17시간 가열하였다. 반응 종료 후, 상기 혼합물을 냉각시키고, 진공하에 농축하여 미정제 잔여물(crude residue)을 얻은 후, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (에틸아세테이트/ 헥산, 1:3)으로 정제하여 흰색 고체의 목적 화합물(74% 수율)을 얻었다.
단계 3: 4 -(3,4- 디메톡시페닐 )-2-( 트리플루오로메틸 )피리미딘-5- 카복실릭 에 시드의 제조
에틸 4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복실레이트(2.5g, 7.61mmol) 의 에탄올 (25 mL)에 1 N NaOH 수용액(5ml)을 첨가하였다. 이후 상기 반응 혼합물을 상온에서 밤샘 교반시켰다. 반응 종료 후, 상기 유기용매를 증발시키고, 1 N HCl 수용액 (5ml)을 잔여물에 첨가하였다. 생성된 침전물을 필터하여 수집하고, 고진공 펌프하에서 건조한 후, 흰색 고체로 목적 화합물을 얻었다. 수율: 2g, 90%.
< 제조예 2> 4-(3,4- 디메톡시페닐 )-2-( 메틸티오 )피리미딘-5- 카복실릭 에시드 의 제조
Figure pat00019
상기 제조예 1의 단계 1에서, 2,2,2-트리플루오로아세트이미다미드 대신 메틸 카바미미도티오에이트(55.48 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 유사한 방법으로 4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복실릭 에시드를 제조하였다(수율:90%).
< 제조예 3> 4 - 모폴리노 -2-( 트리플루오로메틸 )피리미딘-5- 카복실릭 에시드의 제조
Figure pat00020
상기 제조예 1의 단계 2에서, 3,4-디메톡시페닐보로닉 에시드 대신 모폴린(0.42 mL, 4.92 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 유사한 방법으로 4-모폴리노-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복실릭 에시드를 제조하였다(수율: 98%).
< 제조예 4> 2-( 메틸티오 )-4- 모폴리노피리미딘 -5- 카복실릭 에시드의 제조
Figure pat00021
상기 제조예 1의 단계 1에서 2,2,2-트리플루오로아세트이미다미드 대신 메틸 카바미미도티오에이트(55.48 mmol)를 사용하고, 상기 제조예 1의 단계 2에서 3,4-디메톡시페닐보로닉 에시드 대신 모폴린(0.42 mL, 4.92 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 유사한 방법으로 2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복실릭 에시드를 제조하였다(수율: 98%).
< 제조예 5> 4-(3, 4- 디메톡시페닐 )-2-( 메틸티오 ) 피리미딘 -5- 카복실릭 에시드의 제조
Figure pat00022
상기 제조예 1과 유사한 방법으로 4-(3, 4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오) 피리미딘 -5-카복실릭 에시드를 제조하였다(수율:90%).
< 제조예 6> 4-(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일)-2-( 메틸티오 )피리미딘-5-카복실랙 에시드의 제조
Figure pat00023
에틸 4-클로로-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복실레이트(250 mg, 0.766 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(258 μl, 1.53 mmol)의 dry THF (8 mL)에 1-(2-하이드록시에틸)피페라진 (95 μl, 0.766 mmol)을 첨가하였다 상기 혼합물을 상온에서 24시간 교반시켰다. 반응 종료 후, 상기 반응 혼합물을 진공하에 농축하고, 컬럼 크로마토그래피(에틸아세테이트: 헥산, 4:6)을 정제하여 에틸 4-(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복실레이트를 흰색고체(300 mg, 88%)로 얻었다. 이 후, 상기 에스터 중간체를 분석 없이 다음 단계에 사용하였다. 상기 에틸 4-(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복실레이트를 5ml의 에탄올에 용해시키고, 1 N NaOH 수용액(2 mL)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 상온에서 밤샘 교반시켰다. 상기 유기용매를 증발시키고, 1 N HCl 수용액을 (2.5 mL) 첨가하였다(pH -7.0). 상기 침전물을 필터하여 수집하고, 고진공 펌프하에 건조하여 목적 화합물을 흰색 고체로 얻었다.
< 실시예 1> N-(3,4- 디메톡시페닐 )-2-( 메틸티오 )-4- 모폴리노피리미딘 -5- 카복사미드의 제조
상기 제조예 4에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신 3,4-이페톡시페닐을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 N-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 2> N-(3,5- 디클로로피리딘 -4-일)-4-(3,4- 디메톡시페닐 )-2-( 메틸티오 )피리미딘-5-카복사미드의 제조
상기 제조예 2에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신 3,5-디클로로-4-피리디닐을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 N-(3,5-디클로로피리딘-4-일)-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 3> 4-(3,4- 디메톡시페닐 )-2-( 메틸티오 )-N-(피리딘-4-일)피리미딘-5-카복사미드의 제조
상기 제조예 2에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신 4-피리디닐을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)-N-(피리딘-4-일)피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 4> N-(2-(1H-인돌-3-일)에틸)-2-( 메틸티오 )-4- 모폴리노피리미딘 -5-카복사미드의 제조
상기 제조예 4에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신 트립타민 을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 N-(2-(1H-인돌-3-일)에틸)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 5> 4-(3,4- 디메톡시페닐 )-2-( 메틸티오 )-N-( 테트라하이드로 -2H-피란-4-일)피리미딘-5-카복사미드의 제조
상기 제조예 2에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신 4-플루오로페닐을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 6> N-(4- 플루오로페닐 )-2-( 메틸티오 )-4- 모폴리노피리미딘 -5- 카복사미드의 제조
상기 제조예 4에서 제조된 화합물을 사용하여4-아미노피리미딘 대신 4-플루오로페닐을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 N-(4-플루오로페닐)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 7> N-(3,4- 디메톡시페네틸 )-2-( 메틸티오 )-4- 모폴리노피리미딘 -5- 카복사미드의 제조
상기 제조예 4에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신 3,4-디메톡시페닐에틸을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 N-(3,4-디메톡시페네틸)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 8> N-(2,4- 디메톡시벤질 )-4- 모폴리노 -2-( 트리플루오로메틸 )피리딘-5-카복사미드의 제조
상기 제조예 3에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신 2,4-디메톡시페닐메틸을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 N-(2,4-디메톡시벤질)-4-모폴리노-2-(트리플루오로메틸)피리딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 9> N-(2,4- 디메톡시벤질 )-2-( 메틸티오 )-4- 모폴리노피리미딘 -5- 카복사미드의 제조
상기 제조예 4에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신 2,4-디메톡시페닐메틸을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 N-(2,4-디메톡시벤질)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 10> N-(3,5- 디클로로피리딘 -4-일)-2-( 메틸티오 )-4- 모폴리노피리미딘 -5-카복사미드의 제조
상기 제조예 4에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신 3,5-디클로로-4-피리딜을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 N-(3,5-디클로로피리딘-4-일)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 11> N-(3,4- 디메톡시페닐 )-4- 모폴리노 -2-( 트리플루오로메틸 )피리미딘-5-카복사미드의 제조
상기 제조예 3에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신 3,4-디메톡시페닐을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 N-(3,4-디메톡시페닐)-4-모폴리노-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 12> 4-(3,4- 디메톡시페닐 )-N-( 테트라하이드로 -2H-피란-4-일)-2-( 트 리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드의 제조
상기 제조예 1에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신 테트라하이드로피란-4-아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 4-(3,4-디메톡시페닐)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 13> 4-(3,4- 디메톡시페닐 )- N,N - 디에틸 -2-( 트리플루오로메틸 )피리미딘-5-카복사미드의 제조
상기 제조예 1에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신 N,N-디에틸아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 4-(3,4-디메톡시페닐)-N,N-디에틸-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 14> 4-(3,4- 디메톡시페닐 )-2-( 메틸설포닐 )-N-( 테트라하이드로 -2H-피란-4-일)피리미딘-5-카복사미드의 제조
상기 제조예 2에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신 테트라하이드로피란-4-아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸설포닐)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 15> N- 사이클로프로필 -4-(3,4- 디메톡시페닐 )-2-( 트리플루오로메틸 )피리미딘-5-카복사미드의 제조
상기 제조예 1에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신 사이클로프로판아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 N-사이클로프로필-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 16> N-(3,5- 디클로로피리딘 -4-일)-4-(3,4- 디메톡시페닐 )-2-( 트리플 루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드의 제조
상기 제조예 1에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신 3,5-디클로로-4-피리딜을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 N-(3,5-디클로로피리딘-4-일)-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 17> 4-(3,4- 디메톡시페닐 )- N,N - 디에틸 -2-( 메틸티오 )피리미딘-5- 카복사미드의 제조
상기 제조예 2에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신 N,N-디에틸아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 4-(3,4-디메톡시페닐)-N,N-디에틸-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 18> N- 사이클로프로필 -4-(3,4- 디메톡시페닐 )-2-( 메틸티오 )피리미딘-5-카복사미드의 제조
상기 제조예 2에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신 사이클로프로판아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 N-사이클로프로필-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 19> N- 사이클로프로필 -4-(3,4- 디메톡시페닐 )-2-( 메틸설포닐 )피리미딘-5-카복사미드의 제조
상기 제조예 2에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신 사이클로프로판아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 N-사이클로프로필-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸설포닐)피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 20> N-(4-아미노-3,5- 디이소프로필페닐 )-4-(3,4- 디메톡시페닐 )-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드의 제조
상기 제조예 2에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신 2,6-디이소프로필아닐린을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 N-(4-아미노-3,5-디이소프로필페닐)-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 21> N-(4-아미노-3,5- 디이소프로필페닐 )-4-(3,4- 디메톡시페닐 )-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드의 제조
상기 제조예 1에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신 2,6-디이소프로필아닐린을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 N-(4-아미노-3,5-디이소프로필페닐)-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 22> N-(3,4- 디메톡시페닐 )-4-(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드의 제조
상기 제조예 4에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신 3,4-디메톡시페닐을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 N-(3,4-디메톡시페닐)-4-(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 23> N-(3,4- 디메톡시페네틸 )-4- 모폴리노 -2-( 트리플루오로메틸 )피리미딘-5-카복사미드의 제조
상기 제조예 3에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신 2-(3,4-디메톡시페닐에틸)에틸을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 N-(3,4-디메톡시페네틸)-4-모폴리노-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 24> N-(2-(1H-인돌-3-일)에틸)-4- 모폴리노 -2-( 트리플루오로메틸 )피리미딘-5-카복사미드의 제조
상기 제조예 3에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신트립타민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 N-(2-(1H-인돌-3-일)에틸)-4-모폴리노-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 25> 4-(3,4- 디메톡시페닐 )-N-(피리딘-4-일)-2-( 트리플루오로메틸 )피리미딘-5-카복사미드의 제조
상기 제조예 1에서 제조된 화합물을 사용하여 하기 반응식 6에 표시된 합성과정을 통해 4-(3,4-디메톡시페닐)-N-(피리딘-4-일)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
[반응식 6]
Figure pat00024
단계 1: 4 -(3,4- 디메톡시페닐 )-2-( 트리플루오로메틸 )피리미딘-5- 카보닐클로라이드의 제조
상기 제조예 1에서 제조된 4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복실릭 에시드 (500mg, 1.52 mmol)를 건조 DCM 5ml 에 용해시킨 용액에, 옥살릴 클로라이드(260μl, 3.04mmol) 및 무수 DMF(촉매량)를 0℃에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하였으며, 1시간 동안 상온에서 방치시켰다.
다음으로, 반응이 종결된 혼합물을 진공 감압으로 농축시켜 미정제된 옅은 노란색 고체상의 4-(3, 4-디메톡시페닐)-2-(트리플루오로메틸) 피리미딘-5-카보닐 클로라이드를 수득하였다(0.6g, 1.73mmol).
단계 2: 4 -(3,4- 디메톡시페닐 )-N-(피리딘-4-일)-2-( 트리플루오로메틸 )피리미딘-5-카복사미드의 제조
상기 단계 1에서 수득한 4-(3, 4-디메톡시페닐)-2-(트리플루오로메틸) 피리미딘-5-카보닐 클로라이드를 건조 DCM 5ml에 용해시키고, 트리에틸아민(2.5mmol)을 첨가한 후, 4-aminopyridine(0.2g, 2.32mmol)을 첨가하여 0℃를 유지하였다. 반응 혼합물을 15분 동안 0℃에서 교반하였다. 다음으로, 1 시간 동안 천천히 반응 온도를 상온으로 상승시켰다. TLC를 통해 반응이 완료되었음을 확인하고, 반응이 종결된 혼합물을 진공상태에서 농축시켰으며, 농축된 혼합물을 실리카겔을 고정상으로 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 크로마토그래피 정제 후, 연한 노란색 고체상의 4-(3,4-디메톡시페닐)-N-(피리딘-4-일)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드를 수득하였다(수율: 0.6g, 70%).
TLC (CH2Cl2: CH3OH, 9:0.5 v/v)
Rf = 0.4
IR: 1687, 1591, 1266, 1146, 1024, 814 cm-1
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ9.06 (s, 1H), 8.43 - 8.38 (m, 2H), 8.07 (s, 1H), 7.48 (dd, J = 8.4, 2.2 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.37 - 7.32 (m, 2H), 6.93 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.82 (s, 3H); 13C NMR (500 MHz, CDCl3) δ 164.61, 163.04, 158.74, 152.61, 150.83, 149.58, 144.06, 128.39, 126.61, 123.33, 120.30, 113.60, 111.76, 111.33, 56.12, 56.03, 31.57, 22.63, 14.10; Q-TOF MS (ESI+) C19H15F3N4O3 Calcd: 404.3492, found: 406.1403 (M+2).
< 실시예 26> 4-(3,4- 디메톡시페닐 )-N-(2- 모폴리노에틸 )-2-( 트리플루오로메 틸)피리미딘-5-카복사미드의 제조
상기 제조예 1에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신 2-모폴리노에탄-1-아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 4-(3,4-디메톡시페닐)-N-(2-모폴리노에틸)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 27> 4-(3,4- 디메톡시페닐 )-2-( 메틸티오 )-N-(2- 모폴리노에틸 )피리미딘-5-카복사미드의 제조
상기 제조예 2에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신2-모폴리노에탄-1-아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)-N-(2-모폴리노에틸)피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 28> N-(3,4- 디메톡시페네틸 )-4-(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드의 제조
상기 제조예 4에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신 2-(3,4-디메톡시페닐)에틸을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 N-(3,4-디메톡시페네틸)-4-(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 29> N,4 -bis(3,4- 디메톡시페닐 )-2-( 메틸티오 )피리미딘-5- 카복사미드의 제조
상기 제조예 2에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신 3,4-디메톡시페닐을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 N,4-bis(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
< 실시예 30> N,4 -bis(3,4- 디메톡시페닐 )-2-( 트리플루오로메틸 )피리미딘-5- 카 복사미드의 제조
상기 제조예 1에서 제조된 화합물을 사용하여 4-아미노피리미딘 대신 3,4-디메톡시페닐을 사용한 것을 제외하고는 실시예 25와 유사한 방법으로 N,4-bis(3,4-디메톡시페닐)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드를 제조하였다.
(문의: 각 실시예 들의 NMR 데이터를 송부하여주시기 바랍니다.)
(문의: 실시예 14, 19, 22 및 28에 대한 구체적인 합성 프로토콜을 알려주시기 바랍니다.)
상기 실시예들의 화학구조 및 화학식명을 하기 표 1에 정리하여 나타내었다.
실시예 화학구조 화학식명
1
Figure pat00025
 N-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드
2
Figure pat00026
 N-(3,5-디클로로피리딘-4-일)-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드
3
Figure pat00027
 4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)-N-(피리딘-4-일)피리미딘-5-카복사미드
4
Figure pat00028
 N-(2-(1H-인돌-3-일)에틸)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드
5
Figure pat00029
 4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)피리미딘-5-카복사미드
6
Figure pat00030
 N-(4-플루오로페닐)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드
7
Figure pat00031
 N-(3,4-디메톡시페네틸)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드
8
Figure pat00032
 N-(2,4-디메톡시벤질)-4-모폴리노-2-(트리플루오로메틸)피리딘-5-카복사미드
9
Figure pat00033
 N-(2,4-디메톡시벤질)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드
10
Figure pat00034
 N-(3,5-디클로로피리딘-4-일)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드
11
Figure pat00035
 N-(3,4-디메톡시페닐)-4-모폴리노-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드
12
Figure pat00036
 4-(3,4-디메톡시페닐)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드
13
Figure pat00037
 4-(3,4-디메톡시페닐)-N,N-디에틸-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드
14
Figure pat00038
 4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸설포닐)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)피리미딘-5-카복사미드
15
Figure pat00039
 N-사이클로프로필-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드
16
Figure pat00040
 N-(3,5-디클로로피리딘-4-일)-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드
17
Figure pat00041
 4-(3,4-디메톡시페닐)-N,N-디에틸-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드
18
Figure pat00042
 N-사이클로프로필-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드
19
Figure pat00043
 N-사이클로프로필-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸설포닐)피리미딘-5-카복사미드
20
Figure pat00044
 N-(4-아미노-3,5-디이소프로필페닐)-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드
21
Figure pat00045
 N-(4-아미노-3,5-디이소프로필페닐)-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드
22
Figure pat00046
 N-(3,4-디메톡시페닐)-4-(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드
23
Figure pat00047
 N-(3,4-디메톡시페네틸)-4-모폴리노-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드
24
Figure pat00048
 N-(2-(1H-인돌-3-일)에틸)-4-모폴리노-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드
25
Figure pat00049
 4-(3,4-디메톡시페닐)-N-(피리딘-4-일)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드
26
Figure pat00050
 4-(3,4-디메톡시페닐)-N-(2-모폴리노에틸)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드
27
Figure pat00051
 4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)-N-(2-모폴리노에틸)피리미딘-5-카복사미드
28
Figure pat00052
 N-(3,4-디메톡시페네틸)-4-(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드
29
Figure pat00053
 N,4-bis(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드
30
Figure pat00054
 N,4-bis(3,4-디메톡시페닐)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드
실시예 화합물의 NMR 데이터
상기 실시예 1-30의 NMR 데이터(1H-NMR 및 13C-NMR)는 하기와 같다.
<실시예 1의 1H-NMR>
Figure pat00055
<실시예 1의 13C-NMR>
Figure pat00056
<실시예 2의 1H-NMR>
Figure pat00057
<실시예 2의 13C-NMR>
Figure pat00058
<실시예 3의 1H-NMR>
Figure pat00059
<실시예 3의 13C-NMR>
Figure pat00060
<실시예 4의 1H-NMR>
Figure pat00061
<실시예 4의 13C-NMR>
Figure pat00062
<실시예 5의 1H-NMR>
Figure pat00063
<실시예 5의 13C-NMR>
Figure pat00064
<실시예 6의 1H-NMR>
Figure pat00065
<실시예 6의 13C-NMR>
Figure pat00066
<실시예 7의 1H-NMR>
Figure pat00067
<실시예 7의 13C-NMR>
Figure pat00068
<실시예 8의 1H-NMR>
Figure pat00069
<실시예 8의 13C-NMR>
Figure pat00070
<실시예 9의 1H-NMR>
Figure pat00071
<실시예 9의 13C-NMR>
Figure pat00072
<실시예 10의 1H-NMR>
Figure pat00073
<실시예 10의 13C-NMR>
Figure pat00074
<실시예 11의 1H-NMR>
Figure pat00075
<실시예 11의 13C-NMR>
Figure pat00076
<실시예 12의 1H-NMR>
Figure pat00077
<실시예 12의 13C-NMR>
Figure pat00078
<실시예 13의 1H-NMR>
Figure pat00079
<실시예 13의 13C-NMR>
Figure pat00080
<실시예 14의 1H-NMR>
Figure pat00081
<실시예 14의 13C-NMR>
Figure pat00082
<실시예 15의 1H-NMR>
Figure pat00083
<실시예 15의 13C-NMR>
Figure pat00084
<실시예 16의 1H-NMR>
Figure pat00085
<실시예 16의 13C-NMR>
Figure pat00086
<실시예 17의 1H-NMR>
Figure pat00087
<실시예 17의 13C-NMR>
Figure pat00088
<실시예 18의 13C-NMR>
Figure pat00089
<실시예 19의 1H-NMR>
Figure pat00090
<실시예 19의 13C-NMR>
Figure pat00091
<실시예 20의 1H-NMR>
Figure pat00092
<실시예 20의 13C-NMR>
Figure pat00093
<실시예 21의 1H-NMR>
Figure pat00094
<실시예 21의 13C-NMR>
Figure pat00095
<실시예 22의 1H-NMR>
Figure pat00096
<실시예 22의 13C-NMR>
Figure pat00097
<실시예 23의 1H-NMR>
Figure pat00098
<실시예 23의 13C-NMR>
Figure pat00099
<실시예 24의 1H-NMR>
Figure pat00100
<실시예 24의 13C-NMR>
Figure pat00101
<실시예 25의 13C-NMR>
Figure pat00102
<실시예 26의 1H-NMR>
Figure pat00103
<실시예 26의 13C-NMR>
Figure pat00104
<실시예 27의 1H-NMR>
Figure pat00105
<실시예 27의 13C-NMR>
Figure pat00106
<실시예 28의 1H-NMR>
Figure pat00107
<실시예 29의 1H-NMR>
Figure pat00108
<실시예 29의 13C-NMR>
Figure pat00109
<실시예 30의 1H-NMR>
Figure pat00110
<실시예 30의 13C-NMR>
Figure pat00111
< 비교예 1> 아토피 치료제의 준비
기존에 아토피 치료제로 사용되는 화합물인 Rolipram(4-(3-(사이클로펜틸록시)-4-메톡시페닐)피롤리딘-2-온)을 준비하였다.
Figure pat00112
< 실험예 1> 본 발명에 따른 화합물의 PDE4B 억제 활성 분석
본 발명에 따른 화합물들의 PDE4B 억제 활성을 평가하기 위하여, LANCE Ultra cAMP assay kit(Perkin Elmer, U.S.A)를 사용하여 실험을 수행하였다.
구체적으로, 반응 완충 용액에 용해시킨 3 nM의 cAMP 5 μl를 반응 웰(LANCE Ultra cAMP assay kit)에 첨가하였다. 다음으로, 상기 웰에 각각의 실시예 화합물 희석 용액(2.5 μl) 및 PDE4B 효소(0.1 ng/well, BPS Biosciences, San Diego, U.S.A)를 첨가하여 1 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 후, 5 μl의 Eu-cAMP 트레이서(tracer) 및 1 mM의 IBMX(LANCE Ultra cAMP assay kit)로 보충된 5μl의 ULight-anti-cAMP 감지 반응물을 첨가하였다.다음으로, 한 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양이 끝난 후, 384 마이크로 웰-플레이트는 340 nm에서 들뜨고, 665nm에서 방출되는 신호를 EnVision Multilabel Reader(Perkin Elmer, U.S.A.)로 기록하였다.
실시예 1 ~ 실시예 30 화합물들의 cAMP로부터 5'AMP로의 억제 활성에 대한 IC50 수치를 하기 표 2에 정리하여 나타내었다. IC50 수치는 cAMP로부터 5'AMP로의 50% 억제율을 위해 필요한 PDE4B 억제제 화합물의 몰랄 농도를 기준으로 계산되었다.

실시예
화학구조
화학식명		 PDE4B IC50(nM)
1
Figure pat00113
 N-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드 31
2
Figure pat00114
 N-(3,5-디클로로피리딘-4-일)-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드 178
3
Figure pat00115
 4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)-N-(피리딘-4-일)피리미딘-5-카복사미드 95
4
Figure pat00116
 N-(2-(1H-인돌-3-일)에틸)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드 166
5
Figure pat00117
 4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)피리미딘-5-카복사미드 239
6
Figure pat00118
 N-(4-플루오로페닐)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드 367
7
Figure pat00119
 N-(3,4-디메톡시페네틸)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드 61
8
Figure pat00120
 N-(2,4-디메톡시벤질)-4-모폴리노-2-(트리플루오로메틸)피리딘-5-카복사미드 74
9
Figure pat00121
 N-(2,4-디메톡시벤질)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드 377
10
Figure pat00122
 N-(3,5-디클로로피리딘-4-일)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드 73
11
Figure pat00123
 N-(3,4-디메톡시페닐)-4-모폴리노-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드 67
12
Figure pat00124
 4-(3,4-디메톡시페닐)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드 266
13
Figure pat00125
 4-(3,4-디메톡시페닐)-N,N-디에틸-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드 833
14
Figure pat00126
 4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸설포닐)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)피리미딘-5-카복사미드 506
15
Figure pat00127
 N-사이클로프로필-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드 252
16
Figure pat00128
 N-(3,5-디클로로피리딘-4-일)-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드 44
17
Figure pat00129
 4-(3,4-디메톡시페닐)-N,N-디에틸-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드 NA
18
Figure pat00130
 N-사이클로프로필-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드 477
19
Figure pat00131
 N-사이클로프로필-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸설포닐)피리미딘-5-카복사미드 189
20
Figure pat00132
 N-(4-아미노-3,5-디이소프로필페닐)-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드 745
21
Figure pat00133
 N-(4-아미노-3,5-디이소프로필페닐)-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드 222
22
Figure pat00134
 N-(3,4-디메톡시페닐)-4-(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드 881
23
Figure pat00135
 N-(3,4-디메톡시페네틸)-4-모폴리노-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드 150
24
Figure pat00136
 N-(2-(1H-인돌-3-일)에틸)-4-모폴리노-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드 469
25
Figure pat00137
 4-(3,4-디메톡시페닐)-N-(피리딘-4-일)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드 15
26
Figure pat00138
 4-(3,4-디메톡시페닐)-N-(2-모폴리노에틸)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드 195
27
Figure pat00139
 4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)-N-(2-모폴리노에틸)피리미딘-5-카복사미드 860
28
Figure pat00140
 N-(3,4-디메톡시페네틸)-4-(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드 238
29
Figure pat00141
 N,4-bis(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드 634
30
Figure pat00142
 N,4-bis(3,4-디메톡시페닐)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드 61
비교예 1
(Rolipram)
Figure pat00143
 4-(3-(사이클로펜틸록시)-4-메톡시페닐)피롤리딘-2-온 2.2μM
상기 표 2에서도 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 실시예 1 ~ 실시예 30의 화합물은 나노몰 수준의 PDE4B IC50 수치를 나타내는 것을 알 수 있다. 이는 기존 아토피 치료제로 사용되어 왔던 비교예 1의 화합물(Rolipram)의 IC50 수치가 약 2.2μM인 것과 비교하였을 때, 현저히 높은 PED4B 억제활성을 나타내는 것임을 의미한다. 특히, 실시예 1, 3, 7, 8, 10, 11, 16, 25 및 30 화합물의 경우 모두 10nM 미만의 현저히 낮은 IC50 수치를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 염증 질환과 관련된 효소인 PDE4B의 억제활성이 현저히 뛰어나므로, 염증질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
< 실험예 2> 본 발명에 따른 화합물의 세포 내 효소 억제 활성 평가
본 발명에 따른 실시예 1 및 실시예 25 화합물의 세포 내 효소 억제활성을 평가하기 위해 GFP(green fluorescent protein)을 사용하여 PDE4B GFP fusion protein-inhibitor assay를 수행하였다.
인간 혈액 샘플(QIAamp DNA Blood Mini Kit, Qiagen, Valencia, CA, U.S.A.)로부터 추출한 DNA 게놈을 사용하여 인간 PDE4B2A에 대한 상보 DNA를 PCR 증폭시켰다.
DNA 증폭을 위해 forward primer로 5'-CCGGAATTCGTTCTATGGCCCAGACCTCACA-3'를 사용하였으며, reverse primer로는 5'-CGCGGATCCTACCAGGGTTTGAGCTCAGC-3'를 사용하였다.
증폭된 PDE4B2A cDNA를 EcoR1 및 BamH1 억제 영역 사이의 포유류 발현 매개체 pAcGFP1-N1로 복제하였고, 그 다음 화학적 형질변화 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A.)을 사용하여 E. coli DH5α 세포로 트랜스펙션하였다.
카나마이신이 존재하는 콜로니로부터의 플라스미드는 Plasmid Midi Kit(Qiagen, Valencia, CA, U.S.A.)를 사용하여 고립시켰다. 그런 다음 PDE4B2A 유전자와 함께 복제된 플라스미드를 lipofectamine 3000(Invitrogen)을 사용하여 HEK-293 세포계(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)로 트랜스펙션하였다.
트랜스펙션된 세포들을 CO2 인큐베이터의 DMEM medium에서 37℃로 48시간 동안 배양하였다. 그 다음 세포들을 10nM, 100nM 및 500nM 농도의 실시예 1, 실시예 25 및 비교예 1 각각의 화합물과 함께 5% CO2 인큐베이터 안에서 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 HEK-293 세포의 형광 방출을 공초점 현미경 사진으로 촬영하여 정량분석을 수행하였고 그 결과를 도 1 및 도2에 나타내었다.
또한, MetaMorph 소프트웨어를 사용하여 세포 전체 표면적 대비 GFP의 표면 커버영역 비율을 측정하여 도 2에 나타내었다.
도 1은 본 발명에 따른 실시예 1, 실시예 2 화합물과 비교예 1 화합물의 PDE4B GFP fusion protein-inhibitor assay 형광 방출을 촬영한 공초점 현미경 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 실시예 1, 실시예 2 화합과 비교예 1 화합물로 처리된 PDE4B GFP 퓨전 단백질의 형광 강도 및 세포 전체 표면적 대비 GFP의 전체 표면 커버 영역 비율을 나타낸 그래프이다. 도 2에서 바 그래프는 형광강도를 나타내며, 선 그래프는 GFP 커버영역을 나타낸다.
도 1 및 도 2에서도 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 실시예 1 및 실시예 25 화합물은 어떠한 억제제도 처리하지 않은 대조군과 비교했을 때, 비교적 약한 형광 강도를 나타냄을 알 수 있다. 특히 100nM 및 500nM의 농도에서는 형광 강도가 현저히 감소함을 확인할 수 있다. 이는 본 발명에 따른 실시예 1 및 실시예 25 화합물이 세포 내의 PDE4B2의 발현을 효과적으로 억제함을 나타내는 것으로, 본 발명에 따른 화합물이 PDE4B2와 연관된 아토피 질환에 효과적으로 사용될 수 있다는 것을 의미한다.
< 실험예 2> 본 발명에 따른 화합물의 아토피 피부염 완화 효과 실험
1. DNCB처리 Nc / Nga 마우스의 아토피 증상 완화 실험
본 발명에 따른 실시예 1 및 실시예 25 화합물의 아토피 피부염 완화 효과를 확인하기 위하여 아토피 증상이 유발된 마우스를 대상으로 아토피 증상 완화 실험을 수행하였다.
Nc/Nga 마우스의 등 부위에 DNCB(dinitrochlorobenzene)를 도포하여 아토피 피부염 유사 증상을 유도하였다.
DNCB를 처리하기 위한 전달물질로는 아세톤과 올리브 오일이 3:1로 혼합된 아세톤-올리브오일을 사용하였으며, 전달물질만 처리한 마우스, 실시예 1 화합물을 처리한 마우스, 실시예 25 화합물을 처리한 마우스, DNCB만을 처리한 마우스, DNCB와 실시예 1 화합물을 처리한 마우스 및 DNCB와 실시예 25 화합물을 처리한 마우스의 총 6종류의 마우스를 준비하였다.
구체적으로, 실험 시작 2일 전에 마우스의 등 피부의 털을 제거하였다. 털을 제거하고 2일 후 1% DNCB 150μl를 전달물질에 녹인후 마우스의 등 피부에 발라주었다. 그 후 4일이 지난 뒤 같은 용액을 다시 한번 마우스의 등 피부에 발라주었다. 그 다음, 5주 동안 일주일에 한 번 씩 0.2% DNCB 용액 150μl를 마우스의 등 피부에 발라주었다. 실험군 마우스에는 실시예 1 및 실시예 25 화합물을 실험 시작 6일 째 부터 실험이 끝날 때 까지 매일 한 번씩 발라주었다.
등 피부의 건조 정도, 염증, 홍반 및 출혈 등의 증상을 통해 아토피 피부염 유사 피부가 되었음을 확인하였으며, DNCB 처리 이주 후 아토피 피부염 증상이 상당히 증가하는 것을 확인하였다.
도 3은 실험 마지막 날 촬영한 각 실험군 및 대조군 마우스의 등 피부 사진이다.
도 3을 통해 확인할 수 있듯이, DNCB만을 처리한 마우스의 등 피부에는 염증이 일어나는 것을 알 수 있다. 반면, DNCB 와 함께 실시예 1 및 실시예 25 화합물을 처리한 경우 DNCB만을 처리했을 때에 비하여 염증 발생이 현저히 감소함을 확인할 수 있다. 또한, 실시예 1 및 실시예 25 화합물 만을 처리한 마우스에서는 아무런 부작용이 나타나지 않음을 확인할 수 있어, 본 발명에 따른 화합물이 생체 내 안정성을 확보했음을 알 수 있다.
2. 아토피 증상 정도 평가 실험
5주의 실험기간 동안 일주일에 한번씩 실험군 및 대조군 마우스의 아토피 증상 정도를 평가하여 수치화 하였다. 점수는 홍반/출혈, 부종, 탈곡/부식, 스케일링/건조증 각각 네가지의 항목에 대하여 1(없음); 2(보통); 3(심각)의 세가지 점수를 부여했다. 총 합계 12점을 기준으로 각각의 실험군 및 대조군에 대하여 점수를 매겼다. 5주 동안의 점수 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4는 5주 동안의 실험결과 측정된 마우스의 아토피 증상을 점수화한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4(a)는 실시예 1 화합물에 대한 피부염 점수 그래프이고, 도 4(b)는 실시예 25 화합물에 대한 피부염 점수 그래프이다.
도 4에서도 확인할 수 있듯이, DNCB만을 처리했을 때, 5주 째의 피부염 점수는 12점인 반면, DNCB와 함께 실시예 1 및 실시예 25 화합물을 처리한 경우 5주 째의 피부염 점수가 약 3점 미만으로 현저히 차이남을 알 수 있다. 이를 통해 본 발명에 따른 화합물을 사용하였을 때, 외관상 나타나는 피부염 질환 증상을 현저히 완화시킬 수 있음을 확인할 수 있다.
3. 간지러움 완화 효과 측정
나아가, 본 발명에 따른 화합물의 간지러움증 완화 효과를 확인하기 위하여 실험군 및 대조군 마우스를 대상으로 20분 동안의 가려움 횟수를 측정하여 도 5(a)에 그래프로 나타내었다.
도 5(a)는 각각의 실험군 및 대조군 마우스의 20분 동안 긁는 횟수를 나타낸 그래프이다.
도 5(a)에서도 확인할 수 있듯이, DNCB만을 처리한 마우스의 긁는 횟수보다 실시예 1 및 실시예 25 화합물을 함께 처리한 마우스의 긁는 횟수가 현저히 적은 것을 알 수 있다.
4. 피부 변화 관찰 실험
또한, 상기 실험을 완료한 후, 실험군 및 대조군 마우스들의 등 피부를 절개하여 신체적 변화를 관찰하였다. DNCB만을 처리한 마우스에서는 뚜렷한 비대증상과 부종이 관찰되었다. 대조적으로, 실시예 1 및 실시예 25를 처리한 마우스의 피부는 DNCB만을 처리했을 때 보다 비후 및 부종의 증상이 나타나지 않았다.
나아가, 본 발명에 따른 화합물의 피부 비대증상 완화 효과를 확인하기 위해 절개된 피부 두께를 측정하였으며, 이를 도 5(b)에 그래프로 나타내었다.
도 5(b)는 절개된 실험군 및 대조군 마우스의 등 피부 두께를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5(b)에서도 확인할 수 있듯이, DNCB만 처리한 마우스 피부 두께는 1.19mm로 대조군의 두께 0.45mm와 비교하여 현저히 증가하였으나, 실시예 1 및 실시예 25 화합물을 처리했을 때의 피부두께는 각각 0.83mm 및 0.71mm로 현저히 감소하는 것을 알 수 있다.
5. 림프절 및 비장 변화 관찰
또한, 본 발명에 따른 화합물의 효과를 확인하기 위해 실험군 및 대조군 마우스 각각의 림프절을 분리하여 관찰하는 실험을 수행하였다. 림프절은 항원과 면역 세포 사이의 상호작용 부위이며, 염증성 증상이 발현되는 동안 림프절의 크기가 비대해지므로 림프절의 크기에 따라 염증성 질환의 발병 유무를 확인할 수 있다. 분리된 실험군 및 대조군 마우스 각각의 림프절을 촬영한 사진을 도 6(a)에 나타내었으며, 림프절의 중량 및 비장의 중량을 측정하여 도 6(b), 도6(c)에 나타내었다.
도 6(a)는 실험군 및 대조군 마우스의 림프절을 촬영한 사진이다.
도 6(b)는 실험군 및 대조군 마우스의 림프절의 중량을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6(c)는 실험군 및 대조군 마우스의 비장 중량을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6(a)에서 확인할 수 있듯이, DNCB 단독 처리된 마우스의 림프절인 대조군 마우스의 림프절과 비교하여 현저히 비대해졌음을 알 수 있다. 또한, 실시예 1 및 실시예 25 화합물을 처리한 마우스의 림프절은 DNCB를 단독 처리한 마우스의 림프절보다 현저하게 감소 되는 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 6(b)에서 확인할 수 있듯이, DNCB 단독 처리된 마우스의 림프절 중량이 대조군의 것과 비교하여 현저히 높은 것을 알 수 있다. 반면, 실시예 1 및 실시예 25 화합물을 처리한 마우스의 림프절 중량은 DNCB를 단독 처리한 것과 비교하여 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있다.
나아가, 도 6(c)에서도 확인할 수 있듯이 실시예 1 및 실시예 25 화합물을 처리할 경우 비장의 중량 또한 유의미한 수치로 감소하는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 화합물을 사용할 경우 생체내의 염증질환의 발생과 밀접한 관련이 있는 림프절 및 비장의 비대증상을 억제하는 것이 확인되었고, 이를 통해 본 발명에 따른 화합물이 염증질환의 치료에 효과적이라는 것을 확인할 수 있다.
< 실험예 3> 마우스의 피부 조직 관찰 실험
본 발명에 따른 화합물의 염증질환에 대한 효과를 확인하기 위하여 상기 마우스의 등 피부 조직을 관찰하였다.
실험이 완료된 실험군 및 대조군 마우스의 등 피부 샘플을 채취한 후, 10%의 중성 완충 포르말린을 사용하여 고정시킨 다음 파라핀에 끼워넣었다. 4 μm의 얇은 조직 절편을 준비하고 H&E(헤마톡실린&에오신)로 염색하였다. 또한, 비만 세포 침윤을 조사하기 위해 절편을 톨루이딘 블루로 염색하였다. 그 후, 염색된 조직 절편을 NikonAX70 광학 현미경(Tokyo, Japan)을 사용하여 촬영하였다.
도 7은 실험군 및 대조군 마우스의 등 피부 조직 절편을 H&E(헤마톡실린&에오신) 염색하여 촬영한 광학 현미경 사진을 나타낸다.(ⅰ=대조군, ⅱ=실시예 1, ⅲ=실시예 25, ⅳ=DNCB, ⅴ=DNCB+실시예 1, ⅵ=DNCB+실시예 25)
도 8는 실험군 및 대조군 마우스의 등 피부 조직 절편의 지방세포를 톨루이딘 블루로 염색하여 촬영한 광학 현미경 사진을 나타낸다.(ⅰ=대조군, ⅱ=실시예 1, ⅲ=실시예 25, ⅳ=DNCB, ⅴ=DNCB+실시예 1, ⅵ=DNCB+실시예 25)
도 9는 실험군 및 대조군 마우스의 등 피부 조직 절편의 지방 세포의 수를 나타낸 그래프이다.
도 7에서 확인할 수 있듯이, 대조군, 실시예 1 및 실시예 25 화합물을 처리한 피부조직 절편은 정상적인 피부구조를 나타냄을 알 수 있다. 반면, DNCB 단독 처리된 피부 절편은 심한 표피 과형성(표피증), 각화증이 나타나며 염증세포가 표피 및 진피 영역 모두로 고밀도로 깊게 침투한 것을 확인할 수 있다. 이에 비하여 실시예 1 및 실시예 25 화합물을 DNCB와 함께 처리한 마우스의 피부 절편에서는 표피 과형성 및 각화증이 현저히 감소한 것을 확인할 수 있으며, 염증세포가 거의 존재하지 않는 것을 확인할 수 있다.
나아가, 도 8 및 도 9에서 확인할 수 있듯이, 대조군과 비교하여 DNCB 단독 처리된 마우스의 피부 조직은 비만 세포의 숫자가 증가한 것을 알 수 있다. 반면, 실시예 1 및 실시예 25 화합물을 처리한 마우스의 피부 조직에서는 DNCB를 단독으로 처리했을 때와 비교하여 비만 세포의 숫자가 현저히 감소한 것을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 실시예 1 및 실시예 25 화합물을 염증 질환이 나타나는 피부에 도포하였을 때, 피부 내의 표피증 및 각화증을 완화시키고 염증세포의 생성을 억제시키며, 비만 세포의 증가를 감소시키므로, 염증질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 마우스의 피부 조직 CD4+ 세포를 염색하여 IL-17, IFN-γ, IL-4 및 IL-5의 발현을 확인하였다.
도 10 (a)~(d)는 실험군 및 대조군 마우스의 등 피부 조직 CD4+ 세포를 염색한 후 IL-17, IFN-γ, IL-4 및 IL-5 각각의 발현 정도를 촬영한 현미경 사진이다.(ⅰ=대조군, ⅱ=실시예 1, ⅲ=실시예 25, ⅳ=DNCB, ⅴ=DNCB+실시예 1, ⅵ=DNCB+실시예 25)
도 10(a), 도 10(c) 및 도 10(d)에서 확인할 수 있듯이, DNCB만을 단독으로 처리하였을 때 보다, 실시예 1 및 실시예 25 화합물을 피부에 도포한 경우 CD4+ 세포의 IL-17, IL-4 및 IL-5의 발현이 억제되는 것을 알 수 있다. IL-17, IL-4 및 IL-5는 염증의 발현과 관련된 시토카인으로써, 본 발명에 따른 화합물을 염증질환 피부에 도포할 경우 IL-17, IL-4 및 IL-5의 발현을 억제시키므로 본 발명에 따른 화합물은 염증질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 도 10(b)에서도 확인할 수 있듯이, 실시예 1 및 실시예 25 화합물을 피부에 도포할 경우 DC4+세포의 IFN-γ 발현을 활성화 시키는 것을 알 수 있다. IFN-γ는 세포 내의 바이러스 증식을 억제하는 시토카인 단백질로써, 본 발명에 따른 화합물을 피부에 도포할 경우 IFN-γ 발현을 활성화하여 세포 내의 염증 질환을 억제하므로, 본 발명에 따른 화합물은 염증질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
< 실험예 4> 본 발명에 따른 화합물의 효소결합 면역흡착측정(ELISA) 실험
본 발명에 따른 화합물의 DNCB 유도 IgE 및 염증 매개체 합성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 대조군 및 실험군의 실시예 1 및 실시예 25 화합물에 대한 ELISA(효소결합 면역흡착측정, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)을 수행하였다.
도 11 (a)~(e)는 마우스 피부 조직에 대하여 샌드위치 ELISA(효소결합 면역흡착측정, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)를 수행하였을 때 나타나는 IL-4, IL-5, IFN-γ, IL-17 및 IgE 각각의 발현 수치를 나타낸 그래프이다.
도 11 (a), (b) 및 (d)에서도 확인할 수 있듯이 DNCB만을 처리한 마우스의 피부에서는 IL-4, IL-5 및 IL-17과 같은 시토카인의 발현이 현저히 높게 나타남을 알 수 있다. 반면, 실시예 1 및 실시예 25 화합물을 처리하였을 때에는 IL-4, IL-5 및 IL-17의 발현이 현저히 억제됨을 확인할 수 있다.
IL-4, IL-5 및 IL-17은 염증의 발현과 관련된 시토카인으로써, 본 발명에 따른 화합물을 염증질환 피부에 도포할 경우 IL-17, IL-4 및 IL-5의 발현을 억제시키므로 본 발명에 따른 화합물은 염증질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 도 11(b)에서도 확인할 수 있듯이, DNCB만을 처리한 마우스의 피부에서는 IFN-γ의 발현이 현저히 감소함을 알 수 있다. 이와 대조적으로 실시예 1 및 실시예 25 화합물을 처리한 마우스의 피부에서는 IFN-γ의 발현이 높게 나타남을 확인할 수 있다.
IFN-γ는 세포 내의 바이러스 증식을 억제하는 시토카인 단백질로써, 본 발명에 따른 화합물을 피부에 도포할 경우 IFN-γ 발현을 활성화하여 세포 내의 염증 질환을 억제하므로, 본 발명에 따른 화합물은 염증질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
나아가, 도 11(e)에서도 확인할 수 있듯이, DNCB만을 처리한 마우스의 피부에서는 IgE(면역글로불린 E)의 발현이 대조군과 비교하였을 때, 현저히 높은 것을 알 수 있다. 반면, DNCB와 실시예 1 및 실시예 25 화합물을 함께 처리한 경우 IgE((면역글로불린 E)의 발현이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있다.
IgE(면역글로불린 E)는 비만 세포와 호염기구 표면에 있는 Fc 수용체에 결합하여 IgE 매개 알레르기 반응을 개시시키는 물질로써, 본 발명에 따른 화합물을 피부에 도포할 경우 IgE 발현을 억제시켜 세포 내의 염증 질환을 억제하므로, 본 발명에 따른 화합물은 염증질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 림프구에서 TNF-α 합성에 대한 실시예 1 및 실시예 25 화합물의 저해 잠재성을 평가하기 위해, 시험관 분석을 수행하였다. 구체적으로 인간 PBMC 세포를 배양 한 후 세균성 LPS를 사용하여 TNF-α 분비를 자극하여 그 발현량을 측정하였다.
도 11(f)는 실시예 1 및 실시예 25 화합물에 대한 TNF-α의 합성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 11(f)에서도 확인할 수 있듯이 실시예 1 및 실시예 25 화합물 모두 림프구 배양실험에 있어서 TNF-α 합성을 효과적으로 억제한다는 것을 알 수 있다.
TNF-α는 잘 알려진 친 염증성 매개체이며, 그 합성은 T 림프구에서 이루어지는 것으로 알려져 있다. 본 실험을 통해 본 발명에 따른 화합물은 TNF-α의 발현을 억제하는 것이 확인되었으므로, 본 발명에 따른 화합물은 염증질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
< 실험예 5> 본 발명에 따른 화합물의 분자 도킹(docking)실험
실시예 25 화합물의 PDE4B 효소의 cAMP 결합 부위에 대한 결합력을 확인하기 위하여 분자 도킹 실험을 수행하였다.
PDE4B (PDB : 1F0J)에 대한 실시예 25 화합물의 분자 도킹은 그래픽 인터페이스 DS-CDOCKER 프로토콜을 통해 구현된 Accelrys Discovery Studio (v 4.0)를 사용하여 관찰되었다.
도 12는 촉매결합 영역에서의 리간드와 PDE4B 사이의 결합을 나타낸 Discovery Srudio 사진이다.
도 13은 실시예 25 화합물과 PDE4B 간의 거리를 나타낸 사진이다.
도 14는 실시예 25 화합물과 PDE4B 간의 결합을 2차원 그림으로 나타낸 모식도이다.
도 15는 실시예 25 화합물의 PDE4B 촉매 결합 부위에서의 아로마틱 3차원 그림이다.
도 16는 PDE4A, PDE4B, PDE4C 및 PDE4D의 액티브 영역에서의 실시예 25 화합물의 결합 구조를 나타낸 3차원 그림이다.
도 13 및 도 14를 통해 확인할 수 있듯이 실시예 25 화합물의 불소 원자(도 15에서 a로 표시된 불소 원자)는 PDE4B의 Gln 500과 3.23Å의 강력한 수소 결합을 형성하고, 또 다른 불소 원자(도 15에서 b로 표시된 불소 원자)는 PDE4B의 His234와 강력한 탄소 수소 결합을 형성한다.
또한, 도 15를 통해 확인할 수 있듯이, 실시예 25 화합물은 PDE4B의 활성영역에 깊숙히 침투하여 결합하는 것을 알 수 있다.
나아가, 도 16을 통해 확인할 수 있듯이, 실시예 25 화합물은 PDE4A, PDE4C 및 PDE4D에 대한 매우 제한적인 결합성을 가지는 것을 알 수 있다. 따라서, 실시예 25 화합물은 PDE4B에 대한 선택성을 가지므로 보다 효과적으로 염증 질환 연관 효소인 PDE4B를 억제할 수 있다.
본 발명에 따른 실시예 25 화합물의 분자 도킹 실험을 통해 실시예 25 화합물의 PDE4B에 대한 우수한 결합성과 선택적 결합성을 확인할 수 있다. 이를 통해 본 발명에 따른 화합물이 염증 질환 관련 효소인 PDE4B의 발현을 효과적으로 억제시킨다는 것을 분자 수준 영역에서 확인하였으므로 본 발명에 따른 화합물이 염증 질환의 치료 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

Claims (11)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure pat00144

    (상기 화학식 1에서,
    L은 단일결합 또는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C6 알킬렌이고;
    R1은 수소; C3-C8 사이클로 알킬; 비치환 또는 치환된 C6-C12 아릴; N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 6-12각 헤테로 아릴; 또는 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 6-10각 헤테로 사이클로 알킬이고; 이때, 상기 치환된 C6-C12 아릴은 할로겐, -NH2, 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬, 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고, 상기 치환된 6-12각 헤테로 아릴은 하나 이상의 할로겐으로 치환될 수 있고;
    R2는 수소 또는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬이고;
    R3는 비치환 또는 치환된 C6-C10 아릴; 또는 비치환 또는 치환된 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 6-8각 헤테로 사이클로 알킬이고; 이때, 상기 치환된 C6-C10 아릴은 하나 이상의 메톡시기로 치환될 수 있고, 상기 치환된 6-8각 헤테로 사이클로 알킬은 하나 이상의 하이드록시 에틸기로 치환될 수 있고; 및
    R4는 C1-C3 할로알킬, -SR5 또는 -SO2R5이고, 이때, 상기 R5는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C6 알킬이다).
  2. 제1항에 있어서,
    L은 단일결합 또는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬렌이고;
    R1은 수소; C3-C6 사이클로 알킬; 비치환 또는 치환된 C6-C10 아릴; N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 6-10각 헤테로 아릴; 또는 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 6-8각 헤테로 사이클로 알킬이고, 이때, 상기 치환된 C6-C10 아릴은 플루오로, -NH2, 메톡시 및 이소프로필로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고, 상기 치환된 6-10각 헤테로 아릴은 하나 이상의 클로로로 치환될 수 있고;
    R2는 수소 또는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬이고;
    R3는 비치환 또는 하나 이상의 메톡시기로 치환된 C6-C10 아릴; 또는 비치환 또는 하나 이상의 하이드록시 에틸기로 치환된 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 6-8각 헤테로 사이클로 알킬이고; 및
    R4는 -CH2F, -CHF2, -CF3, -CH2Cl, -CHCl2, -CCl3, -CH2Br, -CHBr2, -CBr3, -SR5 또는 -SO2R5이고, 이때, 상기 R5는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬인 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  3. 제1항에 있어서,
    L은 단일결합, -CH2- 또는 -CH2CH2-이고;
    R1은 수소, 사이클로 프로필, 모폴리닐, 테트라하이드로피라닐, 인돌릴, 페닐 또는 비치환 또는 하나 이상의 클로로로 치환된 피리디닐이고, 이때 상기 페닐은 메톡시, 플루오로, 이소프로필, -NH2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고;
    R2는 수소, 메틸 또는 에틸이고;
    R3는 모폴리닐; 비치환 또는 하나 이상의 메톡시로 치환된 페닐; 또는 비치환 또는 하나 이상의 하이드록시 에틸기로 치환된 피페라지닐이고; 및
    R4는 -CHF2, -CH2F, -CF3, -SCH3 또는 -SO2CH3인 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  4. 제1항에 있어서,
    L은 단일결합 또는 -CH2CH2-이고;
    R1은 수소,
    Figure pat00145
    ,
    Figure pat00146
    ,
    Figure pat00147
    ,
    Figure pat00148
    ,
    Figure pat00149
    ,
    Figure pat00150
    ,
    Figure pat00151
    ,
    Figure pat00152
    또는
    Figure pat00153
    이고;
    R2는 수소 또는 에틸이고;
    R3는
    Figure pat00154
    ,
    Figure pat00155
    또는
    Figure pat00156
    이고; 및
    R4는 -CF3, -SCH3 또는 -SO2CH3인 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나인 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    (1) N-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드;
    (2) N-(3,5-디클로로피리딘-4-일)-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드;
    (3) 4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)-N-(피리딘-4-일)피리미딘-5-카복사미드;
    (4) N-(2-(1H-인돌-3-일)에틸)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드;
    (5) 4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)피리미딘-5-카복사미드;
    (6) N-(4-플루오로페닐)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드;
    (7) N-(3,4-디메톡시페네틸)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드;
    (8) N-(2,4-디메톡시벤질)-4-모폴리노-2-(트리플루오로메틸)피리딘-5-카복사미드;
    (9) N-(2,4-디메톡시벤질)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드;
    (10) N-(3,5-디클로로피리딘-4-일)-2-(메틸티오)-4-모폴리노피리미딘-5-카복사미드;
    (11) N-(3,4-디메톡시페닐)-4-모폴리노-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드;
    (12) 4-(3,4-디메톡시페닐)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드;
    (13) 4-(3,4-디메톡시페닐)-N,N-디에틸-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드;
    (14) 4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸설포닐)-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)피리미딘-5-카복사미드;
    (15) N-사이클로프로필-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드;
    (16) N-(3,5-디클로로피리딘-4-일)-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드;
    (17) 4-(3,4-디메톡시페닐)-N,N-디에틸-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드;
    (18) N-사이클로프로필-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드;
    (19) N-사이클로프로필-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸설포닐)피리미딘-5-카복사미드;
    (20) N-(4-아미노-3,5-디이소프로필페닐)-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드;
    (21) N-(4-아미노-3,5-디이소프로필페닐)-4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드;
    (22) N-(3,4-디메톡시페닐)-4-(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드;
    (23) N-(3,4-디메톡시페네틸)-4-모폴리노-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드;
    (24) N-(2-(1H-인돌-3-일)에틸)-4-모폴리노-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드;
    (25) 4-(3,4-디메톡시페닐)-N-(피리딘-4-일)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드;
    (26) 4-(3,4-디메톡시페닐)-N-(2-모폴리노에틸)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드;
    (27) 4-(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)-N-(2-모폴리노에틸)피리미딘-5-카복사미드;
    (28) N-(3,4-디메톡시페네틸)-4-(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드;
    (29) N,4-bis(3,4-디메톡시페닐)-2-(메틸티오)피리미딘-5-카복사미드; 및
    (30) N,4-bis(3,4-디메톡시페닐)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-카복사미드.
  6. 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이
    화학식 2로 표시되는 화합물과 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜, 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법:
    [반응식 1]
    Figure pat00157

    (상기 반응식 1에서,
    L, R1, R2, R3 및 R4는 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다).
  7. 제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 염증 질환은 피부염, 아토피 피부염, 천식, 비염, 관절염, 류머티스성 관절염, 위염, 장염, 신장염, 간염, 알레르기, 위궤양, 십이지장궤양, 식도염, 대장염, 전신부종, 국소부종, 각막염, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 염증성 통증, 요도염, 전립선염, 방광염, 치주염, 치은염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두통, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, PGE 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염 및 습진 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 질환인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 PDE4의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 IL-4(Interleukin-4), IL-5(Interleukin-4), IFN-γ(interferon-γ), IL-17(Interleukin-17), IgE(면역글로불린 E) 및 TNF-α(Tumor necrosis factor-α)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 물질을 조절하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  11. 제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강 기능성 식품 조성물.
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