KR20190056063A - 일산화질소 방출성 고분자, 이를 포함하는 일산화질소 방출성 나노 구조체, 및 이를 이용한 일산화질소 전달 방법 - Google Patents

일산화질소 방출성 고분자, 이를 포함하는 일산화질소 방출성 나노 구조체, 및 이를 이용한 일산화질소 전달 방법 Download PDF

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Abstract

일산화질소 방출성 고분자, 이를 포함하는 일산화질소 방출성 나노 구조체, 및 이를 이용한 일산화질소 전달 방법에 관한 것으로, 다이올(diol)기를 포함하는 일산화질소 방출 물질; 및 보론산(boronic acid)기를 반복 단위의 잔기 내에 포함하는 고분자;가 화학 결합된, 일산화질소 방출성 고분자, 이를 포함하는 일산화질소 방출성 나노 구조체, 및 이를 이용한 일산화질소 전달 방법을 제공할 수 있다.

Description

일산화질소 방출성 고분자, 이를 포함하는 일산화질소 방출성 나노 구조체, 및 이를 이용한 일산화질소 전달 방법{NITROGEN MONOXIDE RELEASING POLYMER, NITROGEN MONOXIDE RELEASING NANO-STRUCTURE COMPRISING THE SAME, AND METHOD FOR DELIVERING NITROGEN MONOXIDE USING THE NITROGEN MONOXIDE RELEASING NANO-STRUCTURE}
본 발명은 일산화질소 전달 시스템에 관한 것으로, 보다 상세하게는 일산화질소 방출성 고분자, 이를 포함하는 일산화질소 방출성 나노 구조체, 및 이를 이용한 일산화질소 전달 방법에 관한 것이다.
일산화질소(Nitrogen monoxide)는 인체의 여러 세포에서 발생하며 면역계에서는 항암 및 항미생물 작용을 나타내는 방어물질로, 신경계에서는 신경전달물질로, 순환기계에서는 혈관확장물질로 알려져 있다.
이에, 일산화질소를 항암치료 등 의약적 용도로 사용하기 위해 일산화질소를 이용 목적에 맞게 더욱 효율적으로 방출할 수 있는 새로운 물질 및 방법에 대한 연구들이 진행되고 있다.
이와 관련하여, 일산화질소는 고농도에서 독성을 갖기 때문에 신체 내에 전반적으로 다량 방출되는 경우 오히려 신체에 악영향을 끼칠 수 있다. 따라서 적절한 농도의 일산화질소를 주위 환경의 신호에 따라 적절한 속도로 방출하거나, 필요한 경우 방출을 억제·지연하되, 주변 환경의 원하지 않는 잡음성 신호에는 방출 특성이 영향을 받지 않는 일산화질소 방출용 전달체 개발에 대한 요구가 나날이 증가하고 있다.
본 발명의 일 양태는, 신체 내 특정 세포로 선택적으로 일산화질소를 전달 및 방출할 수 있는 일산화질소 방출성 고분자를 제공하고자 한다.
본 발명의 일 양태는, 상기 일산화질소 방출성 고분자를 포함하는 나노 구조체를 제공하고자 한다.
본 발명의 일 양태는, 상기 나노 구조체를 이용한 일산화질소 전달 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 양태는, 다이올(diol)기를 포함하는 일산화질소 방출 물질; 및 보론산(boronic acid)기를 반복 단위의 잔기 내에 포함하는 고분자;가 화학 결합된, 일산화질소 방출성 고분자를 제공한다.
상기 다이올(diol)기를 포함하는 일산화질소 방출 물질은 비시널(vicinal) 또는 시스(cis) 다이올기를 포함하는 것일 수 있다.
상기 일산화질소 방출성 고분자는 하기 구조식 1을 반복단위의 잔기 내에 포함하는 것일 수 있다.
[구조식 1]
Figure pat00001
상기 구조식 1에서, R1은 C1 내지 C10의 치환 또는 비치환된 알킬렌, C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 시클로알킬렌, C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 아릴렌, 또는 C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고, R4는 C1 내지 C10의 치환 또는 비치환된 알킬기이고, R5는 C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 아릴기, 또는 C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 헤테로아릴기이고, L1, R2 및 R3는, (ⅰ) L1, R2 및 R3는 서로 고리를 이루어 치환 또는 비치환된 C5 내지 C12의 시클로알킬렌, C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 아릴렌, 또는 치환 또는 비치환된 C5 내지 C12의 헤테로아릴렌을 형성하거나, (ⅱ) L1은 단일 또는 이중결합이고, R2는 C1 내지 C10의 치환 또는 비치환된 알킬렌, C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 시클로알킬렌, C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 아릴렌, 또는 C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고, R3는 수소, 또는 C1 내지 C10의 치환 또는 비치환된 알킬기이다.
상기 일산화질소 방출성 고분자는 하기 구조식 2을 반복단위의 잔기 내에 포함하는 것일 수 있다.
[구조식 2]
Figure pat00002
상기 일산화질소 방출성 고분자는 세포 내 글루타티온(glutathione)과의 화학반응을 통해 일산화질소를 방출하는 것일 수 있다.
상기 일산화질소 방출성 고분자는 세포 내 글루타티온의 농도가 0.5 내지 10 mM 인 환경에서 일산화질소를 방출하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태는, 상기 일산화질소 방출성 고분자가 자기 조립된 나노 구조체를 제공한다.
상기 나노 구조체의 입경은 10 내지 500nm 일 수 있다.
본 발명의 일 양태는 상기 나노 구조체와 글루타티온(glutathione)의 반응을 통한 일산화질소의 방출을 이용하는 일산화질소 전달 방법을 제공한다.
본 발명의 일 양태의 일산화질소 방출성 고분자는 통상의 생리환경에서는 일산화질소를 방출하지 않다가, 특정 생체분자와 선택적으로 반응하여 일산화질소를 방출함으로써, 표적 세포로 선택적으로 일산화질소를 전달 및 방출할 수 있다. 이에, 인체 내 독성을 최소화하면서 일산화질소를 더욱 효율적으로 항암치료 등의 의약적 용도로 사용할 수 있다.
본 발명의 일 양태의 일산화질소 방출성 나노 구조체는, 상기 일산화질소 방출성 고분자를 포함하면서 나노 사이즈의 구조체를 가짐으로써, 암, 염증 등의 부위의 표적 세포에서 쉽게 혈관 내로 침투할 수 있고, 표적 세포 내에서의 선택적인 일산화질소 방출을 가능하게 할 수 있다.
본 발명의 일 양태의 일산화질소 전달 방법에 의하면, 표적 세포로 선택적으로 일산화질소를 전달할 수 있다.
도 1은 실시예에서 제조된 MA-diol-NO의 핵자기공명분석 결과이다.
도 2는 실시예에서 제조된 MA-diol-NO의 일산화질소 방출 양태를 측정한 데이터이다.
도 3은 실시예에서 제조된 Diol-NO-arene의 핵자기공명분석 결과이다.
도 4는 실시예에서 제조된 Diol-NO-arene의 일산화질소 방출 양태를 측정한 데이터이다.
도 5는 실시예에서 제조된 일산화질소 방출성 고분자의 핵자기공명분석 결과이다.
도 6은 실시예에서 제조된 일산화질소 방출성 나노 구조체의 투과전자현미경 사진이다.
도 7은 MDA-MB-231 세포에 대한 세포독성 테스트 결과이다.
도 8은 4T1 세포에 대한 세포독성 테스트 결과이다.
도 9는 MCF-7 세포에 대한 세포독성 테스트 결과이다.
도 10은 A549 세포에 대한 세포독성 테스트 결과이다.
도 11은 HCT8-DR 세포에 대한 세포독성 테스트 결과이다.
다른 정의가 없다면 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 명세서 전체에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 또한 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다.
본 발명의 일 양태는, 일산화질소의 선택적인 전달 및 방출이 가능한 물질로서, 다이올(diol)기를 포함하는 일산화질소 방출 물질; 및 보론산(boronic acid)기를 반복 단위의 잔기 내에 포함하는 고분자;가 화학 결합된, 일산화질소 방출성 고분자를 제공한다.
이러한 일산화질소 방출성 고분자의 일 결합 물질로서 일산화질소 방출 물질은 다이올(diol)기를 포함하며, 다이올기를 포함하는 일산화질소 방출 물질은 보론산기를 반복 단위의 잔기 내에 포함하는 고분자의 보론산기와 일산화질소 방출 물질의 다이올기 간 화학 결합을 통해 일산화질소 방출성 고분자를 형성할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 일산화질소 방출성 물질은 비시널(vicinal) 또는 시스(cis) 다이올기를 포함할 수 있다. 비시널(vicinal) 또는 시스(cis) 다이올기를 포함하는 경우, 보론산기를 반복 단위의 잔기 내에 포함하는 고분자와 보다 용이하게 반응할 수 있어 일산화질소 방출성 고분자의 형성이 보다 용이하고, 보다 선택적으로 일산화질소는 전달 및 방출할 수 있는 일산화질소 방출성 고분자를 형성할 수 있어 바람직할 수 있다.
상기 화학결합은 구체적으로 공유 결합일 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 다이올기를 포함하는 일산화질소 방출 물질의 다이올기와 보론산기를 반복 단위의 잔기 내에 포함하는 고분자의 보론산기 간에 탈수반응을 통해 공유 결합을 이루는 것일 수 있다.
이러한 일산화질소 방출성 고분자는, 상술한 구조를 가짐으로써 특정 생체분자와 반응하여 선택적으로 일산화질소를 방출하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 생체분자는 글루타티온(Glutathione)일 수 있다. 글루타티온은 각종 암세포에 특히 다량 포함되어 있는 물질로, 글루타티온과의 선택적인 화학 반응 및 일산화질소 방출에 의해 암세포의 표적이 가능할 수 있다.
이에, 혈액 등 글루타티온이 없거나 농도가 매우 낮은 생리적 환경에서는 일산화질소를 방출하지 않다가, 암세포 등 글루타티온의 농도가 높은 환경에서 선택적으로 일산화질소를 방출 할 수 있고, 혈액 또는 정상세포에서 일산화질소가 과다 방출되어 바람직하지 못한 독성이 작용하는 것을 방지할 수 있다.
상기 일산화질소 방출성 고분자는, 세포 내 글루타티온의 농도가 0.5 내지 10mM 인 환경에서 일산화질소를 방출하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 하한으로서 1mM 이상, 또는 2mM 이상이고 상한으로서 5mM 이하, 또는 3mM 이하인 환경에서 일산화질소를 방출하는 것일 수 있으나, 반드시 이에 한정하는 것은 아니다.
또한, 상기 일산화질소 방출성 고분자는 세포 내 10μM 이상의 농도로 존재하는 경우에 세포 독성을 보이는 것일 수 있다. 다만, 본 발명을 반드시 이에 한정하는 것은 아니다. 보다 구체적으로는 세포 내 20μM 이상, 40μM 이상, 50 μM 이상, 또는 60μM 이상의 농도로 존재하는 경우에 세포 독성을 보이는 것일 수 있다. 농도의 상한은 1mM 이하, 500μM 이하, 200μM 이하, 또는 100μM 이하일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 일산화질소 방출성 고분자는, 혈액 등과 같은 수성 용액 환경에서 자기 조립에 의한 나노 구조체를 형성할 수 있다. 이러한 나노 구조체의 입경은 예시적으로 10 내지 500nm일 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.
상기 일산화질소 방출성 고분자가 자기 조립에 의해 나노 구조체를 형성함으로써, 일산화질소의 표적 전달 및 방출 효과가 더욱 증대될 수 있다.
구체적으로, 나노 사이즈를 갖는 나노 구조체는 혈관이 매우 약하며 느슨한 구조를 갖는 암, 염증 등 조직의 세포에서 쉽게 혈관 내로 통과할 수 있다.
이에, 일산화질소 방출성 고분자를 포함하는 나노 구조체 자체의 암, 염증 세포 등 표적세포로의 표적 전달 및 해당 표적 세포 내에서의 일산화질소의 선택적인 방출 효과가 보다 향상될 수 있다.
이하, 상기 본 발명의 일 양태의 일산화질소 방출성 고분자의 구조에 대해 보다 자세히 설명한다.
상기 일산화질소 방출성 고분자는, 하기 구조식 1을 반복단위의 잔기 내에 포함하는 것일 수 있다.
[구조식 1]
Figure pat00003
상기 R1은 C1 내지 C10의 치환 또는 비치환된 알킬렌, C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 시클로알킬렌, C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 아릴렌, 또는 C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 헤테로아릴렌일 수 있다.
R1 에서 치환이란, 비한정적인 예시로 아미노(amino)기, 아미드(amide)기, C1 내지 C10의 알콕시기(alkoxy), C1 내지 C10의 알킬아미노(alkylamino)기, C1 내지 C10의 알킬아미드(alkylamide)기, C1 내지 C10의 알킬에스터(alkylester)기로 치환된 것일 수 있으며, 이러한 치환기들이 곁가지로 치환된 경우는 물론, 이러한 치환기들을 매개로 R1이 * 또는 B와 연결된 양태도 포함된다.
상기 R4는 C1 내지 C10의 치환 또는 비치환된 알킬기일 수 있다.
R4에서 치환이란, 비한정적인 예시로, 1 이상의 C1 내지 10의 알킬기, 또는 C1 내지 C10의 시클로알킬기로 치환된 것일 수 있다.
상기 R5는 C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 아릴기, 또는 C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 헤테로아릴기일 수 있다.
R5에서 치환이란, 1 이상의 전자 구인성(electron-withdrawing)기로 치환된 것일 수 있으며, 상기 전자 구인성 기는 예를 들어, 니트로(nitro)기, 할로겐, 또는 니트릴(nirile)기일 수 있다.
상기 L1, R2 및 R3는, 하기 (ⅰ) 또는 (ⅱ)를 만족할 수 있다.
(ⅰ) L1, R2 및 R3는 서로 고리를 이루어 치환 또는 비치환된 C5 내지 C12의 시클로알킬렌, C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 아릴렌, 또는 치환 또는 비치환된 C5 내지 C12의 헤테로아릴렌을 형성할 수 있다.
여기서 치환이란 비한정적인 예시로, 1 이상의 C1 내지 10의 알킬기, 또는 C1 내지 C10의 시클로알킬기로 치환된 것일 수 있다.
(ⅱ) L1은 단일 또는 이중결합이고, R2는 C1 내지 C10의 치환 또는 비치환된 알킬렌, C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 시클로알킬렌, C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 아릴렌, 또는 C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고, R3는 수소, 또는 C1 내지 C10의 치환 또는 비치환된 알킬기일 수 있다.
여기서 치환이란 비한정적인 예시로, 1 이상의 C1 내지 10의 알킬기, 또는 C1 내지 C10의 시클로알킬기로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태의 일산화질소 방출성 고분자가 상기의 구조를 가짐으로써, 혈액 등 생체 내 환경에서 자기조립되어 나노 구조체의 형성이 가능함과 동시에, 글루타티온과의 선택적인 반응을 통해 일산화질소를 방출 할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일 양태의 일산화질소 방출성 고분자는 하기 구조식 2을 반복단위의 잔기 내에 포함하는 것일 수 있다.
[구조식 2]
Figure pat00004
이러한 잔기를 갖는 일산화질소 방출성 고분자는 페닐보론산기를 잔기로 갖는 고분자와 비시널(vicinal) 다이올(diol)을 갖는 일산화질소 방출 물질을 pH 7 이상의 염기성 조건에서 반응시켜 제조될 수 있다.
보다 상세히 설명하면,
우선 2차 아민(secondary amine)기와 비시널(vicinal) 다이올(diol)기를 갖는 3-메틸아미노-1,2-프로판디올(3-methylamino-1,2-propanediol)을 메탄올(methanol) 또는 이써(ether) 등의 유기 용매 하에서 일산화질소를 가하여 N-디아제니윰디올레이트(N-diazeniumdiolates)기를 도입할 수 있다.
이후, 1-플루오로-2,4-디니트로벤젠(1-fluoro-2,4-dinitrobenzene) 등의 보호기 전구체 물질을 포함하는 용액과 반응시켜 N-디아제니윰디올레이트(N-diazeniumdiolates)기의 O 말단에 보호기를 도입할 수 있다. 이러한 보호기의 도입을 통해 글루타티온과의 선택적인 반응에 의한 일산화질소의 선택적인 방출이 구현될 수 있다.
이후, 페닐보론산기를 잔기로 갖는 고분자와 pH 7 이상의 염기성 조건에서 반응시켜 상기 구조식 2로 표시되는 잔기를 갖는 일산화질소 방출성 고분자를 제조할 수 있다.
상기 일산화질소 방출성 고분자는 보다 구체적으로 하기 구조식 3으로 표시되는 것일 수 있다. 다만 이러한 구조는 본 발명의 일 양태의 일산화질소 방출성 고분자를 이해를 돕기 위해 보다 상세히 설명하기 위한 것으로, 본 발명을 이에 반드시 한정하는 취지는 아니다.
[구조식 3]
Figure pat00005
상기 구조식 3에서 m은 20 내지 5000의 정수이고, n은 20 내지 5000의 정수이다.
상기 구조식 3으로 표시되는 물질은 잔기에 페닐보론산기를 갖는 고분자와 일산화질소 방출성 물질을 상술한 바에 따라 반응시켜 제조될 수 있으며, 이하에서는 페닐보론산기를 갖는 고분자에 대해 보다 상세히 설명한다.
상기 페닐보론산기를 갖는 고분자는 석신산 무수물 모이어티(moiety)를 포함하고 있는 말레산 무수물 중합체에 페닐보론산이 결합한 것일 수 있다. 구체적으로, 페닐보론산이 석신산 무수물 모이어티와 결합하여 상술한 일산화질소 방출성 물질의 결합 부위를 형성할 수 있다.
석신산 무수물 모이어티(moiety)를 포함하고 있는 말레산 무수물 중합체는 폴리(메틸 비닐 이써-알트-말레익 안하이드라이드(Poly(methyl vinyl ether-alt-maleic anhydride), pMAnh)계열의 고분자일 수 있으나, 가수분해 후 수용성이고 석신산 무수물 모이어티를 포함하고 있는 고분자라면 제한되지 않고 사용할 수 있다.
석신산 무수물 모이어티(moiety)를 포함하고 있는 말레산 무수물 중합체의 수평균 분자량은 1000 내지 1000000일 수 있고, 보다 구체적으로는 5000 내지 500000, 10000 내지 300000, 또는 25000 내지 100000일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 페닐보론산기를 갖는 고분자는 아래 구조식 4로 표현되는 폴리 메틸 비닐 에터-알트-말레산 무수물(Poly(methyl vinyl ether-alt-maleic anhydride), pMAnh)에 페닐보론산이 결합하여 제조될 수 있다.
[구조식 4]
Figure pat00006
(n은 20 내지 10000이다.)
상기 페닐 보론산은 말레산 무수물 모이어티를 포함하고 있는 고분자에 결합하기 위해서 아민기가 결합된 아미노 페닐보론산(aminophenyboronic acid)을 사용할 수 있다. 아미노 페닐보론산은 아래 구조식 5로 표현되는 3-아미노 페닐보론산일 수 있다.
[구조식 5]
Figure pat00007
아미노 페닐보론산의 아미노기와 고분자에 포함된 말레산 무수물 모이어티가 가수분해를 통한 고리열림 반응(ring opeing)으로 결합할 수 있다. 중합체 합성은 상온에서 다이메틸설폭사이드(dimehyl sulfoxide, DMSO)나 아세톤(acetone)과 같은 용매 내에서 단순히 말레산 무수물 중합체와 아미노 페닐보론산의 혼합을 통해 이루어질 수 있기 때문에 매우 간단하며, 합성 효율도 우수하다.
상기 구조식 4의 말레산 무수물 중합체와 구조식 5의 아미노 페닐보론산의 결합에 의해 제조된 폴리 페닐보론산-말레산 무수물 중합체(poly(phenylboronic acid-co-maleic anhydride), pPBA)를 전술한 일산화질소 방출성 물질과 pH 7 이상의 염기성 조건에서 반응시켜 구조식 3의 일산화질소 방출성 고분자를 합성할 수 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예를 기재한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
1. 일산화질소 방출성 물질의 제조
(1) vic - diol을 가지고 있으면서 이차 아민기를 가지고 있는 물질을 이용한 일산화질소 방출성 물질의 합성
vic-diol을 포함하면서 이차 아민을 가지고 있는 3-메틸아미노-1,2-프로판다이올(3-methylamino-1,2-propanediol, MA-diol)을 메탄올(Methanol)과 이써(Ether)의 혼합용매에 녹이고 소듐 메톡사이드(sodium methoxide)를 넣은 뒤 고압의 일산화질소를 가하여 MA-diol의 이차 아민에 N-다이아제니윰디올레이트(N-diazeniumdiolates)가 도입된 소듐 1-(N-메틸-N-2,3-디히드록시프로필)-디아젠-1-이윰-1,2 디올레이트(1-(N-methyl-N-2,3-dihydroxypropyl)-diazen-1-ium-1,2-diolate, MA-diol-NO)을 합성하였다.
핵자기공명분석(Nuclear Magnetic Rresonance analysis, NMR)을 통해 확인한 결과 N-diazeniumdiolates가 도입된 부분의 주변의 수소원자 환경이 변화하였으며, MA-diol-NO가 정상적으로 합성되었음을 확인하였다.(도 1)
일산화질소 분석기(Nitric oxide Analyzer Sievers 280i, GE Analytical instruments)를 이용하여 제조된 물질이 일산화질소를 방출하는 것을 확인하였다.(도 2)
(2) N -diazeniumdiolates에 보호기(protection group) 도입
물에 넣으면 즉시 일산화질소를 방출하는 것이 아닌, 세포 내에 존재하는 생체분자 중 글루타티온(Glutathione)과 반응하여 선택적으로 일산화질소를 방출할 수 있도록 N-diazeniumdioates에 보호기를 도입하였다.
저온의 포화된 소듐 비카보네이트(sodium bicarbonate) 용액에 N-diazeniumdioates가 도입된 MA-diol-NO를 녹인 후, 1-플루오로-2,4-디니트로벤젠(1-fluoro-2,4-dinitrobenzene) 용액과 섞어 N-diazeniumdioates의 O 말단에 Arene group이 도입된 O2-(2,4-디니트로페닐)-1-(N-메틸-N-2,3-디히드록시프로필)-디아젠-1-이윰-1,2 디올레이트(O2-(2,4-dinitrophenyl)-1-(N-methyl-N-2,3-dihydroxypropyl)-diazen-1-ium-1,2-diolate, Diol-NO-arene)를 합성하였다.
핵자기공명분석(Nuclear Magnetic Rresonance analysis, NMR)을 통해 확인한 결과 2,4-dinitrophenyl기에 붙은 수소 원자의 존재를 통해 N-diazeniumdioates 의 O 말단에 Arene group가 결합하였음을 확인하였다. (도 3)
또한, 일산화질소 분석기(Nitric oxide Analyzer Sievers 280i, GE Analytical instruments)를 이용하여 제조된 물질이 Glutathione이 존재하지 않을 때에는 일산화질소를 방출하지 않다가 (도 4의 좌측 그림) Glutathione이 존재할 때 일산화질소의 방출을 시작하는 것을 확인하였다.(도 4의 우측 그림)
2. 일산화질소 방출성 고분자 및 나노 구조체의 제조
(1) 말레산 무수물(maleic anhydrate) 중합체로 수평균 분자량 80,000인 폴리(메틸 비닐 이써-알트-말레익 안하이드라이드(Poly(methyl vinyl ether-alt-maleic anhydride, pMAnh)와 아민기가 결합된 페닐보론산으로 3-아미노페닐보론산 수화물(3-aminophenylboronic acid monohydrate, PBA-NH2)을 사용하였다.
우선, pMAnh(3.2mmol 숙신산 무수물 포함) 500mg을 아세톤(acetone)에 용해시킨 수용액을 준비하였다. 이 후, pMAnh를 용해시킨 수용액에 PBA-NH2(1mmol) 160mg을 첨가하고 실온에서 24시간 저어 주었다. 24시간 후, 0.1N NaOH 10㎖를 첨가하여 말레산 무수물 중합체의 미반응한 석신산 무수물 모이어티(moiety)의 가수분해를 통해 카복실산(carboxyl acid)로 치환하여 반응을 종결하였다. 반응 종료 후, 이틀 간 투석하여 부유물을 제거하고 동결 건조하여 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체인 폴리(페닐보로닉 에시트-코-말레익 안하이드라이드) (poly(phenylboronic acid-co-maleic anhydride), pPBA)를 얻었다.
핵자기공명분석(Nuclear Magnetic Rresonance analysis, NMR)을 통해 pPBA의 합성을 확인하고, 한 고분자 가닥에 함유된 페닐보론산의 양을 확인하였다. (도 5)
(2) 제조된 pPBA 고분자를 물에 녹인 후, NaOH를 첨가하여 pH를 8로 조절하였다. 여기서 위에서 제조된 Diol-NO-arene을 디메틸 설폭사이드(Dimethyl Sulfoxide, DMSO)에 녹인 500 mM 농도의 용액을 상기 pPBA 수용액에 들어있는 페닐보론산의 양과 Diol-NO-arene 양이 몰 기준으로 1:1의 당량이 되도록 투입하였다.
이렇게 제조된 일산화질소 방출성 나노 구조체 투과전자현미경(Transmission electron microscopy, TEM)을 통해 관찰하였으며(도 6) 약 50nm 정도의 입경을 갖는 나노 구조체가 형성된 것을 확인하였다.
3. 제조된 일산화질소 방출성 고분자 및 나노 구조체의 암 성장 억제 가능성 확인
세포독성평가(cell viability test)를 통해 제조된 일산화질소 방출성 나노 구조체의 암 성장 억제 가능성을 확인하였다.
암세포인 MDA-MB-231, 4T1, MCF-7, A549, HCT8-DR 세포를 각각 96웰(well) 배양 플레이트에 6000cell/well로 분주하고 하루밤 배양하였다. 이러한 암세포들은 세포 내 glutathione을 약 2 ~ 10mM 포함한다. 배양 후, 각각 새 배지로 교체하고 위에서 제조된 Diol-NO-arene 및 pPBA의 페닐보론산이 반응하여 제조된 나노 구조체를 0 에서 100 μM 농도로 각각 처리한 후 48시간 동안 더 배양한 뒤, MTT 에세이(assay)를 통해 세포독성을 확인하였다. (도 7 내지 11)
도 7 내지 11의 각 인덱스는 아래를 의미한다.
MA-diol : N-diazeniumdiolates가 도입되기 전의 전구체인 3-methylamino-1,2,-propandiol
Arene : 보호기인 Dinitrobenzene을 포함하고 있는 2,4-dinitrophenol
MA-diol-NO : N-diazeniumdiolates는 도입되었으나, 보호기가 도입되지 않은 물질
pPBA : poly(phenylboronic acid-co-maleic anhydride)
Diol-NO-arene : MA-diol-NO에 보호기가 도입된 물질
pPBA:Diol-NO-arene 1:1 complex : pPBA의 페닐보론산의 함유량과 Diol-NO-arene의 몰비가 1:1인 나노 구조체
pPBA:Diol-NO-arene 2:1 complex pPBA의 페닐보론산의 함유량과 Diol-No-arene의 몰비가 2:1인 나노 구조체
그 결과 MA-diol, Arene, MA-diol-NO, 및 pPBA는 독성을 보이지 않으나 Diol-NO-arene 및 pPBA:Diol-NO-arene complex에서는 특정농도 이상의 조건에서는 암세포의 성장이 효과적으로 억제되는 것을 확인하였다. 특히 보호기가 도입되기 전 후(MA-diol-NO, Diol-NO-arene) 암세포 성장 억제 효과가 극명하게 차이나는 것 보면, 암세포의 성장억제를 하기 있어서는 세포내 존재하는 특정 생체분자(glutathione)에 감응하여 일산화질소를 방출하는 것이 매우 중요하다는 것을 확인하였다.
또한, pPBA 및 Diol-NO-arene가 반응하여 나노구조체를 이룸으로써, 암세포 표적이 보다 우수하고, 암세포 내 생체분자인 glutathione과의 반응을 통해 선택적인 일산화질소의 전달 및 방출이 가능함을 확인할 수 있었다.

Claims (9)

  1. 다이올(diol)기를 포함하는 일산화질소 방출 물질; 및 보론산(boronic acid)기를 반복 단위의 잔기 내에 포함하는 고분자;가 화학 결합된, 일산화질소 방출성 고분자.
  2. 제 1항에서,
    상기 다이올(diol)기를 포함하는 일산화질소 방출 물질은 비시널(vicinal) 또는 시스(cis) 다이올기를 포함하는, 일산화질소 방출성 고분자.
  3. 제 1항에서,
    하기 구조식 1을 반복단위의 잔기 내에 포함하는, 일산화질소 방출성 고분자.
    [구조식 1]
    Figure pat00008

    (상기 구조식 1에서,
    R1은 C1 내지 C10의 치환 또는 비치환된 알킬렌, C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 시클로알킬렌, C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 아릴렌, 또는 C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고,
    R4는 C1 내지 C10의 치환 또는 비치환된 알킬기이고,
    R5는 C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 아릴기, 또는 C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 헤테로아릴기이고,
    L1, R2 및 R3는,
    (ⅰ) L1, R2 및 R3는 서로 고리를 이루어 치환 또는 비치환된 C5 내지 C12의 시클로알킬렌, C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 아릴렌, 또는 치환 또는 비치환된 C5 내지 C12의 헤테로아릴렌을 형성하거나,
    (ⅱ) L1은 단일 또는 이중결합이고, R2는 C1 내지 C10의 치환 또는 비치환된 알킬렌, C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 시클로알킬렌, C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 아릴렌, 또는 C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고, R3는 수소, 또는 C1 내지 C10의 치환 또는 비치환된 알킬기이다.)
  4. 제 1항에서,
    하기 구조식 2을 반복단위의 잔기 내에 포함하는, 일산화질소 방출성 고분자.
    [구조식 2]
    Figure pat00009
  5. 제 1항에서,
    세포 내 글루타티온(glutathione)과의 화학반응을 통해 일산화질소를 방출하는 것인,
    일산화질소 방출성 고분자.
  6. 제 5항에서,
    세포 내 글루타티온의 농도가 0.5 내지 10mM 인 환경에서 일산화질소를 방출하는 것인,
    일산화질소 방출성 고분자.
  7. 제 1항의 일산화질소 방출성 고분자가 자기 조립된, 나노 구조체.
  8. 제 7항에서,
    입경이 10 내지 500nm인, 나노 구조체.
  9. 제 7항의 나노 구조체와 글루타티온(glutathione)의 반응을 통한 일산화질소의 방출을 이용하는,
    일산화질소 전달 방법.
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Junseok LEE et al., Acta Pharmacologica Sinica, 2017, vol. 38, pp.848-858 *

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